JP2002530114A

JP2002530114A - 宿主細胞において抗菌カチオン性ペプチドを産生するための効率的な方法

Info

Publication number: JP2002530114A
Application number: JP2000584088A
Authority: JP
Inventors: ジャンブリアン，; ダニエルバートフェルド，
Original assignee: マイクロロジックスバイオテック，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2002-09-17
Also published as: WO2000031279A3; CA2351737A1; HK1040737A1; EP1131448A2; WO2000031279A2; AU1255300A

Abstract

(57)【要約】内因性に産生されたカチオン性抗菌ペプチドは、哺乳動物、鳥類、両生類、昆虫、および植物における宿主防御の偏在性成分である。カチオン性ペプチドはまた、治療剤として投与された場合に効果的である。しかし、カチオン性ペプチド療法の実際的な欠点は、薬剤を産生する費用である。本明細書中で記載される方法は、カチオン性ペプチドを組換え宿主細胞から効率的に産生する手段を提供する。これらの組換え的に産生されたカチオン性ペプチドは、宿主細胞タンパク質から陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して迅速に精製され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、組換えペプチドおよびタンパク質を宿主細胞から得る方法
に関する。詳細には、本発明は、ペプチドが高収率で発現されかつ容易に回収さ
れるカチオン性ペプチドを、組換え宿主細胞から産生および精製する、改善され
たプロセスに関する。

【０００２】（発明の背景）抗菌性ペプチド、特にカチオン性ペプチドは、その広い抗菌活性のスペクトル
および多剤耐性病原性微生物の急速な発生のため、新規な薬学的物質として注目
が高まっている。内因性ペプチド抗生物質は、哺乳類、鳥類、両生類、昆虫、お
よび植物における宿主防御の遍在的成分である。これらの内因性抗菌性ペプチド
は通常カチオン性両親媒性分子であり、１０個から４５個のアミノ酸残基および
過剰のリジンおよびアルギニン残基を含む。（概説については、Ｂｒｏｅｋａｅ
ｒｔら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３、１９９５；Ｇａｎｚ
およびＬｅｈｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６６：１９１，１９９５；
Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５８：１２８，１９９５；Ｈａ
ｎｃｏｃｋおよびＬｅｈｒｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ１６：８２，１９９８参照）
。カチオン性ペプチドの例としては、ウサギのデフェンシン、カニのタキプレシ
ン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）、ウシのバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ）
、カイコガのセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ａ、カエルのマガイニン、および
ウシのインドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）が挙げられる。ペプチドの作
用の主要な部位は、細菌および他の微生物の細胞膜である。このペプチドは、そ
の両親媒性の性質のため、膜を破壊し、カリウムイオンの損失、膜の脱分極、お
よび細胞質ＡＴＰの減少を引き起こす。

【０００３】その新たな合成または貯蔵部位からの放出が迅速に誘導され得るので、カチオ
ン性ペプチドは、微生物の侵入に対する抵抗の初期相において特に重要である。
カチオン性ペプチドはまた、治療薬として投与される場合にも有効である。局所
感染の処置において、例えば、αヘリックスのマガイニン改変体ペプチドは、糖
尿病における複数の微生物による（ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉｃ）足の潰瘍感染に
有効であることが示されており、そしてプロテグリン由来のペプチドは、癌患者
における複数の微生物による口腔の潰瘍の処置に有用であることが見いだされた
（ＨａｎｃｏｃｋおよびＬｅｈｒｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ１６：８２，１９９８
）。全身性感染に対する効力は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ腹膜感染の処置に用いられるαヘリックスペプチド、メチシリン耐性Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓおよびバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓに対するβシートプロテグリン、ならびにＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ真菌感染に対する伸長ヘリックスインドリシジンで示されてい
る（Ｇｏｕｇｈら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４９２２，１９９６；Ｓ
ｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ．４１：１７３８，１９９７；およびＡｈｍａｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２３７：１０９，１９９５）。従って、天然に存在する
カチオン性ペプチド、およびその合成改変体は価値のある抗菌性治療薬である。

【０００４】カチオン性ペプチドによる治療の実際的な欠点は、費用効率の良い薬剤の大量
産生方法がないことである。典型的には、カチオン性ペプチドの天然源からの単
離は費用効率が悪く、そして高い効力を有し得る操作されたカチオン性ペプチド
改変体の産生には適用されない。化学的ペプチド合成は天然かまたは操作された
かのいずれかのカチオン性ペプチドの製造に用いられ得るが、このアプローチは
非常に費用がかかる。

【０００５】従って、組換えＤＮＡ法を用いた宿主細胞中でのインビボ合成のような、代替
のより経済的かつ効率的な合成方法が必要とされる。研究者らは、カチオン性ペ
プチドの組換え産生のための種々の方法を試みた。例えば、カチオン性ペプチド
は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのような
細菌、酵母、昆虫細胞、およびトランスジェニック哺乳類中で産生された（Ｐｉ
ｅｒｓら、Ｇｅｎｅ１３４：７，１９９３，Ｒｅｉｃｈｈａｒｔら，Ｉｎｖｅ
ｒｔｅｂｒａｔｅＲｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．２１：１５，１９９２，Ｈ
ｅｌｌｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：４３５，１９９１，お
よびＳｈａｒｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１
：９３３７，１９９４）。

【０００６】Ｅ．ｃｏｌｉでの産生に多くの注目が集まった。なぜなら、当業者は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおいて組換えＤＮＡ技術を用いると高い生産性が得られるという事実を
熟知しているからである。しかし、小さいペプチドについては、より大きな融合
タンパク質の一部としてそれらを産生することがしばしば必要とされる。この技
術においては、そのペプチドの遺伝子をより大きなキャリアタンパク質の遺伝子
と連結し、そしてその融合体を単一のより大きなタンパク質として発現させる。
合成の後、ペプチドを融合パートナーから切断しなければならない。タンパク質
融合、特に遺伝子発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉにおける多数の文献が存在する。例えば
、多くの組換えタンパク質（例えば、インスリンＡおよびＢ鎖、カルシトニン、
βグロブリン、ミオグロビン、ならびにヒト成長ホルモン）が、Ｅ．ｃｏｌｉ中
で融合タンパク質として産生されている（ＵｈｌｅｎおよびＭｏｋｓ、「Ｇｅｎ
ｅＦｕｓｉｏｎｓｆｏｒＰｕｒｐｏｓｅｓｏｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ１８５：１２９−１４３ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１
９９０）。それにもかかわらず、宿主細胞からの組換え遺伝子発現は、特に、特
定のタンパク質を大量に産生することが所望される場合、多くの技術的問題を提
示している。例えば、タンパク質がカチオン性ペプチドの場合、そのようなペプ
チドは、おそらくはその小さいサイズのため、あるいは高度に規則的な三次構造
を欠くために、タンパク質分解を非常に受けやすい。この問題を解決するための
１つのアプローチは、プロテアーゼ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞株中で組換えカチ
オン性タンパク質を産生することである（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、米国特
許第５，５８９，３６４号およびＷＯ９６／０４３７３参照）。どのプロテアー
ゼ欠損株が特定の組換えタンパク質に対して有効であるかを予想する一般的な方
法は、まだ存在しない。

【０００７】原則として、組換えＤＮＡ技術は簡単（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）
である。しかし、複製、または細菌に対して毒性の産物（例えば、溶解性カチオ
ン性ペプチド）の産生を通じて細菌の増殖を妨害する任意の配列は、クローニン
グすることが困難である。不安定または毒性の外来ペプチド遺伝子産物（例えば
、カチオン性ペプチド）はまた、そのペプチドを宿主細胞タンパク質を含む融合
タンパク質の一部として発現させることによって安定化され得る。例えば、Ｃａ
ｌｌａｗａｙら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：１６１４，１９９３は、セクロピンＡをＥ．ｃｏｌｉ中でＬ−リブロキ
ナーゼ遺伝子産物の短縮部分との融合ペプチドとして発現させた。Ｐｉｅｒｓら
、Ｇｅｎｅ１３４：７、１９９３は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
およびデフェンシン（ＨＮＰ−１）または合成セクロピン−メリチンハイブリッ
ドのいずれかを含む融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。他方、Ｈａ
ｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０：６
６４，１９９６は、カイコのモリシン（ｍｏｒｉｃｉｎ）をＥ．ｃｏｌｉ中でβ
−ガラクトシダーゼまたはマルトース結合タンパク質部分との融合タンパク質と
して発現させた。

【０００８】高効率産生において宿主細菌細胞に対する細菌溶解性ペプチドの毒性の効果を
回避するため、およびペプチドのタンパク質溶解性分解を回避するための、より
良い選択肢の１つは、異種タンパク質を変性した不溶形態として封入体中に駆動
するという細菌宿主に本来そなわっている機構を利用することである。

【０００９】上記に概略を示したアプローチには、小さい単一ペプチド（およそ１０％）を
大きい融合タンパク質の中で用いることによって課される、全体としての生産性
に対する固有の限界がある。

【００１０】従って、カチオン性ペプチドを組換え宿主細胞から効率的に産生する手段に対
する必要性が存在する。

【００１１】（発明の要旨）本発明は、選択されたポリペプチドを大量に発現させるための組成物および方
法を提供する。本発明の１つの局面では、大量の選択されたポリペプチドは、不
溶性タンパク質として発現される核酸分子に作動可能に連結されたプロモーター
を含むマルチドメイン融合タンパク質発現カセットを利用して発現され得、ここ
で核酸分子は、構造（カチオン性ペプチド）−［（切断部位）−（カチオン性ペ
プチド）］_nを含むポリペプチドをコードし、ここでｎは１から１００の間の値
を有する整数である。特定の実施形態において、切断部位が、上記構造（例えば
、（切断部位）−（カチオン性ペプチド）−［（切断部位）−（カチオン性ペプ
チド）］_n（切断部位）、ここでｎは１から１００の間の値を有する整数である
）のいずれの側にも挿入され得る。

【００１２】特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を利用して、規定した数の発現さ
れるべきカチオン性配列を特異的に付加するために、ユニット：−（切断部位）
−（カチオン性ペプチド）−が、上記発現カセットに付加され得る。種々の実施
形態において、ｎは下限で２、３、５、１０、または、２０、そして上限で１０
、１５、２０、３０、４０、５０、７５、または８０の値を有する整数である（
例えば、ｎは約２から３０、２から４０など、５から３０、６または７から４０
などの間、１０または２０まで、から４０，５０、７０または８０までの整数で
あり得る）。一例として、１つの実施形態において、ｎは５から４０の間、また
は１０から４０までの間の値を有する。

【００１３】特定の実施形態において、核酸分子はさらにキャリアタンパク質を含み得る。
種々の実施形態において、キャリアタンパク質が発現カセットによって発現され
る限りにおいて、このキャリアタンパク質は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ
末端のいずれかに位置し得る。広範な範囲のキャリアタンパク質が利用され得、
例えば、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、またはＣＢＤの断片が挙げられる
。種々の実施形態において、キャリアタンパク質は１００アミノ酸長よりも大き
いか、等しいか、あるいはそれ未満であり得る。

【００１４】さらなる実施形態において、発現カセット内の切断部位は、例えば、低ｐＨに
よって、あるいは臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−
メチル−３’−ブロモインドレニン（ｂｒｏｍｏｉｎｄｏｌｅｎｉｎｅ）、ヒド
ロキシルアミン、ｏ−ヨードソ安息香酸、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナ
ーゼ、コラゲナーゼ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロ
テアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、またはトリプシンなどの試薬によ
って切断され得る。

【００１５】別の実施形態において、発現カセットは、より詳細には、（ａ）キャリアタン
パク質、（ｂ）構造（切断部位）−（アニオン性スペーサーペプチド）を有する
少なくとも１つのペプチドを有するアニオン性スペーサーペプチド成分、および
（ｃ）構造（切断部位）−（カチオン性ペプチド）を有する少なくとも１つのペ
プチドを有するカチオン性ペプチド成分から構成され得、ここでこの切断部位は
アニオン性スペーサーペプチドまたはカチオン性ペプチドのいずれの側にでも存
在し得、そしてエレメント（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は任意の順番および／
または数であり得る。さらなる関連の実施形態において、発現カセットは、（ａ
）構造（切断部位）−（アニオン性スペーサーペプチド）を有する少なくとも１
つのペプチドを有するアニオン性スペーサーペプチド成分、および（ｂ）構造（
切断部位）−（カチオン性ペプチド）を有する少なくとも１つのペプチドを有す
るカチオン性ペプチド成分から構成され得、ここで上記アニオン性スペーサーペ
プチド成分の累積電荷が上記カチオン性ペプチド成分の累積電荷を減少させる。

【００１６】アニオン性スペーサーが含まれる程度において、このようなスペーサーは、０
、１、２またはそれ以上のシステイン残基を有し得る。特定の実施形態において
、カチオン性ペプチドより多い、同数、または少ないアニオン性スペーサーが融
合構築物中に存在し得る。特定の実施形態において、アニオン性スペーサーはカ
チオン性ペプチドよりもサイズが小さい。

【００１７】広範な範囲の切断部位が利用され得、例えば、メチオニン残基が挙げられる。
加えて、広範な範囲のプロモーターが利用され得、例えば、ｌａｃＰプロモータ
ー、ｔａｃＰプロモーター、ｔｒｃＰプロモーター、ｓｒｐＰプロモーター、Ｓ
Ｐ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、ａｒａＰプロモーター、ｔｒｐＰプロモ
ーター、およびλプロモーターが挙げられる。

【００１８】本発明はまた、上記発現カセットを利用して、融合タンパク質を産生する方法
を提供する。１つの実施形態において、このような方法は、概して、発現カセッ
トを含む組換え宿主細胞を、融合タンパク質を産生するに十分な条件下および時
間で培養する工程を包含する。適切な宿主細胞の代表例としては、酵母細胞、真
菌細胞、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、および植物細胞が挙げら
れる。

【００１９】一旦融合タンパク質を産生すると、これをさらに精製および単離し得る。さら
に、融合タンパク質を切断して、各々の成分とし得る（例えば、低ｐＨを用いて
、あるいは臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチル
−３’−ブロモインドレニン、ヒドロキシルアミン、ｏ−ヨードソ安息香酸、Ｘ
ａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ
、またはトリプシンなどの試薬によって）。

【００２０】さらに、融合タンパク質または切断されたカチオン性ペプチドは、クロマトグ
ラフィー法を用いて精製され得る（例えば、陰イオンクロマトグラフィーカラム
または樹脂）。特定の実施形態において、カラムは、カラムに上記カチオン性ペ
プチドを付する前に、塩基によって荷電され、そして水で洗浄され得る。種々の
実施形態において、カラムは、水および約８Ｍまでの尿素で平衡化され得る。さ
らに、カチオン性ペプチドは、約８Ｍまでの尿素を含む溶液中に可溶化される。
さらなる実施形態において、カチオン性ペプチドは、温和な有機溶媒（例えば、
アセトニトリル、あるいはメタノールまたはエタノールのようなアルコール）を
含む溶液中に可溶化される。

【００２１】本発明のこれらおよび他の局面は以下の詳細な説明および添付の図面を参照す
ることで明らかになる。加えて、種々の参照文献が以下に示され、そしてその全
体が本明細書中に参考として援用される。

【００２２】（発明の詳細な説明）（１．概論）上記のように、固有に不安定または毒性の外来ペプチド遺伝子産物を安定化す
るための首尾のよいアプローチは、これらを関連の宿主細胞中で安定性を示すタ
ンパク質に融合させて発現させることである。しかし、小さいカチオン性ペプチ
ドの場合、融合タンパク質の産生は、所望のペプチドの小さな部分および明白な
低収率を生じる。生産性およびそれゆえプロセスの経済性における主たる利益は
、融合タンパク質における所望のペプチドの割合が実質的に大きい場合に達成さ
れ得る。この概念に対する好適な経路（ｒｏｕｔｅ）は、リンカー配列により分
離されたペプチドの連続的な配列のコピーを含む融合タンパク質（コンカトマー
（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒ）またはマルチドメインタンパク質）の発現に関係する
。リンカーは、コンカトマー（マルチドメインタンパク質）が切断されて、所望
のペプチドのモノマーを与える位置であり、この所望のペプチドは切断プロセス
の結果として、改変されたＣ末端を有する可能性が高い。

【００２３】他方で、１つの融合タンパク質当たりのカチオン性ペプチドのコピーの数の増
加は、このタンパク質を、ますます塩基性のタンパク質とし、このことは、融合
タンパク質の発現に影響し得、および／または宿主細胞に対するその毒性を増大
させ得る。

【００２４】組換え産生されるマルチドメインカチオン性タンパク質の高い塩基性を克服し
、そしてまたその毒性を低減させる１つのアプローチは、小さな酸性ペプチド配
列を、カチオン性ペプチドの正電荷を中和するリンカー配列中に含めることであ
る。マルチドメインタンパク質中のカチオン性ペプチドを高い割合にするという
経済的概念を保つために、酸性ペプチドはできる限り小さく、好ましくはカチオ
ン性ペプチドよりも小さく設計することが重要である。カチオン性ペプチドおよ
びアニオン性スペーサーからなるマルチペプチド前駆体構造の天然現象が、記述
されている（Ｃａｓｔｅｅｌｓ−Ｊｏｓｓｏｎら（１９９３）ＥＭＢＯＪ．、
１２巻、１５６９−１５７８）。この刊行物におい.て、著者らは、抗菌性カチ
オン性ペプチドであるアピダエシン（ａｐｉｄａｅｃｉｎ）の、ミツバチ（Ａｐ
ｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）などの昆虫中での天然の産生を記載している。アピ
ダエシンは、複数の繰り返し前駆体単位を含む単一の遺伝子として生成され、各
々がアピダエシンペプチド遺伝子（１８アミノ酸）とそれに先立つ酸性スペーサ
ー領域（６−８アミノ酸）からなる。さらなる実施形態において、Ｌｅｅら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＥｘｐ．Ｐｕｒｉｆ１２：５３（１９９８）は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおいて、１融合タンパク質当たり６コピーのカチオン性ペプチド、ブフォリ
ン（ｂｕｆｏｒｉｎ）ＩＩを発現した。これはまた、酸性ペプチドとしてカチオ
ン性ペプチド配列と交互に改変されたマガイニン介在配列を含んでいた。マガイ
ニン介在配列は、この配列が隣接するシステイン残基を含むことで「改変」され
ていた。Ｌｅｅら「酸性ペプチド中のシステイン残基の存在は、融合ペプチドマ
ルチマーの高レベル発現のために重要であった」による。

【００２５】初期の研究において、本発明者らは、異なるサイズのキャリアタンパク質を用
いてカチオン性ペプチドのモノマー形態およびポリマー形態を発現させた。これ
らの研究の試験キャリアタンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌ
ｏｖｏｒａｎｓｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＡ由
来の同じもののＣＢＤおよびその断片であった。選択したキャリアタンパク質は
、Ｅ．ｃｏｌｉ中で不溶形態としての高発現および蓄積の要件を満たしていた。
このアプローチは、カチオン性融合ペプチド遺伝子の数が３コピーを超える場合
に発現における有意な減少によって制限された。４コピーを超えるペプチド遺伝
子を含むベクターからは実質的に発現しなかった。新たな手順が設計され、これ
は、負に荷電したペプチドをコードする特定のアニオン性スペーサー配列を用い
て関連のカチオン性ペプチド遺伝子の増倍を可能とした。これらの研究において
、アニオン性スペーサーペプチドは、１１アミノ酸から構成された。カチオン性
ペプチド−アニオン性スペーサーペプチドマルチドメインタンパク質をコードす
る種々の遺伝子を構築し、そしてキャリアタンパク質に融合させた。３０コピー
を超える関連のカチオン性ペプチド遺伝子を含む全ての構築物について高レベル
の発現が、達成された。次の研究において、カチオン性ペプチド遺伝子とアニオ
ン性スペーサーのポリマーをキャリアから放出させ、そして直接発現させた。こ
れらの構築物は、高レベルの発現、およびキャリアを含まないマルチドメインタ
ンパク質中での標的カチオン性ペプチドの高いパーセンテージを達成した。

【００２６】（２．定義）以下の説明において、多数の用語が、広範に用いられる。以下の定義は、本発
明の理解を容易にするために提供される。

【００２７】「構造遺伝子」はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されるヌクレオチ
ド配列であり、次いでこれは、特定のポリペプチドに特有なアミノ酸の配列に翻
訳される。

【００２８】本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によって生成される断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアー
ゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成される断片のい
ずれをも意味する。核酸は、モノマーから構成され得、このモノマーは天然に存
在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチ
ド）、または天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在する
ヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、あるいは両方の組合せである。「単
離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡとして組み込まれていない核酸分子
である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離されたカチオン性ペプチドをコー
ドするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の
例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。

【００２９】「単離されたポリペプチドまたはタンパク質」は、炭水化物、脂質、核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）のような混入細胞成分、あるいは性質上このポリペプチドに
付随する他のタンパク質性不純物を本質的に含まないポリペプチドである。好ま
しくは、単離されたポリペプチドは、所望の用量での臨床的注射のために十分純
粋である。特定のカチオン性ポリペプチド調製物が単離されたカチオン性ポリペ
プチドを含むか否かは、尿素／酢酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびこの
ゲルのクーマシーブリリアントブルー染色、逆相高速液体クロマトグラフィー、
キャピラリー電気泳動、核酸検出アッセイ、およびリムルスアメーバ様細胞溶解
物試験（ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅｔｅｓｔ）のよ
うな方法を用いて決定され得る。このような方法の利用することによって、単離
されたポリペプチド調製物は少なくとも約９５％の純粋なポリペプチドである。

【００３０】「不溶性ポリペプチド」は、細胞を破砕して開き、細胞細片を遠心分離（例え
ば、１０，０００ｇから１５，０００ｇ）で沈殿させた場合に、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲルとクーマシーブルー染色で決定されるように可溶性成分を実質的
に生成しないポリペプチドをいう。

【００３１】「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。
典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接する遺伝子の５
’領域に位置する。プロモーターが誘導性プロモーターの場合、転写速度は、誘
導因子に応じて増大する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである
場合、転写速度は、誘導因子によって調節されない。

【００３２】用語「発現」は、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合、発
現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１つ以上のポリペプチド
への翻訳を含む。

【００３３】「クローニングベクター」は、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファ
ージのような核酸分子であり、これは宿主細胞中で自律的に複製する能力を有す
る。クローニングベクターは、典型的には、１つまたは少数の制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を含み、ここに外来のヌクレオチド配列が、ベクターの必須な生
物学的機能を損なうことなく、決定可能な様式で挿入され、同様に、マーカー遺
伝子をコードするヌクレオチド配列が挿入され得る。ここでこのマーカー遺伝子
は、クローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選択におけ
る使用に適する。マーカー遺伝子は、典型的には、抗生物質耐性を提供する遺伝
子を含む。

【００３４】「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現する遺伝子をコードする核酸分子（プ
ラスミド、コスミド、またはバクテリオファージ）である。典型的には、遺伝子
の発現は、プロモーターの制御下に置かれ、そして必要に応じて、少なくとも１
つの調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は、プロモーターに
「作動可能に連結した（された）」といわれる。同様に、調節エレメントおよび
プロモーターは、その調節エレメントがプロモーターの活性を調節する場合、作
動可能に連結されている。

【００３５】「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含
む任意の原核生物または真核生物細胞であり得る。この用語はまた、遺伝子操作
されて宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニング遺伝子を含む原核生物ま
たは真核生物細胞も包含する。

【００３６】本明細書において使用される「カチオン性ペプチド」は、９以上の等電点（ｐ
Ｉ）を有するペプチドをいう。カチオン性ペプチドは、少なくとも５アミノ酸長
であり、そして少なくとも１つの塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン
、ヒスチジン）を有する。カチオン性ペプチドは、通常５０アミノ酸より多くを
有さず、そして典型的には１０から３５アミノ酸残基を含む。

【００３７】「キャリアタンパク質」は、宿主細胞中で独立して発現され得るアミノ酸配列
であり、そして所望のペプチドまたはポリペプチドに対して組換え融合されるこ
とによってキャリアとして働き得、所望のペプチドの宿主細胞中での発現を可能
にする。

【００３８】「アニオン性スペーサーペプチドドメイン」は、会合したカチオン性ペプチド
の正電荷を低減させるに十分にアニオン性のペプチド配列である。すなわち、カ
チオン性ペプチドとアニオン性スペーサーペプチドとの組合せは、本質的にわず
かに正、負または中性の正味電荷を有する。アニオン性スペーサードメインのサ
イズは、カチオン性ペプチドドメインのサイズと同様であるが、好ましくはそれ
より小さい。

【００３９】本明細書において使用される「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子
のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質
である。「マルチドメインタンパク質」は、カチオン性ペプチドを残りのマルチ
ドメインタンパク質から分離するための適切な切断部位を有する、好ましくは１
つより多くの「カチオン性ペプチドドメイン」とそれと同数、少ないあるいは多
い数の「アニオン性スペーサーペプチドドメイン」との組合せを含む。マルチド
メインタンパク質は、より高い発現および／または安定性を達成するために、キ
ャリアタンパク質に融合し得る。マルチドメインタンパク質の安定性および発現
レベルが十分である場合、キャリアタンパク質を用いる必要はない。「アニオン
性スペーサーペプチド成分」は、切断部位を有する少なくとも１つのアニオン性
スペーサーペプチドを含む。カチオン性ペプチド成分の「累積電荷」は、カチオ
ン性ペプチド成分を含む全てのカチオン性ペプチドの総電荷をいう。同様に、ア
ニオン性スペーサーペプチド成分の「累積電荷」は、アニオン性スペーサーペプ
チド成分を含む全てのアニオン性スペーサーペプチド総電荷をいう。

【００４０】本明細書において使用される「抗菌活性」は、微生物を殺滅するか、またはそ
の増殖を防ぐ能力、あるいは微生物感染細胞を殺滅するか、またはその増殖を防
ぐ能力をいう。用語「微生物」は、細菌、真菌、酵母、藻類、原生動物、および
ウイルスを包含する。この用語は、これらのカチオン性ペプチドの生物学的活性
の全ての解釈的説明を含むがこれらに限定されない。

【００４１】（３．カチオン性ペプチド遺伝子を含むベクターの構築および発現）（ａ．カチオン性ペプチド発現ベクター）本発明は、上記で定義した用語のような「カチオン性ペプチド」の産生を意図
する。例えば、適切なカチオン性ペプチドとしては、限定されないが、天然に存
在するカチオン性ペプチドおよびそのアナログ、セクロピン（通常、鱗翅目（Ｓ
ｔｅｉｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２９２：２４６，１９８１）および双翅目（Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、ＣｉｂａＦｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１８６：５，１９９
４）、ブタ腸によって（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８６：９１５９、１９８９）、海の原索動物（ｐｒｏｔｏｃｈｏｒｄ
ａｔｅ）の血液細胞（Ｚｈａｏら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１２：１４４，１９
９７）によって作られる）、セクロピンＡの合成アナログ、メリチン、およびセ
クロピン−メリチンキメラペプチド（Ｗａｄａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＲｅｓ．４０：４２９，１９９２）、セクロピンＢアナログ（Ｊａ
ｙｎｅｓら、ＰｌａｎｔＳｃｉ．８９：４３，１９９３）、キメラセクロピン
Ａ／Ｂハイブリッド（Ｄｕｒｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．２：２９７，１９９
６）、マガイニン（Ｚａｓｌｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ８４：５４４９，１９８７）、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ウサギ、
およびヒツジの白血球由来のカテリン関連抗菌性ペプチド（Ｚａｎｅｔｔｉら、
ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３７４：１，１９９５）、脊椎動物デフェンシン（例えば
、ヒト好中球デフェンシン［ＨＮＰ１−４］、マウスおよびヒトの小腸のパネー
ト細胞デフェンシン（ＯｕｌｅｔｔｅおよびＳｅｌｓｔｅｄ，ＦＡＳＥＢＪ．
１０：１２８０，１９９６；Ｐｏｒｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５
：２３９６，１９９７））、脊椎動物β−デフェンシン（例えば、ヒト上皮細胞
のＨＢＤ−１（Ｚｈａｏら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３６８：３３１，１９９５）
）、炎症を起こしたヒトの皮膚のＨＢＤ−２（Ｈａｒｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３８７：８６１，１９９７）、ウシβ−デフェンシン（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１５６５，１９９６）、植物デフェンシン（例え
ば、ラディッシュ種子のＲｓ−ＡＦＰ１（Ｆｅｈｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６９：３３１５９，１９９４））、α−およびβ−チオニン（Ｓｔ
ｕａｒｔら、ＣｅｒｅａｌＣｈｅｍ．１９：２８８，１９４２；Ｂｏｈｌｍａ
ｎｎおよびＡｐｅｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＭｏｌ
．Ｂｉｏｌ．４２：２２７，１９９１）、γ−チオニン（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら
、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３、１９９５）、抗真菌ドロソ
マイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）（Ｆｅｈｌｂａｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：３３１５９，１９９４）、アピダエシン（ミツバチ、マルハナバ
チ、ハナダカバチモドキ、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）、スズメバチ（ｙｅｌｌ
ｏｗｊａｃｋｅｔ）、およびスズメバチ（ｗａｓｐ）によって産生される）（
Ｃａｓｔｅｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６１０７，１９９４；
Ｌｅｖａｓｈｉｎａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：６９４，１９９
５）、カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）（例えば、ウシ好中球由来の
インドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）（Ｆａｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７７：１９２９８，１９９６））、バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｃｉｎ）（例えば、ナイシン（ｎｉｓｉｎ）（Ｄｅｌｖｅｓ−Ｂｒｏｕｇｈｔ
ｏｎら、ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＪ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．６９：１９３，１９９６））、ならびにプロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒ
ｉｎ）およびタキプレシン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）（これは抗真菌、抗菌お
よび抗ウイルス活性を有する）（Ｔａｍａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１６３：２０９、１９９３；Ａｕｍｅｌａｓら、Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：５７５、１９９６；Ｉｗａｎｇａら、Ｃｉｂａ
Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１８６：１６０，１９９４）が挙げられる。例示
的なカチロン性ペプチドを、表１に列挙する。

【００４２】表１例示のカチオン性ペプチド^**

【００４３】

【表１】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】カチオン性ペプチドをコードする核酸分子は、天然源から単離され得、あるい
はまた核酸分子の自動合成によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で
カチオン性ペプチドの既知のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有す
るオリゴヌクレオチドプライマーを用いて得られ得る。後者のアプローチでは、
カチオン性ペプチド遺伝子は、相互にプライミングした長いオリゴヌクレオチド
を用いて合成される（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版、８−８から８
−９頁（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９５）、「Ａｕｓｕｂｅｌ
（１９９５）」参照）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いた確立された技術は、少な
くとも長さ２キロ塩基のＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇら、
ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１，１９９３；Ｂａｍｂｏ
ｔら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ２：２６６
，１９９３；Ｄｉｌｌｏｎら、「ＵｓｅｏｆｔｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＲａｐｉｄＣｏｎｓｔｒ
ｕｃｔｉｏｎｏｆＳｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第１５巻：ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ：ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗ
ｈｉｔｅ（編）、２６３−２６８頁（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９
９３）；Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．４：２
９９，１９９５）。

【００５１】上記のように、天然のカチオン性ペプチドのアナログはまた、現在記載した方
法によって組換え的に産生され得る。コドンの存在は、発現に対して有害な効果
を有し得、従って、所望のカチオン性ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、特定
の宿主系、この場合はＥ．ｃｏｌｉに対して至適化される。新規カチオン性ペプ
チドのアミノ酸配列は、例えば、Ｆａｌｌａら、ＷＯ９７／０８１９９によって
、およびＦｒａｓｅｒら、ＷＯ９８／０７７４５によって開示される。

【００５２】カチオン性ペプチドアナログの１つの型は、天然に存在するカチオン性ペプチ
ドのアミノ酸配列と比べて１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドであ
る。例えば、既知のカチオン性ペプチド配列の１つ以上のアミノ酸置換を含むカ
チオン性ペプチドアナログが案出され得、ここで天然アミノ酸配列のアルキルア
ミノ酸をアルキルアミノ酸に置換し、天然アミノ酸配列の芳香族アミノ酸を芳香
族アミノ酸に置換し、天然アミノ酸配列の硫黄含有アミノ酸を硫黄含有アミノ酸
に置換し、天然アミノ酸配列のヒドロキシ含有アミノ酸をヒドロキシ含有アミノ
酸に置換し、天然アミノ酸配列の酸性アミノ酸配列を酸性アミノ酸に置換し、天
然アミノ酸配列の塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸配列に置換し、あるいは天然
アミノ酸配列の二塩基性モノカルボキシル化アミノ酸（ｄｉｂａｓｉｃｍｏｎ
ｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｍｉｎｏａｃｉｄ）を二塩基性モノカルボキシル
化アミノ酸に置換する。

【００５３】一般的なアミノ酸のなかでも、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の各
群中のアミノ酸内での置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バ
リン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、お
よびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸お
よびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リジン
、アルギニンおよびヒスチジン。

【００５４】このような「保存的アミノ酸」アナログをコードするヌクレオチド配列は、例
えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、リンカー−スキャニング変異誘発、
ポリメラーゼ連鎖反応を用いる変異誘発などによって得られ得る（Ａｕｓｂｅｌ
（１９９５）、８−１０〜８−２２頁；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編）、Ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏ
ａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９９１）を参照のこと）。このようなアナログ
の抗菌活性は、本明細書に記載のアッセイのような標準的方法を用いて決定され
得る。あるいは、カチオン性ペプチドアナログは、抗カチオン性ペプチド抗体を
特異的に結合する能力によって同定され得る。典型的には、カチオン性ペプチド
アナログは、対応の天然に存在するカチオン性ペプチドの活性の少なくとも５０
％、および好ましくは７０、８０または９０％を超える活性を示すべきである。

【００５５】カチオン性ペプチド改変体を構築する１つの目的は、その活性を向上させるこ
とであり得るが、天然に存在するカチオン性ペプチドのアミノ酸配列を変化させ
て組換え宿主細胞中でのその産生を増強することもまた所望され得る。例えば、
ラディッシュのカチオン性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ラディッ
シュ中で一般に見いだされるが、Ｅ．ｃｏｌｉでは稀なコドンを含み得る。稀な
コドンの存在は、ラディッシュカチオン性ペプチドを組換えＥ．ｃｏｌｉ中で発
現させる場合に、タンパク質レベルに対して有害な効果を有し得る。ヌクレオチ
ド配列を変更して、コドン使用の問題を軽減する方法は、当業者に周知である（
例えば、Ｋａｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４９４，
１９９５，Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２，１
９９６，およびＢｒｏｗｎ（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａ
ｂＦａｘ（ＢＩＯＳＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｔｄ．
１９９１）（これは２４５−２５３頁にコドン使用の表を提供する）を参照のこ
と）。

【００５６】本発明は、上記で定義した用語の「アニオン性スペーサーペプチド」の使用を
意図する。下記のように、例示のアニオン性スペーサーペプチドは、アミノ酸配
列ＨＥＡＥＰＥＡＥＰＩＭを有し、ここでメチオニン残基が切断部位として用い
られ得る。同様の天然に存在するアニオン性スペーサーペプチドの例は、ＥＡＥ
ＰＥＡＥＰ，ＥＡＫＰＥＡＥＰ，ＥＡＥＰＫＡＥＰ，ＥＡＥＳＥＡＥＰ，ＥＡＥ
ＬＥＡＥＰ，ＥＰＥＡＥＰおよびＥＡＥＰを包含する（Ｃａｓｔｅｅｌｓ−Ｊｏ
ｓｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ．，１２：１５６９−１５７９，１９９３）。上記例
示のものの二重または他の組合せのようなさらなるアニオン性スペーサーペプチ
ドは、カチオン性ペプチドの産生での使用に適している。マルチドメインタンパ
ク質の概念における特定のカチオン性ペプチドの発現のためにアニオン性スペー
サーペプチドを設計する場合、以下の基準を心に留めておくべきできである：ア
ニオン性スペーサーペプチドの負電荷は、マルチドメイン融合タンパク質のカチ
オン性ペプチドの正電荷を実質的に低減するべきであり、切断点は、マルチドメ
インタンパク質が切断されて所望のペプチドのモノマーを与える場所に存在しな
ければならず、そしてアニオン性スペーサーペプチドは、好ましくは、カチオン
性ペプチドよりも小さい。このような融合タンパク質は、カチオン性ペプチドお
よびアニオン性スペーサーペプチドの単位を変更して設計され得る。しかし、こ
のような立体配置は、必要とされない。カチオン性ペプチドおよびアニオン性ス
ペーサーペプチドの任意の配列は、マルチドメインタンパク質中のコンカトマー
の累積電荷が宿主細胞中での発現に影響しない限り、許容可能である。

【００５７】本明細書に記載の実施例において、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）キャリ
アタンパク質は、カチオン性ペプチドを産生するための方法を例示するように用
いられる。キャリアタンパク質のさらなる適切な例としては、限定されないが、
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓａｕｒｅｕｓプロテインＡ、プロテインＡの２つの合成ＩｇＧ結合ドメ
イン（ＺＺ）、外膜プロテインＦ、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、および
バクテリオファージλおよびバクテリオファージＴ７の種々の産物が挙げられる
。本明細書で提供される教示から、他の多くのタンパク質が、キャリアとして用
いられることが明らかである。ＣＢＤ断片の使用で示されるように、宿主細胞中
で高度に発現される限り、キャリアタンパク質全体を使用する必要はない。単純
性かつ経済性のために、適切なキャリアタンパク質は、できる限り小さく（１０
０程度のアミノ酸残基、あるいは好ましくはそれより小さく）あるべきである。
いくつかの場合では、システイン残基を欠くキャリアタンパク質、あるいは１つ
を超えないシステイン残基を含むキャリアタンパク質のいずれかの使用が所望さ
れる。また、ＣＮＢｒ試薬が、連結したペプチドを放出するために使用される場
合、切断部位以外ではメチオニン残基を避けることが望ましい。

【００５８】カチオン性ペプチド配列の単離を容易にするために、切断されやすいアミノ酸
を用いて、マルチドメインタンパク質中のキャリアタンパク質、カチオン性ペプ
チド部分、およびアニオン性スペーサーペプチド部分を架橋し得る。切断部位の
アミノ酸配列の決定および設計は、切断のストラテジーおよびカチオン性ペプチ
ド、アニオン性スペーサーペプチド、およびキャリアタンパク質のアミノ酸配列
に大きく依存する。カチオン性ペプチドの除去は、ペプチド結合に特異的な任意
の既知の化学的または酵素的切断を通じて達成され得る。化学的切断としては（
Ｒ．Ａ．Ｊｕｅ＆Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（
１９８５）２４：１６２−１７０；Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ、Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（
ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ；１９９１）５章）、限定さ
れないが、メチオニンでの臭化シアン切断（Ｍｅｔ↓）、トリプトファンでのＮ
−クロロスクシンイミドまたはｏ−ヨードソ安息香酸（Ｔｒｐ↓）、アスパラギ
ニル−グリシン結合でのヒドロキシルアミン（Ａｓｎ↓Ｇｌｙ）、あるいはアス
パルチル−プロリン結合での低いｐＨ（Ａｓｐ↓Ｐｒｏ）によって処理されるも
のが挙げられる。あるいは、文献に記載された多数のプロテアーゼがあるが、大
部分は切断部位に対しての特異性がほとんどない。行われ得る酵素的切断として
は、限定されないが、Ｘａ因子、ＸＩＩａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ
、コラゲナーゼ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロテア
ーゼ（エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、
エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、キモトリプシンまたはトリプシンによって触
媒されるものが挙げられる。

【００５９】カチオン性ペプチド遺伝子を発現させるために、このペプチドをコードする核
酸分子は、発現ベクター中で転写および翻訳（発現）を制御する調節配列に作動
可能に連結されなければならず、そして次に宿主細胞中に導入される。加えて、
発現ベクターは、発現ベクターを保有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を
含み得る。

【００６０】本発明の発現ベクターは、カチオン性ペプチド遺伝子の１つを超えるコピーを
有するマルチドメイン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。理解される
ように、キャリアタンパク質ドメイン、アニオン性スペーサーペプチド成分、お
よびカチオン性ペプチド成分を有するマルチドメイン融合タンパク質は、カチオ
ン性ペプチド遺伝子の２個から３０個を超えるコピーを含み得る。アニオンスペ
ーサーペプチド成分を欠くが、キャリアタンパク質ドメインおよびカチオン性ペ
プチド成分を含むマルチドメイン融合タンパク質は、２個から４個のカチオン性
ペプチド遺伝子のコピーを含む。さらに、キャリアタンパク質ドメインを欠くが
、アニオン性スペーサーペプチドおよびカチオン性ペプチド成分の両方を含むマ
ルチドメイン融合タンパク質は、５個から２０個を超えるカチオン性ペプチド遺
伝子のコピーを含み得る。

【００６１】好ましくは、カチオン性ペプチドは、原核生物宿主細胞中で産生される。原核
生物宿主中でポリペプチドを発現させるために用いられ得る適切なプロモーター
は当業者に周知であり、そして例えば、特定のファージＲＮＡポリメラーゼによ
り認識されるＴ４、Ｔ３、ＳＰ６およびＴ７プロモーター、バクテリオファージ
λのｉｎｔ、Ｐ_RおよびＰ_Lプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱
ショック、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ、ｐｈｏＡ、ｌａｃＰ
、ｔａｃＰ、ｔｒｃＰ、ｓｒｐＰ、ａｒａＰ、およびｌａｃＺプロモーター、Ｂ
．ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージの
プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター、ｃａｔプロモーターの
ｂｌａプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ、Ｊ．
Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７，１９８７，Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、第４版（Ｂｅｎｊａ
ｍｉｎＣｕｍｍｉｎｓ１９８７）によって、およびＡｕｓｂｅｌら（１９９
５）によって総説されている。

【００６２】好適な原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｕｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓが挙げられる。適
切なＥ．ｃｏｌｉの株としてはＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ
５ＩＦ’、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１０Ｂ／ｐ３、ＤＨ１１Ｓ、Ｃ６
００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８
、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、およびＥＲ１
６４７（例えば、Ｂｒｏｗｎ（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬ
ａｂｆａｘ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９９１）参照）が挙げられる。
適切なＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓの株としては、ＢＲ１５１，ＹＢ８
８６、ＭＩ１１９，ＭＩ１２０、およびＢ１７０（例えば、Ｈａｒｄｙ「Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄ」、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ１９８５）参照）が挙げられる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒ
ｅｕｓの例示的な株はＲＮ４２２０である（Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３０５：７０９、１９８３）。本発明はプロテアーゼ欠損の細菌株を使用
することを必要としない。

【００６３】発現ベクターは、リン酸カリウムトランスフェクション、微粒子銃仲介送達（
ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙ）、エ
レクトロポレーションなどを包含する種々の標準的技術を用いて、宿主細胞中に
導入され得る。発現ベクターを細菌細胞中に導入する方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ（
１９５）によって提供される。原核生物宿主中でタンパク質を発現するための方
法は、当業者に周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎｏｆｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＥ．ｃｏｌｉｕｓｉｎ
ｇｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏ
ｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＤＮ
ＡＣｌｏｎｉｎｇ２：ＥｃｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，第２版、Ｇ
ｌｏｖｅｒら（編）、１５頁（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓ
ｓ１９９５）；およびＧｅｏｒｇｉｏｕｓ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＢａｃｔｅｒｉａ」、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎ
ｄら（編）、１０１頁（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９
６）参照）。

【００６４】カチオン性ペプチドはまた組換え酵母細胞中で発現され得る。酵母中での発現
のためのプロモーターとしては、ＧＡＬＩ（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグ
リセレートキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸＩ（ア
ルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）などが
挙げられる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手可
能である。これらのベクターとしてはＹＩｐベースのベクター（例えばＹＩｐ５
）、ＹＲｐベクター（例えばＹＲｐ１７）、ＹＥｐベクター（例えばＹＥｐ１３
）およびＹＣｐベクター（例えばＹＣｐ１９）が挙げられる。酵母細胞中での発
現に適した多様なベクターがあることが当業者には理解される。

【００６５】バキュロウイルス系はカチオン性ペプチド遺伝子を昆虫細胞中で発現するため
の効率的な手段を提供する。適切な発発現ベクターはＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づき、そしてＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス前初期遺伝子プロ
モーター（ｉｅ−１）および後初期３９Ｋプロモーター、バキュロウイルスｐ１
０プロモーター、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａメタロチオネインプロモーターの
ような周知のプロモーターを含む。適切な昆虫宿主細胞としては、ＩＰＬＢ−Ｓ
ｆ−２１、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ蛹卵巣細胞株（例えば
Ｓｆ９（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ、およびＳｆ２１（Ｉｎ
ｖｉｔｏｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ））
、ならびにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞が挙げられる。
組換えタンパク質をバキュロウイルス系中で産生するための確立された技術は、
Ｂａｉｌｅｙら、「ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ、第７巻：ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｕｒｒａｙ（編）、１４７−１６８頁（ＴｈｅＨｕｍ
ａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）、Ｐａｔｅｌら、「Ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ」、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ２
：ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ、第2版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、２
０５−２４４頁（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９５
）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、１６−３７から１６−５７頁、Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ（編）、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ（ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、およびＬ
ｕｃｋｎｏｗ、「ＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ」、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１８３−２１８（Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９６）によって提供される。
組換えタンパク質をバキュロウイルス系から単離するための確立された方法は、
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５
）に記載されている。

【００６６】組換え宿主細胞は、当該分野で公知の手段に従って培養され、至適な細胞増殖
を達成する。組換え細菌宿主、好ましくはＥ．ｃｏｌｉの場合、増殖の必要条件
を満たす栄養材料を含む適切な培養培地に細菌を導入する。播種の後、細菌は分
裂し続け、そして濃度が飽和密度に達するまで増殖する。例えば、振盪フラスコ
発酵はこの時点に達するまで３０℃で１５〜１７時間必要であり得る。次に細菌
を新鮮な培地中で１：３に希釈し、そして中期または後期の対数増殖期まで増殖
させ、この時点でカチオン性ペプチドの合成を誘導する。細菌が関連の組換えタ
ンパク質を合成するように誘導するいくつかの方法がある。適切な誘導条件はＥ
．ｃｏｌｉの株およびそれが含むプラスミドによって異なる。例えば、温度依存
性誘導の場合、誘導は温度を４２℃まで上昇させ、そしてこれを約１時間から約
５時間まで好適なｐＨ範囲である６．５−７．２で維持することによって得られ
る。所望の遺伝子の発現が至適レベルに達したとき、細菌を収穫し、そして細胞
を凍結するか、あるいは回収プロセスを続ける。

【００６７】（ｂ．キャリアタンパク質−カチオン性ペプチドをコードするヌクレオチド配
列を有する例示ベクター）実施例で詳細に記載するように、例示のキャリアタンパク質遺伝子を含むプラ
スミドを構築した。簡単に述べると、Ｔ７発現プラスミドであるプラスミドベク
ターｐＥＴ２１ａ（＋）（ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）
を最初の研究のためのコアプラスミドとして用いた（図１Ａ）。プラスミドｐＥ
Ｔ−ＣＢＤ１８０（Ｓｈｐｉｇｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：
１７−２３，１９９９参照）をセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）キャリアタン
パク質をコードする遺伝子の供給源として用いた（図１Ｂ）。ＰＣＲ反応を、Ｃ
ＢＤ１８０遺伝子を含むフラグメントをｐＥＴ−ＣＢＤ１８０から６４６ｂｐフ
ラグメントとして増幅するように設計した（図１Ｃ）。ＢａｍＨＩ制限部位（Ｇ
ＧＡＴＣＣ）を、ＣＢＤ１８０ＰＣＲフラグメントの３’末端に組み込んだ。ｐ
ＥＴ−ＣＢＤ１８０のＢｇｌＩＩまたはＸｂａＩ部位およびＢａｍＨＩを用いて
ＰＣＲフラグメントを切り出し、そして２つのフラグメントを別々にｐＥＴ２１
ａ（＋）に連結して、２つのプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＢおよびｐＥＴ２１
ＣＢＤ−Ｘをそれぞれ得た（図１Ｄ）。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＸはｐＥ
Ｔ２１ａ（＋）由来のｌａｃＯを含み、これはＴ７発現系の調節を向上させる。
両プラスミドは終止コドンをＢａｍＨＩの顆粒に含み、ＣＢＤ１８０タンパク質
の発現を可能にする。Ｔ７発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ４１００中でｐＧＰ１−
２に基づいて調製され、これはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、ｃＩ８５７
熱感受性リプレッサーによって制御されるλ_Rプロモーターの下で担う。ＣＢＤ
１８０タンパク質は両系で高レベルで発現された。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ
−Ｘを次の研究のために用いた。

【００６８】インドリシジンは天然の１３アミノ酸抗菌性カチオン性ペプチドであり、ウシ
好中球の細胞質顆粒中に存在し、そして３９％のトリプトファンおよび２３％プ
ロリンから構成される独特の組成を有する。最初の研究は、インドリシジンの修
飾から誘導される２つのカチオン性ペプチド、ＭＢＩ−１１ペプチド（ＩＬＫＫ
ＷＰＷＷＰＷＲＲＫ）およびＭＢＩ−１１Ｂ７ペプチド（ＩＬＲＷＰＷＷＰＷＲ
ＲＫ）をＦｅｌｌａら、ＷＯ９７／０８１９９、およびＦｒａｓｅｒら、ＷＯ９
７／０７７４５に記載のように、用いた。インドリシジン型カチオン性ペプチド
ＭＢＩ−１１をコードする遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニ
ング部位で合成し、ＣＢＤ１８０キャリアタンパク質に融合し、発現させた。発
現のレベルは高く、ＣＢＤ１８０単独の場合と等しかった。次に、２つのＭＢＩ
−１１遺伝子の直列（２×１１）をＣＢＤ１８０に融合すると、再び高発現が達
成された。カチオンペプチドのキャリアタンパク質に対する比率を増大させるた
めに、ＣＢＤ１８０の１７７アミノ酸を短縮して９６アミノ酸とし、そしてこの
バージョンのキャリアタンパク質（ＣＢＤ９６と称する）を新しいキャリアタン
パク質として用いた。ＣＢＤ９６を保有するＤＮＡフラグメントを、ｐＥＴ−Ｃ
ＢＤ１８０を鋳型として用いて、ＰＣＲによって調製し、そしてｐＥＴ２１ａ（
＋）中にクローニングしてプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６を得た。ＭＢＩ−１
１遺伝子の単一または二重コピーの両方をＣＢＤ９６に融合し、そして高レベル
で発現させた。次に１０個までのＭＢＩ−１１ユニットを含むポリ遺伝子を調製
した。しかし、４個のＭＢＩ−１１遺伝子を直列で含む融合タンパク質での発現
が達成されたのみであった。遺伝子数が３個を越えると発現の劇的な減少に直面
した（図２および３）。

【００６９】（ｃ．キャリアタンパク質−カチオン性ペプチドとアニオン性スペーサーをコ
ードするヌクレオチド配列を有する例示のベクター）他のアプローチにおいて、カチオン性ペプチドドメインの間にアニオン性ペプ
チドスペーサーを有するマルチドメイン融合タンパク質を含むベクターを、構築
した。このマルチドメイン遺伝子の構築方法は、任意のカチオン性ペプチド遺伝
子をアミノ酸配列を変化させることなく重合することを可能にした。最初の研究
では、ＭＢＩ−１１Ｂ７カチオン性ペプチドを用いた。

【００７０】ＭＢＩ−１１Ｂ７カチオン性ペプチド遺伝子および負に荷電したペプチドスペ
ーサーを特定する３つの別個のＤＮＡカセットを合成し：１1B７−ポリ、アニオ
ン性スペーサー、および２×１１Ｂ７−ラスト（ｌａｓｔ）（図４）、そして適
切なプラスミドベクター中にクローニングした。１１Ｂ７−ポリのカセットおよ
びスペーサーのカセットを互いに連結して、１１Ｂ７ポリ−スペーサーカセット
を得た。アニオン性スペーサーペプチドおよびカチオン性ペプチド遺伝子をＭｅ
ｔに関するコドンによって隔て、臭化シアン（ＣＮＢｒ）による切断のための部
位を創製した。Ａｌａおよび終止コドンを特定する２つのコドンをラスト２×１
１Ｂ７遺伝子に連結した。２×１１Ｂ７−ラストカセットを、次にＣＢＤ９６を
コードする遺伝子の下流に、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６中にクローニングし（図５）
、プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１Ｂ７を得た。このプラスミドを後
でいくつかの融合マルチドメイン遺伝子の構築に用いた。１１Ｂ７ポリ−スペー
サーカセットを連続的クローニング手順で用い、これは１１Ｂ７遺伝子を、ｐＥ
Ｔ２１ＣＢＤ９６発現系中でマルチドメイン誘導ＣＢｄ９６−スペーサー−ポリ
１１Ｂ７タンパク質に重合することを可能にする（図６）。ｎコピー（ここでｎ
＝３から３０）のＭＢＩ−1１Ｂ７遺伝子および（ｎ−２）スペーサーを含む全
てのマルチドメイン構築物が高レベルで発現した。発現の例を図７に示す。連続
的クローニング手順を加速するために、５個の１１Ｂ７ドメインおよび５個のア
ニオン性スペーサードメインを含む重合カセットを調製し、そして１５個を越え
る（すなわち、２０コピー、２５コピー、３０コピーなど）１１Ｂ７ドメインを
含むマルチドメイン遺伝子の構築に用いた。このカセットは末端にアニオン性ス
ペーサーペプチドを有し、次に終止コドンを有する。このカセットの使用により
、同数の１１Ｂ７およびスペーサードメインを含むＣＢＤ９６ベースのマルチド
メイン系の構築が可能となった。

【００７１】（ｄ．カチオン性ペプチドとアニオン性スペーサーをコードするヌクレオチド
配列を有するが、キャリアタンパク質を欠く例示のベクター）マルチドメインタンパク質の１つの系列は、ｎ×ＭＢＩ−１１Ｂ７ペプチドお
よびｎ−２のアニオン性スペーサーペプチドを含む。ｎ＝５の場合、マルチドメ
インタンパク質の分子量は１３．４６ｋＤａに等しく、これはＥ．ｃｏｌｉ中で
の発現に十分な大きさであるはずである。およそこのサイズのマルチドメイン遺
伝子を含むＤＮＡフラグメントを、関連のプラスミドから制限エンドヌクレアー
ゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出し、そして特別に設計されたリ
ーダー１１Ｂ７ドメインを含むプラスミド中に融合した。Ｅ．ｃｏｌｉ中で、全
てのタンパク質中の最初のメチオニンはホルミル−メチオニンとして翻訳され、
これはＣＮＢｒによって切断できない。従って、キャリアを含まないマルチドメ
インタンパク質は、第１のドメインがＭ−Ｔ−Ｍアミノ酸で開始するような方法
で修飾され、これによりＣＮＢｒが第１のペプチドを二番目のメチオニンで切断
し、真正のペプチドを遊離することが可能となった。プラスミドｐＥＴ２１−３
Ｓ−５×１１Ｂ７およびｐＥＴ２１−５Ｓ−７×１１Ｂ７の関連部分を図８に示
す。５から１４コピーのＭＢＩ−１１Ｂ７遺伝子を含むキャリアを含まないマル
チドメイン構築物全てが、図７で示されるように、高レベルで発現した。同じ方
法で、同数の１１Ｂ７とアニオン性スペーサードメインとを含み、スペーサー配
列が末端にある構築物を調製した。これらもまた高レベルで発現した。実験的に
得られたマルチドメインタンパク質内のＭＢＩ−１１Ｂ７ペプチドの理論的収率
は表２に見ることができる。

【００７２】本発明はまた、他の抗菌性カチオン性ペプチド（ＭＢＩ−２６）のさらなる例
を提供し、これは上記ペプチド（ＭＢＩ−１１Ｂ７）の２倍のサイズであり、２
６個のアミノ酸を含み、ここでこれらの内の７個が塩基性アミノ酸である。この
ペプチドは天然の抗菌性カチオン性ペプチドであるセクロピンおよびメリチンの
選択された配列間の融合によって人工的に設計された。本発明において、カルボ
キシ末端の最後のアミノ酸であるセリンをメチオニン残基で置き換え、これをマ
ルチドメインタンパク質からのペプチドの遊離のために用いた。このペプチドの
産生は、ＭＢＩ−１１Ｂ７について上記したように、マルチドメインタンパク質
法を用いて、宿主細胞中での組換え合成によって得られた。詳細は実施例８で提
供する。

【００７３】表２発現に成功した構築物^*およびそのマルチドメインタンパク質中のＭＢＩ−１
１Ｂ７カチオン性ペプチドの理論的割合のまとめ（キャリアタンパク質有りまた
は無し）

【００７４】

【表２】

【００７５】^* 発現の例は図７に見ることができる。

【００７６】（４．組換え宿主細胞によって産生されるカチオン性ペプチドの精製およびア
ッセイ）組換え宿主細胞によって産生されるタンパク質の回収のための一般的な技術は
、例えば、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏ
ｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＥ．ｃｏｌｉｃｅ
ｌｌｓ」、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
ｓ、第２版、Ｇｌｏｖｅｒら（編）、５９−９２頁（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９５）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＢａｃｔｅｒｉａ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、
Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１０１頁（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．１９９６）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＴｈｅＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．１９９５）、およびＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＭａｍｍａｌｉａｎ
ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｃｌｅｌａｎｄら（編）、１
６３頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）で提供される。カチオン性
ペプチドの単離および精製におけるバリエーションは当業者によって考案され得
、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる（例えば、Ｓｅｌ
ｓｔｅｄ「ＨＰＬＣＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏ
ｆＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅｓ」、Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒ
ｉａｌＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｈａｆｅｒ（編）（Ｈｕｍａ
ｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７））。特定の精製方法を以下に記載する。

【００７７】本発明は、宿主細胞中のカチオン性ペプチドの組換え産生のための、新規な、
スケールアップ可能な、費用効率的な精製プロセスを提供する。マルチドメイン
融合ポリペプチドはＥ．ｃｏｌｉ中で不溶性の複合体を形成し、これは封入体と
呼ばれる。細菌を機械的に破砕した後に、これらの封入体を当該分野で公知の手
段（例えば、濾過または沈殿）に従って細胞の可溶性成分から分離し得る。宿主
の不純物は、界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のような溶媒、酵素（リゾ
チーム、ＤＮＡｓｅ）および塩を用いて除去され得る。

【００７８】カチオン性ペプチドはアニオン性スペーサーペプチドおよびキャリアタンパク
質（短縮型ＣＢＤなど）から標準的な技術を用いて遊離され得る。メチオニン残
基が所望の切断点に含められている場合、例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）試薬
による酸性環境中での化学的切断が用いられ得る。反応は、７０％ギ酸または７
０％ギ酸と０．１ＮＨＣｌまたは７０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中で行わ
れ得る。反応の最後に（反応は４〜１５時間持続し得る）、反応混合物を水中で
、好ましくは反応混合物の１５倍の容量で希釈し、そして次に乾燥する。この段
階で、カチオン性ペプチドのカルボキシル末端はホモセリンラクトンとして存在
する。

【００７９】ポリカチオン性ペプチドの等電点は非常に高く（１０．５−１２．５）、これ
により、普通でない条件下でアニオン交換クロマトグラフィー間カラムを用いて
、非常に独特の精製プロセスの開発が可能になる。弱いまたは強いカチオンリガ
ンドとカップリングされたほとんど全てのアニオン交換樹脂、特に工業的目的で
タンパク質、ペプチド、炭水化物および核酸を精製する目的で使用されるものは
、以下のカチオン性ペプチドのための精製プロセスにおいて用いられ得る。この
手順は９５％精製を得るためにわずか１回のクロマトグラフィー工程を必要とす
るのみである。このクロマトグラフィーの利点は、短時間で、迅速に、高圧装置
を必要とせず、そして有機溶媒なしで行えることである。好ましい手順は、乾燥
した切断物質を７〜８Ｍの尿素（あるいは、５０％エタノールまたは水）に溶解
し、そしてこれをアニオン交換カラムにロードすることによる。この段階で、ロ
ードした試料のｐＨは酸性（ｐＨ２〜３）である。カラムは予め、２カラム容量
の０．５〜１ＭのＮａＯＨで洗浄し、そして１度、水で短時間洗浄して、カラム
の出口で測定して１０ｍＳ未満、好ましくは１ｍＳ未満の伝導率とする。所望の
切断物質が８Ｍ尿素に溶解された場合、ロードする前に８Ｍ尿素で１度、カラム
を洗浄することが好ましい。不純物とは対照的に、カチオン性ペプチドはカラム
を通過するのに対して、不純物は樹脂に吸着し、それにより分離される（図９）
。この段階で、カチオン性ペプチドのカルボキシ末端は転換され、そしてホモセ
リンとして現れる。さらに、カチオン性ペプチド試料のｐＨを酸性から塩基性（
ｐＨ１１より高く）に変化させる。

【００８０】アニオン交換カラムにロードされる乾燥した切断物質が７〜８Ｍ尿素の存在下
である場合、フロースルーする精製ペプチドは尿素溶液中にあり、これは高スル
ープットの逆相クロマトグラフィーによって、灌流支持体Ｐｏｒｏｓ２０または
５０Ｒ−２樹脂（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）
を用いて、分離およびさらに精製され得る。大量生産のためにはＰｏｒｏｓ５０
の方が、より良好なフローと、高圧装置の使用が避けられるという事実のため、
好ましい。

【００８１】他のより一般的ではあるが、より高価な手順は、当該分野で公知の手段、例え
ば逆相クロマトグラフィーに従って行われ得、ここで乾燥した切断物質は水また
は０．１％ＴＦＡ中に溶解され、そしてＣ８またはＣ１８カラム上に、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ技術を用いてロードされ得る。しかし、この方法は高圧装置および有機溶
媒を必要とし、そしてＣ末端ホモセリンラクトンを有するカチオン性ペプチドを
もたらす。

【００８２】上記の研究において、組換えカチオン性ペプチドＭＢＩ−１１Ｂ７は、マルチ
ドメイン構築物から得られた。その結果、ＣＮＢｒ切断はホモセリンラクトン残
基の形成をカルボキシ末端で引き起こし、これはｐＨを上昇させると容易にホモ
セリンに転化する。このカルボキシ末端は、殺菌剤のアミド化化学合成ＭＢＩ−
１１Ｂ７ＣＮとは異なる。それゆえ、抗菌活性を化学的および組換えで合成した
カチオン性ペプチド間で比較した。

【００８３】カチオン性ペプチドの活性を決定するための多くのインビトロ法があり、これ
には、アガロース希釈ＭＩＣアッセイ、ブロス希釈、時間−死滅（ｔｉｍｅ−ｋ
ｉｌｌ）アッセイ、または等価法が挙げられる（例えば、Ｓｈａｆｅｒ（編）、
ＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａ
ｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）参照）。抗生物質活性は、代表的には、
微生物または微生物感染細胞の増殖の阻害または死滅として測定される。

【００８４】例えば、カチオン性ペプチドを、最初に、カルシウムおよびマグネシウムを補
充したＭｕｅｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎブロスに溶解し、そして次に、この溶液を
融解アガロースと混合する。他のブロスおよび寒天は、ペプチドがその媒体を通
って自由に拡散できる限りにおいて、使用され得る。アガロースをペトリ皿また
はウェルに注いで固化させ、そして試験株をアガロースプレートに適用する。試
験株を、部分的にペプチドの意図された適用に基づいて、選択する。プレートを
終夜インキュベートし、そして細菌の増殖に関して目視検査する。カチオン性ペ
プチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、生物体の増殖を完全に阻害するペプチドの
最小濃度である。試験株、あるいは株のグループに対して許容できる活性を示す
ペプチド（代表的には１６μｇ／ｍｌ以下のＭＩＣを有する）をさらなる試験に
供し得る。

【００８５】あるいは、時間−死滅曲線を用いて、設定した時間（代表的には２４時間）に
わたるコロニー数の違いを決定し得る。簡単に述べると、既知濃度の生物体の懸
濁液を調製し、そしてカチオン性ペプチドを添加する。懸濁液のアリコートを設
定時間毎に取り出し、希釈し、培地にプレートし、インキュベートし、そして計
数する。ＭＩＣは生物体の増殖を完全に阻止するペプチドの最小濃度として測定
される。

【００８６】カチオン性ペプチドはまた、正常な哺乳動物細胞に対するその毒性についても
試験され得る。アッセイの一例は、赤血球（ＲＢＣ）（赤血球（ｅｔｙｔｈｒｏ
ｃｙｔｅ））溶血アッセイである。簡単に述べると、このアッセイにおいて、赤
血球を代表的には遠心分離で全血から単離し、そして血漿成分を含まないように
洗浄する。等張性食塩水中の５％（ｖ／ｖ）の赤血球の懸濁液を、異なる濃度の
カチオン性ペプチドと共にインキュベートする。３７℃で約１時間のインキュベ
ーションの後、細胞を遠心分離し、そして上清の吸光度を５４０ｎｍで測定する
。溶解の相対的測定値は、ＮＨ₄Ｃｌまたは等価物を用いた赤血球の完全溶解後
の吸光度（１００％値を確立）と比べることにより決定される。１００ｇ／ｍｌ
で１０％未満の溶解のペプチドが適切である。好ましくは、カチオン性ペプチド
は１００ｇ／ｍｌで５％未満の溶解を誘導する。溶解性ではないカチオン性ペプ
チド、あるいはわずかに穏やかな溶解性のものが望ましく、そしてさらなるスク
リーニングに適している。インビトロ毒性はまた、培養した哺乳動物細胞に対す
る毒性の測定によっても評価し得る。

【００８７】さらなるインビトロアッセイが、カチオン性ペプチドの治療的可能性を評価す
るために行われ得る。このようなアッセイとしては、処方物中へのペプチドの可
溶性、血液または血漿中での薬理学、血清タンパク質結合、二次構造の分析（例
えば円偏光二色性法による）、リポソームの透過性、および細菌内膜の透過性が
挙げられる。

【００８８】本発明の場合、ＭＢＩ−１１Ｂ７ＣＮ、ＭＢＩ−１１Ｂ７ＨＳＬ（ホモセリン
ラクトン形態）およびＭＢＩ−１１Ｂ７ＨＳ（ホモセリン形態）の抗菌活性を、
種々のグラム陰性およびグラム陽性株（抗生物質耐性株を含む）に対して試験し
た。アッセイは「ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤｉｌｕｔｉｏｎＡｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂｉａｌＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｓｆｏｒＢａｃｔ
ｅｒｉａＴｈａｔＧｒｏｗＡｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ−ＦｏｕｒｔｈＥｄ
ｉｔｉｏｎ；ＡｐｐｒｏｖｅｄＳｔａｎｄａｒｄ」ＮＣＣＬＳ文書Ｍ７−Ａ４
（ＩＳＢＮ１−５６２３８−３０９−４）第１７巻、第２号（１９７７）に記
載のようにして行った。ペプチドの最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、ＭＢＩ−
１１Ｂ７ＨＳＬおよびＭＢＩ−１１Ｂ７ＨＳペプチドが、アミド化ＭＢＩ−１１
Ｂ７ＣＮペプチドと同様の抗菌活性を維持することを示した。実施例１３の表３
参照。

【００８９】カチオン性ペプチドはまた、インビボで、効力、毒性などについて試験され得
る。選択されたペプチドの抗生物質活性は、インビボで、種々の動物モデルを用
いて、微生物感染を軽減するその能力について評価され得る。カチオン性ペプチ
ドは、微生物の増殖の阻害がベヒクル単体による阻害と比べて統計的に有意であ
るならば、治療的に有用であると考えられる。この測定は、体液または部位から
単離された培養物から直接的に行われ得、あるいは感染動物の生存率の評価によ
って間接的に行われ得る。抗菌活性の評価のために、いくつかの動物モデルが利
用可能であり、例えば、（ａ）致死量の微生物を受容した正常マウス、（ｂ）致
死量の微生物を受容した好中球減少（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ）マウス、または
（ｃ）心臓に接種を受けたウサギを含む急性感染モデル、および慢性感染モデル
である。選択されるモデルはカチオン性ペプチドの意図される臨床的適応症に一
部は依存する。

【００９０】例として、正常マウスモデルにおいて、マウスにｉｐまたはｉｖで致死量の細
菌を接種する。代表的には、用量は９０−１００％の動物が２日以内に死亡する
量である。このアッセイのための微生物株の選択は、一部は、カチオン性ペプチ
ドの意図される適用に依存する。簡単に述べると、接種の直前または直後（通常
６０分以内）に、カチオン性ペプチドを適切な処方緩衝液中で注射する。カチオ
ン性ペプチドの複数回の注射が投与され得る。動物を感染後、最高で８日間観察
し、そして動物の生存率を記録した。成功した処置は動物を死亡から救うか、ま
たは、非処置対照動物と比べて、統計的に有意なレベルで死亡を遅らせるかのい
ずれかである。

【００９１】ペプチドのインビボ毒性は、ある範囲の用量で、意図される臨床的使用によっ
て一部は規定される経路で、動物（典型的にはマウスに）投与することによって
測定され得る。動物の生存率を記録し、そしてＬＤ₅₀、ＬＤ_90-100、および最大
許容用量（ＭＴＤ）を計算して、カチオン性ペプチドの比較を可能とし得る。

【００９２】カチオン性ペプチドの低い免疫原性もまた、インビボでの使用のために好まし
い特性である。免疫原性を測定するために、ペプチドを正常な動物（通常ウサギ
）に注射する。単回または複数回の注射の後の種々の時間で、血清を得て、ペプ
チドアナログに対する抗体反応性について試験する。ペプチドに対する抗体はＥ
ＬＩＳＡ、免疫沈殿アッセイ、ウェスタンブロット、および他の方法によって同
定され得る（一般に、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８８）を参照のこと）。

【００９３】本明細書に記載のマルチドメイン融合タンパク質を含む発現ベクターを用いて
、組換え宿主細胞の総タンパク質の２５％より多くを表すマルチドメイン融合タ
ンパク質を産生し得る。マルチドメイン融合タンパク質はカチオン性ペプチド遺
伝子の複数のコピーを含むので、融合タンパク質のカチオン性ペプチド成分は実
質的に融合タンパク質の５０％を越えて獲得され得る。

【００９４】本発明は、このように一般的に記載したが、以下の実施例を参照すると、さら
に容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のために提供され、本発
明の限定を意図しない。

【００９５】（実施例１）（プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−Ｘ（Ｂ）およびｐＥＴ２１ＣＢＤ９６の構築
）Ｔ７発現プラスミドであるプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａ
ｇｅｎＣｏｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を、全ての発現系に対してコアプ
ラスミドとして用いた（図１Ａおよび１０）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌ
ｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ由来のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を、抗菌性カチ
オン性ペプチドの発現のためのキャリアタンパク質として選択した。プラスミド
ｐＥＴ−ＣＢＤ１８０（Ｓｈｐｉｇｅｌら、前出）を出発物質として用いた（図
１Ｂおよび１０）。ＶｓｐＩおよびＮｓｉＩ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を除く制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑポリメ
ラーゼをＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈから購入した。ＣＢＤの関連部分
（ｐＥＴ−ＣＢＤ１８０のＴ７プロモーターを含む）をＰＣＲによって、各２５
ｐｍｏｌの各々のプライマーＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣ
Ｇ（配列番号１）およびＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＡ
ＡＧＴＡＧ（配列番号２）、２ＵのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ、対応する反応
緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂
、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）
および２０ｎｇの熱変性ｐＥＴ−ＣＢＤ１８０を用いて増幅した。ＰＣＲはＭＪ
−ＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラー中で、５０μｌの反応容量で
、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒、および７２℃、３０秒で３０サイクル行っ
た。ＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）をｃｂｄ遺伝子の３’末端に取り入れ
て、これがｐＥＴ２１ａ（＋）中にクローニングされるようにした。すでにｐＥ
Ｔ−ＣＢＤ１８０上に存在するＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）またはＸｂａＩ（Ｔ
ＣＴＡＧＡ）部位を用いて，ＰＣＲフラグメントの５’末端を切断した。１μｇ
のＰＣＲ産物を、１．５×ＯＰＡ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈアッセ
イ緩衝液Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌを１０×濃度で補充：１００ｍＭのＴｒｉｓ
−酢酸、ｐＨ７．５；１００ｍＭの酢酸マグネシウムおよび５００ｍＭの酢酸カ
リウム）ならびに１０ＵのＢａｍＨＩおよび１０ＵのＨｉｎｄＩＩＩを含む１０
０μｌの反応中で消化した。プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）を同じ方法で、各々
０．２５μｇのプラスミドＤＮＡ、１．５×ＯＰＡおよび２ＵのＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩを各々含む２×５０μｌの反応中で消化した。反応をフェノー
ル／ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿で停止した。得られた、消化されたｐ
ＥＴ２１ａ（＋）ならびに関連のｃｂｄおよびｄｂｄ９６挿入物のＤＮＡペレッ
トを、８μｌの水に溶解し、そして次いで２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの
１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、そして反応を１０℃で
１時間インキュベートした。２μｌの各ライゲーション混合物を用いて、４０μ
ｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）を、滅菌したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ
）および２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦにセットした、Ｇｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーション装置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションパル
ス後、１ｍｌのＴＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９）を細
胞懸濁液に加え、そして細菌を１時間３７℃で激しく振盪しながらインキュベー
トした。次いで、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液をＭａｃＫｏｎｋｅ
ｙ寒天（ＢＢＬ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ
，ＵＳＡ）プレート上に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に播種し、３７℃
で一晩インキュベートした。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し
、３７℃で激しく振盪しながら一晩培養した。次いでプラスミドＤＮＡを単離し
、そして当業者に公知の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。ポジティ
ブクローンはプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＢまたはｐＥＴ２１ＣＢＤ−Ｘを各
々含んでいた（図１０）。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＸはｌａｃＯを含み、
これはＴ７発現系の調節を向上させる。両プラスミドが、ＢａｍＨＩの下流に終
止コドンを含み、ＣＢＤ１８０他の発現を可能とする。Ｔ７発現系は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉＭＣ４１００Ｆ（株ＭＣ４１００ＦはＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅお
よびＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００の交配によって調製した；ＡＴＣＣ番号３５６
９５）中で、ｐＥＴ変異体およびｐＧＰ１−２に基づいて調製され、これはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をｃＩ８５７熱感受性リプレッサーで制御されるλ
Ｒプロモーターの下に保有する（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８２：１０７４，１９８５）。ＣＢＤ１８０タンパク質
は、両方の系中で高レベルで発現した。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−Ｘを次の
作業に用いた。

【００９６】プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６（図５）を同じＰＣＲ条件およびクローニン
グ手順を用いて調製した。この実験において、キャリアタンパク質ＣＢＤ１８０
は約９６アミノ酸に短縮した。従って、ＰＣＲプライマーＧＣＧＴＣＣＧＧ、
ＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号３）およびＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣ
ＡＧＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＴＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣ（
配列番号４）のペアを用いて、ｃｂｄ９６をコードする関連のＤＮＡフラグメン
トを調製し（図５）、これを次にｐＥＴ２１ａ（＋）中にクローニングした。次
いで、再びＴ７発現系を、Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ４１００Ｆ中でプラスミドｐＥＴ２
１ＣＢＤ９６およびｐＧＰ１−２に基づいて調製し、タンパク質ＣＢＤ９６を高
レベルで発現した。ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６をこの後の作業の大部分に用いた。

【００９７】（実施例２）（ＣＢＤ−ＭＢ−１１融合の構築および発現）全てのカチオン性ペプチドをコードする配列を、天然の抗菌性ペプチドである
改変インドリシジンから設計した。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＸおよびｐＥ
Ｔ２１ＣＢＤ９６（各０．２５μｇ）を、１．５×ＯＰＡ中の２ＵのＢａｍＨＩ
および２ＵのＨｉｎｄＩＩＩで、５０μｌの反応において、３７℃で１時間で消
化した。同じ方法で、ＭＢＩ−１１をコードするフラグメントを約１μｇのＤＮ
Ａおよび２５ＵのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ各々を用いて、１００μｌの
反応中で消化した（図４）。両方の反応をフェノール／ＣＨＣｌ₃（Ｓｉｇｍａ
−ＡｌｄｒｉｃｈＣａｎａｄａＬｔｄ．）抽出およびエタノール沈殿で停止
した。得られた各ベクターのＤＮＡおよびＭＢＩ−１１挿入物を８μｌの水に溶
解および混合し、次いで２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよ
び２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、そしてライゲーション反応物を１０℃で
１時間インキュベートした。次いで２μｌの各ライゲーション混合物を用いて、
４０μｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅを滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュ
ベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）および２．５ｋＶ、２００オームおよび２５
０μＦに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター装置を用いてエ
レクトロポレーションした。エレクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ
培地を細胞懸濁液に加え、そして細菌を１時間３７℃で、激しく振盪しながらイ
ンキュベートした。次いで、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液をＭａｃ
Ｋｏｎｋｅｙ寒天プレート上に１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ−
ＡｌｄｒｉｃｈＣａｎａｄａＬｔｄ．）と共に播種し、３７℃で一晩インキ
ュベートした。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し、３７℃で激
しく振盪しながら一晩培養した。次にプラスミドＤＮＡを単離し、そして当業者
に公知の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。ポジティブクローンはＣ
ＢＤ１８０およびＣＢＤ９６に融合したＭＢＩ−１１を含んでいた。プラスミド
ｐＧＰ１−２およびｐＥＴ２１ＣＢＤ−１１またはｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１１
を各々有するＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００Ｆの発現株がエレクトロポレーション
で調製された。最後の株を２ｍｌＴＢ中、３０℃で激しく振盪しながら一晩イ
ンキュベートし、そして次の日に１ｍｌの細胞懸濁液を等容量の新鮮なＴＢで希
釈し、そして培養温度を最少で２時間かけて４２℃まで上昇させた。予備誘導お
よび誘導した細胞の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＭＢＩ−１１または２
×ＭＢＩ−１１遺伝子を保有する融合タンパク質の発現レベルは高く、ＣＢＤ１
８０またはＣＢＤ９６単独の発現に等しかった。

【００９８】（実施例３）（ＣＢＤ融合ポリカチオン性ペプチド直列ドメインの発現）この実験は、いくつのペプチド遺伝子が、直列でキャリアタンパク質に融合し
て発現され得るかを試験するように設計された。ＭＢＩ−１１をコードする２つ
のＤＮＡフラグメントを作製する必要があり、１つはＤＮＡクローニングによる
重合のためであり、もう一方は直列の最後の遺伝子であった。従って、直列の最
後の遺伝子を作製するため、ＣＯＯＨ末端を有するＭＢＩ−１１ペプチドをコー
ドする、本来のＤＮＡフラグメントを改変し（実施例４）、そして新規遺伝子を
特定のクローニング手順のために設計した。これはＣＢＤ１８０またはＣＢＤ９
６キャリアタンパク質遺伝子に融合する複数の直列ペプチド遺伝子の構築を可能
とした（実施例４）。このクローニング手順の結果、余分のイソロイシンのＭＢ
Ｉ−１１直列配列に付加を生じた。従って、同一のペプチド分子を産生するため
には、イソロイシンコドンもまた最後の遺伝子配列に付加した。ペプチドを融合
タンパク質から切断するためにＣＮＢｒが用いられ、これはペプチド分子が末端
にホモセリンラクトンを有することを意味する。従って、最後のペプチド遺伝子
はまた、等しいペプチド産物を産生するために、ＣＮＢｒ切断のために、末端に
メチオニン、次いで２つのチロシンを有するように改変された。

【００９９】ＣＢＤ１８０およびＣＢＤ９６が融合した、直列で１０単位までのペプチドポ
リ遺伝子を調製した。しかし、良好な発現は、２または３個のＭＢＩ−１１ドメ
インを含む融合でのみ達成され、ペプチド遺伝子の数が４を越えると実質的に停
止した。ＤＮＡ合成およびＭＢＩ−１１ポリマーを含むプラスミドの構築は実施
例４に記載される。

【０１００】（実施例４）（カチオン性ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントの合成および改変）所望の配列は、通常、オリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法によっ
て、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９１ＤＮＡ合成
機を用いて、関連する化学およびプロトコルで合成された。所望のオリゴヌクレ
オチドをＰＣＲ反応で鋳型として用いて、ＤＮＡクローニングに適した二本鎖Ｄ
ＮＡを産生した。

【０１０１】（Ａ．ＭＢＩ−１１ＤＮＡドメインの合成）オリゴヌクレオチドＴＴＴＡＡＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴ
ＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧ（配列番号５）ＣＣＧＴＧＧ
ＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡ
ＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＧ（配列番号６）を合成し、そしてＰＣＲ
の鋳型として用い、プライマーＴＴＴＡＡＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴ
ＣＡＴＡＴＧ（配列番号７）およびＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴ
ＧＧＴＡＣＣＴＧＣＧ（配列番号８）を用いた。ＰＣＲはＭＪ−Ｒｅｓａ
ｒｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４℃、３０
秒；５０℃、３０秒；および７２℃、３０秒で３０サイクルで、２ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ、対応の反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭ
ＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９）、
０．２ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２５
ｍｏｌの各プライマーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチドで行い、そ
の結果８８ｂｐのｄｓＤＮＡＭＢＩ−１１フラグメントが得られた。ＤＮＡを
実施例２に記載のクローニング手順に用いた。

【０１０２】（Ｂ．直列の最後のドメインとしてのＭＢＩ−１１ドメインの改変）ＰＣＲを用いてＭＢＩ−１１をコードする本来のＤＮＡフラグメントを、直列
ポリペプチド遺伝子の最後の遺伝子として用いるために改変した。本来のオリゴ
ヌクレオチド（Ａ）を鋳型として用いた。センスプライマーＴＴＴＡＡＣＧＧ
ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧ（配列番号９）は合成ＰＣＲ反応で
用いたものと同一であるが、新規なアンチセンスプライマーＣＧＣＧＡＡＧＣ
ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＣ
ＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号１０）を、ＭＢＩ−１１遺伝子の末端
を改変するために設計した（説明については、実施例３を参照のこと）。ＰＣＲ
はＭＪ−ＲｅｓａｒｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラーで、５０μｌの反応容量
で、９４℃、３０秒；５１℃、３０秒；および７２℃、３０秒で３０サイクルで
、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、対応する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応
緩衝液：５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよ
びｄＣＴＰ）、２５ｍｏｌの各プライマーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌク
レオチドで行った。ＰＣＲ産物を次いでＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トとしてｐＢＣＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）中にクローニング
して、プラスミドｐＢＣＫＳ−１１を得た。改変をＤＮＡ配列決定で確認した。

【０１０３】（Ｃ．重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）クローニング手順のために設計
されたＭＢＩ−１１フラグメントの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡ
ＡＡＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣＧＴＡＡＡ
ＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴ
ＧＴＧＴＧＡ（配列番号１１）を合成し、そしてＰＣＲの鋳型として用いて
、プライマーＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（
配列番号１２）およびＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
Ｃ（配列番号１３）を用いた。ＰＣＲを、ＭＪ−ＲｅｓａｒｃｈＰＴＣ−１０
０熱サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４℃、３０秒；５１℃、３０秒；
および７２℃、３０秒で３０サイクルで、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、
対応する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２５ｍｏｌの各プライマ
ーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチドで行い、１１４ｂｐのｄｓＤＮ
ＡＭＢＩ−１１−ＢＥフラグメントを得た。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲＩ挿入物としてｐＢＣＫＳ（＋）中にクローニングし、ｐＢＣＫＳ−
１１ＢＥを得た。

【０１０４】（Ｄ．重合クローニング手順）重合クローニング手順のために設計されたＭＢＩ−１１のコピーをｐＥＴ２１
ＣＢＤ９６−１１にクローニングし、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１を得た。
ｐＢＣＫＳ−１１ＢＥを、２×ＯＰＡ中の２ＵのＢａｍＨＩおよびＶｓｐＩを用
いて、５０μｌの反応中、３７℃で１時間、消化し、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１
１を、２×ＯＰＡ中の２ＵのＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて、５０μｌの反
応中、３７℃で１時間、消化した。反応をフェノール／ＣＨＣｌ₃抽出およびエ
タノール沈殿で停止した。得られたＤＮＡペレットを、８μｌの水に各々溶解お
よび混合し、次いで２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよび２
ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、そして反応を１０℃で１時間インキュベート
した。次いで２μｌのライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１ＢｌｕｅをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギ
ャップ）および２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦに設定したＧｅｎｅ
Ｐｕｌｓｅ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてエレクト
ロポレーションした。エレクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を
細胞懸濁液に加え、そして細菌を３７℃で１時間、激しく振盪しながらインキュ
ベートした。次いで、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液を、ＭａｃＫｏ
ｎｋｅｙ寒天プレート上に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に播種し、３７
℃で一晩インキュベートした。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移
し、３７℃で激しく振盪しながら一晩培養した。次いで、プラスミドＤＮＡを単
離し、そして当業者に公知の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。ポジ
ティブクローンは、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１を含んでいた。親和性のＶ
ｓｐＩおよびＮｄｅＩの凝集末端のライゲーションの結果、両方の制限部位が除
かれる。同時に、ｍｂｉ−１１ｂｅカセットの挿入は、新規なＮｄｅＩ部位を導
入し、これがクローニング手順の繰り返しと、別のｍｂｉ−１１ｂｅの挿入を可
能にする。この手順は、理論的には無制限に繰り返すことができる。この特定の
場合では、連続的クローニングを９回繰り返し、そしてｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−
１０×１１までの構築物を調製した。

【０１０５】（実施例５）（融合および非融合マルチドメイン発現系の構築のためのＤＮＡカセットの合
成）（Ａ．ＭＢＩ２×１１Ｂ７ラスト（ｌａｓｔ）カセットの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴ
ＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＡＡＡＡＴＧ
ＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧ
ＴＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣ
ＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣ（配列番号１４）を合成し、そしてＰＣ
Ｒのための鋳型として用いて、プライマーＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号１５）およびＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴ
ＡＧＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号１６）を用いた。ＰＣＲはＭＪ−Ｒｅｓａｒ
ｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４℃、３０秒
；５５℃、３０秒；および７２℃、３０秒で３０サイクルで、２ＵのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ、対応する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭ
ＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９）、
０．２ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２５
ｐｍｏｌの各プライマーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチドで行い、
その結果、１５１ｂｐのｄｓＤＮＡＭＢＩ−１１フラグメントを得た。ＰＣＲ
産物をフェノール／ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿で精製した。得られた
ＤＮＡを１００μｌ×ＯＰＡ、２０ＵのＢａｍＨＩおよび２０μｌのＨｉｎｄＩ
ＩＩに溶解し、そして反応を３７℃で２時間インキュベートした。ベクターｐＢ
ＣＫＳ（＋）（０．２５μｇ）を同じ方法で消化した。両反応をフェノール／Ｃ
ＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿で停止させた。得られた各ベクターのＤＮＡ
およびＭＢＩ−１１挿入物を、８μｌの水に溶解および混合し、次いで２μｌの
１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを
加え、そしてライゲーション反応物を１０℃で１時間インキュベートした。次い
で２μｌの各ライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１
Ｂｌｕｅを滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギャッ
プ）および２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦに設定したＧｅｎｅＰ
ｕｌｓｅｒエレクトロポレーター装置を用いてエレクトロポレーションした。エ
レクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を細胞懸濁液に加え、そし
て細菌を１時間３７℃で激しく振盪しながらインキュベートした。次いで、１０
、５０および１００μｌの細胞懸濁液をＭａｃＫｏｎｋｅｙ寒天プレート上に１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に播種し、３７℃で一晩インキュベートした
。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し、３７℃で激しく振盪しな
がら一晩培養した。次いで、プラスミドＤＮＡを単離し、そして当業者に公知の
方法によるＤＮＡ配列決定を含む分析をした。得られたプラスミドは、ｐＢＣＫ
Ｓ−２×１１Ｂ７であった。挿入物は後で、ｐＢＣＫＳ−Ｖに再度クローニング
し、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−２×１１Ｂ７を得た。

【０１０６】（Ｂ．ＭＢＩ−１１Ｂ７−ポリカセットの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴ
ＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＡＡＡＡＴＧ
ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣ
（配列番号１７）を合成し、そしてＰＣＲのための鋳型として用い、プライマー
ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号１８
）およびＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号１９）
をプライマーとして用いた。ＰＣＲはＭＪ−ＲｅｓａｒｃｈＰＴＣ−１００熱
サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；およ
び７２℃、３０秒で３０サイクルで、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、対応
する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴＰ（
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２５ｐｍｏｌの各プライマー
および５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチドで行い、その結果、１１２ｂｐの
ｄｓＤＮＡＭＢＩ−１１フラグメントを得た。得られたＤＮＡ産物をｐＴＡ１
８Ｒ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）中にＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントとして（Ａ）節に記載のようにクローニングし、プラスミドｐＴＺ
１８Ｒ−１１Ｂ７ポリを得た。

【０１０７】（Ｃ．アニオン性スペーサーカセットの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣ
ＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣ（配列番号２０）を合成し、
そしてＰＣＲのための鋳型として用い、プライマーＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴ
ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号２１）およびＧＣＧＴＣＣＧＧ
ＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号２２）を用いた。ＰＣＲは、ＭＪ−
ＲｅｓａｒｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４
℃、３０秒；５５℃、３０秒；および７２℃、３０秒で３０サイクルで、２Ｕの
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、対応する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：
５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴ
Ｐ）、２５ｍｏｌの各プライマーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチド
で行い、その結果、９７ｂｐのｄｓＤＮＡＭＢＩ−１１フラグメントを得た。
得られたＤＮＡフラグメントを、ｐＢＣＫＳ−Ｖ中にＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントとして（Ａ）節に記載のようにクローニングし、プラスミドｐＢ
ＣＫＳ−Ｖ−Ｓを得た。

【０１０８】（Ｄ．ＭＢＩ−１１−Ｂ７第１カセットの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＴＴＣ
ＴＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣ
ＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣ
ＧＧＡＣＧＣ（配列番号２３）を合成し、そしてＰＣＲのための鋳型として
用い、プライマーＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣ（配列番号２４）およびＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣ
Ｇ（配列番号２５）を用いた。ＰＣＲは、ＭＪ−ＲｅｓａｒｃｈＰＴＣ−１０
０熱サイクラーで、５０μｌの反応容量で、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；
および７２℃、３０秒で３０サイクルで、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、
対応する反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応緩衝液：５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２５ｍｏｌの各プライマ
ーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチドで行い、その結果、１１４ｂｐ
のｄｓＤＮＡＭＢＩ−１１フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメント
をｐＢＣＫＳ−Ｖ−Ｓ中にＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩフラグメントとして、基本的に
（Ａ）節に記載のようにしてクローニングし、プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１
Ｂ７Ｓ−Ｆを得た。唯一の違いは２×ＯＰＡを制限酵素消化反応のために用いた
ことであった。

【０１０９】（Ｅ．プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖの構築）プラスミドｐＢＣＫＳ−ＶはｐＢＣＫＳ（＋）から調製された。この目的は本
来のプラスミドから全てのＶｓｐ１制限部位を除去することであり、そして得ら
れたプラスミドをいくつかのＤＮＡカセットのクローニングのために用いること
であった。

【０１１０】約１μｇのｐＢＣＫＳ（＋）を、ＶｓｐＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、５０
μｌの１×ＯＰＡを使用する反応中で消化した。反応を、フェノール／ＣＨＣｌ ₃ 抽出およびエタノール沈殿で停止させた。得られたＤＮＡを、５０μｌの１×
ＯＰＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび１ＵのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼに溶解し
た。反応を３０℃で３０分間インキュベートし、次いで、フェノール／ＣＨＣｌ ₃ 抽出およびエタノール沈殿で停止させた。次いで、ＤＮＡを、５０μｌの１×
ＯＰＡ、０．５ｍＭのＡＴＰおよび１５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼに溶解し、そ
して反応を１０℃でインキュベートし、そして４時間後、６５℃で３０分間イン
キュベートすることによって停止させた。次に２０ＵのＶｓｐＩを反応に加えて
、残余のｐＢＣＫＳ（＋）分子を消化し、そして３７℃で３時間のインキュベー
ションの後、２μｌのライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏｌｉ
ＭＣ４１００Ｆを滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギ
ャップ）、および２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦに設定したＧｅｎ
ｅＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター装置を用いてエレクトロポレーションし
た。エレクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を細胞懸濁液に加え
、そして細菌を１時間３７℃で、激しく振盪しながらインキュベートした。次い
で、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液を、ＭａｃＫｏｎｋｅｙ寒天プレ
ート上に２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと共に播種し、３７℃で一晩イ
ンキュベートした。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し、３７℃
で激しく振盪しながら一晩培養した。次いで、プラスミドＤＮＡを単離し、そし
てＶｓｐＩ制限分析によって分析した。全てのプラスミドはＶｓｐＩ部位を欠き
、そしてそのサイズはｐＢＣＫＳ−Ｖの計算されたサイズに対応した。

【０１１１】（実施例６）（融合マルチドメイン発現系の構築）（Ａ．ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１Ｂ７の構築）プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６（０．２５μｇ）およびｐＢＣＫＳ−２×１
１Ｂ７（２．５μｇ）を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを入れた１．５×Ｏ
ＰＡで、５０μｌの反応中、３７℃で１時間、２Ｕの各制限酵素および２０Ｕの
各酵素をそれぞれ用いて、消化した。両反応を、フェノール／ＣＨＣｌ₃抽出お
よびエタノール沈殿で停止させた。得られたＤＮＡを、８μｌの水に溶解および
混合し、次に２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、そしてライゲーション反応を、１０℃で１時間イン
キュベートした。次に、２μｌのライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ
．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅを、滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０
．２ｃｍ電極ギャップ）、ならびに２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦ
に設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター装置を用いて、エレク
トロポレーションした。エレクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地
を細胞懸濁液に加え、そして細菌を、１時間３７℃で、激しく振盪しながらイン
キュベートした。次に、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液を、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭａｃＫｏｎｋｅｙ寒天プレート上にプレーティ
ングし、３７℃で終夜インキュベートした。次の日、いくつかのコロニーを、２
ｍｌのＴＢに移し、３７℃で激しく振盪しながら終夜培養した。次にプラスミド
ＤＮＡを単離し、そして当業者に公知の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析
した。ポジティブクローンｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１Ｂ７は、ｃｂｄ９６
に融合した直列ＭＢＩ−１１遺伝子を含んでいた。

【０１１２】（Ｂ．融合マルチドメインプラスミドの構築のための連続的クローニング手順
の使用）連続的クローニング手順のアイディアは、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１Ｂ
７のＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ部位およびそれに続くマルチドメインクローンのＢａ
ｍＨＩ−ＮｄｅＩ部位への、ＢａｍＨＩ−ＭＢＩ−１１Ｂ７−Ｐ−ＶｓｐＩカセ
ットの挿入は常に、オリジナルのＮｄｅＩ部位をＮｄｅＩ／ＶｓｐＩライゲーシ
ョンによって除去し、そして新規なＮｄｅＩ部位が各挿入で導入され、これがＢ
ａｍＨＩと共に次のクローニングのサイクルで使用されるということである。

【０１１３】プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１Ｂ７（０．２５μｇ）を、２Ｕの
ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを入れた２×ＯＰＡで、５０μｌの反応中、３７℃で
１時間消化した。プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ（２．５μｇ）を、１
００μｌ反応中で、２０ＵのＢａｍＨＩおよびＶｓｐＩを入れた２×ＯＰＡ中、
３７℃で１時間消化した。両方の反応を、フェノール／ＣＨＣｌ₃抽出およびエ
タノール沈殿で停止させた。得られたＤＮＡを、８μｌの水に溶解および混合し
、次に、２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを加え、そしてライゲーション反応を、１０℃で１時間インキュベ
ートした。次に、２μｌのライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏ
ｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅを、滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃ
ｍ電極ギャップ）、ならびに２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦに設定
したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター装置を用いて、エレクトロポ
レーションした。エレクトロポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を細胞
懸濁液に加え、そして細菌を１時間３７℃で、激しく振盪しながらインキュベー
トした。次に、１０、５０および１００μｌの細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むＭａｃＫｏｎｋｅｙ寒天プレート上にプレーティングし、
３７℃で終夜インキュベートした。次の日、いくつかのコロニーを、２ｍｌのＴ
Ｂに移し、３７℃で激しく振盪しながら終夜培養した。次に、プラスミドＤＮＡ
を単離し、そして当業者に公知の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。
ポジティブクローンｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１ｓ−３×１１Ｂ７は、ｃｂｄ９６
に融合した１つのスペーサーを有する３つのＭＢＩ−１１単位を含んでいた。こ
れが、連続的クローニングの第１のサイクルであった。次のサイクルにおいて、
ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１ｓ−３×１１Ｂ７およびｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ
を用い、そしてクリーニングを繰り返して、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２ｓ−４×
１１Ｂ７を得た。次に、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２ｓ−４×１１Ｂ７およびｐＢ
ＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓを次のクローニングに用いて、その結果、ｐＥＴ２１Ｃ
ＢＤ９６−３ｓ−５×１１Ｂ７を得、以下同様にした。

【０１１４】連続的クローニング手順を加速するために、プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−５×
１１Ｂ７Ｓを調製した。そして各クローニングサイクルは、５つの１１Ｂ７Ｓド
メインを付加する。ｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓの第１の１１Ｂ７Ｓ挿入物を、
ｐＴＺ１８Ｒ中に再度クローニングして、ｐＴＺ１８Ｒ−１１Ｂ７Ｓが得られた
。次に、このプラスミドを、ＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ／ＶｓｐＩストラテジーを用
いたｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ中への連続的クローニングのための１１Ｂ７Ｓ
ドメインのドナーとして、用いた。連続的クローニング手順を４回繰り返すと、
ｐＢＣＫＳ−Ｖ−５Ｓ−５×１１Ｂ７Ｓが得られた。５Ｓ−５×１１Ｂ７カセッ
トを、次に、１５個を越える１１Ｂ７ドメインを含むＣＢＤ９６融合系の構築、
ならびに同数の１１Ｂ７とアニオン性スペーサードメインを有するＣＢＤ９６融
合マルチドメイン系の構築のために使用した（表２）。

【０１１５】ｐＢＣＫＳ−Ｖ−５Ｓ−５×１１Ｂ７のカセット５Ｓ−５×１１Ｂ７とその末
端のアニオン性スペーサードメインを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限酵素を用
いてｐＥＴ２１ＣＢＤ９６中にクローニングし、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−５Ｓ−
５×１１Ｂ７を得た。第２のクローニングサイクルにおいて、同じカセットをｐ
ＢＣＫＳ−Ｖ−５×１１Ｂ７ＳのＢａｍＨＩ−ＶｓｐＩ断片として、ｐＥＴ２１
ＣＢＤ９６−５Ｓ−５×１１Ｂ７のＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ部位中にライゲーショ
ンし、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１０Ｓ−１０×１１Ｂ７を得た。これを数回繰り
返して、１５、２０、２５等の個数の１１Ｂ７ドメインと同数のアニオン性スペ
ーサードメインとを有する、構築物が得られ得る。制限酵素、ライゲーション、
エレクトロポレーションおよび組換えプラスミドの分析の条件は、上記の通りで
ある。

【０１１６】（実施例７）（非融合マルチドメイン発現系の構築）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、全てのタンパク質の最初のアミノ酸は、ｆ−メチオニ
ンである。しかし、このアミノ酸は、ＣＮＢｒで切断されない。これは、マルチ
ドメインタンパク質から遊離する１つのペプチドドメインがｆ−メチオニンから
始まることを、意味する。この解決法は、ｆ−メチオニンおよびメチオニンを直
列でペプチドの最初にコードする修飾ＭＢＩ−１１カセットを創製することであ
り、そうすると、第２のメチオニンが、ＣＮＢｒで切断されることになる。その
結果は、マルチドメイン遺伝子中に特別の第１ドメインである、カセットＭＢＩ
−１１Ｂ７Ｆを合成することであり、これは、最初にＭＴＭアミノ酸をコードす
る。このドメインを、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−Ｓ中のスペーサードメインに融合して、
プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ−Ｆを得た。

【０１１７】プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ−Ｆおよび関連のｐＥＴ２１ＣＢＤ９
６−マルチドメイン−１１Ｂ７プラスミドを、非融合マルチドメインＭＢＩ−１
１Ｂ７遺伝子の構築に用いた。マルチドメイン遺伝子を、ｃｂｄ９６からＮｄｅ
Ｉ−ＸｈｏＩ消化によって遊離させ、そしてｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ−Ｆの
ＶｓｐＩ−ＸｈｏＩ部位中に、１１Ｂ７Ｓ挿入物の下流にクローン化した。これ
は非融合マルチドメイン１１Ｂ７遺伝子のラインを、プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ
中に創製した。これらの遺伝子を、次に、ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ断片としてｐＥＴ
２１ａ（＋）中に再度クローニングし、その結果、一連のｐＥＴプラスミドが得
られ、これは、Ｔ７プロモーター系を用いたマルチドメインタンパク質の発現が
可能である。

【０１１８】プラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ−Ｆ（０．２５μｇ）を、２ＵのＮｄ
ｅＩおよびＸｈｏＩを入れた２×ＯＰＡで、いくつかの５０μｌ反応中、３７℃
で１時間消化した。関連のプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−マルチドメイン−
１１Ｂ７（２．５μｇ）を、１００μｌの反応中で２０ＵのＮｄｅＩおよびＸｈ
ｏＩを入れた２×ＯＰＡで、３７℃で１時間消化した。全ての反応を、フェノー
ル／ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿で停止させた。得られたベクターおよ
び挿入物ＤＮＡを、８μｌの水に溶解および混合し、次に２μｌの１０ｍＭＡ
ＴＰ、２μｌの１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、そして
ライゲーション反応を、１０℃で１時間インキュベートした。次に、２μｌの各
ライゲーション混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅを
滅菌ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）、ならびに
２．５ｋＶ、２００オームおよび２５０μＦに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ
エレクトロポレーター装置を用いて、エレクトロポレーションした。エレクトロ
ポレーションパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を細胞懸濁液に加え、そして細菌を
１時間３７℃で、激しく振盪しながらインキュベートした。次に、１０、５０お
よび１００μｌの細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭａｃ
Ｋｏｎｋｅｙ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で終夜インキュベート
した。次の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し、３７℃で激しく振盪
しながら終夜培養した。次に、プラスミドＤＮＡを単離し、そして当業者に公知
の方法によるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。ポジティブクローンは、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６および２１個のＭＢ
Ｉ−１１Ｂ７ドメインを含む、ｐＥＴ２１−マルチドメイン−１１Ｂ７プラスミ
ドを含んでいた。

【０１１９】同じ方法で、同数の１１Ｂ７とアニオン性スペーサードメインとを含む構築物
を調製した。例として：ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−５Ｓ−５×１１Ｂ７をＢａｍＨ
ＩおよびＸｈｏＩ（またはＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、そして断片５Ｓ−５×１
１Ｂ７をｐＢＣＫＳ−Ｖ−１１Ｂ７Ｓ−ＦのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（またはＨｉ
ｎｄＩＩＩ）中にライゲーションして、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−６Ｓ−６×１１Ｂ７を
得た。ｐＢＣＫＳ−Ｖ−６Ｓ−６×１１Ｂ７のＢａｍＨＩ−６Ｓ−６×１１Ｂ７
−ＸｈｏＩカセットを、次に、ｐＥＴ２１ａ（＋）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ中に
再度クローニングして、ｐＥＴ２１−６Ｓ−６×１１Ｂ７を得た。全てのクロー
ニング手順およびクローン分析は上記の通りである。

【０１２０】（実施例８）（融合マルチドメインＭＢＩ２６発現系の構築）本発明者らの以前の研究で、本発明者らは、マルチドメインカチオン性ペプチ
ド発現系の構築に関連する主要な問題すべてを解決した。この実施例は、本発明
者らが、プロセス、特に複数の特定のＤＮＡカセットを合成する必要性を単純化
できたことを、実証する。わずか１つのｍｂｉ２６カセットを調製し、そして連
続的クローニング手順の場合と同様に、最初および最後の位置に用いた。プラス
ミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１ｓ−２６およびｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２ｓ−２
×２６を調製した。本発明者らは、ｍｂｉ２６およびｍｂｉ１１Ｂ７ドメインの
組合せの発現を試験した。本発明者らは、２つのクローニングサイクルを行い、
ｍｂｉ２６ＳカセットをｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１Ｓ−３×１１Ｂ７中に挿入し
、その結果、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２６Ｓ−３×１１Ｂ７およびｐＥＴ２１Ｃ
ＢＤ９６−２×２６Ｓ−３×１１Ｂ７を得た。両構築物とも、組合せたｍｂｉ２
６−１１Ｂ７マルチドメインタンパク質を良好なレベルで発現した。

【０１２１】（Ａ．ユニバーサルＭＢＩ２６ドメインの合成）オリゴヌクレオチドＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴ
ＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＣＴ
ＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＡ
ＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴ
ＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣ（配列番号２６）を合
成し、そしてＰＣＲのための鋳型として、プライマーＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴ
ＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号１８）およびＧＣＧＴＣＣＧ
ＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号１９）を用いて使用した。ＰＣＲ
はＭＪ−ＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ−１００熱サイクラーで、５０μｌの反応容
量で、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；および７２℃、３０秒で３０サイクル
で、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、対応の反応緩衝液（１０×ＰＣＲ反応
緩衝液：５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌｐＨ９）、０．２ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよ
びｄＣＴＰ）、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび５０ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌ
クレオチドで行い、その結果、１１２ｂｐのｄｓＤＮＡＭＢＩ２６断片を得た
。得られたＤＮＡ断片をｐＴＺ１８Ｒ中にＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とし
て、実施例２、段落（Ａ）に記載のようにクローニングして、プラスミドｐＴＺ
１８Ｒ−２６ＧＴを得た。ＤＮＡ配列の確認の後、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ｍｂｉ２６断片をｐＢＣＫＳ（＋）中に再度クローニングし、ｐＢＣＫＳ−２
６ＧＴを得た。

【０１２２】（Ｂ．ＭＢＩ２６融合マルチドメイン系の構築）構築の第１ステップは、ｍｂｉ２６カセットをｐＥＴ２１ＣＢＤ９６中のｃｂ
ｄ９６に直接融合することであった。プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６（０．２
５μｇ）およびｐＢＣＫＳ−２６ＧＴ（２．５μｇ）をＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩを入れた１．５×ＯＰＡ（５０μｌ反応容量）で３７℃で１時間、２Ｕ
の各制限酵素および２０Ｕの各酵素をそれぞれ用いて、消化した。両反応を、フ
ェノール／ＣＨＣｌ₃抽出およびエタノール沈殿で停止させた。得られた各ＤＮ
Ａを８μｌの水に溶解し、これら２つを、２μｌの１０ｍＭＡＴＰ、２μｌの
１０×ＯＰＡおよび２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、そしてこのライ
ゲーション反応を、１０℃で１時間インキュベートした。２μｌのライゲーショ
ン混合物を用いて、４０μｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１Ｂｌｕｅを、滅菌Ｇｅｎ
ｅＰｕｌｓｅｒキュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）、ならびに２．５ｋ
Ｖ、２００オームおよび２５０μＦに設定したＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒエレクト
ロポレーター装置を用いて、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーシ
ョンパルスの後、１ｍｌのＴＢ培地を細胞懸濁液に加え、そして細菌を、１時間
３７℃で激しく振盪しながらインキュベートした。次に、１０、５０および１０
０μｌの細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＭａｃＫｏｎｋ
ｅｙ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で終夜インキュベートした。次
の日、いくつかのコロニーを２ｍｌのＴＢに移し、３７℃で激しく振盪しながら
終夜培養した。次に、プラスミドＤＮＡを単離し、そして当業者に公知の方法に
よるＤＮＡ配列決定を含めて分析した。ポジティブクローンｐＥＴ２１ＣＢＤ９
６−２６は、ｃｂｄ９６に融合したＭＢＩ−２６遺伝子を含んでいた。

【０１２３】第２のステップは、連続的クローニング手順のためのカセットの調製であった
。ｐＴＺ１８Ｒ−２６ＧＴのｍｂｉ２６断片をｐＢＣＫＳ−Ｖ−Ｓ中にＢａｍＨ
Ｉ−ＮｓｉＩ断片として、基本的に実施例５（Ａ）に記載されたのと同様にクロ
ーニングし、その結果、ｍｂｉ２６ドメインがアニオン性スペーサーをコードす
る配列に融合したプラスミドｐＢＣＫＳ−Ｖ−２６Ｓを得た。唯一の違いは、２
×ＯＰＡを制限酵素消化反応に用いたことであった。次に、挿入物をｐＴＺ１８
Ｒ中にクローニングし、その結果、ｐＴＺ１８Ｒ−２６Ｓを得た。これは、Ｂａ
ｍＨＩ−２６Ｓ−ＶｓｐＩ挿入物をｐＢＣＫＳ−Ｖ−２６ＳのＢａｍＨＩ−Ｎｄ
ｅＩ部位にクローニングすることを可能とし、その結果、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−２Ｓ
−２×２６が得られた。

【０１２４】第３のステップは、実際の連続的クローニング手順（詳細は実施例６Ｂ参照）
であった。簡単に述べると、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−２６Ｓを、ＢａｍＨＩおよびＶｓ
ｐＩで消化して、断片ＢａｍＨＩ−２６Ｓ−ＶｓｐＩを得、これを、ＢａｍＨＩ
およびＮｄｅＩで消化したプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２６ＧＴ中にライ
ゲーションした。ポジティブクローンｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１ｓ−２×２６は
、２つのＭＢＩ−２６単位を含んでおり、１つのスペーサーがｃｂｄ９６に融合
していた。これが、連続的クローニングの第１のサイクルであった。次のサイク
ルにおいて、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１ｓ−２×２６およびｐＢＣＫＳ−Ｖ−２
６Ｓを用いて、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２ｓ−３×２６が調製され得、以下同様
であった。

【０１２５】（Ｃ．組み合わされたＭＢＩ２６−ＭＢＩ１１Ｂ８７マルチドメイン遺伝子の
構築および発現）プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１Ｓ−３×１１Ｂ７を、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−
２６Ｓのｍｂｉ２６Ｓドメインの連続的クローニングのためのベクターとして用
いた。簡単に述べると、ｐＢＣＫＳ−Ｖ−２６Ｓを、ＢａｍＨＩおよびＶｓｐＩ
制限エンドヌクレアーゼで消化して、断片ＢａｍＨＩ−２６Ｓ−ＶｓｐＩを得、
これを、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化したプラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６
−１Ｓ−３×１１Ｂ７中にライゲーションした。ポジティブクローンｐＥＴ２１
ＣＢＤ９６−２Ｓ−２６−３×１１Ｂ７は、ＭＢＩ−２６単位を含み、１つのス
ペーサーが、１つのスペーサーを有する３つの１１Ｂ７単位に融合していた。こ
れは、連続的クローニングの第１のサイクルであった。次のサイクルにおいて、
ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２Ｓ−２６−３×１１Ｂ７およびｐＢＣＫＳ−Ｖ−２６
Ｓを用いて、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−３Ｓ−２×２６−３×１１Ｂ７を調製した
。

【０１２６】Ｔ７発現系を、Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ４１００Ｆ中でプラスミドｐＥＴ２１ＣＢ
Ｄ９６−２Ｓ−２６−３×１１Ｂ７またはｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−３Ｓ−２×２
６−３×１１Ｂ７、およびｐＧＰ１−２に基づいて調製した。タンパク質ＣＢＤ
９６−２Ｓ−２６−３×１１Ｂ７およびＣＢＤ９６−３Ｓ−２×２６−３×１１
Ｂ７は、温度誘導の後、良好なレベルで発現した。

【０１２７】（実施例９）（短縮型ＣＢＤに融合したマルチドメインカチオン性ペプチドまたは非融合系
の振盪フラスコ発酵の生成）異なるｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−（ｎ−２）Ｓ−ｎ×１１Ｂ７、ｐＥＴ２１ＣＢ
Ｄ９６−ｎＳ−ｎ×１１Ｂ７、ｐＥＴ２１−（ｎ−２）Ｓ−ｎ×１１Ｂ７および
ｐＥＴ２１−ｎＳ−ｎ×１１Ｂ７Ｆ構築物（ここでｎ＝コピー数、Ｓはアニオン
性スペーサーを示し、そして１１Ｂ７または１１Ｂ７Ｆはカチオン性ＭＢＩ−１
１Ｂ７ペプチドを表す）の各々を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＣ４１００Ｆ中で発現した
。

【０１２８】全ての発酵は、ＴＢブロス中で行った。これは以下のように調製される：１２
ｇのトリプチカーゼペプトン（ＴｒｙｐｔｉｃａｓｅＰｅｐｔｏｎｅ）（ＢＢ
Ｌ）、２４ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）および４ｍｌのグリセロール（Ｆｉｓｈｅ
ｒ）を９００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に加える。材料を溶解させ、そして１００
ｍｌの０．１７ＭＫＨ₂ＰＯ₄（ＢＤＨ）、０．７２ＭのＫ₂ＨＰＯ₄（Ｆｉｓｈ
ｅｒ）を加える。このブロスを１２１℃のオートクレーブに２０分間かける。得
られるｐＨは７．４である。

【０１２９】１リットルのエルレンマイヤーフラスコに、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．）および３０μｇ／ｍｌのカナマイ
シンＡ（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．）を含む１７０ｍｌの培地を
入れたものに、関連の０．５ｍｌ凍結ストックを接種し、そして３００ｒｐｍで
、振盪インキュベーター（モデル４６２８、ＬａｂＬｉｎｅＩｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔＩｎｃ．）中、３０℃で１６時間振盪した。

【０１３０】次に、培養物を、３３０ｍｌの新鮮なＴＢ培地（抗生物質無し）を入れた２．
０Ｌフラスコに移し、３０℃で予備インキュベートした。希釈後、培養温度を４
２℃まで上昇させることによってタンパク質発現を誘導し、そして３００ｒｐｍ
でさらに５〜７時間振盪した。ｐＨを、３０％水酸化アンモニウムを用いて、６
．７と７．１との間に維持した。細菌に、誘導の間に少なくとも２回、１フラス
コ当たり０．５ｇのグルコースを供給した。細胞を、１５，０００×ｇで１５分
間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣ−５Ｂ）して採取し、そして細胞
ペレットを−７０℃で細胞溶解の前に貯蔵した。

【０１３１】（実施例１０）（粗分画および封入体の単離）細菌は、マルチドメインタンパク質を不溶性の封入体として産生する。封入体
を遊離および単離するために、採取した細胞を２００ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、そして超音
波（Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ^TM、ＳｏｎｉｃａｎｄＭａｔｅｒｉａｌＩｎｃ
．）で５回、４５秒間、氷の上で処理して溶解し、次に２１，８７５×ｇで１５
分間、４℃で遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＲＣ−５Ｂ）した。ペレッ
トを１６０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００μｇ／ｍｌ
リゾチーム、ｐＨ８．０）中でホモジナイズ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｉｌ
ｅｓ、ＩＬＵＳＡ）し、そして室温で４５分間インキュベートした。次に、Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を加え（１％ｖ／ｖ）、そして混合物を完全にホモジナ
イズし、そして２１，８７５×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。封入体ペレ
ットを、２００ｍｌの０．１ＭＮａＣｌ中に再懸濁し、ホモジナイズし、そし
て、上記のように遠心分離で沈殿させ、次に、２００ｍｌの水中に再懸濁させ、
そして再び、遠心分離で沈殿させた。この段階で、封入体は７０％を越える融合
タンパク質を含んでいた。

【０１３２】（実施例１１）（化学的切断によるカチオン性ペプチドの遊離）単離された封入体を、７０％ギ酸（１ｍｌ当たり１００ｍｇ湿潤重量ＩＢ）に
溶解し、次に、ＣＮＢｒを加えて、最終濃度を０．１Ｍから０．１５Ｍとした。
カチオン性ペプチドを融合タンパク質およびスペーサーから遊離させる、切断反
応を、暗中で４時間、窒素下で攪拌しながら行った。次に、反応混合物を、１５
容量のＭｉｌｌｉ−Ｑ水で希釈し、そしてロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ
ｖａｐ）装置（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒｅ，Ｒ−１２４ＶＰ，ＢＵＣＨＩＳｗｉｔ
ｚｅｒｌａｎｄ）中で乾燥した。次に、乾燥したペレットを１０ｍｌの７〜８Ｍ
の尿素に溶解し、そして不溶性物質を２１，８７５×ｇで１５分間の遠心分離に
より分離した。

【０１３３】この段階で、酸性ｐＨ（２〜３．３）および低伝導度（１〜５ｍＳ）の可溶性
物質は、カチオン性ペプチドのホモセリンラクトン体を含む。この物質を、クロ
マトグラフィー手順を用いてさらに精製した。

【０１３４】（実施例１２）（遊離カチオン性ペプチドの精製）ホモセリン体のＭＢＩ−１１Ｂ７ペプチドの精製を、ＢｉｏＳｙｓ^TM２０００
クロマトグラフィーワークステーション（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ，Ｉｎｃ．）で、ＸＫカラム（１．６×１１ｃｍ）に充填したＦａｓｔＦ
ｌｏｗＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換樹脂（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉ
ｏｔｅｃｈＡＢ）を用いて行った。カラムを、２カラム容量（ＣＶ）の１Ｍ
ＮａＯＨで流速９ｍｌ／分で平衡化し、次いで、水で洗浄した。伝導度、ｐＨお
よび２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。伝導度が５ｍＳより下に下がったら
、乾燥した切断物質を７〜８Ｍの尿素に溶かしたものをカラムにローディングし
、そして４Ｍの尿素で洗浄した。非結合の純粋なカチオン性ペプチドがカラムを
通って流れ、リーディングピークとしてモニターされた。吸光度がベースライン
よりも下がったら、結合物質（すなわち不純物）を、１ＭＮａＯＨでカラムか
ら洗い流した。これが、第２のピークとして現れた（図９）。

【０１３５】フロースルーピークを採取してプールし、そしてｐＨを、０．２ＮのＨＣｌで
７．０〜７．５に調節した。試料の純度について、Ｃ８カラム（４．６×１０、
Ｎｏｖａ−Ｐａｋ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（図１１）、および酸
−尿素ゲル電気泳動（ＷｅｓｔａｎｄＢｏｎｎｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ１９：３２３８，１９８０）で分析した。ＭＢＩ−１１Ｂ７ペプチドの正
体を、質量分析法によって確認して、このフロースルーピークが、ＭＢＩ−１１
Ｂ７ペプチドのホモセリン体を表すことを示した。

【０１３６】（実施例１３）（尿素の分離およびさらなる精製）精製したペプチドからの尿素の分離は、高スループット逆相クロマトグラフィ
ー技術を利用し、ＢｉｏＣＡＤ^TM（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓＩｎｃ．）灌流クロマトグラフィーワークステーションおよびＰｒｏｓ（登
録商標）Ｒ−ＩＩ２０カラム、４．６×１００ｍｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）を用いた。約１０ｍｇのペプチドを、カラムに
５ｍｌ／分で付し、次いで、０．１％ＴＦＡでカラムを平衡化した。ペプチドを
カラムから、０から５０％まで１０分間かけてアセトニトリルを増やすグラジエ
ントで、流速５ｍｌ／分で溶出した。さらに、精製されて尿素を含まないペプチ
ドのピークを採取し、凍結乾燥した。

【０１３７】（実施例１４）（ＭＢＩ−１１Ｂ７ＣＮペプチドおよびそのホモセリン／ホモセリンラクトン
アイソフォームの殺菌活性）化学合成したカチオン性ペプチドと組換え合成したカチオン性ペプチドとの間
の抗菌活性の比較を行った。

【０１３８】化学合成したＭＢＩ−１１Ｂ７ＣＮペプチドおよび組換えＤＮＡ合成したＭＢ
Ｉ−１１Ｂ７ＨＳＬ（ホモセリンラクトン体）およびＭＢＩ−１１Ｂ７ＨＳ（ホ
モセリン体）ペプチドの抗菌活性を、抗生物質耐性株を含む種々のグラム陰性お
よび陽性細菌の株に対して試験した。アガロース希釈アッセイは「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｆｏｒＤｉｌｕｔｉｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＳｕｓｃｅｐｔ
ｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｓｆｏｒＢａｃｔｅｒｉａＴｈａｔＧｒｏｗ
Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ−ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ
Ｓｔａｎｄａｒｄ」ＮＣＣＬＳ文書Ｍ７−Ａ４（ＩＳＢＮ１−５６２３８−
３０９−４）第１７巻、第２号（１９７７）に記載のようにして行った。

【０１３９】アガロース希釈アッセイは、ペプチドおよびペプチドアナログの抗菌活性を測
定し、これはペプチドの最少阻害濃度（ＭＩＣ）として表される。

【０１４０】インビボでの状態を模倣するために、カルシウムおよびマグネシウムを補充し
たＭｕｅｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎブロスを低ＥＥＯアガロースと組み合わせて、
細菌増殖培地として用いる。寒天ではなくアガロースを用いる、なぜなら寒天中
の荷電した基が、培地を通じてのペプチドの拡散を妨げるからである。培地をオ
ートクレーブにかけ、次に５０℃〜５５℃に水浴中で冷却し、その後、抗菌性溶
液を無菌状態で添加する。同じ容量の異なる濃度のペプチド溶液を冷却した溶融
アガロースに添加し、次にこれを３〜４ｍｍの深さまで注ぐ。

【０１４１】細菌の接種物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度標準（ＰＭＬＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に調整し、そして次に、アガロースプレート上に適用す
る前に１：１０に希釈する。アガロースに適用した最終接種物は、５〜８ｍｍ直
径のスポット中約１０⁴ＣＦＵである。アガロースプレートを、３５℃〜３７℃
で１６〜２０時間インキュベートする。

【０１４２】ＭＩＣを目視で決定して、ペプチドが生物の増殖を完全に阻害する最低の濃度
として記録する。種々の細菌株に対するカチオン性ペプチドについての代表的な
ＭＩＣを、表３に示す。

【０１４３】表３（ＭＢＩ−１１Ｂ７ＣＮ（カルボキシ−アミダイト化）ペプチド、ＭＢＩ−１
１Ｂ７ＨＳＬ（ホモセリンラクトン体）ペプチドおよびＭＢＩ−１１Ｂ７ＨＳ（
ホモセリン体）ペプチドの、種々のグラム陰性細菌株およびグラム陽性細菌株に
対する最少阻害濃度（ＭＩＣ）値）

【０１４４】

【表３】

【０１４５】以上は、特に好適な実施形態について述べたが、本発明はこのように限定され
ないことが、理解される。種々の改変が開示の実施形態に対してなされ得ること
、そしてこのような改変は本発明の範囲内であることが意図され、この本発明の
範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定されることが、当業者にはわかるで
あろう。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１は、（Ａ）プラスミドｐＥＴ２１（＋）、（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＣＢ
Ｄ１８０、（Ｃ）ｃｂｄ１８０を含むＰＣＲ断片、ならびに（Ｄ）プラスミドｐ
ＥＴ２１ＣＢＤ１８０−ＢおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ１８０−Ｘの地図である。

【図１Ｂ】図１は、（Ａ）プラスミドｐＥＴ２１（＋）、（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＣＢ
Ｄ１８０、（Ｃ）ｃｂｄ１８０を含むＰＣＲ断片、ならびに（Ｄ）プラスミドｐ
ＥＴ２１ＣＢＤ１８０−ＢおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ１８０−Ｘの地図である。

【図１Ｃ】図１は、（Ａ）プラスミドｐＥＴ２１（＋）、（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＣＢ
Ｄ１８０、（Ｃ）ｃｂｄ１８０を含むＰＣＲ断片、ならびに（Ｄ）プラスミドｐ
ＥＴ２１ＣＢＤ１８０−ＢおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ１８０−Ｘの地図である。

【図１Ｄ】図１は、（Ａ）プラスミドｐＥＴ２１（＋）、（Ｂ）プラスミドｐＥＴ−ＣＢ
Ｄ１８０、（Ｃ）ｃｂｄ１８０を含むＰＣＲ断片、ならびに（Ｄ）プラスミドｐ
ＥＴ２１ＣＢＤ１８０−ＢおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ１８０−Ｘの地図である。

【図２】図２は、融合ポリカチオン性ペプチド遺伝子の地図を示す。

【図３】図３は、異なるＣＢＤ−ポリ−ＭＢＩ−１１融合タンパク質の発現を示すＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析である。カラムＳＴ：分子量マーカー：１４．４、２１．５、
３１、４５、６６．２および９７．４ｋＤａ；カラム１：３０℃で培養されたＥ
．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２）の全細胞溶解物；カラム２：３０℃
で培養されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９
６−１１）の全細胞溶解物；カラム３：４２℃で誘導されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ
４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−１１）の全細胞溶解物；カラ
ム４：３０℃で培養されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ
２１ＣＢＤ９６−２×１１）の全細胞溶解物；カラム５：４２℃で誘導されたＥ
．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−２×１１）
の全細胞溶解物；カラム６：３０℃で培養されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００（
ｐＧＰ１−２）の全細胞溶解物；カラム７：３０℃で培養されたＥ．ｃｏｌｉ
ＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−３×１１）の全細胞溶解
物；カラム８：４２℃で誘導されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２
、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−３×１１）の全細胞溶解物；カラム９：３０℃で培養
されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−４
×１１）の全細胞溶解物；カラム１０：４２℃で誘導されたＥ．ｃｏｌｉＭＣ
４１００（ｐＧＰ１−２、ｐＥＴ２１ＣＢＤ９６−４×１１）の全細胞溶解物；

【図４】図４は、マルチドメインタンパク質の遺伝子の構築に用いられるカセットの地
図を示す。

【図５】図５は、プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ９６およびその挿入物の１つの地図を提
示する。

【図６Ａ】図６Ａは、融合マルチドメインタンパク質遺伝子の地図を示す。

【図６Ｂ】図６Ｂは、融合マルチドメインタンパク質遺伝子の地図を示す。

【図６Ｃ】図６Ｃは、融合マルチドメインタンパク質遺伝子の地図を示す。

【図７】図７は、５つ以上のＭＢＩ−１１Ｂ７コピーを有するマルチドメインクローン
の発酵の結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。上のパネルはＣＢＤキャリア
に融合したマルチドメインクローンを表す。下のパネルは、キャリアを含まない
マルチドメインクローンを示す。左のパネルは全細胞溶解物を示し、右側のパネ
ルは封入体分割工程を示す。各レーンの主バンドは関連のマルチドメインタンパ
ク質を表し、そして各レーンの下に記載された「ｘ」数はＭＢＩ−ペプチドコピ
ーの数を示す。ゲルの左端に記載された数は、分子量標準物（ｋＤ）を表す。

【図８】図８は、プラスミドｐＥＴ２１−３ｓ−５×１１Ｂ７およびｐＥＴ２１−５ｓ
−７×１１Ｂ７の一部の地図を示す。

【図９】図９は、カチオン性ペプチド精製のためのＱ−セファロースクロマトグラフィ
ー工程のクロマトグラムであり、これは２８０ｎｍでのＵＶ吸収および伝導度を
モニターしている。

【図１０Ａ】図１０Ａは、プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＸおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ−Ｂの
構築を表す模式図である。

【図１０Ｂ】図１０Ｂは、プラスミドｐＥＴ２１ＣＢＤ−ＸおよびｐＥＴ２１ＣＢＤ−Ｂの
構築を表す模式図である。

【図１１】図１１は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーリーディングピーク（純粋な
カチオン性ペプチドを表す）の逆相分析の結果を示すグラフである。この研究に
おいて、Ｃ８カラム（４．６×１０、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ、Ｗａｔｅｒｓ）を０．
１％ＴＦＡを含む水で、１ｍｌ／分の流速で平衡化した。次に５０μｌのＱ−セ
ファロースクロマトグラフィーリーディングピーク材料を５０μｌの平衡化溶液
で希釈したものをカラムに付した。溶出は、溶液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９９．９
％アセトニトリル）の０−４５％勾配で、１分ごとにＢを１％増加させて行い、
次に１００％Ｂのステップで行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 3650 ＷｅｓｂｒｏｏｋＭａｌｌ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａＶ６Ｓ２Ｌ２ＣＡＮＡＤＡ (72)発明者バートフェルド，ダニエルカナダ国ブリティッシュコロンビアブイ６エル２シー８，バンクーバー，マクベインアベニュー 2636 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA07 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA02 4B065 AA26X AB01 BA01 CA34 CA44 4H045 AA20 AA30 BA10 CA11 EA29 FA16 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マルチドメイン融合タンパク質発現カセットであって、不溶
性タンパク質として発現される核酸分子に作動可能に連結したプロモーターを包
含し、ここで該核酸分子は、構造（カチオン性ペプチド）−［（切断部位）−（
カチオン性ペプチド）］_nを含むポリペプチドをコードし、ここでｎは、１と１
００との間の値を有する整数であり、そして該カチオン性ペプチドは抗菌活性を
有する、発現カセット。
【請求項２】前記核酸分子がまた、キャリアタンパク質をコードする、請
求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】前記ｎが５と４０との間の値を有する、請求項１に記載の発
現カセット。
【請求項４】請求項１に記載の発現カセットであって、ここで前記切断部
位は、低いｐＨまたは臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−
３−メチル−３’−ブロモインドレニン、ヒドロキシルアミン、ｏ−ヨードソ安
息香酸、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼ
Ａｒｇ−Ｃおよびトリプシンからなる群より選択される試薬によって切断され得
る、発現カセット。
【請求項５】請求項１に記載の発現カセットであって、ここで前記核酸分
子は、（ａ）キャリアタンパク質、（ｂ）構造（切断部位）−（アニオン性スペ
ーサペプチド）を有する少なくとも１つのペプチドを有するアニオン性スペーサ
ペプチド成分、および（ｃ）構造（切断部位）−（カチオン性ペプチド）を有す
るペプチドを少なくとも１つのペプチドを有するカチオン性ペプチド成分を含む
融合タンパク質をコードし、ここで該切断部位は該アニオン性スペーサペプチド
または該カチオン性ペプチドのいずれかの側であり得、そしてエレメント（ａ）
、（ｂ）、および（ｃ）は、任意の順序または数においてであり得る、発現カセ
ット。
【請求項６】前記キャリアタンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端に
位置する、請求項５に記載のマルチドメイン融合タンパク質発現カセット。
【請求項７】前記アニオン性スペーサが、システイン残基を欠く、請求項
５に記載の発現カセット。
【請求項８】前記融合タンパク質が、２〜４０のカチオン性ペプチドを含
む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項９】前記融合タンパク質が、３〜１５のカチオン性ペプチドを含
む、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】前記アニオン性スペーサペプチドの数が、前記カチオン性
ペプチドの数よりも大きいかまたは同じである、請求項５に記載の発現カセット
。
【請求項１１】前記アニオン性スペーサペプチドの数が、前記カチオン性
ペプチドの数よりも少ない、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項１２】前記キャリアタンパク質が、１００アミノ酸残基未満の長
さである、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項１３】前記キャリアタンパク質が、１００アミノ酸未満の短縮セ
ルロース結合ドメインである、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項１４】請求項１に記載の発現カセットであって、ここで前記核酸
分子は、（ａ）構造（切断部位）−（アニオン性スペーサペプチド）を有する少
なくとも１つのペプチドを有するアニオン性スペーサペプチド成分、および（ｂ
）構造（切断部位）−（カチオン性ペプチド）を有するペプチドを少なくとも有
するカチオン性ペプチド成分を含む融合タンパク質をコードし、ここで該アニオ
ン性スペーサペプチド成分の累積的な電荷が、該カチオン性ペプチド成分の累積
的な電荷を減少させる、発現カセット。
【請求項１５】請求項１に記載の発現カセットであって、ここで前記プロ
モーターが、ｌａｃＰプロモーター、ｔａｃＰプロモーター、ｔｒｃＰプロモー
ター、ｓｒｐＰプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、ａｒａ
Ｐプロモーター、ｔｒｐＰプロモーター、およびλプロモーターからなる群より
選択される、発現カセット。
【請求項１６】請求項１に記載の発現カセットを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１７】前記宿主細胞が、酵母細胞、真菌細胞、細菌細胞または植
物細胞である、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】前記細菌宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ
である、請求項１７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】請求項１に記載の発現カセットによってコードされる、ポ
リペプチド。
【請求項２０】カチオン性ペプチドを含む融合タンパク質を産生する方法
であって：（ａ）請求項１５に記載の組換え宿主細胞を、該融合タンパク質を産
生する条件下およびそれに十分な時間培養する、方法。
【請求項２１】前記融合タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請
求項１９に記載の方法。
【請求項２２】請求項２０に記載の方法であって、前記融合タンパク質を
、低いｐＨでまたは臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３
−メチル−３’−ブロモインドレニン、ヒドロキシルアミン、ｏ−ヨードソ安息
香酸、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＶ８プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡ
ｒｇ−Ｃおよびトリプシンからなる群より選択される試薬で処理することによっ
て前記ポリペプチドを切断する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２３】請求項２１に記載の方法であって、前記切断されたポリペ
プチドを陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に適用することによって前記カチ
オン性ペプチドを精製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】請求項２３に記載の方法であって、ここで前記陰イオン交
換カラムが、塩基で荷電され、そして前記カチオン性ペプチドをカラムに充填す
る前に水で洗浄する、方法。
【請求項２５】前記カラムが、水および約８Ｍまでの尿素で平衡化される
、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】前記カチオン性ペプチドが、約８Ｍまでの尿素を含む溶液
中で可溶化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】前記カチオン性ペプチドが、温和な有機溶媒を含む溶液中
で可溶化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】前記温和な有機溶媒が、メタノール、エタノール、または
アセトニトリルである、請求項２７に記載の方法。