JPH07196527A - ペプチドまたはその誘導体と、細胞増殖賦活化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞増殖賦活作用のある新規なペプチド類、
その誘導体、および従来のＥＧＦが単独添加された薬剤
よりも、さらに効果的な細胞増殖賦活化剤を提供する。 【構成】 配列番号１から配列番号７のアミノ酸配列を
有するペプチドまたはその誘導体。配列番号１から配列
番号７のペプチド、その誘導体またはそれらの混合物と
上皮細胞成長因子とを有効成分として含有する細胞増殖
賦活化剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ペプチドまたはその
誘導体と、細胞増殖賦活化剤に関するものである。さら
に詳しくは、この発明は特定のアミノ酸配列を有する新
規なペプチドまたはその誘導体と、皮膚、毛髪、消化管
上皮等の細胞の増殖賦活化剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリン（lactoferrin 、以下Ｌ
ｆと記載することがある）は、母乳中に極めて多量に含
まれている分子量約８０，０００の鉄結合性蛋白質であ
って、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブド
ウ球菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知
られている［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Jo
urnal of Pediatrics)、第９４巻、第１ページ、１９７
９年、およびジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス
(Journal of Dairy Science)、第６７巻、第６０ペー
ジ、１９８４年］。

【０００３】また最近では、ラット小腸上皮クリプト細
胞およびマウス線維芽細胞Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３のＤＮＡ
合成がＬｆにより促進されることが明らかにされ［ペデ
ィアトリック・リサーチ(Pediatric Research) 、第２
１巻、第５６３ページ、１９８７年、およびアグリカル
チャル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ−（Agri
cultural and Biological Chemistry ）、第５３巻、第
３１ペ−ジ、１９８９年］、新たな細胞増殖刺激因子と
して注目されている。

【０００４】Ｌｆおよびその分解物については、抗菌性
およびチロシナーゼ活性阻害（ヨーロッパ特許公開第４
３８７５０号）、細胞への病原菌付着防止（特開平３−
２２０１３０号公報）、抗ウイルス作用（特開平１−２
３３２２６号公報）等が知られてもいる。

【０００５】一方、細胞増殖活性を有するペプチドとし
ては、いわゆる細胞成長因子が知られており（日本組織
培養学会編、「細胞成長因子」、朝倉書店、１９８４年
および日本組織培養学会編、「細胞成長因子ＰａｒｔＩ
Ｉ」、朝倉書店、１９８７年）、たとえば、上皮細胞成
長因子（epidermal growth factor ，ＥＧＦ）、血小板
由来成長因子（platelet-derived growth factor、ＰＤ
ＧＦ）、インシュリン様成長因子（Insulin-like growt
h factor、ＩＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（basi
c fibroblast growth factor、ｂＦＧＦ）、酸性線維芽
細胞成長（acidic fibroblast growth factor 、ａＦＧ
Ｆ）等が公知となっている。

【０００６】このうちＥＧＦは、多種多様な細胞に対し
て細胞増殖作用を有する分子量約 6,000のペプチドであ
り、哺乳類のすべての体液中に含まれている。ＥＧＦの
発見は1962年と極めて古く、以来様々な応用研究が盛ん
に行われ、ＥＧＦに創傷治癒効果があること［ジャ−ナ
ル・オブ・サ−ジカル・リサ−チ（Journal of Surgica
l Research）、第３３巻、第１６４ペ−ジ、１９８２
年、およびジャ−ナル・オブ・エキスペリメンタル・メ
ディシン（Journal of Experimental Medicine)、第１
６３巻、第１３１９ペ−ジ、１９８６年］、ＥＧＦが角
膜損傷の治癒に有効であること［エキスペリメンタル・
アイ・リサ−チ(Experimental Eye Research) 、第４０
巻、第４７ペ−ジ、１９８５年、およびインベスティゲ
イティブ・オフサルモロジ−・アンド・ビジュアル・サ
イエンス（Investigative Ophthalmology & Visual Sci
ence）、第２６巻、第１０５ペ−ジ、１９８５年］等が
明らかにされている。

【０００７】これらの知見に基づき、ＥＧＦを皮膚用剤
に応用した例も知られている。すなわち、皮膚に対して
は、皮膚細胞の賦活化、新陳代謝の促進、創傷治癒効果
等により、滑らかでしっとりした若々しい肌を与え、毛
髪に対しては、毛母細胞の賦活化、毛髪の成長促進、抜
毛防止効果等により養毛、育毛および脱毛防止作用を与
える皮膚用剤が提案されている（特開昭６１−５００６
号公報）。

【０００８】また、近年、食品蛋白質の加水分解物から
種々の生理活性ペプチドが単離され、栄養面での本来の
機能に加え、食品蛋白質には潜在的調節因子が含まれて
いると考えられるようになってきた。たとえば、牛カゼ
インの加水分解物からマウス線維芽細胞Ｂａｌｂ／ｃ３
Ｔ３のＤＮＡ合成を促進する細胞増殖活性ペプチドが単
離され、構造が決定され、ウシβ−カゼインの第１７７
位から第１８３位のヘプタペプチド（Ala-Val-Pro-Tyr-
Pro-Gln-Arg ）に相当することが明らかにされている
（化学と生物、第２５巻、第２０７ペ−ジ、１９８７
年）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従来、ＥＧＦを有効成
分として含有する創傷治癒剤、皮膚用剤等が知られてい
たが、それらの効果は必ずしも十分なものではなかっ
た。

【００１０】この発明の発明者等は、ラクトフェリン類
の加水分解物の生物学的活性について研究を行っていた
が、ウシＬｆの加水分解物中に、抗菌性を有するペプチ
ドとは全く異なり、かつＥＧＦの作用を増強し得るペプ
チドが存在することを発見し、そのペプチドを単離して
アミノ酸配列を初めて明らかにした。

【００１１】この発明は、以上のとおりの新規な事実に
基づいてなされたものであり、細胞増殖賦活化作用を有
する新規なペプチドまたはその誘導体を提供することを
目的としている。

【００１２】またこの発明は、従来のＥＧＦ単独添加の
薬剤よりも、さらに効果的な細胞増殖賦活化剤を提供す
ることを目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、配列番号１から配列番号７のい
ずれかのアミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導
体を提供する。

【００１４】またこの発明は、配列番号１から配列番号
７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド、その誘
導体またはそれらの混合物と上皮細胞成長因子とを有効
成分として含有する細胞増殖賦活化剤をも提供する。

【００１５】なお、この発明の細胞増殖賦活化剤におい
ては、上記ペプチド、その誘導体またはその混合物が、
少なくとも０．１μｇ／ｇの割合で含有されていること
を望ましい態様としてもいる。

【００１６】以下、この発明について詳しく説明する。

【００１７】この発明のペプチドまたはその誘導体（以
下、これらをペプチド類と記載することがある）の製造
について例示すれば、次のとおりである。まず、ペプチ
ド類製造のための出発物質としてラクトフェリン類を使
用する。このラクトフェリン類は、市販のＬｆ、獣乳、
人乳から常法により分離されるＬｆ、これらのＬｆから
常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラク
トフェリンに常法により鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金
属を完全にまたは一部キレ−トさせた金属飽和、または
金属部分飽和ラクトフェリン、またはこれらの混合物の
いずれであってもよい。

【００１８】次いでラクトフェリン類を酸または酵素で
加水分解する。酸による加水分解は、ラクトフェリン類
を０．１〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水ま
たは精製水等に溶解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等
の無機酸、またはクエン酸等の有機酸を添加し、溶液の
ｐＨを１〜４、望ましくは２〜３に調整する。次いで、
このようにして得られた溶液を、調整されたｐＨに応じ
て適当な温度で所定時間加熱して加水分解する。例え
ば、ｐＨが１〜２に調整された場合には８０〜１３０
℃、望ましくは９０〜１２０℃で、ｐＨ２〜４に調整さ
れた場合には１００〜１３０℃、望ましくは１００〜１
２０℃で、それぞれ１〜１２０分間、望ましくは５〜６
０分間加熱する。

【００１９】酵素により加水分解する場合には、ラクト
フェリン類を０．５〜２０％、望ましくは５〜１５％の
濃度で水、精製水等に溶解し、得られた溶液を使用酵素
の至適ｐＨに調整して加水分解する。使用する酵素には
特に制限がなく、市販の酵素、例えばモルシンＦ（商
標。盛進製薬社製。至適ｐＨ２．５〜３．０）、豚ペプ
シン（和光純薬社製。至適ｐＨ２〜３）スミチームＡＰ
（商標。新日本化学社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＭ
（商標。アマノ製薬社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＡ
（商標、アマノ製薬社製。至適ｐＨ７．０）、トリプシ
ン（ノボ社製。至適ｐＨ８．０）等を単用または任意に
併用するが、特に豚ペプシン、スミチームＡＰが望まし
い。前記の酵素の他に、例えば、市販のエキソペプチダ
ーゼを含有する醤油酵素（田辺製薬社製）を組み合わせ
て使用することもできる。使用する酵素の量は、基質に
対して０．１〜５．０％の範囲、特に、０．５〜３．０
％が望ましい。

【００２０】すなわち、この酵素による加水分解は、具
体的には、ラクトフェリン類の溶液のｐＨを調整し、上
記の酵素を適量添加した後、得られた溶液の温度を１５
〜５５℃、望ましくは３０〜５０℃で３０〜６００分
間、望ましくは６０〜３００分間保持してラクトフェリ
ン類を加水分解する。次いで溶液をそのまま、または中
和した後、酵素を常法により加熱失活する。

【００２１】得られたラクトフェリン類の加水分解物か
ら、例えば次のようにしてこの発明のペプチドを単離す
ることができる。すなわち、ウシラクトフェリンをペプ
シンで加水分解した分解物を水（ＭｉｌｌｉＱ水）に溶
解し、ＯＤＳ１２０−Ｔ（東ソ−社製）を充填したカラ
ム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）により、０．５％トリフ
ルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０４１％トリフルオロ
酢酸を含む９０％アセトニトリル水溶液（Ｂ液）の直線
濃度句配により単離する。さらに詳細には、ウシラクト
フェリンのペプシン加水分解物のＭｉｌｌｉＱ水溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを、Ａ液とＢ液が８０％
対２０％の混合率（Ａ液：Ｂ液＝８０：２０）で平衡化
したＯＤＳ１２０−Ｔに１分当たり０．８ｍｌの流速で
通液し、５分後、３０分間でＢ液の濃度を６０％まで増
加する直線濃度句配（Ａ液対Ｂ液の比率を８０対２０か
ら、Ａ液対Ｂ液の比率を４０対６０）にかけ（この間の
流速も０．８ｍｌ／分である）、通液開始後、３分から
７分（フラクション１）、７分から１０分（フラクショ
ン２）、１４分から１８分（フラクション３）、１８分
から２１分（フラクション４）、および２１分から２３
分（フラクション５）の間に溶出されるペプチドを分取
する。活性ペプチドはフラクション２に含まれるので、
フラクション２を濃縮し、乾燥し、ＭｉｌｌｉＱに溶解
し、再度前記の逆相高速液体クロマトグラフィ−によ
り、同一条件で活性ペプチドを精製する。

【００２２】次にこの発明のペプチドのアミノ酸配列の
同定について説明する。

【００２３】以上のようにしてウシＬｆの加水分解物か
ら単離したペプチドを６規定塩酸で加水分解し、アミノ
酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。
また、同一の試料を気相式シークェンサー（アプライド
・バイオシステムズ社製）を用いてエドマン分解を行
い、アミノ酸残基の配列を決定した。その結果、このペ
プチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、ウシ
ＬｆのＮ末端から第７９位〜第９３位に相当するペンタ
デカペプチドであることが、この発明の発明者らにより
初めて明らかにされた。

【００２４】この発明のペプチドを化学的に合成する例
を示せば次のとおりである。ペプチド自動合成装置（例
えば、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製。LK
B Biolynx 4170）を用い、シェパード等［ジャーナル・
オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ（Journa
l of Chemical Society Perkin Ｉ）、第５３８ペー
ジ、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて
合成する。アミン官能基を９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル（Fmoc）基で保護したアミノ酸（以下Fmoc−ア
ミノ酸と略記する）に、Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを添加して所望のアミノ酸の無水物を生成
させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成に用いる。ペプ
チド鎖を製造するためにＣ−末端のアミノ酸残基に相当
するFmoc−アミノ酸無水物を、そのカルボキシル基を介
し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウルトロシン
Ａ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメチ
ルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のアミン官
能基の保護基を除去する。のち所望のペプチドのアミノ
酸配列のＣ−末端から２番目のアミノ酸残基に相当する
Fmoc−アミノ酸無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基を介
して樹脂に固定された１番目のアミノ酸の脱保護アミン
官能基にカップリングさせる。以下同様にして順次所望
のアミノ酸を固定する。全部のアミノ酸のカップリング
が終了し、所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形成され
た後、溶媒（例えば、９４％トリフルオロ酢酸、５％フ
ェノールおよび１％エタンジオールからなる）で保護基
の除去およびペプチドの脱離を行い、高速液体クロマト
グラフ法によりペプチドを精製する。

【００２５】この発明のペプチドは、前記方法の他、組
換えＤＮＡ技術により製造することもでき、ラクトフェ
リン類の加水分解物から単離されたもの、組換えＤＮＡ
技術により製造されたもの、化学的に合成されたもの、
またはこれらの混合物のいずれのものであってもこの発
明の細胞増殖賦活化剤に使用できる。

【００２６】また、この発明においては、配列番号１か
ら配列番号７のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチ
ド、その誘導体、それらの薬理学的または食品学的に許
容される塩およびそれらの２以上の混合物からなる群よ
り選択される物質を有効成分として含有させることもで
きる。

【００２７】このペプチドの誘導体としては、アセチル
体、アミド体、およびフォスフォ体（リン酸化体）等で
ある。アセチル体は、ラクトフェリンの加水分解物から
得られたペプチドあるいは上記のように合成したペプチ
ドを無水酢酸あるいは塩化アセチルと反応させることで
調製できる。アセチルの代わりにプロピル等のいわゆる
脂肪酸もペプチドに導入できる。導入には脂肪酸の酸塩
化物や活性エステル体を用いる。アミド体は、上記の固
相合成で用いたウルトロシンＡ樹脂の代わりにアミド体
合成用樹脂であるウルトロシンＣ樹脂（ファルマシアＬ
ＫＢバイオテクノロジー社製）を用い合成できる。フォ
スフォ体（リン酸化体）は、ラクトフェリンの加水分解
物から得られたペプチド、合成したペプチド、またはそ
れらのアセチル体あるいはアミド体をセリンとスレオニ
ンの側鎖をリン酸化する酵素であるプロテインキナ−ゼ
Ｃ（コスモバイオ社製）やチロシンの側鎖をリン酸化す
る酵素であるチロシンキナ−ゼ（オンコジ−ン・サイエ
ンス社製）で処理することにより調製できる。

【００２８】この発明において使用するＥＧＦは公知の
物質であり、常法により人尿、獣乳または人乳から単離
されたもの、組換えＤＮＡ技術により製造されたもの、
化学的に合成されたもの、市販品またはこれらの混合
物、のいずれのものであってもよい。

【００２９】この発明の細胞増殖賦活化剤は、一般的な
医薬製剤の形態で実用に供することができる。使用目的
に応じて各種の剤形を適宜選択することができ、粉剤、
顆粒剤、カプセル剤、錠剤、液状塗布剤、ロ−ション
剤、エアゾ−ル剤（スプレ−）、軟膏剤、坐剤、注射剤
等として使用し得る。

【００３０】この発明のペプチドまたはその誘導体は、
医薬品、化粧料および養毛剤の成分としても使用するこ
とができ、例えば、胃腸薬、目薬、外用剤等の医薬品と
して、化粧水、クリ−ム、ファンデ−ション、乳液等の
皮膚に適用される化粧品として、またヘア−クリ−ム、
ヘア−リキッド、ヘア−ロ−ション、ヘア−リンス、ヘ
ア−トニック、ポマ−ド、シャンプ−等の頭皮および毛
髪に適用される毛髪用化粧品として使用し得る。

【００３１】この発明の細胞増殖賦活剤のペプチドおよ
びＥＧＦの濃度は、それぞれ０．１μｇ〜１００ｍｇ／
ｇおよび０．０１ｎｇ〜１０μｇ／ｇが望ましい範囲で
ある。 この発明のペプチドおよび細胞増殖賦活化剤に
併用するＥＧＦは、いずれも天然物であるから、それら
の安全性については問題がない。

【００３２】次に試験例を示してこの発明の作用効果を
説明する。 試験例１ この試験は、ウシＬｆから得られたペンタデカペプチド
のアミノ酸配列を決定するために行った。 （１）試料の調製 実施例１と同一の方法により調製した。 （２）試験方法 単離されたペンタデカペプチドのアミノ酸配列は以下の
とおり決定した。実施例１に示すように最終的に逆相高
速液体クロマトグラフィ−で単一のピークに精製したペ
プチド５μｇを０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液２５
μｌに溶解し、ポリブレンで処理したグラスファイバー
フィルターに滴下した。フィルターを乾燥し、気相式自
動シークェンサー（ＡＢＩ４７３Ａプロテインシークェ
ンサ−。アプライド・バイオシステムズ社製）によりア
ミノ酸配列を決定した。 （３）試験結果 このペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有
し、ウシＬｆのＮ末端から第７９位〜第９３位に相当す
るペンタデカペプチドであることが明らかになった。な
お、他の方法により調製したＬｆ由来のペプチドについ
ても同様に試験を行い、配列番号１のアミノ酸配列を有
することを確認した。 試験例２ この試験は、この発明のペプチドの細胞増殖賦活化活性
を調べるために行った。（１）試料の調製 実施例１と同一の方法により分画フラクション（１−
５）を調整した。 （２）試験方法 マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３またはラット小腸上
皮細胞ＩＥＣ１８（共にAmerican Type Culture Collec
tionから購入）を９６穴カルチャ−プレ−トに１穴当た
り５０００個ずつ蒔き、１０％牛胎児血清を含むダルベ
ッコ変法イ−グル培養液（日水製薬社製。以下ＦＢＳ−
ＤＭＥＭと略記する）で細胞がコンフルエント（細胞密
度が増し細胞どうしが接触することで増殖がほぼ停止す
ることを意味する）になるまで培養した（培養液は、１
穴当たり０．１ｍｌ使用した）。培養液を０．２％ＦＢ
Ｓ−ＤＭＥＭと交換し、さらに１日培養し、細胞を静止
期に導入し、試験検体を含む０．２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ
（０．１ｍｌ）で１７時間培養した。次に、培養液を³
Ｈ−チミジン（ＩＣＮバイオメディカル社製。１μＣ／
ｍｌ）を含む０．２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（０．１ｍｌ）
と交換し、さらに２時間培養した。培養液を除き、０．
１％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を１穴当たり０．１
ｍｌ加え細胞を溶解した。セルハ−ベスタ−（Ｓｋａｔ
ｒｏｎ ＩＮＣ社製）によりＤＮＡをフィルタ−（Ｓｋ
ａｔｒｏｎ ＩＮＣ社製）上に回収し、ＤＮＡに取り込
まれ³ Ｈ−チミジン量を液体シンチレイションカウンタ
−（ＬＫＢ社製）で測定した。なお、試験検体は、何も
添加しない試料、分画フラクション（１〜５）を５０μ
ｇ／ｍｌ添加した試料、ＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ添加し
た試料、およびＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌと分画フラクシ
ョン（１〜５）を５０μｇ／ｍｌ添加した試料である。 （３）試験結果 この試験の結果は、表１および２に示すとおりである。
表１は、マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、表２は、
ラット小腸上皮細胞ＩＥＣ１８を用いた³ Ｈ−チミジン
の取り込み活性試験の結果を示している。なお、結果
は、実測値および無添加対照群あるいはＥＧＦのみを添
加した群の値を１００％としたときの相対値で表してい
る。

【００３３】表１および表２から明らかなように、フラ
クション２に著しい活性が認められた。すなわち、マウ
ス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３では（表１）、フラクシ
ョン２による³ Ｈ−チミジンの取り込み量は、ＥＧＦ無
添加の場合、対照群の１５２％、ＥＧＦを添加した場合
は、１３５％であった。ラット小腸上皮細胞ＩＥＣ１８
では（表２）、フラクション２による³ Ｈ−チミジンの
取り込み量は、ＥＧＦ無添加の場合、対照群の１０８
％、ＥＧＦを添加した場合は、１２５％であった。この
結果に基づいて、試験例１に示したように、フラクショ
ン２から活性ペプチドを単離し、構造を決定した。な
お、他のペプチドについてもほぼ同様な結果が得られ
た。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】 試験例３ この試験は、活性ペプチドの有効量を決定するために行
った。 （１）試料の調製 実施例１と同一の方法により調製した。 （２）試験方法 ラット小腸上皮細胞ＩＥＣ１８（American Type Cultur
e Collectionから購入）を用い、試験例２と同一の方法
により試験した。なお、試験試料は、種々の濃度の活性
ペプチド（フラクション２）を添加した試料、およびＥ
ＧＦを１０ｎｇ／ｍｌと種々の濃度の活性ペプチド（フ
ラクション２）を共に添加した試料である。（３）試験
結果 この試験の結果は、表３に示すとおりである。なお、結
果は、実測値および無添加対照群あるいはＥＧＦのみを
添加した群の値を１００％としたときの相対値で表して
いる。

【００３６】表３から明らかなように、１０ｎｇ／ｍｌ
のＥＧＦと活性ペプチド（フラクション２）を２５ある
いは５０μｇ／ｍｌを共に添加すると、³ Ｈ−チミジン
の取り込み量は、ＥＧＦのみを添加した群のそれぞれ１
２９％、１２５％であり、５０μｇ／ｍｌ以下の濃度で
も有効であることが明らかになった。なお、他のペプチ
ドについてもほぼ同様な結果が得られた。

【００３７】

【表３】 参考例（ＥＧＦの調製） ＥＧＦは、コ−エンおよびカ−ペンタ−の方法［プロス
ィ−ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシス・ユ−・エス・エイ（Proceedings of t
he Natlional Academy of Sciences U.S.A.)、第７２
巻、第１３１７ペ−ジ、１９７５年］、サベ−ジおよび
ハ−パ−の方法［アナリティカル・バイオケミストリ−
（Analytical Biochemistry ）、第１１１巻、第１９５
ペ−ジ、１９８１年）］および西室らの方法［ケミカル
・アンド・ファ−マセウティカル・ブレティン（Chemic
al and Pharmacuetical Bulletin) 、第３３巻、第４０
３７ペ−ジ、１９８５年］によりヒト尿から次のように
して調製した。

【００３８】約２０リットルのヒト原尿に氷酢酸１リッ
トルを加えて酸性とし、濃塩酸を加えてｐＨを３．０〜
３．３に調整した。イオン交換樹脂Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０
（バイオラッド社製）を氷酢酸でｐＨを３．１に調整
し、５％酢酸で洗浄し、尿に加え、４℃で１８時間撹拌
した。２〜４時間放置後上澄を廃棄し、該樹脂を０．０
１規定塩酸で洗浄し、１モル酢酸アンモニウム（ｐＨ
８．０）でＥＧＦを溶出させた。溶出液を凍結乾燥し、
乾燥物を５０ｍｌの蒸留水に溶解し、ペプスタチン
（０．５ｍｇ）、２ミリモルのアルギニン、２００ｍｇ
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した。

【００３９】この溶液に１，５００ｍｌのエタノールを
加えて撹拌し、３０分間放置し、１，０００×ｇで２０
分間遠心し、沈査に２ミリモルのアルギニン１５ｍｌを
加え、塩酸でｐＨを３．０に調整し、さらに、３０，０
００×ｇ２０分間遠心し、上澄を得た。

【００４０】０．０５％ギ酸で平衡化したＤＥＡＥセル
ロース（ワットマン社製）を充填したカラム（４×１４
ｃｍ）に上記上澄を通液し、カラムに吸着せずに溶出す
るＥＧＦを集め、溶出液を凍結乾燥し、乾燥物を２０ｍ
ｌの０．０５規定塩酸で溶解し、ｐＨを１．５に調整
し、３，０００×ｇで３０分間遠心し、上澄を得た。

【００４１】Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−１０（バイオラッド社
製）を充填したカラム（４×９０ｃｍ）を０．０５規定
塩酸で平衡化し、毎時４２ｍｌの流速で溶出させた。大
部分のＵＶ吸収物質は１．５カラム容積に溶出するが、
ＥＧＦは１．７カラム容積以後に溶出した。活性分画を
集め、アンモニア水でｐＨを６．０に調整し、凍結乾燥
した。乾燥物を０．０４モル酢酸アンモニウム（ｐＨ
３．９）５０ｍｌに溶解し、限外濾過して５ｍｌに濃縮
した。

【００４２】ＣＭセルロース（ワットマン社製）を充填
したカラム（０．９×１０ｃｍ）を０．０４モル酢酸ア
ンモニウムで平衡化し、上記濃縮液を添加し、０．０４
モル酢酸アンモニウムで洗浄し、のち１４ｍｌの１モル
酢酸アンモニウムで溶出し、溶出液を凍結乾燥し、０．
０２モル酢酸アンモニウム（ｐＨ５．３）５ｍｌに溶解
した。

【００４３】ＤＥ−５２セルロース（ワットマン社製）
を充填したカラム（０．９×１０ｃｍ）を０．０２モル
酢酸アンモニウム（ｐＨ５．３）で平衡化し、毎時８ｍ
ｌの流速で溶出し、上記溶液を添加後０．０２モル酢酸
アンモニウムで洗浄し、０．０２〜０．３モル酢酸アン
モニウムの濃度勾配で溶出し、３つのピーク（１，２，
３）が得られ、ＥＧＦ活性の主要なピークは１と３であ
り、約１５０〜２５０μｇのＥＧＦを得た。

【００４４】次に実施例を示してこの発明をさらに詳し
く説明するが、この発明は、以下の例に限定されるもの
ではない。

【００４５】

【実施例】

実施例１ ラクトフェリン加水分解物からのペンタデカペプチド
を、次の方法により製造した。ウシラクトフェリン（オ
レオフィナ社製）５００ｇを、９．５リットルの水に溶
解し、豚ペプシン（和光純薬工業社製）１０ｇを添加
し、３７℃で６時間保持して加水分解し、のち８５℃で
５分間加熱して酵素を失活させた。

【００４６】得られたペプシン加水分解物をＭｉｌｌｉ
Ｑ水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、この溶液０．１
ｍｌを、０．５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と
０．０４１％トリフルオロ酢酸を含む９０％アセトニト
リル水溶液（Ｂ液）が８０％対２０％の混合率（Ａ液：
Ｂ液＝８０：２０）で平衡化したＯＤＳ１２０−Ｔ（東
ソ−社製）を充填したカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ）に、１分当たり０．８ｍｌの流速で通液した。５分
後から３０分間でＢ液の濃度を６０％まで増加する直線
濃度句配（Ａ液対Ｂ液の比率を８０対２０から、Ａ液対
Ｂ液の比率を４０対６０）にかけた。この間の流速も
０．８ｍｌ／分である。通液開始後、３分から７分（フ
ラクション１）、７分から１０分（フラクション２）、
１４分から１８分（フラクション３）、１８分から２１
分（フラクション４）、および２１分から２３分（フラ
クション５）の間に溶出される分画を分取した。この一
連の操作を１０回反復した。

【００４７】前記試験例２の結果から活性ペプチドはフ
ラクション２に含まれるので、フラクション２を濃縮
し、乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ（０．１ｍｌ）に溶解し、再
度前記逆相高速液体クロマトグラフィ−により、同一条
件で活性ペプチドを精製した。

【００４８】最終的に活性ペプチドを含む画分（精製し
たフラクション２）を濃縮し、乾燥し、ＭｉｌｌｉＱ
（０．１ｍｌ）に再度溶解し、凍結乾燥し、活性ペプチ
ドを得た。この方法では、ウシラクトフェリンのペプシ
ン加水分解物１０ｍｇから約１５０μｇの割合で配列番
号１のアミノ酸配列を有する活性ペプチドが得られた。 実施例２ 市販のペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイ
オテクノロジー社製。Biolynx 4170）を用い、配列番号
１のアミノ酸配列を有するペンタデカペプチドを合成し
た。合成には、アミノ酸のαアミノ基を９−フルオレニ
ルメトキシカルボニル（Fmoc）基で保護したFmoc−アミ
ノ酸の３、４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ
−１、２、３、−ベンゾトリアジンエステル（ＯＤｈｂ
ｔ）またはペンタフルオロフェニルエステル（０Ｐｆ
ｐ）を用い、いわゆる活性エステル法で順次Ｃ末端から
ペプチド鎖を延長するステップワイズエロンゲ−ション
・ストラテジ−により目的とするペンタデカペプチドを
固相法により合成した。なお、チロシン、セリンおよび
スレオニンの側鎖の水酸基は第三ブチル（ｔＢｕ）基
で、グルタミン酸の側鎖のカルボキシル基は第三ブチル
エステル（ＯｔＢｕ）基で、リジンの側鎖は第三ブチル
オキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で、グルタミンおよびヒ
スチジンの側鎖はトリチル（Ｔｒｔ）基で保護した。そ
の他のペンタデカペプチドの構成アミノ酸であるアラニ
ン、イソロイシン、グリシンおよびプロリンの側鎖には
保護を必要とする官能基はない。

【００４９】この合成で用いたFmoc−アミノ酸の活性エ
ステルは、Fmoc-Tyr(tBu)-ODhbt 、Fmoc-Thr(tBu)-ODhb
t 、Fmoc-Ser(tBu)-ODhbt 、Fmoc-Glu(OtBu)-ODhbt、Fm
oc-Lys(Boc)-OPfp、Fmoc-His(Trt)-OPfp、Fmoc-Ala-OPf
p 、Fmoc-Ile-OPfp 、Fmoc-Gly-OPfp 、Fmoc-Pro-OPfp
（いずれもファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ−社
製）およびFmoc-Gln(Trt)-OPfp（渡辺化学工業社製）で
ある。ペプチド固相合成用樹脂は、ヒドロキシメチルフ
ェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）樹脂（商品名、ウルトロシン
Ａ樹脂。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）
を用いた。

【００５０】先ず、ペンタデカペプチドのＣ末端アミノ
酸に相当するFmoc-Tyr(tBu)-ODhbt（０．５ｍｍｏｌ）
をウルトロシンＡ樹脂１ｇ（ファルマシアＬＫＢバイオ
テクノロジー社製）と反応させ、Fmoc−Tyr(tBu)を樹脂
上に固定した。次いでこの樹脂をピペリジンを含むジメ
チルホルムアミドで洗浄し、Ｃ末端アミノ酸（Fmoc−Ty
r(tBu)）のαアミノ基の保護基（Fmoc基）を除去した。
のち目的とするペンタデカペプチドのアミノ酸配列のＣ
末端から２番目のアミノ酸残基に相当するFmoc-Tyr(tB
u)-ODhbt （０．５ｍｍｏｌ）を樹脂に固定されたＣ末
端アミノ酸（Tyr(tBu)）にカップリングさせた。以下同
様にして順次所望のアミノ酸を固定した。ただし、活性
エステルがペンタフルオロフェニルエステル（０Ｐｆ
ｐ）の場合には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル
（ＨＯＢｔ、０．５ｍｍｏｌ）をカップリング反応の触
媒として用いた。所望のアミノ酸配列のペプチド鎖が形
成された後、以下に示すように、アミノ酸側鎖の保護基
の脱離とペプチドの樹脂からの脱離を同時に行い、目的
とするペンタデカペプチドを得た。すなわち、Ala-Glu
(OtBu)-Ile-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtB
u)-Ser(tBu)-Pro-Gln(Trt)-Thr(tBu)-His(Trt)-Tyr(tB
u)-Tyr(tBu)−ウルトロシンＡ樹脂、０．１ｇとトリフ
ルオロ酢酸・チオアニソ−ル・エタンジチオ−ル・アニ
ソ−ル（９０：５：３：２）、３ｍｌを室温で反応させ
た。２時間後、樹脂を濾去し、残った樹脂をトリフルオ
ロ酢酸３ｍｌで洗浄し、濾液と洗浄液を合わせ、エ−テ
ルを１０ｍｌ加え、析出したパウダ−を遠心し集め、エ
−テルで洗浄し、残渣を酢酸５ｍｌに溶解し、凍結乾燥
し、粗ペプチド約５８ｍｇを得た。

【００５１】得られた粗ペプチド（１ｍｇ）を実施例１
と同一の逆相高速液体クロマトグラフィ−により精製
し、目的とするペンタデカペプチドの純粋品約０．８ｍ
ｇを得た。 実施例３ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号２のペプチドを合成した。この
ペプチドは、ヒトラクトフェリンおいて、この発明の発
明者らが見出した配列番号１のウシ由来のペンタデカペ
プチドに対応するペプチド部分である。 実施例４ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号３のペプチドを合成した。この
ペプチドは、マウスラクトフェリンおいて、この発明の
発明者らが見出した配列番号１のウシ由来のペンタデカ
ペプチドに対応するペプチド部分である。 実施例５ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号４のペプチドを合成した。この
ペプチドは、この発明の発明者らが見出した配列番号１
のウシ由来のペンタデカペプチドの１位から７位に相当
するヘプタペプチドである。 実施例６ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号５のペプチドを合成した。この
ペプチドは、この発明の発明者らが見出した配列番号１
のウシ由来のペンタデカペプチドの１位から９位に相当
するノナペプチドである。 実施例７ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号６のペプチドを合成した。この
ペプチドは、この発明の発明者らが見出した配列番号１
のウシ由来のペンタデカペプチドの１位から１１位に相
当するウンデカペプチドである。 実施例８ アミノ酸の配列を変更したことを除き、実施例２と同一
の方法により、配列番号７のペプチドを合成した。この
ペプチドは、この発明の発明者らが見出した配列番号１
のウシ由来のペンタデカペプチドの３位から１５位に相
当するトリデカペプチドである。 実施例９ 固相合成用樹脂をアミド体合成用樹脂であるウルトロシ
ンＣ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
製）に変更したことを除き、実施例２と同一の方法によ
り、配列番号１のペプチドのＣ末端にアミド基が結合し
たアミド体を合成し、実施例１と同一の方法により逆相
高速液体クロマトグラフィ−で精製した。 実施例１０（親水性軟膏） 実施例１と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド １０（ｇ） 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．０１ 白色ワセリン ２５０ ステアリルアルコ−ル ２２０ プロピレングリコ−ル １２０ ウラリル硫酸ナトリウム １５ ラオキシ安息香酸メチル ０．２５ パラオキシ安息香酸プロピル ０．１５ 精製水 ３８４．５９ 上記成分を配合し、常法により１０００ｇの親水性軟膏
を製造した。なお、ペプチドおよびＥＧＦ以外の原料は
いずれも市販品を用いた。 実施例１１（製剤） 実施例２と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド ５０（ｍｇ） 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．０１ 結晶セルロ−ス １７０ コ−ンスタ−チ ６６ タルク １１ ステアリン酸マグネシウム ３ １錠当たり上記の割合の各原料を均一に混合し、常法に
より造粒し、乾燥し、打錠し、錠剤を得た。なお、ペプ
チドおよびＥＧＦ以外の原料はいずれも市販品を用い
た。 実施例１２（製剤） 実施例９と同一の方法により製造した配列番号１のペプチドの アミド体 ２０（ｇ） 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．０２ 結晶セルロ−ス ７８ コ−ンスタ−チ ２０ 乳糖 １７ ポリビニルピロリドン ３ 上記各材料を均一に混合し、常法により顆粒化し、ゼラ
チン硬カプセル１０００カプセルに充填し、カプセル剤
を調製した。なお、ペプチドのアミド体およびＥＧＦ以
外の原料はいずれも市販品を用いた。 実施例１３（クリ−ム） 実施例５と同一の方法により製造した配列番号４のペプチド ０．５（ｇ） 実施例１と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド ０．５ 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．００１ ポリオキシエチレンステアリルエ−テル ２．０ ポリオキシエチレンセチルエ−テル ３．０ ミツロウ ４．０ セタノ−ル ３．０ ラノリン １．０ イソプロピルパルミテ−ト ２．０ 流動パラフィン １５．０ ポリエチレングリコ−ルモノステアレ−ト ０．５ パラオキシ安息香酸メチル ０．１ 精製水 ６８．３９９ 上記成分を配合し、常法により１００ｇのクリ−ムを製
造した。なお、ペプチドおよびＥＧＦ以外の原料はいず
れも市販品を用いた。 実施例１４（ファンデ−ション） 実施例６と同一の方法により製造した配列番号５のペプチド ０．５（ｇ） 実施例１と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド ０．５ 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．００１ ステアリン酸 ２．４ モノステアリン酸プロピレングリコ−ル ２．０ セトステアリルアルコ−ル ０．２ 液状ラノリン ２．０ 流動パラフィン ３．０ ミリスチン酸イソプロピル ８．５ 防腐剤 適量 カルボキシメチルセルロ−スナトリウム ０．２ ベントナイト ０．５ プロピレングリコ−ル ４．０ トリエタノ−ルアミン １．０ 酸化チタン ８．０ タルク ４．０ 着色料 適量 精製水 ６３．１９９ 上記成分を配合し、常法により約１００ｇのファンデ−
ションを製造した。なお、ペプチドおよびＥＧＦ以外の
原料はいずれも市販品を用いた。 実施例１５（乳液） 実施例３と同一の方法により製造した配列番号２のペプチド １．０（ｇ） 実施例１と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド １．０ 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．００１ 自己乳化型グリセロ−ルモノステアレ−ト １．１ ポリオキシエチレンセチルエ−テル １．９ ＭＣステアリン酸 ２．０ セタノ−ル １．０ イソプロピルミリステイト ２．０ パラオキシ安息香酸メチル ０．１ 香料 ０．１ 精製水 ８９．７９９ 上記成分を配合し、常法により１００ｇの乳液を製造し
た。なお、ペプチドおよびＥＧＦ以外の原料はいずれも
市販品を用いた。 実施例１６（パック） 実施例２と同一の方法により製造した配列番号１のペプチド ０．５（ｇ） 実施例８と同一の方法により製造した配列番号７のペプチド ０．５ 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．００１ エタノ−ル ３．０ パラオキシ安息香酸メチル ０．１ カルボキシビニルポリマ− １．０ 炭酸カルシウム ０．３ 精製水 ９４．５９９ 上記成分を配合し、常法により１００ｇのパックを製造
した。なお、ペプチドおよびＥＧＦ以外の原料はいずれ
も市販品を用いた。 実施例１７（ポマ−ド） 実施例７と同一の方法により製造した配列番号６のペプチド ０．５（ｇ） 実施例４と同一の方法により製造した配列番号３のペプチド ０．５ 参考例と同一の方法により製造したＥＧＦ ０．００１ モクロウ １３．０ ヒマシ油 ８４．７９９ 香料 ０．２ 上記成分を配合し、常法により１００ｇのポマ−ドを製
造した。なお、プチドおよびＥＧＦ以外の原料はいずれ
も市販品を用いた。

【００５２】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、従来のＥＧＦのみを有効成分とする薬剤、化粧
料および養毛剤より優れた効果を有する細胞増殖賦活化
剤が提供される。

【００５３】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列： Ala Glu Ile Tyr Gly Thr Lys Glu Ser Pro Gln Thr His Tyr Tyr 1 5 10 15 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列： Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr Tyr 1 5 10 15 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列： Ala Glu Val Tyr Gly Thr Lys Glu Gln Pro Arg Thr His Tyr Tyr 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド 配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、およびこのペプチドをフラ
グメントとして含むペプチド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 Ｃ０７Ｋ 7/06 8318−4Ｈ 7/08 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 萩原 朋之 神奈川県横浜市旭区鶴ケ峰１−89−33 マ・メゾンＶ２−Ｃ号室

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１から配列番号７のいずれかの
   アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体。
2. 【請求項２】 配列番号１から配列番号７のいずれかの
   アミノ酸配列を有するペプチド、その誘導体またはそれ
   らの混合物と上皮細胞成長因子とを有効成分として含有
   する細胞増殖賦活化剤。
3. 【請求項３】 ペプチド、その誘導体またはそれらの混
   合物が、少なくとも０．１μｇ／ｇの割合で含有されて
   いる請求項２の細胞増殖賦活化剤。