JP2015203013A - 融合蛋白質、その製造方法、及び融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明が提供する融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法は以下の工程を含む。融合蛋白質の配列はN端からC端にかけて順にTatペプチド、(His)6ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する。工程aでは、融合蛋白質を製造する。融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程bでは、Tatペプチドにより細胞外から前記細胞の細胞質中に融合蛋白質を導入する。抗原ペプチドを切り出す工程cでは、細胞質中のユビキチン蛋白質C端加水分解酵素により、融合蛋白質中から抗原ペプチドを切り出す。抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程dでは、細胞質中の小胞体の膜のTAP1/2輸送蛋白質により切り出された抗原ペプチドを小胞体内に輸送する。
【選択図】図2
Description
Tatペプチド、(His)6ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する融合蛋白質を製造する工程aを含む。
Tatペプチドにより細胞外から細胞の細胞質中に融合蛋白質を導入する「融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程b」を含む。細胞質中のユビキチン蛋白質C端加水分解酵素により融合蛋白質中から抗原ペプチドを切り出す「抗原ペプチドを切り出す工程c」を含む。細胞質中の小胞体の膜のTAP1/2輸送蛋白質により切り出された抗原ペプチドを小胞体内に導入する「抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程d」を含む。
本発明は、癌治療の研究にも応用可能である。細菌由来の抗原ペプチドをヒト細胞の小胞体に輸送した後、抗原ペプチドがヒト細胞のHLA―B27により細胞の表面に現れ、CD8+T細胞を活性化させ、細胞毒反応を引き起こす。故に本発明は、癌治療の研究分野に応用可能であり、本方法により特定の抗原ペプチドを癌細胞の中に導入すると、癌細胞のMHC Class I分子は、抗原ペプチドが輸送された細胞膜に現れ、この際、癌細胞は活性化されたCD8+T細胞に毒殺され、癌治療の効果を達成することができる。
図1から図3に示す融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法は、融合蛋白質100を製造する工程aを含む。融合蛋白質100の配列はN端からC端にかけて順にTatペプチド10、(His)6ペプチド20、ユビキチン蛋白質30、及び抗原ペプチド40を含有する、または、図2に示すように、順に(His)6ペプチド20、Tatペプチド10、ユビキチン蛋白質30、及び抗原ペプチド40を含有する。図3によると、抗原ペプチド40の配列はRRFKEGGRGGKYまたはRRYLENGKETLである。配列がRRFKEGGRGGKYである場合、抗原ペプチド40はクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis) のDNA primase由来であり、形成される融合蛋白質100はTHUC融合蛋白質100という。配列がRRYLENGKETLである場合、抗原ペプチド40は人間のHLA―B27重鎖由来であり、形成される融合蛋白質100はTHUB融合蛋白質100という。
10 Tatペプチド、
20 (His)6ペプチド、
30 ユビキチン蛋白質、
40 抗原ペプチド。
Claims (15)
- Tatペプチド、(His)6ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有する融合蛋白質を製造する工程aと、
前記Tatペプチドにより細胞外から前記細胞の細胞質中に前記融合蛋白質を導入する「融合蛋白質を細胞外から細胞質に輸送する工程b」と、
前記細胞質中のユビキチン蛋白質C端加水分解酵素により前記融合蛋白質中から前記抗原ペプチドを切り出す「抗原ペプチドを切り出す工程c」と、
前記細胞質中の小胞体の膜のTAP1/2輸送蛋白質により、切り出された前記抗原ペプチドを前記小胞体内に導入する「抗原ペプチドを小胞体に輸送する工程d」と、を含むことを特徴とする融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。 - 前記融合蛋白質の配列は、N端からC端にかけて順に前記Tatペプチド、前記(His)6ペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項1に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
- 前記融合蛋白質の配列は、N端からC端にかけて順に前記(His)6ペプチド、前記Tatペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項1に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRFKEGGRGGKYであることを特徴とする請求項1に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRYLENGKETLであることを特徴とする請求項1に記載の融合蛋白質により抗原ペプチドを小胞体に輸送する方法。
- Tatペプチド、(His)6ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有し、
前記抗原ペプチドは前記融合蛋白質のC端に位置すると共に前記ユビキチン蛋白質のC端に結合されていることを特徴とする融合蛋白質。 - 前記融合蛋白質の配列はN端からC端にかけて順に前記Tatペプチド、前記(His)6ペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項6に記載の融合蛋白質。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRFKEGGRGGKYであることを特徴とする、請求項6に記載の融合蛋白質。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRYLENGKETLであることを特徴とする、請求項6に記載の融合蛋白質。
- 前記融合蛋白質のcDNAを準備し、PCR法により前記cDNAをクローニングする工程1と、
前記cDNAクローンをベクターDNAに挿入し、形質転換によりベクターDNAを大腸菌細胞株中に導入し、前記大腸菌細胞株で前記cDNAからのタンパク質を発現し、前記融合蛋白質を大量に発現する工程2と、
前記大腸菌細胞株中の蛋白質を抽出する工程3と、
工程cで抽出した蛋白質を精製し、前記融合蛋白質を精製する工程4とを含むことを特徴とする融合蛋白質の製造方法。 - 前記融合蛋白質を精製する工程4において、Ni2+―Sepharoseカラムを使用して親和性クロマトグラフィーを行い、高速蛋白質液体カラムを使用して陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、精製することを特徴とする請求項10に記載の融合蛋白質の製造方法。
- 前記融合蛋白質は、Tatペプチド、(His)6ペプチド、ユビキチン蛋白質、及び抗原ペプチドを含有し、
前記抗原ペプチドは前記融合蛋白質のC端に位置すると共に前記ユビキチン蛋白質のC端に結合されていることを特徴とする請求項10に記載の融合蛋白質の製造方法。 - 前記融合蛋白質の配列は、N端からC端にかけて順に前記Tatペプチド、前記(His)6ペプチド、前記ユビキチン蛋白質、及び前記抗原ペプチドを含有することを特徴とする請求項12に記載の融合蛋白質の製造方法。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRFKEGGRGGKYであることを特徴とする請求項12に記載の融合蛋白質の製造方法。
- 前記抗原ペプチドのアミノ酸の配列はRRYLENGKETLであることを特徴とする請求項12に記載の融合蛋白質の製造方法。
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2014
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Non-Patent Citations (2)
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J. CLIN. INVEST., 1996, VOL.98, NO.12, PP.2764-2770, JPN6015025292, ISSN: 0003100840 * |
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