JPH09504166A - リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、融合タンパク質（これは次いで細胞質外へ輸送される）の発現を促進することにより、組換えポリペプチドの溶解度および活性を増大させるための手段として、リーダー配列を含まない融合パートナーを使用することに関する。本発明は、成熟インターロイキン-1-様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドおよび目的のポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸；ならびにこのような核酸を含む宿主細胞、およびそのようにコードされた融合タンパク質を包含する。本発明はまた、このような核酸を用いて組換え融合ポリペプチド、目的の成熟ポリペプチド、およびそれらの精製組成物を生成する方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現 発明の説明 技術分野 本発明は組換えタンパク質合成の分野に関する。特に、目的のポリペプチドが 、リーダー配列のない融合パートナーを含む融合ポリペプチドとして発現され、 ここで、融合パートナーは、融合ポリペプチドを宿主細胞の細胞質から分泌させ る。背景技術 遺伝子工学は、組換え発現系、特に、Escherichia coli（E．coli）のような 原核生物における発現により、クローン化DNAにコードされたポリペプチドを大 量に産生することを可能にした。宿主細胞によって全く産生されないか、または 限られた量しか産生されないこのいずれかの発現された異種ポリペチドは、宿主 細胞の全細胞ポリペプチドの重要部分を構成し得る。 しかし、いくつかの問題に頻繁に遭遇する。細菌細胞質に過剰に発現されたポ リペプチドは、不溶性の「偏在体」としてしばしば蓄積する（Williamsら、Scie nce 215:687-688,1982; Schonerら、Biotechnology 3:151-154，1985）。偏在体 形成は、細菌発現系に限らない。例えば、DrosophilaのKruppel遺伝子産物は、 バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞において産生された場合、偏在体を形 成し得る。偏在体の形態で蓄積したポリペプチドは、生物学的または生化学的ア ッセイにおけるスクリーニングの目的にとって、もしくは薬剤として比較的有用 でない。この不溶性物質を活性な可溶性ポリペプチドに変換するには、時間を要 する困難な可溶化および再生プロトコールが要求され、これによってしばしば生 物学的に活性なポリペプチドの正味の収量が大幅に減少する。 異種ポリペプチドが可溶形態で細菌の細胞質に発現された場合でさえ、それら は宿主プロテアーゼによる分解の結果のためにあまり蓄積しないことが多い。さ らに、蓄積されたポリペプチドは、所望のアミノ末端とは異なるアミノ末端をし ばしば有する。 これらの問題に対する１つのアプローチは、目的のポリペプチドを、lacZおよ びtrpE遺伝子産物（Goeddelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA. 76:106-110，197 9; Furmanら、Biotechnology 5:1047-1051,1987）；マルトース結合ポリペプチ ド(Di Guanら、Gene 67:21-30，1988)；グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(J ohnson，Nature 338:585-587，1989)；ユビキチン(Millerら、Biotechnology 7: 698-704，1989);またはチオレドキシン（LaVallieら、Biotechnology 11:187-19 3，1993）のようなポリペプチド融合パートナーと融合することである。しばし ば融合パートナーは、特に組換え宿主が生育に最適な温度より低い温度で培養さ れる場合、目的のポリペプチドに高溶解性のような所望の特性を付与する(LaVal lieら、1993，前出)。しかし、低温培養は、その方法を商業的規模で行うのを好 ましくないものにするその他の実際上の問題を生じる。 ポリペプチド融合物の使用はまた、組換え宿主に効率的に蓄積するには小さす ぎるポリペプチドを産生させる（Schultzら、J．Bacteriol. 169:5385-5392，19 87）。さらに、適切な融合パートナーは、例えば親和性ペプチドとして作用し、 その他の数百のポリペプチドを含有する細胞抽出物由来の融合ポリペプチドの回 収および精製を容易にする（例えば、WO 91/11454参照）。 しかし、融合ポリペプチドを使用することには欠点がある。酵素または化学的 手段によって、融合パートナーから所望のポリペプチドを切断する必要がある場 合が多い。これは、融合パートナーの配列と所望のポリペプチドの配列との間に 切断のための適切な標的配列を配置することによって行うことができる。残念な ことに、ポリペプチド切断に最も広く使用されている酵素は、高価であり、非効 率的、すなわちそれらの切断が不正確であるため、多数の融合構築物に常に適用 できるわけではない。例えば、エンテロキナーゼおよびＸａ因子は非常に特異的 なエンンドプロテアーゼであるが、これらの哺乳動物酵素は製造に費用がかかり 、そして原核生物宿主細胞に発現される目的のポリペプチドを、哺乳動物酵素で 処理する前に宿主細胞から単離しなければならないので、大量生産のためにはさ らにかなりの費用を要する。さらに、酵素が基質を切断するときの効率および特 異性は、高い可変性である。例えば、酵素様ズブチリシンは製造が比較的安価で あるが、それが基質を切断する精度が、現在の「Good Manufacturing Practices 」 （ＧＭＰ）において、商業規模の製造法として決して許容されない。 いくつかの酵母ユビキチンヒドロラーゼには、ユビキチンが融合パートナーで あり、そして切断部位の直ぐ下流のアミノ酸がプロリンでない融合物を効率的に 切断するものがある（Millerら、前出，1989; TobiasおよびVarshavsky，J．Bio l．Chem. 266:12021-12028，1991; WO 88/02406およびWO 89/09829も参照）。酵 母Saccharomyces cerevisiae（S．cerevisiae）からクローン化されたユビキチ ンヒドロラーゼ遺伝子の１つであるＹＵＨ-１（Millerら、前出 1989）は、下流 ポリペプチドが約25kDよりも大きい融合物を効率的に切断しない。もう１つのS. cerevisiaeユビキチンヒドロラーゼ遺伝子（TobiasおよびVarshavsky，J．Biol. Chem. 266:12021-12028，1991）は、切断部位の下流のポリペプチドが130kD程度 の大きさのユビキチン融合物を切断することができる。両方のユビキチンヒドロ ラーゼは、E．coliの細胞内に発現された場合に活性になり、これによってイン ビボで融合物を切断するのに使用され得るものとなる。しかし、ユビキチンを融 合パートナーとして使用することは、ユビキチン融合構築物を有する多コピープ ラスミドが、例えばE．coli宿主細胞の増殖を遅らせ、生存度を損なうという事 実により勧められない。 融合ポリペプチドの細胞質蓄積は、異種ポリペプチド部分が細胞質の強い還元 環境下で正しく折りたたむことができないことがあり、そのために生物学的に活 性なポリペプチドの収量が低くなるという欠点を有する。この問題を克服するた めに、目的のポリペプチドを、分泌（すなわち、非細胞質部位に輸送する）のた めの前駆体ポリペプチドのアミノ末端に存在する短い（15〜30アミノ酸）配列で ある「シグナルペプチド」に融合し得る。E．coliにおいて、そのような位置は 、内膜、細胞周辺腔、細胞壁、および外膜を含む。代表的には、細胞質外へのポ リペプチドの輸送の直前または輸送の間のある時点において、シグナル配列が宿 主酵素によって除去されて、「成熟」ポリペプチドを産生する。シグナル配列が 宿主酵素によって除去されて、「成熟」ポリペプチドを産生するこれらの場合に おいて、シグナル配列はまた「リーダーペプチド」として公知である（グラム陰 性細菌における一般分泌経路についての最近の概説、およびリーダーペプチドに 関する議論については、Pugsley，Microbiol．Rev. 57:50-108，1993を参照）。 発現ポリペプチドの細胞周辺腔への局在は、「浸透ショック法」およびその他 の技法を含むポリペプチドの簡単な回収法を使用することができるので、有益で ある。リーダー配列を用いて、異種ポリペプチドをE．coliの細胞周辺腔に送達 し得るが、ポリペプチドがこの方法によって可溶形態で効率的に蓄積することは ほとんどない。内膜の脂質２重層を横切るポリペプチドのトランスロケーション は非効率的であると考えられ、特に異種ポリペプチドに連結しているリーダー配 列を含む融合物の場合においてそうである。 本来、リーダー配列を有していない数種のポリペプチドのみが、浸透ショック または凍結解凍プロトコールによる処理時にそれらが細胞から選択的に放出され ることによって示されるように、非細胞質（または細胞周辺）位置へ分泌される 。これらは、チオレドキシン（LunnおよびPigiet，前出，1982）および延長因子 Ｔｕ（ＥＦ-Ｔｕ）（Jacobsonら、Biochemistry 15:2297-2302，1976）を含む。E．coli で発現するIL-1-βは、改変浸透ショック法によって抽出されている（Jo seph-Liauzunら、前出，1990）。 細胞外局在もまた有効であり、そして少なくとも２つの異なる戦略によって達 成され得る：（１）外膜を透過性にし、細胞周辺ポリペプチドを「漏出」させる （米国特許第4,595,658号;Katoら、Gene 54:197-202，1987）；および（２）細 胞外輸送を導く配列への融合（Nagahariら、EMBO J. 4:3589-3592，1985；米国 特許第5,143,830号）。しかし、これらの方法は多くの場合に機能しない；たと え機能したとしても、その方法は一般に非効率的であり、そして、しばしば所望 のアミノ末端を有するポリペプチドを産生しない（Hollandら、Biochimie 72:13 1-141，1990）。 融合ポリペプチドの構築において、理想的な融合パートナーとは、組換え宿主 細胞、例えばE．coli中で、最適な生育温度で、多種の異種ポリペプチドを産生 するのに有用なものである。好ましくは、そのような融合パートナーは、細胞位 置で可溶な活性形態の所望のポリペプチドの蓄積を高め、その位置でそれは、例 えば、タンパク質分解から保護され、融合ポリペプチドが単純な方法で回収する ことができる。そのような融合パートナーが、効果的、安価、およびインビボに おいて正確な切断系の使用を可能にするのであれば、さらに有益である。発明の開示 本発明は、成熟ポリペプチドまたはそのフラグメントから本質的になる融合パ ートナーを含む宿主細胞の細胞質から選択的に輸送される融合ポリペプチドに関 し、ここで該融合パートナーが任意のリーダー配列を有していない。特に、本発 明は、以下を含む融合ポリペプチドを包含する：（ａ）細胞質外輸送を導くこと ができ、成熟ポリペプチドの少なくとも１つのフラグメントからなる本質的に融 合パートナーであって、ここで該成熟ポリペプチドがインターロイキン１様ポリ ペプチドおよびリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドからなる群から 選択される；および（ｂ）目的のポリペプチド、ここで目的のポリペプチドが該 融合パートナーのカルボキシ末端に対して遠位に位置する。好ましくは、本発明 の融合ポリペプチドはさらに、該融合パートナーと該目的ポリペプチドとの間に 位置するリンカーペプチドを含む。最も好ましくは、該リンカーペプチドは、切 断部位、例えば、ユビキチンヒドロラーゼによって切断する部位を含む。 本発明の融合ポリペプチドは、多種の宿主細胞中、例えばE．coli中で、可溶 性、活性、および回収容易な形態で、宿主細胞の生育にとって生理学的に最適な 温度またはそれに近い温度において産生され得る。種々の目的のポリペプチドが 、この様式で産生され得、ポリペプチドは酵素、成長因子、単鎖抗体、DNAまた はRNA結合タンパク質、膜レセプター、およびそれらのフラグメントを包含する 。 また本発明に含まれるのは、核酸、好ましくは本発明の融合ポリペプチドをコ ードする発現ベクター、およびそのような核酸を含む宿主細胞である。好ましく は、そのような宿主細胞はさらに、宿主細胞の細胞質中にタンパク質分解酵素を 発現することができる核酸を含み、このタンパク質分解酵素は融合ポリペプチド 中、好ましくはリンカー中に、切断部位を特異的に認識する。そのような系は融 合ポリペプチドのインビボでの切断に有用であり、特に、ユビキチンヒドロラー ゼが同時発現されて融合パートナーと目的のポリペプチドの間に位置するリンカ ー内に位置する適合性切断部位で融合ポリペプチドを切断する場合に有用である 。 これらの形質転換宿主細胞は、融合ポリペプチドとしての目的のポリペプチド の組換え産生に有用であり、また、好ましくは目的のポリペプチドから、融合ポ リペプチドの他の配列、例えば、IL-1様ポリペプチド、リーダー欠失トランスロ ケーションポリペプチド、およびリンカーを切断して除くために、インビボでの 切断を用いる。 本発明はさらに、本発明の核酸によってコードされる本発明の実質的に精製さ れた融合ポリペプチドの産生方法を含み、この方法は以下の工程を包含する：（ ａ）該融合ポリペプチドをコードする該核酸を宿主細胞に導入し、それによって 形質転換宿主細胞を産生する工程；（ｂ）該融合ポリペプチドを発現させるのに 適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、それによって該融合ポリペプチド を発現する工程；および（ｃ）該融合ポリペプチドを精製し、それによって実質 的に精製された融合ポリペプチドを得る工程。 本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプチドを産生する方法を含 み、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）切断部位を含むリンカーペプチド を含む本発明の融合ポリペプチドの１つをコードする本発明の核酸を、宿主細胞 に導入し、それによって形質転換宿主細胞を産生する工程；（ｂ）該融合ポリペ プチドを発現させるのに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、それによ って該融合ポリペプチドを発現する工程；（ｃ）該融合ポリペプチドを、切断部 位を認識するタンパク質分解酵素または切断剤で切断し、これによって該目的の ポリペプチドを産生する工程；および（ｄ）該目的のポリペプチドを精製し、そ れによって実質的に精製された目的のポリペプチドを得る工程。 本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプチドの産生方法を含み、 この方法は以下の工程を包含する：（ａ）切断部位を含むリンカーペプチドを含 む本発明の融合ポリペプチドの１つをコードする本発明の核酸を、宿主細胞に導 入し、ここで、該宿主細胞がさらに、該切断部位を特異的に認識するタンパク質 分解酵素を該宿主細胞中に発現させることができる核酸を含み；それによって形 質転換宿主細胞を産生する工程；（ｂ）該融合ポリペプチドおよび該タンパク質 分解酵素を発現させるのに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、それに よって該融合ポリペプチドを発現させ、該融合ポリペプチドのインビボでの切断 を引き起こし、該目的のポリペプチドを産生する工程；および（ｃ）該目的のポ リペプチドを精製し、それによって実質的に精製された目的のポリペプチドを得 る工程。 本発明はさらに、実質的に精製された目的のポリペプチドの製造方法を含み、 この方法は以下の工程を包含する：（ａ）切断部位を含むリンカーペプチドを含 む本発明の融合ポリペプチドの１つをコードする本発明の核酸を、宿主細胞に導 入し、それによって形質転換宿主細胞を産生する工程；（ｂ）該融合ポリペプチ ド発現させるのに適切な条件下で該形質転換宿主細胞を培養し、それによって該 融合ポリペプチドを発現する工程；（ｃ）該融合ポリペプチドを精製し、それに よって実質的に精製された融合ポリペプチドを産生する工程；（ｄ）該実質的に 精製された融合ポリペプチドを、該切断部位を認識するタンパク質分解酵素また は切断剤で切断し、それによって該目的のポリペプチドを産生する工程；および （ｅ）該目的のポリペプチドを精製し、それによって実質的に精製された目的の ポリペプチドを得る工程。図面の簡単な説明 図１は、IL-1様タンパク質ファミリーの５つのメンバーの配列のならびを示す ：（１）E．coli DsbA、（２）ヒトIL-1-β、（３）ヒトIL-1-α、（４）ヒト塩 基性線維芽細胞増殖因子（FGF）、および（５）ヒト酸性FGF。 図２は、E．coli DsbA、ヒトIL-1-β、ヒトIL-1-α、ヒト塩基性線維芽細胞増 殖因子（FGF）の成熟ポリペプチドと、Vibrio choleraeの毒素と同時調節される 繊毛（toxin coregulated pilus）（TcpG）ポリペプチドとの間の相同性を要約 している。各成熟ポリペプチドのサイズが括弧内に示されている。 図３は、IL-1-βが発現される37℃で増殖させたE．coli細胞由来画分のクーマ シー染色SDS-PAGEゲルを示す。Ａ：時間０（０'）における全細胞溶解物（「WCL 」）；Ｂ：120分（120'）でのWCL；Ｃ：TEX抽出物；Ｄ：「細胞質」画分；Ｅ： 「不溶性」画分。各ゲルに対して、レーン１は野性型IL-1β、レーン２はIL-1β の３種の変異体R4A、L6A、R11G、およびレーン３はIL-1βの３種の変異体R4D、L 6A、R11G。野性型または各場合における変異体IL-1βの予想されるサイズは約17 kD（●）である。 図４は、E．coli DsbAを発現するE．coli細胞由来の画分のSDS-PAGEを示す。 （ａ）成熟DsbAを発現する細胞からの、０'、60'、および120'におけるWCL；（ ｂ）「変異体」DsbAを発現する細胞からの、０'、60'、および120'におけるWC L；（ｃ）成熟DsbAを発現する細胞からのTEX抽出物（「Ｔ」）および「細胞質」 （「Ｃ」）画分；（ｄ）「変異体」DsbAを発現する細胞からの「Ｔ」および「Ｃ 」画分。発現されるポリペプチドの予想サイズは約22kD（●）である。 図５は、IL-1様タンパク質と、ヒトIGF-ＩまたはII型TGF-βレセプターの可溶 性細胞外ドメインとの種々の融合が発現されたE．coli細胞由来の画分のSDS-PAG Eゲルを示す。左：（１）IL1β-IGF（pDM16963）、予想サイズ約24〜25kD；（２ ）IL1β-Ubi-IGF（pDM16965）、予想サイズ約32kD（●）；（３）DsbA-Ubi-IGF （pYZ22070）、予想サイズ約37kD（●）；および（４）DsbA-Ubi-TGFR（pDM1542 8）、予想サイズ約46kD（●）についての0'および120'でのWCL。右：４つの融合 ポリペプチドに対するTEXおよび「細胞質」（「CYT」）画分。２つの点がある場 合、下の点は、大きいポリペプチドの低分子量分解生成物を表す。 図６は、その天然のシグナル配列が欠失したヒトIL-1-レセプターアンタゴニ ストを発現するE．coli細胞からの画分のSDS-PAGEを示す（pDM15424）。左：０' および120'におけるWCL；右：TEX（「Ｔ」）および「細胞質」（「Ｃ」）画分（ 「FXN」）。予想生成物は約18kDのサイズを有する。 図７、左は、予想サイズ約20kDのユビキチン-TGF-β２融合ポリペプチドをコ ードするpDJ16920、または予想サイズ42kDのDsbA-ユビキチン-TGF-β２融合をコ ードするプラスミドpYZ22096で形質転換されたE．coli細胞からの０'および120' におけるWCL、および可溶性（「Ｓ」）および不溶性（「Ｉ」）画分のSDS-PAGE ゲルを示す。 図８、左は、予想サイズ約15kDのユビキチン-IGF融合物を発現するpDJ16927、 または予想サイズ約32kDのIL-1-β-ユビキチン-IGFを発現するpDM16965で形質転 換されたE．coli細胞からの０'および120'におけるWCL、および可溶性（「Ｓ」 ）および不溶性（「Ｉ」）画分のSDS-PAGEゲル。図８、右は、予想サイズ約37kD のDsbA-ユビキチン-IGFをコードするpYZ22070、または予想サイズ約37kDの、Dsb Aがその天然シグナル配列を有するDsbA-ユビキチン-IGFをコードするpDM15426で 形質転換されたE．coli細胞の抽出物の同様のゲルを示す。 図９は、IGFBP-3への融合を発現するE．coli細胞の画分のSDS-PAGEゲルを示す 。パネル［ｉ］：予想サイズ約38kDのユビキチン-IGFBP-3融合物をコードするpD J1 2875を発現するE．coli細胞の０'および120'におけるWCLおよび「可溶性」（「 Ｓ」）および不溶性（「Ｉ」）抽出物；パネル［ii］：予想サイズ約55kDのIL-1 -ユビキチン-IGFBP-3（pDM16967）；および［iii］：予想サイズ約60kDのDsbA- ユビキチン-IGFBP-3（pDM15427）。 図１０、パネル［ｉ］は、予想サイズ約24kDのユビキチン-TGF-βＲ融合物（P DJ16921）を発現するE．coli細胞からの０'および120'におけるWCLおよび「可溶 性」（「Ｓ」）および不溶性（「Ｉ」）画分のSDS-PAGEゲルを示し；パネル［ii ］は予想サイズ約46kDのDsbA-ユビキチン-TGF-βR融合物（pDM15428）を示す。 図１１ＡおよびＢは各々、30℃で増殖させたDsbA-ユビキチン-IGFおよびユビ キチン-IGF構築物の培養物由来のユビキチンヒドロラーゼ切断IGF-ＩのHPLC逆相 溶離プロフィルである。ＣおよびＤは各々、37℃で増殖させたユビキチンヒドロ ラーゼ切断DsbA-ユビキチン-IGFおよびユビキチン-IGFを示す。IGFピークの比活 性を、箱で囲った値（任意単位）で示す。 図１２は、¹²⁵Ｉ放射性同位元素標識TGF-β１で架橋された部分的に精製され たTGF-βＲ（136アミノ酸細胞外ドメイン、pDM15428）のSDS-PAGEゲルを示す。 予想される架橋生成物のサイズは約30kDである。左（−）：非付加の非放射性TG F-β１。右（＋）：過剰の非放射性TGF-β１（2500倍モル） 図１３は、（１）DsbA-ユビキチン-IGFBP-3融合物をコードするpDM15427；（ ２）ユビキチン-IGFBP-3融合物をコードするpDJ12875；または（３）pDJ12887、 「ベクターのみ」の対照、を発現するE．coli細胞の粗抽出物（「可溶性」画分 ）の結合活性を測定するための¹²⁵Ｉ-放射性同位元素標識IGF-Ｉを用いたドット -ブロットアッセイの結果を示す。サンプルは未処理（−ＵＨ）またはユビキチ ンヒドロラーゼで切断した（＋ＵＨ）。 図１４は、IL-1-β-IGFBP-3をコードするpDM15430(「ILI-BP3」)、またはベク ターのみ（「ベクター」）を一時的にトランスフェクトしたCOS細胞由来の架橋 サンプルのSDS-PAGEゲルを示し、架橋サンプルをエンドグリコシダーゼＦで処理 する（＋）または処理なし（−）、および「非放射性」IGFとの競合ありまたは なしである。図の右側は、55kD融合ポリペプチド（Ｘ）、天然のグリコシル化IG F結合タンパク質（Ｙ）、および天然の脱グリコシル化IGF結合タンパク質（Ｚ） に対する標識である。 図１５は、プラスミドpDM15486、pDM25492、pDM46805およびpDM46806がW3110D E3に導入されたときの、それらのプラスミドによって発現されるタンパク質を示 す。図１５のパネル「Ａ」および「Ｂ」は各々、pDM25492およびpDM46805を有す る株の音波処理後の、TEX抽出物（Ｔ）および残りの可溶性画分（Ｓ）を示して いる。IGF-Ｉ融合構築物、pDM15486およびpDM46806に対応するサンプルを、図１ ５のパネル「Ｃ」および「Ｄ」に示す。DsbCタンパク質の予想位置を、各々の場 合において矢印で記す。 図１６は、プラスミドpDM15486、pDM25492、pDM46805およびpDM46806を、実施 例１０における構築物に対して記載したように試験したとき、それらによって発 現されるタンパク質を示す。パネル「Ａ」および「Ｂ」は、pYZ9206（リーダー 欠失DsbA）およびpDM25452（リーダー欠失ミニ-DsbA）の比較を示している。各 々の場合において、誘導サンプルは、TEX（Ｔ）、残りの可溶性（Ｓ）、および 不溶性（Ｉ）画分に分画された。パネル「Ｃ」はpDM25499で得られた結果を示す 。 図１７は、プラスミドpYZ22055、pDM25450、pDM25453およびpDM15449によって 発現されたタンパク質を分析したときに得られた結果を示す。各パネルにおける レーン「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」および「Ｄ」は、pYZ22055、pDM25450、pDM15499 およびpDM15457に対応する抽出物をロードした。１３マーのビオチン化基質ペプ チドを発現する２つの構築物（pDM25450およびpDM15457）は、ウエスタンブロッ ト上に明瞭なポジティブシグナルを提供するが、対照は提供しない。 図１８は、pDM15449（パネル「Ａ」）またはpDM25466（パネル「Ｂ」）を有す る誘導細胞から採取されたサンプルの分画を示す。 図１９Ａは、融合タンパク質の発現およびそのTEX（Ｔ）および残りの可溶性 （Ｓ）画分への部分的分画を示す。 図１９Ｂは、両方の精製された画分が、DNA結合活性を示すことを示している 。 図２０は、天然のdsbA（リーダーを持つ）ビオチン化ペプチドに対する核酸配 列（プラスミド25453）を示す。 図２１は、リーダーのないdsbA（３'改変）-ビオチン化ペプチドに対する核酸 配列（プラスミド25450）を示す。 図２２は、リーダーのないdsbA（３'改変）-hubi（de145）．IGF．newに対す る核酸配列（プラスミド25477）を示す。 図２３は、リーダーのないdsbA（３'改変）-hubi．IGF．newに対する核酸配列 （プラスミド41620）を示す。 図２４は、天然のdsbAに対する核酸配列（プラスミド9205）を示す。 図２５は、リーダーのないdsbC（３'改変）Ｃ＞Ｓ変種に対する核酸配列（プ ラスミド46805）を示す。 図２６は、リーダーのないdsbAに対する核酸配列（プラスミド9206）を示す。 図２７は、リーダーのないdsbA（３'改変）に対する核酸配列（プラスミド220 55）を示す。 図２８は、リーダーのないミニ-dsbA（３'改変）に対する核酸配列（プラスミ ド25452）を示す。 図２９は、リーダーのないdsbA（３'改変）^-y．ubi．IGF．oldに対する核酸配 列（プラスミド22070）を示す。 図３０は、リーダーのないdsbC（３'改変）-hubi．IGF．newに対する核酸配列 （プラスミド25498）（ベクターpUC18）を示す。 図３１は、リーダーのないdsbC（３'改変）Ｃ＞Ｓ変種-IGF1（new）に対する 核酸配列（プラスミド46806）を示す。 図３２は、リーダーのないdsbC（３'改変）-IGF１（new）に対する核酸配列（ プラスミド15486）を示す。 図３３は、リーダーのないdsbC（３'改変）に対する核酸配列（プラスミド254 92）を示す。 図３４は、成熟ヒトインターロイキン１β（３'改変）-IGF（old）に対する核 酸配列（プラスミド16963）（ベクターpBR322）を示す。 図３５は、成熟ヒトインターロイキン１βに対する核酸配列（プラスミド1215 1）（ベクターpBR322ｐ）を示す。 図３６は、成熟ヒトインターロイキン１β（３'改変）に対する核酸配列（プ ラスミド15449）を示す。 図３７は、ヒトインターロイキン１β Ｒ１１Ｇ変異体（３'改変）に対する 核酸配列（プラスミド25466）を示す。 図３８は、インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（３'改変）-IGF（ new）に対する核酸配列を示す。 図３９は、リーダーのないインターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（ ３'改変）に対する核酸配列（プラスミド15424）を示す。 図４０は、成熟ヒトインターロイキン １β（３'改変）-yubi．IGF．oldに対 する核酸配列（プラスミド16965）を示す。 図４１は、ミニ-dsbA（３'改変）-hubi（de145）．IGF．newに対する核酸配列 （プラスミド25499）を示す。 図４２は、リーダーのないミニ-dsbA（３'改変）-hubi．IGF．newに対する核 酸配列（プラスミド25485）ベクターpUC18）を示す。本発明の実施態様 インターロイキン-１様のポリペプチド（「IL-1様ポリペプチド」）、リーダ ー欠失トランスロケーションポリペプチド、またはそのフラグメントを含む融合 パートナーに融合されたときに、広範囲のポリペプチドが、宿主細胞増殖にとっ て生理学的に最適な温度またはそれに近い温度において、可溶性の、活性な、回 収容易な形態で、種々の宿主細胞において大量に蓄積される。所望であれば、目 的のポリペプチドを、インビボまたはインビトロのいずれかで、効率的かつ安価 にインターロイキン-１様ポリペプチドから切断し得る。インターロイキン-１様 ポリペプチドおよびリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドの両方が、 E．coli、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む原核細胞および真核細胞の 両方で広汎な種類の異種ポリペプチドの発現のための一般的な融合パートナーと して有用である。 インターロイキン-１-β（IL-1-β）は、シグナル配列を欠く天然に分泌され るポリペプチドの特有なクラスの１つである（Mueschら、TIBS，1990年3月、pp. 86-88,1990）。このクラスのメンバーは、細菌からヒトに至る広汎な種で見い出 され得る。哺乳動物の単核細胞において、細胞質からのIL-1-β輸送が、一般の 分泌経路から独立していることが示されている(Rubartelliら、EMBO J. 9:1503 -1510，1990; Singerら、J．Exp．Med. 167:389-407，1988; およびRubartelli ら、J．Biol．Chem. 267:24161-24164、1992もまた参照)。 IL-1-βは、アミノ末端シグナルペプチドまたは内部シグナル配列として機能 し得る顕著に疎水性の領域を含んでいないが、IL-1-βに対する遺伝子がE．coli 宿主細胞で発現されると、IL-1-βポリペプチドが、細胞を溶解することなく浸 透ショックによって宿主細胞から放出され得る（Joseph-Liauzunら、Gene 86:29 1-295，1990）。さらに、アミノ末端メチオニンを含むIL-1-β（Met-IL-1-β） は、酵母細胞によって分泌される（Joseph-Liauzunら、前出，1990における報告 G.P．Livi私信）。 哺乳動物単核細胞においては、IL-1が細胞質膜と相互作用し、小胞を形成し、 小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体を通過せずに分泌されると考えられている。この 特性のために、ポリペプチド上の共通のグリコシル化部位が、グリコシル化され ずに残る。しかし、切断可能なシグナル配列がそのアミノ末端に連結している場 合には、IL-1-βのグリコシル化が起こる（Baldariら、EMBO J. 6:229-234，198 7）。従って、融合パートナーとしてのIL-1様ポリペプチドの使用は、哺乳動物 細胞における非グリコシル化ポリペプチドの産生を可能にし得る。この特長は、 目的のポリペプチドのグリコシル化が望ましくない場合に特に重要である。例え ば、ヒトタンパク質が他の哺乳動物細胞中で合成されるとき、異なるグリコシル 化が起こり得、そしてヒト受容者に対して抗原性であり得る。このことは、ヤギ またはヒツジのようなトランスジェニック動物において、ヒトの治療剤として有 用なポリペプチドを発現させることに関心を持つ者にとって主要な領域である。 さらに、IL-1様ポリペプチドによって使用される細胞質からの輸送の代替ルー トはＥＲを避けるので、遊離のスルフヒドリル基を持つポリペプチド、例えば、 bFGF、PD-ECGF、およびADF（Takahashiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 83:80 19-8023,1986）を、IL-1様ポリペプチドへの融合物として発現することが有利で あり得る。なぜなら、IL-1様融合物はＥＲ内腔の酸化環境を避けるからである。 また、IL-1様融合物は、脂質２重層を通過してトランスロケーションすること なく分泌されるようである。従って、一般分泌経路を経由して通常分泌され得な い異種ポリペプチドとのIL-1様融合物を使用することによって、これらのポリペ プチドの細胞質からの輸送を可能にする。例としては、脂質２重層の通過を妨害 し得る長い疎水性またはその他の配列を含むポリペプチドが含まれるか、それら に限定されない。 本発明の目的にためには、「インターロイキン-１様」（または「IL-1様」） ポリペプチドは、実質的に成熟ヒトインターロイキン-１-βの三次元構造と類似 の三次元構造により特徴付けられるポリペプチドまたはその機能的フラグメント である（Priestleら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 86:9667-9671，1989）。目 的のポリペプチドに融合されると、そのようなIL-1様ポリペプチドはまた、その 融合ポリペプチドを細胞質から専用の細胞区画へ輸送することができ、その細胞 区画では融合ポリペプチドは可溶性であり、そして生物学的に活性であるが、タ ンパク質分解からは保護される。 実際上、成熟IL-1-βは比較的小さく（約17kD）、そして安定である。それは 大きな不活性前駆体として合成され、後に切断されて153アミノ酸長さの成熟ポ リペプチドを放出する。成熟IL-1-βは特に安定な構造（円筒構造を形成するた めの３つの折りたたみ対称軸のまわりに並んだ３つの類似単位によって特徴付け られる、いわゆるβ-三つ葉折りたたみ）を持ち、各単位は２対の逆平行βスト ランドを含む（Priestleら、前出，1989）。このβ-三つ葉折りたたみは、αヘ リックスを含まない構造であり、その構造が一部を成す融合ポリペプチドの全体 構造を安定化させる機能を果たし得る。β-三つ葉折りたたみ構造をもつファミ リーのメンバーは、以下を含むがそれらに限定されない：IL-1-αおよびIL-1-β ；繊維芽細胞増殖因子（FGF）のメンバー、例えば、酸性FGFおよび塩基性FGF、i nt-2、hst/KS3、FGF-5、FGF-6、およびケラチノサイト増殖因子（Zhangら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA. 88:3446-3450，1991; Zhuら、Science 251:90-93，19 91）を含む；ヒサクトフィリン（hisactophilin）（Habazettlら、Nature 359:8 55-857，1992）；およびダイズトリプシンインヒビター（Wolfsonら、Biochemis try 32:5327-5331，1993）。McDonaldおよびHendrickson，Cell 73:421-424，19 93）もまた参照。 β-三つ葉構造を持つポリペプチドは、もしそれらがIL-1のように、目的の融 合ポリペプチドを細胞質から専用の細胞区画（そこから、それが例えば選択的な 抽出手順によって、活性な形態で容易に放出され得る）へ輸送し得るのであれば 、IL-1様ポリペプチドであると考えられる。従って、β-三つ葉構造の存在は、 可能な融合パートナーがインターロイキン-１様ポリペプチドであることを示す ために使用され得る。例えば、リーダー配列を欠く塩基性FGFは、IL-1-βのため のプロセスと類似のプロセスによって、細胞から分泌されることが知られている （Abrahamら、Science 233:545-548，1986）。 「IL-1様ポリペプチド」は、成熟ポリペプチドおよびその機能的フラグメント のみを含み、それは：（ａ）von Heijneの方法によって認識され得るアミノ末端 リーダー配列を欠き（Nucl．Acids，Res. 14:4683-4690，1986）；（ｂ）最適に 並べられたときに成熟ヒトインターロイキン-１-β（IL-1-β）のアミノ酸配列 と少なくとも20％相同性であるアミノ酸配列を有し；および（ｃ）約20％以上の 融合ポリペプチドを専用の細胞区画へトランスロケーションし得る。IL-1様ポリ ペプチドが、アミノ末端リーダー配列を有する前駆体として天然に合成される場 合、成熟ポリペプチドに対応するDNA配列（すなわちリーダー配列を欠いている ）のみが、本発明の目的の「IL-1様ポリペプチド」をコードする核酸であると考 えられる。従って、本発明の「IL-1様ポリペプチド」は、インターロイキン-１ 遺伝子ファミリーのメンバーを含み、この遺伝子ファミリーには、ヒトおよび非 ヒトの種、例えばマウスおよびラット、からのインターロイキン-１-αおよび- β、ならびにインターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）（Eisen bergら、Nature 343:341-346，1990; Eisenbergら、Proc．Natl．Acad．Sci．US A, 88:5232-5236，1991）、およびE．coliおよび関連する細菌からのDsbAが含ま れる。 成熟E．coli DsbAポリペプチド（Bardwellら、Cell 67:581-589,1991; Kamita niら、EMBO J. 11:57-62，1992）およびその公知の細菌の相同体（Vibrio chole rae TcpG; PeekおよびTaylor，Proc．Natl．Acad．Sci．USA. 89:6210-6214，19 92、を含む）もまたこれらの基準によるIL-1様ポリペプチドの例である。DsbAは 通常、おそらくトランスロケーションの間に除去される１９アミノ酸のアミノ末 端リーダー配列によって、細胞周辺腔に分泌される。しかし、リーダーペプチド が単一のメチオンで置き換えられたDsbAポリペプチドの変種は、予期せぬ挙動を 示す：そのポリペプチドは細胞膜を横切るだけでなく、細胞膜を横切る輸送を実 際に増加させる。DsbAはまた、下記実施例に示すように、改良浸透ショック手続 、および細胞を溶解しないその他の単純化した方法によって、細胞から放出させ 得る。 図１はヒトIL-1-β DNAと短縮型dsbA遺伝子との間の配列類似性を示している 。ならびを最大にするために、dsbA配列の２つの領域（アミノ酸残基21-35およ び126-157に対応する）を比較から除外している。これらのセグメントのうちの 第１番目（21-35）は、「２重システイン活性部位ループドメイン」の例を含み 、これは他の酸化還元酵素の活性部位領域に対して部分的な相同性を示す（Bard wellら、前出，1991）。この相同の領域には他のクラスのIL-1様ポリペプチドは 存在せず、この領域が本発明のIL-1様ポリペプチドの特性に必ずしも必要ではな いことを示している。これらの２重システイン活性部位ループドメイン、例えば DsbAの残基21-35内に含まれるドメインは、インターロイキン-１様ポリペプチド またはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドのクラスに入る、任意の 酸化還元酵素を含む融合パートナーから除去（または置き換え）され得、そして 本発明の融合ポリペプチドの輸送に影響し得ない。 用語「インターロイキン」は、配列相同性および構造の見地から広範囲に異な る多数のタンパク質（今日までのところ26）を包含することに注目すべきである 。IL-1以外のインターロイキンは一般に、上記に定義したような「IL-1様ポリペ プチド」であるとは一般には考えられないであろう。 チオレドキシンは、IL-1様ポリペプチドであるとは考えられない。チオレドキ シン分泌は、IL-1様ポリペプチドの分泌にある局面では類似しており、その類似 点とは、E．coliチオレドキシンがリーダー配列を欠き、および哺乳動物チオレ ドキシンンがＥＲおよびゴルジ体を通らずに分泌されるように見えることである 。しかし、IL-1とチオレドキシンとの配列相同性は15％未満であり、それらの三 次元構造には明確な類似性がない。さらに、IL-1-βの分泌はチオレドキシンの それとは異なっている。例えば、ＣＯＳトランスフェクタントは、チオレドキシ ンを分泌するが、IL-1-βは分泌しない。さらに、活性化された単球において、 いくつかのIL-1-βが細胞内小胞に見い出されるが、その一方チオレドキシンは 小 胞のような膜で境界された区画には検出されず、このことは分泌されたチオレド キシン分子が原形質膜に直接輸送されることを示している（Rubartelliら、前出 ，1992）。チオレドキシンは、優先的に、接着ゾーンとしてE．coliの細胞質膜 の内部周縁のまわりの部位、またはバイヤーパッチ（Bayer's patche）（内部お よび外部細胞膜が融合しているペプチドグリカン細胞壁中の間隙がある部位）に 存在する。IL-1-βの分泌とチオレドキシンの分泌との間におけるこれらの観察 された違いは、これら２つのポリペプチドが異なる分泌経路を使用し得ることを 示す。 LaVallieら(前出，1993)は、融合パートナーとしてチオレドキシンの使用を提 案しているが、チオレドキシン融合物のいくつかは、それらを発現する細胞の増 殖温度が低下するにつれてより可溶性になる（LaVallieら、前出，1993）。 「リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド」は、成熟ポリペプチドお よびその機能的フラグメントのみを含み、それらは：（ａ）最初に翻訳されたと きに、それらの天然の状態においてアミノ末端リーダー配列を含むタンパク質に 由来し、そのアミノ末端リーダー配列は成熟タンパク質の形成において実質的に 切断され；そして（ｂ）融合ポリペプチドの約20％以上を専用の細胞区画へ輸送 し得る。リーダー欠失トランスロケーションポリペプチドが由来する全てのタン パク質は、アミノ末端リーダー配列を持つ前駆体として天然に合成されるが、成 熟ポリペプチド、即ち任意のリーダー配列を欠くペプチドに対応するDNA配列の みが、本発明の目的の「リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド」をコ ードする核酸であると考えられる。 従って、本発明の「リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド」は、E ．coliおよび関連する細菌のDsbAおよびDsbCタンパク質、ならびにヒトおよび非 ヒト種、例えば、マウスおよびラット、由来のインターロイキン-１レセプター アンタゴニスト（IL-1ｒａ）を含む（Eisenbergら、Nature 343:341-346，1990; Eisenbergら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA, 88:5232-5236，1991）。 その他のIL-1様ポリペプチドおよびリーダー欠失トランスロケーションポリペ プチドの同一性を測定することは、当業者により容易に実施され得る。IL-1様ポ リペプチドについては、20％の配列相同性の要求に合致するタンパク質は、スク リーニングされるべき活性（例えば、細胞質から輸送される）について先導候補 として供し得る。リーダー欠失トランスロケーションポリペプチドについては、 アミノ末端リーダー配列を持つ前駆体として天然に合成され、そしてペリプラズ ムのような専用の細胞区画へ天然に分泌されるタンパク質は、先導候補として機 能し、特に酸化還元酵素、そしてさらにはE．coliおよび関連する細菌のDsbタン パク質である。 本発明は、単一のIL-1様ポリペプチドまたは単一のリーダー欠失トランスロケ ーションポリペプチド由来の１つまたはそれ以上のフラグメントを持つ融合パー トナーを含む融合ポリペプチド、複数のIL-1様ポリペプチド、複数のリーダー欠 失トランスロケーションポリペプチド由来の融合パートナーを含む融合ポリペプ チドを含み、または本発明においては特に、両方のクラスのポリペプチド由来の フラグメントの組み合せが企画されている。さらに、本発明は特に、変異体IL-1 様ポリペプチドまたは変異体リーダー欠失トランスロケーションポリペプチドを 本発明の融合ポリペプチドの融合パートナーに使用することを含む。そのような 変異体は、欠失、アミノ酸の交換またはアミノ酸の付加を含み、特に、「インタ ーロイキン-1-βの生物学的活性」に関して欠陥がある」（野性型インターロイ キン-1-β生物学的活性の３％未満である）成熟インターロイキン-1-βの変異体 ポリペプチドフラグメントである。 選択された異種ポリペプチドのDNAに融合される、IL-1様ポリペプチドまたは リーダー欠失トランスロケーションポリペプチドのDNA配列を含む融合ポリペプ チド、もしくは目的のペプチドは、従来の遺伝子工学技術によって容易に構築さ れ得る。IL-1様ポリペプチドは好ましくは選択された異種ポリペプチドのアミノ 末端に融合されるが、選択されたポリペプチドをIL-1様ポリペプチド内の部位に 挿入することもまた適切であり得る。例えば、異種ポリペプチダーゼインヒビタ ー・ループが、IL-1-βの内部部位に挿入されている。Wolfsonら、前出，1993参 照。 融合ポリペプチドをコードする核酸は、IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠 失トランスロケーションポリペプチドを含む融合パートナー、および目的のポリ ペプチドに加えて、付加的アミノ酸をコードする付加的「リンカー」DNAを必要 に応じて含む。このリンカーペプチドは、融合パートナーと目的のペプチドとの 間に位置する。 リンカーペプチドは、多くの機能を提供し得る。第一に、リンカーはIL-1様ポ リペプチドと目的のポリペプチドとの間に特異的切断部位を提供し得る。そのよ うな切断部位は、例えば、Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、トロンビン、 またはズブチリシンエンテロキナーゼ、または、好ましくはユビキチンヒドロラ ーゼのようなタンパク質分解酵素のための標的、または、例えば臭化シアンまた はヒドロキシルアミンのような化学的「切断剤」のための標的を含む。 切断工程は、宿主細胞によって発現され、そしてリンカーペプチドのタンパク 質切断部位を特異的に認識するタンパク質分解酵素によって、インビボで実施さ れ得る。あるいは、切断工程は、融合ポリペプチドサンプル上で、宿主細胞物質 を除去する予備精製工程を経て、または経ずに実施され得、そしてそれに続いて 切断剤またはタンパク質分解酵素、および切断されたタンパク質フラグメント、 例えば、融合パートナーおよびリンカーを除去するための精製工程が実施され得 る。目的のペプチドを本発明の融合タンパク質から切断する方法、および種々の 関連する精製工程は、使用される切断剤またはタンパク質分解酵素に特異的であ り、そして当該技術分野において公知である。切断工程および精製工程の適切な 方法の例が、下記に記載されており、以下の実施例のセクションに例示されてい る。 リンカーはまた、融合ポリペプチドの他の細胞ポリペプチドからの精製を補助 するための「アフィニティータグ（affinity tag）」をコードし得る。例えば、 リンカーによってコードされる複数のヒスチジン残基は、融合ポリペプチドの精 製のための金属キレートアフィニティークロマトグラフィー法の使用を可能にす る。 リンカーはまた、IL-1様ポリペプチドと目的のポリペプチドとの間の融合ポリ ペプチド中の立体（stearic）妨害を防止するためのスペーサーとして供し得る 。リンカーが必要かどうかは、当業者に明かであるように、IL-1様ポリペプチド に融合される目的のポリペプチドの構造的および機能的特性に依存する。目的の ポリペプチドが天然に切断される場合、リンカーは必要とされない。融合ポリペ プ チド自体が切断なしで有用であり得る。 リンカーは、これらの目的の任意または全て、または別の機能、または所望さ れるような他の機能を供し得る。 同じ宿主細胞内の他の配列の存在下で、融合ポリペプチドを細胞質外空間へと 標的させるIL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペ プチドの能力（例えば、米国特許第4,595,658号に教示されるように、外膜の透 過処理後、ペリプラズムのポリペプチドを「漏出」させる）は、例えばE．coli が培養培地にポリペプチドをほとんど分泌しないため、融合ポリペプチドの精製 を単純化する。あるいは、下記実施例に示すように、適切な抽出緩衝液で融合ポ リペプチドを発現する細胞全体を単純に処理するだけで、大部分の細胞質ポリペ プチドまたは核酸を放出することなく融合ポリペプチドを選択的に放出し得る。 そのような選択的放出は、融合ポリペプチドの精製を非常に単純化する。 不安定または非常に不溶性であるペプチドを含む広範囲のポリペプチドを、本 発明のIL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチ ドとの融合物として、適切な発現系を用いることにより、原核動物細胞または真 核動物細胞中で発現させ得る。 要約すると、本発明は、IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケ ーションポリペプチドをコードする配列を含む核酸が、好ましくは発現ベクター 中で目的のポリペプチドに融合される方法および組成物を提供する。実施例にお いて、翻訳カップリング（Squiresら、J．Biol．Chem. 263:16297-16302，1988 ）によって改良されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで駆動される発現系（Studierお よびMoffat，J．Mol．Biol．189:113-130，1986）が、IL-1様ポリペプチド配列 がリンカーポリペプチド配列を介して異種ポリペプチドのアミノ末端に連結して いる融合ポリペプチドを大量に発現させるために利用された。異種ポリペプチド のいくつかの例が、２つの成長因子、２つの酵素、一本鎖抗体、結合ポリペプチ ド、および膜に広がるレセプターの細胞外ドメインを含むこの発現系の一般的特 性を示すために使用された。これらの実施例は、本発明の方法および組成物が、 特定の所望の治療用ポリペプチド、他の方法であれば細菌宿主細胞で低レベルで しか産生されない、例えば、IGF-Ｉの高レベルの可溶性発現を可能にすることを 示す。 本発明による融合ポリペプチドの産生は、所望の異種ポリペプチドの溶解度を 確実に改良し、かつ、所望のポリペプチドの活性なコンホメーションへの折たた みを促進することによって、および宿主細胞内の専用の区画へ融合ポリペプチド を偏在させることによって、または宿主細胞の細胞質からの輸送を生じさせるこ とによって、異種ポリペプチド産生物の安定性および蓄積を増加させる。 さらに、本発明は、ランダムなポリペプチドのライブラリーのスクリーニング を、それらの生物学的機能についてアッセイすることによって可能にする。IL-1 様ポリペプチドに融合されたとき、ランダムなポリペプチドは、可溶性、活性形 態で、保護された細胞区画に蓄積する。哺乳動物DNAを含む発現ライブラリーの 機能的スクリーニングは、所望のタンパク質機能が維持されているという保証が ないという事実によって束縛されてきた。この問題は、そのライブラリーの遺伝 子配列を、IL-1様ポリペプチドの配列を含む発現ベクターにクローン化し、それ によってライブラリーの配列がIL-1融合物として発現され得るようにすることに よって、容易に回避し得る。例えば、そのライブラリーで形質転換されたE．col i細胞のコロニーが、ナイロン膜のような固体支持体に移される。そこでその細 胞を穏やかに溶解して（例えば、Triton-X 100のような穏和な界面活性剤を使用 して）、発現された融合ポリペプチドを放出し、そしてその融合ポリペプチドが 、目的の遺伝子を持つクローンを同定する生物学的活性についてスクリーニング される。 さらに、本発明の融合ポリペプチドは、当業者に周知の方法によって、モノク ローナル抗体を含む抗体を開発するために使用され得る。ポリペプチド 通常、本発明のIL-1様ポリペプチドは、天然のヒトIL-1-βポリペプチドに対 して少なくとも約20％の相同性であり、好ましくは少なくとも40〜60％、より好 ましくは少なくとも約95％の相同性である。IL-1の特徴的な三次元構造を共通に 所有していることは必要ではないけれども、そのような相同は「実質的に相同で ある」と考えられ、IL-1様ポリペプチドを同定するために使用され得る。 ポリペプチドの相同性は、代表的には、Genetics Computer Group，Universit y of Wisconsin Biotechnology Center(1710 University Avenue，Madison，WI 53705)のSequence Analysis Software Packageのような配列分析ソフトウエアを 用いて分析される。ポリペプチド分析ソフトウエアは、種々の置換、欠失、置換 、およびその他の改変に帰する相同性の測定値を用いて類似配列にマッチさせる 。保存的な置換は、代表的には、以下の群の中の置換を含む：グリシン、アラニ ン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパ ラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニ ルアラニン、チロシン。 IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドの 「フラグメント」は、実質的にその機能的特性を保持している、完全長のIL-1様 またはリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドの一部である。すなわち 、IL-1様ポリペプチドフラグメントまたはリーダー欠失トランスロケーションポ リペプチドフラグメントは、少なくとも約20％の融合ポリペプチドを、それが発 現される宿主細胞の適切な専用の細胞区画へ輸送し得る。また、「細胞質外輸送 を導き得る」という句は、そのように記載されているポリペプチドまたはフラグ メントが、それが発現される宿主細胞の適切な保護された細胞区画に標的され得 るものであるということを意味にするために使用されている。 さらに、用語「リーダーペプチド」、「シグナルペプチド」、および「リーダ ー」は、本明細書において互換的に使用されており、それらは、分泌、即ち、非 細胞質部位に輸送することを目的とした前駆体ポリペプチドのアミノ末端に存在 する短い（１５−３０アミノ酸）配列を意味しており、それらは成熟タンパク質 に存在しない。「分離」 用語「分離された」、「実質的に純粋な」、「実質的に精製された」、および 「実質的に均質の」という語は互換的に使用されており、例えば、リンカー配列 （天然成分を持たない目的のポリペプチドを得るために化学的または酵素的に切 断される）などを含む天然成分から分離されているポリペプチドを意味する。単 量体ポリペプチドは、少なくとも約60〜75％のサンプルが単一のポリペプチド配 列を示すときに実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドは、代表的に は、約60〜90％W/W、より一般的には約95％、そして好ましくは約99％以上のポ リペプチドサンプルを含む。ポリペプチドの純度または同質性は、当該分野で周 知の多くの方法によって示され得、例えば、ポリペプチドサンプルのポリアクリ ルアミドゲル電気泳動、それに続くゲル染色時の単一のポリペプチドバンドの視 覚化である。ある目的に対しては、HPLCまたは当該分野で周知のその他の方法を 用いて、より高度な分析を提供することができる。ポリペプチド精製 細菌細胞に発現されたときに、IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トラン スロケーションポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドは、改変浸透ショック 法、凍結／解凍法、または、下記に例を示したような、特定の抽出緩衝液中での 再懸濁によって細胞から放出され得る。さらに、ポリペプチド精製は、当該分野 で周知の様々な方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって行うこ とができる。 目的のポリペプチドを、融合パートナーおよび／またはリンカー配列または融 合ポリペプチドの一部分を含むその他の配列から単離するために、融合ポリペプ チドを切断することが有益であり得る。ポリヒスチジンストレッチをコードする 配列を含むリンカーは、例えば、Ni-NTA樹脂（QIAGEN，Chatsworth，CA）および ProBond樹脂（Invitrogen，San Diego，CA）のような樹脂に結合させることによ って精製することができる。ポリペプチド精製のその他の有用な方法については 、例えば、ポリペプチド精製へのガイド、M．Deutscher編、182 Meth．Enzymol ．(Academic Press，Inc.：San Diego，1990)およびR．Scopes、Polypeptide Pu rification：Principles and Practice ，Springer-Verlag：New York，1982に記 載されている。 好ましくは、宿主細胞の細胞質内で、適合可能なタンパク質分解酵素の同時発 現により融合ポリペプチドの切断がインビボで生じる。E．coliのような細菌宿 主においては、ユビキチンヒドロラーゼが好ましい。例えば、本発明の融合遺伝 子のリンカーの一部分としてユビキチンヒドロラーゼ切断部位を有するポリペプ チドを伴って発現される場合は、実施例６に示された通りユビキチンヒドロラー ゼは特異的および効率的に切断する。 完全な融合ポリペプチドもまた有用であり得る。例えば、第２のポリペプチド に対するヒトインターロイキン-1-β、またはそのアナログは治療上の用途を有 し得る。 ポリペプチドの改変；フラグメント；融合ポリペプチド 本発明はまた、ヒト IL-1-βポリペプチドの１次構造配列に実質的に相同的なポリペプチドまたはそ のフラグメントも提供する。本発明はまた、インビボまたはインビトロの化学的 および生化学的改変を伴うポリペプチドまたは特異アミノ酸を組み込んだポリペ プチドも包含する。このような改変は周知であり、そして、例えば、アセチル化 、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種 による標識、種々の酵素的改変を含む。例えば、Molecular Cloning：A Laborat ory Manual 、第２版、１-３巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology、F．Ausubelら、 Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York（1987および定期最新版 ）を参照のこと。 本発明は、IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリ ペプチド(leader-deleted-translocating polypeptide)、および目的のポリペプ チド含有する融合ポリペプチドを提供する。IL-1様ポリペプチドまたはリーダー 欠失トランスロケーションポリペプチドに融合したポリペプチドの例としては、 ヒトまたは家畜の治療、診断、または研究への適用に有用なペプチドまたはポリ ペプチドが挙げられる。このような目的のポリペプチドとしては、ホルモン、サ イトカイン、成長因子または阻害因子、および酵素が挙げられるが、これらに限 定されない。 IL-1様ポリペプチド、リーダー欠失トランスロケーションポリペプチド、目的 のポリペプチド、および融合ポリペプチドは、代表的には組換え法により作成さ れるが、化学的にも合成され得る。ポリペプチドの合成についての技術は、例え ばMerrifield，J．Amer．Chem．Soc. 85:2149-2156，1963に記載されている。核酸 本発明は、IL-1様ポリペプチドまたはリーダー欠失トランスロケーションポリ ペプチド、および目的の別のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドをコード する核酸を提供する。このような核酸には、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成形態、 および混合ポリマー、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が含まれる。このよ うな核酸は、化学的または生化学的に改変され得、そして非天然または誘導体化 されたヌクレオチド塩基を含み得る。融合ポリペプチドをコードする配列は、イ ントロンによって中断され得る。 本発明の核酸配列は、このような融合ポリペプチドをコードするに充分な長さ であり、そして必要ならば何らかのベクター配列である。配列は、通常、数百の ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の長さであり、そして数キロ塩基長であ り得る。 本発明の融合ポリペプチドをコードし、そして発現し得る核酸の構築を含む、 核酸操作の技術は周知であり、そして一般に、例えば、Sambrookら、前出または Ausubelら、前出に記載されている。このような技術を適用するに有用な試薬、 例えば、制限酵素などは、当業者に周知であり、そして市販されている。 本発明の融合ポリペプチドを生産するために使用される組換え核酸配列は、天 然配列または合成配列に由来し得る。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列およ び/またはそれらのフラグメントは、以下のデータベースアクセス番号で、GENBA NKおよび/またはSwiss Protein Databaseから入手され得る： IGFおよびIGFBP-3の場合、コドンを最適化した遺伝子を使用した。すべての場合 において、成熟遺伝子産物をコードする各配列の部分のみを使用した。 種々のIL-1-様およびリーダー欠失トランスロケーションポリペプチドのヌク レオチド配列については、例えば、Maliszewskiら、Mol．Immunol. 25:429-437 、1988；Auronら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA. 81:7907-7911，1984；Marchら 、Nature(Lond.)315:641-647，1985；Lomedicoら、Nature(Lond.)312:458-462， 1984；Grayら、J．Immunol. 137:3644-3648，1986；Nishidaら Monokines and O ther Nonlymphocytic Cytokines 、Powandaら編(Liss，New York)、73-78頁、198 8；Furutaniら、Nucl．Acids Res. 13:5869-5882，1985；Moriら、Biochem．Bio phys．Res．Commun. 150:1237-1243，1988(ヒト、マウス、ラット、ウシ、およ びウサギ由来のIL-1-αおよびIL-1-β);Eisenbergら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA. 88:5232-5236，1991（ヒト、マウス、およびラットIL-1ra）;およびBar dwellら、Cell 67:581-589，1991（E．coli DsbA）;LovettおよびKolodner，J. Bacteriol. 173:353-364，1991；Missiakasら、EMBO J. 13:2013-2020，1994(Ds bC)にも報告されている。これらの参考文献の内容は、本明細書中に参考として 援用されている。 本発明の融合ポリペプチドの構築に用いられる他の配列としては、タイプII T GF-βレセプター(Linら、Cell 68:775-785，1992)およびEGF-結合カリクレイン( Blaberら、Biochemistry 26:6742-6749，1987)の可溶性細胞外ドメインが挙げら れる。選定された宿主細胞に適合可能ないずれの発現ベクターも、本発明の実施 に使用され得る。 本発明の融合ポリペプチドの構築は、組換えDNA技術、例えばPCR、自動DNA合 成などにおいて周知の方法を用いて容易に達成される。 「コードする」 天然の状態においてまたは当業者に周知の方法によって操作 される場合において、核酸がポリペプチドを生産するために転写および/または 翻訳され得る場合に、核酸はポリペプチドを「コードする」という。このような 核酸のアンチセンス鎖もまた、ポリペプチドをコードするという。 「作動可能に連結される」 別の核酸配列と機能的な関係がある場合、核酸配 列は作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写ま たは発現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結さ れる。一般に、作動可能に連結されるとは、連結されているDNA配列が隣接し、 そして２つのポリペプチドコーディング領域を結合するのに必要な場所において 隣接し、そして読み枠内に存在することを意味する。 「組換え」 用語「組換え」核酸(および類推によって、組換え核酸の発現に よって生産される「組換え」ポリペプチド)は、天然に存在しないもの、あるい は、化学合成手段または核酸の単離されたセグメントの人為的操作により、例え ば遺伝子工学技術により、分離された２つの他の配列のセグメントの人為的組合 せにより作成されるものである。 組換え核酸または化学的に合成された核酸の調製；ベクター、形質転換、宿主 細胞 本発明の大量の核酸は、細菌、酵母、昆虫、両性動物、トリ、哺乳動物、 または他の真核生物の細胞および発現系のいずれかの適切な宿主細胞において複 製により生産され得る。所望のフラグメントをコードする天然または合成DNAフ ラグメントは、組換え核酸構築物(代表的にはDNA構築物)に組み込まれる。これ らのDNA構築物は、これらが複製する原核細胞または真核細胞に導入される。通 常、このDNA構築物は、酵母または細菌のような単核細胞宿主において自己複製 に適切である。この構築物もまた、培養した昆虫、哺乳動物、植物、またはその 他の真核細胞株のゲノム内に導入され、そして組み込まれ得る。これらの目的の ための適切な方法は当業者に周知であり、そして例えばSambrookら(1989)または Ausubelら(1987および定期最新版)に記載されている。 本発明の核酸は、必要に応じて化学合成、例えばBeaucageおよびCarruthers(T etra．Letts. 22:1859-1862，1981)に記載のホスホルアミダイト法、またはMatt eucciら(J．Am．Chem．Soc. 103:3185，1981)によるトリエステル法により生産 され、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で実施され得る。 原核宿主または真核宿主への導入のために調製されたDNA構築物は、代表的に は、宿主によって認識される複製系を含有し、このようなDNA構築物は所望のポ リペプチドをコードする意図したDNAフラグメントを含み、そして好ましくは、 ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳開始 調節配列も含む。発現ベクターとしては、例えば、複製開始点または自己複製配 列(ARS)および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、ならびにリボソー ム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配 列、およびmRNA安定化配列のような必要なプロセッシング情報部位が挙げられる 。このようなベクターは、当業者に周知の標準的な組換え技術によって調製され 、そして例えばSambrookら(1989)またはAusubelら(1987)に記載されている。 適切なプロモーターおよびその他の必要なベクター配列は、宿主の機能に対し て選択される。細胞株と発現ベクターとの機能的組合せの例については、Sambro okら、1989またはAusubelら、1987)に記載されている；例えば、Metzgerら、Nat ure 334:31-36，1988も参照のこと。多くの有用なベクターが当業者に知られて おり、そして市販されている。真核宿主の使用については、trp、lac、およびフ ァージプロモーター、tRNAプロモーター、および解糖系酵素プロモーターが挙げ られるが、これらに限定されない。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチ オネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、あるいはエノラーゼまたはグリセル アルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのような他の解糖系酵素、ならびにマル トースおよびガラクトースの利用を司る酵素が挙げられるが、これらに限定され ない。酵母の発現に使用するための他の適切なベクターおよびプロモーターにつ いては、さらにHitzemanら EP 73,657Aに記載されている。適切な非天然の哺乳 動物のプロモーターとしては、SV40由来の初期および後期プロモーター(FiersらNature 273:113，1978)、またはネズミモロニー白血病ウイルス、マウス乳ガン ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピローマウイルス、お よびポリオーマウイルス由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定され ない。さらに、構築物は増幅可能な遺伝子(例えば、DHFR)に結合され得るため、 遺伝子の多重コピーが作成される。 このような発現ベクターは、自己複製し得る。あまり好ましくない態様におい ても、当業者に周知の方法により、宿主細胞のゲノムに挿入されることによって 、発現ベクターは複製し得る。 発現ベクターおよびクローニングベクターは、一般に、宿主細胞の生存または 生育に必要なポリペプチドをコードする選択マーカーを含む。この遺伝子の存在 は、マーカーを発現する宿主細胞のみの生育が確実にする。代表的な選択遺伝子 は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどの抗生物 質または他の毒性物質に耐性を示し；(b)栄養要求生の欠損を補い；または(c)複 合培地から得られない重要な栄養物を供給するポリペプチドをコードする。適切 な選択マーカーの選定は、宿主細胞に依存する。異なる宿主細胞に対する適切な マーカーは、当業者に周知である。 目的の核酸を有するベクターは、インビトロで転写され得、そして得られたRN Aは、周知の方法により（例えば、注入により）宿主細胞に導入される。T．Kubo ら、FEBS Lett. 241:119，1988を参照のこと。あるいは、ベクターは、当業者に 周知の方法により、直接宿主細胞に導入され得る。これは、細胞宿主のタイプに 依存して変化する。これらの方法としては、エレクトロポレーション；塩化カル シウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の 物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバード(mic roprojectile bombardment)；リポフェクション(lipofection)；および感染(こ こでベクターは、レトロウイルスゲノムのような感染剤である)が挙げられるが 、これらには限定されない。一般に、Sambrookら(1989)およびAusubelら(1987) を参照のこと。このように形質転換された細胞もまた、このような細胞の子孫を 含むものとする。 本発明の大量の核酸およびポリペプチドは、適合可能な原核宿主細胞または真 核宿主細胞内のベクターまたは他の発現ベヒクルにおいて核酸またはその一部を 発現することによって調製される。最も一般的に使用される原核宿主はE．coli の株であるが、Bacillus subtilisまたはPseudomonasのような他の原核細胞もま た使用され得る。酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、またはトリ種の細胞のよ うな、哺乳動物細胞または他の真核宿主細胞もまた、本発明のポリペプチドの生 産に有用であり得る。 本発明は直接的な記載によって開示されている。以下は、可溶性の活性なポリ ペプチドを生産する方法の有効性を示す実施例である。本実施例はあくまで例に 過ぎず、如何なる場合においても、本発明の範囲を限定するものとして解釈され るべきではない。 実施例 実施例１： 融合タンパク質の発現および精製 別に示さない限り、実施例を通して、以下の材料および方法を使用した。さら なる詳細については、本明細書に引用されている文献に見出され得る。 細菌株および生育条件 E．coli JM109 F- traD36 lacIq del(lacZ)M15 proAB /recAl endAl gyrA96 thi hsdR17 supE44 relAl del(lac-proAB)。 E．coli W3110 DE3 F- thi(λDE3溶原菌；StudierおよびMoffat，J．Mol．Bio l. 189:113-130，1986)。 別に示さない限り、これらの株はL-ブロス中、37℃で通気しながら生育させた 。プラスミドを含む株については、抗生物質を適切なように増殖培地に添加した 。 プラスミド 本研究で使用した発現ベクターは、pJU1003(Squiresら、J．Bio l．Chem. 263:16297-16302，1988)と本質的に一致する。但し、配列が種々の配 置の以下の遺伝子をコードする翻訳カップラーおよび開始コドンの下流に挿入さ れた場合を除く：成熟ヒトIGF-1(70 aa)、IGFBP-3(264 aa)、TGF-β2（112 aa) 、TGF-β-レセプター(細胞外ドメイン、136 aa)、またはマウスEGF-結合カリク レイン(237 aa)。各場合において、終止コドンがこれらの配列に続く。これらの プラスミドもまた、(a)pJU1003のtet遺伝子の5'末端に合成16bpアダプター配列 を含有しない点；および(b)pSC101のpar遺伝子座を含有する385bpフラグメント からなる、pBR322由来のバックボーン(backbone)中の唯一のPvuII部位にDNA挿入 物を含有する点において、pJU1003と異なる(MeacockおよびCohen、Cell 20:529- 542，1980)。これらのプラスミドはまた、外来遺伝子の下流でかつ同一転写ユニ ット内にリーダー部位を有さないE．coliのペリプラズムロタマーゼ(periplasmi c rotamase)をコードする遺伝子も含有する。ロタマーゼ遺伝子のシグナル配列 を、LiuおよびWalsh、Proc．Natl．Acad．Sci．USA. 87:4028-4032，1990に記載 のように、欠失し、そして開始メチオニンコドンに置き換えた。短縮型ロタマー ゼ遺伝子が存在すると、E．coli宿主細胞内でユビキチン融合物の増殖阻害効果 が中和される。このことは、同一日に提出され、そして代理人の処理番号第2209 5-20266.00号で「宿主細胞におけるタンパク質の過剰発現についての方法および DNA発現系」という表題の同時係属中の出願に開示された通りである。 各遺伝子を４つの独立した配置における発現について調製し、表１に記載のプ ラスミドを得た：(１)インフレームでかつ遺伝子配列の上流に挿入された酵母ユ ビキチン(「Ubi」)の76個のコドンを伴う；(２)開始コドンと遺伝子との間のイ ンフレームに融合された成熟ヒトIL-1-β(「IL1β」)に関する153個のコドン、 およびIL-1-β配列と遺伝子配列との間に挿入されたAsp-Arg-Gly-Glyをコードす るリンカーを伴う；(３)リンカーと配置(２)の遺伝子配列との間に挿入された酵 母ユビキチンの76個のコドンを伴う；および(４)成熟E．coli DsbAの189個のコ ドンの後に、IL-1-β＋配置(３)のリンカー配列を置き換えて、His-His-His-His -His-His-Serをコードするリンカーを伴う。さらに、遺伝子を欠失させ、そして リンカー(5'...GGATCCCGTGGAGGATTAAACCATGGATGCATAAGCTTCGAATTCTGCCAGGCATGCA AGCTCAGATCC...3')に置き換えたベクター12886および12887をコントロールとし て使用した。 ６つのプラスミド‐pYZ22070、pYZ22096、pYZ9205、pYZ9206、pDM15426、およ びpDM15424 -は、pACYC184バックボーン内の上記のプラスミドのT7転写ユニット を含有する(ChangおよびCohen、J．Bacteriol. 134:1141-1156，1978)。具体的 には、これら６つのプラスミドにおいて、T7プロモーター、翻訳カップラー、遺 伝子構築物、ロタマーゼ遺伝子、およびT7ターミネーターを有するClaI-ScaIフ ラグメントは、pACYC184の1.0 kb ClaI-NruIフラグメントを置き換えたものであ る。pYZ9205プラスミドは、上記ベクターバックボーン内のDsbAに関する全コー ディング配列を含有する。pYZ9206プラスミドは、DsbAのシグナル配列がメチオ ニンコドンに置き換えられている点を除いて、pYZ9205と同一である。pDM15426 プラスミドは、DsbAのシグナル配列を含む点を除いて、pYZ22070（上記）と同一 である。pDM15424プラスミドは、天然のシグナル配列を伴わずに、IL-1-レセプ ターアンタゴニストのコーディング配列を含有する。 適切なゲノムDNAからのPCR-介在増幅を用いて、酵母ユビキチン配列およびロ タマーゼ配列を得た。Sprattら、Growth Factors 3:63-72，1990に記載のように 、IGFBP-3に対するcDNAクローンを単離し、そしてアミノ末端の３分の１の遺伝 子を、天然の遺伝子(つまり、成熟配列の最初の288個のヌクレオチド、唯一のBs sHII部位まで)と同一のアミノ酸をコードする合成DNA配列と置換することによっ て、しかしE．coliにおける発現のために最適化されたコドンを用いることによ って、さらに改変した(例えば、Fiers，Nature 260:500，1976を参照のこと)。 合成DNA からデノボでIGF-I配列を構築し、そして同様にE．coliについて最適化したコド ンを用いた。 Michael Sporn博士、National Institutes of Healthから入手したcDNAクロー ンのPCR-介在改変により、TGF-β2配列を得た。TGF-β-レセプター配列も、同様 にpH2-3FF(Herb Lin博士、Massachusetts Institute of Technologyから入手し たcDNAクローン)に由来し、そしてマウスEGF-結合カリクレイン配列はpMS2-12A( Ralph Bradshaw博士、University of California at Riversideから入手したcDN Aクローン)に由来した。全てのPCR由来DNAを、使用前に配列決定した。 塩化カルシウム介在形質転換および抗生物質耐性についての選択により、各プ ラスミドをW3110DE3に導入した。 酵素および試薬 酵素および試薬を、New England Biolabs，Beverly，MA；Bo ehringer Mannheim，Indianapolis，IN；Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO； Pharmacia，Piscataway，NJ；BRL，Gaithersburg，MD；US Biochemical，Clevel and，OH；およびClontech，Palo Alto，CAより購入した。 一般的技術 制限消化、アガロースゲル電気泳動、ライゲーション、形質転換 、DNAの調製、DNA配列決定、細胞培養、SDS-PAGE、ウエスタンブロット、ELISA 、およびその他通常の分子生物学的技術については、Maniatisら、Molecular Cl oning: A Laboratory Manual ，第２版、１-３巻、Sambrookら編、Cold Spring H arbor Laboratory Press，1989およびCurrent Protocols in Molecular Biology ，F．Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York，19 87および定期最新版に記載されている。 細胞増殖および回収 上記のプラスミドのうち１つを含有するE．co1i W3110D E3株を、テトラサイクリン(15μg/ml)またはクロラムフェニコール(20μｇ/ml) を含有する５mlのLuriaブロス(LB)に導入し、37℃で一晩、通気しながら飽和に なるまで増殖させた。２mlの新鮮な一晩培養物を、0.2%グルコースを補充した10 0mlのLBに希釈した。この培養物を、通気しながら数時間、同一温度で増殖させ た。培養物の吸光度を、初期対数増殖期の間、吸光度(600nm)が0.4に達するまで 追跡した。次に、１mlのアリコートを取り出し、そして細胞を回収した(「０分 」時点)。 イソプロピル-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度0.4mMとなるように 添加し、そして培養物のインキュベーションを２時間継続した。第２のアリコー トの細胞を取り出した(「120分」時点)。 これらの時点からのアリコートを用いて、「全細胞溶解物」(WCL)を下記のよ うに調製した。残りの培養物を遠心分離により回収し、次に、(１)「TEX緩衝液 抽出」プロトコールまたは(２)TEX工程を除いたTEXプロトコールの変法、「単純 音波処理プロトコール」により処理した。 TEX緩衝液抽出プロトコール 細胞を、最初の培養容量の1/10量のTEX緩衝液(5 0mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，0.1% Triton X-100)に再懸濁し、そして20〜60 分間氷上においた。Beckman TJ-6遠心機で3,000rpm、15分間４℃にて遠心分離後 、上清(「TEX抽出物」または図中「Ｔ」)を取り出し、そして細胞ペレットを同 容量のTE(10mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA)に再懸濁した。Bransonソニケーター (２×30秒バースト)を用いて、細胞を破砕した。いくつかの実験において、0.2m g/mlのニワトリリゾチームを破砕緩衝液に添加することによって、溶解を促進し たが、この工程は必要ではないと思われた。破砕された細胞をBeckman TJ-6遠心 機中で3,000rpm、15分間、４℃にて遠心分離した。上清(「細胞質画分」または 図中「Ｃ」)を取り出した。ペレットをTE中で１回洗浄し、そしてさらに分析の ために、等容量のTE緩衝液中に再懸濁した(「不溶性画分」または図中「Ｉ」)。 単純音波処理プロトコール 細胞を、最初の培養容量の1/10量のTE(10mM Tris -Cl，pH8.0，1mM EDTA)に再懸濁し、そして音波処理した。その後の全ての工程 は、音波処理後のTEX緩衝液抽出プロトコールに関するものと同一であった。し かし、このプロトコールの音波処理後に得られた上清は、「可溶性」画分(図中 で標識された「Ｓ」)を意味する(そして「TEX」画分および「細胞質」画分の合 計を表す)。 増殖中の培養物から取り出した各全細胞アリコートを100μl SDS-PAGEサンプ ル緩衝液に再懸濁し、そして５分間煮沸することによって、全細胞抽出物を電気 泳動用に調製した。２×サンプル緩衝液(１%SDS、10%グリセロール、0.1%ブロム フェノールブルー)の１容量を添加し、そして65℃で15分間インキュベートする ことによって、「可溶性」画分サンプルおよび「不溶性」画分サンプルを調製 した。実施例２： IL-1様タンパク質間の相同性 図１は、IL-1様タンパク質ファミリーの次の５つのメンバーの配列のアライン メントを示す：(１)E．coli DsbA、(２)ヒトIL-1-β、(３)ヒトIL-1-α、および (４)ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)、および(５)ヒト酸性線維芽細胞増殖 因子(FGF)。このアラインメントを最大にするために、より長いメンバーの適切 な領域を、比較(特にDsbAの酸化還元酵素活性部位ループ(残基21〜35)、およびD sbAにおける他の別の大きなループ(残基126〜157))から除外した。 この様式で最適に整列化すると、このグループの種々のメンバーおよび毒素に より同時調節された線毛(TcpG)ポリペプチド(Vibrio cholerae由来のE．coli Ds bAの細菌性同族体(PeekおよびTaylor、前出))は、図２に示すIL-1-βに対して相 同性を示す。認められた相同性に加えて、図１に示す配列の種々の位置で、いく つかの保存的置換を観察し得た。例えば、いくつかの位置で、Ile--〉Val、Phe- -〉Tyr、およびAsp--〉Gluを観察した。実施例３： 細菌細胞からのIL-1様ポリペプチドおよびその融合物の蓄積および 選択的放出 細菌細胞からの融合タンパク質の蓄積および選択的放出を達成するために、IL -1様タンパク質ファミリーの代表的な以下の３つのメンバーを選定して、IL-1- 様ポリペプチドに対するポリペプチド融合物の広範囲の適用性の例を示した：( １)ヒトIL-1-β、(２)ヒトIL-1-レセプターアンタゴニスト(IL-1ra)、および(３ )E．coli DsbA。IL-1raおよびE．coli DsbAの成熟配列を発現させた。即ち、こ れらの天然にコードされたアミノ末端シグナル配列を、単一の開始メチオニンコ ドンに置き換えた(pDM15424およびpYZ9206;DsbAのV22からQ35のコドンが、バク テリオファージm13由来の遺伝子IIIのV22からP77のコドンに置き換えられたこと 以外は、p15433はpY9206と同一である;変異遺伝子産物の予想されるサイズは、 約27kDである)。IL-1-βについては、成熟タンパク質を特定する153個のコドン を、開始メチオニンコドンの下流に配置した(pDJ12151)。 図３は、IL-1-βが発現され、そして37℃で増殖するE．coli細胞のSDS-PAGEに よる分画の結果を示す。図3Aは、０分時点での細胞からの全細胞溶解物(「WCL」 )を示す；図3Bは、WCL、120分；図3Cは、TEX抽出物；図3Dは、「細胞質」画分； および図3Eは、「不溶性」画分を示す。各ゲルについては、レーン１は、野生型 IL-1β、レーン２は、IL-1β３重変異R4A、L6A、R11G)、およびレーン３は、IL- 1β３重変異R4D L6A R11Gである。これら２つの３重変異体は、天然のレセプタ ーの少なくとも１つに結合するIL-1-βに影響することなく、IL-1-βの生物学的 活性をなくす残基で改変されている(Gehrkeら、J．Biol．Chem．265:5922-5925 ，1990;Labriola-Tomkinsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．88:11182-11186，1 991)。各場合における野生型または変異IL-1βの予想されるサイズは、約17kDで ある(各ゲルの右側に●で示す)。 これらのゲルは、TEX画分において、発現された野生型IL-1-β(図3A-Eのレー ン１)の大部分が見られることを示し、IL-1-βがインビボで非細胞質位置に偏在 することが示された。このことは、２つの３重変異体(R4A L6A R11G，レーン２ ；およびR4D L6A R11G，レーン３)の場合には認められなかった。これら変異体 由来の大部分の発現されたIL-1-βは、「不溶性」画分に見出された。これらの データは、微細な改変であっても、非細胞質の可溶性の形態で蓄積するIL-1-β の能力に影響することを示す。 表２(以下)のデータからこれらの結果が確認され、これは、ほとんどTEX画分 においてのみ、ペリプラズムタンパク質であるβ-ラクタマーゼと共に、IL-1-β -IGF融合物(IL-1-β自体に類似する)が見出されることを示している。少ない割 合のIL-1-β-IGF融合タンパク質のみが、細胞質マーカーのβ-ガラクトシダーゼ と適合する。 図４は、E．coli DsbAの蓄積およびSDS-PAGE分画を示す。図4aは、成熟DsbAを 発現する細胞の０、60、および120分時点における全細胞溶解物(「WCL」)(即ち リーダー配列を欠く)を示す；図4bは、活性部位ループのバクテリオファージm13 の遺伝子III由来の約55個のアミノ酸による置換(DsbAのコドンV22からQ35が、m1 3遺伝子IIIのコドンV22からP77に置き換えられた)を有する、「変異」成熟DsbA を発現する細胞の０、60、および120分時点におけるWCL；図4cは、野生型成熟Ds bAを発現する細胞のTEX抽出(「Ｔ」)画分および「細胞質」(「Ｃ」)画分；およ び図4dは、「変異」DsbAを発現する細胞の「Ｔ」および「Ｃ」画分を示す。発現 されたポリペプチドの予想されるサイズは、約22kDである。 また、事実上、全ての発現されたDsbAタンパク質がTEX画分に見出された。Dsb Aの「活性」部位ループが関連のない遺伝子由来の配列に置き換えられた場合、 抽出可能なコンパートメントに輸送する能力は失われていなかった。 図５は、IL-1様タンパク質とヒトIGF-IまたはTGF-βレセプターとの種々の融 合物が発現された細胞の分画を示す：(１)予想されるサイズが約24-25kDのIL1β -IGF（pDM16963）；(２)予想されるサイズが約32kDのIL1β-Ubi-IGF（pDM16965 ）；(３)予想されるサイズが約37kDのDsbA-Ubi-IGF（pYZ22070）；および(４)予 想されるサイズが約46kDのDsbA-Ubi-TGFR(pDM15428)。 図５の４つのSDS-PAGEゲル(左)は、これらの４つの融合ポリペプチドを発現す るE．coli細胞の０および120分時点におけるWCLを示す。図５の４つのSDS-PAGE ゲル(右)は、これらの４つの融合ポリペプチドに対するTEX画分および「細胞質 」画分を示す。点(dot)は、融合ポリペプチドのバンドを示すために用いられ、 そして第２の点が存在する場合は、融合ポリペプチドの分解産物が存在する。 ４つの全ての場合において、融合タンパク質の実質的な比が、TEX画分に見出 された。従って、細胞由来のこれらのIL-1様タンパク質の融合物もまた、実質的 に抽出可能なコンパートメントに輸送した。 図６は、天然のリーダー配列の欠失(pDM15424)を伴うE．coliで発現されたヒ トIL-1-レセプターアンタゴニストの、０および120分時点における、全細胞溶解 物(「WCL」)、ならびにTEX(「Ｔ］)画分および「細胞質」（「Ｃ」）画分（「FX N」）を示す。さらに、ほとんどのタンパク質がTEX画分において見出された。こ の結果は、リーダー配列を欠くIL-1-raが適切に分泌されることを示す。 表２(以下)は、IL-1-βまたはIL-1-β-IGF融合物を発現するE．coli細胞のTEX 画分が、ペリプラズム酵素マーカーであるβ-ラクタマーゼを含むが、細胞質マ ーカーであるβ-ガラクトシダーゼを含まないことを示す。同一のサンプルにお いて、Il-1免疫反応性(融合タンパク質の存在を示す)が、ほとんどTEX画分にお いてのみ見出された。 成熟DsbAによる同様の局在化を確認するために、Holmgren(J．Biol．Chem. 25 4 ;9627-9632，1979)により記載のように、酸化還元酵素アッセイを粗抽出物で実 施した。但し、以下の改変を行った：アッセイを室温で実施した；DTTは、0.1mM であった；そしてインスリン基質は1mg/mlであった。結果を表３に示す。IL-1-r aと同様に、リーダー配列を欠くDsbAが分泌され、その結果TEX画分に局在する。 実施例４： 細菌における可溶性融合ポリペプチドの蓄積 IL-1様融合パートナーは、細菌において発現される種々の構造的に関連のない 異種タンパク質の溶解性に対して、著しいおよび有益な効果を示した。 図７〜10に、４つの異なるヒト遺伝子のそれぞれに対する構築物を有する誘導 された細胞の「可溶性」(Ｓ)画分および「不溶性」画分(Ｉ)を比較した場合に得 られた結果をまとめる。 図７では、TGF-β2融合構築物を分析した。図７(左)は、約20kDの予想される サイズを有するユビキチン-TGF-β2融合ポリペプチドをコードするpDJ16920で形 質転換したE．coli細胞の０および120分時点由来の全細胞溶解物(「WCL」)、な らびに可溶性(「Ｓ」)画分および不溶性(「Ｉ」)画分のクーマシー染色SDS-ポリ アクリルアミドゲルを示す。事実上、この融合ポリペプチドの全てが「不溶性」 画分に見出された。しかし、約42kDのDsbA-ユビキチン-TGF-β2融合物をコード するプラスミドpYZ22096の場合、図７(右)は、タンパク質がほとんど全体的に可 溶性であることを示す。これらの結果もまた、可溶性のTGF-β2が37℃で入手さ れ得ることを示す点で重要である。可溶性TGF-β2を得るための以前の試みは、 低温での増殖(例えば、30℃)に依存しており、より低温での増殖は、E．coli宿 主細胞の増殖にとって最適ではなく、そして高価なリアクター冷却機器を必要と することから、あまり望ましくない。 図８では、いくつかのIGF-I融合物で得られた結果が示されている。図８(左) は、pDJ16927およびpDM16965で形質転換したE．coli細胞の、０および120分時点 由来の全細胞溶解物(「WCL」)、ならびに可溶性(「Ｓ」)画分および不溶性(「Ｉ 」)画分のクーマシー染色SDS-ポリアクリルアミドゲルを示す。pDJ16927は、約1 5kDの予想されるサイズでユビキチン-IGF融合物を発現する。pDJ16925は、約32k Dの予想されるサイズでIL1β-ユビキチン-IGFを発現する。 図８(右)は、約37kDの予想されるサイズで成熟DsbA-ユビキチン-IGF(即ち、シ グナル配列を欠くDsbA)を発現するpYZ22070で形質転換されたE．coli細胞、また はDsbAが天然のシグナル配列を保持し、そして約37kDの予想されるサイズを有す るDsbA-Ubi-IGFを発現するpDM15426で形質転換されたE．coli細胞の抽出物の同 様のゲルを示す。 図９は、IGFBP-3への融合物により得られた結果を示す。パネル[i]は、予想さ れるサイズが約38kDのユビキチン-IGFBP-3融合物(pDJ12875);パネル[ii]は、予 想されるサイズが約55kDのIL1-ユビキチン-IGFBP3(pDM16967)；および[iii]は、 予想されるサイズが約60kDのDsbA-ユビキチン-IGFBP-3(pDM15427)。IL-1への融 合物ついては、溶解性は著しく高かった。 図10、パネル[i]は、予想されるサイズが約24kDのユビキチン-TGF-βR融合物( pDJ16921)を発現するE．coli細胞の、０および120分時点由来の全細胞溶解物、 ならびに可溶性(「Ｓ」)画分および不溶性(「I」)画分を、パネル[ii]は、予想 されるサイズが約46kDのDsbA-ユビキチン-TGF-βR融合物(pDM15428；βRはTGF- βレセプターの細胞外ドメインである)を示す。ユビキチン-TGF-βR融合物は、 大部分は不溶性であった。極めて対照的に、DsbA-ユビキチン-TGF-βR融合物は 、事実上完全に溶解性であった。実施例５： 37℃で増殖した細菌細胞中の融合タンパク質から得られたヒトIGF- Iの生物学的活性 図11は、IGF-Iの生物学的に活性な配置へのインビボでの的折り畳みに対する 温度およびDsbAへの融合の効果を示す。 100mlの誘導された細胞から調製された「可溶性」画分を、上記(「単純音波処 理プロトコール」)のように、50mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTAで平衡化したQ-セ ファロース(Pharmacia)カラム(５mlベッド容量)に通すことにより、これらの培 養物の抽出物から融合タンパク質を精製した。カラムを２カラム容量の同緩衝液 で洗浄し、そしてサンプルを、0.4M NaClを添加した８mlの同緩衝液で溶出した 。Centricon-30メンブラン(Amicon)上で、溶出物0.5mlの容量まで濃縮した。 ユビキチンヒドロラーゼ切断 上記の濃縮物に、以下の実施例６に記載の通り プラスミド23344を含む株から調製したユビキチンヒドロラーゼ酵素の10μlの粗 抽出物を添加した。 HPLC-逆相クロマトグラフィー HPLC-逆相クロマトグラフィーを以下の通り実 施した。37℃で60分間のユビキチンヒドロラーゼとインキュベートした後、消化 物を直接C-18(Vydac)逆相カラムにかけ、そして２緩衝液系でHPLCクロマトグラ フィーに供した：緩衝液Ａは、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液であり、そし て緩衝液Ｂは、0.1%TFA/アセトニトリルであった。カラムを以下の通り展開した ：４分で０-22%B；６分間22%Ｂで洗浄；１分あたり0.5%での22-42％Ｂ勾配で溶 出(全体で40分)。IGF-I標準物は、これらの条件下で31.4%Ｂで溶出する。ピーク を回収し、次にIGFバイオアッセイ(下記)のため希釈し、またはPAGE分析に供し た。全てのサンプルにおいて31.4%の位置から回収したピークは、PAGEで測定さ れた通り、銀染色により可視化されたタンパク質のバンドとともに、7.5kDに泳 動した単一のタンパク質のバンドを含んでいた。この画分には混入タンパク質は 観察されなかった。従って、ピーク高を用いて、市販のIGF標準物と比較するこ とによって、存在するIGFの量を推定した。 IGFバイオアッセイ IGFバイオアッセイでは、MG63細胞(ATCC CRL #1427、雄 性骨肉腫細胞株)を、5000細胞/ウエルで96-ウエルマイクロタイタープレートに 播き、そしてCO₂インキュベーター中、37℃で16時間インキュベートした。培養 培地を吸引し、そしてサンプル(例えば、Imcera、Terre Haute、INから入手可能 な市販のIGF標準物を含む)を、RPMI培地(２mMグルタミン、50U/mlペニシリン、5 0mcg/mlストレプトマイシン、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA))の入ったウエルに 加えた。 各サンプルの２倍系列希釈物について試験した。Cell Proliferation Kit(カ タログ番号RPN.210、Amersham)を用いて、細胞を24時間、37℃でインキュベート し、培地をデカントし、そして100μlのキット標識試薬(kit's labelling reage nt)を指示通り同培地で希釈し、そして各ウエルに添加した。次にプレートを37 ℃で３時間インキュベートした。 試薬をデカントした後、細胞を、冷PBSで３回洗浄し、次に100μlの90%エタノ ール、５%酢酸を各ウエルに添加することによって固定した。固定された細胞を3 0分間室温でインキュベートし、そして、それぞれ(a)PBS＋0.1% Tween-20；(b)P BS＋0.1% Triton X-100、および(c)PBS＋0.1% Tween-20で３回洗浄した。続いて 、ウエルを、PBS＋0.1% Tween-20＋0.1%脱脂粉乳(NFDM、Carnationブランド)中 で15分間、室温にてブロックし、そして製造者のプロトコール(Amersham)に従い 、キットに供給されている抗体標識物で処理した。5-ブロモ-2-ジオキシウリジ ン(BRDU)の取り込みを測定するために、A₄₀₅/A₄₉₀比を測定した。標準曲線と比 較することによって、各サンプル中のIGF-Iの濃度を測定した。すべてのサンプ ルを三つ組みで測定した。 結合反応後、４℃で30分間、0.3mMスベリン酸ジスクシンイミジルを添加する ことによって、サンプルを化学的に架橋した。架橋を、Tris-HCl，pH7.5を濃度2 0mMとなるように添加し、続いて10分間煮沸することによって停止した。架橋し たサンプルの一部を、0.2% 2-メルカプトエタノールおよび２% SDSの存在下、N- グリコシダーゼＦと共に３時間、37℃でインキュベートすることによって、酵素 的に脱グリコシル化した。このインキュベーションの後、N-グリコシダーゼＦの 第２のアリコートを添加し、そしてサンプルをさらに１時間インキュベートした 。結合反応の生成物を、８%ゲルを用いた還元条件下でのSDS-PAGEにより分離し た。標識した種を、10%酢酸、40%メタノール中での固定化後、オートラジオグラ フィーにより可視化した。 図11Aおよび11Bは、それぞれ30℃で増殖したDsbA-ユビキチン-IGF構築物およ びユビキチン-IGF構築物の培養物由来のユビキチンヒドロラーゼ-切断IGF-Iから のHPLC逆相溶出プロフィールを示す。図11Cおよび11Dは、それぞれ37℃で増殖し たDsbA-ユビキチン-IGF構築物およびユビキチン-IGF構築物の培養物の対応する データを示す。市販の精製IGF標準物と比較することによって、31.4%緩衝液Ｂで のIGF-Iの位置を確立した。図11Dにおいて、37℃でのユビキチン融合物が適切に 折り畳まれたIGF-I(IGF-Iは約35%Ｂで存在)を生産しないが、30℃ではユビキチ ン融合物が適切に折り畳まれたIGF-Iを生産したことが明らかである。IGF-I折り 畳み自体の温度依存性は予想されなかったが、適切に折り畳まれたIGF-Iの回収 に対するDsbA融合物パートナーの著しい効果は驚くべきものであった(図11Cと11 Dとを比較すること)。 IGFバイオアッセイにより、IGFピークの比活性(枠内の数値(任意の単位)とし て図11に示す。)を確立した。このアッセイにおいて、実際のIGF-Iの比活性は0. 206であった。対照的に、図11Dの主要ピークであるピーク#2の比活性(ユビキチ ン融合物、37℃)は0.004であった。 図11CのIGF-Iピークに対するアミノ末端タンパク質の配列を、自動シークエン サー(Applied BioSystems，Foster City，CA)でのエドマン分解により確立され た。配列Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-X-Gly-Ala-Glu-Leuを有する単一の主な種を回収 した。これは成熟IGF-Iに対する予想されるアミノ末端配列であり、そしてさら に、ユビキチンヒドロラーゼが予想された通り正確に切断したことを示す。 HPLC前のIGF-Iサンプルの精製が結果に影響し得るという見込みのない可能性 を排除するために、表４に挙げた構築物を有する株からの粗抽出物(「可溶性」 画分)をユビキチンヒドロラーゼで処理し、総タンパク質濃度を調整し、そしてI GFバイオアッセイのために希釈した。融合タンパク質の切断を、各場合において SDS-PAGEにより確認した。粗生物活性（任意の単位で）は以下の通りであった： これらの結果から、DsbA融合パートナーが、実質的にE．coli由来の生物学的に 活性なIGF-Iの回収率を上昇させるという初期の観察を確認した。DsbAの代わり にIL-1-βを含む融合物から、同様の方法で生物活性のあるIGF-Iも得、そして分 析した。得られたIGF-I-DsbA融合物もまた、ユビキチンヒドロラーゼによる切断 後、正確なアミノ末端配列(GPETLXGA...)を示した。 以上をまとめると、これらの結果は、細菌細胞における生物学的に活性なIGF- Iの生産、蓄積、および回収におけるIL-1様融合パートナーの有用性を示す。実施例６： 細菌細胞における酵母ユビキチンヒドロラーゼの生産および融合ポ リペプチドの同時発現 ユビキチンヒドロラーゼ(UH)発現ベクターは、唯一のBglII部位の上流の遺伝 子のアミノ末端の92個のコドンを欠失し、かつこのDNAを以下のコドンと置き換 えるUBP-1のcDNAクローンに由来した(TobiasおよびVarshavsky，J．Biol．Chem. 266 :12021-12028，1991)：(a)バクテリオファージT7のphi-10遺伝子の最初の12 個のコドンで、プラスミド23344を産出するコドン；(b)成熟ヒトIL-1-βの153個 のコドンの後にAsp-Arg-Gly-Asp-Pro-His-His-His-His-His-His-Gluをコードす るリンカーが続き、プラスミド23399を生産するコドン；または(c)E．coli DsbA の189個のコドンの後にHis-His-His-His-His-His-Serをコードするリンカーが続 き、その後に酵母ユビキチンの(メチオニン後の)最初の75個のコドンが続き、そ の後にAsp-Pro-His-His-His-His-His-His-Gluをコードするリンカーが続き、プ ラスミド27246を産出するコドン。各場合において、インフレーム融合物は、T7 プロモーター制御下で融合遺伝子を生じた。これらの実験で使用した転写単位の ベクターバックボーンおよびその他の詳細については、実施例１に記載されてい る。 以下のような適合可能なプラスミドの組合せで、E．co1i W3110 DE3株細胞を 形質転換した： 実施例１に記載の通りIPTGで誘導後、クーマシー染色SDS-ポリアクリルアミドゲ ル上に主要なバンドが出現し、これらはIGF融合タンパク質およびそのUHでの切 断の産物の予想されるサイズに対応した。 表５に示された結果から、一般的な分泌経路によるペリプラズム空間を標的と するタンパク質融合物が、IL-1-βまたはDsbAのいずれかに融合したUH酵素によ る分解は比較的免れるが、成熟DsbAにより使用される別の経路により偏在する同 一の融合タンパク質(即ち、シグナル配列を欠く)が、細胞質酵素またはDsbA融合 UH酵素のいずれかにより効果的に切断されることを明らかに示す。E．coliでの 発現時に、IL-1様ポリペプチドおよびそれらの融合物について選択的な抽出が観 察された(実施例３)にもかかわらず、これらのポリペプチドは古典的なペリプラ ズムタンパク質とは異なる方法で偏在すると思われる。これらの結果もまた、同 時発現したユビキチンヒドロラーゼ遺伝子が、インビボで効率的に、IGFのよう な目的のポリペプチドから分離されたIL-1様プラスミドを含有する融合ポリペプ チドを、ユビキチンヒドロラーゼ切断部位を含むリンカーのところで切断し得る 。実施例７： TGFレセプターフラグメントの精製および架橋アッセイ プラスミドpDM15428を含む誘導された細胞(100ml培養容量)から調製された「 可溶性」画分を、製造者の推奨に従って、1mlベッド容量のNi-NTAアフィニティ ーカラム(QIAGEN Inc.，Chatsworth，CA)に通し、平衡化し、洗浄し、そして展 開した。溶出物を、最初のローディング緩衝液に対して透析し、ユビキチンヒド ロラーゼの部分純粋調製物で消化し、そして上記と同一のNi-NTAカラムを通した 。通過物をCentricon-10メンブラン(Amicon)上で濃縮して最終容量を0.5mlとし 、そして以下の通り架橋アッセイに使用した：このサンプルの20μlを100pM ¹²⁵ I-TGF-β1 (250nM)と共に一晩インキュベートした。このサンプルを0.3mMスベリ ン酸ジスクシンイミジル(Pierce Chemical，Rockford，IL)で15分間４℃で架橋 した。３分の１容量の４×Laemmliゲルサンプル緩衝液(50mMジチオスレイトール を含む)を添加することにより、反応を停止した。サンプルを２分間煮沸(100℃) し、そしてSDS-PAGEに供した。ゲルを乾燥し、そして-80℃で一晩曝するオート ラジオグラフィーにより可視化した。 図12は、¹²⁵I放射標識TGF-β1および部分精製TGF-βR(136アミノ酸細胞外ドメ イン)を用いる架橋実験の結果を示す。予想される架橋産物が約30kDに泳動した ことが観察される。この産物は、特異的結合相互作用によって形成される。何故 なら、その出現は過剰の非放射性TGF-β1(1000倍モル濃度)の添加によって、完 全になくなるからである。これらのデータは、IL-1様融合パートナーにより機能 的なTGF-βレセプターが細菌内で生産され得ることを示す。実施例８： IGFBP-3ドットブロットアッセイ IGFBP-3ドットブロットアッセイのために、予め切り取ったImmobilon-Pメンブ ラン(Millipore)を５秒間メタノールに浸漬し、Tris-緩衝化生理食塩水(TBS)で 濯ぎ、次に10分間TBSに浸漬した。メンブランをドットブロット装置に載せ、そ して各ウエルに50μlのTBSを加えた。サンプルを真空吸引によりメンブランに載 せた。次に、メンブランを、TBS＋３%脱脂粉乳(CARNATIONブランド)中、室温で ２時間、ブロックした。¹²⁵I放射標識IGF-1(１μl/mlブロッキング緩衝液)を添 加し、室温で２時間インキュベートした。緩衝液を捨て、そしてフィルターをTB Sで洗浄した(室温で２×15分洗浄)。次にメンブランを10分間風乾し、次に-80℃ で一晩、Kodak XR-Omatフィルムに曝した。 図13は、(１)DsbA-ユビキチン-IGFBP-3融合物(pDM15427)、(２)ユビキチン-IG FBP-3融合物(pDJ12875)、または(３)「ベクターのみ」コントロール(pDJ12887) を発現する株の祖抽出物(「可溶性」画分)の結合活性を測定するための、¹²⁵I放 射標識IGF-Iを用いたドットブロット結合アッセイの結果を示す。サンプルを予 めユビキチンヒドロラーゼで前処理した(+UH)かまたは処理しなかった(-UH)かに かかわらず、同様の結果が得られた。このことから、完全な融合タンパク質が、 切断されたIGFBP-3タンパク質と同じくらい効率的にリガンドを結合し得ること を示す。この場合、活性タンパク質を得るためにユビキチン切断は必要ではない 。 この結果は、DsbA融合パートナーが生物活性のあるIGFBP-3の回収率を約16倍 上昇させることを明らかに示す(４倍系列希釈をブロットで用いる)。実施例９： 哺乳動物細胞におけるIL-1-β-IGFBP-3融合タンパク質の発現 哺乳動物細胞においてIL-1-β-IGFBP3融合タンパク質をコードする発現プラス ミドpDMl1430を、プラスミドpDM16964由来の融合配列をpDJ12147(pRcCMVの欠失 誘導体(InVitrogen Crop，La Jolla，CA)であって、ヒトサイトメガロウイルス プロモーターおよびエンハンサー、ならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化シ グナルを利用する)中に挿入することによって、構築した。プラスミドpDM16964 由来の融合配列は、開始メチオニン、成熟ヒトIL-1-βの153個のアミノ酸、およ び成熟ヒトIGFBP-3の264個のアミノ酸のコドンを含有する。 この構築物および対応する非組換えプラスミド(「ベクター」)を使用し、DEAE -デキストラン法を用いて一時的にCOS-M6細胞をトランスフェクトした(Seedおよ びAruffo、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3365-3369，1987)。トランスフェク ション72時間後、0.2% NP-40を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞層を４℃ にて30分間溶解することによって、細胞抽出物を作成した。この抽出物を遠心分 離して、不溶性破砕物を除去し、そして上清を結合アッセイに使用した。 図14は、内因性のIGF-結合活性が、COS細胞抽出物中で、45〜50kDのサイズ範 囲の広いバンド(Y)で見い出されたことを示す。図14右は、IL1β-IGFBP3(「IL1- BP3」)をコードするpDM15430で、上記のように一時的にトランスフェクトしたC OS細胞由来の架橋サンプルのSDS-PAGEを示す。図14左は、ベクター単独(「ベク ター」)でトランスフェクトしたCOS細胞由来の架橋サンプルのSDS-PAGEを示す。 各セットのゲルは、エンドグリコシダーゼＦ処理なし、または「非放射性」IGF 競合の左側のレーンを有する。中央のレーンは、エンドグリコシダーゼＦでの処 理後の結果を示し、そして右側のレーンは、過剰の「非放射性」IGFを用いた競 合の結果を示す。上記のように、エンドグリコシダーゼＦを用いて架橋サンプル を処理した後、この内因性のIGF結合バンドは、約40kDで移動するより鮮明なバ ンドに縮小した。IL-1-β-IGFBP-3融合構築物でトランスフェクトした細胞では 、予想されるサイズ範囲(約55kD＋、図14中の「X」)で架橋バンドが観察された 。しかし、エンドグリコシダーゼFを用いた処理では、Xバンドの移動度は変わら なかった。このことは、これら細胞中で蓄積したIL1β-IGFBP-3融合タンパク質 がグリコシル化されなかったことを示す。観察された結合のすべては、それが非 放射性IGFで首尾良く競合したように特異的であった(図14の右のレーンを参照の こと)。 並行実験で、IL-1融合パートナーを欠いているMet-IGFBP-3構築物でトランス フェクトした細胞は、上記の基準により任意の検出可能なIGF結合を示さなかっ た(データは示さず)。その他の実験は、IGFBP-3遺伝子の天然形態(即ち、それ自 身のシグナル配列を有する)が、哺乳動物細胞においてグリコシル化生成物を産 生することを示した(Sprattら、Growth Factors 3:63-72、1990)。従って、本実 施例のIL-1融合物は、IGFBP-3タンパク質のグリコシル化を生じ得る分泌タンパ ク質が通る正常の経路である、ERおよびゴルジを通る通過によるのではなく、(I L-1-β自身のように)哺乳動物細胞内に偏在するようである。実施例10： リーダー欠失DsbC、変異体、および融合物の発現 E. coliにおける、最近同定されたDsbタンパク質のファミリーのメンバーであ るDsbCは、先に記載された他の酸化還元酵素に対して、明らかな一次配列相同性 を持たない。この遺伝子は、以前にはxprAと命名されていた(Missiakasら、EMBO J. 13：2013-2020、1994；LovettおよびKolodner、J．Bacteriol. 173：353-364 、1991)。この遺伝子のリーダーを欠失異型(version)を、先に記載した(例えば 、 上記実施例１中のpYZ22070を参照)T7発現ベクター中に、鋳型としてのE．co1i D NA、ならびにプライマー を用いるPCRによりクローン化した。得られたプラスミドpDM25492を、さらに以 下のように改変した：推定される２重 変異の方法を用いて変えた。得られたプラスミドをpDM46805と命名した。リーダ ー欠失DsbC(２重システイン活性部位ループを有するまたは有さない)のIGF-Iへ の融合物を構築し、それぞれ、プラスミドpDM15486およびpDM46806を生成した。 これら４つのプラスミドpDM15486、pDM25492、pDM46805、およびpDM46806中に 存在するリーダー欠失DsbC変種のDNA配列を、図32、33、25、31にそれぞれ挙げ る。 図15は、それらがW3110DE3中に導入される場合に、これらのプラスミドにより 発現されるタンパク質を示す。上記の実施例１に記載されるように、誘導および 選択的抽出の後、サンプルを４〜20％のアクリルアミドグラジエントゲル上で分 離し、クーマシーブルーで染色し、そして写真撮影した。図15のパネル「A」お よび「B」は、pDM25492およびpDM46805をそれぞれ有する株の音波処理後のTEX抽 出物(T)および残りの可溶性画分(S)を示す。IGF-I融合構築物、pDM15486およびp DM46806の対応するサンプルを、図15のパネル「Ｃ」および「Ｄ」に示す。DsbC タンパク質の予想される位置を各場合に矢印で示す。 これらの結果は、リーダー欠失DsbCが、IGF-IへのDsbCの融合物のように、効 率的に細胞質から輸送されることを明瞭に示す。２重システイン活性部位ループ の存在は、輸送のために明らかに必要とされない。実施例１１：ミニDsbAの発現と融合 DsbAの２重システイン活性部位のループ付近の全領域を取り除いた効果を試験 するために、DsbA発現ベクターpYZ9206(上記の実施例１に記載)を、このプラス ミドの特有のBssHIIおよびBglII部位間のDNAを、以下の配列の合成DNAに置換す ることにより改変した： この置換（これ以後は、「ミニDsbA」と呼ぶ）の効果は、元の（成熟）DsbAのア ミノ酸#21-62の代わりにアミノ酸Ser-Gly-Serを用いることである。２重システ イン活性部位のループ（#30-33に位置する）を本手法により欠失させる。得られ たプラスミド（pDM25452）をミニDsbAのカルボキシ末端にユビキチンとIGF配列 とを融合することによりさらに改変し、pDM25486を作製した。pDM25499は、ユビ キチンのアミノ末端の45アミノ酸をコードするDNAをさらに欠失させた、pDM2548 6の変種である。 pDM25452、pDM25486、およびpDM25499にコードされたリーダー欠失ミニDsbAの DNA配列を、図28、43、および41にそれぞれ列挙する。 図１６は、上記の実施例１０中の構築物について記載されたように試験した場 合に、これらのプラスミドにより発現されたタンパク質を示す。パネル「Ａ」お よび「Ｂ」は、pYZ9206（リーダー欠失DsbA）とpDM25452（リーダー欠失ミニDsb A）との比較を示す。各場合において、誘導されたサンプルを、TEX(T)画分、残 渣可溶性(S)画分、および不溶性(I)画分に分画した。パネル「Ｃ」は、pDM25499 で得られた結果を示す。 この結果は、ミニDsbAが容易に細胞質から移動し、可溶型で蓄積することを示 す。２重システイン活性部位のループの存在は、リーダー欠失DsbAの輸送機能に 明らかに無関係である。 以下の表６に、本明細書に含まれる実施例に用いられたプラスミドを記載する 。 実施例１２：インビボビオチン化DsbAおよびILI-βの発現 最近の報告（Schatz，Bio/Technology 11:1138-1143,1993）で、E. coliのビ オチンホロ酵素合成酵素の標的基質に見かけ上擬態するコンセンサス13merペプ チド配列を同定している。DsbAおよびILI-βのカルボキシ末端へこの配列を付加 した効果を調べるために、ベクターpYZ22055（上記のpYZ9206に、カルボキシ末 端リジン、コドン189の下流の配列が、合成された次の配列であること以外は類 ；下線は終止コドン）中のリーダー欠失DsbA遺伝子を、合成配列： リンカー内の特有のSphI部位とXhoI部位との間に挿入することにより改変した。 この操作で、リーダー欠失DsbA配列のすぐ下流のビオチン化基質ペプチド配列が 融合される。得られたプラスミドはpDM25450である。コントロールのプラスミド pDM25453は、天然DsbAリーダー配列がpDM25453中において回復されたことを除い てはpDM25450と一致する。 pDM15457は、上記のpDM25450に類似するように構築された。それは、ILI-βの すぐ下流のビオチン化基質ペプチドをコードする。pDM15449は、非改変ILI-βを 発現する親ベクターである。 pYZ22055、pDM25450、pDM25453、およびpDM15449に存在するDNA配列を、それ ぞれ図27、21、20、および35に列挙する。 図17は、これらのプラスミドにより発現されたタンパク質が前述の実施例（上 記実施例１、10、および11を参照のこと）で記載されたように分析された場合に 得られた結果を示す。TEX画分のみを分析に供した。ゲルをクマシーブルーで染 色して撮影し、あるいはウエスタンブロットを行い、ビオチン化タンパク質を検 出するように設計された試薬キット（Clontech's GENE-TECT カタログ番号K1035 -1;Palo Alto，CA）で処理した。 各パネルのレーン「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、および「Ｄ」には、pYZ22055、pD M25450、pDM15449、およびpDM15457に対応する抽出物を流した。13merのビオチ ン化基質ペプチドを発現する２つの構築物（pDM25450およびpDM15457）は、ウエ スタンブロットでクリアな陽性シグナルを提供するが、コントロールは提供しな い。 この検出系をさらに検討するために、pDM25450およびpDM25453（両方ともビオ チン化基質の13merをコードする）由来のTEX抽出物を、製造者の指示に従って、 Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（QUIAGEN，Inc．Chatsworth，CA）に かけた。これらの２つのプラスミドによりコードされたDsbAタンパク質の改変カ ルボキシ末端は、Ni-NTA樹脂への結合を容易にする一続きの６つのヒスチジン残 基を含む。pDM25453タンパク質の分泌後（リーダーがリーダーペプチダーゼによ り切除された場合）、タンパク質はpDM25450によりコードされたリーダー欠失異 型に一致する。従って、この実験において精製された２つのDsbAタンパク質間の ほんのわずかな差は、それらが細胞質から外に輸送されたルートである：pDM254 53産物は一般の分泌経路により、そしてpDM25450産物は（おそらく）いくつかの 新規な機構により分泌される。これらを試験した場合（それぞれ、パネル「Ｅ」 および「Ｆ」）、これらの精製タンパク質は、ビオチン化される効率に少なくと も10倍の差を示す。 実施例３に記載されたようにアッセイした場合、個々の試験では、２つのタン パク質の比酵素活性（酸化還元酵素）に差を示さない。これは、両タンパク質が 正しく折り畳まれていることを示唆している。 以上を考え合わせると、これらのデータは、リーダー欠失DsbAタンパク質の細 胞質外輸送の独立した様式(mode)についての強力な証拠を提供する。実施例１３：ILI-β R11G変異体の発現および輸送 インターロイキン-1-β配列内のいくつかの位置での置換変異の効果を、生物 活性について評価した。R11G(Arg-11からGlyへの)変異体は、１つのIL1レセプタ ーに対して通常の結合を示すが生物活性は示さない。レセプター結合は、タンパ ク質の通常のコンホメーション折り畳みを示唆している。従って、R11G変異体は E．coliにおけるこの輸送機能に関して影響され得ないと考えるのが合理的であ り得る。 pDM25466は、当業者に周知の部位特異的変異誘発法によりコドン#11がCGG(Ar g)からGGG(Gly)に置換されたことを除いてはpDM15449(上記の実施例１２を参照 のこと)に類似している。pDM25466におけるIL1遺伝子のDNA配列を図３７に列挙 する。 図１８は、pDM15449（パネル「Ａ」）またはpDM25466（パネル「Ｂ］）を有す る誘導細胞から得られたサンプルの分画を示す。変異タンパク質の蓄積レベルは 減少するが、輸送は明らかに生じる。実施例１４：DsbA−酵母 MATα-2 相同異質ドメイン（homeodomain）の発現 およそ６０アミノ酸の酵母α-2相同異質ドメインが、DNAに結合するに十分で ある(Wolbergerら、Cell 67:517-528,1991)。プライマー ならびに、S．cerevisiaeゲノムDNA（Sigma Chem．Co.，St．Louis，MO）を基質 として用い、0.22kbのPCRフラグメントを得、SphIとNsiIとで切断し、そして同 酵素で切断されたpYZ22055ベクター（上記）中にクローニングした。得られたプ ラスミドのpDM15478は、DsbAのカルボキシ末端とα-2 相同異質ドメインのアミ ノ末端との間にフレームに合うように融合したものを有する。このプラスミドを 有する株を、前述の実施例に記載されたように試験した。 図１９Ａは、融合タンパク質の発現とTEX(T)画分および残渣可溶性(S)画分へ のその部分的な分画を示す。実施例１２に記載されたNi-NTA法を用いて、精製融 合タンパク質を(T)画分および(S)画分から調製した。これらの精製画分を、図１ ９ＡのパネルN1およびN2に示す。 図１９Ｂは、両方の精製画分がDNA結合活性を示すことを示す。オリゴヌクレ オチドは、まさにWolbergerら(前出)に記載されたものであり、そしてコントロ ールパネル(control panel)は、(a)タンパク質なし、(b)DsbA標準(Epicentre Te chnologies，Madison，WIより購入)、および(c)ビオチン化DsbAである；上記の 実施例１２を参照のこと。(d)および(e)は、精製融合タンパク質サンプルN1およ びN2である。全サンプルは、TBEアクリルアミド濃度勾配ゲル(4-20%)上に２重測 定で添加される。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミド(1μg/ml)で染色し、 撮影する。 結果は、融合タンパク質サンプルからのDNA結合活性を明らかに示しているが 、コントロールでは示さない。 本明細書中に言及されている全ての刊行物および特許出願は、各々個々の開示 または特許出願が、詳細および個別に参考として援用されることが示されている 限り、同程度に参考として本明細書中に援用されている。 本発明は十分に記載されており、多くの変更および修正が添付の請求の範囲の 理念または範囲から逸脱することなくさらになし得ることは、当業者には明らか である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ザン，ヤン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94087, サニーベイル，23―アイ，イー．レミング トン ドライブ 575 (72)発明者 オルソン，パメラ エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014, カパーティノ，バーンハート アベニュー 18630 (72)発明者 オルセン，ディビッド アール. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク，ヘッジ ロード 276 (72)発明者 カリロ，ペドロ エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109, サン フランシスコ，カリフォルニア ス トリート ナンバー７ 1966

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、IL-1α、IL-1ra、DsbA、DsbC、およ びFGFからなる群より選択されるβ-三つ葉形折り畳み構造ファミリーのポリペプ チド、リンカーペプチド、および目的のタンパク質またはポリペプチドを含有し 、ここで該リンカーペプチドはβ-三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチ ドと該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そして該β-三つ 葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドは、該融合タンパク質またはポリペプ チドのアミノ末端を構成し、そしてシグナル配列を欠く、核酸。 ２．前記リンカーペプチドがポリペプチド切断部位を含有する、請求項１に記 載の核酸。 ３．前記リンカーペプチドがユビキチン分子を含む、請求項２に記載の核酸。 ４．前記β-三つ葉形構造ファミリーポリペプチドが成熟E．coli DsbAである 、請求項１に記載の核酸。 ５．前記成熟β-三つ葉形構造ファミリーポリペプチドが、インターロイキン- 1レセプターアンタゴニスト、E.coli DsbC、およびE．coli DsbAからなる群より 選択される、請求項１に記載の核酸。 ６．前記成熟ポリペプチドが、インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト 、E．coli DsbA、およびE．coli DsbCからなる群より選択されるリーダー欠失ト ランスロケーションポリペプチドである、請求項１に記載の核酸。 ７．前記融合パートナーが、DsbAおよびDsbCからなる群より選択される変異E ．coliポリペプチド変種であり、ここで該変異E．coliポリペプチドフラグメン ト が２重システイン活性部位のループドメインを欠く、請求項１に記載の核酸。 ８．前記目的のポリペプチドが異種ポリペプチドである、請求項１に記載の核 酸。 ９．融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であって、 該融合ポリペプチドが、DsbAまたはDsbC、ユビキチン分子を含むリンカーペプ チド；および目的のタンパク質またはポリペプチドを含有し、 ここで、該リンカーペプチドが該DsbAまたはDsbCと該目的のタンパク質またはポ リペプチドとの間に位置し、そして該DsbAまたはDsbCは、該融合タンパク質また はポリペプチドのアミノ末端を構成し、そしてシグナル配列を欠く、核酸。 １０．融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であって、該融合 タンパク質またはポリペプチドが： a)成熟E．coli DsbAと、２重システイン活性部位のループドメインを欠く 成熟E．coli DsbAの変異ポリペプチド変種とからなる群より選択されるポリペプ チド； b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド； および c)目的のタンパク質またはポリペプチドを含み、 そしてここで該DsbAまたはDsbAの変種は、該目的の融合タンパク質またはポリペ プチドのアミノ末端を構成する、 核酸。 １１．融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であって、該融合 タンパク質またはポリペプチドが： a)成熟E．coli DsbCと、２重システイン活性部位のループドメインを欠く 成熟E．coli DsbCの変異ポリペプチド変種とからなる群より選択されるポリペプ チド； b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド； および c)目的のポリペプチドを含み、 そしてここで該DsbCまたはDsbCの変種は、該目的の融合タンパク質またはポリペ プチドのアミノ末端を構成する、核酸。 １２．融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であって、該融合 タンパク質またはポリペプチドが： a)成熟インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト； b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド； および c)目的のポリペプチドを含み、 そしてここで該インターロイキン-1レセプターアンタゴニストは、該目的の融合 タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端を構成する、核酸。 １３．請求項１に記載の核酸を含有する、発現ベクター。 １４．請求項１に記載の核酸を含有する、宿主細胞。 １５．宿主細胞であって、以下： a)該宿主細胞中で融合タンパク質またはポリペプチドを発現し得る発現ベクタ ーであって、該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)インターロイキン-1α、インターロイキン-1-ra、DsbA、DsbC、およびF GFからなる群より選択されるβ-三つ葉形折り畳み構造ファミリーのポリペプチ ド、 ii)タンパク質分解酵素切断部位を含むリンカーペプチド、 および iii)目的のタンパク質またはポリペプチドを含有し、 ここで該リンカーペプチドは該β-三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチ ドと該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そしてさらに該β -三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドは、該融合タンパク質またはポ リペプチドのアミノ末端を構成し、シグナル配列を欠く； ならびに 宿主細胞の細胞質中で、該タンパク質分解酵素切断部位を特異的に認識するタ ンパク質分解酵素を発現し得る核酸 を含む、宿主細胞。 １６．宿主細胞であって、以下： a)該宿主細胞中で融合タンパク質またはポリペプチドを発現し得る発現ベクタ ーであって、該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)成熟E．coli DsbAと、２重システイン活性部位のループドメインを欠く 成熟E．coli DsbAの変異ポリペプチド変種とからなる群より選択されるポリペプ チド； ii)タンパク質分解酵素切断部位を含むリンカーペプチド； および iii)目的のタンパク質またはポリペプチドを含み、 ここで該リンカーペプチドは該β-三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチ ドと該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置し、そしてさらに該β -三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドは、該融合タンパク質またはポ リペプチドのアミノ末端を構成し、シグナル配列を欠く； ならびに 宿主細胞の細胞質中で、該タンパク質分解酵素切断部位を特異的に認識するタ ンパク質分解酵素を発現し得る核酸 を含む、宿主細胞。 １７．前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒドロラーゼであり、前記切断部 位がユビキチンヒドロラーゼ部位である、請求項１５または１６に記載の宿主細 胞。 １８．融合ポリペプチドであって、以下： a)本質的に成熟ポリペプチドの少なくとも1つのフラグメントからなる、 細胞質外輸送を導き得る融合パートナーであって、ここで、該成熟ポリペプチド がβ-三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドとリーダー欠失トランスロ ケーションポリペプチドとからなる群より選択される、融合パートナー； および b)目的のタンパク質またはポリペプチドであって、ここで該タンパク質ま たはポリペプチドは該融合パートナーのカルボキシ末端に対し遠位に位置する、 タンパク質またはポリペプチド を含む、融合ポリペプチド。 １９．さらに前記融合パートナーと前記目的のタンパク質またはポリペプチド との間に位置するリンカーペプチドを含有する、請求項１８に記載の融合ポリペ プチド。 ２０．前記リンカーペプチドが切断部位を含む、請求項１９に記載の融合ポリ ペプチド。 ２１．前記切断部位がユビキチンヒドロラーゼ切断部位である、請求項２０に 記載の融合ポリペプチド。 ２２．前記成熟ポリペプチドが、インターロイキン-1レセプターアンタゴニス ト、E．coli DsbC、およびE．coli DsbAからなる群より選択されるβ-三つ葉形 折り畳み構造ファミリーポリペプチドである、請求項１８に記載の融合ポリペプ チド。 ２３．前記成熟ポリペプチドが、インターロイキン-1レセプターアンタゴニス ト、E．coli DsbA、およびE．coli DsbCからなる群より選択されるリーダー欠失 トランスロケーションポリペプチドである、請求項１８に記載の融合ポリペプチ ド。 ２４．前記融合パートナーが前記成熟ポリペプチドである、請求項２２または ２３に記載の融合ポリペプチド。 ２５．前記融合パートナーが、DsbAとDsbCとからなる群より選択される変異E ．coliポリペプチドフラグメントであり、さらに該変異E．coliポリペプチドフ ラグメントが２重システイン活性部位のループドメインを欠く、請求項１８に記 載の融合ポリペプチド。 ２６．前記目的のポリペプチドが、酵素、成長因子、抗体ポリペプチド、DNA 結合タンパク質、RNA結合タンパク質、および膜レセプターからなる群より選択 されるタンパク質を包含する、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。 ２７．前記目的のポリペプチドが、異種ポリペプチドである、請求項１８に記 載の融合ポリペプチド。 ２８．融合ポリペプチドであって、以下： a)成熟E．coli DsbAと、２重システイン活性部位のループドメインを欠く 成熟E．coli DsbAの変異ポリペプチド変種とからなる群より選択されるポリペプ チドから本質的になる融合パートナー； b)ユビキチン分子を含むリンカーペプチド； および c)目的のタンパク質またはポリペプチド、 ここで該目的のタンパク質またはポリペプチドは、該融合パートナーのカルボキ シ末端に対し遠位に位置し、さらに該リンカーペプチドが該融合パートナーと該 目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置する、 を含む、融合ポリペプチド。 ２９．融合タンパク質またはポリペプチドを生成する方法であって、 該融合タンパク質またはポリペプチドが、インターロイキン-1α、インターロ イキン-1ra、DsbA、DsbC、およびFGFからなる群より選択されるβ-三つ葉形折り 畳み構造ファミリーのポリペプチド、および目的のタンパク質またはポリペプチ ドを含有し、 ここで該β-三つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドは、該目的のタンパ ク質またはポリペプチドのアミノ末端を構成し、シグナル配列を欠く、 以下の工程： a)宿主細胞中に該融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸 を導入し、それにより形質転換された宿主細胞を生成する工程； b)該融合タンパク質またはポリペプチドを発現するに適切な条件下で、 該形質転換された宿主細胞を培養する工程； および c)該融合タンパク質またはポリペプチドを精製する工程 を包含する、方法。 ３０．実質的に精製された目的のタンパク質またはポリペプチドを生成する方 法であって、以下の工程： a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を導 入する工程であって、該融合ポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも１つのフラグメントから本質的にな る、細胞質外輸送を導き得る融合パートナー（ここで該成熟ポリペプチドがβ- 三つ葉形折り畳み構造ポリペプチドとリーダー欠失トランスロケーションポリペ プチドとからなる群より選択される）、および ii)目的のタンパク質またはポリペプチド（ここで該目的のポリペプ チドが該融合パートナーのカルボキシ末端に対し遠位に位置する）、 iii)切断部位をコードするリンカーペプチド（ここで該リンカーペプ チドが該融合パートナーと該目的のポリペプチドとの間に位置する） を含有する； それにより形質転換された宿主細胞を産生する工程； b)該融合ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で、該形質転換された 宿主細胞を培養し、それにより該融合ポリペプチドを発現する工程； c)該タンパク質分解切断部位を認識するタンパク質分解酵素または切断剤 で該融合ポリペプチドを切断し、それにより該目的のポリペプチドまたはタンパ ク質を生成する工程； ならびに、 d)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製する工程 を包含する、方法。 ３１．実質的に精製された目的のタンパク質またはポリペプチドを生成する方 法であって、以下の工程： a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を導 入する工程であって、該融合タンパク質またはポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも１つのフラグメントから本質的にな る、細胞質外輸送を導き得る融合パートナー（ここで該成熟ポリペプチドがβ- 三つ葉形折り畳み構造ポリペプチドとリーダー欠失トランスロケーションポリペ プチドとからなる群より選択される）、および ii)目的のタンパク質またはポリペプチド（ここで該目的のタンパク 質またはポリペプチドが該融合パートナーのカルボキシ末端に対し遠位に位置す る）、 iii)切断部位をコードするリンカーペプチド（ここで該リンカーペプ チドが該融合パートナーと該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置 する）、 を含有する； それにより形質転換された宿主細胞を産生する工程； b)該融合タンパク質またはポリペプチドを発現するのに適切な条件下で、 該形質転換された宿主細胞を培養し、それにより該融合ポリペプチドを発現する 工程； c)該融合タンパク質またはポリペプチドを精製し、それにより実質的に精 製された融合タンパク質またはポリペプチドを生成する工程； d)該タンパク質分解切断部位を認識するタンパク質分解酵素または切断剤 で該実質的に精製された融合ポリペプチドを切断し、それにより、該目的のタン パク質またはポリペプチドを生成する工程； ならびに e)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製し、それにより実質的に 精製された目的のタンパク質またはポリペプチドを得る工程 を包含する、方法。 ３２．前記融合パートナーが、成熟E．coli DsbAと２重システイン活性部位の ループドメインを欠く該E．coli DsbAの変異ポリペプチドフラグメントとからな る群より選択されるポリペプチドから本質的になる、請求項３０または３１に記 載の方法。 ３３．前記融合パートナーが、成熟E．coli DsbCと２重システイン活性部位の ループドメインを欠く該E．coli DsbCの変異ポリペプチド変種とからなる群より 選択されるポリペプチドから本質的になる、請求項３０または３１に記載の方法 。 ３４．前記融合パートナーが、完全成熟インターロイキン-1レセプターアンタ ゴニストポリペプチドからなる、請求項３０または３１に記載の方法。 ３５．前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒドロラーゼであり、前記切断部 位がユビキチンヒドロラーゼ部位である、請求項３１に記載の方法。 ３６．実質的に精製された目的のポリペプチドを生成する方法であって、以下 の工程： a)宿主細胞中に融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を 導入する工程であって、該融合ポリペプチドが、 i)成熟ポリペプチドの少なくとも１つのフラグメントから本質的にな る、細胞質外輸送を導き得る融合パートナーにこで該成熟ポリペプチドがβ-三 つ葉形折り畳み構造ファミリーポリペプチドとリーダー欠失トランスロケーショ ンポリペプチドとからなる群より選択される）、および ii)目的のタンパク質またはポリペプチド（ここで該目的のタンパク 質またはポリペプチドが該融合パートナーのカルボキシ末端に対し遠位に位置す る）、 iii)切断部位をコードするリンカーペプチド（ここで該リンカーペプ チドが該融合パートナーと該目的のタンパク質またはポリペプチドとの間に位置 する） を含有し； さらに該宿主細胞が、該宿主細胞中で、該切断部位を特異的に認識するタンパ ク質分解酵素を発現し得る核酸を含有し； それにより形質転換された宿主細胞を産生する工程； b)該融合タンパク質またはポリペプチドおよび該タンパク質分解酵素を発 現するのに適切な条件下で、該形質転換された宿主細胞を培養し、それにより該 融合タンパク質またはポリペプチドを発現し、該融合タンパク質またはポリペプ チドのインビボ切断を引き起こし、そして該目的のタンパク質またはポリペプチ ドを生成する工程； ならびに c)該目的のタンパク質またはポリペプチドを精製し、それにより実質的に 精製された目的のタンパク質またはポリペプチドを得る工程 を包含する、方法。 ３７．前記融合パートナーが、成熟E．coli DsbAと２重システイン活性部位の ループドメインを欠く成熟E．coli DsbAの変異ポリペプチド変種とからなる群よ り選択されるポリペプチドから本質的になる、請求項３６に記載の方法。 ３８．前記タンパク質分解酵素がユビキチンヒドロラーゼであり、前記切断部 位がユビキチンヒドロラーゼ切断部位である、請求項３６に記載の方法。