JPH05229957A

JPH05229957A - Ｍｋタンパク質

Info

Publication number: JPH05229957A
Application number: JP4283717A
Authority: JP
Inventors: Joseph Mark Backer; ジヨセフ・マーク・バツカー; Peter Bohlen; ピーター・ボーレン
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1992-09-29
Publication date: 1993-09-07
Also published as: TW255827B; KR930005634A; EP0535336A2; AU2604292A; CA2079290A1; ZA927468B; EP0535336A3; AU650786B2

Abstract

(57)【要約】【構成】ＭＫタンパク質を利用することによって内皮
細胞のような細胞の成長を抑制する方法。【効果】新しい血管の新生又は形成に関連する病気の
処置において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＭＫタンパク質の使用により細
胞の成長を抑制する方法に関する。本発明において有用
な方法は、通常、ヒトの脳において産生されるが、ヘパ
リン結合性神経突起成長促進因子（ＨＢＮＦ）として知
られており、またヘパリン結合性好中球性因子として知
られている、他のヘパリン結合性タンパク質と明らかに
発育的に異なる時に産生される。ヒトＭＫタンパク質を
エンコードする遺伝子は、ヒトの新生児の脳幹のＲＮＡ
から得られたｃＤＮＡのライブラリーから分離され、そ
して発現されると、１２１アミノ酸を有するタンパク質
を産生する。予期せざることには、ＭＫタンパク質は、
塩基性線維芽成長因子（ｂＦＧＦ）に対して内皮的に応
答し、これにより成長に対して潜在的な抑制の生体内作
用を示す抑制因子であることが発見された。

【０００２】近年、成長因子として知られている、ある
数の比較的小さいポリペプチドが同定され、そして分離
されてきている。用語「成長因子」は、ある種の動物の
成長および分化に影響を与える、あるクラスのシグナル
を発生する物質を意味する。この作用は動物および組織
培養物の両者において見ることができ、そして所定の成
長因子は１より多い型の細胞に対して作用を有すること
ができる。

【０００３】多数のよく知られている成長因子は有意な
好中球活性を有する、すなわち、それらは神経細胞の成
長を維持または刺激することができる。このような好中
球性因子の最も早い発見は、神経成長因子（ＮＦＧ）
（Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉおよびＨａｍｂｕｒ
ｇｅｒ、１９５３）であった。ＮＦＧと同一族の同様な
成長因子は、脳誘導好中球性因子（ＢＤＮＦ）；（Ｌｅ
ｉｂｒｏｃｋｅｔａｌ．、１９８９）および好中球
因子−３（ＮＴ−３）（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅｅ
ｔａｌ．、１９９０）である。追加の成長因子は、次
のものを包含する：線毛の好中球性因子（ＣＮＴＦ）
（Ｌｉｎｅｔａｌ．、１９８０、ＩＧＦ−ＩＩ（Ｍ
ｉｌｌｅｔａｌ．、１９８５）、アクチビン（Ｓｃ
ｈｕｂｅｒｔｅｔａｌ．、１９９０）、パープリン
（Ｂｅｒｍａｎｅｔａｌ．、１９８７）およびまた
ＦＧＦ（ＢａｉｒｄおよびＢｏｈｌｅｎ、１９９０）。

【０００４】ある数の既知の成長因子は、線維芽成長因
子（ＦＧＦ）に関する上科に含まれる。この族は次のも
のを包含する：塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）（Ｂｏｈｌｅ
ｎｅｔａｌ．、１９８４；Ｅｓｃｈｅｔａｌ．、
１９８５）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）（Ｂｏｈｌｅｎ
ｅｔａｌ．、１９８５；Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅ
ｇｏｅｔａｌ．、１９８５）ならびに腫瘍遺伝子ｉ
ｎｔ−２の産生物（ＤｉｃｋｅｎｓおよびＰｅｔｅｒ
ｓ、１９８４）、ｈｓｔ／ＫＳ（ＤｅｌｌｉＢｏｖｉ
ｅｔａｌ．、１９８７）、ＦＧＦ−５（Ｚｈａｎｅ
ｔａｌ．、１９８８）、ＦＧＦ−６（Ｍａｒｉｃｓ
ｅｔａｌ．、１９８９）およびＫＧＦ（Ｆｉｎｃｈ
ｅｔａｌ．、１９８９）。これらは脈管の内皮細胞の
ためのすべての（ＫＧＦを除外する）ミトゲンであり、
そしてすべては、また、ヘパリンに強く結合する。他の
ヘパリン結合性成長因子、例えば、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
は、また、知られている（Ｋｅｃｋｅｔａｌ．、１
９８５）。ヘパリン結合性成長因子は、また、脳組織か
ら頻繁に分離され、そして脳細胞の成長および発育にお
いて有意な役割を演ずることがある。

【０００５】カドマツら（Ｋａｄｏｍａｔｓｕｅｔ
ａｌ．、１９８８）は、レチン酸誘発可能なかつ発育的
に調節された遺伝子のｃＤＮＡを分離しそして配列決定
し、この遺伝子はマウスの細胞からのものであり、この
タンパク質はＭＫと呼ばれた。対応するｍＲＮＡはマウ
スの胚の発育の初期の段階において豊富であるが、後の
段階でそうでないと言われた。ＭＫ１タンパク質は細胞
の分化のコントロールに関連するとして、詳しくは遺伝
子の発現を調節するＤＮＡ結合性タンパク質として示唆
された。他の既知のタンパク質の配列に対する関係は発
見されなかった。引き続く論文において、胚の癌細胞の
分化の初期の段階におけるＭＫ遺伝子の発現（Ｔｐｍｏ
ｍｕｒａｅｔａｌ．、１９９０）、およびＭＫ１、
ＭＫ２およびＭＫ３と呼ばれる、ｃＤＮＡクローンの３
つの顕著なクラスの発生（Ｋａｄｏｍａｔｕｅｔａ
ｌ．、１９９０）が報告された。これが示唆するよう
に、ＭＫは種々の細胞の分化において基本的な役割を演
じ、そしてＭＫは上皮組織の発生および中胚葉の改造に
関係づけることができる。

【０００６】マウスＭＫ１配列はヘパリン結合性好中球
性因子（ＨＢＮＦ）として知られているタンパク質に対
して高度の相同性を有することが示された；このタンパ
ク質をエンコードするヌクレオチド配列は米国特許出願
第０７／５６８，５７４号に開示された。ＨＢＮＦタン
パク質は欧州特許（ＥＰ）第３２５０７６号として本来
開示された。

【０００７】本発明は、ＭＫが細胞の成長を抑制すると
いう、予期せざる発見に関する。

【０００８】内皮細胞の増殖および新規な血管の引き続
く形成は、腫瘍の成長、関節炎および網膜症を包含する
病理学的プロセスの発展における無条件的な段階である
（ＦｏｌｋｍａｎおよびＫａｇｓｂｒｕｍ、１９８
７）。塩基性線維芽成長因子（ｂＦＧＦ）は細胞培養に
おける内皮細胞のための効力のあるミトゲン（Ｇｏｓｐ
ｏｄａｒｏｗｉｃｚｅｔａｌ．、１９８４）および
生体内で強力な抗原性因子（ＢａｉｒｄおよびＢｏｈｌ
ｅｎ、１９９０）である。内皮細胞はｂＦＧＦを発現し
（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙｅｔａｌ．、１９８７、Ｍｏ
ｓｃａｔｅｌｌｉｅｔａｌ．、１９８６、Ｈａｎｎａ
ｎｅｔａｌ．、１９８７）そしてオートクリン成長
因子として使用することができる（ＳａｔｏおよびＲｉ
ｆｋｉｎ、１９８８）。ｂＦＧＦの生体内および試験管
内の局在化の研究において、ｂＦＧＦは、また、細胞外
のマトリックス中のヘパリンおよび硫酸ヘパリンの部分
に関連し、そして細胞の酵素により遊離されて内皮細胞
を活性化することができることが示された（Ｗａｎｋａ
ｅｔａｌ．、１９９１、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙｅｔ
ａｌ．、１９８７、Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ、１９８
８、Ｂａｓｈｋｉｎｅｔａｌ．、１９８９およびＦ
ｏｌｋｍａｎｅｔａｌ．、１９８８）。したがっ
て、ｂＦＧＦの特定の一般に無毒の拮抗因子を開発する
ことは、脈管形成の治療学的コントロールに対する有効
なアプローチであることができる。

【０００９】脈管形成をコントロールすることの方法
は、ｂＦＧＦと細胞のレセプターとの間の相互作用のメ
カニズムの決定における最近の進歩にかんがみて、とく
に有効である。大部分の細胞はｂＦＧＦとＫ_d＝１０^-10
〜１０^-11で結合する、高い親和性のトランスメンブレ
ンｇｐｔレセプターを含有する（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ、１９８７）。この型のレセプターは同定されてきて
おり、そしてそのいくつかの形態は種々の種からクロー
ニングされ（Ｒｕｔａｅｔａｌ．、１９８８、Ｃｏ
ｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．、１９８８、Ｋｏｒｎｂｌ
ｕｔｈｅｔａｌ．、１９８８、Ｌｅｅｅｔａ
ｌ．、１９８９、ＰａｓｑｕａｌｅおよびＳｉｎｇｅ
ｒ、１９８９、およびＳａｆｒａｎｅｔａｌ．、１
９９０）これにより成長に影響を与える物質とレセプタ
ーとの間の相互作用のより直接な標準を可能とする。

【００１０】高い親和性のレセプターに加えて、細胞は
いっそ多数の親和性が低いレセプターを含有し、これら
のレセプターは硫酸ヘパリンプロテオグリカン類であ
り、そしてＫ_d＝１０^-9ｄｅｂＦＧＦと結合する（Ｍｏ
ｓｃａｔｅｌｌｉ、１９８７）。この型のレセプターの
第１の構成員は最近クローニングされた（Ｋｉｅｆｅｒ
ｅｔａｌ．、１９９０）。低いおよび高い親和性のレ
セプターに結合するｂＦＧＦの間の新規な相互作用は最
近報告された（Ｙａｙｏｎｅｔａｌ．、１９９
１）。このグループは、細胞表面の硫酸ヘパリン部分の
適切な生合成が高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの
結合に必要であること示した。また、外因性ヘパリンは
ｂＦＧＦレセプターを発現するが、硫酸ヘパリンの生合
成を欠如する細胞の中で高い親和性の結合性を回復でき
ることが示された。ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）らが示唆する
ように、低い親和性の硫酸ヘパリンプロテオグリカンレ
セプターはｂＦＧＦと結合し、ｂＦＧＦにおいてコンフ
ォメーションの変化を誘発し、こうして、高い親和性の
レセプターに結合することができるｂＦＧＦ「つく
る」。硫酸ヘパリンプロテオグリカンの生合成が損傷さ
れる場合、外因性ヘパリンまたは硫酸ヘパリンはｂＦＧ
Ｆにおいて適切なコンフォメーションの変化を誘発する
ことができる。この「誘発された適合」モデルは、レセ
プターへのｂＦＧＦの提示において硫酸ヘパリンプロテ
オグリカンの役割を強調する。さらに、それが示唆する
ように、ヘパリン結合性タンパク質による硫酸ヘパリン
プロテオグリカンレセプターの占有は、高い親和性のレ
セプターへのｂＦＧＦの結合を抑制することがある。事
実、長い間知られてきているように、ある種のヘパリン
結合性タンパク質は試験管内で脈管形成および内皮細胞
の成長を抑制することができる（ＴａｙｌｏｒおよびＦ
ｏｌｋｍａｎ、１９８２、Ｄａｕｃｈｅｌｅｔａ
ｌ．、１９８９）。しかしながら、作用のメカニズムは
未知である。

【００１１】より最近、このモデルについての実験的支
持は、アンギオスタティック（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉ
ｃ）活性を表す（ＴａｙｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａｎ、
１９８２）ヘパリン結合性胎盤誘導されたタンパク質Ｐ
Ｆ４（胎盤因子４）が、また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におい
て高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの結合を抑制す
る（Ｓａｔｏｅｔａｌ．、１９９０）という発見に
より提供された。さらに、ＰＦ４は、また、ウシおよび
ヒトの内皮細胞のｂＦＧＦ誘導移動（Ｓａｔｏｅｔａ
ｌ．、Ｓｈａｒｐｅｅｔａｌ．、１９９０）および
ヒト内皮細胞のｂＦＧＦ誘導成長の両者を抑制するが、
他の正常のおよび腫瘍の細胞の成長に影響を与えない
（Ｍａｉｏｎｅｅｔａｌ．、１９９０、１９９
１）。しかしながら、最近、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）
らは、ＰＦ４の作用のメカニズムはヘパリンへ結合する
その能力に直接関連することができないことを示す、新
規な証拠を提出した（Ｍａｉｏｎｅｅｔａｌ．、１
９９０、１９９１）。このグループの発見によると、両
者がヘパリンに対する親和性を欠如する、組み換えＰＦ
４およびＰＦ４の合成のＣ末端の１３マーの断片は、な
お、生体内で効力のあるアンギオスタティック活性を保
持し、そして突然変異のＰＦ４は試験管内でヒト内皮細
胞の増殖を抑制する（Ｍａｉｏｎｅｅｔａｌ．、１
９９０、１９９１）。

【００１２】ＭＫは成長因子のＦＧＦおよびＰＦ４族と
構造的に無関係である。しかし、ＭＫタンパク質はベイ
ビーハムスタ腎臓（ＢＨＫ）細胞上の高い親和性の結合
部位からｂＦＧＦを変位させ、そして試験管内でウシお
よびヒトの内皮細胞の成長を特異的に抑制することが発
見され、これによりＭＫタンパク質は細胞成長抑制因子
であることが示された。

【００１３】本発明は、ＭＫを動物、好ましくは温血動
物に投与することによって、細胞の成長の抑制する方法
に関する。極めて大きい重要性をもつ細胞の抑制の１つ
のタイプは、新しい血管の新生または形成である。病
気、例えば、充実腫瘍、慢性関節リウマチおよび眼の病
気、例えば、網膜症、血管新生緑内障、眼の腫瘍などに
おける血管新生の抑制は人間の医学的処置において重要
であるが、獣医学的処置において、同様によく、使用で
あることがある。病気の状態の処置に加えて、例えば、
バイパスの外科における手術後の出血のコントロール
は、また、本発明の化合物で提供される。さらに、本発
明の使用は細胞をより分化した状態に推進し、これによ
り化学療法的使用を同様によく提供する。これは精製さ
れたタンパク質の直接投与により達成することができる
か、あるいは、また、このような処置を行う物体の領域
の中に、このタンパク質を産生することができるトラン
スジェニック硫酸ヘパリン細胞を移植することによって
達成することができる。さらに、新しい毛管の新生また
は形成は種々の病理学的状態または病気において重要で
ある。例えば、脈管形成に依存する病気は、次のものを
包含するが、これらに限定されない：血管線維腫、動脈
静脈の奇形、関節炎、関節硬化性班、角膜移植片血管新
生、創傷治癒の遅延、糖尿病性網膜症、顆粒化−熱傷、
血管腫、血友病性関節、過形成性瘢痕、血管新生緑内
障、癒着不良骨折、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−
Ｗｅｂｅｒ）症候群、乾癬、ピオゲン性肉芽腫、水晶体
後線維増殖症、強皮症、、充実腫瘍、トラコーマおよび
血管癒着（Ｍｏｓｅｓｅｔａｌ．、１９９１）。

【００１４】前述の生体内の治療に加えて、本発明にお
いて有用な化合物は、他の用途、すなわち、ＦＧＦのア
ゴニストおよび拮抗因子を同定する試験管内のスクリー
ニングのメカニズムを提供する。

【００１５】自然源および組み換え的に誘導されたＭＫ
の両者ならびにＭＫの類似体は本発明における使用のた
めに考えられる。例えば、アルキル化された類似体、例
えば、カルボキシメチル化されたものは本発明における
使用において有用である。

【００１６】こうして、本発明の目的は、細胞の成長の
生体内抑制因子および試験管内アッセイまたはスクリー
ニング方法、および内皮細胞アッセイを必要とする個体
に有効量のＭＫを生体内に投与することからなる治療学
的方法または内皮細胞アッセイにおいてＭＫを使用する
方法に関する。本発明のこれらおよび他の目的は下の詳
細な説明から明らかになるであろう。

【００１７】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００１８】

【実施例】実施例１ヒトＭＫをエンコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）およびヒトの新生児の脳幹から誘導
されたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの組み合
わせによりクローニングする。ヒトＨＢＮＦ配列をＰＣ
Ｒ増幅反応のためのオリゴヌクレオチドの設計のための
開始点として使用する。ＨＢＮＦと発表されたマウスＭ
Ｋ１のＤＮＡとの間の最も保存された領域に対して、特
定のオリゴヌクレオチドを設計する。これらのオリゴヌ
クレオチドをマウスのゲノムのＤＮＡ上のポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用す
る。期待された１５０塩基対の産生物を適当なベクター
においてクローニングし、そして配列を決定する。この
クローンをヒト脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グのためのプローブとして使用して、ヒトＭＫ同等遺伝
子を同定する。単一のクローンを分離し、サブクローニ
ングし、そして配列決定する。ヌクレオチド配列が追加
のより短い長さのＭＫクローンにおいて引き続いて確証
され、ＭＫクローンはもとのクローンの異なるオーバー
ラッピングする断片を含有することが発見された。ＭＫ
のｃＤＮＡの配列は２つのポリアデニル化シグナルおよ
びポリＡテイルを包含する。もとの分離されたクローン
は、解読領域がヌクレオチド２２で開始しそして１４３
残基のタンパク質を定めるオープンリーディングフレー
ムを有する。Ｎ末端配列は高度に疎水性であり、そして
シグナルペプチドの特性を有する（ＶｏｎＨｅｉｊｎ
ｅ、１９８５）。記載されたシグナルペプチドの構造に
ついての基準（ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ同上およびＶｏ
ｎＨｅｉｊｎｅ、１９８６）およびマウスＭＫおよび
ヒトＨＢＮＦの配列の比較に基づいて、シグナルペプチ
ドの切断はアミノ酸残基２２（Ａｌａ）と２３（Ｌｙ
ｓ）との間で起こり、こうして長さが１２１残基の成熟
ＭＫポリペプチドを生ずる。

【００１９】汚染する真核生物のタンパク質を含まない
成熟ＭＫタンパク質源を準備するために、上で分離した
ｃＤＮＡクローンを、成熟タンパク質のＮ末端のリジン
残基の直ぐ５’末端にメチオニンのコドンを配置するよ
うに設計したプライマーを使用するＰＣＲ増幅のための
鋳型として使用する。増幅した産生物を修飾した形態の
発現ベクターｐＥＴ−３ａ（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａ
ｌ．、１９９０）の中にクローニングし、そして生ずる
プラスミドｐＥＴＭＨ２をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１Ｌ
ｙｓＳの中に形質転換する。ＩＰＴＧ誘発ｐＥＴＭＨ２
含有バクテリアのタンパク質抽出物は、ほぼ１６．５ｋ
Ｄａで移動する主要なタンパク質のバンドを発現する。
誘発しない培養物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの強度
により判定して、非常に少ないタンパク質を含有する。
組み換えＭＫタンパク質は、ＩＰＴＧ誘発バクテリア培
養物から、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、モノ−
Ｓカチオン交換および／または逆相ＨＰＬＣ、および確
証されたそのＮ末端配列およびアミノ酸組成により精製
した。

【００２０】ヒトおよび発表されたマウスＭＫのＤＮＡ
および推定されたタンパク質の配列の間の相同性は、Ｈ
ＢＮＦの同様な進化する比較より低いレベルの保存を示
す。ＨＢＮＦとの相同性から推定された成熟ＭＫタンパ
ク質からの推定上のＮ末端を使用して、マウスの配列に
おける３つのアミノ酸の欠失を含む８６％のアミノ酸の
同一性が観察される。ＨＢＮＦおよびＭＫの両者は脳に
おいて発現されるが、それらの一時的および空間的調節
は異なる。予備的正常部位ハイブリダイゼーションは２
つのメッセージについて明確な発現のパターンを示す。
これらの初期の実験において、ＭＫは検査したいずれの
大人においても発現されないが、ＨＢＮＦのｍＲＮＡは
大人の脳において主として発現されることが示された。
しかしながら、配列の検査は、ＭＫのｍＲＮＡが大人の
脳の２つの領域、尾状核および脳幹において検出可能で
あることを示す。同等の量の胚のＲＮＡに比較して、大
人のＲＮＡにおいてこれらのバンドを見るために要求さ
れる、有意により長い暴露時間に基づいて、ＭＫのＲＮ
Ａは大人において最小のレベルで発現されるようであ
る。

【００２１】ＭＫおよびＨＢＮＦ遺伝子の一時的発現
を、種々の発育ｓｔｇからの完全なラットのＲＮＡを使
用してノザンブロット分析により評価する。ＨＢＮＦプ
ローブとのハイブリダイゼーションは、発育を通すメッ
セージの徐々のを包含するを示し、最大のレベルは大人
の脳において起こる。同一ブロットとＭＫプローブとの
ハイブリダイゼーションは、わずかに１２、１４および
１６日の胚組織がメッセージを含有することを示す。Ｍ
Ｋメッセージの最も豊富な存在は胚の１２日の段階にあ
るように思われる。これらの結果は、一般に、カドマツ
（Ｋａｄｏｍａｔｕ）（ｓｕｐｒａ）の正常部位ハイブ
リダイゼーションは２つのの研究と一致する。しかしな
がら、大人の腎臓中のＭＫのｍＲＮＡの発現は検出され
ない。ラット脳におけるＨＢＮＦタンパク質の研究は、
最高のレベルは生後７日の子犬において起こることを示
唆する。このレベルは、生後５６日の動物と比較したと
き、１０倍の差を反映する（Ｒａｕｖａｌａ、ｓｕｐｒ
ａ）。

【００２２】ヒト胚癌（ＥＣ）細胞系ＮＴ２／Ｄ１を
０．０１〜１０μＭで変化するレチン酸（ＲＡ）濃度で
分化を誘発することができ、分化するＥＣ細胞の比率は
０．０１μｇのＲＡにおける５０％から１および１０μ
ｇＭのＲＡにおける９９％より大の範囲である。ＮＴ２
／Ｄ１の分化の間のＭＫおよびＨＢＮＦの発現を、０．
０１〜１０μＭの濃度において研究する。ＲＡへの９日
の暴露後、合計のＲＡを細胞から抽出し、そしてノザン
分析により遺伝子の発現についてプロービングする。両
者の遺伝子の発現は同様なパターンをたどる。ｍＲＮＡ
発現のレベルは定常状態のバックグラウンドのレベルに
止まる。ＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを対
照のβ−アクチンのプローブに対して正規化するとき、
最大の増加はＨＢＮＦについて６倍そしてＭＫについて
１１倍であると計算される。これらの結果は、マウスＥ
Ｃ細胞系、ＨＭ−１のレチン酸の誘発の間にＭＫについ
て観察されたものに匹敵する（Ｋａｄｏｍａｔｓｕｅ
ｔａｌ．、ｓｕｐｒａ）。この細胞系において、ＭＫ
遺伝子の発現はバックグラウンドより８〜１０倍上で誘
発される。

【００２３】こうして、ＨＢＮＦおよびＭＫは高度に保
存される遺伝子族の構成員であると思われる。さらに、
遺伝子の発現のデータは、これらの遺伝子が組織、とく
に神経組織の増殖、維持および／または発育の分化にお
いて機能することができることを意味する。

【００２４】次はＴ７ＤＮＡポリメラーゼの発現系にお
けるＭＫ遺伝子のクローニングおよび発現を例示する。
しかしながら、このＴ７ＤＮＡポリメラーゼの発現系は
非常に効率よいが、これはＭＫを組み換え的に産生する
ことができる唯一の手段ではないことを理解すべきであ
る。ＭＫの産生は、ＭＫ遺伝子を任意の適当な発現ベク
ターの中に組み込み、引き続いて適当な宿主細胞をこの
ベクターで形質転換することによって達成することがで
きる；あるいは、宿主細胞の形質転換はベクターを使用
しないで裸のＤＮＡにより直接達成することができる。
真核生物細胞または原核生物細胞によるＭＫの産生は本
発明により考えられる。適当な真核生物の細胞の例は、
哺乳動物の細胞、植物の細胞、酵母菌の細胞および昆虫
の細胞を包含する。同様に、適当な原核生物の宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉに加えて枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）を包含する。

【００２５】他の適当な発現ベクターは、また、使用す
ることができ、そして宿主細胞の選択に基づいて選択さ
れる。例えば、バクテリアの細胞の形質転換における使
用に適当な多数のベクターはよく知られている。例え
ば、プラスミドおよびバクテリオファージ、例えば、λ
ファージは、バクテリアの宿主、とくにＥ．ｃｏｌｉの
ための最も普通に使用されているベクターである。哺乳
動物および昆虫の両者の細胞において、ウイルスのベク
ターは外因性ＤＮＡの発現を得るために頻繁に使用され
ている。とくに、哺乳動物の細胞はＳＶ４０またはポリ
オーマウイルスで普通に形質転換される；そして培養に
おける昆虫細胞はバキュロウイルスの発現ベクターで形
質転換される。酵母菌のベクター系は、酵母菌のセント
ロメアのプラスミド、酵母菌のエピソームのプラスミド
および酵母菌の組み込みプラスミドを包含する。

【００２６】また、本発明の実施はＭＫタンパク質の正
確なアミノ酸配列の使用に限定されないことを理解すべ
きである。生ずるタンパク質分子におけるサイレントな
変化を産生する、ＭＫタンパク質のＤＮＡ配列に対する
修飾、例えば、欠失、挿入、または配列中の置換は、ま
た、考えられる。また、生物学的に活性なＭＫタンパク
質を生ずるアミノ酸配列に対する修飾は本発明の範囲内
に包含される。

【００２７】例えば、所定の部位において化学的に同等
のアミノ酸を産生する遺伝子配列中の変更が考えられ
る；こうして、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のた
めのコドンは、他の疎水性残基、例えば、グリシンをエ
ンコードするコドンで容易に置換することができるか、
あるいはより疎水性の残基、例えば、バリン、ロイシン
またはイソロイシンで置換することができる。同様に、
１つの陰性に帯電した残基を他のものと置換する、例え
ば、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換するか、ある
いは１つの陽性に帯電した残基を他のものと置換する、
例えば、リジンをアルギニンで置換する変化は、また、
生物学的に同等の産生物を産生することが期待される。
タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の変更を生ず
るヌクレオチドの変化は、これらの領域が通常生物学的
活性に関係しないので、タンパク質の活性をしばしば変
更しないであろう。また、悪影響が生物学的活性におい
て観測されない場合、疎水性アミノ酸の帯電したアミノ
酸への変化は望ましいであろう。提案された修飾の各々
ならびにエンコードされる産生物の生物学的活性の保持
の決定は、この分野における日常的技量の範囲内であ
る。したがって、句「ＭＫ」または「ＭＫタンパク質」
を明細書および請求の範囲において使用するとき、生物
学的に同等のＭＫタンパク質の産生を生ずる、すべての
このような修飾および変化を包含することを理解すべで
ある。

【００２８】ＭＫタンパク質はＨＢＮＦタンパク質に対
して強く相同性であり、そしてＨＢＮＦに似て神経突起
の発育の誘発を刺激する。したがって、ＭＫは好中球性
因子として提案される。それ自体、末梢および中枢神経
系の神経細胞の生体内および試験管内の両者の成長、維
持および修復のために、ＭＫタンパク質を使用すること
ができる。試験管内の応用の１つの例は、現在パーキン
ソン病の処置における使用に提案されている、胚脳移植
片の維持においてである。

【００２９】分化における明らかな役割にかんがみて、
ＭＫタンパク質は、また、組織の分化、維持および修復
の因子として提案される。とくに、ＭＫは分化した表現
型への復帰を誘発する腫瘍細胞の処置において有用であ
ることができる。

【００３０】遺伝子およびその配列の同定は、トランス
ジェニック細胞、例えば、線維芽、単球またはマクロフ
ァージの構成を可能とし、これらはＭＫ遺伝子の発現を
可能とするように操作することができ、そして前述の病
気の処置のための移植片として使用することができる。

【００３１】そのうえ、ＭＫの治療学的使用は人間単独
の処置に限定されない。事実、顕著に関係する種の間に
このタンパク質が保存されている性質にかんがみて、任
意の形態のＭＫの投与は獣医学的応用のために同様によ
く有益であろう。治療学的組成物は、所望の生物学的活
性の誘発に有効量のＭＫ、および製剤学的に許容されう
る液体または固体の担体からなる。あるいは、この組成
物は、末梢および中枢神経系の修復または分化の処置の
ための移植片として、ＭＫを試験管内で発現することが
できる、適合性のトランスジェニック細胞の製剤学的に
許容されうる集合体からなる。

【００３２】実施例２ＭＫ遺伝子のクローニングおよび配列決定発表されたマウスＭＫタンパク質のアミノ酸配列を使用
して、ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして
使用すべき、特定のオリゴヌクレオチドつくる。マウス
のゲノムのＤＮＡをＣ５７ブラック／６Ｊマウスから、
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ｓｕｐｒａ、に記
載されているように、分離した。

【００３３】センスプライマーを次のアミノ酸配列につ
くる：Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で開始し
そして次のＤＮＡ配列から構成されている：５’−ＣＡ
ＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＴＴ
ＧＡＡ−３’。アンチセンスプライマーを次のアミノ酸
配列につくる：Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、ＥｃｏＲＩ制限部位で開始しそし
て次のＤＮＡ配列から構成されている：５’−ＧＧＡＡ
ＴＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴ−
３’。

【００３４】ＰＣＲ反応を相補的ＤＮＡ鋳型上で５０℃
において１分のアニーリング、７２℃において２分の伸
長および９４℃において１分の変性で３０サイクルの
間、Ｔａｑポリメラーゼ（ＵＳＢＣｏｒｐ．）を使用
して実施する。

【００３５】１５０塩基対のマウスＭＫのＰＣＲ産生物
をブルー・スクライブ（ＢｌｕｅＳｃｒｉｂｅ）（＋）
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中にクローニング
し、そして新生児の脳幹および基底神経節λｇ１１ｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングにおいてプローブと
して使用する。ＭＫ配列を含有する単一の推定上のクロ
ーンを分離し、そしてブルー・スクライブ（Ｂｌｕｅ
Ｓｃｒｉｂｅ）（＋）のＥｃｏＲＩ部位の中にサブクロ
ーニングし、そしてジデオキシヌクレオチド連鎖停止方
法により配列決定する。ＭＫ遺伝子の配列、ならびに予
測されたアミノ酸配列を図５に示す。マウスＭＫ配列と
比較すると、４１ヌクレオチドの差が示され、マウスの
配列における３つのコドンの欠失を示す。

【００３６】実施例３組み換えヒトＭＫの発現前述の分離されたクローンを、ｐＭＫＨＣ２と呼び、Ｎ
末端のリジンに対して直ぐ５’のメチオニンのコドンお
よびＮｄｅＩ制限部位を配置するように設計されたプラ
イマーを使用する、ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用
する。精製したＰＣＲ産生物を発現ベクターｐＥＴ−３
ａの誘導体の中にクローニングし、これを１４００ｂｐ
のＳａｌｌ／ＰｖｕＩＩ断片の欠失および複製のｆ１起
源のＥｃｏＲＩ部位の中への挿入により修飾する。イン
サートを配列決定してＰＣＲ増幅の信頼性を確証した
後、プラスミド（名称ｐＥＴＭＨ２；また、従来ｐＥＴ
ＭＨＣ２）を菌株ＧＬ２１ＬｙｓＳの中に形質転換
し、そして記載されているようにＩＰＴＧでタンパク質
の産生を誘発する（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．、ｓ
ｕｐｒａ）。１ｍｌの培養物からの沈澱物を１００μｌ
のＳＤＳｂＦＧＦ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）の中に
再懸濁させ、そして２．５μｌを１５アクリルアミドＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開する。ゲルをクーマッシー
ブルーで染色する。組み換えＭＫをバクテリアの抽出液
からヘパリンのセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）樹脂で１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０中の精製
し、そして１〜１．１３ＭのＮａＣｌで溶離する。それ
以上の精製は、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）カラムで５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８
中で達成し、塩濃度を０から１ＭのＮａＣｌに増加す
る。精製したタンパク質を０．６ＭのＮａＣｌで溶離す
る。

【００３７】実施例４神経突起の成長のアッセイ生後１８日の胎児ラットからの脳を無菌条件下に取り出
し、そして１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で無菌
の５ｍｌの注射器を使用して単細胞に分散させる。細胞
懸濁液を５×１０⁵細胞／ｍｌに調節し、そして５０μ
ｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンで室温において３０分間予
備コーティングした組織培養皿上に配置する（Ｒａｕｖ
ａｌａおよびＰｉｈｌａｓｋａｒｉ、１９８７）。培養
物を１０％のＣＯ₂中で３７℃において２４時間インキ
ュベーションし、次いで培地を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを
含有するＤＭＥＭと交換し、そしてＨＢＮＦまたはＭＫ
タンパク質を示した濃度で添加する。さらに１日間イン
キュベーションした後、神経突起の成長活性を、細胞の
視的により、対照に比較して拡大した成長／プロセスに
ついて決定した。図５Ｄに示すように、精製した組み換
えＭＫは、組み換えＨＢＮＦおよびウシ脳誘導ＨＢＮＦ
と実質的に同一の程度に、神経突起の成長を刺激するこ
とができる。

【００３８】実施例５ヒトＮＴ２／Ｄ１細胞の成長およびレチン酸の誘発ヒト胚癌細胞系Ｎｔ２／Ｄ１を成長させる。レチン酸の
誘発のために、細胞を１０％のウシ子ウシ血清を含有す
るＤＭＥＭ培地中で成長および再懸濁させ、そして１０
％のウシ子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で５
×１０⁵細胞／１００ｍｍの皿の密度の中に再懸濁させ
る。ジメチルスルホキシド（１０μｌ）中の変化する濃
度のすべてのトランスレチン酸を添加し、そして細胞を
９日間インキュベーションする。新鮮な培地およびＲＡ
を第４日および８日に添加する。プレートをリン酸塩緩
衝液で１回洗浄し、そしてＲＮＡを前述したように抽出
する。ＲＡで誘発したＮＴ２／Ｄ１細胞はニューロンの
分化の研究のためのモデルの系を提供することが示唆さ
れてきているので、この系におけるＨＢＮＦおよびＭＫ
遺伝子の誘発の増加はニューロンの細胞の発育における
可能な役割を示す。

【００３９】実施例６他のタンパク質ヒト、血小板誘導ＰＦ４をシグマ（Ｓｉｇｍａ、セント
ルイス）から購入する。野生型の活性および効能をもつ
組み換えｂＦＧＦおよび類似体を文献に記載されている
ように発現および精製する（Ｓｅｄｄｏｎｅｔａ
ｌ．、１９９１）。¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦ（１，０００Ｃｉ
／ミリモル）をアマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から
購入する。

【００４０】カルボキシメチル化ＭＫは次のようにして
調製する：凍結乾燥した組み換えＭＫを、２ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび４．５ＭのグアニジウムＨＣｌを含有する
０．１ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．６中に０．５ｍｇ／
ｍｌの濃度に溶解する。タンパク質をジチオスレイトー
ル（５ｍＭ）で還元し、そしてこの溶液をアルゴン雰囲
気下に３７℃において１時間インキュベーションする。
還元されたタンパク質溶液を室温に冷却し、そしてヨー
ド酢酸（１５ｍＭ）を使用して暗所で１時間アルキル化
する。カルボキシメチル化されたタンパク質を２００ｍ
ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．２に対して４℃において一夜透析する（３５０００
分子量のカットオフ）。カルボキシメチルシステインお
よびタンパク質の濃度は、ＨＣｌ気相加水分解（５．７
ＭのＨＣｌ／０．１％のフェノール；２４時間、１００
℃）後、オンライン１３０Ａ型分離系を装備した４２０
Ａ型ＰＩＴＣ誘導装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、カリフォルニア州）を使用して、アミノ酸分
析により決定する。カルボキシメチル化ＭＫをヘパリン
−セファロースから０．９ＭのＮａＣｌで溶離される
が、自然ＭＫは１．１ＭのＮａＣｌで溶離される。

【００４１】実施例７細胞系ＢＨＫ細胞を７．５％の胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）
を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）
（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中で成長させ
る。ヒト包皮線維芽（ＨＦＳＦ）およびヒト黒色腫細胞
系、エイシンガー（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ）博士（Ｌｅｄｅ
ｒｌｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州パ
ールリバー）からのギフト、を、５．０％の胎児仔ウシ
血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉ
ａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中で成長させる。ウシＡ
ＢＡＥを１０％子ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充
したＤＭＥＭ中で成長させる。ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶ
Ｅ）細胞（継代培養１）、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）博
士（ＣｏｒｎｅｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｅｄｉ
ａｌＣｅｎｔｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）か
らのギフト、を、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）（１９８
４）が記載するように、４％の血清（Ｇｉｂｃｏ）およ
び１６％の胎児仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充した培
地１９９（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ワシントンＤＣ）中の
成長させる。

【００４２】実施例８ラジオレセプターのアッセイＢＨＫ細胞上の高い親和性のレセプターへの¹²⁵Ｉ−ｂ
ＦＧＦの結合をモスカテリ（ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）
（１９８７）に従い実施する。簡単に述べると、細胞を
５０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦおよび種々の添加物と室温
において１時間インキュベーションし、次いで４℃にお
いて３０分間インキュベーションする。細胞の高い塩
（２Ｍ）の洗浄は低い親和性の部位からｂＦＧＦを解放
するが、０．５％のトリトンＸ１００による細胞の処理
は高い親和性の部位からｂＦＧＦから解放する。このア
ッセイは置換実施例により確認し、ここで増加する濃度
の非放射性ｂＦＧＦをインキュベーション混合物に添加
する。非放射性ｂＦＧＦは投与量に依存する方法で５０
ｐＭのＥＤ₅₀でトリトンＸ１００により解放される放射
能の量を減少する。結合アッセイは二重反復実験で実施
する。

【００４３】実施例９ミトゲンのアッセイミトゲンのアッセイはフェイフェウル（Ｆａｆｅｕｒ）
ら（１９９０）に従い実施する。簡単に述べると、ウシ
ＡＢＡＥ細胞をマルチ−ウェルの皿の中に１ｎｇ／ｍｌ
のｂＦＧＦを使用してあるいは使用しないで８，０００
細胞／ウェルで４時間プレイティングし、次いで増加す
る濃度のヘパリン結合性タンパク質を添加する。１ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦの存在下に、ＡＢＡＥ細胞の数はｂＦ
ＧＦの不存在下より３〜４倍高い。ＨＵＶＥ細胞をゼラ
チンでコーティングした２４ウェルのプレートの中に
８，０００細胞／ウェルで接種し、そして接種後１６時
間に化合物を添加する。４日後、細胞を剥離し、そして
計数する。ミトゲンのアッセイは二重反復実験で実施す
る。

【００４４】実施例１０アッセイおよび結合の研究の結果ＢＨＫ細胞の高い親和性のレセプターへのｂＦＧＦの結
合に対するＭＫの作用は、ＭＫがｂＦＧＦの結合を０．
１μＭのＥＤ₅₀で抑制することを示す（図１）。ＭＫの
この抑制活性はＭＫの中のジサルファイド結合をＤＴＴ
（ジチオスレイトール）で還元することによって破壊さ
れる。この処理は多分ＭＫの適切なフォルディングを妨
害し、そしてヘパリン−セファロースに対するＭＫの親
和性をわずかに減少する。

【００４５】ＭＫに似て、ＰＦ４は投与量に依存する方
法で０．２５μＭのＥＤ₅₀でｂＦＧＦの結合を抑制す
る。この値はＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用する同様な実験
（Ｓａｔｏｅｔａｌ．、１９９０）において得られ
たデータから推定されるものと同一である。

【００４６】ＭＫは投与量に依存する方法でｂＦＧＦの
存在におけるより２倍高いＥＤ₅₀でＡＢＡＥ細胞の基底
およびｂＦＧＦ刺激の成長を抑制する（ｂＦＧＦの不存
在下に約０．０８μＭ、およびｂＦＧＦの存在下に約
０．１８μＭ、図２Ａ）。細胞の成長は０．２μＭ以上
のＭＫの濃度においてほとんど完全に抑制される。しか
しながら、細胞の数は一定に止まり、そして０．３７μ
ＭのＭＫの投与量で脱離した細胞は現れない（図２
Ｂ）。ヒトＰＦ４は、また、投与量に依存する方法で
０．０４μＭのＥＤ₅₀でｂＦＧＦ誘導ＡＢＡＥ細胞の成
長を抑制する。高い濃度のＰＦ４はＡＢＡＥ細胞の成長
を抑制するばかりでなく、かつまたプレートからの可視
の脱離を引き起こす。

【００４７】ＭＫは、また、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎ
ｇ／ｍｌのｂＦＧＦ濃度でヒト一次内皮細胞（ＨＵＶＥ
細胞）のｂＦＧＦ刺激成長を抑制する。ＨＵＶＥ細胞の
ｂＦＧＦ誘導成長は、投与量に依存する方法で両者のｂ
ＦＧＦの濃度において同様なＥＤ₅₀値でＭＫにより抑制
される。高い濃度（０．２μＭ以上）のＭＫは、１ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦにおけるより１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧ
Ｆにおいて、より低い程度にＨＵＶＥ細胞の成長を抑制
する（図３）。

【００４８】ＭＫの抗増殖活性は、ハムスターＢＨＫ細
胞およびラットＰＣ１２細胞で観測されない。これらの
タンパク質は、また、２つの非内皮ヒト細胞系の成長に
影響を与えない：正常ヒト包皮線維芽（ＨＦＳＦ）およ
び高度に悪性の骨髄腫細胞系。両者の細胞系では、０．
５μＭのＭＫはｂＦＧＦ独立の細胞の成長に影響を与え
ない（ヒト包皮線維芽のためのデータは図４に示されて
いる）。培地中の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在は、
線維芽の数の小さいが、有意の増加を生ずる（が、骨髄
腫細胞では生じない）。このｂＦＧＦ依存性作用は０．
７５μＭのＭＫの存在によりに影響を受けない（図
４）。

【００４９】いかなる理論にも拘束されたくないが、前
述のことを述べることができる。

【００５０】ＭＫ、ｂＦＧＦ、およびＰＦ４は異なるタ
ンパク質の族に属し、こうして高い親和性のｂＦＧＦの
レセプターへの結合についての直接の競争は起こらない
ように思われる。しかしながら、ＭＫ、ならびにＰＦ４
は低い親和性のｂＦＧＦレセプターの硫酸ヘパリン部分
に対する結合についてｂＦＧＦと競争することができ
る。前述したように、最近の発見は、低い親和性のレセ
プターへのｂＦＧＦの結合が高い親和性のレセプターに
結合することができるｂＦＧＦの「誘発された適合」の
コンフォメーションの発生に必要であることを示す（Ｙ
ａｙｏｎｅｔａｌ．、１９９１）。機能の研究は、ま
た、低い親和性のレセプターがｂＦＧＦ刺激された線維
芽の成長および筋芽細胞の分化に必要であることを示す
（Ｒａｐｒａｅｇｅｒｅｔａｌ．、１９９１）。こ
うして、上の提案するモデルに従い、ＭＫおよびＰＦ４
による低い親和性のレセプターの占有は高い親和性のレ
セプターに結合することができるｂＦＧＦ分子の番号を
減少することが期待される。

【００５１】細胞の硫酸ヘパリンプロテオグリカンに対
するＭＫの親和性は知られていない。ウシ内皮細胞の硫
酸ヘパリンプロテオグリカンに対するヒトＰＦ４の親和
性は最近特性決定された（Ｋｄ＝２．８７μＭ、Ｒｙｂ
ａｋｅｔａｌ．、１９８９）。ＭＫおよびＰＦ４は
硫酸ヘパリンに対して同様な親和性を有する場合、サブ
マイクロモルのこれらのタンパク質がｂＦＧＦのための
低い親和性のレセプターを飽和するマイクロモルを期待
することができる。ＥＤ₅₀により判定して、組み換えＭ
Ｋが、高い親和性のＢＨＫ細胞のレセプターへのｂＦＧ
Ｆの結合の抑制において、ヒト血小板誘導ＰＦ４より２
〜５倍多い効力を有することは注目に値する。

【００５２】そのうえ、ヒト内皮細胞についてのミトゲ
ンのアッセイにおいて得られたＥＤ₅₀を組み換えＰＦ４
（Ｍａｉｏｎｅｅｔａｌ．、１９９０）および組み
換えＭＫと比較すると、実証されるように、後者のタン
パク質は５〜１０倍多い効力を有する。この差は高い濃
度におけるいくつかのヘパリン結合性タンパク質の細胞
毒性にかんがみると重要であることがある（Ｄａｕｃｈ
ｅｌｅｔａｌ．、１９８９）。

【００５３】ウシＡＢＡＥ細胞を使用して得られた結果
が示すように、高い濃度のＭＫ（０．７５μＭまで）は
細胞の成長を抑制するが、細胞の脱離を引き起こさな
い。対照的に、高い濃度のＰＦ４（０．３μＭ以上）は
ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制しないばかりでなく、かつま
た細胞の脱離を引き起こす。ヒトＨＵＶＥ細胞を使用す
る実験が示すように、高い濃度のＭＫを使用して観測さ
れる作用はｂＦＧＦの濃度を増加することによって消す
ことができる。ＭＫは内皮細胞に影響を与えるばかりで
なく、かつまたヒト線維芽、ヒト骨髄腫、ラットＰＣ１
２およびハムスターＢＨＫ細胞に影響を与えることは重
要である。

【００５４】これらの発見にかんがみて、抑制の追加の
「細胞仲介」メカニズムは内皮細胞に対して向けられた
ヘパリン結合性タンパク質の抗増殖活性に関係すること
を示唆される。ＭＫの抑制作用はＭＫの異なる濃度にお
いて同様なＥＤ₅₀を有し、レセプターに対する直接の競
争は唯一の因子でないことを示唆する。同様に、マイオ
ン（Ｍａｉｏｎｅ）ら（１９９１）が発見したように、
ＰＦ４の組み換え突然変異体はヘパリンに対する親和性
を欠如するが、それは生体内において効力のあるアンギ
オスタティック活性（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃａｃｔ
ｉｖｉｔｙ）をなお保持し、そして試験管内においてヒ
ト内皮細胞の増殖を抑制した。

【００５５】生物学的物質の寄託ｐＭＫＨＣ２を収容するＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｍ１０６１お
よびｐＥＴＭＨ２を収容するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２ＴのＬ
ｙｓＳは、アメリカン・サイアナミド・カンパニー（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐａｎｙ、
ニューヨーク州パールリバー）の菌株保存機関およびア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ、マリイランド州ロックビレ、パーク
ローンドライブ１２３０１）に、それぞれ、１９９０年
８月１３日に受け入れ番号ＡＴＣＣ６８３８４および１
９９０年９月１７日に受け入れ番号ＡＴＣＣ６８４０１
で受託され、そして米国および他の国々における特許の
ための適当な法的基準に従い公衆に入手可能である。

【００５６】引用文献１、バイアード（Ｂａｉｒｄ）、Ａ．およびボーレン
（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．（１９９０）線維芽の成長因
子。ペプチドの成長因子およびそれらのレセプター１。
［スポーン（Ｓｐｏｒｎ）、Ｍ．Ｂ．およびロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ａ．Ｂ．編］ｐｐ．３６９−４１
８。スプリング−フェルラーグ、ベルリン、ハイデルベ
ルグ。

【００５７】２、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．（１９８７）、ジャーナル・オブ・セルラー
・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１
３１：１２３−１３０。

【００５８】３、ルタ（Ｒｕｔａ）、Ｍ．、ホウク（Ｈ
ｏｗｋ）、Ｒ．、リッカ（Ｒｉｃｃａ）、Ｇ．、ドロハ
ン（Ｄｒｏｈａｎ）、Ｗ．、ザベルシャンスキー（Ｚａ
ｂｅｌｓｈａｎｓｋｙ）、Ｍ．、ラウレイス（Ｌａｕｒ
ｅｙｓ）、Ｇ．、バートン（Ｂａｒｔｏｎ）、Ｄ．
Ｅ．、フランケ（Ｆｒａｎｃｋｅ）、Ｕ．、シュレッシ
ンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ．およびギボ
ル（Ｇｉｖｏｌ）、Ｄ．（１９８８）オンコジーン（Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ）３：９−１５。

【００５９】４、クーグリン（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ）、
Ｓ．Ｒ．、バール（Ｂａｒｒ）、Ｐ．Ｇ．、クウセンス
（Ｃｏｕｓｅｎｓ）、Ｌ．Ｓ．、フレット（Ｆｒｅｔｔ
ｏ）、Ｌ．Ｊ．およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ）、Ｐ．Ｔ．（１９８８）生体内のキナーゼ活性。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６３：９２８−９３３。

【００６０】５、コルンブルッス（Ｋｏｒｎｂｌｕｔ
ｈ）、Ｓ．、パウルソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）、Ｋ．Ｓ．
およびハナフサ（Ｈａｎａｆｕｓａ）、Ｈ．（１９８
８）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、８：５５４１−５
５４４。

【００６１】６、リー（Ｌｅｅ）、Ｐ．Ｌ．、ジョンソ
ン（Ｊｏｎｓｏｎ）、Ｄ．Ｅ．、クウセンス（Ｃｏｕｓ
ｅｎｓ）、Ｌ．Ｓ．、フライド（Ｆｒｉｅｄ）、Ｖ．
Ａ．およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、Ｌ．
Ｔ．（１９８９）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４
５：５７−６０。

【００６２】７、パスクアレ（Ｐａｓｑｕａｌｅ）、
Ｅ．Ｂ．およびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、Ｓ．Ｊ．
（１９８９）プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８：５４４９−５４
５３。

【００６３】８、サフラン（Ｓａｆｒａｎ）、Ａ．、ア
ビビ（Ａｖｉｖｉ）、Ａ．、オル−ウルテレゲル（Ｏｒ
ｒ−Ｕｒｔｅｒｅｇｅ）、Ａ．、ネウフェルド（Ｎｅｕ
ｆｅｌｄ）、Ｇ．、ロナイ（Ｌｏｎａｉ）、Ｐ．、ギボ
ル（Ｇｉｖｏｌ）、Ｄ．およびヤーデン（Ｙａｒｄｅ
ｎ）、Ｙ．（１９９０）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ）５：６３５−６４３。

【００６４】９、キーフェル（Ｋｉｅｆｅｒ）、Ｍ．
Ｃ．、ステファンス（Ｓｔｅｐｈａｎｓ）、Ｊ．Ｃ、ク
ラウフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、Ｋ．、オキノ（Ｏ
ｋｉｎｏ）、Ｋ．およびバール（Ｂａｒｒ）、Ｐ．Ｊ．
（１９９０）プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８７：６９８５−６
９８９。

【００６５】１０、ヴロダヴスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋ
ｙ）、Ｉ．、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｊ．、
スリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）、Ｒ．、フレイドマ（Ｆ
ｒｅｉｄｍａｎ）、イシャイ−ミカエリ（Ｉｓｈａｉ−
Ｍｉｃｈａｅｌｉ）、Ｒ．、サッセ（Ｓａｓｓｅ）およ
びクルグスブルン（Ｋｌｕｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．（１９
８７）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：２２９２−２２９６。

【００６６】１１、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バク
テリオロジー（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．）、１０７：
７５３−７５９。

【００６７】１２、バシュキン（Ｂａｓｈｋｉｎ）、
Ｐ．、ドクトロウ（Ｄｏｃｔｒｏｗ）、Ｓ．、スバーン
（Ｓｖａｈｎ）、Ｃ．Ｍ．、フォークマン（Ｆｏｌｋｍ
ａｎ）、Ｊ．およびブロダブスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋ
ｙ）、Ｉ．（１９８９）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８、１７３７−１７４３。

【００６８】１３、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、
Ｊ．、クラグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．、
サッセ（Ｓａｓｓｅ）、Ｊ．、ワドジンスキー（Ｗａｄ
ｚｉｎｓｋｉ）、Ｍ．、イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ）、
Ｄ．およびブロダブスキイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ）、
Ｉ．（１９８８）ジャーナル・オブ・セル・バクテリオ
ロジー（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．）、ジャーナル・オ
ブ・パソロジー（Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１３０：３９３
−４００。

【００６９】１４、ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）、Ａ．、クラ
グスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、Ｍ．、エスコ（Ｅ
ｓｋｏ）、Ｊ．Ｄ．、レダー（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐ．およ
びオルニツ（Ｏｒｎｉｔｚ）、Ｄ．Ｍ．（１９９１）細
胞（Ｃｅｌｌ）、６４：８４１−８４８。

【００７０】１５、タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｓ．お
よびフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、Ｌ．（１９８
２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９７：３０７−３１
２。

【００７１】１６、サトウ（Ｓａｔｏ）、Ｙ．、アベ
（Ａｂｅ）およびタカキ（Ｔａｋａｋｉ）、Ｒ．（１９
９０）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１７２：５９５−６０
０。

【００７２】１７、シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．
Ｊ．、バイアー（Ｂｙｅｒｓ）、Ｈ．Ｒ．、スコット
（Ｓｃｏｔｔ）、Ｃ．Ｆ．、バウエル（Ｂａｕｅｒ）、
Ｓ．Ｉ．およびマイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．Ｅ．
（１９９０）ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサ
ー・インスチチュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．）８２：８４８−８５３。

【００７３】１８、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．、グレイ（Ｇｒａｙ）、Ｇ．Ｓ．、ペトロ（Ｐｅｔ
ｒｏ）、Ｊ．、ハント（Ｈｕｎｔ）、Ａ．Ｔ．、ドナー
（Ｄｏｎｎｅｒ）、Ａ．Ｌ．、バウエル（Ｂａｕｅ
ｒ）、Ｓ．Ｉ．、カーソン（Ｃａｒｓｏｎ）、Ｈ．Ｆ．
およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．Ｇ．（１９９
０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシントンＤＣ）
２４７：７７−７９。

【００７４】１９、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．、グレイ（Ｇｒａｙ）、Ｇ．Ｓ．、ハント（Ｈｕｎ
ｔ）、Ａ．Ｌ．およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．
Ｊ．（１９９１）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）５１：２０７７−２０８３。

【００７５】２０、クレトシュマー（Ｋｒｅｔｓｃｈｍ
ｅｒ）、Ｐ．Ｊ．、ファイアハースト（Ｆａｉｒｈｕｒ
ｓｔ）、Ｊ．Ｌ．、デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、Ｍ．
Ｍ．、チャン（Ｃｈａｎ）、Ｃ．Ｐ．、グルズマン（Ｇ
ｌｕｚａｍａｎ）、Ｙ．、ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、
Ｐ．およびコベスジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ）、Ｉ．（１９９
１）成長因子（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ）５：９
９−１１４。

【００７６】２１、フェイファー（Ｆａｆｅｕｒ）、
Ｖ．、ターマン（Ｔｅｒｍａｎ）、Ｂ．Ｉ．、ブラム
（Ｂｌｕｍ）、Ｊ．およびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、
Ｐ．（１９９０）成長因子（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏ
ｒｓ）３：２３７−２４５。

【００７７】２２、ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）、Ｅ．
Ａ．（１９８４）内皮細胞の生物学における大きい血管
の内皮細胞の培養および同定（Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｒｇｅｖ
ｅｓｓｌｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌｃｅｌｌｓｉｎ
ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＥｎｄｏｔｈｅｒｉａｌＣ
ｅｌｌｓ）［ジャッフェ（Ｊａｆｆｅ）、Ｊ．Ａ．
編］、Ｍａｒｔｉｎｕｓ−Ｎｉｊｈｏｆｆ、ニューヨー
ク。

【００７８】２３、ゴスポドロウィクズ（Ｇｏｓｐｏｄ
ａｒｏｗｉｃｚ）、Ａ．、チェング（Ｃｈｅｎｇ）、
Ｊ．、ルイ（Ｌｕｉ）、Ｇ．Ｍ．、Ｄ．、バイルド（Ｂ
ａｉｒｄ）およびＰ．ボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）（１９
８４）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８１：６９６３−６９６７。

【００７９】２４、モソカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌ
ｉ）、Ｄ．、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｍ．、ジョセ
フ−シルベルステイン（Ｊｏｓｅｐｈ−Ｓｉｌｖｅｒｓ
ｔｅｉｎ）、Ｊ．およびリフキン（Ｒｉｆｋｉｎ）、
Ｄ．Ｂ．（１９８６）ジャーナル・オブ・セルラー・バ
イオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）１２
９：２７３−２７６。

【００８０】２５、ハンナン（Ｈａｎｎａｎ）、Ｒ．
Ｌ．、コウレンバナス（Ｋｏｕｒｅｍｂａｎａｓ）、
Ｓ．、フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）、Ｋ．Ｃ．、
ロゲルジ（Ｒｏｇｅｌｊ）、Ｍ．（１９８７）成長因子
（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ）１：７−１７。

【００８１】２６、サトウ（Ｓａｔｏ）、Ｙ．およびリ
フキン（Ｒｉｆｋｉｎ）、Ｄ．Ｂ．（１９８８）ジャー
ナル・オブ・セル・バクテリオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．）、１０７：１１９９−１２０５。

【００８２】２７、マイオン（Ｍａｉｏｎｅ）、Ｔ．
Ｅ．およびシャーペ（Ｓｈａｒｐｅ）、Ｒ．Ｊ．（１９
９０）ＴＩＢＳ１１：４５７−４６１。

【００８３】２８、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、
Ｊ．およびクラスグブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、
Ｍ．（１９８７）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシ
ントンＤＣ）２３５：４４２−４４７。

【００８４】２９、セッドン（Ｓｅｄｄｏｎ）、Ａ．、
デッカー（Ｄｅｃｋｅｒ）、ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ）、
Ｔ．、アーメリノ（Ａｒｍｅｌｌｉｎｏ）、Ｄ．、コベ
スジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ）、Ｉ．、グルズマン（Ｇｌｕｚ
ｍａｎ）、Ｙ．およびボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）、Ｐ．
（１９９１）アナルス・オブ・ニューヨーク・アカデミ
イ・オブ・サイエンシズ（ＡｎｎａｌｓＮｅｗＹｏ
ｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．）（印刷中）。

【００８５】３０、ダウチェル（Ｄａｕｃｈｅｌ）、
Ｍ．Ｃ．、コーティ（Ｃｏｕｒｔｙ）、Ｊ．、メレアウ
（Ｍｅｒｅａｕ）、Ａ．およびバリタウルト（Ｂａｒｒ
ｉｔａｕｌｔ）、Ｄ．（１９８９）ジャーナル・オブ・
セルラー・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．）３９：４１１−４２０。

【００８６】３１、ラプレガー（Ｒａｐｒａｅｇｅ
ｒ）、Ａ．Ｃ．、クルフカ（Ｋｒｕｆｋａ）、Ａ．およ
びオルウィン（Ｏｌｗｉｎ）、Ｂ．Ｂ．（１９９１）サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ワシンタンＣＤ）２５
２：１７０５−１７０８。

【００８７】３２、リバク（Ｒｙｂａｋ）、Ｍ．Ｅ．、
ギムロン（Ｇｉｍｒｏｎｅ）、Ｊｒ．、Ｍ．Ａ．、デイ
ビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）、Ｐ．Ｆ．およびハンジン（Ｈ
ａｎｄｉｎ）、Ｒ．Ｉ．（１９８９）ブラッド（Ｂｌｏ
ｏｄ）、７３：１５３４−１５３９。

【００８８】３３、ワナカ（Ｗａｎａｋａ）、Ａ．、ミ
ルブラント（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ）、Ｊ．およびジョン
ソン（Ｊｏｈｓｏｎ）、Ｅ．Ｍ．（１９９１）ディブロ
プメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１１１：４５５−
４６８。

【００８９】３４、ゴスポダロウィクズ（Ｇｏｓｐｏｄ
ａｒｏｗｉｃｚ）、Ｄ．（１９７５）バイオロジカル・
ケミストリー（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）２５０：２５１５−２５２０、１９７５。

【００９０】３５、レイボロチ（Ｌｅｉｂｒｏｃｈ）ら
（１９８９）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４１：１４
９−１５３。

【００９１】３６、マイソンピエレ（Ｍａｉｓｏｎｐｉ
ｅｒｒｅ）ら（１９９０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２４７：１４４６。

【００９２】３７、リン（Ｌｉｎ）ら（１９８０）サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４６：１０２３−１０２
５。

【００９３】３８、ミル（Ｍｉｌｌ）ら（１９８５）Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ８２：７１２６−７１３０。

【００９４】３９、シュバート（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）ら
（１９９０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４４：８６
８−８７０。

【００９５】４０、バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら（１９
８７）細胞（Ｃｅｌｌ）５１：１３５−１４２。

【００９６】４１、ボーレン（ｂｏｈｌｅｎ）ら（１９
８４）ＰＮＡＳＵＳＡ８１：５３６４−５３６８。

【００９７】４２、エシュ（Ｅｓｃｈ）ら（１９８５）
ＰＮＡＳＵＳＡ８２：６５０７−６５１１。

【００９８】４３、ボーレン（ｂｏｈｌｅｎ）ら（１９
８５）ＥｍｂｏＪ．４：１９５１−１９５６。

【００９９】４４、ギメンズ（Ｇｉｍｅｎｅｚ）−ガレ
ゴ（Ｇａｌｌｅｇｏ）ら（１９８５）サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２３０：１３８５−１２８８。

【０１００】４５、ディケンス（Ｄｉｃｋｅｎｓ）およ
びペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）（１９８４）ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）３２６：８３３。

【０１０１】４６、デリ・ボビ（ＤｅｌｌｉＢｏｖ
ｉ）ら（１９８７）細胞（Ｃｅｌｌ）５０：７２９−７
３７。

【０１０２】４７、ザーン（Ｚｈａｎ）ら（１９８８）
セル・バイオロジー（ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）８：
３４８７−３４９５。

【０１０３】４８、マリクス（Ｍａｒｉｃｓ）ら（１９
８９）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）４：３３５−
３４０。

【０１０４】４９、フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）ら（１９８
９）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５：７５２−７
５５。

【０１０５】５０、カドマツ（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ）ら
（１９８８）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１５１：１３２
１−１３１８。

【０１０６】５１、ラウバラ（Ｒａｕｖａｌａ）（１９
８９）ＥＭＢＯＪ．８：２９３３−２９４１。

【０１０７】５２、フーバー（Ｈｕｂｅｒ）ら（１９９
０）ニューロケミカル・リサーチ（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）１５：４３５−４３９。

【０１０８】５３、ガウトシ−ソバ（Ｇａｕｔｓｃｈｉ
−Ｓｏｖａ）ら（１９８６）バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）
１４０：１８７４−１８８０。

【０１０９】５４、アビブ（Ａｖｉｖ）およびレダー
（Ｌｅｄｅｒ）（１９７２）ＰＮＡＳＵＳＡ６９：１
４０８８−１４１２０。

【０１１０】５５、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、（１９８２）分子クローニング：実験室のマニュア
ル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・
スプリング・ハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ）、ニューヨーク州。

【０１１１】５６、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９
８８）ＰＮＡＳＵＳＡ７４：５４６３−５４６７。

【０１１２】５７、ミルナー（Ｍｉｌｎｅｒ）ら（１９
８９）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１６５：１０９６−１
１０３。

【０１１３】５８、トモムラ（Ｔｏｍｏｍｕｒａ）ら
（１９９０）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６５：１０７
６５−１０７７０。

【０１１４】５９、コドマツ（Ｋｏｄｏｍａｔｓｕ）ら
（１９９０）ジャーナル・オブ・セル・バクテリオロジ
ー（Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．）１１０：６０７−６１
６。６０、ボン・ヘジネ（ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ）（１９８
５）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１８４：９９−１０５。

【０１１５】６１、ボン・ヘジネ（ＶｏｎＨｅｉｊｎ
ｅ）（１９８６）核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１４：４６８３−４６９０。

【０１１６】６２、レビ−モンタルシニ（Ｌｅｖｉ−Ｍ
ｏｎｔａｌｃｉｎｉ）Ｒ．およびハンバーガー（Ｈａｍ
ｂｕｒｇｅｒ）Ｖ．（１９５３）ジャーナル・オブ・イ
クスペリメンタル・ズーオロジー（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏ
ｌ．）１２３：２３３−２７８。

【０１１７】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【０１１８】１、細胞成長抑制量のＭＫタンパク質、ア
ルキル化ＭＫタンパク質またはそれらの組み合わせを動
物に投与することからなる細胞の成長を抑制する方法。

【０１１９】２、前記ＭＫタンパク質が、ヒトＭＫ、ウ
シＭＫ、ヒツジＭＫ、イヌＭＫ、ブタＭＫ、ネコＭＫ、
ウマＭＫ、トリＭＫタンパク質、サカナＭＫタンパク質
またはそれらのアルキル化された形態である上記第１項
記載の方法。

【０１２０】３、脈管形成コントロール量のＭＫタンパ
ク質、アルキル化ＭＫタンパク質またはそれらの組み合
わせを動物に投与することからなる動物における脈管形
成をコントロールる方法。

【０１２１】４、前記ＭＫタンパク質が、ヒトＭＫ、ウ
シＭＫ、ヒツジＭＫ、イヌＭＫ、ブタＭＫ、ネコＭＫ、
ウマＭＫ、トリＭＫ、サカナＭＫまたはそれらのアルキ
ル化された形態である上記第３項記載の方法。

【０１２２】５、応答性細胞アッセイにおいてＭＫを利
用することからなる細胞成長抑制因子についてスクリー
ニングする方法。

【０１２３】６、手術後の出血をコントロールする量の
ＭＫを人間または温血動物に投与することからなる手術
後の出血をコントロールする方法。

【０１２４】７、前記ＭＫがヒトＭＫである上記第６項
記載の方法。

【０１２５】８、ＭＫタンパク質、アルキル化ＭＫタン
パク質またはそれらの組み合わせを動物に投与すること
からなる腫瘍の成長を抑制する方法。

【０１２６】９、前記ＭＫタンパク質が、ヒトＭＫ、ウ
シＭＫ、ヒツジＭＫ、イヌＭＫ、ブタＭＫ、ネコＭＫ、
ウマＭＫ、トリＭＫタンパク質、サカナＭＫタンパク質
またはそれらのアルキル化された形態である上記第８項
記載の方法。

【０１２７】１０、前記動物がヒトである上記第９項記
載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＨＫ細胞の高い親和性のレセプターに結合す
るｂＦＧＦへのＭＫの作用を示すグラフ。アッセイは実
施例８に記載されている。

【図２】ウシＡＢＡＥ細胞の成長へのＭＫの作用を示す
グラフ。アッセイは実施例６に記載されている。パネル
Ａ：ＭＫは基底（●）およびｂＦＧＦ刺激（▲）（１ｎ
ｇ／ｍｌ）ＡＢＡＥ細胞の成長を抑制する、ＥＤ₅₀＝
０．０４μＭ。パネルＢ：０．３７μＭはＡＢＡＥ細胞
の脱離を引き起こない。全面成長以下のＡＢＡＥ細胞を
０．３７μＭのＭＫに４日間暴露し、その間に細胞の可
視の脱離は起こらない。「開始」はＭＫの添加前のプレ
ートを意味する；「対照」はＭＫで処理しないプレート
を意味する；「ＭＫ」はＭＫで処理したプレートを意味
する。アッセイは二重反復実験である。

【図３】ヒトＨＵＶＥ細胞の成長へのＭＫの作用を示す
グラフ。●−培地中の１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ；▲−培
地中の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。アッセイは実施例９
に記載されている。

【図４】ヒト包皮線維芽の成長への０．７５μＭのＭＫ
の作用を示すグラフ。白抜きバー−ｂＦＧＦなし、クロ
ーズドバー−培地中の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。「対
照」−未処理細胞を意味する；「ＭＫ」は０．７５μＭ
のＭＫで４日間処理した。アッセイは実施例９に記載さ
れている。

【図５】ヒトおよびマウスのＭＫのヌクレオチド配列お
よび推定されたアミノ酸配列を示す図。２つのヌクレオ
チド配列の差は星印（＊）により示す。アミノ酸の差は
肉太の文字で示す。マウスのゲノムのＰＣＲプライマー
の設計において使用したアミノ酸には下線を引いてあ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞成長抑制量のＭＫタンパク質、アル
キル化ＭＫタンパク質またはそれらの組み合わせを動物
に投与することを特徴とする細胞の成長を抑制する方
法。
【請求項２】脈管形成コントロール量のＭＫタンパク
質、アルキル化ＭＫタンパク質またはそれらの組み合わ
せを動物に投与することを特徴とする動物における脈管
形成をコントロールる方法。
【請求項３】応答性細胞アッセイにおいてＭＫを利用
することを特徴とする細胞成長抑制因子についてスクリ
ーニングする方法。
【請求項４】手術後の出血をコントロールする量のＭ
Ｋを人間または温血動物に投与することを特徴とする手
術後の出血をコントロールする方法。
【請求項５】ＭＫタンパク質、アルキル化ＭＫタンパ
ク質またはそれらの組み合わせを動物に投与することを
特徴とする腫瘍の成長を抑制する方法。