JP3375997B2 - 血管内皮細胞増殖促進剤 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】 本発明は、特定のタンパク質か
らなる血管内皮細胞増殖促進剤および血管新生剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】血管を構成する主要な細胞は、内膜の血
管内皮細胞、中膜の平滑筋細胞、および外膜に存在する
繊維芽細胞である。また、末梢に存在する毛細血管は、
血管内皮細胞のみによって構成されていると考えられて
いる。血管新生の機序の詳細については不明な点が多い
が、まず血管壁マトリックスが溶解し、次に血管内皮細
胞の増殖、遊走が起って、血管新生が始まると考えられ
ている。

【０００３】血管新生は、新しい組織血管が形成される
胎生期、成体における子宮内膜の周期的発達、卵巣にお
ける黄体形成のような生理的現象や、慢性炎症、創傷治
癒などの病理的状態などで認められる。また、腫瘍細胞
の増殖の際にも血管新生が認められる。血管内壁を覆う
内皮細胞は、抗血栓性の維持、物質透過の調節、血圧調
節などの多くの生理的機能を有している。動脈硬化や心
筋梗塞などの血管が関与する疾患では、血管を構成する
これら諸細胞の異常が認められている。

【０００４】in vivoでの血管新生実験系、例えばニワ
トリ漿尿膜を用いた実験では、血管を新生する因子が数
多く知られている。タンパク質性因子で一般に知られて
いる血管新生因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ；basic Fibroblast Growth Factor）、上皮
細胞成長因子（ＥＧＦ；Epidermal Growth Factor）、
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；Platelet-derived Gro
wth Factor）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧ
Ｆ：Transforming Growth Factor）等がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】血管新生活性を有する
上記した従来の血管新生因子は、血管内皮細胞の増殖活
性を有するものの、その他の細胞に対しても強い増殖作
用を有することが知られており、例えばｂＦＧＦは繊維
芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞など種々の細胞の増殖を
刺激する。このように種々の細胞に対して幅広い増殖作
用を有する従来の因子は、血管の新生を促進するが、同
時に他の細胞をも増殖させ、血管の新生のみを選択的に
行うことができず、該因子を用いることにより副作用を
生ずる恐れがあるという問題がある。

【０００６】したがって、本発明の課題は、上記した従
来技術の問題点を解決し、血管内皮細胞の増殖は促進す
るが、平滑筋細胞、繊維芽細胞、肝細胞などの他の細胞
の増殖活性を全くもたないかまたはほとんどもたない、
純化された血管新生作用を有する因子を得ることであ
り、更にそのような純化された血管新生因子に基づく、
副作用の少ない医薬品や医療器を開発することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記のような目的のもと
に研究を行った結果、本発明者らはヒト卵巣腫瘍細胞お
よびヒト卵巣腫瘍樹立細胞であるＨＵＯＣＡ−IIおよび
ＨＵＯＣＡ−IIIの産生物が、血管内皮細胞に対して選
択的な増殖活性作用を有することを見いだして先に出願
した(特開平２−２６１３７５号公報、特開平２−２６
２５２３号公報、特開平３−８４０００号公報)。

【０００８】そして研究を進めて、上記のＨＵＯＣＡ−
IIおよびＨＵＯＣＡ−IIIの無血清培養上清を用いて特
定の精製処理を行ったところ、血管内皮細胞の増殖は強
く促進するが、平滑筋細胞、繊維芽細胞、肝細胞などの
他の細胞の増殖活性を示さないという上記した望ましい
特性を有する高純度の特定のタンパク質を得ることがで
きた。

【０００９】更に研究を進めて上記のＨＵＯＣＡ−IIお
よびＨＵＯＣＡ−IIIの細胞からＲＮＡを単離し、その
遺伝子をクローニングした。そして、その遺伝子（ＤＮ
Ａ）における塩基配列を決定したところ、配列番号２で
表される塩基配列を有することが明らかになり、その塩
基配列から上記のタンパク質が配列番号１で表されるア
ミノ酸配列であることが推定された。

【００１０】 すなわち、本発明は、配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有する一本鎖タンパク質からなるこ
とを特徴とする血管内皮細胞増殖促進剤である。

【００１１】 さらに、本発明は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列を有する一本鎖タンパク質からなること
を特徴とする血管新生剤である。

【００１２】配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列はそ
の上流側にシグナル配列等を含んでおり、該シグナル配
列は他の適当なシグナル配列等により適宜置き換えるこ
とができ、更に必要に応じてシグナル配列の直下にはリ
ンカー配列を加えることができる。配列番号２で表され
るＤＮＡ塩基配列からは、配列番号１で表されるアミノ
酸配列を有するタンパク質がコードされ、したがって本
発明のタンパク質はシグナル塩基配列等によりコードさ
れる他のアミノ酸配列に置換可能なアミノ酸配列部分を
も含めて、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する
ものと推定される。

【００１３】 本発明の血管内皮細胞増殖促進剤および
血管新生剤に用いる配列番号１で表されるアミノ酸配列
を有するタンパク質（以下このタンパク質を「本発明の
タンパク質」ということがある）は、ヒト卵巣腫瘍細胞
またはヒト卵巣腫瘍樹立細胞であるＨＵＯＣＡ−IIおよ
び／またはＨＵＯＣＡ−IIIの無血清培養上清を、順
に、（ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｂ）ヘ
パリンアフィニティークロマトグラフィー、（ｃ）ヘパ
リンアフィニティー高速液体クロマトグラフィーおよび
（ｄ）逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製処
理することにより製造することができる。

【００１４】また、本発明のタンパク質は上記〜の
有効な生理活性を有しているので、この本発明のタンパ
ク質から該〜の生理活性を有する生理活性因子製剤
を製造することができ、したがってかかる生理活性因子
製剤も本発明にとって重要であり、本発明の範囲に包含
し得る。そしてその場合に、配列番号２で表される塩基
配列を有する上記のＤＮＡをベクター（プラスミドな
ど）に挿入し、これを宿主細胞中に挿入して増殖させる
と、配列番号１で表される有用なタンパク質を大量に得
ることができ、したがって本発明では、配列番号２で表
される塩基配列をベクターに挿入したＤＮＡ組み換ベク
ターも有用である。また、かかるベクターを導入した組
み換え体も有用である。

【００１５】上記のＨＵＯＣＡ−IIおよびＨＵＯＣＡ−
IIIは、本発明者らによって通商産業省工業技術研究所
に、平成元年３月１日に、受託番号微工研条寄第２３１
０号および第２３１１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３１１）
として寄託されている。該ＨＵＯＣＡ−IIおよびＨＵＯ
ＣＡ−IIIの培養、それらの無血清培養上清の取得は、
通常の方法により行うことができるが、本発明者らによ
る上記した特開平２−２６１３７５号公報、特開平２−
２６２５２３号公報および特開平３−８４０００号公報
に詳しい。

【００１６】そして本発明のタンパク質は、その分子中
に配列番号３で表されるペプチド鎖（配列番号１におけ
る３６番〜４２番のアミノ酸配列）、配列番号４で表さ
れるペプチド鎖（配列番号１における１１１番〜１２０
番のアミノ酸配列）および配列番号５で表されるペプチ
ド鎖（配列番号１における５２６番〜５４１番のアミノ
酸配列）を結合含有しており、後記するように、これら
の配列番号３〜配列番号５で表されるペプチド鎖を手掛
かりにして、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡの塩基配列が決定され、本発明のタンパク
質のアミノ酸配列の概要が決められる。

【００１７】本発明のタンパク質は、ヒト卵巣腫瘍細胞
またはヒト卵巣腫瘍樹立細胞であるＨＵＯＣＡ−IIおよ
び／またはＨＵＯＣＡ−IIIの無血清培養上清を、順
に、上記した工程（ａ）〜（ｄ）によって処理すること
により調製することができ、具体的には下記の工程
（ｉ）〜（iv）により好ましくは得ることができる。

【００１８】タンパク質の調製 （ｉ） ＨＵＯＣＡ−ＩＩおよび／またはＨＵＯＣＡ−
ＩＩＩの無血清培養上清を陽イオン交換カラム中のイオ
ン交換樹脂に吸着させる。その場合の陽イオン交換樹脂
としては、強イオン性または弱イオン性の陽イオン交換
樹脂のいずれでもよく、Ｓ−セファロースを使用するの
が好ましい。陽イオン交換カラムに吸着された画分を緩
衝液で洗浄し、次に１５０ｍＭ ＮａＣｌと２Ｍ ＮａＣ
ｌとをそれぞれ含む緩衝液でのリニアグラジエントによ
り血管内皮細胞増殖促進活性画分を溶出させる［工程
（ａ）］； （ii） 上記の（ｉ）で溶出した活性画分を１５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む上記と同様の緩衝液で２〜３倍程度に
希釈したものを、ヘパリンセファロースカラムに吸着さ
せ、０.５Ｍ ＮａＣｌを含む同様の緩衝液で洗浄し、次
いで０.５Ｍ ＮａＣｌと２Ｍ ＮａＣｌとをそれぞれ含
む緩衝液とのリニアグラジエントで血管内皮細胞増殖促
進活性画分を溶出させる［工程（ｂ）］； （iii） 上記（ii）で溶出した活性画分を上記と同様に
して希釈して、高速液体クロマトグラフィー用ヘパリン
カラムに吸着させ、上記と同様にして血管内皮細胞増殖
促進活性画分を溶出させる［工程（ｃ）］；そして、 （iv） 上記(iii)で溶出した活性画分を逆相高速液体
クロマトグラフィー用のカラムにかけて、血管内皮細胞
増殖促進活性作用を有するタンパク質である純化された
生成物を得る［工程（ｄ）］。

【００１９】上記のタンパク質の調製工程で使用する緩
衝液としては、リン酸緩衝液等の通常使用される緩衝液
のいずれでもよく、またヘパリンの担体としてはセファ
ロースやその他の汎用の担体のいずれもが使用できる。

【００２０】そして、上記で得られた純化された生成物
に関して、タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分子量測定法を採用して、その分子量を
測定した。すなわち、１０％のポリアクリルアミドゲル
を用いて、Lammeliらの方法［Lammeli et al.,Nature,
277, 680-685(1970)］に従って行った。泳動後、ゲルを
５０％エタノール、４０％酢酸で３０分間固化し、１０
％エタノール、５％酢酸で洗浄後、銀染色を行った。本
発明のタンパク質は単一のバンドとして染色され、その
分子量マーカーとの相対移動度より、分子量約７２，０
００〜８０，０００ダルトンと推定された。また、還元
条件下では、試料に５％となるように２−メルカプトエ
タノールを加えて、９５℃で１０分間熱処理した後、非
還元条件下と同様の方法で実施した。還元条件下では、
タンパク質の分子量は約７９，０００〜８５，０００ダ
ルトンと推定された。

【００２１】そして、上記で得られた純化された生成物
がタンパク質に糖鎖が結合している糖タンパク質である
ことが、（イ）該純化された生成物を糖鎖分解酵素であ
るＮ−グリカナーゼと反応させて得た生成物を０．１％
ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析したところ、該生成物に処理前に比べて糖鎖の切断
によると考えられる分子量低下があったことが泳動パタ
ーンに示されたこと、（ロ）該純化された生成物がコン
カナバリンＡに親和性を示すこと、から確認され、した
がって上記の電気泳動法により測定されたタンパク質の
分子量は、結合した糖部分を含む糖タンパク質としての
分子量であると推定される。

【００２２】また、本発明のタンパク質におけるタンパ
ク質部分が一本鎖タンパク質からなっていることは、該
純化された生成物の０．１％ＳＤＳを含む１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分析によって、還元条
件下で単一のバンドを示したことから確認された。

【００２３】そして、上記で得たタンパク質のアミノ酸
配列の決定は、タンパク質のアミノ酸配列の決定に際し
て通常使用されているいずれの方法を採用して行っても
よいが、ここでは該タンパク質をコードするＤＮＡの塩
基配列をまず決定し、それに基づいてタンパク質のアミ
ノ酸配列を決定する下記の方法を採用して行った。

【００２４】《ＤＮＡの塩基配列およびタンパク質のア
ミノ酸配列の決定》 （１）還元カルボキシメチル化；上記した工程（iv）に
おける逆相高速液体クロマトグラフィーで精製分離され
たサンプルをコンセントレーターで濃縮し、８Ｍ 尿素
／０.５Ｍ Tris／１ｍＭＥＤＴＡで溶出し、終濃度２０
ｍＭとなるようにジチオスレイトールを加え、窒素置換
して室温暗所で２時間還元反応を行った。次に、終濃度
２０ｍＭとなるようにモノヨード酢酸を加え室温暗所で
３０分間アルキル化反応を行った；

【００２５】（２）リシルエンドペプターゼによる切
断；上記（１）で得られた還元アルキル化物に２−メル
カプトエタノールを加え、次いで０.１Ｎ ＮａＯＨを加
えてｐＨを８.５に調製した。リシルエンドペプチター
ゼ（和光純薬社製）を基質の１／１０量加えて３７℃で
４時間酵素分解反応を行った；

【００２６】（３）ペプチド断片の分画とアミノ酸配列
の決定；上記（２）で得た還元アルキル化ペプチド断片
をＲＰ３００カラム（アプライドバイオシステムズ社
製）を用いた逆相高速クロマトグラフィーで分離した。
溶出は、０.１％ＴＦＡ存在下、アセトニトリル濃度を
０％から６０％まで直線的に上昇させて溶出させること
により行った。該溶出処理により得られたペプチド断片
を、気相式シーケンサー（アプライドバイオシステムズ
社製；４７７Ａ型）でEdman分解を行い、得られたＰＴ
Ｈ−アミノ酸をＰＴＨ−アミノ酸同定用高速液体クロマ
トグラフィー（アプライドバイオシステムズ社製；１２
０Ａ型）で同定した。その結果、本発明のタンパク質に
は、配列番号３、配列番号４および配列番号５で表され
るペプチド鎖の３者が含まれていることが確認された。

【００２７】（４） 配列番号３〜配列番号５で表され
るこれらのアミノ酸配列は、ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨ
ＧＦ）［中村，Nature 342，440−443(1989)］における
ものとよく一致している。そのため本発明の因子はｈＨ
ＧＦの類似タンパクであると考えられるので、ｈＨＧＦ
のＤＮＡの塩基配列を基にして、本発明のタンパク質の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、
それに基づいて本発明のタンパク質のアミノ酸配列を次
の（５）のようにして決定した。

【００２８】（５）(ｉ)Polymerase Chain Reaction
（ＰＣＲ）用のプライマーの合成；ｈＨＧＦファミリー
に関しては、数種類のｃＤＮＡの塩基配列が報告されて
おり［Nature 342，440−443(1989);宮沢，Biological
and Biophysical ResearchCommunication 163，967−97
3(1989)]、そこでこれらの５'，３'非翻訳領域の共通塩
基配列を基にしてＰＣＲ用のプライマーを合成した。す
なわち、翻訳領域の５’末端（翻訳開始点）から４７〜
８２番目の上流の塩基を含む領域（５’プライマー）
と、３’末端側の終止コドンから下流に１〜３７番目の
塩基を含む領域（３’プライマー）を基に、それぞれの
プライマーを合成した。

【００２９】(ii)ｃＤＮＡの合成；ヒト卵巣腫瘍由来細
胞ＨＵＯＣＡ−IIIからＳＤＳ・フェノール法によりＲ
ＮＡを調製し、このＲＮＡを鋳型としてM−MLV 逆転写
酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。

【００３０】(iii)ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅；上記
（ｉ）で合成したＰＣＲ用のプライマーを用いて、上記
（ii）で合成したｃＤＮＡの増幅を行って、ＰＣＲ産物
を得た。

【００３１】(iv)ＰＣＲ産物の解析；上記(iii)で得ら
れたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動より解析した
結果、約２.３ＫｂのＤＮＡ断片が１本だけ確認され
た。現在知られているｈＨＧＦファミリーの転写解読枠
は、約２．３Ｋｂであるから、このＤＮＡ断片が本発明
のタンパク質に対するｃＤＮＡであると考えられる。

【００３２】(ｖ)ＤＮＡ断片のクローン化および塩基配
列の決定；そこで、上記で得られたＤＮＡ断片をゲルか
ら精製し、ｐＵＣ１８プラスミドベクターに組み込んだ
後、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行ってクローン化
し、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。数クローンの
塩基配列を決定することによりＰＣＲ時の読み間違いを
補正し、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードす
るするＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号２
で表される塩基配列を有していた。

【００３３】(vi)タンパク質のアミノ酸配列の決定；上
記（ｖ）で決定されたＤＮＡの塩基配列は、配列番号６
に示すようなアミノ酸をコードしていると推定される。
したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、シ
グナル塩基配列等によってコードされる他のアミノ酸配
列に置換可能なアミノ酸配列部分をも含めて、配列番号
１で表されるアミノ酸配列を有するものと考えられる。

【００３４】上記において、本発明のタンパク質を得る
ための一例およびそのアミノ酸配列の決定方法について
説明したが、本発明のタンパク質の調製法は特に限定さ
れず、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列によりコー
ドされ且つ上記した〜の特性を有するタンパク質で
あれば、勿論その他の方法で製造したものであってもよ
い。

【００３５】本発明のタンパク質は、ヒトおよび種々の
動物の血管内皮細胞に対して増殖促進活性を有する一方
で、ヒトおよび種々の動物の繊維芽細胞、血管平滑筋細
胞および肝細胞に対しては増殖促進活性を示さず、更に
ＨｅＬａ細胞に対しては増殖促進活性および増殖抑制作
用を示さないので、血管内皮細胞の増殖を選択的に促進
することができ、その結果、副作用を起こすことなく血
管新生を円滑に進行させることができる。ここで、本発
明でいう「繊維芽細胞、血管平滑筋細胞および肝細胞に
対して増殖促進活性を示さず、更にＨｅＬａ細胞に対し
ては増殖促進活性および増殖抑制作用を示さない」と
は、繊維芽細胞、血管平滑筋細胞および肝細胞に対する
増殖促進活性並びにＨｅＬａ細胞に対する増殖促進活性
および増殖抑制作用を全く示さない場合、更には多少は
示すがその活性が血管内皮細胞に対する増殖促進活性に
比べて著しく低い場合を包含する。

【００３６】本発明のタンパク質の、血管内皮細胞、繊
維芽細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞およびＨｅＬａ細胞
に対する増殖促進活性の有無、並びにＨｅＬａ細胞に対
する増殖抑制作用の有無の測定は、具体的には後述の実
施例に記載した方法により行った。

【００３７】更に、本発明のタンパク質は、コンカナバ
リンＡに親和性を示す。本発明では、コンカナバリンＡ
に対する親和性は、具体的には次のようにして調べた。

【００３８】コンカナバリンＡに対する親和性試験 上記の純化された生成物（５００ｎｇ）をドットブロッ
ト装置（Bio−Rad社製「バイオドット」）を用いて、あ
らかじめ１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液／０.１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）に浸したニトロセルロース膜（Bio-
Rad社製）に吸着させた。風乾後、１０ｍＭ トリス緩衝
液／０.１５Ｍ ＮａＣｌ／０.０５％Tween（ｐＨ７．
５）で１０分間４回液を交換して洗浄した後、１％ＢＳ
Ａ（ウシ血清アルブミン）を含む同緩衝液に４℃で１時
間浸し、再び洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識化コンカナバリンＡ溶液（１０μ
ｇ／ｍｌ）に４℃で１時間浸し、再び洗浄後、３，３’
−ジアミノベンジジンを基質として、Ｈ₂Ｏ₂を加えてＨ
ＲＰを発色させ、コンカナバリンＡとの結合能を判定し
た。その結果、コントールでは無色であったのに対し
て、該生成物では茶褐色に発色し、染色が見られたとこ
ろから、該生成物はコンカナバリンＡに対して親和性を
もつことが確認された。

【００３９】本発明のタンパク質の上記した優れた血管
内皮細胞増殖促進活性、ひいてはその血管新生作用によ
り、該タンパク質を含む生理活性因子製剤は、創傷、火
傷、褥瘡、術後組織の治癒促進剤や心血管障害の治療薬
として、人工血管や人工皮膚等の人工臓器への応用面
で、さらには本発明のタンパク質に対する抗体および阻
害剤は、悪性腫瘍、網膜症、慢性関節リウマチの診断薬
や治療薬として有用である。

【００４０】そして、シグナル塩基配列等の置換可能な
塩基配列部分を含む、本発明のタンパク質のアミノ酸配
列をコードする配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ、
および該ＤＮＡを挿入したベクター（プラスミドなど）
やこのＤＮＡ挿入プラスミドを導入した組換体は、上記
した優れた特性を有する本発明のタンパク質の製造（大
量生産など）に極めて有効である。

【００４１】以下に実施例により、本発明のタンパク質
の調製法、分子量の測定、アミノ酸配列の決定、各種細
胞に対する活性の有無および糖鎖の有無、本発明のタン
パク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの調製、その
塩基配列の決定などについて具体的に説明するが、本発
明はそれらの例により限定されない。

【００４２】《実施例１》[タンパク質の調製、分子量
の測定およびアミノ酸配列の決定] （１） ＨＵＯＣＡ−ＩＩＩ無血清培養上清１０リット
ルに最終濃度０．０３％となるようにＣＨＡＰＳ（３−
［(３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ］−１−
プロパンスルホネート；（株）同人化学研究所）（販売
元：和光純薬）を加えた。ベット体積４０ｍｌのＳ−セ
ファロース Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）を
１０ｍＭ リン酸緩衝液／０.１５Ｍ ＮａＣｌ／０.０３
％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．２）からなる緩衝液で平衡化
し、無血清培養上清を４℃、流速２００ｍｌ／時で吸着
させた。上記の０.１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した
後、０.１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液および２.０Ｍ ＮａＣｌ
緩衝液の各々でリニアグラジエントにより、流速２００
ｍｌ／時、温度４℃で溶出させて、波長２８０ｎｍにお
ける吸光度を測定すると共に６.７ｍｌ／画分になるよ
うに分画して採液した。波長２８０ｎｍにおける吸光度
は図１に示すとおりであった。上記で得た各画分のウシ
大動脈血管内皮細胞に対する増殖促進作用を下記により
測定したところ、図２に示すとおりであり、画分Ｎｏ.
１２〜２４の画分が高い血管内皮細胞増殖促進活性を有
していた。

【００４３】ウシ大動脈血管内皮細胞に対する増殖促進
作用の測定法 ウシ大動脈血管内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む
ＤＭＥ培地（Flow Laboratory社製）に懸濁して、５×
１０³細胞個／ウエルの細胞密度で２４穴（ウエル）マ
ルチプレート（コーニング社製）にまいた。翌日、５％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で培地交換すると共に試
料を加えて５日間培養して細胞数を計測した。

【００４４】（２） 上記（１）で得た血管内皮細胞増
殖促進活性の高い画分を緩衝液で３倍に希釈した後、
０.５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で平衡化したベッド体積
４ｍｌのヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）に温度４℃、流速０．２〜０．４ｍｌ／分で吸
着させた。同塩濃度の緩衝液で洗浄した後、０.５Ｍ Ｎ
ａＣｌ緩衝液および２.０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液の各々でリ
ニアグラジエントにより、流速０.２ｍｌ／分、温度４
℃で溶出させて、その波長２８０ｎｍにおける吸光度を
測定すると共に３ｍｌ／画分になるように分画して採液
した。波長２８０ｎｍでの吸光度は図３に示すとおりで
あった。上記で得た各画分のウシ大動脈血管内皮細胞に
対する増殖促進作用を上記と同様にして測定したとこ
ろ、図４に示すとおりであり、画分Ｎｏ．２３〜３０の
画分が高い血管内皮細胞増殖促進活性を有していた。

【００４５】（３） 上記（２）で得た血管内皮細胞増
殖促進活性の高い画分を緩衝液で３倍に希釈した後、
０.５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で平衡化したＴＳＫ−ヘパリン
５ＰＷ（内径７.５ｍｍ、長さ７.５ｃｍ；東ソー社製）
に吸着させた。同塩濃度の緩衝液で洗浄した後、０.５
Ｍ ＮａＣｌ緩衝液および２.０Ｍ ＮａＣｌ緩衝液の各
々でリニアグラジエントにより、流速０.５ｍｌ／分、
室温で溶出させて、その波長２１５ｎｍにおける吸光度
を測定すると共に、０.５ｍｌ／画分になるように分画
して採液したところ、画分ごとの２１５ｎｍにおける吸
光度は図５に示すとおりであった。上記で得た各画分の
ウシ大動脈血管内皮細胞に対する増殖促進作用を上記と
同様にして測定したところ、図６に示すとおりであり、
画分Ｎｏ．３０〜３２の画分が高い血管内皮細胞増殖促
進活性を有していた。

【００４６】（４） 上記（３）で得た血管内皮細胞増
殖促進活性の高い画分をＶＰ−３１８カラム（内径４.
６ｍｍ、長さ３０ｍｍ；センシュー科学社製）を用いた
逆相クロマトグラフィーで、０.１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）の存在下に、アセトニトリル濃度を１０％か
ら６０％まで直線的に上昇させ、流速１．０ｍｌ／分で
溶出して、その波長２１５ｎｍにおける吸光度を測定す
ると共に、１０ｍｌ／画分になるように分画して採液し
たところ、画分ごとの２１５ｎｍにおける吸光度は図７
に示すとおりであった。上記で得た各画分のウシ大動脈
血管内皮細胞に対する増殖促進作用を上記と同様にして
測定したところ、図８に示すとおりであった。そのピー
ク画分を分取して高い血管内皮細胞増殖促進活性を有す
る高純度の精製物を得た。

【００４７】（５） 上記（４）で得た高純度精製物の
分子量をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により測定
した。分子量マーカーとして、分子量既知の下記の物質
６種を用いて、前記と同様にして電気泳動を行った。 ［分子量マーカー］ ○ ウサギ筋肉由来ホスホリラーゼ （分子量９７，４
００ダルトン） ○ ウシ血清アルブミン （分子量６６，２
００ダルトン） ○ オボアルブミン （分子量４５，０
００ダルトン） ○ カルボニックアンヒドラーゼ （分子量３１，０
００ダルトン） ○ ダイズトリプシンインヒビター （分子量２１，５
００ダルトン） ○ ライソザイム （分子量１４，４
００ダルトン）

【００４８】そして、図９に示す電気泳動パターンを得
た。図９の結果から、上記（４）で得た高純度精製物の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量
が、非還元条件下で７２，０００〜８０，０００ダルト
ンであり、還元条件下で７９，０００〜８５，０００ダ
ルトンであり、一本鎖タンパク質であることが確認され
た。

【００４９】電気泳動後に、ゲルを２ｍｍ間隔で切り、
各ゲル部分を試験管内に各々入れて粉砕し、これに緩衝
液５００μｌを加えて４℃で１６時間振盪した。遠心し
て上清を回収し、緩衝液に対して透析した。これを凍結
乾燥した後、１００μｌの緩衝液に溶解し、ウシ大動脈
内皮細胞に対する増殖促進活性を上記と同様にして測定
したところ、図１０に示すように、非還元条件下での分
子量７２，０００〜８０，０００ダルトンの画分に内皮
細胞に対する増殖促進活性が認められた。

【００５０】また、該高純度精製物に対して前記した方
法によりそのアミノ酸配列の決定を行ったところ、配列
番号３で表されるペプチド鎖、配列番号４で表されるペ
プチド鎖および配列番号５で表されるペプチド鎖を有す
ることが確認された。

【００５１】更に、該高純度精製物２５０ｎｇ／５μ
ｌ、Ｎ-グリカナーゼ(genzyme社製；２５０units／ｍ
ｌ)３.２μｌを、３０μｌの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に加えて１８時間反応させた後、０．
１％ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動し、その後銀染色したところ、図１１に示す泳動パタ
ーンとなり、Ｎ-グリカナーゼ処理された該高純度精製
物では糖鎖の分離によると考えられる分子量低下が確認
され、このことから該高純度精製物は糖鎖の付加した糖
タンパク質であることが確認され、したがって、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した上記
の分子量は、糖が付加した糖タンパク質としての分子量
であると判断される。

【００５２】《実施例２》［コンカナバリンＡに対する
親和性試験］ 前記したと同じ方法によって、実施例１の工程（４）で
得た高純度精製物のコンカナバリンＡに対する親和性を
調べたところ、該精製物がコンカナバリンＡに対して親
和性であることが確認された。そして、上記実施例１の
結果およびこの実施例２の結果から、該工程（４）で得
た高純度精製物が糖タンパク質であることが確認され
た。

【００５３】《実施例 ３》上記実施例１で得られたタ
ンパク質における配列番号３〜配列番号５で表される各
ペプチド鎖におけるアミノ酸配列は、ｈＨＧＦにおける
ものとよく一致しし、したがって実施例１で得られタン
パク質はｈＨＧＦのファミリーに属すると考えられるの
で、ｈＨＧＦファミリーのＤＮＡを基にして、実施例１
で得られたタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａの塩基配列および該アミノ酸配列を下記のようにして
決定した。

【００５４】（ａ）ＰＣＲ用のプライマーの合成；プラ
イマーはＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９２
（アプライドバイオシステムズ社製）により４０ｎＭカ
ラムを用いてプライマーサイクルで合成を行った。すな
わち、翻訳領域の５’末端（翻訳開始点）から４７〜８
２番目の上流の塩基を含む領域（Ｒ’プライマー）と、
３’末端（終止コドン）から下流に１〜３７番目の塩基
を含む領域（３’プライマー）をもとに、それぞれプラ
イマーを合成した。なお、３’プライマーは、その塩基
の一部を置換することによりＢａｍＨｌ認識部位をつく
った。 ５’プライマー；５’TCTTTTAGGCACTGACTCCGAACAGGATTC
TTTCAC３’ ３’プライマー；５’GTTGTATTGGTGGATCCTTCAGACACACTT
ACTTCAG３’

【００５５】（ｂ）ｃＤＮＡの合成；ヒト卵巣腫瘍由来
細胞ＨＵＯＣＡ−IIIからＳＤＳ・フェノール法［Mania
tisetal, Molecular Clooning，vol.1（1989）］により
調製したＲＮＡ試料（１０μｇ／μｌ）の５μｌを７０
℃で５分間加熱した後、氷中で急冷した。そのままで５
分間冷やした後、１０μｌの５ｘ逆転写反応用緩衝液
（２５０ｍＭ トリス緩衝液／ｐＨ８.３、３７５ｍＭ
ＫＣl、１５ｍＭ ＭgＣl₂）、１５μｌの２．５ｍＭ ｄ
ＮＴＰ（ｄＡＴＰ・ｄＣＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ混合
物；宝酒造社製）、０．５μｌの１Ｍ ジチオスレイト
ール、１μｌのオリゴ(ｄＴ)_12-18（アマシャム社
製）、２．５μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（２
００units／μｌ；宝酒造社製）、１３μｌの蒸留水お
よび３μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００units／μ
ｌ；GIBCOBRL社製）を加え、３７℃で１時間反応させて
ｃＤＮＡを合成した。反応終了後、フェノール処理して
除蛋白質を行い、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを回収
し、５０μｌの蒸留水に溶解し、−８０℃で保存した。

【００５６】(ｃ)ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅；上記
（ｂ）で調製したｃＤＮＡ水溶液の５μｌに、７０μｌ
の蒸留水と、１０μｌの１０ｘＰＣＲ反応用緩衝液［５
００ｍＭ ＫＣl、１５ｍＭ ＭgＣl₂、１００ｍＭ トリ
ス緩衝液／ｐＨ８.３、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチ
ン］、８μｌのｄＮＴＰ（宝酒造社製）、上記（ａ）で
合成した５’プライマー（１μｇ／μｌ)の３μｌおよ
び３’プライマー（１μｇ／μｌ）の３μｌを加え、９
５℃で７分間加熱後、急冷した。これに１μｌのＡｍｐ
ｌ:Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５units／μｌ；PERK
IN ELMER CETUS社製）を加え、反応液の液面をミネラル
オイル（ヌジョールミネラルオイル；PERKIN ELMER CET
US社製）で覆った後、ＰＣＲ反応（９４℃で１分、６０
℃で２分、７２℃で３分の３段階の反応を３０回繰り返
した）を行った。反応終了後、クロロホルム処理により
ミネラルオイルを除去し、次いでフェノール処理して除
蛋白質を行い、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を回収
した。

【００５７】(ｄ)ＢａｍＨｌによるＰＣＲ産物の消化；
８５μｌのＰＣＲ産物に、１０μｌの１０ｘＢａｍＨｌ
反応用緩衝液（１．５Ｍ ＮaＣl、６０ｍＭ トリス緩衝
液／ｐＨ７．９、６０ｍＭ ＭgＣl₂）と５μｌのＢａｍ
Ｈｌ（１５units／μｌ；ニッポンジーン社製）を加え
て３７℃で１時間保温してＰＣＲ産物の消化を行った。

【００５８】(ｅ)ＢａｍＨｌによって消化されたＰＣＲ
産物の精製；ＢａｍＨｌによって消化されたＰＣＲ産物
を定電圧（１００Ｖ）で、０．７％アガロースゲル電気
泳動を行った。電気泳動終了後、エチジウムブロマイド
で染色し、ＵＶトランスイルミネーター上でＤＮＡを観
察したところ、約２.３ＫｂのＤＮＡバンドが確認され
た。この２．３ＫｂのＤＮＡバンド部分を切り出し、ゲ
ル中のＰＣＲ産物をSephaglas Band Prep Kit（ファル
マシア社製）を用いて精製した。

【００５９】(ｆ)ｐＵＣ１８プラスミドベクターのＢａ
ｍＨｌによる消化；２μｌのｐＵＣ１８（１μｇ／μ
ｌ、宝酒造社製）に６．６μｌの蒸留水と３μｌの１０
ｘＢａｍＨｌ反応用緩衝液および１．４μｌのＢａｍＨ
ｌ（１５units／μｌ；ニッポンジーン社製）を加えて
３７℃で１時間反応させて、プラスミドの消化を行っ
た。反応終了後、フェノール処理して除蛋白質を行った
後、エタノール沈殿によるプラスミドを回収した。得ら
れたプラスミドを３３μｌの蒸留水に溶解した後、４μ
ｌのＣＩＰ緩衝液（５０ｍＭ トリス緩衝液／ｐＨ８．
０、１ｍＭ ＭgＣl₂）と３μｌのアルカリホスファター
ゼ（「Calf Intestin」；２，５００units／ｍｌ；東洋
紡社製）を加え、３７℃で４０分間、更に５０℃で２０
分間反応させた。反応終了後、フェノール処理およびエ
タノール沈殿を行ってプラスミドを回収した。

【００６０】(ｇ)ＰＣＲ産物によるＪＭ１０９の形質転
換；上記(ｅ)で得られたＢａｍＨｌで消化されたＰＣＲ
産物の精製物の６μｌ（３０μｇ）に、上記(ｆ)で調製
したＢａｍＨｌで消化されたｐＵＣ１８プラスミドの２
μｌ、および２μｌの１０ｘライゲーション緩衝液（１
０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＭgＣ
l₂、５００ｍＭ トリス緩衝液／ｐＨ７.９)、９μｌの
蒸留水および１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５００uni
ts／μｌ；ニッポンジーン社製）を加え、１６℃で一晩
反応させた。反応終了後、その一部を１００μｌのE.co
li JM 109 compitent cell（ニッポンジーン社製）に加
え、氷中で２０分間静置した後、４２℃で４５秒間熱処
理し、再び氷中に移して２分間以上静置した。これを４
００μｌのHi-compitence Broth（ニッポンジーン社
製）に加え、３７℃で６０分間振とうさせた後、４０μ
ｌの２％Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）／ジエチルホ
ルムアミド溶液と４０μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）を加
え、ＬＢプレート（０．５％イースト抽出物、１％バク
トトリプトン、１．５％寒天、１％ＮaＣl、５０μｇ／
ｍｌアンピシリン／ｐＨ７．５）に撒き、３７℃で一晩
培養した。プレート上に白色のコロニー(組換え体)と青
色コロニー(非組換え体)が形成されたが、白色のコロニ
ーを拾うことによるｃＤＮＡの挿入したプラスミドをも
つＪＭ１０９を選択した。

【００６１】(ｈ)プラスミドの調製；上記（ｇ）におい
てプラスミドを導入したＪＭ１０９を１００ｍｌのＬＢ
培地（１％バクトトリプトン、０．５％イースト抽出
物、１％ＮaＣl／ｐＨ７．５）で３７℃にて一晩培養し
た。菌が対数増殖期に達したら、遠心（５０００ｒｐ
ｍ，０℃で５分間）して集菌し、４ｍｌのＰ１緩衝液
（１００μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼ Ａ、５０ｍＭ
トリス緩衝液／ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ
８．０）に懸濁した後、４ｍｌのＰ２緩衝液（２００ｍ
Ｍ ＮaＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、室
温にて５分間アルカリ変性処理した。アルカリ変性後、
４ｍｌのＰ３緩衝液（２．５５ｍＭ 酢酸カリウム／ｐ
Ｈ４．８）を加えて中和し、遠心した（１５０００ｒｐ
ｍ、４℃で３０分間）。得られた上清液を、予め２ｍｌ
のＱＢ緩衝液（７５０ｍＭ ＮaＣl、５０ｍＭ ３−
［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルフォン酸／ｐＨ７．
０、１５％エタノール）で平衡化しておいたQIAGEN-MID
I column-pack 100（DIAGEN社製）にアプライした。カ
ラムを４ｍｌのＱＣ緩衝液（１Ｍ ＮaＣl、５０ｍＭ
３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルフォン酸／ｐＨ
７．０、１５％エタノール）で２回洗浄した後、２ｍｌ
のＱＦ緩衝液（１．２Ｍ ＮaＣl、１５％エタノール５
０ｍＭ ３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルフォン
酸／ｐＨ８．０）でプラスミドを溶出させた。溶出液に
５００μｌのイソプロパノールを加え、室温で３０分間
遠心し、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、１
００μｌの蒸留水に溶解した。

【００６２】(ｉ)ジデオキシ法によるＤＮＡの塩基配列
の決定；上記（ｈ）で調製した３μｇのプラスミド水溶
液１６μｌに、２μｌの２ＮＮaＯＨと２μｌの２ｍＭ
ＥＤＴＡを加え、３７℃で２５分間プラスミドをアルカ
リ変性させた。変性後、２μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム
と１００μｌの冷エタノールを加え、−８０℃で１０分
間エタノール沈殿を行った。沈殿してきたプラスミドを
遠心して回収し、７０％エタノールで洗浄した後、７μ
ｌの蒸留水に溶解した。これに、１μｌのシークエンス
用プライマー（０．５ｐｍｏｌｅ）と、２μｌの５ｘ緩
衝液Ａ（２５０ｍＭ ＮaＣl、２００ｍＭ トリス緩衝液
／ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＭgＣl₂）を加え、６５℃で
２分間保温した後、３０℃まで徐冷し、プラスミドとプ
ライマーをアニールさせた。アニール後、１μｌの０．
１Ｍ ジチオトレイトールと２μｌのラベル混液（１．
５μＭ ７−デアザ−ｄＧＴＰ、１．５μＭ ｄＡＴＰ、
１．５μＭ ｄＴＴＰ）、０．５μｌの［α−³⁵Ｓ］ｄ
ＣＴＰ（１０００ Ｃi／ミリモル；アマシャム社
製）、２μｌのSeuenaseVer. 2.0（１．５Ｕ／μｌ；Un
ited States Biochemical Corp．製）を加え、３７℃で
５分間反応させた。

【００６３】反応終了後、反応混液を３．５μｌずつ予
め保温しておいた２．５μｌのＧ溶液（５０ｍＭ ＮaＣ
l、８０μＭ ７−デアザ−ｄＧＴＰ、８０μＭ ｄＡＴ
Ｐ、８０μＭ ｄＣＴＰ、８０μＭ ｄＴＴＰ、８μＭ
ｄｄＧＴＰ）、Ａ溶液（８０μＭ ７−デアザ−ｄＧＴ
Ｐ、８０μＭ ｄＡＴＰ、８０μＭ ｄＣＴＰ、８０μＭ
ｄＴＴＰ、８μＭ ｄｄＡＴＰ、５０ｍＭ ＮaＣl）、
Ｃ溶液（８０μＭ ７−デアザ−ｄＧＴＰ、８０μＭ ｄ
ＡＴＰ、８０μＭ ｄＣＴＰ、８０μＭ ｄＴＴＰ、８μ
Ｍ ｄｄＣＴＰ、５０ｍＭ ＮaＣl）、Ｔ溶液（８０μＭ
７−デアザ−ｄＧＴＰ、８０μＭ ｄＡＴＰ、８０μＭ
ｄＣＴＰ、８０μＭ ｄＴＴＰ、８μＭ ｄｄＴＴＰ、
５０ｍＭ ＮaＣl）にそれぞれ加えた。３７℃で５分間
反応させた後、４μｌの反応停止液（９５％ホルムアミ
ド、０．０５％ブロモフェノールブルー、２０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）を加えて
反応を終了させた。

【００６４】次に、９０℃で５分間加熱し、急冷した
後、試料の２．５μｌを電気泳動した。使用したゲルの
組成は、７Ｍ 尿素／１０％ HydroLink^TM LONGRANGER
（ＡＴBiochem社製）/100mM トリス緩衝液／１００ｍＭ
ホウ酸／２ｍＭ ＥＤＴＡであり、０．０５％過硫酸ア
ンモニウムと０．０００５％Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメ
チレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を用いてゲルを重合させ
た。また、電気泳動は緩衝液としてＴＥＢ緩衝液（５０
ｍＭ トリス緩衝液、５０ｍＭ ホウ酸、１ｍＭＥＤＴ
Ａ）を用いて、６０Ｗの定電力で行った。電力泳動終了
後、ゲルを濾紙上で乾燥させ、オートラジオグラフィー
を行ってＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号
２で表される塩基配列を有していた。

【００６５】配列番号２で表される塩基配列における各
コドンは、配列番号６で表されるようにしてタンパク質
における各アミノ酸をコードし、したがって配列番号２
で表されるＤＮＡの塩基配列（すなわち配列番号６で表
される配列表）から、実施例１で得られたタンパク質が
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが明ら
かになった。そして、配列番号１で表されるタンパク質
のアミノ酸配列において、上記の実施例１でそのアミノ
酸配列が確認された配列番号３で表されるペプチド鎖は
３６番目〜４２番目のアミノ酸配列に相当し、配列番号
４で表されるペプチド鎖は１１１番目〜１２０番目のア
ミノ酸配列に相当し、配列番号５で表されるペプチド鎖
は５２６番目〜５４１番目のアミノ酸配列に相当する。

【００６６】《実施例４》［血管新生活性の測定］ 受精８日目のニワトリ受精卵を各区１０個準備し、その
漿尿膜上に、実施例１の工程（４）で得た高純度精製物
（本発明のタンパク質）を担持量を変えて含浸させたフ
ィルター（直径６ｍｍ）を静置して、３７℃、加湿状態
で３日間培養した。３日後に血管新生状態を実体顕微鏡
下で観察した。判定は、陽性（＋）（フィルター周囲に
血管の新生を認める）、陰性（−）（血管の新生が認め
られない）として、１０個の受精卵に対する陽性の個数
を数えた。また、比較のために、生理食塩水を含浸させ
たフィルターを使用して同様の試験を行った。その結果
を下記の表１に示す。

【００６７】

【表１】 タンパク質担持量 陽性(＋)個数／検体数 １区 ０ （生理食塩水） ０個／１０個 ２区 １ ｎｇ／フィルター １個／１０個 ３区 １０ ｎｇ／フィルター ３個／１０個 ４区 ５０ ｎｇ／フィルター ５個／１０個 ５区 １００ ｎｇ／フィルター ６個／１０個

【００６８】上記表１の結果から、本発明のタンパク質
が血管新生作用を有することがわかる。

【００６９】《実施例５》［ヒトサイ帯血管内皮細胞に
対する増殖促進作用の試験］ ヒトサイ帯血管内皮細胞を常法に従ってヒトサイ帯より
分離し、コラーゲンコーティングした２４穴マルチプレ
ート（コーニング社製）に、２０％ウシ胎児血清を含む
ＭＣＤＢ１０７培地（極東製薬社製）を用いて１×１０
⁴個細胞／ウエルの細胞密度でまいた。翌日より２日お
きに実施例１の工程（４）で得た本発明のタンパク質を
各々下記の表２に示す濃度で含む５％ウシ胎児血清入り
培地で交換して、８日目に細胞数を計測したところ、下
記の表２に示す結果を得た。

【００７０】

【表２】 タンパク質濃度 細 胞 数 （ｎｇ／ｍｌ） (個数／ウエル) ０ ２７１６８ ０.３ ２９４６０ １.０ ３０９２０ ３.３ ３７４９２ １０.０ ４３０７２ ３３.３ ５４７７２ １００.０ ５３９８８ ３３３ ４６４６０

【００７１】上記表２の結果から、本発明のタンパク質
がヒトサイ帯血管内皮細胞の増殖を促進する作用を有す
ることがわかる。

【００７２】《実施例６》［繊維芽細胞に対する増殖促
進作用の有無の試験］ ヒト真皮由来繊維芽細胞をヒト皮膚より初代培養し継代
８代目を使用した。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培
地（Flow Laboratory社製）で２４穴マルチプレートに
より５×１０³個細胞／ウエルの細胞密度でまいた。翌
日より２日おきに実施例１の工程（４）で得た本発明の
タンパク質を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む０．５％ウ
シ胎児血清入りＤＭＥ培地で交換して、８日目に細胞数
を計測した。また比較のため、タンパク質を含まない培
地および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度で含む培地を使用して各々同様にして試
験を行って、８日目に細胞数を計測した。その結果を下
記の表３に示す。

【００７３】

【表３】 ８日目の細胞数 添 加 成 分 (個／ウエル) 無添加 ２８２４８ 実施例１で得たタンパク質 ２４３２５ ｂＦＧＦ ４２６４５

【００７４】上記表３の結果から、ｂＦＧＦが繊維芽細
胞増殖を強く促進するのに対して、実施例１で得た本発
明のタンパク質は、無添加の場合と８日目の繊維芽細胞
の数があまり変わらず、繊維芽細胞増殖促進作用をほと
んどもたないことがわかる。

【００７５】《実施例７》［血管平滑筋細胞に対する増
殖促進作用の有無の試験］ ヒト平滑筋細胞をサイ帯より初代培養し継代６代目を使
用した。１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で２４穴
マルチプレートにより５×１０³個細胞／ウエルの細胞
密度でまいた。翌日より２日おきに実施例１の工程
（４）で得た本発明のタンパク質を１００ｎｇ／ｍｌの
濃度で含む培地で交換して、８日目に細胞数を計測し
た。また比較のため、タンパク質を含まない培地および
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を１ｎｇ／ｍｌ
の濃度で含む培地を使用して各々同様にして試験を行っ
て、８日目に細胞数を計測した。その結果を下記の表４
に示す。

【００７６】

【表４】 ８日目の細胞数 添 加 成 分 (個／ウエル) 無添加 ６１９２ 実施例１で得たタンパク質 ７４８０ ｂＦＧＦ ４８９６２

【００７７】上記表４の結果から、実施例１で得た本発
明のタンパク質は、無添加の場合と８日目の繊維芽細胞
の数があまり変わらず、ヒト平滑筋細胞に対する増殖促
進活性がないことがわかる。

【００７８】《実施例８》［肝細胞に対する増殖促進活
性の有無の試験］ 肝実質細胞（以下「肝細胞」と称する）を高橋らの方法
[組織培養 １２(８)，３０８−３１２（１９８６）］に
従って分離した。この肝細胞をＷＥ基礎培地に５％ウシ
胎児血清と１０^-8Ｍデキサメタゾンを含む播種用培地に
懸濁して５．０×１０⁴個細胞／０．２ｍｌに調製し
た。この肝細胞浮遊液をコラーゲンコートした２４穴マ
ルチプレートに播いて培養した。培養開始４時間後と２
０時間後にＷＥ基礎培地に交換し、この際に実施例１で
得た本発明のタンパク質を下記の表４に示す割合で添加
して培養を継続した。培養開始４０時間後に新しいＷＥ
基礎培地に交換して³Ｈ−チミジンを添加し、２時間の
パルスラベリングを行った。パルスラベリング後に、培
地上清を除き、冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、２％過塩素
酸塩、９５％冷エタノールの順に各３回洗浄した後、室
温で乾燥させた。１％ＳＤＳ／０.１Ｎ ＮａＯＨを０．
８ｍｌづつ添加し、３７℃で１時間以上静置した。細胞
溶解後、ピペッティングして各ウエル当たり０．５ｍｌ
をシンチレーションバイアルにとり、シンチレーター
（オプティフロー；パッカード社製）を７ｍｌ加えて混
和し、シンチレーションカウンターで放射能を測定し
て、³Ｈ−チミジンの取り込みを調べた。

【００７９】また比較のため、インシュリン（１００ｎ
Ｍ）と上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）
を使用して、上記と同様にして試験を行った。その結果
を、下記の表５に示す。

【００８０】

【表５】 添 加 成 分 ³Ｈ−チミジンの取り込み 実施例１のタンパク質 ３００ ｎｇ／ｍｌ ５６９７ ＤＰＭ １００ ｎｇ／ｍｌ ４３４７ ＤＰＭ ３０ ｎｇ／ｍｌ ４８６９ ＤＰＭ １０ ｎｇ／ｍｌ ４６１９ ＤＰＭ インシュリン＋ＥＧＦ ７６８１５ ＤＰＭ (100nM＋50ng／ml) 対 照（無添加） ４９９２ ＤＰＭ

【００８１】上記表５の結果から、本発明のタンパク質
を添加しても³Ｈ−チミジンの取り込みがなく、肝細胞
の増殖促進作用をもたないことがわかる。

【００８２】《実施例９》［ＨｅＬａ細胞に対する増殖
抑制促進および作用の有無の試験］ ＨｅＬａ−Ｓ３細胞を５％ウシ血清を含むＭＥＭ培地に
懸濁して１×１０⁵個細胞／ｍｌの懸濁液を調製した。
このＨｅＬａ−Ｓ３細胞懸濁液を９６穴マルチプレート
に１００μｌづつ分注して２４時間培養した。培養後、
培地を実施例１で得たタンパク質を含む５％ウシ血清入
りＭＥＭ培地で交換して４８時間培養した。

【００８３】判定は、クリスタルバイオレットによる染
色法で測定した。すなわち、培養後に、リン酸緩衝液で
各穴を洗浄した後、１０％ホルマリン溶液に３０分浸し
て細胞を固定した。次いで、ホルマリンを流水で洗浄し
た後乾燥して、２％エタノールを含む０．２％クリスタ
ルバイオレット溶液を加えて１５分間染色した。未結合
色素を流水中で洗浄して除去した後乾燥させ、次いで１
％ＳＤＳ溶液を分注して結合色素を溶解させた。溶出し
たクリスタルバイオレットの吸光度を波長５４０ｎｍで
測定した。

【００８４】一方、対照として、タンパク質を添加せず
に上記と同様にして培養およびクリスタルバイオレット
による染色を行って、その５４０ｎｍにおける吸光度を
測定した。対照の５４０ｎｍでの吸光度を１．００とし
てその比率を算出したところ、下記の表６に示すとおり
の結果を得た。

【００８５】

【表６】 添 加 成 分 ５４０ｎｍでの吸光度比 実施例１のタンパク質 ３００ ｎｇ／ｍｌ １.０２ １００ ｎｇ／ｍｌ １.０１ ３０ ｎｇ／ｍｌ １.０１ １０ ｎｇ／ｍｌ １.０２ 対 照（無添加） １.００

【００８６】上記表６の結果から、本発明のタンパク質
を添加しても無添加（対照）の場合と比べて５４０ｎｍ
での吸光度にほとんど差がなく、本発明のタンパク質は
ＨｅＬａ細胞に対する増殖促進作用および増殖抑制作用
の両方ともないことがわかる。

【００８７】《実施例１０》［血管内皮細胞および平滑
筋細胞に対する遊走刺激作用］ 常法によりウサギ角膜毛細血管より血管内皮細胞を分離
して初代培養した。遊走能はボイデンチャンバー法によ
り測定した。すなわち、下段に実施例１で得たタンパク
質を含む１０％ウシ胎児血清入りＤＭＥ培地、上段に血
管内皮細胞を２×１０⁴個／ｍｌ含む１０％ウシ胎児血
清入りＤＭＥ培地を加えて３７℃で４時間培養した。ま
た、平滑筋細胞は、ラット肺大動脈より分離し初代培養
した細胞を用いて同様に試験を行った。培養後に、ディ
フクイック液で染色して顕微鏡下で一視野当たりの遊走
細胞数を計測した。その結果を下記の表７に示す。

【００８８】

【表７】 遊 走 細 胞 数 タンパク質濃度 血管内皮細胞 平滑筋細胞 （個） （個） ３００μｇ／ｍｌ ２６８ ０ １００μｇ／ｍｌ ５０ ０ ３０μｇ／ｍｌ ３７ ０

【００８９】上記表７の結果から、本発明のタンパク質
は血管内皮細胞に対しては遊走活性を示すが、平滑筋細
胞に対しては全く遊走活性を示さないことがわかる。

【００９０】

【発明の効果】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を
有するタンパク質からなる本発明の血管内皮細胞増殖促
進剤、ひいては血管新生剤は、血管内皮細胞の増殖は促
進するが、平滑筋細胞、繊維芽細胞および肝細胞に対す
る増殖促進活性をもたず、更にＨｅＬａ細胞に対する増
殖促進作用および増殖抑制作用を示さないので、血管内
皮細胞の増殖を選択的に促進することができ、副作用を
起こすことなく血管新生を円滑に進行させることが期待
できる。そのため、本発明の血管内皮細胞増殖促進剤、
ひいては血管新生剤は、上記した優れた血管新生作用に
より、創傷、火傷、褥瘡、術後組織の治癒促進剤や心血
管障害の治療薬として、また人工血管や人工皮膚等の人
工臓器への応用面で、更に悪性腫瘍、網膜症、慢性関節
リウマチの診断薬や治療薬として有用である。更に、本
発明の血管内皮細胞増殖促進剤および血管新生剤に用い
る配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク
質は、従来の生理活性因子に比べて生産性が高く、しか
も高純度で得ることができる。

【００９１】

【配列表】

【００９２】配列番号：１ 配列の長さ：７２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【００９３】配列番号：２ 配列の長さ：２１８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 細胞の種類:ヒト卵巣腫瘍樹立細胞HUOCA-III 配列 ATG TGG GTG ACC AAA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC 48 CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAA 96 AGG AAA AGA AGA AAT ACA ATT CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT 144 ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAA GGA CTT 240 CCA TTC ACT TGC AAG GCT TTT GTT TTT GAT AAA GCA AGA AAA CAA TGC 288 CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAA AAA GAA TTT 336 GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 384 ATC ATT GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 432 AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 480 AGC TTT TTG CCT TCG AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC 528 TGT CGA AAT CCT CGA GGG GAA GAA GGG GGA CCC TGG TGT TTC ACA AGC 576 AAT CCA GAG GTA CGC TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA 624 GTT GAA TGC ATG ACC TGC AAT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT 672 CAT ACA GAA TCA GGC AAG ATT TGT CAG CGC TGG GAT CAT CAG ACA CCA 720 CAC CGG CAC AAA TTC TTG CCT GAA AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT 768 GAT AAT TAT TGC CGC AAT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT 816 ACT CTT GAC CCT CAC ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC 864 GCT GAC AAT ACT ATG AAT GAC ACT GAT GTT CCT TTG GAA ACA ACT GAA 912 TGC ATC CAA GGT CAA GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GTC AAT ACC ATT 960 TGG AAT GGA ATT CCA TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC GAG 1008 CAT GAC ATG ACT CCT GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT 1056 TAC TGC CGA AAT CCA GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT 1104 GAT CCA AAC ATC CGA GTT GGC TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT 1152 ATG TCA CAT GGA CAA GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG 1200 GGC AAC TTA TCC CAA ACA AGA TCT GGA CTA ACA TGT TCA ATG TGG GAC 1248 AAG AAC ATG GAA GAC TTA CAT CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA 1296 AGT AAG CTG AAT GAG AAT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT 1344 GGA CCC TGG TGC TAC ACG GGA AAT CCA CTC ATT CCT TGG GAT TAT TGC 1392 CCT ATT TCT CGT TGT GAA GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC AAT TTA 1440 GAC CAT CCC GTA ATA TCT TGT GCC AAA ACG AAA CAA TTG CGA GTT GTA 1488 AAT GGG ATT CCA ACA CGA ACA AAC ATA GGA TGG ATG GTT AGT TTG AGA 1536 TAC AGA AAT AAA CAT ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAG AGT TGG 1584 GTT CTT ACT GCA CGA CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT 1632 GAA GCT TGG CTT GGA ATT CAT GAT GTC CAC GGA AGA GGA GAT GAG AAA 1680 TGC AAA CAG GTT CTC AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA 1728 TCA GAT CTG GTT TTA ATG AAG CTT GCC AGG CCT GCT GTC CTG GAT GAT 1776 TTT GTT AGT ACG ATT GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA 1824 AAG ACC AGT TGC AGT GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC 1872 TAT GAT GGC CTA TTA CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG 1920 AAA TGC AGC CAG CAT CAT CGA GGG AAG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA 1968 ATA TGT GCT GGG GCT GAA AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT 2016 TAT GGT GGC CCA CTT GTT TGT GAG CAA CAT AAA ATG AGA ATG GTT CTT 2064 GGT GTC ATT GTT CCT GGT CGT GGA TGT GCC ATT CCA AAT CGT CCT GGT 2112 ATT TTT GTC CGA GTA GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT 2160 TTA ACA TAT AAG GTA CCA CAG TCA 2184

【００９４】配列番号：３ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００９５】配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００９６】配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Ser Xaa Val Leu Thr Ala Arg Gln Xaa Phe Pro Ser Arg Asp Leu 1 5 10 15

【００９７】配列番号：６ 配列の長さ：２１８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 細胞の種類:ヒト卵巣腫瘍樹立細胞HUOCA-III 配列 ATG TGG GTG ACC AAA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAA 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 AGG AAA AGA AGA AAT ACA ATT CAT GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT 144 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAA GGA CTT 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 CCA TTC ACT TGC AAG GCT TTT GTT TTT GAT AAA GCA AGA AAA CAA TGC 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAA AAA GAA TTT 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 ATC ATT GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 AGC TTT TTG CCT TCG AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC 528 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 TGT CGA AAT CCT CGA GGG GAA GAA GGG GGA CCC TGG TGT TTC ACA AGC 576 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 AAT CCA GAG GTA CGC TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA 624 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 GTT GAA TGC ATG ACC TGC AAT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT 672 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 CAT ACA GAA TCA GGC AAG ATT TGT CAG CGC TGG GAT CAT CAG ACA CCA 720 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 CAC CGG CAC AAA TTC TTG CCT GAA AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT 768 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 GAT AAT TAT TGC CGC AAT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT 816 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 ACT CTT GAC CCT CAC ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC 864 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 GCT GAC AAT ACT ATG AAT GAC ACT GAT GTT CCT TTG GAA ACA ACT GAA 912 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 TGC ATC CAA GGT CAA GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GTC AAT ACC ATT 960 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 TGG AAT GGA ATT CCA TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC GAG 1008 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 CAT GAC ATG ACT CCT GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT 1056 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 TAC TGC CGA AAT CCA GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT 1104 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 GAT CCA AAC ATC CGA GTT GGC TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT 1152 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 ATG TCA CAT GGA CAA GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG 1200 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 GGC AAC TTA TCC CAA ACA AGA TCT GGA CTA ACA TGT TCA ATG TGG GAC 1248 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 AAG AAC ATG GAA GAC TTA CAT CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA 1296 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 AGT AAG CTG AAT GAG AAT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT 1344 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 GGA CCC TGG TGC TAC ACG GGA AAT CCA CTC ATT CCT TGG GAT TAT TGC 1392 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 CCT ATT TCT CGT TGT GAA GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC AAT TTA 1440 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 GAC CAT CCC GTA ATA TCT TGT GCC AAA ACG AAA CAA TTG CGA GTT GTA 1488 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 AAT GGG ATT CCA ACA CGA ACA AAC ATA GGA TGG ATG GTT AGT TTG AGA 1536 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 TAC AGA AAT AAA CAT ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAG AGT TGG 1584 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 GTT CTT ACT GCA CGA CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT 1632 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 GAA GCT TGG CTT GGA ATT CAT GAT GTC CAC GGA AGA GGA GAT GAG AAA 1680 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 TGC AAA CAG GTT CTC AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA 1728 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 TCA GAT CTG GTT TTA ATG AAG CTT GCC AGG CCT GCT GTC CTG GAT GAT 1776 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 TTT GTT AGT ACG ATT GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA 1824 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 AAG ACC AGT TGC AGT GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC 1872 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 TAT GAT GGC CTA TTA CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG 1920 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 AAA TGC AGC CAG CAT CAT CGA GGG AAG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA 1968 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 ATA TGT GCT GGG GCT GAA AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT 2016 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 TAT GGT GGC CCA CTT GTT TGT GAG CAA CAT AAA ATG AGA ATG GTT CTT 2064 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 GGT GTC ATT GTT CCT GGT CGT GGA TGT GCC ATT CCA AAT CGT CCT GGT 2112 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 ATT TTT GTC CGA GTA GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT 2160 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 TTA ACA TAT AAG GTA CCA CAG TCA 2184 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＵＯＣＡ−IIIの無血清培養上清を陽イオン
交換クロマトグラフィーにより処理した溶出液の各画分
の波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定したグラフであ
る。

【図２】図１で得られた各溶出液画分の血管内皮細胞に
対する増殖促進作用を測定したグラフである。

【図３】陽イオン交換クロマトグラフィーにより処理し
た溶出液のうちの血管内皮細胞増殖促進活性画分を更に
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより処理
した溶出液の各画分の波長２８０ｎｍにおける吸光度を
測定したグラフである。

【図４】図３で得られた各溶出液画分の血管内皮細胞に
対する増殖促進作用を測定したグラフである。

【図５】ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに
より処理した溶出液のうちの血管内皮細胞増殖促進活性
画分を更にヘパリンアフィニティー高速液体クロマトグ
ラフィーにより処理した溶出液の各画分の波長２１５ｎ
ｍにおける吸光度を測定したグラフである。

【図６】図５で得られた各溶出液画分の血管内皮細胞に
対する増殖促進作用を測定したグラフである。

【図７】ヘパリンアフィニティー高速液体クロマトグラ
フィーにより処理した溶出液のうちの血管内皮細胞増殖
促進活性画分を更に逆相高速液体クロマトグラフィーに
より処理した溶出液の各画分の波長２１５ｎｍにおける
吸光度を測定したグラフである。

【図８】図７で得られた各溶出液画分の血管内皮細胞に
対する増殖促進作用を測定したグラフである。

【図９】本発明の実施例１で得られた高純度精製物（タ
ンパク質）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる泳動パターンを示す図である。

【図１０】図９の泳動パターンゲルを各区分に切断し
て、その各区分中の高純度精製物をゲルから溶出させ、
その血管内皮細胞に対する増殖促進作用を調べたときの
グラフである。

【図１１】本発明の実施例１で得られた高純度精製物
（タンパク質）をＮ−グリカナーゼで処理した生成物の
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による泳動パタ
ーンを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 足立 雅美 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内 (56)参考文献 特開 平３−72883（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−84000（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−261375（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−262523（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（Ａｕｇ．1991），88，ｐ. 7001−7005 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
   する一本鎖タンパク質からなることを特徴とする血管内
   皮細胞増殖促進剤。
2. 【請求項２】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
   する一本鎖タンパク質からなることを特徴とする血管新
   生剤。