JPH10507069A

JPH10507069A - ユビキチン−溶解ペプチド融合遺伝子構築物、蛋白質産物、その派生物、並びにこれらの作製法および利用法

Info

Publication number: JPH10507069A
Application number: JP8505918A
Authority: JP
Inventors: ガーバリノ，ジョーン; ジェインズ，ジェシー; ベルクナップ，ウィリアム
Original assignee: Demeter Biotechnologies Ltd; US Department of Agriculture USDA
Current assignee: Demeter Biotechnologies Ltd; US Department of Agriculture USDA
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-24
Publication date: 1998-07-14
Also published as: AU3199695A; CA2195625C; EP0781347A4; AU3199595A; IL114697A0; EP0781347A1; WO1996003522A1; WO1996003519A1; US6448391B1; CA2195625A1

Abstract

(57)【要約】安定化されたユビキチン-溶解ペプチド融合ポリペプチド、並びに、溶解ペプチドをコードする核酸配列をプロモーターおよびユビキチンポリペプチドコード配列を含むプラスミドベクターにサブクローン化することによるその作製法、ここでユビキチンポリペプチド配列を溶解ペプチド核酸配列の5'端に連結させて融合ポリペプチドとして翻訳させる。

Description

【発明の詳細な説明】ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物、蛋白質産物、その派生物、並びにこれらの作製法および利用法関連出願の相互関係本出願はJesse M．JaynesとGordon R．Julianの名義で1994年4月20日に出願された出願第08/231,730号の一部継続出願であり、後者はJesse M．JaynesとGordo n R．Julianの名義で1994年4月８日に出願された出願第08/225,476号の継続出願であり、その後者はGordon R．Julianの名義で1993年11月８日に出願された出願第08/148,491号および1993年11月８日に出願された出願第08/148,889号の継続出願であり、さらにその後者はJesse M．JaynesとGordon R．Julianの名義で1993 年6月4日に出願された出願第08/039,620号の継続出願である。従来の技術発明の分野本発明は、安定性および遺伝子発現の昂進した、ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物、ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質産物、並びにそれらの作製法および利用法に関する。関連分野の記載天然に存在する溶解ペプチドは昆虫において免疫剤として決定的ではなくとも重要な役割を担っており、二次的ではあるが、他の動物においてもある程度の防御機能を有している。これらペプチドの機能は、細胞膜を壊し細胞溶解を促進することによって、原核細胞および他の非宿主細胞を破壊することである。これらの天然に存在する溶解ペプチドに共通の特徴として、全体的に塩基性の電荷であること、サイズが小さいこと（23-29アミノ酸残基）、そして両親和性のα-ヘリックスもしくはひだ状β-シートを形成する能力を有していることが含まれる。いくつかのタイプの溶解ペプチドが同定されている：セクロピン（cecropins、H ul tmarkらにより米国特許第4,355,104号および第4,520,016号に記載）、ディフェンシン（difensins）、サルコトキシン（sarcotoxins）、メリチン（melittin）、およびマガイニン（magainins、Zasloffにより米国特許第4,810,777号に記載）。これらペプチドの各タイプは、配列および二次構造の特徴により区別される。いくつかの仮説が溶解ペプチドの作用機序に関して示唆されている：溶解ペプチドの両親和性α-ヘリックス部分による膜脂質二重構造の破壊、その結果、浸透圧により細胞溶解が誘導される；溶解ペプチドによる蛋白質凝集の促進、その結果、イオンチャンネルが形成される；そして溶解ペプチドに誘導されるリン脂質の放出。溶解ペプチドに誘導される膜障害の機構が何であれ、両親和性α-ヘリックスなどの規制された二次立体構造および正の電荷密度が、溶解ペプチドの機能に働くと見られる特徴である。天然に存在する溶解ペプチドの有効な合成類似物が生産され、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、真菌、酵母、原生動物、エンベロープウイルス、ウイルスに感染した真核細胞、および新生物もしくは形質転換された哺乳動物細胞を含めた、種々の原核および真核細胞タイプに対してin vitro検定された（例、Arro wood，M．J.ら、ｊ．Protozool. 38: 161s(1991); Jaynes，J．M．ら、FASEB J. 2: 2878(1988)）。こうした研究の結果により、合成溶解ペプチド類似物の多くが、多くの異なるタイプの細胞に対して、天然に存在する形のものに比べて、同レベル若しくは高レベルの溶解活性を有すことが示された。加えて、原生動物、酵母、および細菌などの微生物病原体を溶解させるのに要すペプチド濃度では、正常な哺乳動物細胞を溶解しない。しかし、正の電荷および両親和性を保持している限り絶対的な配列は重要ではないと以前の研究が示していることから、合成ペプチドの活性レベルは予測しがたい。溶解作用の特異性もまた、ペプチド濃度および相互作用する膜のタイプに依存する。Jaynes，J．M.ら、Peptide Research 2: 157(1989)は、ペプチドによる溶解への細胞の感受性を高める、形質転換された若しくは新生物哺乳動物細胞の変更された細胞骨格特性について、考察している。これらの実験では、正常な形質転換されていないヒト細胞が、ある濃度のペプチドに影響されなかったのに対し、形質転換された細胞は溶解された；しかし、正常細胞を細胞骨格阻害剤であるサイトカラシンＤ若しくはコルヒチンで処理すると、溶解感受性が増大した。実験では、溶解ペプチドの正常細胞への作用が制限されることを示している。この溶解に対する抵抗性は、正常細胞のよく発達した細胞骨格網によっている可能性が高いと考えられた。反対に、形質転換された細胞系列では、よく知られているように細胞骨格の欠損があり、溶解に感受性であった。溶解に対する細胞の感受性の違いから、溶解ペプチド濃度を、同じ場所にある一方の細胞タイプには溶解を起こし、別のタイプには起こさないよう操作することが可能である。合成溶解ペプチド類似物は真核細胞増殖剤としても作用しうる。形質転換細胞の溶解を促進するペプチドは、低い濃度では、あるタイプの細胞の細胞増殖を促進するだろう。この刺激性作用はペプチドのチャンネル形成能に依ると考えられており、何らかの方法により栄養分の取り込み、カルシウム流入もしくは代謝物放出を刺激し、それにより細胞増殖が刺激される（Jaynes，J．M.，Drug News & Perspectives 3: 69(1990)；およびReed，W．A.ら、Molecular Reproduction a nd Development 31: 106(1992)を参照されたい）。この様に、ある濃度では、これらのペプチドは、毒素化合物を排除することが重要でないような良好な環境では正常哺乳動物細胞にとって恩恵を与えうるチャンネルを刺激または創造することができる。合成溶解ペプチド類似物は、典型的には、少なくて12、多くて40アミノ酸残基を含んでいる。フェニルアラニン残基は、該蛋白質のアミノ末端に位置することが多く、天然のセクロピンのアミノ末端近くに位置するトリプトファン残基に類似した芳香性部分、および該合成ペプチドの精製を監視するためのUV吸収部分を提供する。これら溶解ペプチド類似物の設計基礎は、両親和性α-ヘリックス構造もしくはひだ状β-シートモチーフ、および全体に正の電荷密度を有している最短のペプチドが溶解活性を生じさせることにある。植物病は世界の収穫損失の主要要因の一つであり、世界中の収穫損失全体の3 分の1を占めると見られている；例えば、細菌性病気に関連したじゃがいもの損失は、全世界の生産量の25％にもあたる。さらに、集中した地域において数種の植物を栽培することは病気の伝播を悪化させる。最近の遺伝子工学の進歩は、組み換えDNA分子の発現に基づいた病気抵抗性の表現型を有する植物の開発をもたらした。傷害誘導性のPiIIプロモーターと構成的な35Sプロモーターの両方を持ち、溶菌活性を持つ2つの溶解ペプチド(SHIVA-1およびSB-37)を発現する、トランスジェニックタバコ植物が作られた。SHIVA-1植物は、Pseudomonas solanacearum の感染により生じる細菌性立ち枯れ病に高い抵抗性を示した（Jaynes，J．M.ら、Pla nt Science 89: 43(1993); Destefano-Beltran，L.ら、Biotechnology in Plant Disease Control，pp．175-189，Wileys-Liss(1993)）。このように、溶解ペプチドは、抗植物病原体物質として価値ある用途を有している。しかし、これら溶解ペプチドの化学的合成は非常に高価である。それ故、組み換えDNA手法を用いた宿主細胞でのin vivo合成などの、より経済的かつ有効な別の合成法が必要である。組み換えDNA分子は、細菌宿主という中間体を用いて遺伝子をプラスミドにサブクローン化することによって作られる。原理的には、この技術は単刀直入である。しかし、溶解ペプチドなどの、細菌にとって毒性のある産物の複製若しくは生産により、細菌の増殖が干渉を受けるような配列の場合、クローン化は困難である。毒性産物をコードするDNA配列の変異型を含む宿主細菌細胞が、しばしば選択される。これらの変異は、不活性化産物の発現または産生のいずれかが低下している可能性がある。細菌は、真核生物プロモーター（原核生物では活性を持たない）の制御下にあるクローン化遺伝子の持つ潜在的に毒性のある産物の発現を防ぐ変異すら挿入してしまうものである。この変異種の選択の影響により、選択による変異していない遺伝子を含むサブクローンの単離ができなくなる。従って、サブクローン化した遺伝子の中には、細菌宿主中において不安定なものもある。もっとも、この不安定性は経験的にしか示せないが。溶解ペプチドの溶菌活性は、高レベルで発現される安定な組み換えDNA分子の産生にとって障害である。例えば、天然の溶解ペプチドであるカエルのマガイニンをコードする遺伝子を標準的なプラスミドベクターにサブクローン化しようとする際に、細菌形質転換体がマガイニンコード領域に欠失変異を含んでいた。別の試行では、合成溶解ペプチド(SEQ ID NO．98)を、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを含む標準プラスミドベクター(pUC19)にサブクローン化しようとした。得られた形質転換体をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりスクリーニングした。しかし、30 コロニーのうち、2つのサブクローンしか微かな陽性シグナルを示さなかった。これら 2つのサブクローンをシークエンスした。配列から、一方は、溶菌ペプチドの途中3/4の所で終止コドンを導入する点変異を持っており、他方は、開始コドンをメチオニンからイソロイシンに変える点変異を持っていたことが示された。双方の変異は共に、蛋白質の生合成を防ぐものであろう。さらに4つのクローンを解析し、この4つのうち1つは誤った方向にサブクローン化されており、他の3つは配列中に変異が導入されていた。これらサブクローンの一つを選択し更に解析したが、大腸菌宿主の増殖を阻害するものであった。この様に、溶解ペプチドをコードする組み換えDNA分子の生産は、正しいサブクローンを得ることが不確実なために困難である。ユビキチンは、小さく、全ての真核生物において高度に保存された蛋白質である，ユビキチンは、基本的な2つのタイプの構造から特徴づけられる遺伝子ファミリーによりコードされる。ポリユビキチン遺伝子はいくつかのユビキチンをダイレクトリビート状に含んでおり、ユビキチン-リボソーム融合遺伝子は小さなリボソーム関連蛋白質のコード領域が融合したユビキチン1単位分をコードする。これら遺伝子型は共に、ポリ蛋白質として翻訳され、それから真核生物に存在する内在性のユビキチン加水分解酵素により加工され、複数のユビキチン蛋白質を、またはユビキチンとリボソーム関連蛋白質を放出する。ジャガイモからの植物性ユビキチンcDNAおよびゲノムクローンを含め、多くのユビキチンcDNAもしくはゲノムクローンが単離されている（Garbarino，J．とBelknap，W.，Plant Mol ecular Biology 24: 119(1994); Garbarino，J．ら、Plant Molecular Biology 20: 235(1992)）。 Bachmairらによる米国特許第5,093,242号および第5,132,213号は、特殊な蛋白質アミノ末端を作る手法としてのユビキチンクローニングベクターの利用を教示している。ある組み換えDNA分子において、蛋白質コード領域を、そのアミノ末端でユビキチンコード遺伝子に融合させて構築した。ポリペプチドとして翻訳され、加水分解酵素により切断されるため、アミノ末端のアミノ酸がいかなる蛋白質も作ることが可能である。アミノ末端は蛋白質の代謝安定性の制御に利用可能である。しかし、蛋白質の代謝安定性は、得られるアミノ末端のアミノ酸に依存し、翻訳ポリペプチドの製造には依存しない。先行事実から、あるクラスとしての溶解ペプチドは細菌、新生物細胞、真菌、ウイルス感染細胞および原生動物の破壊に効果的である種を包括しうるが、この溶解特性は宿主細胞中のサブクローン化された溶解ペプチドの安定性を減少させもする。この減少した安定性は、溶解ペプチド合成のより経済的かつ効率の良い手段を開発する努力を削ぐ。それ故、溶解ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターにサブクローン化する方法の開発は、昂進した安定性および遺伝子発現並びに減少した毒性を合わせ持つ遺伝子構築物を提供し、当該分野において有意な進歩だろうし、対応して本発明の目的である。発明の概要本発明は、一般的に、プロモーターおよび溶解ペプチドに連結されたユビキチンポリペプチドコード配列を含むユビキチン-溶解ペプチド融合核酸発現ベクター、ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質産物、並びにそれらの作製法および利用法に関する（後に本明細書中にてより十分に記載される）。本発明の別の目的は、ユビキチン-溶解ペプチド融合発現ベクターおよびそれから作られる蛋白質産物を提供することである。本発明の別の目的は、植物で発現され、傷害からの回復促進および植物における細菌感染との格闘に用途を持つ、ユビキチン-溶解ペプチド融合発現ベクターを提供することである。本発明のさらなる目的は、哺乳動物および植物において、原生動物感染、腫瘍形成、真菌感染、ウイルス感染、および細菌感染との格闘に用途を持つ、ユビキチン-溶解ペプチド融合ポリペプチドを提供することである。本発明の更に別の目的は、安定性および遺伝子発現の昂進したユビキチン融合発現ベクターにポリペプチド配列をサブクローン化する方法の開発である。本発明の更に別の目的は、真核細胞で発現される、構成的および傷害誘導性ユビキチンプロモーターを含む発現ベクターを提供することである。本発明の更に別の目的は、ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子を原核生物宿主で発現させる原核生物プロモーターを持った発現ベクター（その産物はユビキチン加水分解酵素によりin vitroで切断可能である）を提供することである。これらおよび他の目的、並びに利点は、以下の開示および請求項から、より十分に明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図1は、6 bp BamHI部位を3'端に持った（この3'端には溶解ペプチドコード遺伝子(D5D*，SEQ ID NO．98)が融合される）228 bpのユビキチンポリペプチドコード領域(SEQ ID NO．93)を連結された920bpのユビキチン-リボソーム融合遺伝子プロモーター領域を含む、組み換え核酸発現ベクターpUCUbi3-LP98のマップである。Ubi3ユビキチン-溶解ペプチドのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.92に対応する。ノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを溶解ペプチド遺伝子の3'端に位置させる。図2は、6 bp BamHI部位を3'端に持った（この3'端には溶解ペプチドコード遺伝子(D5D*，SEQ ID NO．98)が融合される）228 bpのユビキチンポリペプチドコード領域(SEQ ID NO．96)を連結された1220 bpのポリユビキチンプロモーター領域および568 bpイントロンを含む、組み換え核酸発現ベクターpUCUbi7-LP98のマップである。Ubi7ユビキチン-溶解ペプチドのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO． 95に対応する。ノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを溶解ペプチド遺伝子の3'端に位置させる。発明の詳細な説明およびその関連態様先行の同時係属中のJesse M．JaynesとGordon R．Julianの名義で1993年6月4 日に出願された米国特許出願第08/039,620号、Gordon R．Julianの名義で1993年 11月8日に出願された米国特許出願第08/148,889号、Gordon R．Julianの名義で1 993年11月8日に出願された米国特許出願第08/148,491号、Jesse M．JaynesとGor don R．Julianの名義で1994年4月8日に出願された米国特許出願第08/225,476号、およびJesse M．JaynesとGordon R．Julianの名義で1994年4月20日に出願された米国特許出願第08/231,730号の開示は、本明細書中で全てそのまま参考文献に取り入れられている。本明細書中で使われている「両親和性」という用語は、親水性および疎水性アミノ酸残基がα-ヘリックス構造若しくは他の二次立体構造の互いに反対の面に沿って分布し、α-ヘリックス構造の一方の面は主に疎水性、他方の面が主に親水性になることを言う。ペプチドの両親和性の度合いは、その一連のアミノ酸残基をEdmunsonヘリカルホイールにプロットすることにより評価することができる（Kamtekar，S．ら、Science 262: 1680（1993）も参照されたい）。本明細書で使われる「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基の鎖から成る分子を言い、約10,000ダルトン以上の分子量を持つ蛋白質以外に、本質的に分子量10,000ダルトンまでのポリペプチドおよびペプチドの包含物として解釈されることを意図されている（ここで、分子量は平均分子量数である）。この用語はまた、本明細書および請求項における特定のペプチドコード配列に関して用いる場合、その機能的等価物(functional equivalent)の包含物として解釈されることも意図されている。ペプチドおよびポリペプチド機能的等価物には、ペプチドもしくはポリペプチド鎖のアミノ酸の欠失、付加、および置換（これらにより、得られるペプチドもしくはポリペプチドの全体の機能が不利な影響を被ることはないもの）が含まれるが、これらのみに制限されない。本明細書で使われる「プラスミド」という用語は、宿主細胞内で染色体外で、若しくは宿主細胞染色体の一部として自律的に複製できるDNA分子を言う。本明細書中の基本となる最初のプラスミドは、商業的に入手可能であるか、制限されないベースで公的に入手可能であるか、またはそのような入手可能なプラスミドから、本明細書で開示されるように、および／または公表された手法に従って、構築することができる。ある例においては、当該分野の熟達者には明らかなように、当該分野において既知の他のプラスミドを本明細書中に記載のプラスミドと置き換えて用いてもよい。本明細書で使われる「ライゲーション、連結」という用語は、二つの2本鎖DNA 断片間にホスホジエステル結合を形成させる工程を言う。特に記載がない場合、ライゲーションは当該分野の熟達者に既知の標準操作を用いて行われる。本明細書で使われる「ポリメラーゼ連鎖反応」若しくは「PCR」という用語は、本明細書中でそっくりそのまま参考文献として援用されている米国特許第4,68 3, 195号に記載されているように、in vitroで求めるヌクレオチド配列を増幅させる方法を言う。本明細書で使われる「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド(DNA) の鎖から成るデオキシリボヌクレオチド分子、およびリボヌクレオチド(RNA)の鎖から成るリボヌクレオチド分子を言う。本明細書で使われる「核酸」という用語は、本明細書および請求項中の特定のヌクレオチド配列に関して使われる場合、その機能的等価物を含むものとして解釈されるべきものである。核酸分子の機能的等価物には、生じる核酸分子の全体の機能に影響しない、一つ若しくは複数のコドン置換および欠失若しくは付加を持つ、同義のコード配列が含まれる。遺伝暗号の縮退性は、当該分野においてよく知られており；それ故、一つ若しくは複数のコドン置換を持つ同義のコード配列は、当該分野の熟達者により容易に決定できる。同義の核酸コード配列は例示されるコード配列から変化するが、本明細書中で特異的に提供されるものと同じアミノ酸配列の蛋白質、または同様の機能を持つ蛋白質をコードし、それ故、その機能的等価物としても見なされる。本明細書で使われる「プロモーター」という用語は、ヌクレオチド配列のポリペプチドコード領域の上流の非翻訳（即ち、ペプチド産物も蛋白質産物も生じない）配列で、遺伝子の転写を制御するものを言う。プロモーターは典型的には構成的および誘導性の二つのクラスに落ちる。誘導性プロモーターは外的刺激に応答して、その制御下にある核酸の高レベルな転写を開始させる。構成的プロモーターは、ある細胞での比較的定常レベルの転写を維持する。本発明に用いるのに適したプロモーターは、原核および真核プロモーターを両方が含まれることが可能であり、全てのユビキチンプロモーターは望ましく、ナス科植物のユビキチンプロモーターは非常に望ましく、そしてジャガイモのユビキチンプロモーターが最も望ましい。リボソーム結合部位およびエンハンサーなどの付加的な制御配列も必要なら制御配列として含むことができる。本明細書で使われる「ポリアデニル化部位」という用語は、遺伝子構築物の3' 端に位置し、プロモーターから発現した転写単位の切断およびポリアデニル化に関するシグナルを提供する制御配列に関する。これらの制御配列は当該分野の熟達者に既知のものである。本明細書で使われる「発現」という用語は、蛋白質またはペプチドをコードする核酸配列の転写および／または翻訳を言う。ある態様では、本発明は、ユビキチンプロモーターおよびその機能的等価物に連結されたユビキチンポリペプチドおよびその機能的等価物をコードする遺伝子を含む、単離された核酸配列に向けられる。本発明での使用に適したユビキチンプロモーターは、ナス科植物のユビキチンプロモーターを含むが、それに制限されない。好適には、ユビキチンプロモーターはジャガイモ植物のユビキチンプロモーターであり、最も望ましくは、ジャガイモのUbi3もしくはUbi7プロモーターである。単離されたヌクレオチド配列がユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子に連結されたジャガイモUbi3プロモーターをコードする態様では、それはSE Q ID NO．93によるヌクレオチド配列を持つ。Ubi3プロモーターはそれだけで真核細胞中で構成的プロモーターとしての用途も持つ。単離されたヌクレオチド配列が、ユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子に連結されたジャガイモUbi7プロモーターをコードする態様では、それはSEQ ID NO．96によるヌクレオチド配列を持つ。SEQ ID NO．96によるUbi7ヌクレオチド配列は、ユビキチン転写単位の一部であるイントロンを含む。イントロンは、Ub i7プロモーターからの遺伝子発現に必要なく、従って、イントロンを欠くUbi7プロモーター領域を、Ubi7プロモーターの特異な機能的等価物と見なすことも可能である。Ubi7プロモーターは、イントロンの有無に拘わらず、単独で真核細胞において傷害誘導性プロモーターとしての用途を持つ。単離されたユビキチンプロモーターおよびユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列はさらに、ユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子の3'端に連結された溶解蛋白質をコードする遺伝子を含むことが望ましい。溶解ペプチドをコードする適当な遺伝子は、SEQ ID NO．1-91および97-98によるアミノ酸配列のいずれか一つをコードするヌクレオチド配列を持つ。ある望ましい態様では、本発明は、SEQ ID NO．92によるヌクレオチド配列を持つUbi3ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードすろ遺伝子の3'端に連結された溶解ペプチドをコードする遺伝子を含む、単離された核酸配列に向けられる。この態様の別のものでは、本発明は、SEQ ID NO．9 5によるヌクレオチド配列を持つUbi7ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子の3'端に連結された溶解ペプチドをコードする遺伝子を含む、単離された核酸配列に向けられる。別の態様では、本発明は、組み換え核酸発現ベクターに向けられる一本ベクターは、ユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子がユビキチンプロモーターに連結されたヌクレオチド配列を含むという、特徴を持つ。望ましくは、本発明は、溶解ペプチドをコードする遺伝子が、ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子の3'端に連結されたヌクレオチド配列をさらに含むという特徴を持つ、組み換え核酸発現ベクターに向けられる。本発明での使用に適したベクターには、当該分野の真核もしくは原核発現ベクターのいずれもが含まれる。本発明に使われる好適なベクターはpUC19およびpCGN1547 である。別の態様では、本発明は、ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えDNA発現ベクターにより形質転換される宿主細胞に向けられる。本発明の形質転換に適した宿主細胞には、既知の全ての細菌宿主細胞が含まれるが、大腸菌およびAgrobacterium tumefaciensの全ての菌株が望ましい。望ましくは、本発明は、上記組み換えDNA発現ベクターが、ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子の3'端に溶解ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むような宿主細胞に向けられる。溶解ペプチドに適した遺伝子は、SEQ ID NO．1-91および97-98によるアミノ酸配列のいずれか一つをコードするヌクレオチド配列を持つ。望ましくは本発明は、組み換え発現ベクターにより形質転換されたナス科植物宿主細胞に向けられる。ナス科植物細胞がジャガイモ植物細胞であるのが、最も望ましい。別の態様では、本発明は、溶解ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列およびその機能的等価物（上記ヌクレオチド配列はSEQ ID NO．1-91および9 7-98によるアミノ酸配列のいずれか一つをコードする配列を持つ）に向けられる。さらに別の態様では、本発明は、SEQ ID NO．94によるアミノ酸配列を持つ精製されたユビキチンポリペプチドおよびその機能的等価物に向けられる。この態様は、ユビキチンポリペプチドのカルボキシ末端に翻訳的に融合された溶解ペプチドをさらに含むことができる。別の態様では、本発明は、溶解ペプチドをコードし、そのような配列を細胞で発現させるヌクレオチド配列をサブクローン化する方法に向けられる。本方法には、ユビキチンプロモーターに連結されたユビキチンポリペプチドをコードする遺伝子に連結された溶解ペプチドをコードする遺伝子を含む組み換え核酸が第一の宿主で生産される、第一の工程が含まれる。適当な第一の宿主細胞には既知のいずれの細菌宿主細胞が含まれる。望ましくは、第一の宿主細胞は大腸菌細胞もしくはAgrobacterium tumefaciens細胞である。ペプチドをそのようなユビキチン融合発現ベクターを用いてサブクローン化するなら、以下の利点が生じる：即ち、溶解ペプチド遺伝子構築物の細菌宿主での安定性が増大する。本発明者は、いかなる一つの理論にも拘束されたくはないものの、上記安定性が、溶解ペプチドコード核酸配列の5'端に融合されたユビキチン蛋白質コード核酸領域によるものと考えている。細菌はユビキチン融合蛋白質の切断に必要な内在性加水分解酵素を含まず、活性のある溶解ペプチドが放出されないので、上記遺伝子構築物は細菌にとって毒性を持たない。従ってユビキチン融合ポリペプチドの機能的等価物には、宿主細胞を欺いて遺伝し構築物およびその産物を毒性のないものと見させる能力を有す、いずれのユビキチン分子も含まれる。この態様の変種では、組み換え核酸ベクターを第一の宿主から単離し、第二の宿主で発現させる。適当な第二の宿主は、植物および動物細胞で、望ましくはナス科植物細胞、そして最も望ましくはジャガイモ植物細胞である。第二の宿主では、融合遺伝子が高レベルに発現され、ポリ蛋白質が内在性ユビキチン加水分解酵素により切断され、活性のある溶解ペプチドが産生される。これらトランスジェニック宿主は、in vivoで発現ベクターから溶解ペプチドを提供し、細菌感染、真菌感染、原生動物感染、ウイルス感染および腫瘍形成と格闘する。加えて、構成的もしくは傷害誘導性のユビキチンプロモーターを含む発現ベクターを用いて、真核細胞中でペプチドを発現させる。本発明はまた、溶解ペプチドをコードし、この様な配列を細胞中で発現させるヌクレオチド配列をサブクローン化する方法にも向けられる。本方法は、原核プロモーター配列に連結されたユビキチンプロモーターをコードする遺伝子の3'端に連結された溶解ペプチドをコードする遺伝子を含む、組み換え核酸発現ベクターを宿主細胞中で産生することを含む。適当な原核プロモーターには、当該分野の熟達者に知られた、原核生物中で活性を持ち、細菌遺伝子発現用のプラスミドベクターで使われるものが含まれる。組み換え核酸発現ベクターは宿主細胞中で発現され、ユビキチン-溶解ペプチド融合ポリペプチドは宿主から分離される。望ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞もしくはAgrobacterium tumefaciens細胞である。分離されたユビキチン-溶解ペプチド融合ポリペプチドは、次いで、ユビキチン加水分解酵素によりin vitroで切断され、ユビキチンポリペプチドから溶解ペプチドを放出する（Bachmairらによる米国特許第5,196,321号を参照していただきたい）。活性のある溶解ペプチドは、それから、細菌感染、真菌感染、原生動物感染、ウイルス感染および腫瘍形成の治療に使われる。これらの分離された溶解蛋白質は、いくつかの例においては、in vivoでの蛋白質分解に対して安定させるために、グリオキシル化もしくはメチル化される。ユビキチン融合発現ベクターは、従って、これを用いなければ宿主に毒性を持つ多種多様な蛋白質コード核酸配列と同様に、溶解ペプチドヌクレオチド配列を安定化させサブクローン化するためのクローニングおよび発現ベクターとして広範な用途を持つ。ユビキチン-溶解ペプチド発現ベクターも、宿主細胞中で溶解ペプチドを合成する経済的かつ有効な手段として広範な用途を持つ。これら溶解ペプチドは、哺乳動物および植物における原生動物感染、腫瘍形成、真菌感染、ウイルス感染および細菌感染との格闘に用途を持つ。本発明の特徴および利点は、以下の例示的な実施例および態様（これらは本発明の広範な範囲、用途および応用性に関して制限的に解釈されるべきではない）により、より十分に示される。実施例１代表的な溶解ペプチドおよびユビキチンポリペプチド溶解ペプチドの例示的実施例として以下の表1に示されるのは、近縁の溶解ペプチドファミリーのアミノ酸配列である。これらの溶解ペプチドは、簡単のため SEQ ID NO．1-91および97-98の参照番号で命名されている、。これらの溶解ペプチドおよびその機能的等価物をコードする核酸配列は、ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物およびポリペプチドを作るためにサブクローン化される溶解ペプチド核酸配列の例を表す。ユビキチンポリペプチド（簡単のためSEQ ID NO ．94の参照番号で命名されている）およびその機能的等価物は、5'融合ユビキチンポリペプチドの例を表す。実施例2 ユビキチン-リボソーム融合遺伝子プロモーター(Ubi3)を持ったユビキチン-溶解ペプチド融合プラスミドの構築ジャガイモ(Solanum tubersum)ユビキチン-リボソーム融合プロモーター(Ubi3 )、ユビキチンポリペプチドコード領域および溶解ペプチドコード遺伝子を含む、模範的かつ好適なpUC19およびpCGN1547プラスミドベクターを構築する。ユビキチン-リボソーム融合プロモーターおよびユビキチンポリペプチドコード領域を含むゲノムクローンを得るために、λFIXIIジャガイモゲノムライブラリーをPCRを用いて最初の予備スクリーニングを行う。PCRプライマーは、ユビキチン-リボソーム融合cDNA領域に相同である（Garbarino J．ら、Plant Molecula r Biology 20: 235(1992); Garbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biol ogy 24: 119(1994)（共に本明細書中においてそのまま参考文献として取り込まれている）を参照していただきたい）。ユビキチンの開始ATGの5'側のプライマーおよびリボソーム蛋白質の5'端近くの配列に相補的なプライマーを使用する。ライブラリーを、約0.5×10⁶pfu（プラーク形成単位）を含む22個の分注液として、各々大腸菌のローン上に蒔く。得られる22のプラークの各々からプラグを採取し、各溶出液を標準条件下でPCRにかける。PCR産物をアガロースゲルに流す。次いでゲルをプロットし、ユビキチン-リボソーム融合cDNAのユビキチンコード領域をプローブに標準条件によりハイブリダイズさせる。二つのプラグにおいて、cDNAプローブとハイブリダイズするPCR産物が産生された。これらは共に、予想されたユビキチン-リボソーム融合ゲノム断片の正しい大きさである。これら二つのプラグからの溶出物を、それからプレートにまき、ユビキチン- リボソーム融合cDNAのユビキチンコード領域で標準条件によりスクリーニングした。確認のため、最初のスクリーニングからの陽性プラークを再度まき、リボソーム蛋白質コード領域およびジャガイモユビキチン-リボソーム融合cDNAの3'端の両方を含むプローブでスクリーニングする。ゲノムクローンをSequenase version 2.0（United States Biochemical Corpo ration）若しくはPromega fmol DNA Sequencing System を用いて標準条件でシークエンスする。ユビキチン-リボソーム融合プロモーターおよびユビキチン-リボソーム融合コード領域の両方を含むゲノムクローンを同定する。それからキメラ遺伝子を、ジャガイモユビキチン-リボソーム融合ゲノムクローンの一部を溶解ペプチド遺伝子に連結させて構築する。PCRを用いて、キメラ遺伝子のUbi3プロモーターおよびユビキチン部分を作製する。Ubi3プロモーター領域は、ユビキチンATGの上流920 bpのプロモーター領域を含み、ユビキチンポリペプチドコード領域は228 bp とその3'端の6bpのBamHI制限部位である(SEQ ID NO．93)。プライマーはそれぞれBamHI制限部位を含み、一方はUbi3プロモーターの5'端に、他方はユビキチンポリペプチドコード領域の3'端に相同である。ユビキチン-リボソーム融合ゲノムクローンは増幅鋳型として用いられる。この挿入物を最初にプラスミドpCGN1547（Garbarinoら、Plant Molecular Biology 24: 119(1994)に記載）にサブクローン化する。Ubi3挿入物をそれからBamHI部位を用いてpCGN1547から分離し、pUC19に標準条件下で連結させる。標準条件により大腸菌の形質転換を行い、正しいサブクローンをミニ調製もしくはPCRDNA分析により確認する。このプラスミドをpUCUbi3と命名する。溶解ペプチドをコードするヌクレオチド断片（アミノ酸配列SEQ ID NO．98に対応）を、核酸合成機を用いて3'端に終止コドンを付加して合成し、PCR鋳型として用いる。溶解ポリペプチドヌクレオチド配列に相同な5'PCRプライマーはBam HI部位を含み、3'プライマーはXbaI部位を含む。これらの部位を用いてPCRで作られた挿入物をpUC19にサブクローン化する。次いでノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナル(NOS3')を溶解ペプチドの3'側にクローン化する。配列解析に続き、Ubi3プロモーターおよびユビキチンコード領域を含むBamHT挿入物(SEQ ID N O．93)を溶解ペプチドの5'側にクローン化する。標準条件下で大腸菌を形質転換した後、pUC19サブクローンを標準条件によりミニ調製もしくはPCR DNA分析に対して選択する。標準条件による配列決定により、プロモーターの方向を確認し、つなぎ目部分の配列を検証する。得られるUb i3ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物は、SEQ ID NO．92に対応する。従来の技術の項で記載された、CaMV35Sプロモーターを用いた以前のクローニング計画と異なり、配列は溶解ペプチドサブクローン中でいかなる点変異も示さない。本プラスミドは大腸菌宿主中で安定であり、その増殖を阻害しなかった。得られるpUC19組み換えプラスミドを図1のプラスミドマップに示す。ユビキチン-リボソーム融合遺伝子プロモーターおよびユビキチンコード領域を含むUbi3- ユビキチン挿入物の配列は、以下の表2のSEQ ID NO．93に対応する。キメラUbi3 ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物の配列は、以下の表2のSEQ ID NO．9 2に対応する。このプラスミドをpUCUbi3-LP98と命名する。 Ubi3ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物全体を、ポリアデニル化部位を含めて、Asp718/HindIII制限断片としてpUC19から分離し、植物の形質転換に用いるpCGN1547アグロバクテリウムベクター（McBrideら、Plant Molecular Bio logy 14: 269(1990)を参照していただきたい）中にサブクローン化した。このプラスミドをpCGNUbi3-LP98と命名する。実施例3 ポリユビキチンプロモーターおよびイントロンを持ったユビキチン-溶解ペプチド融合プラスミドの構築ジャガイモ(Solanum tuberosum)ポリユビキチンプロモーターおよびイントロン(Ubi7)、ユビキチンポリペプチドコード領域および溶解ペプチドコード遺伝子を含む、模範的かつ好適なpUC19およびpCGN1547プラスミドベクターを構築する。ポリユビキチンプロモーター、イントロンおよびユビキチンポリペプチドコード領域を含むゲノムクローンを得るために、λFIXIIジャガイモゲノムライブラリーを、上記実施例2に記載したように、PCRを用いて最初の予備スクリーニングを行った。PCRプライマーは、ポリユビキチンcDNA領域に相同である（Garbarino J. ら、Plant Molecular Biology 20: 235(1992)を参照していただきたい）。ポリユビキチンcDNAのユビキチンの5'非翻訳領域に相同なプライマー、およびポリユビキチンcDNAのユビキチンコード領域のアミノ末端に相補的なプライマーを使用する。ポリユビキチンプロモーター領域、イントロン、およびポリユビキチンコード領域をいずれも含むゲノムクローンを同定した。キメラ遺伝子をそれから、実施例2に記載したように、ジャガイモポリユビキチンゲノムクローンの一部を溶解ペプチド遺伝子に連結させて構築する。PCRを用いて、キメラ遺伝子のUbi7ユビキチン部分を作製する。Ubi7プロモーター領域は、ユビキチンATGの上流1220 bpのプロモーターおよび568 bpのイントロンを含み、ユビキチンポリペプチドコード領域は228 bpと6 bpのBamHI制限部位である( SEQ ID NO．96)。このプラスミドをpUCUbi7と命名する。溶解ペプチドをコードするヌクレオチド断片（アミノ酸配列SEQ ID NO．98に対応）を、実施例2に記載されたように合成する。得られるUbi7ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物は、SEQ ID NO．95に対応する。従来の技術の項で記載された、CaMV35Sプロモーターを用いた以前のクローニング計画と異なり、本配列は溶解ペプチドサブクローン中でいかなる点変異も示さない。本プラスミドは大腸菌宿主中で安定で、その増殖を阻害しなかった。得られるpUC19組み換えプラスミドを図2のプラスミドマップに示す。ポリユビキチンプロモーター、イントロンおよびユビキチンコード領域を含むPCR挿入物の配列は、以下の表3のSEQ ID NO．96に対応する。キメラUbi7ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物の配列は、以下の表3のSEQ ID NO．95に対応する。このプラスミドをpUCUbi7-LP98と命名する。 Ubi7ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子構築物全体を、ポリアデニル化部位を含めて、Asp718/HindIII部分消化制限断片（イントロンが内部にHindTII部位を持つ）としてpUCI9から分離し、植物の形質転換に用いるpCGN1547アグロバクテリウムベクター中にサブクローン化する。このプラスミドをpCGNUbi7-LP98と命名する。実施例4 ユビキチン-溶解ペプチド融合遺伝子プラスミドベクターの構築ジャガイモ($olanum tuberosum)Ubi3プロモーター、ユビキチンポリペプチドコード領域、および溶解ペプチドコード領域を含むpUC19およびpCGN1547プラスミドベクターを実施例2に従って構築する。各プラスミドはそれぞれ、SEQ ID NO ．1，7，15，21，30，39，43，52，83，86，88，90，および91に対応するアミノ酸配列をコードする溶解ペプチドヌクレオチド配列を一つ含む。得られるpUC19 Ubi3 ユビキチン-溶解ペプチド組み換えプラスミドは、以下のように命名される：pUCUbi3-LP1，pUCUbi3-LP7，pUCUbi3-LP15，pUCUbi3-LP21，pUCUbi3-LP30，pU CUbi3-LP39 pUCUbi3-LP43，pUCUbi3-LP52，pUCUbi3-LP83，pUCUbi3-LP86 pUCUbi 3-LP88，pUCUbi3-LP90，およびpUCUbi3-LP91。得られるpGCN1547 Ubi3 ユビキチン-溶解ペプチド組み換えプラスミドは、以下のように命名される：pGCNUbi3-LP 1, pCGNUbi3-LP7，pCGNUbi3-LP15，pCGNUbi3-LP21，pCGNUbi3-LP30，pCGNUbi3-L P39 pCGNUbi3-LP43，pCGNUbi3-LP52，pCGNUbi3-LP83，pCGNUbi3-LP86 pCGNUbi3- LP88，pCGNUbi3-LP90，およびpCGNUbi3-LP91。ジャガイモ(Solanum tuberosum)Ubi7プロモーター、イントロン、ユビキチンポリペプチドコード領域、および溶解ペプチドコード領域を含むpUC19およびpCG N1547プラスミドベクターを実施例3に従って構築する。各プラスミドはそれぞれ、SEQ ID NO．1，7，15，21，30，39，43，52，83，86，88，90，および91に対応するアミノ酸配列をコードする溶解ペプチドヌクレオチド配列を一つ含む。得られるpUC19 Ubi7ユビキチン-溶解ペプチド組み換えプラスミドは、以下のように命名される：pUCUbi7-LPI，pUCUbi7-VP7，pUCUbi7-LP15，pUCUbi7-LP21，pUCU bi7-LP30，pUCUbi7-LP39 pUCUbi7-LP43，pUCUbi7-LP52，pUCUbi7-LP83，pUCUbi7 -LP86 pUCUbi7-LP88，pUCUbi7-LP90，およびpUCUbi7-LP91。得られるpGCN1547 U bi7ユビキチン-溶解ペプチド組み換えプラスミドは、以下のように命名される： pGCNUbi7-LP1，pCGNUbi7-LP7，pCGNUbi7-LP15，pCGNUbi7-LP21，pCGNUbi7-LP30 ，pCGNUbi7-LP39 pCGNUbi7-LP43，pCGNUbi7-LP52，pCGNUbi7-LP83，pCGNUbi7-LP 86 pCGNUbi7-LP88，pCGNUbi7-LP90，およびpCGNUbi7-LP91。実施例5 GUS- ユビキチン融合遺伝子組み換えDNA分子およびユビキチンプロモーター-GUS組み換えDNA分子の構築 β-グルクロニダーゼ(GUS)レポーター遺伝子およびUbi3プロモーターを含む二つのキメラ遺伝子を、Garbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 2 4: 119(1991)（本明細書中においてそのまま参考文献として取り込まれている）に従ってpCGN1547プラスミドベクターにおいて構築した。最初のベクターはGUS 遺伝子を連結された920 bp UPi3プロモーターを含み、GUS蛋白質を発現する。このプラスミドをpCGNUbi3-GUSと命名する。第二のベクターは、920 bp Ubi3プロモーターおよびGUS遺伝子をイン-フレームで連結された228 bpのユビキチンコード領域を含む。このプラスミドはユビキチン-GUS融合ポリペプチドを発現する。このプラスミドをpCGNVbi3-GUSfと命名する。 β-グルクロニダーゼ(GUS)レポーター遺伝子およびイントロンを欠くUbi7プロモーターを含む二つのキメラ遺伝子を、実施例3およびGarbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 24: 119(1994)（本明細書中においてそのまま参考文献として取り込まれている）に記載されたようにして、PCRを用いてpCGN154 7プラスミドベクターにおいて構築した。最初のベクターはGUS遺伝子を連結された1156 bp Ubi7プロモーター領域（ユビキチンの5'非翻訳領域を含む）挿入物を含む。このプラスミドはUbi7イントロンを含まず、GUS蛋白質を発現する。このプラスミドをpCGNUbi7-GUSと命名する。第二のベクターは、pCGNUbi7-GUSからの 1156 bp Ubi7ユビキチンプロモーター、およびGUSレポーター遺伝子をイン-フレームで融合された228 bpのユビキチンコード領域を含む。このプラスミドはユビキチン-GUS融合ポリペプチドを発現し、pCGNUbi7-GUSfと命名される。実施例6 植物形質転換ならびにGUS遺伝子発現実施例5からのキメラプラスミドpCGNUbi3-GUS，pCGNUbi3-GUSf，pCGNUbi7-GUS ，およびpCGNUbi7-GUSfを、Garbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biol ogy 24: 119（1994）によるアグロバクテリウムを介した形質転換法を用いてジャガイモ(Solanum tuberosum)に導入する。形質転換に用いるAgrobacterium tumef aciensの菌株（PC2760，An，G．ら、EMBO J．4: 277(1985)を参照していただきたい）は、無力化されたTiプラスミドpAL4404（Hoekema，A．ら、Nature 303: 1 79(1983)を参照していただきたい）を有している。植物形質転換は、Synder，G ．W．ら、Plant Cell Rep 12: 324（1993）に以前記載されたようにして行うが、1 mg/l のチオ硫酸銀をステージIIの形質転換焙地に添加する（Chang，H．H．ら、Bot Bull Acad Sci 32: 63（1991）を参照）。ユビキチン-GUS融合ポリペプチドおよびmRNA産物およびGUS蛋白質のみの発現は、Garbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 24: 119（1994）に記載されたように、ノザンおよびウェスタン分析により調べられる。GUS蛋白質発現は、ウェスタン分析を用いてトランスジェニック植物中で調べられる。個々のクローン間で幅広い活性があるが、ユビキチン-GUS融合ポリペプチドを含む植物は、GUS蛋白質のみを含む植物よりも一般に5-10倍高い発現を示す。この高レベルな蛋白質発現は、ノザン分析により示されるように、ユビキチン-GUS融合構築物のmRNA転写レベルが同様に昂進していることに対応する（Garbarino ら、Pl ant Molecular Biology 24: 119（1994）に記載）。ウェスタン分析もまた、ユビキチン-GUS融合ポリペプチドが、内在性ユビキチン加水分解酵素により適切に加工され遊離GUS蛋白質が産生されることを示している。 GUS蛋白質活性をJefferson R．A．ら、EMBO J．6: 3901（1987）に記載されたようにして測定する。以下の表4は、pCGNUbi3-GUS（ubi-）で形質転換した植物と、pCGNUbi3-GUSf（ubi+）で形質転換した植物におけるGUS活性の比較を示す。活性は、nmole メチルウンベリフェロン(MU)／分／蛋白質mgで測定される。メチルウンベリフェロンは、GUS酵素反応の蛍光産物である。実施例7 植物形質転換とユビキチン-溶解ペプチド遺伝子発現実施例2からのキメラプラスミドpCGNUbi3-LP98および実施例3からのpCGNUbi7- LP98をGarbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 24: 119（1994）によるアグロバクテリウムを介した形質転換法を用いてジャガイモ(Solanum tub erosum)に導入する。形質転換に用いるAgrobacterium tumefaciensの菌株（PC27 60，An，G．ら、EMBO J．4: 277(1985)を参照していただきたい）は、無力化されたTiプラスミドpAL4404（Hoekema，A．ら、Nature 303: 179(1983)を参照していただきたい）を有している。植物形質転換は、Synder，G．W．ら、Plant Cell Rep 12: 324（1993）に以前記載されたようにして行うが、1 mg/l のチオ硫酸銀をステージIIの形質転換培地に添加する（Chang，H．H．ら、Bot Bull Acad S ci 32: 63（1991）を参照）。ユビキチン-溶解ペプチド融合ポリペプチドおよびmRNA産物の発現は、実施例6 およびGarbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 24: 119（1994）に記載されたように、ノザンおよびウェスタン分析により調べられる。ノザン分析は、ユビキチン-溶解ペプチドmRNAがトランスジェニック植物において本遺伝子構築物から転写されていることを示している。ウェスタン分析は、ユビキチン -溶解ペプチド融合ポリペプチドが内在性ユビキチン加水分解酵素により適切に加工され、遊離溶解ペプチドが産生されることを示している。実施例8 クローン化されたUbi3/Ubi7プロモーター活性クローン化されたUbi3プロモーターからのmRNA発現を傷をつける前後で調べて、クローン化されたUbi3プロモーターが形質転換された植物中で誘導されるか否かを決定した（Garbarino J．とBelknap W.，Plant Molecular Biology 24: 119 (1994)を参照）。形質転換された植物中での内在性Ubi3 mRNA発現レベルをpCGNU bi3-GUSおよびpCGNUbi3-GUSf mRNA発現レベルと比較するノザン分析（実施例5参照）により、内在性Ubi3 mRNA転写が傷害に応じて増加するのに対し、組み換えU bi3プラスミドからの転写は増加しないことが示される。従って、組み換えUbi3 プロモーターは、内在性Ubi3プロモーターの傷害誘導特性を有していない。この結果は、Ubi3ゲノムクローンにクローン化された920 bpの上流配列がプロモーターの傷害依存性活性化を得るのに十分でないことを示唆している。そのかわり、プロモーターは構成的である。しかし、上記の表4に示されるように発生による制御を依然として示している。対照的に、クローン化されたUbi7プロモーターはその傷害依存性誘導を保持している。形質転換された植物中での内在性Ubi7 mRNA発現レベルをpCGNUbi7-GUS およびpCGNUbi7-GUSf からの発現レベルと比較するノザン分析（実施例5参照）は、内在性およびクローン化されたUbi7 プロモーターが共に傷害依存性の活性化を有していることを示している。寄託情報各々それぞれ、pUCUbi7-LP98（ローカルアクセス番号PBT-0273）、pUCUbi3-LP 98（ローカルアクセス番号PBT-0276）、pUCUbi7（ローカルアクセス番号PBT-027 7）、およびpUCUbi3（ローカルアクセス番号PBT-0234）で形質転換された大腸菌培養物は、農業リサーチサービスカルチャーコレクション（Agricultural Resea rch Service Culture Colletion; NRRL）に寄託された。受託場所は、1815 Nort h Unversity Street，Peoria，IL，61604 である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガーバリノ，ジョーンアメリカ合衆国カリフォルニア州94702, バークリー，カーティス・ストリート 1709 (72)発明者ジェインズ，ジェシーアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27606，ローリー，ハイリッジ・ロード 2417 (72)発明者ベルクナップ，ウィリアムアメリカ合衆国カリフォルニア州94706, アルバニー，キー・ルート・ブールバード 1012

Claims

【特許請求の範囲】１．ユビキチンがその3'端で溶解ペプチドに連結された、ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質を含むポリペプチド。２．上記ユビキチンポリペプチドが配列SEQ ID NO.: 94により記載される、請求項1に記載のポリペプチド。３．上記溶解ペプチドがセクロピン、ディフェンシン、サルコトキシン、メリチンおよびマガイニンから成るグループから選択される、請求項1に記載のポリペプチド。４．上記溶解ペプチドが天然に存在する溶解ペプチドの合成類似物である、請求項1に記載のポリペプチド。５．上記溶解ペプチドがSEQ ID NO.: 1-91および97-98から選択される、請求項1 に記載のポリペプチド。６．ユビキチン-解ペプチド融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えDNA分子。７．上記5'融合ユビキチンペプチドをコードする配列が、SEQ ID NO.: 93のヌクレオチド残基921から1154を含む、請求項6に記載の組み換えDNA分子。８．上記3'融合溶解ペプチドをコードする配列が、SEQ ID NO.: 1-91および97-9 8のペプチドをコードするヌクレオチド配列から選択される、請求項4に記載の組み換えDNA分子。９．上記融合ユビキチンコード配列がその5'端でユビキチンプロモーターに連結された、請求項4に記載の組み換えDNA分子。 10．ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質をコードするDNA配列、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞で該DNA配列の発現を指示することのできるプロモーター配列を含む、発現ベクター。 11．上記ベクターのDNA配列がSEQ ID NO.: 93の配列を含む、請求項10に記載の発現ベクター。 12．上記ユビキチンプロモーターおよびユビキチンペプチド配列のDNA配列がヌクレオチドSEQ ID NO.: 96を含む、請求項10に記載の発現ベクター。 13．上記プロモーターが原核宿主細胞での発現を指示することのできる、請求項 10に記載の発現ベクター。 14．上記原核宿主細胞が大腸菌である、請求項10に記載の発現ベクター。 15．上記原核宿主細胞がAgrobacterium tumefaciensである、請求項10に記載の発現ベクター。 16．上記プロモーターが真核宿主細胞での発現を指示することのできる、請求項 10に記載の発現ベクター。 17．請求項10に記載の発現ベクターで形質転換された、ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質産生宿主細胞。 18．上記宿主が植物細胞である、請求項10に記載のユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質産生宿主細胞。 19．上記植物細胞がジャガイモ植物細胞である、請求項10に記載のユビキチン- 溶解ペプチド融合蛋白質産生宿主細胞。 20．ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質を宿主細胞中で発現させることを含む、溶解ペプチドの細胞での発現方法。 21．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質の発現がユビキチンプロモーターにより指示される、請求項20に記載の方法。 22．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質が真核細胞で発現される、請求項2 0に記載の方法。 23．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質が植物細胞で発現される、請求項2 2に記載の方法。 24．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質がジャガイモ植物細胞で発現される、請求項23に記載の方法。 25．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質が原核細胞で発現される、請求項2 0に記載の方法。 26．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質が大腸菌細胞で発現される、請求項25に記載の方法。 27．上記ユビキチン-溶解ペプチド融合蛋白質がAgrobacterium tumefaciens細胞で発現される、請求項25に記載の方法。