JPH07309777A - 骨折の予防および治療剤 - Google Patents
骨折の予防および治療剤Info
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- JPH07309777A JPH07309777A JP6106737A JP10673794A JPH07309777A JP H07309777 A JPH07309777 A JP H07309777A JP 6106737 A JP6106737 A JP 6106737A JP 10673794 A JP10673794 A JP 10673794A JP H07309777 A JPH07309777 A JP H07309777A
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- bone
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- acid sequence
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 リボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌクレアーゼ
ＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨＴ−２９を有効成分と
する骨折の予防および治療剤。 【効果】 本剤は骨芽細胞の分化を促進するので骨折な
どの骨の分化増殖の促進を必要とする疾患の予防および
治療に有効である。
ＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨＴ−２９を有効成分と
する骨折の予防および治療剤。 【効果】 本剤は骨芽細胞の分化を促進するので骨折な
どの骨の分化増殖の促進を必要とする疾患の予防および
治療に有効である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、骨形成の関わる疾患、
特に骨折の予防および治療剤に関する。
特に骨折の予防および治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術およびその問題点】骨は局所で骨吸収と骨
形成を繰り返し、古い骨を新しい骨に置換することで内
骨格としての支持機能を維持し、また種々のメカニカル
ストレスやミネラルバランスの変化に対し、迅速に反応
する準備を整えている。この骨再造形は破骨細胞等の骨
吸収系細胞、骨芽細胞等の骨形成系細胞が主体となり、
両者のカップリングに基づいて遂行される。近年、骨芽
細胞の機能は、単に骨形成にどどまらず、破骨細胞の分
化・活性化に密接に関連し、細胞連鎖的な骨改造現象に
おけるコントロールセンターとしてその役割を果たして
いる可能性が強くなってきている（Inoue, T., Mebio
(1990), Special Version p2-7）。
形成を繰り返し、古い骨を新しい骨に置換することで内
骨格としての支持機能を維持し、また種々のメカニカル
ストレスやミネラルバランスの変化に対し、迅速に反応
する準備を整えている。この骨再造形は破骨細胞等の骨
吸収系細胞、骨芽細胞等の骨形成系細胞が主体となり、
両者のカップリングに基づいて遂行される。近年、骨芽
細胞の機能は、単に骨形成にどどまらず、破骨細胞の分
化・活性化に密接に関連し、細胞連鎖的な骨改造現象に
おけるコントロールセンターとしてその役割を果たして
いる可能性が強くなってきている（Inoue, T., Mebio
(1990), Special Version p2-7）。
【０００３】リボヌクレアーゼはＲＮＡ中のホスホジエ
ステル結合を加水分解する酵素である。リボヌクレアー
ゼは動物細胞のほとんどの組織・体液にあり、環状ヌク
レオチドを経て最終的にはヌクレオシド３−リン酸を遊
離するか、あるいはそれを末端にもつヌクレオチドを形
成する。ヒト尿中リボヌクレアーゼは、リンパ球や赤血
球の増殖を阻害することが知られている（Rabin. E.
Z., et al., Proc Eur Dial Transplant Assoc （197
7） vol 14, p528-534 ）。また、ウシの精液から精製
されたＡＳリボヌクレアーゼは、２倍体非悪性細胞株の
ヒト肺胚細胞であるＬＥＰ細胞の増殖を阻害することが
知られている（Cinatl. J., et al., FoliaBiol（197
7） vol.23,p235-2442）。さらにＡＳリボヌクレアーゼ
は白血病細胞のＥＬ−４腫瘍およびＢＰ−８腫瘍と共に
マウスに投与するとその腫瘍細胞数を減少させることが
知られている（Matousek, R. et al., Folia Biol（197
7） vol.23, p56-65）。
ステル結合を加水分解する酵素である。リボヌクレアー
ゼは動物細胞のほとんどの組織・体液にあり、環状ヌク
レオチドを経て最終的にはヌクレオシド３−リン酸を遊
離するか、あるいはそれを末端にもつヌクレオチドを形
成する。ヒト尿中リボヌクレアーゼは、リンパ球や赤血
球の増殖を阻害することが知られている（Rabin. E.
Z., et al., Proc Eur Dial Transplant Assoc （197
7） vol 14, p528-534 ）。また、ウシの精液から精製
されたＡＳリボヌクレアーゼは、２倍体非悪性細胞株の
ヒト肺胚細胞であるＬＥＰ細胞の増殖を阻害することが
知られている（Cinatl. J., et al., FoliaBiol（197
7） vol.23,p235-2442）。さらにＡＳリボヌクレアーゼ
は白血病細胞のＥＬ−４腫瘍およびＢＰ−８腫瘍と共に
マウスに投与するとその腫瘍細胞数を減少させることが
知られている（Matousek, R. et al., Folia Biol（197
7） vol.23, p56-65）。
【０００４】リボヌクレアーゼはスーパーファミリーを
形作ることが知られており、モリタらはウシから少なく
とも７種類のリボヌクレアーゼを分離した（Morita,T.,
etal., Agric. Biol. Chem. (1987), vol.51, p2751-2
761）。スーパーファミリー中でリボヌクレアーゼＢＬ4
およびリボヌクレアーゼＰＬ3はそれぞれ１１９個のア
ミノ酸から構成されるポリペプチドであり、そのアミノ
酸配列は１１９個のアミノ酸のうち、７個が異なるだけ
で相同性はかなり高く、また、リボヌクレアーゼＨＴ−
２９もアミノ酸構成が類似しておりよく類似した遺伝子
産生物であると推測できる（Hofsteenge, J., et al.,
Biochemistry (1989) vol.28, p9806-9813)）。
形作ることが知られており、モリタらはウシから少なく
とも７種類のリボヌクレアーゼを分離した（Morita,T.,
etal., Agric. Biol. Chem. (1987), vol.51, p2751-2
761）。スーパーファミリー中でリボヌクレアーゼＢＬ4
およびリボヌクレアーゼＰＬ3はそれぞれ１１９個のア
ミノ酸から構成されるポリペプチドであり、そのアミノ
酸配列は１１９個のアミノ酸のうち、７個が異なるだけ
で相同性はかなり高く、また、リボヌクレアーゼＨＴ−
２９もアミノ酸構成が類似しておりよく類似した遺伝子
産生物であると推測できる（Hofsteenge, J., et al.,
Biochemistry (1989) vol.28, p9806-9813)）。
【０００５】一方、骨の形成過程において種々の骨形成
因子が関与していることが知られている（Noda, M., BI
Omedica (1993), vol.8, p28-33）。特に、エストロゲ
ン（estrogen）、ＰＴＨ、蛋白同化ホルモンは骨形成を
促進することが知られている。しかし、リボヌクレアー
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９が骨形成に効果があることを示唆する報告
はこれまでなされていなかった。
因子が関与していることが知られている（Noda, M., BI
Omedica (1993), vol.8, p28-33）。特に、エストロゲ
ン（estrogen）、ＰＴＨ、蛋白同化ホルモンは骨形成を
促進することが知られている。しかし、リボヌクレアー
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９が骨形成に効果があることを示唆する報告
はこれまでなされていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、骨形成に対して、優れた効果を有し、かつ副作
用の少ない新たな骨折の予防および治療薬として用いる
ことのできるペプチドを提供することである。より詳し
くは、従来骨形成促進効果が示唆されていたエストロゲ
ン、ＰＴＨ、蛋白同化ホルモンの如く副作用が強く、経
過観察を十分必要とされる薬剤より、より安全な骨形成
促進効果を有するペプチドを提供することを目的とす
る。
課題は、骨形成に対して、優れた効果を有し、かつ副作
用の少ない新たな骨折の予防および治療薬として用いる
ことのできるペプチドを提供することである。より詳し
くは、従来骨形成促進効果が示唆されていたエストロゲ
ン、ＰＴＨ、蛋白同化ホルモンの如く副作用が強く、経
過観察を十分必要とされる薬剤より、より安全な骨形成
促進効果を有するペプチドを提供することを目的とす
る。
【０００７】
【問題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
の結果、リボヌクレアーゼＢＬ4が骨形成を促進するこ
と、さらに、リボヌクレアーゼＢＬ4と非常によく似た
構造を有するリボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレ
アーゼＨＴ−２９も同様の効果を有することを見出し、
本発明を完成した。
の結果、リボヌクレアーゼＢＬ4が骨形成を促進するこ
と、さらに、リボヌクレアーゼＢＬ4と非常によく似た
構造を有するリボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレ
アーゼＨＴ−２９も同様の効果を有することを見出し、
本発明を完成した。
【０００８】ヒトを含む哺乳類動物の胎児及び新生児の
血液中には、成長の激しい胎児及び新生児の各細胞組織
の成長を刺激する種々の成長因子が含有されることが考
えられる。量的に入手しやすいウシ新生児血清を出発原
料として、新たな骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株において
アルカリ性フォスファターゼ（Alkaline phosphatase:
ALPase）活性を上げる蛋白因子の精製分離を試みた。
血液中には、成長の激しい胎児及び新生児の各細胞組織
の成長を刺激する種々の成長因子が含有されることが考
えられる。量的に入手しやすいウシ新生児血清を出発原
料として、新たな骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株において
アルカリ性フォスファターゼ（Alkaline phosphatase:
ALPase）活性を上げる蛋白因子の精製分離を試みた。
【０００９】ALPase活性測定のために用いる骨肉腫由来
骨芽細胞様細胞株としては、例えば、ROS 17/2.8細胞株
が使用できる。骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株ROS 17/2.8
細胞でALPase活性をあげることは、例えば、トランスフ
ォーミンググロースファクターベータ（Transforming g
rowth factor-β：TGF-β）を用いてALPase活性をあげ
ることは、骨形成の指標とみなされている（Pfeilschif
ter, J., et al., Endocrinology (1987), vol.121, p2
12-218; Rodan, G. A., et al., Calcium regulating h
ormones and bone metabolism, Elsevier Science Publ
ishers B. V.,(1992), p183-196）。
骨芽細胞様細胞株としては、例えば、ROS 17/2.8細胞株
が使用できる。骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株ROS 17/2.8
細胞でALPase活性をあげることは、例えば、トランスフ
ォーミンググロースファクターベータ（Transforming g
rowth factor-β：TGF-β）を用いてALPase活性をあげ
ることは、骨形成の指標とみなされている（Pfeilschif
ter, J., et al., Endocrinology (1987), vol.121, p2
12-218; Rodan, G. A., et al., Calcium regulating h
ormones and bone metabolism, Elsevier Science Publ
ishers B. V.,(1992), p183-196）。
【００１０】種々の成長因子は、ヘパリンに結合しやす
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフにより、さらに
細かい画分に分けることができる。これらの、各画分に
ついてALPase活性を測定した。その結果、ROS 17/2.8細
胞のALPase活性を上昇される画分が見つかった。その画
分について、部分アミノ酸配列を決定し、蛋白質データ
ーベースと参照して、公知の蛋白質であるかどうか調べ
た。その結果、公知のリボヌクレアーゼＢＬ4のアミノ
酸配列に一致したことから、得られた活性画分がリボヌ
クレアーゼＢＬ4であることが同定された（配列番号：
１）。
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフにより、さらに
細かい画分に分けることができる。これらの、各画分に
ついてALPase活性を測定した。その結果、ROS 17/2.8細
胞のALPase活性を上昇される画分が見つかった。その画
分について、部分アミノ酸配列を決定し、蛋白質データ
ーベースと参照して、公知の蛋白質であるかどうか調べ
た。その結果、公知のリボヌクレアーゼＢＬ4のアミノ
酸配列に一致したことから、得られた活性画分がリボヌ
クレアーゼＢＬ4であることが同定された（配列番号：
１）。
【００１１】リボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌクレアー
ゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は天然原料
の肝臓あるいは血清からの精製により、また知られてい
るアミノ酸を基にしてリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９を
コードするＤＮＡをそれぞれ合成することにより、又
は、それぞれの遺伝子をクローン化することにより、当
業者によく知られた遺伝子工学を利用して産生できる。
これらのペプチドは骨芽細胞に関連のある疾患の治療・
予防剤として使用できる。特に、骨芽細胞の分化を促進
することから骨折等の骨の分化増殖の促進を必要とする
疾患の治療に有効である。
ゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は天然原料
の肝臓あるいは血清からの精製により、また知られてい
るアミノ酸を基にしてリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９を
コードするＤＮＡをそれぞれ合成することにより、又
は、それぞれの遺伝子をクローン化することにより、当
業者によく知られた遺伝子工学を利用して産生できる。
これらのペプチドは骨芽細胞に関連のある疾患の治療・
予防剤として使用できる。特に、骨芽細胞の分化を促進
することから骨折等の骨の分化増殖の促進を必要とする
疾患の治療に有効である。
【００１２】骨折治療には適当なゲル状の基剤と混合し
て局所的に直接患部に塗布する投与法が最もふさわし
い。また、その他にもリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は
水溶性が高く水溶性注射液として全身性投与でき、また
微粒子のエアロゾル剤として経鼻または経肺的に投与す
ることができる。投与量は、局所投与では、１〜１００
μg／投与部位／人／日、また全身性投与では０.１〜１
０mg／kg／日を投与する。以下に実施例により本発明を
詳述する。
て局所的に直接患部に塗布する投与法が最もふさわし
い。また、その他にもリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は
水溶性が高く水溶性注射液として全身性投与でき、また
微粒子のエアロゾル剤として経鼻または経肺的に投与す
ることができる。投与量は、局所投与では、１〜１００
μg／投与部位／人／日、また全身性投与では０.１〜１
０mg／kg／日を投与する。以下に実施例により本発明を
詳述する。
【００１３】
実施例１ ウシの新生児血清よりのリボヌクレアーゼＢ
Ｌ4の精製 １）ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー法による
粗精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この加塩
新生児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（２０mM T
ris−ＨＣｌ pH７.５, ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化し
ておいたヘパリン−トヨパールカラム（直径５cm×長さ
５.５cm，東ソー社）に流速３ml/分で展開する。その
後、トリス緩衝液Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄
後、ヘパリン−トヨパールカラムに吸着したペプチド又
は蛋白質をトリス緩衝液Ｂ（２０mM Tris−ＨＣｌ, pH
７.５, １.０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出する。溶出液は、吸
光度光度計を用い、２８０nmの吸光度によりモニター
し、吸収度の高い画分、約３００mlを採取した。
Ｌ4の精製 １）ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー法による
粗精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この加塩
新生児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（２０mM T
ris−ＨＣｌ pH７.５, ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化し
ておいたヘパリン−トヨパールカラム（直径５cm×長さ
５.５cm，東ソー社）に流速３ml/分で展開する。その
後、トリス緩衝液Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄
後、ヘパリン−トヨパールカラムに吸着したペプチド又
は蛋白質をトリス緩衝液Ｂ（２０mM Tris−ＨＣｌ, pH
７.５, １.０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出する。溶出液は、吸
光度光度計を用い、２８０nmの吸光度によりモニター
し、吸収度の高い画分、約３００mlを採取した。
【００１４】２）逆相液体クロマトグラフィー法による
精製 操作１）で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいた
コスモシール5C18-300カラム（直径４.６mm×長さ２５
０mm、ナカライテスク社）に展開し、０.１％ＴＦＡを
含む水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプチド又
は蛋白質をアセトニトリル濃度にして０〜８０％のリニ
アグラジェントにより溶出した。溶出液は、２１４nmの
吸光度によりモニターし、ピークごとに採取した。溶出
パターンを図１に示す。
精製 操作１）で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいた
コスモシール5C18-300カラム（直径４.６mm×長さ２５
０mm、ナカライテスク社）に展開し、０.１％ＴＦＡを
含む水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプチド又
は蛋白質をアセトニトリル濃度にして０〜８０％のリニ
アグラジェントにより溶出した。溶出液は、２１４nmの
吸光度によりモニターし、ピークごとに採取した。溶出
パターンを図１に示す。
【００１５】実施例２ 各ピークについての ALPase活
性の測定 骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株のROS 17/2.8細胞を２４ウ
エル培養プレートに１ウエル当たり２×１０4個ずつ、
１mlの５％牛胎児血清添加Ｆ１２培地（Flow Laborator
y USAより購入)中に播種し、ＣＯ2培養器中で３日間、
３７℃で培養した。その後、培養液を除き、細胞をＦ１
２培地で１回洗浄後、操作２）の各ピーク画分を含む無
血清培地（０.２％ウシ血清アルブミン添加Ｆ１２培
地）１mlを加え、更に２日間培養した。その後、培養液
を除き、細胞をダルベッコ改変ＰＢＳ(GIBCO Laboraotr
ies社より購入）で３回洗浄後、０.２％ノニデット(Non
idet）Ｐ−４０と０.９％塩化ナトリウムを含む溶液を
２００μｌ加え、室温で1時間放置し細胞を溶解し、つ
いでエッペンドルフ遠心機で５分間遠心後、上清を集め
た。その上清２０μｌに１０mM ｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート（ｐ−nitrophenyl phosphate）を含む溶
液（０.１Ｍグリシン、１mM ＺｎＣｌ2、１mM ＭｇＣｌ
2, pH １０.４）を加えて、撹拌した後、２０分、３７
℃で反応させ、反応混合物の４２０ nmの吸光度を測定
した。図１のピーク１のROS 17/2.8細胞におけるALPase
活性への効果の測定結果を表１に示す。用量はピーク画
分中のタンパク濃度を示し、ALPase活性の各数値は各群
の平均と標準偏差を示す。
性の測定 骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株のROS 17/2.8細胞を２４ウ
エル培養プレートに１ウエル当たり２×１０4個ずつ、
１mlの５％牛胎児血清添加Ｆ１２培地（Flow Laborator
y USAより購入)中に播種し、ＣＯ2培養器中で３日間、
３７℃で培養した。その後、培養液を除き、細胞をＦ１
２培地で１回洗浄後、操作２）の各ピーク画分を含む無
血清培地（０.２％ウシ血清アルブミン添加Ｆ１２培
地）１mlを加え、更に２日間培養した。その後、培養液
を除き、細胞をダルベッコ改変ＰＢＳ(GIBCO Laboraotr
ies社より購入）で３回洗浄後、０.２％ノニデット(Non
idet）Ｐ−４０と０.９％塩化ナトリウムを含む溶液を
２００μｌ加え、室温で1時間放置し細胞を溶解し、つ
いでエッペンドルフ遠心機で５分間遠心後、上清を集め
た。その上清２０μｌに１０mM ｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート（ｐ−nitrophenyl phosphate）を含む溶
液（０.１Ｍグリシン、１mM ＺｎＣｌ2、１mM ＭｇＣｌ
2, pH １０.４）を加えて、撹拌した後、２０分、３７
℃で反応させ、反応混合物の４２０ nmの吸光度を測定
した。図１のピーク１のROS 17/2.8細胞におけるALPase
活性への効果の測定結果を表１に示す。用量はピーク画
分中のタンパク濃度を示し、ALPase活性の各数値は各群
の平均と標準偏差を示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例３ 図１のピーク１のペプチドの物
理化学的性質の測定 １） アミノ酸配列分析による同定 実施例２で活性が確認された画分のペプチドの、Ｎ末端
配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６Ａ（アプ
ライトバイオシステムズ社）により通常の分析を行った
ところ、配列は決定できなかった。この理由としてはＮ
末端がブロックされていることが考えられた。次にこの
活性ペプチドを断片化しその部分アミノ酸配列の決定を
行った。活性ピーク蛋白質約１nmol（アミノ酸分析によ
り決定）をスピードバックコンセントレーター（SAVANT
社）にて乾固し、６Ｍグアニジン塩酸、０.２Ｍ Tris−
ＨＣｌ、２mM ＥＤＴＡ, pH８.０溶液２００μｌに溶か
し、ジチオスレイトール（ナカライテスク社）２０nmol
を加え、３７℃、１.５時間保温し反応させた。これ
に、４−ビニルピリジン（アルドリッチ社）１００nmol
を加え、さらに３７℃、１.５時間保温し反応させた。
この反応液を、あらかじめ０.１％ＴＦＡを含有する水
で平衡化しておいたコスモシール5C18-300カラム（直径
４.６mm×長さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開
し、０.１％ＴＦＡを含む水で十分に洗浄した。その
後、吸着したペプチド又は蛋白質をアセトニトリル濃度
にして０〜８０％のリニアグラジェントにより溶出し
た。溶出液は、２１４nmの吸光度によりモニターし、ピ
ークごとに採取し、ピリジルエチル化プロテインを得
た。
理化学的性質の測定 １） アミノ酸配列分析による同定 実施例２で活性が確認された画分のペプチドの、Ｎ末端
配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６Ａ（アプ
ライトバイオシステムズ社）により通常の分析を行った
ところ、配列は決定できなかった。この理由としてはＮ
末端がブロックされていることが考えられた。次にこの
活性ペプチドを断片化しその部分アミノ酸配列の決定を
行った。活性ピーク蛋白質約１nmol（アミノ酸分析によ
り決定）をスピードバックコンセントレーター（SAVANT
社）にて乾固し、６Ｍグアニジン塩酸、０.２Ｍ Tris−
ＨＣｌ、２mM ＥＤＴＡ, pH８.０溶液２００μｌに溶か
し、ジチオスレイトール（ナカライテスク社）２０nmol
を加え、３７℃、１.５時間保温し反応させた。これ
に、４−ビニルピリジン（アルドリッチ社）１００nmol
を加え、さらに３７℃、１.５時間保温し反応させた。
この反応液を、あらかじめ０.１％ＴＦＡを含有する水
で平衡化しておいたコスモシール5C18-300カラム（直径
４.６mm×長さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開
し、０.１％ＴＦＡを含む水で十分に洗浄した。その
後、吸着したペプチド又は蛋白質をアセトニトリル濃度
にして０〜８０％のリニアグラジェントにより溶出し
た。溶出液は、２１４nmの吸光度によりモニターし、ピ
ークごとに採取し、ピリジルエチル化プロテインを得
た。
【００１８】これをスピードバックコンセントレーター
にて乾固し、２０mMトリス−塩酸緩衝液、０.１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、pH８.５ ５００μｌに溶解した。２０mMトリス
緩衝液、０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH８.５に溶かしたＴＬＣ
Ｋ−トリプシン(EC3.4.21.4)（ワシントンバイオケミカ
ル社）を酵素／基質（モル化）で１／２００をなるよう
にを加え、３７℃、１６時間反応させ消化した。得られ
た断片ペプチドを含む溶液をコスモシール5C18-300カラ
ム（直径４.６mm×長さ２５０mm, ナカライテスク社）
にて分離し、ピークごとの画分を採取した。このうちの
３画分につき、アミノ酸配列を、アミノ酸シークエンサ
ー、モデル４７６Ａにより決定した。得られたアミノ酸
配列を蛋白質データベースにより、一致するものがある
か否かを調べたところ、リボヌクレアーゼＢＬ4である
ことが確認された（Hofsteenge. J., et al. 上述）。
得られたアミノ酸配列を配列表、配列番号１に示す。
にて乾固し、２０mMトリス−塩酸緩衝液、０.１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、pH８.５ ５００μｌに溶解した。２０mMトリス
緩衝液、０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH８.５に溶かしたＴＬＣ
Ｋ−トリプシン(EC3.4.21.4)（ワシントンバイオケミカ
ル社）を酵素／基質（モル化）で１／２００をなるよう
にを加え、３７℃、１６時間反応させ消化した。得られ
た断片ペプチドを含む溶液をコスモシール5C18-300カラ
ム（直径４.６mm×長さ２５０mm, ナカライテスク社）
にて分離し、ピークごとの画分を採取した。このうちの
３画分につき、アミノ酸配列を、アミノ酸シークエンサ
ー、モデル４７６Ａにより決定した。得られたアミノ酸
配列を蛋白質データベースにより、一致するものがある
か否かを調べたところ、リボヌクレアーゼＢＬ4である
ことが確認された（Hofsteenge. J., et al. 上述）。
得られたアミノ酸配列を配列表、配列番号１に示す。
【００１９】２）電気泳動による分析 図１のピーク１のペプチドの分子量を還元条件下のＳＤ
Ｓ電気泳動により確認したところ，見かけの分子量約1
2,000〜15,000を示した。この分子量は報告されている
リボヌクレアーゼＢＬ4の分子量と一致する（Hofsteeng
e.J., et al. 上述）。
Ｓ電気泳動により確認したところ，見かけの分子量約1
2,000〜15,000を示した。この分子量は報告されている
リボヌクレアーゼＢＬ4の分子量と一致する（Hofsteeng
e.J., et al. 上述）。
【００２０】
【発明の効果】本発明によって提供されるリボヌクレア
ーゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレア
ーゼＨＴ−２９は、骨肉腫由来骨芽細胞様細胞のALPase
活性を上げ、骨形成促進剤として有用である。
ーゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレア
ーゼＨＴ−２９は、骨肉腫由来骨芽細胞様細胞のALPase
活性を上げ、骨形成促進剤として有用である。
【００２１】
配列番号：１ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 起源： 生物名：ウシ（Bos taulus） 組織の種類：血清 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：１番目のXaaは、Pyro-Gln又はGlu、５０番目
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Glu Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Cys Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Glu Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Cys Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
【００２２】配列番号：２ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 起源： 生物名：ブタ（Porcine） 組織の種類：血清 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：１番目のXaaは、Pyro-Gln又はGlu、５０番目
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Tyr Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Tyr Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
【図１】ウシ新生児血清をヘパリンアフィニテイカラム
クロマトグラフ処理し、溶出された画分をさらに、逆相
液体クロマトグラフィーにより展開したパターンを示
す。矢印はリボヌクレアーゼＢＬ4を含む、活性画分
（ピーク１）である。
クロマトグラフ処理し、溶出された画分をさらに、逆相
液体クロマトグラフィーにより展開したパターンを示
す。矢印はリボヌクレアーゼＢＬ4を含む、活性画分
（ピーク１）である。
Claims (3)
- 【請求項１】 リボヌクレアーゼＢＬ4、ＰＬ3およびＨ
Ｔ−２９より成る群から選ばれたリボヌクレアーゼの１
種又は２種以上を有効成分とする骨折の予防および治療
剤。 - 【請求項２】 配列番号：１のウシのリボヌクレアーゼ
ＢＬ4である請求項１の骨折の予防および治療剤。 - 【請求項３】 配列番号：２のブタのリボヌクレアーゼ
ＰＬ3である請求項１の骨折の予防および治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6106737A JPH07309777A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 骨折の予防および治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6106737A JPH07309777A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 骨折の予防および治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07309777A true JPH07309777A (ja) | 1995-11-28 |
Family
ID=14441244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6106737A Pending JPH07309777A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 骨折の予防および治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07309777A (ja) |
-
1994
- 1994-05-20 JP JP6106737A patent/JPH07309777A/ja active Pending
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