JPH05213771A - ヘパリン結合性神経突起の成長プロモーター因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヘパリン結合性神経突起の成長促進因子（Ｈ
ＢＮＦ）を利用することによって内皮細胞のような細胞
の成長を抑制する方法。 【効果】 動物の脈管形成に関係する病気の処置に有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヘパリン結合性神経突起の成長
促進因子（ＨＢＮＦ）、また、ヘパリン結合性好中球性
因子呼ばれ、また、従来ヘパリン結合性脳ミトゲン（Ｈ
ＢＢＭｓ）と呼ばれた、の使用により細胞の成長を抑制
する方法に関する。

【０００２】ＨＢＮＦをエンコードする遺伝子はｃＤＮ
Ａライブラリーから分離されてきており、そして約１５
ＫＤの分子量をもつタンパク質中の１３６アミノ酸を有
する４１１ヌクレオチド配列である。この遺伝子は配列
決定され、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現されてきてお
り、そしてそのように産生されたタンパク質は自然のＨ
ＢＮＦの神経突起促進活性を保持する。

【０００３】予期せざることには、ＨＢＮＦタンパク質
は、塩基性線維芽成長因子（ｂＦＧＦ）に対して内皮的
に応答し、これにより成長に対して潜在的な抑制の生体
内作用を示す抑制因子であることが発見された。

【０００４】近年、成長因子として知られている、ある
数の比較的小さいポリペプチドが同定され、そして分離
されてきている。用語「成長因子」は、ある種の動物の
成長および分化に影響を与える、あるクラスのシグナル
を発生する物質を意味する。この作用は動物および組織
培養物の両者において見ることができ、そして所定の成
長因子は１より多い型の細胞に対して作用を有すること
ができる。

【０００５】多数のよく知られている成長因子は有意な
好中球活性を有する、すなわち、それらは神経細胞の成
長を維持または刺激することができる。このような好中
球性因子の最も早い発見は、神経成長因子（ＮＦＧ）
（Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉおよびＨａｍｂｕｒ
ｇｅｒ、１９５３）であった。ＮＦＧと同一族の同様な
成長因子は、脳誘導好中球性因子（ＢＤＮＦ）；（Ｌｅ
ｉｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）および好中球
因子−３（ＮＴ−３）（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅ
ｔ ａｌ．、１９９０）である。追加の成長因子は、次
のものを包含する：線毛の好中球性因子（ＣＮＴＦ）
（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８０、ＩＧＦ−ＩＩ（Ｍ
ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９８５）、アクチビン（Ｓｃ
ｈｕｂｅｒｔｅｔ ａｌ．、１９９０）、パープリン
（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）およびまた
ＦＧＦ（ＢａｉｒｄおよびＢｏｈｌｅｎ、１９９０）。

【０００６】ある数の既知の成長因子は、線維芽成長因
子（ＦＧＦ）に関する上科に含まれる。この族は次のも
のを包含する：塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）（Ｂｏｈｌｅ
ｎｅｔ ａｌ．、１９８４；Ｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、
１９８５）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）（Ｂｏｈｌｅｎ
ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅ
ｇｏ ｅｔ ａｌ．、１９８５）ならびに腫瘍遺伝子ｉ
ｎｔ−２の産生物（ＤｉｃｋｅｎｓおよびＰｅｔｅｒ
ｓ、１９８４）、ｈｓｔ／ＫＳ（ＤｅｌｌｉＢｏｖｉ
ｅｔ ａｌ．、１９８７）、ＦＧＦ−５（Ｚｈａｎ ｅ
ｔ ａｌ．、１９８８）、ＦＧＦ−６（Ｍａｒｉｃｓ
ｅｔ ａｌ．、１９８９）およびＫＧＦ（Ｆｉｎｃｈ
ｅｔ ａｌ．、１９８９）。これらは脈管の内皮細胞の
ためのすべての（ＫＧＦを除外する）ミトゲンであり、
そしてすべては、また、ヘパリンに強く結合する。他の
ヘパリン結合性成長因子、例えば、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
は、また、知られている（Ｋｅｃｋ ｅｔ ａｌ．、１
９８５）。ヘパリン結合性成長因子は、また、脳組織か
ら頻繁に分離され、そして脳細胞の成長および発育にお
いて有意な役割を演ずることがある。

【０００７】従来未知のヘパリン結合性タンパク質あ欧
州特許（ＥＰ）第３２６，０７５号に記載され、そして
組み換え遺伝子は米国特許出願第０７／５６８，５７４
号に開示された。このタンパク質は前述の成長因子のい
ずれにも無関係であるが、遺伝子がＭＫとして従来言及
されたタンパク質に構造的に関係し（Ｋａｄｏｍａｔｓ
ｕ ｅｔ ａｌ．、１９８８）ＭＫタンパク質のヒト形
態は米国特許出願第０７／５６８，５７４号に開示され
た。ＨＢＮＦとＭＫ遺伝子およびタンパク質の相同性は
非常に高く、そしてそれらは神経突起促進活性、こうし
て潜在的に好中球活性をもつタンパク質の新しい族を構
成する。

【０００８】より最近、ＨＢＮＦタンパク質はラット
（Ｒａｕｖａｌａ、１９８９、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９０）、および雌牛（Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．、１９８９、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９
０；Ｂｏｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９１）の両者か
ら分離され、そしてアミノ末端の配列は決定された。同
様に、ヒトおよびニワトリのタンパク質のＮ末端のアミ
ノ酸配列は決定された（欧州特許（ＥＰ）第３２６，０
７５号；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０）。その
うえ、ＨＢＮＦ遺伝子のＤＮＡ配列は米国特許出願第０
７／５６８，５７４号に開示された。ＨＢＮＦのｃＤＮ
Ａは、また、種々の組織から（Ｌｉ ｅｔａｌ．、１９
９０）および骨芽細胞（Ｔｅｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．、
１９９０）からのｃＤＮＡライブラリーからクローニン
グされた。

【０００９】本発明は、ＨＢＮＦが細胞の成長を抑制す
るという、予期せざる発見に関する。

【００１０】内皮細胞の増殖および新規な血管の引き続
く形成は、腫瘍の成長、関節炎および網膜症を包含する
病理学的プロセスの発展における無条件的な段階である
（ＦｏｌｋｍａｎおよびＫａｇｓｂｒｕｍ、１９８
７）。さらに、本発明の使用は細胞をより分化した状態
に推進し、これにより化学療法的使用を同様によく提供
する。これは精製されたタンパク質の直接投与により達
成することができるか、あるいは、また、このような処
置を行う物体の領域の中に、このタンパク質を産生する
ことができるトランスジェニック硫酸ヘパリン細胞を移
植することによって達成することができる。さらに、新
しい毛管の新生または形成は種々の病理学的状態または
病気において重要である。例えば、脈管形成に依存する
病気は、次のものを包含するが、これらに限定されな
い：血管線維腫、動脈静脈の奇形、関節炎、関節硬化性
班、角膜移植片血管新生、創傷治癒の遅延、糖尿病性網
膜症、顆粒化−熱傷、血管腫、血友病性関節、過形成性
瘢痕、血管新生緑内障、癒着不良骨折、オスラー−ウェ
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、乾癬、ピオゲ
ン性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、、充実腫
瘍、トラコーマおよび血管癒着（Ｍｏｓｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９１）。塩基性線維芽成長因子（ｂＦＧＦ）
は細胞培養における内皮細胞のための効力のあるミトゲ
ン（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．、１９
８４）および生体内で強力な抗原性因子（Ｂａｉｒｄお
よびＢｏｈｌｅｎ、１９９０）である。内皮細胞はｂＦ
ＧＦを発現し（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．、１
９８７、Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ ｅｔａｌ．、１９８
６、Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８７）そしてオ
ートクリン成長因子として使用することができる（Ｓａ
ｔｏおよびＲｉｆｋｉｎ、１９８８）。ｂＦＧＦの生体
内および試験管内の局在化の研究において、ｂＦＧＦ
は、また、細胞外のマトリックス中のヘパリンおよび硫
酸ヘパリンの部分に関連し、そして細胞の酵素により遊
離されて内皮細胞を活性化することができることが示さ
れた（Ｗａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｖｌｏ
ｄａｖｓｋｙ ｅｔａｌ．、１９８７、Ｍｏｓｃａｔｅ
ｌｌｉ、１９８８、Ｂａｓｈｋｉｎ ｅｔａｌ．、１９
８９およびＦｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８
８）。したがって、ｂＦＧＦの特定の一般に無毒の拮抗
因子を開発することは、脈管形成の治療学的コントロー
ルに対する有効なアプローチであることができる。

【００１１】脈管形成をコントロールすることの方法
は、ｂＦＧＦと細胞のレセプターとの間の相互作用のメ
カニズムの決定における最近の進歩にかんがみて、とく
に有効である。大部分の細胞はｂＦＧＦとＫ_d＝１０^-10
〜１０^-11で結合する、高い親和性のトランスメンブレ
ンｇｐｔレセプターを含有する（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ、１９８７）。この型のレセプターは同定されてきて
おり、そしてそのいくつかの形態は種々の種からクロー
ニングされ（Ｒｕｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｃｏ
ｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｋｏｒｎｂｌ
ｕｔｈ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｌｅｅ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８９、ＰａｓｑｕａｌｅおよびＳｉｎｇｅ
ｒ、１９８９、およびＳａｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．、１
９９０）これにより成長に影響を与える物質とレセプタ
ーとの間の相互作用のより直接な標準を可能とする。

【００１２】高い親和性のレセプターに加えて、細胞は
いっそ多数の親和性が低いレセプターを含有し、これら
のレセプターは硫酸ヘパリンプロテオグリカン類であ
り、そしてＫ_d＝１０^-9ｄｅｂＦＧＦと結合する（Ｍｏ
ｓｃａｔｅｌｌｉ、１９８７）。この型のレセプターの
第１の構成員は最近クローニングされた（Ｋｉｅｆｅｒ
ｅｔ ａｌ．、１９９０）。低いおよび高い親和性のレ
セプターに結合するｂＦＧＦの間の新規な相互作用は最
近報告された（Ｙａｙｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９
１）。このグループは、細胞表面の硫酸ヘパリン部分の
適切な生合成が高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの
結合に必要であること示した。また、外因性ヘパリンは
ｂＦＧＦレセプターを発現するが、硫酸ヘパリンの生合
成を欠如する細胞の中で高い親和性の結合性を回復でき
ることが示された。ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）らが示唆する
ように、低い親和性の硫酸ヘパリンプロテオグリカンレ
セプターはｂＦＧＦと結合し、ｂＦＧＦにおいてコンフ
ォメーションの変化を誘発し、こうして、高い親和性の
レセプターに結合することができるｂＦＧＦ「つく
る」。硫酸ヘパリンプロテオグリカンの生合成が損傷さ
れる場合、外因性ヘパリンまたは硫酸ヘパリンはｂＦＧ
Ｆにおいて適切なコンフォメーションの変化を誘発する
ことができる。この「誘発された適合」モデルは、レセ
プターへのｂＦＧＦの提示において硫酸ヘパリンプロテ
オグリカンの役割を強調する。さらに、それが示唆する
ように、ヘパリン結合性タンパク質による硫酸ヘパリン
プロテオグリカンレセプターの占有は、高い親和性のレ
セプターへのｂＦＧＦの結合を抑制することがある。事
実、長い間知られてきているように、ある種のヘパリン
結合性タンパク質は試験管内で脈管形成および内皮細胞
の成長を抑制することができる（ＴａｙｌｏｒおよびＦ
ｏｌｋｍａｎ、１９８２、Ｄａｕｃｈｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８９）。しかしながら、作用のメカニズムは
未知である。

【００１３】より最近、このモデルについての実験的支
持は、アンギオスタティック（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉ
ｃ）活性を表す（ＴａｙｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａｎ、
１９８２）ヘパリン結合性胎盤誘導されたタンパク質Ｐ
Ｆ４（胎盤因子４）が、また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におい
て高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの結合を抑制す
る（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９０）という発見に
より提供された。さらに、ＰＦ４は、また、ウシおよび
ヒトの内皮細胞のｂＦＧＦ誘導移動（Ｓａｔｏｅｔ ａ
ｌ．、Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０）および
ヒト内皮細胞のｂＦＧＦ誘導成長の両者を抑制するが、
他の正常のおよび腫瘍の細胞の成長に影響を与えない
（Ｍａｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０、１９９
１）。しかしながら、最近、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）
らは、ＰＦ４の作用のメカニズムはヘパリンへ結合する
その能力に直接関連することができないことを示す、新
規な証拠を提出した（Ｍａｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ.、１９
９０、１９９１）。このグループの発見によると、両者
がヘパリンに対する親和性を欠如する、組み換えＰＦ４
およびＰＦ４の合成のＣ末端の１３マーの断片は、な
お、生体内で効力のあるアンギオスタティック活性を保
持し、そして突然変異のＰＦ４は試験管内でヒト内皮細
胞の増殖を抑制する（Ｍａｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ.、１９
９０、１９９１）。

【００１４】ヘパリン結合性タンパク質ＨＢＮＦは、成
長因子のＦＧＦおよびＰＦ４の族に構造的に無関係であ
る。しかし自然および組み換えＨＢＮＦタンパク質はベ
イビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞上の高い親和性
の結合部位からｂＦＧＦ置換し、そしてウシおよびヒト
の内皮細胞の成長を特異的に抑制し、これによりＨＢＮ
Ｆタンパク質は細胞成長抑制因子であることを示す。

【００１５】本発明は、ＨＢＮＦを動物、とくに温血動
物に投与することによって、細胞の成長の抑制する方法
に関する。極めて大きい重要性をもつ細胞の抑制の１つ
のタイプは、新しい血管の新生または形成である。病
気、例えば、充実腫瘍、慢性関節リウマチおよび眼の病
気、例えば、網膜症、血管新生緑内障、眼の腫瘍などに
おける血管新生の抑制は人間の医学的処置において重要
であるが、獣医学的処置において、同様によく、使用で
あることがある。病気の状態の処置に加えて、例えば、
バイパスの外科における手術後の出血のコントロール
は、また、本発明の化合物で提供される。さらに、本発
明の使用は細胞をより分化した状態に推進し、これによ
り化学療法的使用を、同様によく、提供する。これは精
製されたタンパク質の直接投与により達成することがで
きるか、あるいはこのタンパク質を産生することができ
るトランスジェニック宿主細胞をこのような処置を必要
とする領域の中に移植することによって、また、達成す
ることができる。自然源および組み換え的に誘導された
ＨＢＮＦは本発明における使用が考えられる。さらに、
ＨＢＮＦの類似体は、アルキル化ＨＢＮＦとしてここに
おける使用のために開示されたカルボキシメチル化され
た形態により見られるように、本発明において有用であ
る。ＨＢＮＦ上に存在する１または２以上のアミノ酸の
位置のアルキル化は、治療学的使用における供給のため
にタンパク質のより安定な配合された形態を提供するこ
とができる。

【００１６】前述の生体内の治療に加えて、本発明の化
合物は応答アッセイ、例えば、内皮アッセイにおいて、
ＦＧＦのアゴニストおよび拮抗因子についてスクリーニ
ングするための試験管内のスクリーニングのメカニズム
を提供することにおいて有用である。

【００１７】こうして、本発明の目的は、動物、とくに
温血動物を脈管形成に関係する病気のために処理する方
法を提供することを包含する。さらに、本発明は、ま
た、動物、再び、とくに温血動物における細胞の成長を
抑制する方法に関する。これは効力のある化学療法の養
生法のために腫瘍の成長をコントロールすることを包含
する。また、本発明において有用なＨＢＮＦ次のものを
包含するが、これらに限定されない：ヒトＨＢＮＦ、ウ
シＨＢＮＦ、ヒツジＨＢＮＦ、イヌＨＢＮＦ、ブタＨＢ
ＮＦ、ネコＨＢＮＦ、ウマＨＢＮＦ、トリＨＢＮＦおよ
びサカナＨＢＮＦ。本発明のこれらおよび他の目的は下
の詳細な説明から明らかになるであろう。次はＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼの発現系におけるＨＢＮＦ遺伝子のクロ
ーニングおよび発現を例示する。しかしながら、このＴ
７ＤＮＡポリメラーゼの発現系は非常に効率よいが、こ
れはＨＢＮＦを組み換え的に産生することができる唯一
の手段ではないことを理解すべきである。ＨＢＮＦの産
生は、ＨＢＮＦ遺伝子を任意の適当な発現ベクターの中
に組み込み、引き続いて適当な宿主細胞をこのベクター
で形質転換することによって達成することができる；あ
るいは、宿主細胞の形質転換はベクターを使用しないで
裸のＤＮＡにより直接達成することができる。真核生物
細胞または原核生物細胞によるＨＢＮＦの産生は本発明
により考えられる。適当な真核生物の細胞の例は、哺乳
動物の細胞、植物の細胞、酵母菌の細胞および昆虫の細
胞を包含する。同様に、適当な原核生物の宿主は、Ｅ．
ｃｏｌｉに加えて枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）を包含する。

【００１８】他の適当な発現ベクターは、また、使用す
ることができ、そして宿主細胞の選択に基づいて選択さ
れる。例えば、バクテリアの細胞の形質転換における使
用に適当な多数のベクターはよく知られている。例え
ば、プラスミドおよびバクテリオファージ、例えば、λ
ファージは、バクテリアの宿主、とくにＥ．ｃｏｌｉの
ための最も普通に使用されているベクターである。哺乳
動物および昆虫の両者の細胞において、ウイルスのベク
ターは外因性ＤＮＡの発現を得るために頻繁に使用され
ている。とくに、哺乳動物の細胞はＳＶ４０またはポリ
オーマウイルスで普通に形質転換される；そして培養に
おける昆虫細胞はバキュロウイルスの発現ベクターで形
質転換される。酵母菌のベクター系は、酵母菌のセント
ロメアのプラスミド、酵母菌のエピソームのプラスミド
および酵母菌の組み込みプラスミドを包含する。

【００１９】また、本発明の実施はＨＢＮＦタンパク質
の正確なアミノ酸配列の使用に限定されないことを理解
すべきである。生ずるタンパク質分子におけるサイレン
トな変化を産生する、ＨＢＮＦタンパク質のＤＮＡ配列
に対する修飾、例えば、欠失、挿入、または配列中の置
換は、また、考えられる。

【００２０】さらに、生物学的に活性なＨＢＮＦ類似体
を生ずるアミノ酸配列における変化は、また、本発明に
おいて有用であると考えられる。例えば、遺伝暗号の同
義性を反映するか、あるいは所定の部位において化学的
に同等のアミノ酸を産生する遺伝子配列中の変更が考え
られる；こうして、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸
のためのコドンは、他の疎水性残基、例えば、グリシン
をエンコードするコドンで容易に置換することができる
か、あるいはより疎水性の残基、例えば、バリン、ロイ
シンまたはイソロイシンで置換することができる。同様
に、１つの陰性に帯電した残基を他のものと置換する、
例えば、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換するか、
あるいは１つの陽性に帯電した残基を他のものと置換す
る、例えば、リジンをアルギニンで置換する変化は、ま
た、生物学的に同等の産生物を産生することが期待され
る。さらに、種の間で保存されるはタンパク質の中央部
分であるので、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部
分の変更を生ずるヌクレオチドの変化は、これらの領域
が通常生物学的活性に関係しないので、タンパク質の活
性をしばしば変更しないであろう。事実、欧州特許（Ｅ
Ｐ）第３２６，０７５号に開示されている「ＨＢＢＭ」
の大きさの変化は、ＨＢＮＦタンパク質のＣ末端の切頭
を包含する。また、悪影響が生物学的活性において観測
されない場合、疎水性アミノ酸の帯電したアミノ酸への
変化は望ましいであろう。提案された修飾の各々ならび
にエンコードされる産生物の生物学的活性の保持の決定
は、この分野における日常的技量の範囲内である。した
がって、句「ＨＢＮＦ」または「ＨＢＮＦタンパク質」
を明細書および請求の範囲において使用するとき、生物
学的に同等のＨＢＮＦタンパク質の産生を生ずる、すべ
てのこのような修飾および変化を包含することを理解す
べである。とくに、本発明は、標準の高いストリンジェ
ンシイのサザンハイブリダイゼーションの条件下のそれ
とのハイブリダイゼーション、例えば、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら、［分子クローニング：実験室のマ
ニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８２］に記載
するもの、を可能とするように十分に二重反復性である
タンパク質を包含する。

【００２１】遺伝子およびその配列の同定は、トランス
ジェニック細胞、例えば、線維芽、単球またはマクロフ
ァージの構成を可能とし、これらはＨＢＮＦ遺伝子の発
現を可能とするように操作することができ、そして前述
の病気の処置のための移植片として使用することができ
る。

【００２２】そのうえ、ＨＢＮＦの治療学的使用は人間
単独の処置に限定されない。事実、顕著に関係する種の
間にこのタンパク質が保存されている性質にかんがみ
て、任意の形態のＨＢＮＦの投与は獣医学的応用のため
に同様によく有益であろう。治療学的組成物は、所望の
生物学的活性の誘発に有効量のＨＢＮＦ、および製剤学
的に許容されうる液体または固体の担体からなる。ある
いは、この組成物は、末梢および中枢神経系の修復また
は分化の処置のための移植片として、ＨＢＮＦを試験管
内で発現することができる、適合性のトランスジェニッ
ク細胞の製剤学的に許容されうる集合体からなる。

【００２３】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００２４】

【実施例】実施例１ ＨＢＮＦタンパク質の精製、クローニングおよび 発現およびアミノ酸配列の分析 ＨＢＮＦタンパク質を、ウシ脳から、欧州特許（ＥＰ）
第３２６，０７５号、その全体を引用によってここに加
える、に従来記載されているように、ヘパリン−セファ
ロース親和カルボキシメチル化ＨＢＮＦおよびモノ−Ｓ
カチオン交換クロマトグラフィーにより分離する。簡単
に述べると、逆相ＨＰＬＣ精製したＨＢＮＦを、メルカ
プトエタノール中の還元反応および従来記載されている
手順（Ｇａｕｔｓｈｉ−Ｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．、１９
８６）に従いシステイン残基をヨード−（２−１４Ｃ）
−酢酸でアルキル化することによって、化学的に修飾す
る。カルボキシメチル化タンパク質を、ブラウンリー・
アクアポア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ）Ｃ
８カラム（２５×０．４６ｃｍ、７μｍの粒子サイズ、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する逆
相ＨＰＬＣにより、移動相として、アセトニトリル勾配
中の０．１％のトリフルオロ酢酸を使用して、精製す
る。２ナノモルのカルボキシメチル化ＨＢＮＦに相当す
るアリコートを、酵素消化緩衝液で希釈して、試料のア
セトニトリル濃度をほぼ１０％に減少し、そして次のプ
ロテアーゼで消化する：黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８（グルタミン酸
残基後の切断）、Ａｒｇ−Ｃ（アルギニン後の切断）、
Ａｓｐ−Ｎ（アスパラギン酸前の切断）およびキモトリ
プシン（芳香族残基後の優先的切断）。酵素はベーリン
ガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）からのものであり、そして切断反応は製造業者
により本質的に示唆されるように実施する。消化後、ペ
プチドはＣ８カラムの逆相ＨＰＬＣによりペプチドの溶
離のために０．１％のトリフルオロ酢酸中のアセトニト
リルの９０分の直線の勾配（開始におけるアセトニトリ
ル含量：１２〜１６％、終わりにおいて：３０〜４４
％、消化のタイプに依存する）を使用して分割する。精
製されたペプチドの相同性を確認するために、ペプチド
物質を含有する分画を第２逆相ＨＰＬＣの工程（Ｃ８カ
ラム、適当な浅い勾配の０．１％のヘプタ酪酸）にかけ
る。分離されたペプチドの５〜５００ピコモルのアリコ
ートを、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７７Ａ気体／液相マイク
ロ配列決定装置で配列決定する。フェニルチオヒダント
イン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体を１２０Ａ型オンライン
ＰＴＨアミノ酸分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）で同定する。両者の手順についての実験の
プロトコルは、計器の製造業者により供給されたもので
ある。

【００２５】ウシＨＢＮＦアミノ酸配列を使用して、Ｐ
ＣＲ増幅反応のための同義性をもつオリゴヌクレオチド
を設計する。完全に同義性をもつセンスプライマーを次
のアミノ酸配列にする：Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位
で開始しそして次のＤＮＡ配列から構成されている：
５’−ＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＰｙＴＧＰｙＧＧＮＧＡＰ
ｕＴＧＧＣＡＰｕＴＧＧ−３’。完全に同義性をもつア
ンチセンスプライマーを次のアミノ酸配列にする：Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈ
ｒ、ＥｃｏＲＩで開始しそして次のＤＮＡ配列から構成
されている：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＰｙＴＴＰｙ
ＴＧＰｕＣＡＰｕＴＣＮＧＣＰｕＴＴ−３’。

【００２６】完全なラットの脳のＲＮＡを、スプレイク
−ダウレイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットか
ら、グアジニウムイソチオシアネート−塩化セシウム法
により分離し、そしてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを２サイクル
のオリゴ（ｄＴ）−セルロースへの結合により選択する
（ＡｖｉｖおよびＬｅｄｒ、１９７２）。ラット脳のポ
リ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）およびＡＭＶ逆転写
酵素で逆転写する（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、
１９８２）。ＰＣＲ反応は相補的ＤＮＡ鋳型上で、３０
サイクルで、５０℃において１分のアニーリング、７２
℃において２分の伸長および９４℃において１分の変性
で、ｔａｑポリメラーゼ（ＵＳＢ）を使用して３０サイ
クルの間実施する。

【００２７】２８２塩基対のラットＨＢＮＦのＰＣＲ産
生物はブルー・スクライブ（Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ
（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ）の中にクローニ
ングし、そして新生児のヒト脳幹および基底神経節λｇ
ｔ１１ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて
プローブとして使用する。３０のＨＨＣクローンを最初
に同定し、そして予備的制限分析後、４つのクローンを
分離し、ブルー・スクライブ（Ｂｌｕｅ Ｓｃｒｉｂｅ
（＋）のＥｃｏＲＩ部位中でサブクローニングし、そし
てジデオキシヌクレオチド連鎖停止法により配列決定す
る（Ｓａｎｇｅｒｅｔ ａｌ．、１９８８）。

【００２８】クローンの３つは解読領域の中に同一の配
列を有し、そして第４クローンは３ヌクレオチドのイン
フレームの欠失を有し、位置１１９にアラニンの除去を
生ずる。

【００２９】クローンＨＨＣ８を、メチオニンのコドン
およびＮｄｅＩ制限部位をＮ末端のグリシンに対して直
ぐ５’に配置するように設計したプライマーを使用する
ＰＣＲ増幅のための鋳型として選択する。精製したＰＣ
Ｒ産生物を、発現ベクターｐＥＴ−３ａの誘導体の中に
クローニングし、これを１４００ｂｐのＳａｌｌ／Ｐｖ
ｕＩＩ断片の欠失および複製のｆ１起源のＥｃｏＲＩ部
位の中への挿入により修飾する。インサートを配列決定
してＰＣＲ増幅の信頼性を確証した後、プラスミド（名
称ｐＥＴＨＨ８）を菌株ＢＬ２１ ＬｙｓＳの中に形質
転換し、そして記載されているようにＩＰＴＧでタンパ
ク質の産生を誘発する。１ｍｌの培養物からの沈澱物を
１００μｌのＳＤＳｂＦＧＦ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７
０）の中に再懸濁させ、そして２．５μｌを１５アクリ
ルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開する。ゲルをク
ーマッシーブルーで染色する。自然ＨＢＮＦをラットの
脳から精製し、そして組み換えＨＢＮＦをバクテリアの
抽出液からヘパリンのセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）制限で１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０中
の精製し、そして１〜１．１３ＭのＮａＣｌで溶離す
る。それ以上の精製は、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）カラムで５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ６．８中で、溶離のために、０から１ＭのＮａＣｌに
増加する塩濃度の勾配を使用して達成する。

【００３０】ＨＢＮＦ遺伝子の発現をマウスの組織中で
研究する。完全な細胞のＲＮＡをグアニジウムイソチオ
シアネート−塩化セシウム方法により分離し、０．６６
Ｍのホルムアルデヒドを含有する１％のアガロースゲル
で分析し、そしてランダムオリゴヌクレオチドのプライ
ミングにより調製した³²Ｐ標識したｃＤＮＡプローブを
もつナイロン膜フィルターのホルムアミド上にブロッテ
ィングする。フィルターを６５℃において１×ＳＳＣ
（０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウ
ムｐＨ７．０）、０．２％のＳＤＳ中で洗浄し、そして
Ｘ線フィルムに露出する。ヒトＨＢＮＦのｃＤＮＡを使
用する種々の組織からのマウスＲＮＡのノザンハイブリ
ダイゼーション分析は、脳のみが１６５０のヌクレオチ
ドのメッセージを発現したことを示す。全体のヒトＲＮ
Ａの分析は、ヒトｍＲＮＡがほぼ１６００ヌクレオチド
の長さであり、マウスのそれよりわずかに短いことを示
す。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１ｌｙｓＳは、プラスミド
ｐＥＴＨＨ８を収容し、アメリカン・サイアナミド・カ
ンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍ
ｐａｎｙ、ニューヨーク州パールリバー）の菌株保存機
関およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マリイランド州ロックビ
レ、パークローンドライブ１２３０１）に、それぞれ、
１９９０年８月１３日に受け入れ番号ＡＴＣＣ６８３８
５で受託され、そして米国および他の国々における特許
のための適当な法的基準に従い公衆に入手可能である。

【００３１】実施例２ 他のタンパク質 ヒト、血小板誘導ＰＦ４をシグマ（Ｓｉｇｍａ、セント
ルイス）から購入する。野生型の活性および効能をもつ
組み換えｂＦＧＦおよび類似体を文献に記載されている
ように発現および精製する（Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９１）。¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦ（１，０００Ｃｉ
／ミリモル）をアマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から
購入する。

【００３２】実施例３ カルボキシメチル化ＨＢＮＦ カルボキシメチル化ＨＢＮＦは次のようにして調製す
る：凍結乾燥した組み換えＨＢＮＦを、２ｍＭのＥＤＴ
Ａおよび４．５ＭのグアニジウムＨＣｌを含有する０．
１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．６中に０．５ｍｇ／ｍｌ
の濃度に溶解する。タンパク質をジチオスレイトール
（５ｍＭ）で還元し、そしてこの溶液をアルゴン雰囲気
下に３７℃において１時間インキュベーションする。還
元されたタンパク質溶液を室温に冷却し、そしてヨード
酢酸（１５ｍＭ）を使用して暗所で１時間アルキル化す
る。カルボキシメチル化されたタンパク質を２００ｍＭ
のＮａＣｌを含有する１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．２に対して４℃において一夜透析する（３５０００
分子量のカットオフ）。カルボキシメチルシステインお
よびタンパク質の濃度は、ＨＣｌ気相加水分解（５．７
ＭのＨＣｌ／０．１％のフェノール；２４時間、１００
℃）後、オンライン１３０Ａ型分離系を装備した４２０
Ａ型ＰＩＴＣ誘導装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、カリフォルニア州）を使用して、アミノ酸分
析により決定する。カルボキシメチル化ＨＢＮＦをヘパ
リン−セファロースから０．９ＭのＮａＣｌで溶離され
るが、自然ＨＢＮＦは１．１ＭのＮａＣｌで溶離され
る。

【００３３】実施例４ 細胞系 ＢＨＫ細胞を７．５％の胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）
を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）
（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中で成長させ
る。ヒト包皮線維芽（ＨＦＳＦ）およびヒト黒色腫細胞
系、エイシンガー（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ）博士（Ｌｅｄｅ
ｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州パ
ールリバー）からのギフト、を、５．０％の胎児仔ウシ
血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉ
ａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中で成長させる。ウシＡ
ＢＡＥを１０％子ウシ血清（Ｈｙ Ｃｌｏｎｅ）を補充
したＤＭＥＭ中で成長させる。ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶ
Ｅ）細胞（継代培養１）、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）博
士（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｅｄｉ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）か
らのギフト、を、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）（１９８
４）が記載するように、４％の血清（Ｇｉｂｃｏ）およ
び１６％の胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充した培
地１９９（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中の
成長させる。

【００３４】実施例５ ラジオレセプターのアッセイ ＢＨＫ細胞上の高い親和性のレセプターへの¹²⁵Ｉ−ｂ
ＦＧＦの結合をモスカテリ（ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）
（１９８７）に従い実施する。簡単に述べると、細胞を
５０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦおよび種々の添加物と室温
において１時間インキュベーションし、次いで４℃にお
いて３０分間インキュベーションする。細胞の高い塩
（２Ｍ）の洗浄は低い親和性の部位からｂＦＧＦを解放
するが、０．５％のトリトンＸ１００による細胞の処理
は高い親和性の部位からｂＦＧＦから解放する。このア
ッセイは置換実施例により確認し、ここで増加する濃度
の非放射性ｂＦＧＦをインキュベーション混合物に添加
する。非放射性ｂＦＧＦは投与量に依存する方法で５０
ｐＭのＥＤ₅₀でトリトンＸ１００により解放される放射
能の量を減少する。結合アッセイは二重反復実験で実施
する。

【００３５】実施例６ ミトゲンのアッセイ ミトゲンのアッセイはフェイフェウル（Ｆａｆｅｕｒ）
ら（１９９０）に従い実施する。簡単に述べると、ウシ
ＡＢＡＥ細胞をマルチ−ウェルの皿の中に１ｎｇ／ｍｌ
のｂＦＧＦを使用してあるいは使用しないで８，０００
細胞／ウェルで４時間プレイティングし、次いで増加す
る濃度のヘパリン結合性タンパク質を添加する。１ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦの存在下に、ＡＢＡＥ細胞の数はｂＦ
ＧＦの不存在下より３〜４倍高い。ＨＵＶＥ細胞をゼラ
チンでコーティングした２４ウェルのプレートの中に
８，０００細胞／ウェルで接種し、そして接種後１６時
間に化合物を添加する。４日後、細胞を剥離し、そして
計数する。ミトゲンのアッセイは二重反復実験で実施す
る。

【００３６】実施例７ 神経突起の成長のアッセイ 生後１８日の胎児ラットからの脳を無菌条件下に取り出
し、そして１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で無菌
の５ｍｌの注射器を使用して単細胞に分散させる。細胞
懸濁液を５×１０⁵細胞／ｍｌに調節し、そして５０μ
ｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンで室温において３０分間予
備コーティングした組織培養皿上に配置する（Ｒａｕｖ
ａｌａおよびＰｉｈｌａｓｋａｒｉ、１９８７）。培養
物を１０％のＣＯ₂中で３７℃において２４時間インキ
ュベーションし、次いで培地を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを
含有するＤＭＥＭと交換し、そしてＨＢＮＦまたはＨＢ
ＮＦタンパク質を示した濃度で添加する。さらに１日間
インキュベーションした後、神経突起の成長活性を、細
胞の視的により、対照に比較して拡大した成長／プロセ
スについて決定した。

【００３７】実施例８ ヒトＮＴ２／Ｄ１細胞の成長およびレチン酸の誘発 ヒト胚癌細胞系Ｎｔ２／Ｄ１を成長させる。レチン酸の
誘発のために、細胞を１０％のウシ子ウシ血清を含有す
るＤＭＥＭ培地中で成長および再懸濁させ、そして１０
％のウシ子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で５
×１０⁵細胞／１００ｍｍの皿の密度の中に再懸濁させ
る。ジメチルスルホキシド（１０μｌ）中の変化する濃
度のすべてのトランスレチン酸を添加し、そして細胞を
９日間インキュベーションする。新鮮な培地およびＲＡ
を第４日および８日に添加する。プレートをリン酸塩緩
衝液で１回洗浄し、そしてＲＮＡを前述したように抽出
する。図８は変化するレベルのレチン酸濃度に対して応
答するとき産生されたＨＢＮＦおよびＭＫの両者のレベ
ルのグラフの表示を示す。ＲＡで誘発したＮＴ２／Ｄ１
細胞はニューロンの分化の研究のためのモデルの系を提
供することが示唆されてきているので、この系における
ＨＢＮＦおよびＭＫ遺伝子の誘発の増加はニューロンの
細胞の発育における可能な役割を示す。

【００３８】実施例９ アッセイおよび結合の研究の結果 ＢＨＫ細胞の高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの結
合に対するＨＢＮＦの作用は、ＨＢＮＦがｂＦＧＦの結
合を０．１μＭのＥＤ₅₀で抑制することを示す（図
１）。ＨＢＮＦのこの抑制活性は、タンパク質の１０シ
ステイン残基のカルボキシメチル化により破壊される
（図１）。この処理は多分ＨＢＮＦの適切なフォルディ
ングを妨害し、そしてヘパリン−セファロースに対する
ＨＢＮＦの親和性をわずかに減少する。

【００３９】ＢＨＫ上の高い親和性の部位へのｂＦＧＦ
の結合は、また、ヒト血小板因子ＰＦ４、他のヘパリン
結合性タンパク質とくに抑制される。ＨＢＮＦに似て、
ＰＦ４は投与量に依存する方法で０．２５μＭのＥＤ₅₀
でｂＦＧＦの結合を抑制する。この値はＮＩＨ３Ｔ３細
胞を使用する同様な実験（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、１
９９０）において得られたデータから推定されるものと
同一である。

【００４０】次に、ウシ内皮ＡＢＡＥ細胞の基底および
ｂＦＧＦ刺激成長へのＨＢＮＦの作用をアッセイする。
ＨＢＮＦは投与量に依存する方法で同様なＥＤ₅₀でＡＢ
ＡＥ細胞の基底およびｂＦＧＦ刺激の成長を抑制する
（図２）。高い濃度のＨＢＮＦ（０．２μＭ以上）はＡ
ＢＡＥ細胞の成長を完全に抑制するばかりでなく、かつ
またプレートからのＡＢＡＥ細胞の可視の脱離を引き起
こす（図２、３パネルＡおよびＢ）。

【００４１】カルボキシメチル化ＨＢＮＦは、ＢＨＫ細
胞のレセプターからｂＦＧＦ置換しないという事実（参
照、図１）に照らしてさせ、ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制
する（図４）。カルボキシメチル化ＨＢＮＦについての
ＥＤ₅₀はＨＢＮＦについてより２〜３倍高い。

【００４２】ＨＢＮＦは、また、１ｎｇ／ｍｌおよび１
０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ濃度でヒト一次内皮細胞（ＨＵ
ＶＥ細胞）のｂＦＧＦ刺激成長を抑制する（図５）。Ｈ
ＵＶＥ細胞のｂＦＧＦ刺激成長は、投与量に依存する方
法で両者のｂＦＧＦの濃度において同様なＥＤ₅₀値でＨ
ＢＮＦにより抑制される。しかしながら、高い濃度
（０．２μＭ以上）のＨＢＮＦは、１ｎｇ／ｍｌのｂＦ
ＧＦにおけるより１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにおいて、
より低い程度にＨＵＶＥ細胞の成長を抑制する（図
５）。ウシＡＢＡＥ細胞と異なり、ヒトＨＢＮＦ細胞は
カルボキシメチル化ＨＢＮＦにより抑制されない（図
５）。

【００４３】ＨＢＮＦの抗増殖活性は、ハムスターＢＨ
Ｋ細胞およびラットＰＣ１２細胞で観測されない。これ
らのタンパク質は、また、２つの非内皮ヒト細胞系の成
長に影響を与えない：正常ヒト包皮線維芽（ＨＦＳＦ）
および高度に悪性の骨髄腫細胞系。両者の細胞系では、
０．６５μＭ（１０μｇ／ｍｌ）のＨＢＮＦはｂＦＧＦ
独立の細胞の成長に影響を与えない（ヒト包皮線維芽の
ためのデータは図６に示されている）。培地中の１０ｎ
ｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在は、線維芽の数の小さいが、
有意の増加を生ずる（が、骨髄腫細胞では生じない）。
このｂＦＧＦ依存性作用は０．６５μＭのＨＢＮＦの存
在によりに影響を受けない（図６）。

【００４４】いかなる理論にも拘束されたくないが、前
述のことを述べることができる。

【００４５】ＨＢＮＦ、ｂＦＧＦ、およびＰＦ４は異な
るタンパク質の族に属し、こうして高い親和性のｂＦＧ
Ｆのレセプターへの結合についての直接の競争は起こら
ないように思われる。しかしながら、ＨＢＮＦ、ならび
にＰＦ４は低い親和性のｂＦＧＦレセプターの硫酸ヘパ
リン部分に対する結合についてｂＦＧＦと競争すること
ができる。前述したように、最近の発見は、低い親和性
のレセプターへのｂＦＧＦの結合が高い親和性のレセプ
ターに結合することができるｂＦＧＦの「誘発された適
合」のコンフォメーションの発生に必要であることを示
す（Ｙａｙｏｎｅｔ ａｌ．、１９９１）。機能の研究
は、また、低い親和性のレセプターがｂＦＧＦ刺激され
た線維芽の成長および筋芽細胞の分化に必要であること
を示す（Ｒａｐｒａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９
１）。こうして、上の提案するモデルに従い、ＨＢＮＦ
およびＰＦ４による低い親和性のレセプターの占有は高
い親和性のレセプターに結合することができるｂＦＧＦ
分子の番号を減少することが期待される。

【００４６】細胞の硫酸ヘパリンプロテオグリカンに対
するＨＢＮＦの親和性は知られていない。ウシ内皮細胞
の硫酸ヘパリンプロテオグリカンに対するヒトＰＦ４の
親和性は最近特性決定された（Ｋｄ＝２．８７μＭ、Ｒ
ｙｂａｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。ＨＢＮＦおよび
ＰＦ４は硫酸ヘパリンに対して同様な親和性を有する場
合、サブマイクロモルのこれらのタンパク質がｂＦＧＦ
のための低い親和性のレセプターを飽和するマイクロモ
ルを期待することができる。ＥＤ₅₀により判定して、組
み換えＨＢＮＦが、高い親和性のＢＨＫ細胞のレセプタ
ーへのｂＦＧＦの結合の抑制において、ヒト血小板誘導
ＰＦ４より２．５倍多い効力を有することは注目に値す
る。

【００４７】そのうえ、ヒト内皮細胞についてのミトゲ
ンのアッセイにおいて得られたＥＤ₅₀を組み換えＰＦ４
（Ｍａｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９０）および組み
換えＨＢＮＦと比較すると、実証されるように、後者の
タンパク質は５〜１０倍多い効力を有する。この差は高
い濃度におけるいくつかのヘパリン結合性タンパク質の
細胞毒性にかんがみると重要であることがある（Ｄａｕ
ｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。

【００４８】ウシＡＢＡＥ細胞を使用して得られた結果
が示すように、高い濃度のＨＢＮＦ（０．２μＭ）は細
胞の成長を抑制するが、細胞の脱離を引き起こさない。
この脱離がＨＢＮＦにより引き起こされるか、あるいは
ＨＢＮＦの細胞毒性の結果であるかどうかは明らかでは
ない。ヒトＨＵＶＥ細胞を使用する実験が示すように、
高い濃度のＨＢＮＦを使用して観測される作用はｂＦＧ
Ｆの濃度を増加することによって消すことができる。Ｈ
ＢＮＦは内皮細胞に影響を与えるばかりでなく、かつま
たヒト線維芽、ヒト骨髄腫、ラットＰＣ１２およびハム
スターＢＨＫ細胞に影響を与えるように思われる。

【００４９】これらの発見にかんがみて、抑制の追加の
「細胞仲介」メカニズムは内皮細胞に対して向けられた
ヘパリン結合性タンパク質の抗増殖活性に関係すること
を示唆される。なぜならＨＢＮＦの抑制作用はＨＢＮＦ
の異なる濃度において同様なＥＤ₅₀を有し、レセプター
に対する直接の競争は唯一の因子でないことを示唆する
からである。

【００５０】同様に、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）ら（１
９９１）が発見したように、ＰＦ４の組み換え突然変異
体はヘパリンに対する親和性を欠如するが、それは生体
内において効力のあるアンギオスタティック活性（ａｎ
ｇｉｏｓｔａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）をなお保持
し、これにより、また、抑制の種々の「細胞仲介」メカ
ニズムを示唆する。

【００５１】引用文献 １、バイアード（Ｂａｉｒｄ）、Ａ．およびボーレン
（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．（１９９０）線維芽の成長因
子。ペプチドの成長因子およびそれらのレセプター１。
［スポーン（Ｓｐｏｒｎ）、Ｍ．Ｂ．およびロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ａ．Ｂ．編］ｐｐ．３６９−４１
８。スプリング−フェルラーグ、ベルリン、ハイデルベ
ルグ。

【００５２】２、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．（１９８７）、ジャーナル・オブ・セルラー
・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１
３１：１２３−１３０。

【００５３】３、ルタ（Ｒｕｔａ）、Ｍ．、ホウク（Ｈ
ｏｗｋ）、Ｒ．、リッカ（Ｒｉｃｃａ）、Ｇ．、ドロハ
ン（Ｄｒｏｈａｎ）、Ｗ．、ザベルシャンスキー（Ｚａ
ｂｅｌｓｈａｎｓｋｙ）、Ｍ．、ラウレイス（Ｌａｕｒ
ｅｙｓ）、Ｇ．、バートン（Ｂａｒｔｏｎ）、Ｄ．
Ｅ．、フランケ（Ｆｒａｎｃｋｅ）、Ｕ．、シュレッシ
ンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ．およびギボ
ル（Ｇｉｖｏｌ）、Ｄ．（１９８８）オンコジーン（Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ）３：９−１５。

【００５４】４、クーグリン（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ）、
Ｓ．Ｒ．、バール（Ｂａｒｒ）、Ｐ．Ｇ．、クウセンス
（Ｃｏｕｓｅｎｓ）、Ｌ．Ｓ．、フレット（Ｆｒｅｔｔ
ｏ）、Ｌ．Ｊ．およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ）、Ｐ．Ｔ．（１９８８）生体内のキナーゼ活性。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６３：９２８−９３３。

【００５５】５、コルンブルッス（Ｋｏｒｎｂｌｕｔ
ｈ）、Ｓ．、パウルソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）、Ｋ．Ｓ．
およびハナフサ（Ｈａｎａｆｕｓａ）、Ｈ．（１９８
８）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、８：５５４１−５
５４４。

【００５６】６、リー（Ｌｅｅ）、Ｐ．Ｌ．、ジョンソ
ン（Ｊｏｎｓｏｎ）、Ｄ．Ｅ．、クウセンス（Ｃｏｕｓ
ｅｎｓ）、Ｌ．Ｓ．、フライド（Ｆｒｉｅｄ）、Ｖ．
Ａ．およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、Ｌ．
Ｔ．（１９８９）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４
５：５７−６０。

【００５７】７、パスクアレ（Ｐａｓｑｕａｌｅ）、
Ｅ．Ｂ．およびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、Ｓ．Ｊ．
（１９８９）プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８：５４４９−５４
５３。

【００５８】８、サフラン（Ｓａｆｒａｎ）、Ａ．、ア
ビビ（Ａｖｉｖｉ）、Ａ．、オル−ウルテレゲル（Ｏｒ
ｒ−Ｕｒｔｅｒｅｇｅ）、Ａ．、ネウフェルド（Ｎｅｕ
ｆｅｌｄ）、Ｇ．、ロナイ（Ｌｏｎａｉ）、Ｐ．、ギボ
ル（Ｇｉｖｏｌ）、Ｄ．およびヤーデン（Ｙａｒｄｅ
ｎ）、Ｙ．（１９９０）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ）５：６３５−６４３。

【００５９】９、キーフェル（Ｋｉｅｆｅｒ）、Ｍ．
Ｃ．、ステファンス（Ｓｔｅｐｈａｎｓ）、Ｊ．Ｃ、ク
ラウフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、Ｋ．、オキノ（Ｏ
ｋｉｎｏ）、Ｋ．およびバール（Ｂａｒｒ）、Ｐ．Ｊ．
（１９９０）プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８７：６９８５−６
９８９。

【００６０】１０、ヴロダヴスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋ
ｙ）、Ｉ．、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｊ．、
スリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）、Ｒ．、フレイドマ（Ｆ
ｒｅｉｄｍａｎ）、イシャイ−ミカエリ（Ｉｓｈａｉ−
Ｍｉｃｈａｅｌｉ）、Ｒ．、サッセ（Ｓａｓｓｅ）およ
びクルグスブルン（Ｋｌｕｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．（１９
８７）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：２２９２−２２９６。

【００６１】１１、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バク
テリオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、１０７：
７５３−７５９。

【００６２】１２、バシュキン（Ｂａｓｈｋｉｎ）、
Ｐ．、ドクトロウ（Ｄｏｃｔｒｏｗ）、Ｓ．、スバーン
（Ｓｖａｈｎ）、Ｃ．Ｍ．、フォークマン（Ｆｏｌｋｍ
ａｎ）、Ｊ．およびブロダブスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋ
ｙ）、Ｉ．（１９８９）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８、１７３７−１７４３。

【００６３】１３、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、
Ｊ．、クラグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．、
サッセ（Ｓａｓｓｅ）、Ｊ．、ワドジンスキー（Ｗａｄ
ｚｉｎｓｋｉ）、Ｍ．、イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ）、
Ｄ．およびブロダブスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ）、
Ｉ．（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バクテリオ
ロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、ジャーナル・オ
ブ・パソロジー（Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１３０：３９３
−４００。

【００６４】１４、ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）、Ａ．、クラ
グスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．、エスコ（Ｅ
ｓｋｏ）、Ｊ．Ｄ．、レダー（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐ．およ
びオルニツ（Ｏｒｎｉｔｚ）、Ｄ．Ｍ．（１９９１）細
胞（Ｃｅｌｌ）、６４：８４１−８４８。

【００６５】１５、タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｓ．お
よびフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｌ．（１９８
２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９７：３０７−３１
２。

【００６６】１６、サトウ（Ｓａｔｏ）、Ｙ．、アベ
（Ａｂｅ）およびタカキ（Ｔａｋａｋｉ）、Ｒ．（１９
９０）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１７２：５９５−６０
０。

【００６７】１７、シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．
Ｊ．、バイアー（Ｂｙｅｒｓ）、Ｈ．Ｒ．、スコット
（Ｓｃｏｔｔ）、Ｃ．Ｆ．、バウエル（Ｂａｕｅｒ）、
Ｓ．Ｉ．およびマイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．Ｅ．
（１９９０）ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサ
ー・インスチチュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．）８２：８４８−８５３。

【００６８】１８、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．、グレイ（Ｇｒａｙ）、Ｇ．Ｓ．、ペトロ（Ｐｅｔ
ｒｏ）、Ｊ．、ハント（Ｈｕｎｔ）、Ａ．Ｔ．、ドナー
（Ｄｏｎｎｅｒ）、Ａ．Ｌ．、バウエル（Ｂａｕｅ
ｒ）、Ｓ．Ｉ．、カーソン（Ｃａｒｓｏｎ）、Ｈ．Ｆ．
およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．Ｇ．（１９９
０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシントンＤＣ）
２４７：７７−７９。

【００６９】１９、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．、グレイ（Ｇｒａｙ）、Ｇ．Ｓ．、ハント（Ｈｕｎ
ｔ）、Ａ．Ｌ．およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．
Ｊ．（１９９１）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）５１：２０７７−２０８３。

【００７０】２０、クレトシュマー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍ
ｅｒ）、Ｐ．Ｊ．、ファイアハースト（Ｆａｉｒｈｕｒ
ｓｔ）、Ｊ．Ｌ．、デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、Ｍ．
Ｍ．、チャン（Ｃｈａｎ）、Ｃ．Ｐ．、グルズマン（Ｇ
ｌｕｚａｍａｎ）、Ｙ．、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、
Ｐ．およびコベスジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ）、Ｉ．（１９９
１）成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）５：９
９−１１４。

【００７１】２１、フェイファー（Ｆａｆｅｕｒ）、
Ｖ．、ターマン（Ｔｅｒｍａｎ）、Ｂ．Ｉ．、ブラム
（Ｂｌｕｍ）、Ｊ．およびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、
Ｐ．（１９９０）成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒｓ）３：２３７−２４５。

【００７２】２２、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）、Ｅ．
Ａ．（１９８４）内皮細胞の生物学における大きい血管
の内皮細胞の培養および同定（Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｒｇｅ ｖ
ｅｓｓｌ ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ Ｃ
ｅｌｌｓ）［ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）、Ｊ．Ａ．
編］、Ｍａｒｔｉｎｕｓ−Ｎｉｊｈｏｆｆ、ニューヨー
ク。

【００７３】２３、ゴスポドロウィクズ（Ｇｏｓｐｏｄ
ａｒｏｗｉｃｚ）、Ａ．、チェング（Ｃｈｅｎｇ）、
Ｊ．、ルイ（Ｌｕｉ）、Ｇ．Ｍ．、Ｄ．、バイルド（Ｂ
ａｉｒｄ）およびＰ．ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）（１９
８４）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８１：６９６３−６９６７。

【００７４】２４、モソカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｍ．、ジョセ
フ−シルベルステイン（Ｊｏｓｅｐｈ−Ｓｉｌｖｅｒｓ
ｔｅｉｎ）、Ｊ．およびリフキン（Ｒｉｆｋｉｎ）、
Ｄ．Ｂ．（１９８６）ジャーナル・オブ・セルラー・バ
イオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１２
９：２７３−２７６。

【００７５】２５、ハンナン（Ｈａｎｎａｎ）、Ｒ．
Ｌ．、コウレンバナス（Ｋｏｕｒｅｍｂａｎａｓ）、
Ｓ．、フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）、Ｋ．Ｃ．、
ロゲルジ（Ｒｏｇｅｌｊ）、Ｍ．（１９８７）成長因子
（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）１：７−１７。

【００７６】２６、サトウ（Ｓａｔｏ）、Ｙ．およびリ
フキン（Ｒｉｆｋｉｎ）、Ｄ．Ｂ．（１９８８）ジャー
ナル・オブ・セル・バクテリオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．）、１０７：１１９９−１２０５。

【００７７】２７、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．Ｊ．（１９
９０）ＴＩＢＳ１１：４５７−４６１。

【００７８】２８、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、
Ｊ．およびクラスグブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、
Ｍ．（１９８７）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシ
ントンＤＣ）２３５：４４２−４４７。

【００７９】２９、セッドン（Ｓｅｄｄｏｎ）、Ａ．、
デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ）、
Ｔ．、アーメリノ（Ａｒｍｅｌｌｉｎｏ）、Ｄ．、コベ
スジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ）、Ｉ．、グルズマン（Ｇｌｕｚ
ｍａｎ）、Ｙ．およびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．
（１９９１）アナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミ
イ・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）（印刷中）。

【００８０】３０、ダウチェル（Ｄａｕｃｈｅｌ）、
Ｍ．Ｃ．、コーティ（Ｃｏｕｒｔｙ）、Ｊ．、メレアウ
（Ｍｅｒｅａｕ）、Ａ．およびバリタウルト（Ｂａｒｒ
ｉｔａｕｌｔ）、Ｄ．（１９８９）ジャーナル・オブ・
セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．）３９：４１１−４２０。

【００８１】３１、ラプレガー（Ｒａｐｒａｅｇｅ
ｒ）、Ａ．Ｃ．、クルフカ（Ｋｒｕｆｋａ）、Ａ．およ
びオルウィン（Ｏｌｗｉｎ）、Ｂ．Ｂ．（１９９１）サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシンタンＣＤ）２５
２：１７０５−１７０８。

【００８２】３２、リバク（Ｒｙｂａｋ）、Ｍ．Ｅ．、
ギムロン（Ｇｉｍｒｏｎｅ）、Ｊｒ．、Ｍ．Ａ．、デイ
ビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）、Ｐ．Ｆ．およびハンジン（Ｈ
ａｎｄｉｎ）、Ｒ．Ｉ．（１９８９）ブラッド（Ｂｌｏ
ｏｄ）、７３：１５３４−１５３９。

【００８３】３３、ワナカ（Ｗａｎａｋａ）、Ａ．、ミ
ルブラント（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ）、Ｊ．およびジョン
ソン（Ｊｏｈｓｏｎ）、Ｅ．Ｍ．（１９９１）ディブロ
プメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１１１：４５５−
４６８。

【００８４】３４、ゴスポダロウィクズ（Ｇｏｓｐｏｄ
ａｒｏｗｉｃｚ）、Ｄ．（１９７５）バイオロジカル・
ケミストリー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）２５０：２５１５−２５２０、１９７５。

【００８５】３５、レイボロチ（Ｌｅｉｂｒｏｃｈ）ら
（１９８９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４１：１４
９−１５３。

【００８６】３６、マイソンピエレ（Ｍａｉｓｏｎｐｉ
ｅｒｒｅ）ら（１９９０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２４７：１４４６。

【００８７】３７、リン（Ｌｉｎ）ら（１９８０）サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４６：１０２３−１０２
５。

【００８８】３８、ミル（Ｍｉｌｌ）ら（１９８５）Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ ８２：７１２６−７１３０。

【００８９】３９、シュバート（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）ら
（１９９０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４４：８６
８−８７０。

【００９０】４０、バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら（１９
８７）細胞（Ｃｅｌｌ）５１：１３５−１４２。

【００９１】４１、ボーレン（ｂｏｈｌｅｎ）ら（１９
８４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：５３６４−５３６８。

【００９２】４２、エシュ（Ｅｓｃｈ）ら（１９８５）
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：６５０７−６５１１。

【００９３】４３、ボーレン（ｂｏｈｌｅｎ）ら（１９
８５）Ｅｍｂｏ Ｊ．４：１９５１−１９５６。

【００９４】４４、ギメンズ（Ｇｉｍｅｎｅｚ）−ガレ
ゴ（Ｇａｌｌｅｇｏ）ら（１９８５）サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２３０：１３８５−１２８８。

【００９５】４５、ディケンス（Ｄｉｃｋｅｎｓ）およ
びペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）（１９８４）ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３２６：８３３。

【００９６】４６、デリ・ボビ（Ｄｅｌｌｉ Ｂｏｖ
ｉ）ら（１９８７）細胞（Ｃｅｌｌ）５０：７２９−７
３７。

【００９７】４７、ザーン（Ｚｈａｎ）ら（１９８８）
セル・バイオロジー（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）８：
３４８７−３４９５。

【００９８】４８、マリクス（Ｍａｒｉｃｓ）ら（１９
８９）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）４：３３５−
３４０。

【００９９】４９、フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）ら（１９８
９）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５：７５２−７
５５。

【０１００】５０、カドマツ（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ）ら
（１９８８）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１５１：１３２
１−１３１８。

【０１０１】５１、ラウバラ（Ｒａｕｖａｌａ）（１９
８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：２９３３−２９４１。

【０１０２】５２、フーバー（Ｈｕｂｅｒ）ら（１９９
０）ニューロケミカル・リサーチ（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１５：４３５−４３９。

【０１０３】５３、ガウトシ−ソバ（Ｇａｕｔｓｃｈｉ
−Ｓｏｖａ）ら（１９８６）バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）
１４０：１８７４−１８８０。

【０１０４】５４、アビブ（Ａｖｉｖ）およびレダー
（Ｌｅｄｅｒ）（１９７２）ＰＮＡＳＵＳＡ ６９：１
４０８８−１４１２０。

【０１０５】５５、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、（１９８２）分子クローニング：実験室のマニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・
スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）、ニューヨーク州。

【０１０６】５６、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９
８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７。

【０１０７】５７、ミルナー（Ｍｉｌｎｅｒ）ら（１９
８９）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１６５：１０９６−１
１０３。

【０１０８】５８、モウゼズ（Ｍｏｓｅｓ） ｅｔ ａ
ｌ．（１９９１）バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）９：６３０−６３４。

【０１０９】５９、レビ−モウタルシニ（Ｌｅｖｉ−Ｍ
ｏｕｔａｌｃｉｎｉ）Ｒ．およびハンバーガー（Ｈａｍ
ｂｕｒｇｅｒ）Ｖ．（１９５３）ジャーナル・オブ・イ
クスペリメンタル・ズーオロジー（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏ
ｌ．）１２３：２３３−２７８。

【０１１０】６０、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ） ｅｔ
ａｌ．（１９９１）成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ）４：９７−１０８。

【０１１１】６１、リ（Ｌｉ） ｅｔ ａｌ．（１９９
０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５０：１６９０−
１６９４。

【０１１２】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【０１１３】１、細胞成長抑制量のヘパリン結合性神経
突起の成長促進因子（ＨＢＮＦ）、アルキル化ＨＢＮＦ
またはそれらの組み合わせを動物に投与することからな
る細胞の成長を抑制する方法。

【０１１４】２、前記ＨＢＮＦまたはアルキル化ＨＢＮ
Ｆが、ヒトＨＢＮＦ、ウシＨＢＮＦ、ヒツジＨＢＮＦ、
イヌＨＢＮＦ、ブタＨＢＮＦ、ネコＨＢＮＦ、ウマＨＢ
ＮＦ、トリＨＢＮＦ、サカナＨＢＮＦまたはそれらのア
ルキル化類似体である上記第１項記載の方法。

【０１１５】３、脈管形成コントロール量のＨＢＮＦ、
アルキル化ＨＢＮＦまたはそれらの組み合わせを動物に
投与することからなる動物における脈管形成をコントロ
ールる方法。

【０１１６】４、前記ＨＢＮＦまたはアルキル化ＨＢＮ
Ｆが、ヒトＨＢＮＦ、ウシＨＢＮＦ、ヒツジＨＢＮＦ、
イヌＨＢＮＦ、ブタＨＢＮＦ、ネコＨＢＮＦ、ウマＨＢ
ＮＦ、トリＨＢＮＦ、サカナＨＢＮＦまたはそれらのア
ルキル化類似体である上記第３項記載の方法。

【０１１７】５、応答性細胞アッセイにおいてＨＢＮＦ
を利用することからなる細胞成長抑制因子についてスク
リーニングする方法。

【０１１８】６、手術後の出血をコントロールする量の
ＨＢＮＦ、アルキル化ＨＢＮＦまたはそれらの組み合わ
せを人間または温血動物に投与することからなる手術後
の出血をコントロールする方法。

【０１１９】７、前記ＨＢＮＦがヒトＨＢＮＦである上
記第６項記載の方法。

【０１２０】８、ＨＢＮＦ、アルキル化ＨＢＮＦまたは
それらの組み合わせを動物に投与することからなる腫瘍
の成長を抑制する方法。

【０１２１】９、前記ＨＢＮＦまたはアルキル化ＨＢＮ
Ｆが、ヒトＨＢＮＦ、ウシＨＢＮＦ、ヒツジＨＢＮＦ、
イヌＨＢＮＦ、ブタＨＢＮＦ、ネコＨＢＮＦ、ウマＨＢ
ＮＦ、トリＨＢＮＦ、サカナＨＢＮＦまたはそれらのア
ルキル化類似体である上記第８項記載の方法。

【０１２２】１０、前記ＨＢＮＦがヒトＨＢＮＦである
上記第８項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＨＫ細胞の高い親和性のレセプターに結合す
るｂＦＧＦへのＨＢＮＦおよびカルボキシメチル化ＨＢ
ＮＦの作用を示すグラフ。●−ＨＢＮＦ、■−カルボキ
シメチル化ＨＢＮＦ。アッセイは実施例８に記載されて
いる。

【図２】ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の成長へのＨ
ＢＮＦおよびカルボキシメチル化ＨＢＮＦの作用を示す
グラフ。アッセイは実施例６に記載されている。パネル
Ａ：ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ
／ｍｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、ＥＤ₅₀
＝０．０４μＭ。パネルＢ：０．３３μＭはＡＢＡＥ細
胞の脱離を引き起す。全面成長以下のＡＢＡＥ細胞を
０．３３μＭのＨＢＮＦに４日間暴露し、その間に細胞
の可視の脱離は起こる。「開始」はＨＢＮＦの添加前の
プレートを意味する；「対照」はＨＢＮＦで処理しない
プレートを意味する；「ＨＢＮＦ」はＨＢＮＦで処理し
たプレートを意味する。パネルＣ：カルボキシメチル化
ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ／ｍ
ｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、それぞれ、
ＥＤ₅₀＝０．２４μＭおよび０．１３μＭ。

【図３】ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の成長へのＨ
ＢＮＦおよびカルボキシメチル化ＨＢＮＦの作用を示す
グラフ。アッセイは実施例６に記載されている。パネル
Ａ：ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ
／ｍｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、ＥＤ₅₀
＝０．０４μＭ。パネルＢ：０．３３μＭはＡＢＡＥ細
胞の脱離を引き起す。全面成長以下のＡＢＡＥ細胞を
０．３３μＭのＨＢＮＦに４日間暴露し、その間に細胞
の可視の脱離は起こる。「開始」はＨＢＮＦの添加前の
プレートを意味する；「対照」はＨＢＮＦで処理しない
プレートを意味する；「ＨＢＮＦ」はＨＢＮＦで処理し
たプレートを意味する。パネルＣ：カルボキシメチル化
ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ／ｍ
ｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、それぞれ、
ＥＤ₅₀＝０．２４μＭおよび０．１３μＭ。

【図４】ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の成長へのＨ
ＢＮＦおよびカルボキシメチル化ＨＢＮＦの作用を示す
グラフ。アッセイは実施例６に記載されている。パネル
Ａ：ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ
／ｍｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、ＥＤ₅₀
＝０．０４μＭ。パネルＢ：０．３３μＭはＡＢＡＥ細
胞の脱離を引き起す。全面成長以下のＡＢＡＥ細胞を
０．３３μＭのＨＢＮＦに４日間暴露し、その間に細胞
の可視の脱離は起こる。「開始」はＨＢＮＦの添加前の
プレートを意味する；「対照」はＨＢＮＦで処理しない
プレートを意味する；「ＨＢＮＦ」はＨＢＮＦで処理し
たプレートを意味する。パネルＣ：カルボキシメチル化
ＨＢＮＦは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（１ｎｇ／ｍ
ｌ）（▲）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、それぞれ、
ＥＤ₅₀＝０．２４μＭおよび０．１３μＭ。

【図５】ヒト臍帯（ＨＵＶＥ）細胞の成長へのＨＢＮＦ
の作用を示すグラフ。●−培地中の１ｎｇ／ｍｌのｂＦ
ＧＦ；▲−培地中の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。アッセ
イは実施例９に記載されている。

【図６】ヒト包皮線維芽の成長への０．６５μＭのＨＢ
ＮＦの作用を示すグラフ。白抜きバー−ｂＦＧＦなし、
クローズドバー−培地中の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。
「対照」−未処理細胞を意味する；「ＨＢＮＦ」は０．
６５μＭのＨＢＮＦで４日間処理した。アッセイは実施
例９に記載されている。

【図７】ＨＢＮＦの完全な配列を示す図。

【図８】ＨＢＮＦの完全な配列を示す図。

【図９】ＨＢＮＦの完全な配列を示す図。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞成長抑制量のヘパリン結合性神経突
   起の成長促進因子（ＨＢＮＦ）、アルキル化ＨＢＮＦま
   たはそれらの組み合わせを動物に投与することを特徴と
   する細胞の成長を抑制する方法。
2. 【請求項２】 脈管形成コントロール量のＨＢＮＦ、ア
   ルキル化ＨＢＮＦまたはそれらの組み合わせを動物に投
   与することを特徴とする動物における脈管形成をコント
   ロールる方法。
3. 【請求項３】 応答性細胞アッセイにおいてＨＢＮＦを
   利用することを特徴とする細胞成長抑制因子についてス
   クリーニングする方法。
4. 【請求項４】 手術後の出血をコントロールする量のＨ
   ＢＮＦ、アルキル化ＨＢＮＦまたはそれらの組み合わせ
   を人間または温血動物に投与することを特徴とする手術
   後の出血をコントロールする方法。
5. 【請求項５】 ＨＢＮＦ、アルキル化ＨＢＮＦまたはそ
   れらの組み合わせを動物に投与することを特徴とする腫
   瘍の成長を抑制する方法。