JPH07309778A - 創傷治療剤 - Google Patents
創傷治療剤Info
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- JPH07309778A JPH07309778A JP6106738A JP10673894A JPH07309778A JP H07309778 A JPH07309778 A JP H07309778A JP 6106738 A JP6106738 A JP 6106738A JP 10673894 A JP10673894 A JP 10673894A JP H07309778 A JPH07309778 A JP H07309778A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 リボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌクレアーゼ
ＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨＴ−２９より成る創傷
治療剤。 【効果】 本発明により提供されるリボヌクレアーゼＢ
Ｌ4、リボヌクレアーゼＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨ
Ｔ−２９は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創傷
治療剤として有用である。
ＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨＴ−２９より成る創傷
治療剤。 【効果】 本発明により提供されるリボヌクレアーゼＢ
Ｌ4、リボヌクレアーゼＰＬ3またはリボヌクレアーゼＨ
Ｔ−２９は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので創傷
治療剤として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リボヌクレアーゼＢＬ
4、ＰＬ3およびＨＴ−２９より成る群から選ばれたリボ
ヌクレアーゼの１種又は２種以上を有効成分とする創傷
治療剤に関する。
4、ＰＬ3およびＨＴ−２９より成る群から選ばれたリボ
ヌクレアーゼの１種又は２種以上を有効成分とする創傷
治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】リボヌクレアーゼはＲＮＡ中のホスホジ
エステル結合を加水分解する酵素である。リボヌクレア
ーゼは動物細胞のほとんどの組織・体液にあり、環状ヌ
クレオチドを経て最終的にはヌクレオシド３−リン酸を
遊離するか、あるいはそれを末端にもつヌクレオチドを
形成する。ヒト尿中リボヌクレアーゼは、リンパ球や赤
血球の増殖を阻害することが知られている（Rabin. E.
Z., et al., Proc Eur Dial Transplant Assoc （197
7） vol 14, p528-534 ）。また、ウシの精液から精製
されたＡＳリボヌクレアーゼは、２倍体非悪性細胞株の
ヒト肺胚細胞であるＬＥＰ細胞の増殖を阻害することが
知られている（Cinatl. J., et al., FoliaBiol（197
7） vol.23,p235-2442 ）。さらにＡＳリボヌクレアー
ゼは白血病細胞のＥＬ−４腫瘍およびＢＰ−８腫瘍と共
にマウスに投与するとその腫瘍細胞数を減少させること
が知られている（Matousek, R. et al., Folia Biol（1
977） vol.23,p56-65 ）。
エステル結合を加水分解する酵素である。リボヌクレア
ーゼは動物細胞のほとんどの組織・体液にあり、環状ヌ
クレオチドを経て最終的にはヌクレオシド３−リン酸を
遊離するか、あるいはそれを末端にもつヌクレオチドを
形成する。ヒト尿中リボヌクレアーゼは、リンパ球や赤
血球の増殖を阻害することが知られている（Rabin. E.
Z., et al., Proc Eur Dial Transplant Assoc （197
7） vol 14, p528-534 ）。また、ウシの精液から精製
されたＡＳリボヌクレアーゼは、２倍体非悪性細胞株の
ヒト肺胚細胞であるＬＥＰ細胞の増殖を阻害することが
知られている（Cinatl. J., et al., FoliaBiol（197
7） vol.23,p235-2442 ）。さらにＡＳリボヌクレアー
ゼは白血病細胞のＥＬ−４腫瘍およびＢＰ−８腫瘍と共
にマウスに投与するとその腫瘍細胞数を減少させること
が知られている（Matousek, R. et al., Folia Biol（1
977） vol.23,p56-65 ）。
【０００３】リボヌクレアーゼはスーパーファミリーを
形作ることが知られており、モリタらはウシから少なく
とも７種類のリボヌクレアーゼを分離した（Morita,T.,
etal., Agric. Biol. Chem. (1987), vol.51, p2751-2
761）。スーパーファミリー中でリボヌクレアーゼＢＬ4
はウシ肝臓および血清から、リボヌクレアーゼＰＬ3は
ブタ肝臓から、そしてリボヌクレアーゼＨＴ−２９はヒ
ト結腸癌細胞から単離された。
形作ることが知られており、モリタらはウシから少なく
とも７種類のリボヌクレアーゼを分離した（Morita,T.,
etal., Agric. Biol. Chem. (1987), vol.51, p2751-2
761）。スーパーファミリー中でリボヌクレアーゼＢＬ4
はウシ肝臓および血清から、リボヌクレアーゼＰＬ3は
ブタ肝臓から、そしてリボヌクレアーゼＨＴ−２９はヒ
ト結腸癌細胞から単離された。
【０００４】リボヌクレアーゼＢＬ4およびリボヌクレ
アーゼＰＬ3はそれぞれ１１９個のアミノ酸から構成さ
れるポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は１１９個
のアミノ酸のうち、７個が異なるだけで相同性はかなり
高く、また、リボヌクレアーゼＨＴ−２９もアミノ酸構
成が類似しておりよく類似した遺伝子産生物であると推
測できる（Hofsteenge, J., et al., Biochemistry (19
89) vol.28, p9806-9813)）。
アーゼＰＬ3はそれぞれ１１９個のアミノ酸から構成さ
れるポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は１１９個
のアミノ酸のうち、７個が異なるだけで相同性はかなり
高く、また、リボヌクレアーゼＨＴ−２９もアミノ酸構
成が類似しておりよく類似した遺伝子産生物であると推
測できる（Hofsteenge, J., et al., Biochemistry (19
89) vol.28, p9806-9813)）。
【０００５】一方、創傷治療の過程において種々の成長
因子が関与していることが知られている（Dijke et a
l., Biotechnology (1989) vol.7, p793-798)。特に、
ＴＧＦ−β（transforming growth factor−β）やＰＤ
ＧＦ（platelet-derived growth factor）は、線維芽細
胞を増殖させ、障害部位へ細胞を誘引し、創傷の修復を
促進することが知られている。しかし、リボヌクレアー
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９が線維芽細胞を増殖させたり、創傷治療に
効果があるという報告はこれまでなされていなかった。
因子が関与していることが知られている（Dijke et a
l., Biotechnology (1989) vol.7, p793-798)。特に、
ＴＧＦ−β（transforming growth factor−β）やＰＤ
ＧＦ（platelet-derived growth factor）は、線維芽細
胞を増殖させ、障害部位へ細胞を誘引し、創傷の修復を
促進することが知られている。しかし、リボヌクレアー
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９が線維芽細胞を増殖させたり、創傷治療に
効果があるという報告はこれまでなされていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は創傷に対して優れた効果を有し、かつ副作用の少
ない新たな創傷治療薬として用いることのできるペプチ
ドを提供することである。より詳しくは、従来創傷治療
効果が示唆されていたＴＧＦ−β、ＰＤＧＦの如くそれ
自体多機能を有する生理活性物質は創傷治療以外の望ま
しくない作用を有することも考えられるので、そのよう
な副次的な活性を有せず、より創傷に特異的に作用する
ペプチドを提供することを目的とする。
課題は創傷に対して優れた効果を有し、かつ副作用の少
ない新たな創傷治療薬として用いることのできるペプチ
ドを提供することである。より詳しくは、従来創傷治療
効果が示唆されていたＴＧＦ−β、ＰＤＧＦの如くそれ
自体多機能を有する生理活性物質は創傷治療以外の望ま
しくない作用を有することも考えられるので、そのよう
な副次的な活性を有せず、より創傷に特異的に作用する
ペプチドを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々検討
の結果、リボヌクレアーゼＢＬ4が線維芽細胞増殖を促
進すること、さらに、リボヌクレアーゼＢＬ4と非常に
よく似た構造を有するリボヌクレアーゼＰＬ3およびリ
ボヌクレアーゼＨＴ−２９も同様の効果を有することを
見出し、本発明を完成した。
の結果、リボヌクレアーゼＢＬ4が線維芽細胞増殖を促
進すること、さらに、リボヌクレアーゼＢＬ4と非常に
よく似た構造を有するリボヌクレアーゼＰＬ3およびリ
ボヌクレアーゼＨＴ−２９も同様の効果を有することを
見出し、本発明を完成した。
【０００８】ヒトを含む哺乳類動物の胎児及び新生児の
血液中には、成長の激しい胎児及び新生児の各細胞組織
の成長を刺激する種々の成長因子が含有されることが考
えられる。量的に入手しやすいウシ新生児血清を出発原
料として、新たな線維芽細胞増殖活性を上げる蛋白因子
の精製分離を試みた。線維芽細胞増殖活性測定のために
は、例えば、Balb/3T3細胞株が使用できる。
血液中には、成長の激しい胎児及び新生児の各細胞組織
の成長を刺激する種々の成長因子が含有されることが考
えられる。量的に入手しやすいウシ新生児血清を出発原
料として、新たな線維芽細胞増殖活性を上げる蛋白因子
の精製分離を試みた。線維芽細胞増殖活性測定のために
は、例えば、Balb/3T3細胞株が使用できる。
【０００９】種々の成長因子は、ヘパリンに結合しやす
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフにより、さらに
細かい画分に分けることができる。これらの、各画分に
ついて線維芽細胞増殖活性を測定した。その結果、線維
芽細胞増殖活性を上昇する画分が見つかった。その画分
について、部分アミノ酸配列を決定し、蛋白質および遺
伝子配列データーベースと参照して、公知のペプチドで
あるかどうか調べた。その結果、公知のリボヌクレアー
ゼＢＬ4のアミノ酸配列に一致したことから、得られた
活性画分がリボヌクレアーゼＢＬ4であることが同定さ
れた（配列番号：１）。
いことが知られていたので、まず、ヘパリンアフィニテ
ィカラムクロマトグラフィでカラムに結合する画分を分
離し、ついで、逆相液体クロマトグラフにより、さらに
細かい画分に分けることができる。これらの、各画分に
ついて線維芽細胞増殖活性を測定した。その結果、線維
芽細胞増殖活性を上昇する画分が見つかった。その画分
について、部分アミノ酸配列を決定し、蛋白質および遺
伝子配列データーベースと参照して、公知のペプチドで
あるかどうか調べた。その結果、公知のリボヌクレアー
ゼＢＬ4のアミノ酸配列に一致したことから、得られた
活性画分がリボヌクレアーゼＢＬ4であることが同定さ
れた（配列番号：１）。
【００１０】リボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌクレアー
ゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は天然原料
の肝臓あるいは血清からの精製により、また知られてい
るアミノ酸を基にしてリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９を
コードするＤＮＡをそれぞれ化学的に合成することによ
り、又は、それぞれの遺伝子をクローン化することによ
り、当業者によく知られた遺伝子工学を利用して産生で
きる。
ゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９は天然原料
の肝臓あるいは血清からの精製により、また知られてい
るアミノ酸を基にしてリボヌクレアーゼＢＬ4、リボヌ
クレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアーゼＨＴ−２９を
コードするＤＮＡをそれぞれ化学的に合成することによ
り、又は、それぞれの遺伝子をクローン化することによ
り、当業者によく知られた遺伝子工学を利用して産生で
きる。
【００１１】これらのペプチドは、線維芽細胞増殖作用
を失わせずに、若干のアミノ酸残基の変更や化学修飾を
加えたり、あるいは、フラグメント化を行なうことによ
り、更に製剤に適したペプチドとなることが期待でき
る。
を失わせずに、若干のアミノ酸残基の変更や化学修飾を
加えたり、あるいは、フラグメント化を行なうことによ
り、更に製剤に適したペプチドとなることが期待でき
る。
【００１２】これらのペプチドは、水溶性が高く、創傷
治療には適当な水溶性基剤と混合して局所的に直接幹部
に塗布する投与法が最もふさわしいが、その他にも全身
性投与として、静脈内注射剤又は皮下投与剤として投与
することができ、また、微粒子のエアロゾル製剤とし
て、経鼻又は経肺的に投与することができる。
治療には適当な水溶性基剤と混合して局所的に直接幹部
に塗布する投与法が最もふさわしいが、その他にも全身
性投与として、静脈内注射剤又は皮下投与剤として投与
することができ、また、微粒子のエアロゾル製剤とし
て、経鼻又は経肺的に投与することができる。
【００１３】投与量は、局所投与では１〜１００μg/投
与部位／人／日、また全身性投与では０.１〜１０mg／k
g／日を投与する。以下に実施例により、本発明をさら
に詳しく説明する。
与部位／人／日、また全身性投与では０.１〜１０mg／k
g／日を投与する。以下に実施例により、本発明をさら
に詳しく説明する。
【００１４】
実施例１ ウシの新生児血清よりの線維芽細胞（Balb/3T3細胞）増
殖促進因子の精製 １） ヘパリンアフィニテイクロマトグラフィー法によ
る粗精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この新生
児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（２０mM Tris
−ＨＣｌ pH７.５ ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化してお
いたヘパリン−トヨパールカラム（直径５cm×長さ５.
５ｃm，東ソー社）に流速３ml／分で展開する。その
後、トリス緩衝液Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄
後、ヘパリン−トヨパールカラムに吸着したペプチド又
は蛋白質をトリス緩衝液Ｂ（２０mM Tris−ＨＣｌ, pH
７.５, １.０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出する。溶出液は、吸
光度光度計を用い、２８０nmの吸光度によりモニター
し、吸収度の高い画分、約３００mlを採取した。
殖促進因子の精製 １） ヘパリンアフィニテイクロマトグラフィー法によ
る粗精製 ウシ新生児血清（GIBCO Laboratories社より購入）１リ
ットルに塩化ナトリウムを２０.５ｇ加える。この新生
児血清を、あらかじめ、トリス緩衝液Ａ（２０mM Tris
−ＨＣｌ pH７.５ ０.５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化してお
いたヘパリン−トヨパールカラム（直径５cm×長さ５.
５ｃm，東ソー社）に流速３ml／分で展開する。その
後、トリス緩衝液Ａで同カラムを充分に洗浄する。洗浄
後、ヘパリン−トヨパールカラムに吸着したペプチド又
は蛋白質をトリス緩衝液Ｂ（２０mM Tris−ＨＣｌ, pH
７.５, １.０Ｍ ＮａＣｌ）で溶出する。溶出液は、吸
光度光度計を用い、２８０nmの吸光度によりモニター
し、吸収度の高い画分、約３００mlを採取した。
【００１５】２） 逆相液体クロマトグラフィー法によ
る精製 操作１）で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいた
コスモシール5C18-300カラム（直径４.６×長さ２５０m
m、ナカライテスク社）に展開し、０.１％ＴＦＡを含む
水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプチド又は蛋
白質をアセトニトリル濃度にして０〜８０％のリニアグ
ラジェントにより溶出した。溶出液は、２１４nmの吸光
度によりモニターし、ピークごとに採取した。溶出パタ
ーンを図１に示す。
る精製 操作１）で得た溶出液を、あらかじめ０.１％のトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水で平衡化しておいた
コスモシール5C18-300カラム（直径４.６×長さ２５０m
m、ナカライテスク社）に展開し、０.１％ＴＦＡを含む
水で十分に洗浄した。その後、吸着したペプチド又は蛋
白質をアセトニトリル濃度にして０〜８０％のリニアグ
ラジェントにより溶出した。溶出液は、２１４nmの吸光
度によりモニターし、ピークごとに採取した。溶出パタ
ーンを図１に示す。
【００１６】実施例２ 線維芽細胞増殖促進活性の測定 線維芽細胞株のBalb/3T3細胞（ＡＴＣＣより購入）を９
６ウエル培養プレートに１ウエル当たり５×１０3個、
播種し、１０％仔牛血清添加ダルベーコ改変イーグルＭ
ＥＭ培地（以下ＤＭＥ）１００μlを加え、培養器中で
２４時間、３７℃で培養した。その後、培養液を除き、
細胞を洗浄後、低血清培地（０.２％仔牛血清添加ＤＭ
Ｅ）１００μlを加え、更に３日間培養した。そこへ、
実施例１により得た各画分を１０μl加え、１５時間培
養した。ついで、3Ｈ-チミジンを７４ KBq／mlになるよ
う加え、６時間培養した。培養後、培地を除き、細胞を
集め細胞中に取込まれた3Ｈ−チミジンの量を測定し
た。その結果、図１中のピーク１（矢印）の画分に細胞
増殖促進活性が認められた。
６ウエル培養プレートに１ウエル当たり５×１０3個、
播種し、１０％仔牛血清添加ダルベーコ改変イーグルＭ
ＥＭ培地（以下ＤＭＥ）１００μlを加え、培養器中で
２４時間、３７℃で培養した。その後、培養液を除き、
細胞を洗浄後、低血清培地（０.２％仔牛血清添加ＤＭ
Ｅ）１００μlを加え、更に３日間培養した。そこへ、
実施例１により得た各画分を１０μl加え、１５時間培
養した。ついで、3Ｈ-チミジンを７４ KBq／mlになるよ
う加え、６時間培養した。培養後、培地を除き、細胞を
集め細胞中に取込まれた3Ｈ−チミジンの量を測定し
た。その結果、図１中のピーク１（矢印）の画分に細胞
増殖促進活性が認められた。
【００１７】実施例３ ピーク１のペプチドの物理化学的性質の測定 １） アミノ酸配列分析による同定 実施例２で活性が確認された画分のペプチドの、Ｎ末端
配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６Ａ（アプ
ライトバイオシステムズ社）により通常の分析を行った
ところ、配列は決定できなかった。この理由としてはＮ
末端がブロックされていることが考えられた。次にこの
活性ペプチドを断片化しその部分アミノ酸配列の決定を
行った。活性ピーク蛋白質約１nmol（アミノ酸分析によ
り決定）をスピードバックコンセントレーター（SAVANT
社）にて乾固し、６Ｍグアニジン塩酸、０.２Ｍ Tris−
ＨＣｌ、２mM ＥＤＴＡ, pH８.０溶液２００μｌに溶か
し、ジチオスレイトール（ナカライテスク社）２０nmol
を加え、３７℃、１.５時間保温し反応させた。これ
に、４−ビニルピリジン（アルドリッチ社）１００nmol
を加え、さらに３７℃、１.５時間保温し反応させた。
この反応液を、あらかじめ０.１％ＴＦＡを含有する水
で平衡化しておいたコスモシール5C18-300カラム（直径
４.６mm×長さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開
し、０.１％ＴＦＡを含む水で十分に洗浄した。その
後、吸着したペプチド又は蛋白質をアセトニトリル濃度
にして０〜８０％のリニアグラジェントにより溶出し
た。溶出液は、２１４nmの吸光度によりモニターし、ピ
ークごとに採取し、ピリジルエチル化プロテインを得
た。
配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６Ａ（アプ
ライトバイオシステムズ社）により通常の分析を行った
ところ、配列は決定できなかった。この理由としてはＮ
末端がブロックされていることが考えられた。次にこの
活性ペプチドを断片化しその部分アミノ酸配列の決定を
行った。活性ピーク蛋白質約１nmol（アミノ酸分析によ
り決定）をスピードバックコンセントレーター（SAVANT
社）にて乾固し、６Ｍグアニジン塩酸、０.２Ｍ Tris−
ＨＣｌ、２mM ＥＤＴＡ, pH８.０溶液２００μｌに溶か
し、ジチオスレイトール（ナカライテスク社）２０nmol
を加え、３７℃、１.５時間保温し反応させた。これ
に、４−ビニルピリジン（アルドリッチ社）１００nmol
を加え、さらに３７℃、１.５時間保温し反応させた。
この反応液を、あらかじめ０.１％ＴＦＡを含有する水
で平衡化しておいたコスモシール5C18-300カラム（直径
４.６mm×長さ２５０mm、ナカライテスク社）に展開
し、０.１％ＴＦＡを含む水で十分に洗浄した。その
後、吸着したペプチド又は蛋白質をアセトニトリル濃度
にして０〜８０％のリニアグラジェントにより溶出し
た。溶出液は、２１４nmの吸光度によりモニターし、ピ
ークごとに採取し、ピリジルエチル化プロテインを得
た。
【００１８】これをスピードバックコンセントレーター
にて乾固し、２０mMトリス−塩酸緩衝液、０.１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、pH８.５ ５００μｌに溶解した。２０mMトリス
緩衝液、０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH８.５に溶かしたＴＰＣ
Ｋ−トリプシン(EC3.4.21.4)（ワシントンバイオケミカ
ル社）を酵素／基質（モル化）で１／２００になるよう
にを加え、３７℃、１６時間反応させ消化した。得られ
た断片ペプチドを含む溶液をコスモシール5C18-300カラ
ム（直径４.６mm×長さ２５０mm, ナカライテスク社）
にて分離し、ピークごとの画分を採取した。このうちの
３画分につき、アミノ酸配列を、アミノ酸シークエンサ
ー、モデル４７６Ａにより決定した。
にて乾固し、２０mMトリス−塩酸緩衝液、０.１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、pH８.５ ５００μｌに溶解した。２０mMトリス
緩衝液、０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH８.５に溶かしたＴＰＣ
Ｋ−トリプシン(EC3.4.21.4)（ワシントンバイオケミカ
ル社）を酵素／基質（モル化）で１／２００になるよう
にを加え、３７℃、１６時間反応させ消化した。得られ
た断片ペプチドを含む溶液をコスモシール5C18-300カラ
ム（直径４.６mm×長さ２５０mm, ナカライテスク社）
にて分離し、ピークごとの画分を採取した。このうちの
３画分につき、アミノ酸配列を、アミノ酸シークエンサ
ー、モデル４７６Ａにより決定した。
【００１９】得られたアミノ酸配列を蛋白質データベー
スにより、一致するものがあるか否かを調べたところ、
リボヌクレアーゼＢＬ4であることが確認された（Hofst
eenge. J., et al. 上述）。得られたアミノ酸配列を配
列表、配列番号１に示す。
スにより、一致するものがあるか否かを調べたところ、
リボヌクレアーゼＢＬ4であることが確認された（Hofst
eenge. J., et al. 上述）。得られたアミノ酸配列を配
列表、配列番号１に示す。
【００２０】２） 電気泳動による分析 図１のピーク１のペプチドの分子量を還元条件下のＳＤ
Ｓ電気泳動により確認したところ、見かけの分子量約1
2,000〜15,000を示した。この分子量は報告されている
リボヌクレアーゼＢＬ4の分子量と一致する（Hofsteeng
e. J., et al. 上述）。以上、１）、２）に示された結
果より、線維芽細胞の増殖活性を有するピーク１のペプ
チドは新規な蛋白質であると確認された。
Ｓ電気泳動により確認したところ、見かけの分子量約1
2,000〜15,000を示した。この分子量は報告されている
リボヌクレアーゼＢＬ4の分子量と一致する（Hofsteeng
e. J., et al. 上述）。以上、１）、２）に示された結
果より、線維芽細胞の増殖活性を有するピーク１のペプ
チドは新規な蛋白質であると確認された。
【００２１】実施例４ リボヌクレアーゼＢＬ4の線維芽細胞増殖活性の測定 実施例２により得た本件蛋白質を、実施例２の方法に従
い、各ウエル当たり０.０３〜１μg／mlになるように加
え3Ｈ−チミジンの取込みを測定した。リボヌクレアー
ゼＢＬ4の線維芽細胞増殖活性の測定の結果を表１に示
す。各カラムは各群の平均と標準偏差を示す。
い、各ウエル当たり０.０３〜１μg／mlになるように加
え3Ｈ−チミジンの取込みを測定した。リボヌクレアー
ゼＢＬ4の線維芽細胞増殖活性の測定の結果を表１に示
す。各カラムは各群の平均と標準偏差を示す。
【００２２】
【表１】 この結果から、リボヌクレアーゼＢＬ4は１.０μg／ml
の濃度でに細胞増殖促進活性を有することが確認され
た。
の濃度でに細胞増殖促進活性を有することが確認され
た。
【００２３】
【発明の効果】本発明により提供されるリボヌクレアー
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので
創傷治療剤として有用である。
ゼＢＬ4、リボヌクレアーゼＰＬ3およびリボヌクレアー
ゼＨＴ−２９は線維芽細胞の増殖促進活性を有するので
創傷治療剤として有用である。
【００２４】
配列番号：１ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 起源： 生物名：ウシ（Bos taulus） 組織の種類：血清 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：１番目のXaaは、Pyro-Gln又はGlu、５０番目
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Glu Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Cys Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Glu Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Cys Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 起源： 生物名：ブタ（Porcine） 組織の種類：血清 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：１番目のXaaは、Pyro-Gln又はGlu、５０番目
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Tyr Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
のXaaは、Leu又はIleを示す。 配列： Xaa Asp Arg Met Tyr Gln Arg Phe Leu Arg Gln His Val Asp Pro Asp 1 5 10 15 Ala Thr Gly Gly Asn Asp Ser Tyr Cys Asn Leu Met Met Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Met Thr Ser His Gln Tyr Lys Arg Phe Asn Thr Phe Ile His Glu 35 40 45 Asp Xaa Trp Asn Ile Arg Ser Ile Cys Ser Thr Thr Asn Ile Gln Cys 50 55 60 Lys Asn Gly Gln Met Asn Cys Tyr Glu Gly Val Val Arg Val Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Pro Asn Cys Arg Tyr Arg Ala 85 90 95 Lys Ala Ser Thr Arg Arg Val Val Ile Ala Cys Glu Gly Asn Pro Glu 100 105 110 Val Pro Val His Phe Asp Lys 115 119
【図１】ウシ新生児血清をヘパリンアフィニテイカラム
クロマトグラフ処理し、溶出された画分をさらに、逆相
液体クロマトグラフィーにより展開したパターンを示
す。矢印はリボヌクレアーゼＢＬ4を含む、活性画分で
ある。
クロマトグラフ処理し、溶出された画分をさらに、逆相
液体クロマトグラフィーにより展開したパターンを示
す。矢印はリボヌクレアーゼＢＬ4を含む、活性画分で
ある。
Claims (3)
- 【請求項１】 リボヌクレアーゼＢＬ4、ＰＬ3およびＨ
Ｔ−２９より成る群から選ばれたリボヌクレアーゼの１
種又は２種以上を有効成分とする創傷治療剤。 - 【請求項２】 配列番号：１のウシのリボヌクレアーゼ
ＢＬ4である請求項１の創傷治療剤。 - 【請求項３】 配列番号：２のブタのリボヌクレアーゼ
ＰＬ3である請求項１の創傷治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6106738A JPH07309778A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 創傷治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6106738A JPH07309778A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 創傷治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07309778A true JPH07309778A (ja) | 1995-11-28 |
Family
ID=14441273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6106738A Pending JPH07309778A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 創傷治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07309778A (ja) |
-
1994
- 1994-05-20 JP JP6106738A patent/JPH07309778A/ja active Pending
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