JP3621431B2 - 平滑筋細胞増殖因子およびそれをコードする単離されたｄｎａ - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、平滑筋細胞の成長を刺激する非グリコシル化組換え型哺乳動物ＢＴＣ−成長因子蛋白質及びその用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
平滑筋細胞の増殖については広く研究されているが（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ 等、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５８巻、第４号、第４２７頁参照。ここの開示は、本文献をここに記載することにより、本明細書に引用する。）、平滑筋細胞の増殖を制御するシグナルについては、大部分が未知のままである。平滑筋細胞増殖は、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症及び高血圧症）のような病気において中心的な役割を演じていることが知られており、幼児における平滑筋増殖の欠如は、血管奇形においても何らかの役割を演じている。このように、平滑筋細胞複製ができない場合は、血管の損傷を治療できなくなり、死に至ることも多い。
アテローム性動脈硬化の損傷が形成されている間に、平滑筋細胞の複製が起こることは、現在一般に知られているが、プラークの履歴全体におけるその増殖応答の役割は、全てが明らかになっているわけではない。２、３の研究者は、動脈の発育中に起こる複製が、脂質蓄積及び内皮損傷に先だって、アテローム性動脈硬化の損傷において起こる最初のことであると示唆している。
血管壁における平滑筋複製を説明する主要な仮説は、損傷応答仮説である。簡単に言うと、この仮説は、血管壁の平滑筋細胞が、通常、静止状態で存在すると言うことである。内皮が損傷を受けると、血小板は、動脈内膜への平滑筋細胞の移動及びその中での複製を刺激する因子を放出する［Ｒｏｓｓ， アルテリオスクレローシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ） １， ２９３−３１１ （１９８１）］というものである。Ｒｏｓｓ は、培養平滑筋細胞の増殖には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が必要であることも示した［Ｒｏｓｓ 及び Ｇｌｏｍｓｅｔ、ニューイングランド ジャーナル オブ メディスン（Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．） ２９５， ３６９−３７７， ４２０−４２５ （１９７６）］。
Ｒｏｓｓ の観察は、それに続くＰＤＧＦの精製、その受容体の同定、更に最近では、２つのＰＤＧＦペプチド鎖のうちの１つの遺伝子としてのオンコジーンｃ−ｓｉｓの同定をもたらした。
【０００３】
細胞周期進行のための第２の公知の要件は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）としても知られるソマトメジンＣの利用である。ＩＧＦ−１それ自身は、平滑筋細胞により合成することができ，ＩＧＦ−１に対する抗体は、細胞周期の進行を抑制する。これらのデータは、ＰＤＧＦが、それ自体の進行因子の産生を刺激することが可能であることを示唆している。この観察は、血管壁に固有な因子により平滑筋複製を制御できるかも知れないと言う興味ある可能性に対し、かなり重要な示唆をするものである。
ＰＤＧＦとは別に、平滑筋細胞の分裂を促進する他の物質も研究されている。更に、血小板も、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）に類似する蛋白質［Ｏｋａ 及び Ｏｒｔｈ、ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．） ７２、２４９−２５９ （１９８３）並びにＡｓｓｏｉａｎ 等、（１９９４）］及びβ腫瘍成長因子と呼ばれる、懸濁状態の細胞の成長を助けることのできる因子［Ｔｕｃｋｅｒ 等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２２６、７０５−７７７ （１９８４）］を含んでいる。しかしながら、増殖の刺激に対するこれらのそれぞれの相対的な寄与については、大部分が知られていない。
高血圧症における平滑筋複製を制御する刺激についても、大部分が未知のままである。悪性高血圧症での微小血管の変化においてＰＤＧＦは重要な役割を演じているかも知れないが、大きい血管又はより穏やかな形若しくはより慢性的な形の高血圧により影響を受ける血管には、ＰＤＧＦは含まれていないようである。
種々の病状における平滑筋の役割については、多くの研究があり、ＰＤＧＦのような成長因子のいくつかの機構及び役割が探求されているが、平滑筋細胞の増殖を刺激する分裂促進因子（マイトージェン）についての新しい情報はその解明に当然必要である。このような分裂促進因子を同定することによって、平滑筋分裂促進因子に対する抗体又はこのような分裂促進因子の受容体に結合する競合蛋白質を用いる競合的結合戦略のような、種々の治療戦略を工夫することが可能となるのである。平滑筋分裂促進因子は、血管奇形のような状態の治療に、あるいは創傷／潰瘍治癒における成長因子として、用いることもできる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
先に本発明者等は、実質的に各ベータ細胞がオンコジーンＳＶ４０ラージＴを発現している、遺伝子導入マウス（ＲＩＰ１−Ｔａｇ２）から当初誘導された膵臓腫瘍細胞の馴化培地から得ることのできる新規な成長因子（以下、“ＢＴＣ−ＧＦ”と言う）を提供する出願を行なった（特願平３−２７９６７６号）。ＢＴＣ−ＧＦが元来それから同定され、単離され、精製された膵臓腫瘍細胞（以下、“ＢＴＣ−３細胞”と言う）のサンプルは、ブダペスト条約により、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １０５８５として１９９０年１０月２６日に寄託されている。ＢＴＣ−ＧＦは、サブラインの膵臓腫瘍細胞（以下、ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞と言う）から精製してもよく、その細胞のサンプルは、ブダペスト条約により、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １０８７５として１９９１年９月２４日に寄託されている。
本発明のＢＴＣ−ＧＦは、平滑筋細胞、３Ｔ３線維芽細胞及び網膜色素上皮細胞のための分裂促進因子であり、内皮細胞のためのものではない。ＢＴＣ−ＧＦは、煮沸、１０ｍＭジチオスレイトル及び１Ｍ酢酸にさらすことによっても失活しない。ＢＴＣ−ＧＦの生物活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約３２，０００の分子量を有する蛋白質の単一バンドとして存在する。ＢＴＣ−３及びＢＴＣーＪＣ１０の両方から精製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列を比較することにより決定した、ＢＴＣ−ＧＦの部分Ｎ−末端アミノ酸配列（配列番号：１）は、次の通りである。
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ （図７および９参照）
翻訳されたＧＥＮＢＡＮＫ及びＮＢＲＦ蛋白質データベースによるコンピューター調査では、同様の蛋白質は見つからなかった。
【０００５】
本発明のＢＴＣ−ＧＦは、創傷／潰瘍等の治療と共に、血管奇形の治療に用いられることができる。ＢＴＣ−ＧＦは、抗体や偽ペプチド（ｆａｌｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のような競合剤を産生するのに使われてもよい。ＢＴＣ−ＧＦは、小島（ランゲルハンス氏島）のインシュリン産生細胞に由来するために、このような競合剤を、高血圧症と共に、糖尿病において認められるアテローム性動脈硬化症及び糖尿病性網膜症のような平滑筋細胞増殖に起因する病気の治療に用いることもできる。また、この因子は診断テストにも用いられる。例えば、この成長因子に対する抗体が、小島での死にかかっている又は再生しつつあるベータ細胞がこの因子を放出している糖尿病患者の血液中に、この因子を検出することができる。
本発明は新規な非グリコシル化組み換え哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ、哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする単離されたＤＮＡを提供するが、このＤＮＡはヒトＢＴＣ−ＧＦをコードする単離されたＤＮＡを含み、またこのＤＮＡから発現される生成物も包含するものである。
本発明によって、平滑筋細胞の増殖を促進する新規な非グリコシル化組み換え哺乳動物の成長因子ＢＴＣ−ＧＦ、およびその製造方法を提供するものである。
天然のＢＴＣ−ＧＦは、各ベータ細胞が実質的にオンコジーンＳＶ４０ Ｔを発現している、遺伝子導入マウス（ＲＩＰＩ−Ｔａｇ２）から当初誘導されたＢＴＣ−３膵臓腫瘍細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１０５８５）の馴化培地から同定、単離された。ＢＴＣ−ＧＦは、ＢＴＣ−ＪＣ１０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１０８７５）からも精製されている。
作られた天然のＢＴＣ−ＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約３２，０００の分子量を有しており、煮沸しても、熱に安定である。ＢＴＣ−ＧＦは、１０ｍＭジチオスレイトルの存在及び濃度１Ｍの酢酸にさらした場合も、安定である。
ＢＴＣ−ＧＦを精製するには、多くの方法を用いることができるが、好ましい方法の概要を次に述べ、実施例で更に詳細に説明する。
【０００６】
まず、ベータ腫瘍細胞を、ローラびん内で、５％子牛血清を含むＤＭＥＭにて４日間培養する。その後、培地を無血清培地と交換し、採取まで４８〜７２時間培養する。
次いで、無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地を濃縮し、バイオレックス（Ｂｉｏｒｅｘ）７０カラム、フェニルセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム、ＦＰＬＣヘパリンアフィニティーカラム、ＨＰＬＣ逆相カラムなどの多数のカラムに通す。
ＢＴＣ−３及びＢＴＣーＪＣ１０細胞からのＢＴＣ−ＧＦを比較することにより得たＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列は、ＡＢＩ ４７０Ａ 蛋白シーケンサー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で決定した場合、次の通りである。
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ（配列番号：１）
ＢＴＣ−ＧＦの中間部のアミノ酸配列（図９参照、アミノ酸４４−６６）は次の通りである。
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−（配列番号：３の１２−３４に相当）
本発明者はマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡを構成しているマウス細胞からマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子をクローニングすることによってマウスＢＴＣ−ＧＦが製造でき、該ＤＮＡとの形質転換から生じた形質転換細胞を培養できることを見出した。
【０００７】
一般論としてヒトに近接している動物のタンパク質は対応するヒトのタンパク質とアミノ酸配列順序において極めて高度な相同を示す。事実、異なるアミノ酸の部分はコドンの一点の突然変異によってしばしば生ずる。それ故上記のマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列順序がヒトのＢＴＣ−ＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列順序と類似する事を予想するのはもっともなことである。本発明者はＤＮＡプローブとしてマウスＢＴＣ−ＧＦ遺伝子の一部を使いヒト細胞からヒトＢＴＣ−ＧＦ遺伝子をクローニングし、該ヒトＢＴＣ−ＧＦ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡを構成し及び該ＤＮＡとの形質転換から生じた形質転換細胞を培養することによってヒトＢＴＣ−ＧＦが製造できることを見出した。
本発明者はさらに研究を行い、以下の（１）〜（５）に関する本発明を完成するに至った。
（１）非グリコシル化組み換え哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ、
（２）哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする単離ＤＮＡ、
（３）（２）の単離ＤＮＡをもつ組み換えベクター、
（４）（３）のベクターを含有する形質転換細胞、および
（５）（４）の形質転換細胞を培地中で培養することからなる（１）のＢＴＣ−ＧＦタンパク質の製造方法。
組み換え非グリコシル化哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦとして、実施例ではヒトＢＴＣ−ＧＦおよびマウスＢＴＣ−ＧＦから構成されるタンパク質を取り扱っている。
組み換え非グリコシル化ヒトＢＴＣ−ＧＦとして、図１０のアミノ酸の１番から８０番又は１番から１４７番から構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示されている。
組み換え非グルコシル化マウスＢＴＣ−ＧＦとして、図９のアミノ酸１番から１４６番で構成されるアミノ酸配列を有するタンパク質が例示される。
【０００８】
また、本発明の別の実施態様では、遺伝子工学技術によるＢＴＣ−ＧＦの製造方法、ＢＴＣ−ＧＦをコードする単離ＤＮＡが提供されている。
より詳しくいうと、例えば以下のようにして製造される哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦのポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現ベクターがある。
（ａ）哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＲＮＡの単離、
（ｂ）該ＲＮＡに基づいた一本鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成及び対応する二本鎖ＤＮＡの合成、及び必要な場合は突然変異誘発の実施、
（ｃ）プラスミドあるいはファージベクターへの該ｃＤＮＡの挿入、
（ｄ）生じた組み換えプラスミドによる宿主の形質転換、
（ｅ）得られた形質転換細胞の培養、あるいはファージプラークの形成及びＤＮＡプローブを用いた例えばコロニーハイブリッド形成法又はプラークハイブリッド形成法のような適当な方法による、形質転換細胞あるいはファージからの目的とするＤＮＡを含有するプラスミドまたはファージＤＮＡの単離、
（ｆ）該プラスミド又はファージからのクローニングされた目的とするＤＮＡの切除、
（ｇ）該クローニングされたＤＮＡをベクターのプロモーターの下流部位への挿入。
【０００９】
哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＲＮＡは、前記のように多種のＢＴＣ−ＧＦ生成細胞又は膵臓腫瘍細胞から得られる。
哺乳動物のＢＴＣ−ＧＦ生成細胞からのＲＮＡ調製方法の一つは、グアニジンチオシアネート法（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１８，５２９４（１９７９））である。
かくして逆転写酵素といっしょに鋳型として得られたＲＮＡを用いて例えばＨ．Ｏｋａｙａｍａ．らの方法（モレキュラ・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．），２，１６１（１９８２））により、ｃＤＮＡが合成できる。得られたｃＤＮＡはプラスミド又はファージベクター中へ挿入する。
上述の技術の他に、部位特異的突然変異誘発を利用することができる。部位特異的突然変異誘発は周知であり、「遺伝子工学」（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ），ＬａｔｈｅｒＲ．Ｆ．， Ｆ．Ｌｅｃｏｑ著、アカデミックプレス・３１〜５０ページ（１９８３年）に記載されている。オリゴヌクレオチドに対する突然変異誘発は、「遺伝子工学」原理と方法、Ｓｍｉｔｈ Ｍ．， Ｇｉｌｌａｍ Ｓ．，プラナムプレス、第３巻、１〜３２ページ（１９８１年）に記載されている。
【００１０】
本哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードする構造遺伝子の生産は、例えば以下のようにして行なうことができる。
（ａ）突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖の構造遺伝子から成る一本鎖ＤＮＡを交雑する。
（ｂ）変異ヘテロ２本鎖を形成するために、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸長する。
（ｃ）この変異ヘテロ２本鎖を複製する。
オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異が行われる遺伝子領域へのプライマーの着実な交雑に不可欠な条件及びオリゴヌクレオチド合成の現在の有効な方法における制限によって変ってくる。オリゴヌクレオチドにより指示される突然変異誘発の使用を意図したオリゴヌクレオチドのデザインにおいて考慮されるべき要因は（例えば、ヌクレオチドの全体サイズ、及び突然変異部位での不適合部のサイズ等）、前記文献中に、スミスＭ．及びギラムＳ、によって記載されている。一般的にオリゴヌクレオチドの全体長は、突然変異部位での安定かつ特有な交雑が最大限活かされるように、かつ、突然変異部位と５’及び３’末端との間がＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の修復を阻止するに十分拡張されるような長さに調整される。
突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは通常１２〜２４個の塩基、好ましくは１４〜２０個、更に好ましくは１４〜１８個の塩基を含有する。これらは通常少なくとも約３塩基からなる、変化を受けるコドンの３’末端を含有している。
例えば付加アミノ酸を有する哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦを得る目的のため、変異性哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子は、直接又は制限酵素での消化による断片化後付加されるべきアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、そしてそれをＤＮＡリガーゼを用いて哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子中の適当な部位へ挿入又は付加することによって製造される。
【００１１】
適当な制限酵素認識部位が、哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子中に存在しない場合は、前記の部位特異性突然変異誘発によって制限酵素認識部位がつくられる。
例えば構成アミノ酸を欠く哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子を得る目的のため、変異性哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦ遺伝子が、例えばカルボキシル末端が欠失された形でつくられる。カルボキシル末端側でのアミノ酸配列の欠失の場合において、欠失されるアミノ酸の配列をコードする遺伝子のコドンが部位特異性突然変異誘発によって終止コドンへ変えられる。
該ｃＤＮＡが挿入されるプラスミドには、例えばｐＢＲ３２２（ジーン（Ｇｅｎｅ）、２、９５（１９７７））、ｐＢＲ３２５（ジーン、４、１２１（１９７８））、ｐＵＣ１２（ジーン、１９、２５９（１９８２））又はｐＵＣ１３（ジーン、１９、２５９（１９８２））のような大腸菌由来のプラスミド又は、ｐＵＢ１１０（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １２、６７８（１９８３））のような枯草菌由来のものがある。使用する宿主で複製でき維持できるものであれば、どのようなプラスミドも同様に使用することができる。
該ｃＤＮＡが挿入されるべきファージベクターには、例えばλｇｔ１０又はλｇｔ１１がある。プラスミドへの挿入の好ましい一方法は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら著の分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ），コールド・スプリング・ハーバー研究室、２３９ページ（１９８２）において記載された方法である。
この手法で得られたプラスミドは、適当な宿主、例えばエシェリキア属又はバチルス属に属する菌に導入される。
エシェリキア属の菌の例としては、大腸菌Ｋ１２ＤＨ１株（プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、６０、１６０（１９６８））、Ｍ１０３株（ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、９、３０９（１９８１））、ＪＡ２２１株（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１２０、５１７（１９７８））、ＨＢ１０１株（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４１、４５９（１９６９））、Ｃ６００株（ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ）、３９、４４０、１９５４））、及びＭＭ２９４株（プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７３、４１７４（１９７６））がある。
バルチス属の菌の例としては、枯草菌ＭＩ１１４株（ジーン、２４、２５５（１９８３））及び２０７−２１株（ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５、８７（１９８４））がある。
【００１２】
形質転換を達成するための好ましい方法として、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら著による分子クローニング（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、２４９（１９８２）に記載の塩化カルシウム又は塩化カルシウム／塩化ルビジウム法が挙げられる。
かくして得られた形質転換細胞の中から、目的とするクローンが例えばＤＮＡ塩基配列決定法（プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７４、５６０（１９７７）；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、９、３０９（１９８１））を併用したコロニーハイブリッド形成法（ジーン、１０、６３（１９８０））によって選択される。
この方法でＢＴＣ−ＧＦをコードするクローニングされたＤＮＡを有するベクター又はＢＴＣ−ＧＦをコードするクローニングされたＤＮＡを有するファージを運ぶ微生物が得られる。
該微生物からプラスミドが単離される。
このようなプラスミドの単離のために、例えばアルカリ抽出法（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１、１５１３（１９７９））が使用できる。
ＢＴＣ−ＧＦをコードするクローニングされたＤＮＡを有する前記プラスミド又はファージベクターは、そのままで、又は該ＤＮＡの切除のため、制限酵素処理を行って使用できる。
発現ベクターはプロモータの下流部位で該ｃＤＮＡの発現に適したベクターへクローニングされたｃＤＮＡを挿入することによって得ることが出来る。
該ベクターには、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージのようなバクテリオファージ、及びレトロウィルス、牛痘ウィルスのような動物ウィルスと同様に、前記の大腸菌由来プラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１３）、及び枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５）が含まれる。
該ｃＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンとしてＡＴＧをもつ。それはまた３’末端に翻訳終止コドンとしてＴＡＡ，ＴＧＡ又はＴＡＧをもつ。該ｃＤＮＡを発現させるため、プロモーターを該ｃＤＮＡの上流部位に接続する。本発明の実施に用いられるプロモーターは該ｃＤＮＡの発現に利用される宿主に適当か、適合するものであればどんなものでもよい。
【００１３】
形質転換される宿主がエシュリキア属に属する菌である場合は、特にＴ７ファージプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、λｐｌプロモータ及びｌｐｐプロモータが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、例えばＳＰ０１プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、及びｐｅｎＰプロモータが好ましい。宿主が酵母である場合は、特に、ＰＨ０５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ及びＡＤＨプロモータが好ましい。特に、宿主はエシェリキア属菌で、プロモータはｔｒｐプロモータ又はλｐＬプロモータであることが好ましい。
宿主が動物細胞である場合は、ＳＶ−４０由来プロモータ及びレトロウィルスプロモータが使用可能である。特にＳＶ４０由来プロモータが好ましい。
かくして得たベクターを宿主細胞へ導入することによって形質転換細胞が増殖できる。宿主の例として、エシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母及び動物細胞がある。エシェリキア及びバチルス属菌の代表例は、本明細書中前記したものである。
酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ・ＡＨ２２Ｒ￣，ＮＡ８７−１１Ａ及びＤＫＤ−５Ｄが使用できる。
動物細胞としては、多数のものが用いられるが、そのうち、好ましい細胞系として、サルＣＯＳ７株（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ，セル２３、１５７（１９８１））及びベロ細胞株、チャイニーズ・ハムスターＣＨＯ細胞株、マウスＬ細胞株、及びヒトＦＬ細胞株が掲げられる。
エシェリキア属菌の形質転換は、例えばプロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）；又はジーン、１７、１０７（１９８２））に記載の方法によって実施できる。
バチルス属菌の形質転換は、例えばモレキュラー・アンド・ゼネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１６８、１１１（１９７９））に記載の方法によって実施される。
酵母の形質転換は、例えばプロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７５、１９２９（１９７８）に記載の方法で実施される。
動物細胞の形質転換は、他にもあるが例えば、ウィロロジー、５２、４５６（１９７３）に記載の方法により実施される。
この手法により、哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦをコードするＤＮＡを含有するベクターと形質転換された形質転換細胞が得られる。
【００１４】
該形質転換細胞を培地中で培養し哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦを生産させる。
宿主としてエシェリキア又はバチルス属菌を用いて得た形質転換細胞の培養に用いられる培地は一般的に液状で、例えば炭素、窒素源及び無機要素等の該形質転換細胞の成長に必要な物質を含んでいる。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性デンプン及び庶糖が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、コーン浸出液、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆ケーキ及びポテトエキスが用いられる。無機物質としては、特に塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムが掲げられる。酵母エキス、ビタミン、成長促進剤等をさらに加えることができる。
培地のｐＨは、約６から８であることが好ましい。
グルコースとカザミノ酸を含有するＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３、コールドスフリングハーバー ラボラトリー、ニューヨーク、１９７２年）は、エシェリキア属菌の培養に好ましい培地である。プロモータ機能を効率的に発揮させるため、ｔｒｐプロモータの場合なら３−β−インドリルアクリル酸のような促進剤を必要に応じて添加することができる。
宿主がエシェリキア属菌である場合は、培養は通常、約１５〜４３℃で約３〜２４時間行われる。必要に応じて通気及び／又は撹拌を行う。
宿主がバチルス属菌の場合は培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行われる。必要に応じて通気及び／又は撹拌を行う。
宿主が酵母である形質転換細胞の場合は、例えばブルクホルダーの最小限培地（Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７７、４５０５（１９８０））が使用できる。培地のｐＨは約５〜８に調整されることが望ましい。培養は一般に約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行われ必要に応じて通気及び／又は撹拌を行う。
動物細胞の形質転換細胞を培養するために好ましい培地には、ＭＥＭ培地（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１２２、５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（ウィロロジー、８、３９６（１９５９））、ＲＰＭＩ１６４０培地（ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシェーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、１９９、５１９（１９６７））、又は１９９培地（プロシーディング・オブ・ザ・ソサエティー・フォー・バイオロジカル・メディシン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、７３、１（１９５０））があり、さらに約５〜２０％牛胎児血清が添加される。この培地は約６〜８のｐＨとするのが望ましい。培養は一般に約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行われ、必要に応じて通気及び／又は撹拌を行う。
【００１５】
組み換えＢＴＣ−ＧＦは上記培養生成物より例えば以下の方法によって純粋な形で単離することができる。
培養細胞からＢＴＣ−ＧＦを抽出する際には、培養後の該細胞を集め塩酸グアニジンのようなタンパク質変性剤を含有する緩衝液中に細胞を懸濁しそれによって目的のタンパク質の細胞外溶解を起こす方法、又はフレンチプレス、音波処理、リゾチーム処理及び／又は凍結融解により細胞を破壊し、続いて遠心分離によってＢＴＣ−ＧＦタンパク質を回収する方法等の適当な方法によって処理を行う。フレンチプレスあるいはリゾチーム処理と音波処理の併用は特に好ましい。
上記方法によって得られた上清からのＢＴＣ−ＧＦの精製には公知の単離精製法を適当に組み合わせたものが用いられる。好ましい単離精製法として特に挙げられるのは、塩析法及び溶媒沈澱法のような溶解度の相違を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のような主に分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー法のような荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー法のような特別な親和性を利用する方法、逆相液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用した方法、等電点電気泳動のような等電点の差を利用した方法などがある。
【００１６】
更に詳しく説明すると、核酸及び酸性タンパク質は該上清をＤＥＡＥセルロースを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより前記上清から取り除くことができる。例えば殆ど中性の緩衝液（例、トリス緩衝液）で平衡にされたＤＥＡＥセルロースカラムへ上清を加え流出物画分を集めることが効率的である。該流出物画分をＣＭセルロース等を用いたイオン交換クロマトグラフィーに通した場合、塩基性タンパク質であるＢＴＣ−ＧＦは担体上に吸収され、続いて塩溶液で流出される。ＣＭセルロース等の酸性樹脂カラムクロマトグラフィーは直接細菌抽出物に使用してＢＴＣ−ＧＦを精製することができる。
例えば若干酸性の緩衝液（リン酸緩衝液等）で平衡にしたＣＭセルロースカラムへ上清を加えるのも効率的である。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、ＢＴＣ−ＧＦは追加の塩（ＮａＣｌ等）を含んだ緩衝液をカラムに流出することにより回収することができる。流出液は透析後凍結乾燥できる。
【００１７】
ヘパリン・セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーは、大腸菌抽出物中のＢＴＣ−ＧＦの精製に応用できる。例えば殆ど中性の緩衝液（例、トリス又はリン酸緩衝液）で平衡にしたヘパリン・セファロースカラムへ上記流出液を加え、カラムを十分に洗浄しＮａＣｌ等で作った直線勾配による流出を行うことによりＢＴＣ−ＧＦタンパク質を精製できる。
高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパリンカラム（例、ショーデックスＡＦ−パックＨＲ−８９４、昭和電工株式会社、日本）は特に効率的である。
この場合ＢＴＣ−ＧＦは前記のヘパリン−セファロースカラムの場合と同じ方法、即ちサンプルをほぼ中性の緩衝液とともにヘパリンカラムへ加え、カラムを十分に洗浄しＮａＣｌで作った直線勾配上で流出させることにより均一な生成物として回収できる。
このようにして得た生成物は透析と凍結乾燥により乾燥粉末形状にすることができる。添加された担体（例、血清アルブミン）とともに製品を保持することによって製品が容器の壁に付着するのを防止することができるので望ましい。
さらに生成物の酸化を防止するため、精製又は保存の過程において少量の還元剤を加えるのが好ましい。
使用できる還元剤にはβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン等がある。
この方法により実質的に純粋なＢＴＣ−ＧＦが得られる。本発明による実質的に純粋なＢＴＣ−ＧＦとは、ＢＴＣ−ＧＦ含量が約９５％（重量比）を下回らない製品をいい、より好ましくはＢＴＣ−ＧＦ含量が約９８％（重量比）を下回らないものをいう。
【００１８】
医薬用に使用するため、本発明によるＢＴＣ−ＧＦは粉末状のものをそのままの形で、あるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤と混合した医薬製剤の形（注射製剤、錠剤、カプセル、溶液、塗布剤）で、非経口又は経口により温血動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ）に対し安全に投与できる。
注射用製剤は、例えば生理的食塩水又はグルコース及び／又は他のアジュバントを含有する水溶液を用いる従来の方法によって製造できる。錠剤、カプセル及び他の薬剤組成物も同様に従来の方法によって製剤できる。
本組み換え非グリコシル化哺乳動物ＢＴＣ−ＧＦは、本来のＢＴＣ−ＧＦと同じ生物的活性を有する。
本発明によって精製されたＢＴＣ−ＧＦは、血管内注入による血管奇形のような病理状態の治療、又は競合的阻害剤の投与によるアテローム動脈硬化の治療に使用できる。
精製されたＢＴＣ−ＧＦはまた、創傷や潰瘍の治療にも使用できる。本発明のＢＴＣ−ＧＦが傷や潰瘍の治療におけると同様に血管奇形の治療にも用いられる場合は、温血動物へ投与されるべきＢＴＣ−ＧＦの量は少量で、適量は投与ルート及び症状によって異なるが、１日当たり１ｎｇから１ｍｇ／１ｋｇの範囲、より好ましくは１０ｎｇから１００μｇ／１ｋｇの範囲である。
本発明の精製ＢＴＣ−ＧＦは、高血圧症と共に、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病性網膜症の治療に使用できる各種競合剤を作るのにも、用いることができる。ＢＴＣ−ＧＦと競合し、及び／又はＢＴＣ−ＧＦが平滑筋細胞の増殖を刺激するのを妨げる、抗体や偽ペプチドのような競合剤を作ることができる。
ＢＴＣ−ＧＦは、それ自身に対する抗体を生成するのに用いられることもできる。生成される抗体は、その適用形態に応じて、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。このような抗体は、当業者によく知られている技術によって調製されることができる。例えば、蛋白質又はその抗原蛋白質を複合させてキーホール リンペット ヘモシアニン（ＫＬＨ）とし、兎等の動物の抗体を高めるのに用いることができる。代表的には、ペプチドーＫＬＨ複合体を、約２カ月の期間にわたって数回注射して、抗体を生成する。その後、標準技術により、血清から抗体を集める。一方、ハイブリドーマ細胞を形成する標準融合技術を用いて、その蛋白質に対する抗体を作る細胞内に、モノクローナル抗体を作ることができる［ここに参照のために記載されている Ｇ． Ｋｏｈｌｅｒ 等 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２５６、４９５ （１９７５）］。この技術の代表的なものとしては、抗体産生細胞を骨髄腫細胞のような不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）細胞株と融合させて、ハイブリッド細胞を作ることが挙げられる。一方、ここに参照のために記載されている Ｈｕｓｅ 等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４６、１２７５ （１９８９） の方法により、細胞からモノクローナル抗体を作ることができる。
【００１９】
通常グリコシル化されたタンパク質は各分子のグリコシル化という不均質性ゆえに不均質な性状で製造される。対照的に非グリコシル化タンパク質は均質的に製造され、そのため非グリコシル化タンパク質はグリコシル化された分子に比べて、精製が容易である。さらに非グリコシル化タンパク質の殆どは原核発現系によって製造される。このため非グリコシル化タンパク質はグリコシル化タンパク質に比べて、その生産性が高いのである。
本明細書、特許請求の範囲及び図面において塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
Ｔｄｒ ：チミジン
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
本発明を以下の参考例および実施例によって更に詳しく説明するが、これは本発明の理解を深めるためのものであって、本発明を限定するものではない。
【００２０】
なお実施例及び表１において検討されている成長因子活性は、前述のように静止状態のマウスＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞のＤＮＡへの（メチル−^３Ｈ）チミジンの取り込みの測定することによって測定した（Ｓｈｉｎｇ Ｙ．， Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｓ．，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ Ｍ．；メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１４６Ｂ，４２−４８（１９８７））。ここの開示は、本文献をここに記載することにより、本明細書に引用する。
【００２１】
参考例１
１０％子牛血清を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ＢＴＣ−３膵臓ベータ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ寄託番号Ｎｏ．ＣＲＬ１０５８５）の一次培養液を調製した。これらの培養液を、１６２ｃｍ^２の細胞フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ ＃３１５０）中に入れ、３７℃の調湿ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした。これらの細胞を、１２５ｍｌのインキュベーターを含有する９００ｃｍ^２のグロース エリアのローラびん（Ｃｏｓｔｅｒ Ｃａｔ ＃３９０１）への播種源として使用した。４日後、各びん内の培地を、無血清培地と交換した。培地を採取し、４８〜７２時間インキュベートした後、新しい培地と交換した。馴化培地６リットルを、成長因子の精製のための出発材料として、毎週採取した。
【００２２】
参考例２
ＢＴＣ−３細胞からのＢＴＣ−ＧＦの精製方法
工程１．濃縮
無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地１０リットルを、分子量１０，０００カットオフフィルターを用いたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）中空繊維濃縮器により、４℃で５００ｍｌに濃縮した。続いて、濃縮された培地を、連続透析により、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７に平衡させた。
工程２．バイオレックス（Ｂｉｏｒｅｘ） ７０クロマトグラフィー
濃縮された培地を、４℃で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７により平衡させたバイオレックスカラム（床容積２００ｍｌ）にかけた。このカラムを４００ｍｌの同一緩衝液で洗浄し、次いで生物活性を、６０ｍｌ／時間の流速で、０Ｍの４００ｍｌから０．６Ｍの４００ｍｌまでのＮａＣｌ勾配により溶出した（図１）。
工程３．フェニルーセファロースクロマトグラフィー
バイオレックスカラムからの活性画分を集めて、５分間煮沸し、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分）により透明にした。透明上澄み液を１．５Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とし、４℃で１．５Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４に入れ、１０ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ７により平衡させたフェニールセファロースカラム（床容積２５ｍｌ）にかけた。このカラムを１００ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、続いて、生物活性を、３０ｍｌ／時間の流速で、ｐＨ７にて、１０ｍＭ燐酸緩衝液中で１．５Ｍの１７０ｍｌから０Ｍの１７０ｍｌまでの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４勾配により溶出した（図２）。
工程４．ＦＰＬＣヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
フェニールセファロースカラムからの活性画分を集めて、透析し、室温で、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７により平衡させたＴＳＫ−ＧＥＬ ヘパリン ５ＰＷガラスカラム（７．５ｃｍ×８ｍｍ内径）にかけた。このカラムを１０ｍｌの同一緩衝液で洗浄し、生物活性を、１ｍｌ／分／画分の流速で、０から０．３ＭまでのＮａＣｌ勾配により、その後、０．３から０．６Ｍまでの他のＮａＣｌ勾配により溶出した（図３）。
工程５．ＨＰＬＣ Ｃ４逆相クロマトグラフィー
ヘパリンカラムからの活性画分を集め、室温で、１０％アセトニトリルの０．１％ＴＦＡ溶液により平衡させたＨＰＬＣ逆相Ｃ４カラムに直接注入した。このカラムを２０ｍｌの同一溶液で洗浄し、生物活性を、２ｍｌ／分の流速で、１０％から３５％までのアセトニトリル勾配により溶出して、１．５ｍｌの画分を集めた（図４）。ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて銀染色された単一バンドを得るために、この工程をもう一度繰り返した（図５）。
【００２３】
精製結果の大略を表１に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
数値は、馴化培地１０リットルの処理に基づくものであった。
生物活性は、マウス３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成により測定した。
成長因子活性１単位は［メチル−^３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの最大取り込み値の半分（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）までを刺激するのに必要な成長因子の量として定義された。
蛋白質質量は１ｍｇ／ｍｌ溶液について、Ａ_２８０＝１．０を用いて算出された。
＊ 蛋白質質量は標準蛋白質の強度と比較した銀染色の強度及びアミノ酸分析により算出された。
【００２６】
参考例３
平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの細胞分裂促進活性
実施例２の精製ＢＴＣ−ＧＦは、牛大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を刺激した（図６）。１％子牛血清を含むＤＭＥＭ中で培養されたＳＭＣで、ＢＴＣ−ＧＦの分裂促進活性をテストした。このテストサンプルを培養液に加えた後４日目に、細胞をトリプシン処理し、２４ウエルプレートの各ウエル内の細胞数をコウルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）カウンターで数えた。
上に例示した精製法により調製された蛋白質は、下記の特性を有している。ＢＴＣ−ＧＦは、Ｎ−末端アミノ酸配列
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号：２）
を有するポリペプチドである。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した場合、分子量は３２，０００である。高温（１００℃、５分）、スルフヒドリル還元剤（１０ｍＭジチオスレイトル）又は酸性状態（ｐＨ２．２）にさらすことによっても、その分裂促進活性は失活しない。
【００２７】
参考例４
ＢＴＣーＪＣ１０を、１０％子牛血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に保持した。馴化培地を生成するために、８リットルの撹拌フラスコ［ベルコグラス（Ｂｅｌｃｏ ｇｌａｓｓ）］内にて、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地、０．５％インシュリン、トランスフェリン及びセレン［ＩＴＳ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）］並びに０．１％ポリエチレングリコール４００中で、１０^４個／ｍｌのＢＴＣ−ＪＣ１０細胞を懸濁液中でふやした。細胞濃度が２×１０^５個／ｍｌになった時に、馴化培地を集めた。
ＢＴＣ−３細胞からＢＴＣ−ＧＦを精製したのと同様な方法により、ＢＴＣ−ＪＣ１０馴化培地からＢＴＣ−ＧＦを精製した。
ＢＴＣ−ＪＣ１０細胞から精製されたＢＴＣ−ＧＦの部分Ｎ−末端アミノ酸配列は、配列番号：６で示される。
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号：６）
図７から分かるように、ＢＴＣ−３細胞及びＢＴＣ−ＪＣ１０細胞からのＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列は、同じであると思われ、このことは両タイプの細胞から得られた２種の蛋白質が同じであることを示している。
【００２８】
実施例１（マウスＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡのクローニング）
マウスＢＴＣ−ＧＦは、そのアミノ酸配列の中間部にアミノ酸配列：−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−（配列番号：３の１２−３４に相当）を有するポリペプチドである。
参考例３及び４（図７及び８）において決定されたマウスＢＴＣ−ＧＦの部分的アミノ酸列に基づいて、Ｎ末端アミノ酸の７番から１２番（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ）、１７番から２３番（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ）、及び図８の中間部のアミノ酸１番から６番（Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）、図８の１２番から１７番（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）の、４つのアミノ酸配列に相応する４つのオリゴヌクレオチドが化学的に合成された。以下のプライマーにおいて、Ｉ（イノシン）は、いずれの塩基にも対応可能な塩基としてコドンの三つ目の位置に使われた。
合成されたオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。
プライマー１：５’ ＡＣＩ ＣＣＩ ＧＡ Ａ／Ｇ ＡＣＮ ＡＡ Ｔ／Ｃ ＧＧ ３’
プライマー２：５’ ＧＣＩ ＣＣＩ ＧＧＩ ＧＡ Ａ／Ｇ ＧＡ Ａ／Ｇ Ｃ／Ａ ＧＮ ＡＣ ３’，
プライマー３：５’ ＣＣ Ａ／Ｇ ＴＧ Ｔ／Ｇ ＡＴ Ａ／Ｇ ＣＡ Ａ／ＧＴＡ Ａ／Ｇ ＴＧ ３’及び（アンチセンス）
プライマー４：５’ＧＧ ＮＧＴ Ｔ／Ｃ ＴＧ Ｔ／Ｃ ＴＣ Ａ／Ｇ Ｔ ＣＮＡＣ ３’
（アンチセンス）（ＮはＡ，Ｔ，Ｇ又はＣを示す）。
ポリ（Ａ）ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出キット（ファルマシア）及びメッセンジャーＲＮＡ精製キット（ファルマシア）を用いてＢＴＣ−ＪＣ１０細胞から調製した。ｃＤＮＡはポリ（Ａ）ＲＮＡとランダムなヘキサヌクレオチド（ｃＤＮＡシンセシス・システム・プラス、アマシャム）から、鋳型としてこれらのｃＤＮＡ、プライマーとして二つのオリゴヌクレオチド（プライマー１と４）を用いて合成された。最初のＰＣＲ（複製連鎖反応）が行われた（９４℃で１分間、４５℃で２分間、及び７２℃で２分間を３０回）。２回目のＰＣＲを最初のＰＣＲ生成物及びプライマー２及び３を用いて行った（９４℃で１分間、４８℃で２分間及び７２℃で２分間を３０回）。
【００２９】
生成物（第２ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ）は、１．５％アガロースゲル電気泳動によって分画され、約０．１Ｋｂの大きさを持つＤＮＡがゲルから溶出された。このＤＮＡは、^３２Ｐでランダムプライミング法で標識した。
前記ＢＴＣ−ＪＣ１０ ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化され、脱リン酸化されたλｇｔ１０ベクター（ストラタージン）と連結し、これらファージベクターをパッケージとしてジガパック ＩＩ ゴールド、ストラタジーンｃＤＮＡライブラリーをつくった。このｃＤＮＡライブラリー（約５×１０^６クローン）は、大腸菌ＮＭ５１４（ＹＫ￣ＭＫ￣）とともにプレートにまき、現れたプラーク（プレート当たり３×１０^５ プラーク）は６枚のフィルター（ハイボンドＮ，アマーシャム）上に移し、０．５Ｎ−ＮａＯＨで分解し、露出し変質したファージＤＮＡをフィルター上に固定した。
標識したＤＮＡはプローブとしてフィルターとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ反応は、５×ＳＳＰＥ（１８０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））及び０．１％ＳＤＳを含む５×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）中に１０μＣｉのプローブを含む変成サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌの割合で含む１０ｍｌの溶液中で、６５℃で１６時間かけて実施した。反応後、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＤ溶液で、２回にわたって、各６５℃で３０分洗浄した。
洗浄したフィルターのラジオオートグラムが取られ、プレート上のプラークとラジオオートグラムを重ね合わせることによって陽性プラークを探し出した。この方法によって、２×１０^６ プラークから７個の陽性ファージクローンが得られた。次に、これらの陽性クローンからのＤＮＡ及びプライマ２及び３を用いてＰＣＲを実施し、目的とする大きさのＤＮＡ（０．１Ｋｂ）がわずか２個のクローンで増幅された。そのうちの一つ（λｇｔ１０ ＢＴＣ−３）は、ＥｃｏＲＩ部位に１．２ＫｂのｃＤＮＡをもつことが示された。このｃＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１１９（プラスミドｐＴＢ１４８９）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。このプラスミドｐＴＢ１４８９を、大腸菌ＤＨＴαＦ’（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＵＳＡ）へ導入し、形質転換細胞たる大腸菌ＤＨ５αＦ’／ｐＴＢ１４８９（ＩＦＯ １５２５６）を得た。この形質転換細胞は、ＡＴＣＣ受託番号６８９１１として１９９２年２月１０日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションとして寄託されており、またこのものは受託番号ＩＦＯ １５２５６として、日本の大阪の発酵研究所に寄託されている。
このｃＤＮＡの塩基配列、即ち１．２ＫｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片の塩基配列はジデオキシリボヌクレオチド合成連鎖停止反応（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、９、３０９（１９８１））によって決定された。この配列解析結果に基づいて、マウスＢＴＣ−ＧＦの全アミノ酸配列が決定できた。
このｃＤＮＡの塩基配列及び該塩基配列から予想されるアミノ酸配列が図９に示されている（配列番号：４）。図９において、略語”Ｅｎｄ”は終止コドンを表し、マウスＢＴＣ−ＧＦのＮ末端残基（アミノ酸番号１番、Ａｓｐ）は図７のものから推定されたものである。
該Ｎ末端アミノ酸残基から上流の３０のアミノ酸残基は、おそらくシグナルペプチドを構成する。矢印は、シグナルルペプチドと成熟マウスＢＴＣ−ＧＦ間の切断部位を示す。
【００３０】
実施例２（哺乳動物細胞用のマウスＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡを含有する１．２Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を実施例１において得たプラスミドｐＴＢ１４８９から単離した。発現プラスミドｐＴＢ７０１（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６３、６９２７（１９８５年））はＥｃｏＲＩで切断され、子牛腸ホスファターゼで処理される。得られたプラスミドは、ＢＴＣ−ＧＦ ｃＲＮＡを含む上記の１．２Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片に連結された。この連結混合物を用いて、大腸菌ＤＨ１（分子クローニング；実験室指針、コールドスプリングハーバーラボラトリー、５０５ページ、１９８２年）の形質転換を行なった。生成したアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドが単離され、このものはｐＴＢ１４９１と命名された。
【００３１】
実施例３（哺乳動物細胞中でのＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡの発現）
サルＣＯＳ７細胞をプレート上にまき（３×１０^５ 細胞／プレート）、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，フロー・ラボラトリズ）中で培養した。１０μｇの発現プラスミドｐＴＢ１４９１（実施例２）及びｐＴＢ１４９５（逆方向のＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡであること以外はｐＴＢ１４９１と同じ構造を有する）を、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍら、ウィロロジー、５２、４５６（１９７３））を用いてＣＯＳ７細胞へ各々、導入した。翌日、培地を０．５％牛胎児血清を含有するＤＭＥＭに交換し、２日間培養した。該馴化培地を集め、静止中のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３Ａ ３１−７１４クローン４（インタナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、１２、４６３（１９７３））への^３ Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成誘起活性を測定した：これについては、モレキュラ・セル・バイオロジー、第８号、５８８ページ、１９８８年に記載されたようにして行なった。結果は以下の表２に示す。

実施例４（ヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡのクローニング）
ポリ（Ａ）ＲＮＡ抽出キット（ファルマシア）及びメッセンジャーＲＮＡ精製キット（ファーマシア）を用いてヒト乳腺ガン細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ２２，ＡＴＣＣの細胞とハイブリドーマのカタログ、第６版、１９８８年）からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。 ｃＤＮＡを、ポリ（Ａ）ＲＮＡとランダムヘキサヌクレオチドプライマー（ｃＤＮＡ シンセシス・システム・プラス、アマシャム）から合成した。これらの ｃＤＮＡは ｃＤＮＡライブラリを作成するため、ＢｓｔＸＩアダプターと形質転換した大腸菌ＤＨ５αＦ’を用いてプラスミドｐＭＥ１８Ｓ（メディカル・イムノロジー（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２０、２７（１９９０））のＢｓｔＸＩ部位に組み込まれた。
この ｃＤＮＡライブラリは、フィルター当たり約５×１０^４ クローンの割合で１０枚のニトロセルロースフィルター（ミリポア製ＨＡＴＦフィルタ）上にまかれた。これらのフィルターをマスターフィルタとして使って、該マスターフィルタに対応するレプリカフィルターを作成した。これらレプリカフィルター上の大腸菌細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで分解し、露出、変性したプラスミドＤＮＡをフィルター上に固定した（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ Ｍ．，Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．Ｓ． プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７２、３９６１（１９７５））。
実施例１で得たプラスミドｐＴＢ１４８９を、ＥｃｏＲＩおよびＮｈａＩで消化し、マウスＢＴＣ−ＧＦをコードする０．７３ＫｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（Ｒｉｇｂｙ， Ｐ．Ｗ．Ｊ．ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１１３、２３７（１９７７））によって^３２Ｐで標識した。このように標識したＤＮＡはプローブとして、レプリカフィルターとハイブリダイズされた。ハイブリダイズ反応は５×ＳＳＰＥ（１８０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ_２ ＰＯ_４ ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））と０．１％ＳＤＳの添加された５×デンハーツ中に１０μＣｉのプローブを含んだ１００μｌ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡ溶液１０ｍｌ中で、６０℃で１６時間にわたって行われた。
反応後、フィルターを０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍコハク酸ナトリウム）溶液で２回室温で３０分、そしてさらに６０℃で３０分間で２回洗浄した（Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら、”分子クローニング”、コールドスプリングハーバー ラボラトリー、３０９ページ、１９８２年）。
洗浄したフィルタについてラジオオートグラムを行った。レプリカフィルターのラジオオートグラムの重なり合いによって細菌コロニーを探索した。この方法でプローブと反応できる大腸菌Ｋ１２ＤＨ１／ｐＴＢ１４９９株が５×１０^５ コロニーの中から得られた。
プラスミドＤＮＡ ｐＴＢ１４９９ を先に得た株からアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ， Ｈ．Ｃ．，Ｄｏｌｙ，Ｊ．，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１、１５１３（１９７９））によって抽出し精製した。プラスミドＤＮＡの ｃＤＮＡ部分を制限酵素ＢｓｔＸＩ（タカラ酒造）を用いて切断し、アガロールゲル電気泳動によって分画した。
続いて、この前記 ｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシリヌクレオチド合成連鎖停止法（Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎｇら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、９、３０９（１９８１））によって決定した。
このＤＮＡ配列から、ヒトＢＴＣ−ＧＦの全アミノ酸配列を決定することができた。
該ｃＤＮＡの塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を図１０に示す。矢印は、シグナルペプチドと成熟ヒトＢＴＣ−ＧＦとの間の切断部位を示す。
プラスミドｐＴＢ１４９９を大腸菌ＤＨ５α（ベテスタ・リサーチ・ラボラトリ、ＵＳＡ）へ導入し、形質転換細胞たる大腸菌ＤＨ５α／ｐＴＢ１４９９を得た。この形質転換細胞はＡＴＣＣ受託番号６８９１０で１９９２年２月１０日付でアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、またこのものは１９９２年１月１４日、受託番号ＩＦＯ １５２５７としてＩＦＯに寄託された。
【００３２】
実施例５（哺乳動物細胞用ヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡを含有する０．７ＫｂのＳｍａＩ−ＤｒａＩ断片をプラスミドｐＴＢ１４９９（実施例４）から単離した。Ｂｇ１ＩＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてこの断片の平滑末端へ連結した。Ｂｇ１ＩＩで消化した後、ヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡを含む０．７Ｋｂ断片を、ＩＬ−２ ｃＤＮＡ領域（図１１）をとり除いて、ｐＴＢ３９９（セル・ストラクチュア・ファンクション（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、１２、２０５ページ（１９８７））から調製した発現プラスミドｐＴＢ１３０８のＢｇ１ＩＩ部位へＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた連結によって挿入した。生成したプラスミド ｐＴＢ１５１５はＳａ１Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ＭｕＬＶ ＬＴＲ及びヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡを含む２．４Ｋｂ断片を単離し、ＳＶ４０初期領域プロモータ及びハムスターＤＨＦＲ ｃＤＮＡを有するｐＴＢ３４８（セル・ストラクチュア・ファンクション、１２，２０５（１９８７））のＳａ１Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に導入した。生成したプラスミドはｐＴＢ１５０７（図１２）と命名した。
【００３３】
実施例６（大腸菌のヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
成熟ヒトＢＴＣ−ＧＦ（１−１４７アミノ酸残基）をコードする０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、プラスミドｐＴＢ１５１５（実施例５）から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（ａ：５’ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ ３’ｂ；５’ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ ３’）を有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片をＴ７プロモータ（ジーン、５６、１２５（１９８７））を含有するプラスミドｐＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築した。
ヒトＢＴＣ−ＧＦの８０のアミノ酸残基（図１０の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プライマとして２個のオリゴヌクレオチド（１：５’ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ ３’，２：５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ ３’）を用いてＰＣＲを行った。生成物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５Ｋｂ ＤＮＡ断片を単離した。この０．２５Ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモータの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼで連結挿入しプラスミドｐＴＢ１５１６（図１３）を得た。
【００３４】
実施例７（哺乳動物細胞中でのヒトＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡの発現）
サルＣＯＳ７細胞をプレート当たり３×１０^５ 細胞の割合でプレート上にまき、１０％牛胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，フロー・ラボラトリ）中で培養した。１０μｇの発現プラスミドｐＴＢ１４９９（実施例４）及びｐＴＢ１５０７（実施例５）をリン酸カルシウム法（ウィロロジー、５２、４５６（１９７３））を用いてＣＯＳ７細胞へそれぞれ導入した。翌日、培地を０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭに交換し、さらに２日間培養を行った。馴化培地を集め、モレキュラ・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）に記載のごとく、静止状態のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４（インタナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３（１９７３））中への^３ Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成誘起活性を測定した。結果を表３に示す。

実施例８（大腸菌中でのヒトＢＴＣ−ＧＦの発現）
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、このプラスミドｐＬｙｓＳを大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌株にプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、これにより、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６を得た。この形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２０ｍｌのＬ−ブロス中で３７℃で培養した。クレット値が約１８０である場合は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度で０．４ｍＭになるよう培地に添加し、４時間培養を続けた。この菌体を遠心分離で集め、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０％庶糖及び０．２５ｍＭ ＰＭＳＦを含有する緩衝液０．５ｍｌ中に懸濁し、続いてこの懸濁液へ、卵白リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に加えた。これを１時間氷溶中に置いた後、混合液を３７℃で５分間培養し、遠心分離（ソルバール、１５００ｒｐｍで３０分、４℃）を行って上清を得た。
この細菌抽出液を、実施例７に記載した静止状態のＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞への^３ Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成誘起活性について測定した。結果は表４に示す。

この形質転換細胞大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６で１９９２年４月２１日付で通産省工業技術院微生物工業研究所に寄託され、またこのものは１９９２年４月１６日付けで受託番号ＩＦＯ １５２８２としてＩＦＯに寄託された。
【００３５】
実施例９（ｈＢＴＣを生成するＣＨＯ細胞株の樹立）
発現プラスミドｐＴＢ１５０７（実施例５）をリン酸カルシウム法によりＣＨＯ ｄｈｆｒ￣ 細胞（ウルラウブら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０））中へ導入した。２日後、培地を選択培地（１０％透析牛胎児血清および３５μｇ／ｍｌプロリンを含んだＤＭＥＭ）に交換し、ＤＨＦＲ＋の細胞を得るため培養を続けた。これらのＣＨＯ ＤＨＦＲ＋細胞を限界希釈法によってクローン化し、６０クローンが作られた。各クローンの細胞を２４ウェルプレート中で８０％飽和となるまで増殖させ、培地を０．５％牛胎児血清及び０．１μｇ／ｍｌのインシュリンを含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）０．５ｍｌに変えた。２日間培養後、馴化培地を集め、実施例３において記載したようにｎＢＴＣのＤＮＡ合成誘起活性を測定した。６０クローン中の３１クローンの馴化培地がマウス３Ｔ３細胞に対してＤＮＡ合成誘起活性を示した。分裂誘発活性は、最大刺激の５０％を与えるのに必要な因子の希釈度を決定することにより活性を算出し、標準のマウスＥＧＦの重量として表わすと、０．１から５．０ｎｇ／ｍｌであった。
【００３６】
実施例１０（ｈＢＴＣを生成するＡ９細胞株の樹立）
マウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．４）に、ｈＢＴＣ ｃＤＮＡを含有するｐＴＢ１５１５（実施例５）とヒトＨＰＲＴ遺伝子を含む発現プラスミドｐ４ａＡ８（Ｊｏｌｌｙ， Ｄ．Ｊ．ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、８０、４７７（１９８３））を用いて同時にリン酸カルシウム法によって形質導入した。この細胞は１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で２日間増殖させ、続いて選択のためＨＡＴ培地（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ｗ．，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１４５、７０９（１９６４））で培養した。ＨＰＲＴ＋細胞はＨＡＴ培地中で増殖し、限界希釈法によってクローンを単離した。各クローンの細胞（２４ウェルプレート中のウェル当たり１０^５細胞）をプレート上にまき、成育培地中で２日間培養し、続いて２日間０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ ０．５ｍｌ中で培養した。１０^６細胞が培地中へ分泌したｈＢＴＣレベルを実施例３に記載のマウス３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起作用によって調べた。数個のクローンの結果を以下の表５に示す。

クローンＡ９／１５１５−１４は１９９３年１月１日に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４１５９として微生物工業研究所に寄託され、またこのものは受託番号ＩＦＯ ５０３８９として１９９２年１２月２８日付でＩＦＯに寄託されている。
【００３７】
実施例１１
ＣＯＳ７細胞より産生されたＢＴＣの精製
プラスミドｐＴＢ１５０７を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清１リットルに、１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０），０．５Ｍ ＥＤＴＡ，５％ＣＨＡＰＳ，０．２５Ｍ ＰＭＳＦを各々１００ｍｌ，２ｍｌ，１０ｍｌ，２ｍｌずつ加え、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラム（径１．６×１０ｃｍ，ファルマシア社）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでかけた。カラムを１００ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で洗浄後、０Ｍから０．２１Ｍの濃度勾配のＮａＣｌを０分から１０分まで、次いで０．２１ＭのＮａＣｌを１０分から４０分までカラムに流し、４０分以後は、０．７Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を流して蛋白を溶出した。次に、２ｍｌ（１分）毎に集めた各溶出画分について、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成誘起活性を調べ、分画番号５１−６９をプールした（図１４）。
Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムのプール分画を限外ロ過（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０；アミコン）により濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳを含む緩衝液にて平衡化したゲルロ過カラム（径１．６×６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ，ファルマシア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでかけた。開始後、１５分より１．２ｍｌ（１分）毎に集めた各分画について生物活性を調べ、高い活性を示した分画番号４０−５０をプールして集めた（図１５）。
ゲルロ過カラムのプール分画を、ヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８５×５ｃｍ；Ｓｈｏｄｅｘ ＨＲ−８９４，昭和電工）にかけ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳにてカラムを洗浄の後、０Ｍから１ＭのＮａＣｌの濃度勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで６０分間にわたってかけ、１分毎に溶出液を分画した。生物活性の認められた分画番号２４から２８の画分をプールした（図１６）。
ヘパリンＨＰＬＣカラムのプール画分にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度０．１％になるように添加し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉ ｃｈｅｍｉｃａｌ）に流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでかけた。カラムを０．１％ＴＦＡにて洗浄後、０％から６３％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル濃度勾配を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで７０分間にわたってかけ、１分毎に溶出液を分画した（図１７）。生物活性は黒ぬりのピークに一致して認められた。
逆相ＨＰＬＣの活性画分２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で調べたところ、分子量２６−３０ＫＤに相当する位置のバンドのみが検出された（図１８）。
以上の操作により４３μｇのＣＯＳ７産生の精製ＢＴＣが得られた。
【００３８】
実施例１２
Ａ９細胞産生ＢＴＣの精製
Ａ９／１５１５−１４細胞の培養上清３．５リットルに１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０），０．５Ｍ ＥＤＴＡ，５％ＣＨＡＰＳ，０．２５Ｍ ＰＭＳＦを各々１８０ｍｌ，７ｍｌ，３６ｍｌ，７ｍｌずつ添加し、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラム（径２．６×４０ｃｍ，ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にかけた。カラムを３００ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で洗浄後、０．７Ｍ ＮａＣｌを含む上記緩衝液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、蛋白を溶出した。５ｍｌ毎に集めた各画分についてＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成誘起活性（生物活性）を調べ、分画番号２３−３２および４０−４９を各々ＢＴＣ−ＩおよびＢＴＣ−ＩＩとしてプールした（図１９）。
Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラムよりの、ＢＴＣ−Ｉプール画分を２５％および８０％流安で分画した後、限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０；アミコン）により濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化したゲルろ過カラム（径１．６×６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ，ファルマシア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでかけ、開始後、１５分より１．２ｍｌ毎に画分を集めた。高い生物活性を示した画分（分画番号３５−４１）をプールした（図２０Ａ）。
Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラムより得られたＢＴＣ−ＩＩプール画分を限外ろ過（ＹＭ２，アミコン）で濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化したゲルろ過カラム（径１．６×６０ｃｍ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ，ファルマシア）に流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでかけ、開始後、１５分より１．２ｍｌ毎に分画した。
高い生物活性を示した分画番号６６−７４をプールした（図２０Ｂ）。
ゲルろ過カラムから集めたＢＴＣ−Ｉプール画分をヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８×５ｃｍ；ＡＦｐａｋ ＨＲ−８９４，昭和電工）にかけた。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで洗浄後、０−０．９Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間にかけ、溶出液を１ｍｌ毎に分画した。生物活性の認められた分画番号９から１３の画分をプールした（図２１Ａ）。
ゲルろ過カラムから集めたＢＴＣ−ＩＩプール画分をヘパリンＨＰＬＣカラム（径０．８×５ｃｍ；ＡＦｐａｋ ＨＲ−８９４，昭和電工）にかけた。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで洗浄後、０−０．９Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで３０分間にかけ、溶出液を１ｍｌ毎に分画した。生物活性の認められた分画番号１６−１９の画分をプールした（図２１Ｂ）。
ヘパリンカラムから集めたＢＴＣ−Ｉプール画分にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように加え、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉ ｃｈｅｍｉｃａｌ）にかけた。０．１％ＴＦＡ存在下にアセトニトリル濃度勾配（０−６３％）を７０分間かけ、０．５ｍｌ（１ｍｉｎ）毎に溶出液を集めた（図２２Ａ）。生物活性は蛋白の溶出ピークと一致して認められた。この部分の蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色で調べると、分子量２６−３０Ｋの位置にのみバンドが検出された（図２３Ａ）。
以上の操作により１５０μｇのＢＴＣ−Ｉが得られた。
ヘパリンカラムから集めたＢＴＣ−ＩＩプール画分にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように加え、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径０．４６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉ ｃｈｅｍｉｃａｌ）にかけた。０．１％ＴＦＡ存在下にアセトニトリル濃度勾配（０−６３％）を７０分間かけ、０．５ｍｌ（１ｍｉｎ）毎に溶出液を集めた（図２２Ｂ）。生物活性は蛋白の溶出ピークと一致して認められた。この部分の蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色で調べると、分子量１４Ｋの位置にのみバンドが検出された（図２３Ｂ）。
以上の操作により７５μｇのＢＴＣ−ＩＩが得られた。
【００３９】
実施例１３
組換え型大腸菌より産生されたＢＴＣの精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐｌｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６を一晩培養した後、培養菌液を、２０倍希釈になるようにＬＢ培地に植菌した。３７℃で２時間培養後、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、さらに３時間培養した。遠心により菌体を集め使用時まで−２０℃に保存した。
５リットル培養相当の菌体ストックを解凍し、氷冷した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１０ｍＭ ＥＤＴＡ−０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０％ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ ＡＰＭＳＦを含むバッファー３００ｍｌに懸濁した。これに卵白リゾチーム４０ｍｇを溶解し、４℃で２時間インキュベートした後、超音波処理を行い、２０，０００×ｇで１時間遠心して上清を取得した。この上清を２００ｍｌのＱ−セファロースベットを通過させた後、ＴＣＡを最終濃度４％になるように加え、４０℃で１０分間静置した。２０，０００×ｇで２０分遠心して集めた沈殿を、１００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＡＰＭＳＦを含むバッファーに懸濁し、乳鉢中でホモゲナイズしながら、５Ｍ ＮａＯＨを加え、ｐＨ６に調整した。このホモゲネートを１００，０００×ｇで１時間遠心して得られた上清をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（径１．６×１０ｃｍ，ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。カラムを０．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含むバッファーで洗浄した後、０Ｍから１ＭのＮａＣｌ濃度勾配を４００ｍｌ，２００分にわたってかけ、溶出液を５ｍｌ毎に集めた。高い生物活性の認められた分画番号２０から２７をＥ．ｃｏｌｉ ＢＴＣ Ｉ，分画番号４０から４５をＥ．ｃｏｌｉ ＢＴＣ ＩＩ分画として、それぞれプールした（図２４）。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＴＣ Ｉのプール分画にＴＦＡを最終濃度０．１％になるように添加し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径１．０×２５ｃｍ；ＡｓａｈｉｐａｋＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉ ｃｈｅｍｉｃａｌ）にかけた。カラムを０．１％ＴＦＡで洗浄後、０％から６３％のアセトニトリル濃度勾配を、３４０ｍｌ，１７０分間にわたってかけ、溶出液を４ｍｌ毎に集めた。生物活性は矢印のピークに一致して認められた（図２５）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色で調べると、１８Ｋ付近に一本のバンドが認められた（図２６レーンＩ）。ＢＴＣ Ｉが精製された。この方法により６３０μｇのＥ．ｃｏｌｉ ＢＴＣ Ｉが得られた。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＴＣ ＩＩのＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムプール分画を０．１％ＴＦＡ存在下にＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（径４．６×１５ｃｍ；Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０，Ａｓａｈｉ ｃｈｅｍｉｃａｌ）にかけた。
カラムを洗浄後、０％から６３％のアセトニトリル濃度勾配を、３５ｍｌ，７０分間にわたってかけ、溶出液を０．５ｍｌ毎に集めた。生物活性は矢印のピークに一致して認められた（図２７）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で調べると、１４．３Ｋ（リゾチーム）より分子量の小さい位置に一本のバンドが認められ（図２６レーンＩＩ）、ＢＴＣＩＩが精製された。この方法により９９０μｇのＥ．ｃｏｌｉＢＴＣＩＩが得られた。
Ｅ．ｃｏｌｉＢＴＣ ＩおよびＩＩのＮ末端アミノ酸配列を２０アミノ酸残基まで決定した。ＢＴＣ Ｉは翻訳開始メチオニンから始まる予想通りのＮ末端を有し、ＢＴＣ ＩＩはＮ末端の３１残基を欠失した分子であることがわかった（図２８）。
【００４０】
【００４１】
【配列表】

【００４２】

【００４３】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【図面の簡単な説明】
【図１】濃縮無血清ベータ腫瘍細胞馴化培地をバイオレックス７０カチオン交換カラムに通した後のＢＴＣ−ＧＦの３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。
【図２】フェニールセファロースカラムに通した場合の、図１から集められた活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。
【図３】ＦＰＬＣヘパリンアフィニティーカラムに通した場合の、フェニールセファロースカラムから集められた活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。
【図４】ＨＰＬＣ Ｃ４逆相カラムに通した場合の、ヘパリンアフィニティーカラムから集められた活性画分の３Ｔ３細胞成長因子活性を示す。
【図５】ＨＰＬＣ Ｃ４逆相カラム精製を繰り返すことにより得られた、プールされた活性画分のゲルにおけるＢＴＣ−ＧＦの銀染色図である。
【図６】牛平滑筋細胞に対するＢＴＣ−ＧＦの分裂促進活性を示す。
【図７】ＢＴＣ−３及びＢＴＣ−ＪＣ１０から、それぞれ精製されたＢＴＣ−ＧＦのＮ−末端アミノ酸配列を示す。
【図８】マウスＢＴＣ−ＧＦ（成長因子）の中間部のアミノ酸配列の３３番から８０番のアミノ酸を示している（配列番号３）。
【図９−１】マウスＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるマウスＢＴＣ−ＧＦのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【図９−２】マウスＢＴＣ−ＧＦ ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるマウスＢＴＣ−ＧＦのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【図１０−１】実施例１で得られたヒトＢＴＣ−ＧＦの ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】実施例１で得られたヒトＢＴＣ−ＧＦの ｃＤＮＡの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸配列を示す。
【図１１】プラスミドｐＴＢ１５１５の構築図である。
【図１２】プラスミドｐＴＢ１５０７の構築図である。
【図１３】プラスミドｐＴＢ１５１６の構築図である。
【図１４】実施例１１で得られたＳ−セファロースカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１５】実施例１１で得られたゲルろ過の結果を示す。
【図１６】実施例１１において得られたヘパリン高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１７】実施例１１において得られた逆相高速液クロマトグラフィーを示す。
【図１８】実施例１１において得られたＳＤＡ−ＰＡＧＥ銀染色の結果を示す。
【図１９】実施例１２において得られたＳ−セファロースカラムクロマトグラフィー及びＤＮＡ合成誘導活性の結果を示す。
【図２０】実施例１２において得られたゲルろ過の結果を示す。
【図２１】実施例１２において得られたヘパリン高速液体クロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２２】実施例１２において得られた逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
【図２３】実施例１２において得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色の結果を示す。
【図２４】実施例１３において得られたＳ−セファロースカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２５】実施例１３において得られた逆相高速液体クロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２６】実施例１３において得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色の結果を示す。
【図２７】実施例１３において得られた逆相高速液体クロマトグラフィーカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２８】実施例１３において得られた結果によるアミノ酸配列を示す。

Claims (12)

1. 配列番号：５（図１０）のアミノ酸番号１番から８０番のアミノ酸で示されるアミノ酸配列からなる非グリコシル化組換え型蛋白質。
2. 配列番号：５（図１０）のアミノ酸番号１番から１４７番のアミノ酸で示されるアミノ酸配列からなる非グリコシル化組換え型蛋白質。
3. 請求項１記載の蛋白質をコードする塩基配列からなる単離されたＤＮＡ。
4. 請求項２記載の蛋白質をコードする塩基配列からなる単離されたＤＮＡ。
5. 配列番号：５（図１０）のＤＮＡ番号３８８番から６２７番の塩基配列からなる請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
6. 配列番号：５（図１０）のＤＮＡ番号３８８番から８２８番の塩基配列からなる請求項４記載の単離されたＤＮＡ。
7. 請求項３記載の単離されたＤＮＡを保持する組換えベクター。
8. 請求項４記載の単離されたＤＮＡを保持する組換えベクター。
9. 請求項７記載のベクターを保持する形質転換体。
10. 請求項８記載のベクターを保持する形質転換体。
11. 請求項９記載の形質転換体を培地中で培養することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の製造方法。
12. 請求項１０記載の形質転換体を培地中で培養することを特徴とする請求項２記載の蛋白質の製造方法。

Images