HUT77746A

HUT77746A - Fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkező savas fibroblaszt növekedési faktor analógok

Info

Publication number: HUT77746A
Application number: HU9800740A
Authority: HU
Inventors: Tsutomu Arakawa; Gary Michael Fox
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-07-28
Also published as: CA2201944C; AU3828195A; CA2201944A1; CN1169158A; NO971508L; EP0786000A1; WO1996022369A1; SK43297A3; CZ98097A3; JPH10507929A; MX9702475A; NO971508D0

Description

A találmány tárgyát az FGF családba tartozó fehérjék analógjai képezik. Ezek az analógok stabilabbak mint a megfelelő természetes fehérjék. A fokozott stabilitást azzal lehet elérni, hogy legalább egy aminosavat egy erősebb hurokképző aminosavval helyettesítenek egy, a fehérje aminosav szekvenciájában azonosított hurokképző régiójában. A jelen találmány szerinti analógok különösen jól használhatók terápiás alkalmazásokban .

63.662/SZE • · · · • · ··· · · ·· • ·« ····· ···· ·· ·· · ··

S.B.G. & K.

Nemzetközi Szabadalmi Iroda

H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-523 y'%. r-7 ·'/ 'í's'K? V 7: ΛΛ.ί ÍVH;: ', -!l SO ÍÍCí 2 ^:?ELDÁ.Hy -

Fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkező savas fibroblaszt növekedési faktor analógok

Amgen Inc., THOUSAND OAKS, CA, US

Feltalálók: Tsutomu ARAKAWA, THOUSAND OAKS, CA, US

Gary Michael FOX, NEWBURY PARK, CA, US

A bejelentés napja: 1995. 10. 12.

Elsőbbsége: 1994. 10. 13.

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US95/12907

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/22369

A szövetsérülést, azaz például sérülést vagy égést követő komplex gyógyulási folyamatot számos fehérjefaktor befolyásolja, amelyeket alkalmanként lágyszövet növekedési faktorok néven említünk. Ezekre a faktorokra van szükség az új sejtek növekedéséhez és differenciálódásához a roncsolt szövet helyettesítésére. A lágyszövet növekedési faktoroknak ebbe a cső» portjába tartozik a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-ek) fehérjecsaládja. Az FGF-ek mitogének és kemotaktikusak számos, epiteliális, mesenchima és neurális eredetű sejtre. Emellett az FGF-ek angiogének is, azaz képesek serkenteni a vérerek képződését. Az FGF-családba tartozik a savas FGF, a bázikus FGF, a

KGF, az Int-2, a HST, az FGF-5 és az FGF-6.

A savas FGF-ről (aFGF) és a bázikus FGF-ről (bFGF) azt gondolják, hogy két eredeti tagjai az FGF családnak. Mind az aFGF-ről mind a bFGF-ről azt gondolják, hogy ugyanabból a génből származnak, mivel mindkét molekula körülbelül 55%-os azonosságot mutat amellett, hogy ugyanazzal az intron/exon szerkezettel rendelkeznek. A savas FGF-ről és a bFGF-ről azt is lehet tudni, hogy ugyanahhoz a receptorhoz kötődnek, jóllehet a specifikus aFGF és bFGF receptorok létét még nem zárták ki. Az aFGF-nek és a bFGF-nek számos különböző molekulasúlyú formáját találták meg különböző szövetekben. A Southern biot kísérletek azonban azt sugallják, hogy csak egy gén létezik az aFGF és a bFGF molekulához, és a két molekula közötti különbségek valószínűleg a poszt-transzlációs folyamatok eredményei. Mind a savas mind a bázikus FGF mitogén hatású számos különböző, mezodermális és neuroektodermális eredetű sejttípusra, és képesek mind in vitro mind in vivő angiogenezist indukálni [ Gospodarowicz és mtsai: Exp. Eye Rés. 28, 501-514 (1979)] . A két osztálynak a biológiai aktivitástartománya közel azonos, jóllehet a biológiai vizsgáló rendszerekben a bFGF körülbelül tízszer hatékonyabb mint az aFGF.

• · • · · · • · · · · · • ··· ·· • · · · · • · · · * · · »

A KGF erős mitogén hatással rendelkezik számos különböző sejttel szemben, és a BALB/MK keratinociták sejtfelszíni receptoraihoz kötődik, amelyekhez az aFGF és a bFGF is kötődhet [ Bottaro és mtsai: Journal of Biological Chemistry 265, 1276712770 (1990)] . A KGF azonban eltér az ismert FGF-ektől (azaz az aFGF-től és a bFGF-től) , amennyiben nincs mitogén tulajdonsága a fibroblaszt vagy endoteliális sejtekkel szemben [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802-806 (1989)] . A KGF-nek az aFGF és bFGF receptoroktól eltérő receptorai vannak az NIH/3T3 fibroblasztokon, amelyek nem képesek kölcsönhatásba lépni a KGF-fel [Bottaro és mtsai: Journal of Biological Chemistry 265, 12767-12770 (1990)] .

Az aFGF és a bFGF közös megkülönböztető tulajdonsága az a hajlandóságuk, hogy erősen kötődnek a heparinhoz. Az aFGF-nek a heparinnal szembeni affinitása gyengébbnek tűnik mint a bFGF-é, az aFGF-nek anionos izoelektromos pontja van [Thomas és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82., 64096413 (1984). Az aFGF és a bFGF egyedi heparinkötő tulajdonsága nagyon megkönnyítette ezeknek a faktoroknak a tisztítását.

Az a felfedezés, hogy az FGF-ek erős affinitással rendelkeznek az immobilizált heparinhoz, új kutatásokra ösztönzött a heparin-szerű molekuláknak az FGF-ek in vivő biológiájában játszott szerepét illetően. Jóllehet a heparin funkcióinak teljes spektrumát még meg kell határozni, az ismert, hogy a a heparin számos különböző módon képes szabályozni az FGF funkcióját [Lobb: Eur. J. Clin. Invest. 18, 321326 (1988)] . A heparin-szerű molekulák például közvetlen • ·· ····· ···· ·· ·· · ·· szerepet játszhatnak az FGF funkcióban, beleértve az aFGF-ek aktiválását vagy potenciálását [ Uhllrich és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 137, 1205-1213 (1986)] .

Azonban nincs közvetlen korreláció az FGF-nek az immobilizált heparinnal szemben tanúsított affinitása és aközött, hogy az oldható heparin képes potencírozni. Ebből a szempontból a heparin potencírozó képessége az aFGF-re szelektívnek tűnik. Uhllrich és munkatársai például a tiszta aFGF potencírozásának mértékére azt találták, hogy körülbelül tízszer nagyobb mint a tiszta bFGF-é, ezzel az aFGF hatékonyságát körülbelül ugyanarra a szintre emeli mint a bFGF-é [Uhllrich és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 137, 1205-1213 (1986)] .

Azonban kiderült, hogy borjúmagzat szérum jelenlétében a heparin potencírozó hatása jelentősen lecsökken [ Uhllrich és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 137, 1205-1213 (1986)] .

Az FGF fehérjék alkalmazásáról azt gondolják, hogy hatékonyan elősegítik a traumás szövetek gyógyulását. Az FGF-ek egyedi angiogén tulajdonságai ezeket a faktorokat különösen értékessé teszik a mély sebek gyógyításában. A bFGF természetes fehérjéket úgy ismerik, mint amelyek jól használhatók a szívizominfarktus kezelésében [4,296,100 és 4,378,347 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés] . Emellett a humán bFGF-ről kiderült, hogy fokozza a neuronális túlélést és a neurit extenziót a patkány magzati hippokampális neuronjaiban, sugallva ezzel, hogy ez a faktor használható lehet még a degeneratív neurológiai rendellenességek, mint például az Alzheimer kór és a Parkinson kór kezelésében • · • ·< · ·· * » *· • · · « · · · • · · · · ·· ·· · · 9 9 9 · · ··«· · · ·· · ·· . 5 [Wallicke és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 3012-3016 (1986)] .

Az aFGF-nek a terápiás alkalmazásokban való hatékony használatában az egyik legnagyobb akadály valószínűleg az, hogy a bFGF-fel összehasonlítva jelentősen kisebb a biológiai aktivitása. Jóllehet a heparinnal végzett vizsgálatok azt sugallják, hogy az aFGF és a bFGF hatékonysága között megfigyelt különbség lényegében eltüntethető, ha heparint használunk az aFGF aktivitásának erősítésére addig a szintig, amit a bFGF mutat, a heparin alkalmazása a gyógyászati készítményekben esetleg nem mindig kívánatos. Ebből a szempontból lényeges megjegyezni, hogy a heparin, egy heterogén szerkezetű, erősen szulfatált glükózaminoglikán egy ismert antikoaguláns, ami úgy működik, hogy felgyorsítja azt a sebességet, amivel az antitrombin III inaktiválja a hemosztázis proteázait [Jaques: Pharmacol. Rév. 31, 99-166 (1980)] . Az nem ismert, hogy káros lehet-e a heparin alkalmazás egy mély sebek kezelésére használt gyógyászati készítményben, ahol bizonyos mértékű koagulációra szükség lehet a megfelelő gyógyulás elérésére.

Emellett gyakorlati megfontolások várhatók, ha a heparint egy sebgyógyításra használt gyógyászati készítménybe tesszük. A gyógyszerbejuttatási megfontolások közé tartozik a gyógyászati készítmény összetételének szabályozása (beleértve az aFGF és a heparin kombinációját) a beteg testébe való bejutás során. Emellett a borjúmagzat szérum negatív hatása a heparin aFGF-et potencírozó hatására, amit Uhllrich és munkatársai figyeltek meg [Uhllrich és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 137,

1205-1213 (1986)] , azt sugallja, hogy bármely előny, ami akkor figyelhető meg, ha a gyógyászati készítménybe heparint teszünk az aFGF faktor aktiváló vagy potencírozó faktoraként, teljesen megszüntethető vagy elveszthető, ha érintkezésbe kerül a beteg saját szérumával.

A jelen találmány tárgya az FGF családba tartozó fehérje analóg, amely a természetben előforduló fehérjeformával összehasonlítva fokozott stabilitással rendelkezik. A jelen találmány tárgya tovább egy olyan aFGF, amely fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkezik heparin távollétében. A jelen találmány tárgya továbbá egy terápiás célokra használható aFGF analóg.

A jelen találmány tárgyát az FGF családba tartozó új analógok képezik. Egy ilyen analóg egy aFGF analóg, amely heparin távollétében a természetben előforduló aFGF-fel összehasonlítva stabilabb és nagyobb biológiai aktivitással rendelkezik. Egy további ilyen analóg egy KGF analóg, amely a természetben előforduló aFGF-fel összehasonlítva nagyobb hőstabilitással rendelkezik. A fokozott hőstabilitást úgy lehet elérni, hogy legalább egy, kis hurokképző tulajdonságokkal rendelkező aminosav csoportot egy erősebb hurokképző potenciállal rendelkező aminosavval helyettesítünk a természetes fehérje Asn-His-TyrAsn-Thr-Tyr hurokképző szekvenciájában. Az aFGF esetében ez a hurokképző szekvencia körülbelül a 92-96-os aminosavaknál fordul elő. A KGF esetében ez a hurokképző régió körülbelül a 115-199-es aminosavak körül fordul elő. A jelen találmány egy előnyös analógja egy olyan aminosav helyettesítést tartalmaz, • fc ·· * ·»· · · • * · « · · · » *’·* ·· ·· * « X . 7 amely aminosav a hurokképző szekvenciában levő hisztidin csoportnál erősebb hurokképző potenciállal rendelkezik.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábrán a rekombináns szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF aminosav szekvenciáját láthatjuk.

A 2. ábrán a rekombináns humán [ Gly ] aFGF aminosav szekvenciája látható.

A 3. ábrán a szarvasmarha [Alá⁴⁷] és [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok elúciós profilja látható hidrofób kölcsönhatásos kromatográfia alkalmazásakor.

A 4A. és 4B. ábrán a szarvasmarha [Alá⁴⁷] és [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok cirkuláris dikroizmus spektruma látható.

Az 5. ábrán a szarvasmarha [Alá⁴⁷] és [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok FTIR spektrumának második deriváltja látható az amid I' régiójában (C=0 tartomány a deuterált fehérjékben).

7 x

A 6. ábra egy grafikon, ami a szarvasmarha [Alá ] es [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok, valamint a humán [ Ser⁷⁰, Ser⁸⁸] bFGF koncentrációjának logaritmusát ábrázolja a maximális serkentés százalékával szemben.

A 7. ábra egy grafikon, ami a szarvasmarha [ Alá ] es [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok aktivitásának időbeli elvesztését 70 88 mutatja heparin távollétében, a humán [ Ser , Ser ] bFGF-fel összehasonlítva.

A 8. ábra a jelen találmány szerinti szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg szerkezetét mutatja, Röntgenkrisztallográfiával meghatározva.

A 9. ábrán a természetben előforduló KGF nukleinsav és aminosav szekvenciáját láthatjuk.

A 10. ábrán a rekombináns [Gly¹¹⁶] KGF nukleinsav- és aminosav szekvenciája látható.

A jelen találmány tárgyát az FGF család új analógjai képezik. Ezek az analógok a természetben előforduló fehérjével összehasonlítva fokozott stabilitással rendelkeznek. A jelen találmány szerinti aFGF analógok esetében az analóg heparin távollétében fokozott stabilitást és biológiai aktivitást mutat. A jelen találmány szerinti KGF analóg esetében az analóg fokozott hőstabilitással rendelkezik. A jelen találmány szerinti analógok legalább egy, a természetben előforduló fehérjében levőtől eltérő aminosavat tartalmaznak a természetes fehérje Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr hurokképző szekvenciájában, vagy annak közvetlen közelében. Az aFGF esetében a hurokképző szekvencia a 92-96-os aminosavak környékén található (a szarvasmarha aFGF ismert aminosav szekvenciájának számozása alapján, amint az az 1. ábrán látható). A KGF esetében a hurokképző szekvencia a 115-119-es aminosavak környékén fordul elő, amint az a 9. és 10. ábrán látható. A különböző aminosav (ak)at az erősebb hurokképző potenciál alapján választjuk ki, azzal a céllal, hogy stabilizáljuk az analóg ezen területét. A viszonylag nagy hurokképző potenciállal rendelkező aminosavak közé tartozik a glicin, a prolin, a tirozin, az aszparaginsav az aszparagin és a szerin [ Leszcynski és mtsai: Science 234, 849-855 (1986)] (a hurokképző potenciál relatív értékeit annak alapján becsülik meg, hogy milyen gyakran fordul • · · ··· · • · elő az adott aminosav természetes molekulák hurok-struktúrájában) . Előnyösen, egy magasabb hurokképző potenciállal rendelkező aminosav helyettesíti a hisztidin csoportot a hurokképző szekvenciában. Még előnyösebben a hurokképző szekvenciában levő hisztidint glicinnel lehet helyettesíteni.

A jelen találmány szerinti analógokon egyéb hozzáadásokat, helyettesítéseket és/vagy deléciókat végezhetünk. Az analógok például adott esetben tartalmazhatnak egy helyettesítést a nemkonzerválódott cisztein-csoportok helyén (azaz a szarvasmarha aFGF molekula 47-es pozíciójában levő cisztein-csoport és a humán aFGF molekula 16-os pozíciójában levő cisztein-csoport) . Emellett a jelen találmány szerinti, Escherichia coli gazdasejtekben expresszálódó analógok tartalmazhatnak egy indító metionin csoportot (azaz a -1-es pozícióban, amint az az 1. ábrán látható). Egy másik módszer szerint a terminális aminosavak közül egyet vagy többet kivághatunk a DNS szekvenciából, amint az ismert a szakterületen jártas szakember számára, miközben a fehérje megtartja a megfelelő, természetben előforduló fehérje fokozott biológiai aktivitását.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a jelen találmány szerinti analógokat vagy azok egy részét kódoló DNS szekvenciák. Az ilyen szekvenciák előnyösen tartalmazhatnak a kiválasztott Escherichia coli gazdatörzsek által előnyben részesített kodonokat (Escherichia coli expressziós kodonok) , hasítási helyeket restrikciós endonukleáz enzimek számára, és/vagy további kezdő, terminális vagy közbenső DNS szekvenciákat, amelyek megkönnyítik a könnyen expresszálható vektorok készítését. Ezek közé az új szekvenciák közé tartoznak azok a szekvenciák, amelyek jól használhatók a jelen találmány szerinti analógok expresszálására mind eukarióta mind prokarióta gazdasejtekben, azaz például Escherichia coli-ban.

Még pontosabban, a jelen találmány szerinti DNS szekvenciák tartalmazhatják az 1. ábrán bemutatott DNS szekvenciát, amelyben a 92-96-os aminosavak kodonjai közül legalább egyet egy olyan kodonnal helyettesítünk, amely egy erősebb hurokképző potenciállal rendelkező aminosavat kódol (a továbbiakban aFGF analóg szekvencia(ák) vagy analóg szekvencia(ák)), valamint egy olyan DNS szekvenciát, amely hibridizálódik az egyik analóg szekvenciához vagy annak fragmenseihez, és egy olyan DNS szekvenciát, amely a genetikai kód degenerációjától eltekintve hibridizálódik az egyik analóg szekvenciához.

Ennek megfelelően, a jelen találmány szerinti DNS szekvenciák tartalmazhatják a 10. ábrán látható DNS szekvenciát, amelyben a 115-119-es aminosavak területét kódoló kodonok közül legalább egyet egy olyan aminosavat kódoló kodonnal helyettesítünk, amely erősebb hurokképző potenciállal rendelkezik (a továbbiakban KGF analóg szekvencia(ák)”, vagy analóg szekvencia (ák)), valamint egy olyan DNS szekvenciát, amely hibridizálódik az egyik analóg szekvenciához vagy annak fragmenseihez, és egy olyan DNS szekvenciát, amely a genetikai kód degenerációjától eltekintve hibridizálódik az egyik analóg szekvenciához .

A jelen találmány szerinti analógokat a számos, a szakterületen jártas szakember számára ismert rekombináns technika • · közül bármelyikkel lehet kódolni, expresszáltatni és tisztítani. Az előnyben részesített előállítási eljárás változhat, számos faktortól és megfontolástól függően, beleértve az anyagok árát és hozzáférhetőségét, valamint egyéb gazdasági megfontolásokat. Egy adott helyzetben az optimális előállítási eljárás a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, minimális kísérletezést igényel a kidolgozása. A jelen találmány szerinti analógok expresszálhatók, különösen magas szinten Escherichia coli gazdasejtekben, és a kapott expressziós termék azután közel homogenitásig tisztítható a szakterületen jártas szakember számára ismert eljárásokkal. Egy tipikus tisztítási eljárás során először oldatba viszik az analógokat tartalmazó zárványtesteket, utána ioncserés kromatográfiát végeznek, majd helyreállítják a fehérje háromdimenziós szerkezetét, és végül hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát végeznek.

A jelen találmány analógjai meglepő mértékű stabilitásfokozódást mutatnak. A természetes aFGF-fel ellentétben a jelen találmány szerinti aFGF analógok fokozott stabilitást és biológiai aktivitást mutatnak heparin távollétében. Jóllehet az ismert, hogy stabilabb bFGF analógokat lehet kapni ha bizonyos cisztein-csoportokat szerinnel vagy egyéb semleges aminosavakkal helyettesítünk [No. 88/04189 PCT szabadalmi bejelentés] , ha a természetes aFGF-ben a 47-es pozícióban levő nemkonzerválódott ciszteint helyettesítjük, akkor erről nem gondoljuk, hogy ez jelentősen fokozza egy aFGF analóg biológiai aktivitását és/vagy stabilitását. Ezt demonstrálja a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analóg (a cisztein van helyettesítve) • · • · · · alacsonyabb aktivitása, egy szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóggal összehasonlítva (ami a kívánt aminosav-helyettesítéseket tartalmazza az aFGF molekula 92-96-os régiójában, amint azt az alábbi példákban mutatjuk be. Pontosabban a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] analógról kiderült, hogy jóllehet kevésbé hatékony mint a bFGF, viszont tízszer hatékonyabb mint a szarvasmarha [Alá⁴⁷] aFGF analóg. 45 μg/ml heparin hozzáadásával az FGF mindhárom formájának biológiai aktivitását fokozni lehet, beleértve a szarvasmarha [ Alá⁴⁷,Gly⁹³] analógot, a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] analógot és a humán [ Ser⁷⁰, Ser⁸⁸] bFGF analógot, és mindegyik lényegében azonos aktivitással rendelkezik.

A szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógoknak heparin távollétében a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analóghoz viszonyított fokozott mitogén aktivitásának és stabilitásának az oka nem volt azonnal világos. Úgy tűnik, hogy ha a 93-as pozícióban levő hisztidin-csoportot glicinre cseréljük, akkor ez az aFGF molekulát valamivel hidrofóbabbá teszi, de valószínűleg nem változtatja meg drasztikusan a tercier struktúráját, cirkuláris dikroizmus és FTIR spektroszkópia alapján meghatározva. Azonban a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg és a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analóg (amely csak a 47-es pozícióban tartalmaz különbséget) aktivitásának in vitro biológiai vizsgálatokban megfigyelt különbsége azt sugallja, hogy a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógnak a glicinnel helyettesített 93-as aminosav pozíciója valószínűleg a receptor-kötésért felelős régión belül, vagy ahhoz közel található. Jóllehet az aFGF-ben nem határozták meg a receptor-kötésért felelős régiót, az aFGF13 ben a 93-as pozíció a bFGF egy olyan régiójának felel meg, amiről leírták, hogy a receptor-kötő doménben vagy annak közelében van [ Baird és mtsai: Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA 85, 2324-2328 (1988)] .

z 47 93

Emellett a jelen találmány szerinti [Alá , Gly ] aFGF analóg a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] analógtól eltérően fokozott stabilitást mutat, 250 óra alatt is megtartja eredeti mitogén staz 47 bilitásat heparin tavolleteben, miközben a szarvasmarha [ Alá ] analóg gyorsan elveszti aktivitását.

93 z

A szarvasmarha [Alá ,Gly ] aFGF analógot kristályosítottuk, majd a kapott kristályokat Röntgen-krisztallográfiával vizsgáltuk. Az ezeknek a kristályoknak a vizsgálatával kapott Röntgen-krisztallográfiái adatok alátámasztják azt a véleményt, ami a hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás adatokból származik, hogy a 93-as csoport érintkezik az oldószerrel, azaz ha a 93-as pozícióban levő hisztidint glicinre cseréljük, akkor ez a molekulát kevésbé hidrofillé teszi. A szarvasmarha [ Alá⁴⁷,Gly⁹³] aFGF analóg szekvencia 93-as csoport körüli régiójának részletes vizsgálata felfedte, hogy itt körülbelül 8 olyan aminosav található egymás mellett, amelyek erős hurokképző aktivitással rendelkeznek a 90-es pozícióban levő glutaminsav és a 97-es pozícióban levő tirozincsoport által meghatározott régióban. Az aminosavak relatív hurokképző hatékonyságát leírták, és a glicint azonosítják úgy, mint egy olyan aminosavat, amely az összes aminosav közül a legmagasabb hurokképző potenciállal rendelkezik [ Leszcynski és mtsai: Science 234, 849-855 (1986)] . Tehát az a vélemény alakult ki, ··* ·· ·· hogy hogy ha a hisztidint glicinre cseréljük, akkor ez stabilizálja a feltételezett hurkot, a glicincsoportnak a hisztidinhez hurokképző nagyobb viszonyított sokkal következtében.

A jelen találmány szerinti KGF analógok azt is igazolják, hogy a megfelelő régió a KGF-ben egy oldószerrel érintkező hurok, amely szerepet játszhat a receptor-kötésben. Pontosabban, a jelen találmány szerinti [ Gly¹¹⁶] KGF analógról kiderült, hogy a természetes KGF-hez viszonyítva megváltozott, csökkent mitogén aktivitással rendelkezik, amit az alább következő példákban ismertetünk. A [Gly¹¹⁶] KGF analógról az is kiderült, hogy a természetes KGF-hez viszonyítva magasabb aktivitása hőstabilitással rendelkezik.

Az alábbiakban ismertetett, előnyben részesített [ Gly ] aFGF és [ Gly¹¹⁶] KGF analógok mellett a jelen találmányban egyéb analógokat is számításba vettünk. Ezeket az egyéb analógokat a szakterületen jártas szakember könnyen előállíthatja az alább következő kitanítás alapján. Például nem kevesebb mint tizenöt olyan aminosavról írták le, hogy a hisztidinénál magasabb hurokképző aktivitással rendelkeznek [ Leszcynski és mtsai: Science 234, 849-855 (1986)] . Ezek az aminosavak a következők (a hurokképző potenciál csökkenő sorrendjében): glicin, prolin vagy tirozin, aszparaginsav vagy aszparagin, szerin, cisztein, glutaminsav, treonin, lizin, cisztin, glutamin, arginin, fenilalanin és triptofán. Ha egy természetes fehérje hurokképző szekvenciájában a hisztidin-csoportot bármelyik előző aminosavval helyettesítjük, akkor az várható, hogy ez egy jelen »« ' 15 találmány szerinti analógot eredményez, amely fokozott stabilitással rendelkezik. Természetesen az az előnyös, ha a a hurokképző szekvenciában a hisztidin-csoportot olyan aminosavval helyettesítjük, amely a lehető legmagasabb hurokképző potenciállal rendelkezik, anélkül, hogy akármilyen negatív hatások lehetőségét hoznánk létre, azaz például nem-kívánt diszulfid-hidak kialakulását további cisztein vagy ciszteincsoportok beszúrása révén. Tehát a hurokképző szekvenciában egyéb előnyös aminosav helyettesítés (azaz a glicin mellett) lehet a prolin, tirozin, aszparaginsav, aszparagin, szerin, glutaminsav, treonin, lizin, glutamin, arginin, fenilalanin és triptofán helyettesítés.

A jelen találmányban számításba vettük azt is, hogy a természetes aFGF 92-96-os aminosav régiójában (azaz a 92-es és a 94-96-os aminosavak), valamint a természetes aFGF 115-119-es aminosav régiójában (azaz a 92-es és a 115-117-119-es aminosavak) egy aminosavat egy magasabb hurokképző aktivitással rendelkező aminosavval helyettesítjük. A jelen találmány szerinti aFGF analógok közé tartoznak például azok az aFGF analógok, amelyekben a természetes aFGF 96-os pozíciójában levő treonint glicinnel, prolinnal vagy tirozinal, aszparaginsavval vagy aszparaginnal, szerinnel vagy glutaminsavval helyettesítjük (a preferencia sorrendjében megadva), jóllehet a stabilitás és/vagy a biológiai aktivitás minimális növekedése várható attól, ha a treonint glutaminsavval helyettesítjük, mivel ezeknek az aminosavaknak a hurokképző potenciálja hasonló egymáshoz.

A természetes aFGF 92-es, 94-es, 95-ös és 97-es pozíciójában levő aminosav-csoportok (aszparagin, tirozin, aszparagin és tirozin) elég magas hurokképző potenciállal rendelkeznek, ezért minimális előny várható attól, ha ezeket az aminosavakat másra cseréljük.

A jelen találmány szerinti analógokat úgy tekintjük, hogy azok lefedik mind a humán mind az állati (azaz szarvasmarha) analógokat, valamint egy olyan fehérjének az összes formáját, amely az alábbi hurokképző aminosav szekvenciával rendelkezik:

93 94 95 96 (aFGF)

-Asn-His-Tyr-Asn-Thr115 116 117 118 119 (KGF)

Az aFGF-nek például mind a humán mind a szarvasmarha formája ismert, és az adatok szerint azonos aminosav szekvenciával rendelkeznek (lásd fent) a 92-96-os pozícióban. Emellett körülbelül 92%-os szekvencia-azonosság van a humán és a szarvasmarha aFGF között, valamint 97%-os hasonlóság (azaz a két aFGF forma közötti összes 8% eltérésnek körülbelül 5%-a konzervatív). A természetes aFGF-nek mind a a humán mind a szarvasmarha formái lényegében azonos in vitro mitogén aktivitással rendelkeznek.

Mivel heparin távollétében fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkeznek, ezért a jelen találmány szerinti biológiailag aktív aFGF analógok különösen alkalmasak gyógyászati készítményekben való alkalmazásra, amely készítményeket orvosok és/vagy állatorvosok emlősök számos különböző sebének kezelésére használják. A jelen találmány szerinti KGF analógok, fokozott hőstabilitásuk miatt szintén jól használhatók gyógyászati készítményekben való alkalmazásra. Az ilyen kezelésekben alkalmazott biológiailag aktív analóg mennyisége természetesen függ a kezelendő seb súlyosságától, a választott beadási módtól és az analóg specifikus aktivitásától vagy tisztaságától, és a kezelőorvosnak vagy az állatorvosnak kell meghatároznia. Az analóg terápiásán hatékony mennyiség szakkifejezés az analógnak arra a mennyiségére vonatkozik, amelyről kiderítették, hogy terápiás választ vált ki egy emlősben. Az ilyen terápiásán hatékony mennyiségeket a szakterületen jártas szakember könnyen meg tudja határozni.

A jelen találmány szerinti analógokat bármely olyan módon beadhatjuk, amely megfelel a kezelendő sebnek vagy állapotnak. Azok az állapotok, amelyeket előnyösen lehet kezelni a jelen találmány szerinti analóg terápiás alkalmazásával, a következők lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: felszíni sebek gyógyítása, csontgyógyítás, angiogenezis, idegregenerálódás és szerv generálódása és/vagy regenerálódása.

A jelen találmány szerinti kiszerelt készítmények, amelyek mind állatgyógyászati mind embergyógyászati felhasználásra használandók, az analógnak egy terápiásán hatékony mennyiségét tartalmazzák egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt, valamint adott esetben más terápiás adalékanyagokat is tartalmaznak. A hordozó(k)nak elfogadható (k) nak kell lennie (ük) abban az értelemben, hogy kompatibiliseknek kell lenniük a készítmény egyéb adalékanyagaival, és nem szabad káros hatással lenniük a betegre sem. A készítményeket egyszerűen egységdózis formában állíthatjuk elő, és bármelyik, a szakterületen ismert módszerrel előállíthatjuk. Mindegyik módszer tartalmazza azt a lépést, hogy az aktív adalékanyagot érintkezésbe hozzuk a hordozóval, ami egy vagy több kiegészítő adalékanyagot is tartalmaz. Általában a készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az analógot egyenletesen és erősen érintkezésbe hozzuk folyékony hordozókkal vagy finoman eloszlatott szilárd hordozókkal vagy mindkettővel.

Az alábbi példákat azzal a céllal adjuk meg, hogy segítsék a jelen találmány megismerését, aminek az oltalmi körét a csatolt igénypontokban definiáljuk. Az nyilvánvaló, hogy az ismertetett eljárásokat módosíthatjuk, anélkül hogy eltérnénk a találmány szellemétől.

1. Példa

Az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg előállítása

Szintézis

Az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógot és a [Gly¹¹⁶] KGF analógot helyspecifikus mutagenezissel állítottuk elő. Az azonban nyilvánvaló, hogy a jelen találmány ezek és egyéb analógjai más módszerekkel is előállíthatok, beleértve például a kémiai szintézist is. Az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg esetében egy szarvasmarha szekvenciát használtunk. Pontosabban, az [ Alá⁴¹, Gly⁹³] aFGF analógot az alábbiak szerint állítottuk elő:

Egy, a jelen találmány szerinti szarvasmarha aFGF analógot készítettünk, és a következő példákban megvizsgáltuk. Ezt az s zarvasmarha analógot, a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF-et úgy szerkesztettük meg, hogy tartalmazza mind a kívánt aminosav helyettesítést (azaz a 93-as pozícióban hisztidin helyett glicint) az aFGF molekula 92-96-os hurokképző szekvenciájában, valamint tartalmazzon egy további aminosav helyettesítést, azaz a 47-es pozícióban a nem-konzerválódott cisztein helyett alanint tartalmazzon, amint az az 1. ábrán látható. Egy szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analógot is előállítottunk, azaz amelyikben csak a ciszteint helyettesítettük alaninnal, azzal a céllal, hogy kontrollként használjuk a kívánt szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg mellett. Jóllehet ezekben a példákban a jelen találmány szerinti szarvasmarha analógokat mutatjuk be, ugyanezek az eredmények kaphatók a rendkívül homológ humán aFGF analógokkal. A jelen találmány szerinti megfelelő humán [Gly⁹³] aFGF analógot például a 2. ábrán mutatjuk be.

A szarvasmarha aFGF [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] analógját kódoló szintetikus gént két részletben raktuk össze összesen 28 oligonukleotid komponensből. Gimenez-Gallego és munkatársai aminosav szekvenciáját [ Gimenez-Gallego és mtsai: Science 230, 1385-1388 (1985)] alkalmaztuk ennek a génnek az alapjául, a kodonokat úgy választva meg, hogy optimalizáljuk az analóg expresszióját Escherichia coli-ban [Gimenez-Gallego és mtsai: Science 230,

1385-1388 (1985)] . Az I. részt 16 oligonukleotidból raktuk össze, így kaptunk egy 287 nukleotidból álló fragmenst, amit be lehet építeni egy plazmid-vektorba az Xbal és Xhol restrikciós endonukleáz hasítási helyekre. A II. részt 12 oligonukleotidból állítottuk össze, így kaptunk egy 170 nukleotidból álló fragmenst, amit Xhol és BamHI kompatibilis végek határolnak. A két részt a pCFM1156 expressziós plazmidba visszük be, amit előzőleg Xbal és BamHI emésztettünk. A két részt háromkomponenses ligálással építjük össze, így kapjuk a teljes aFGF gént, a lambda pL promoter irányítása alatt.

A pCFM1156 plazmidot az ismert pCFM836 plazmidból állítjuk elő. A pCFM836 plazmid készítését a 4,710,473 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben írják le; a leírás megfelelő részeit, főleg az 1-7. példákat a továbbiakban referenciának tekintjük. A pCFM1156-nak pCFM836-ból való előállításához a két endogén Ndel restrikciós hasítási helyet elvágjuk, a keletkező végeket T5 polimerázzal feltöltjük, és a feltöltött végeket tompavég ligálásba visszük.

A kapott plazmidot aután Clal és KpnI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a kivágott DNS fragmenst egy DNS oligonukleotiddal helyettesítjük, aminek a szekvenciája az alábbi:

5' -CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC-3'

3' -TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC-5'

Az ezzel a plazmiddal transzformált Escherichia coli sejteket egy 16 literes fermentorban szaporítjuk [ Fox és mtsai: Journal of Biological Chemistry 263, 18452-18458 (1988)] .

A szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF-et kódoló gént az [Alá⁴⁷] formára konvertáljuk, helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával. Az aFGF gént először az Ml8mpl8 fágvektorba visszük be, majd egyszálú DNS-t készítünk, ami templátként szolgál a mutagenezis reakcióhoz. Ebből a DNS-ből körülbelül 0,5 μ9~οό keverünk össze

5-5 pikomól mutagén primerrel (5' • · · · · ··· ·· « • · · · szőlésztjük, replikázzuk, máj'

GAAGAAAACCATTACAACAC-3' ) és az M13 DNS szekvenáláshoz használt univerzális primerjével, 3 percig 65 °C-on tartjuk, majd hagyjuk lassan lehűlni. Az illesztett tamplát-primert ATP-vel, dNTP keverékkel, DNS polimeráz I nagy fragmenssel és T4 DNS ligázzal keverjük össze, majd 4 óra hosszat 15 °C-on tartjuk.

Ennek a reakcióelegynek alikvot részeit hozzáadjuk kompetens

Escherichia coli JM101 sejtekhez, majd 0,7%-os L-agarra A kapott tarfoltokat nitrocellulóz szűrőlapokra jd a szűrőlapokat P-jelzett mutagen primerrel hibridizáltatjuk. A hibridizálódó fágból DNS-t készítünk, majd megszekvenáljuk, hogy igazoljuk a kívánt mutagenezis esemény sikeres megtörténtét. A kapott gént azután visszavisszük a pCFM1156 vektorba, hogy expresszáljuk a rekombináns fehérjét.

Az aFGF analóg tisztítása

A szarvasmarha aFGF-nek mind az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] mind az [ Alá⁴⁷] analógját a rekombináns fehérjét expresszáló, mechanikusan lizált Escherichia coli sejtek centrifugálásával kapott oldhatatlan frakcióból tisztítjuk. Az üledéket 8 mol/1 karbamid, 0,1 mol/1 glicin (pH=2,5) összetételű oldatban szolubilizáljuk, majd az oldhatatlan anyagok eltávolítására centrifugáljuk. A felülúszót S-Sepharose oszlopra visszük (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amit 6 mol/1 karbamid, 10 mmol/1 glicin (pH=3,0) összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba, majd mossuk 6 mol/1 karbamid, 20 mmol/1 nátriumcifrát (pH=6,5) összetételű oldattal. Az oszlopra kötött fehérjéket 20 mmol/1 nátrium-citrátban (pH=6,5) készített lineáris ··· ··· ' 22

0-0,5 mol/1 nátrium-klorid gradienssel eluáljuk. Az aFGF-et tartalmazó frakciókat egyesítjük, húszszorosra hígítjuk 20 mmol/1 nátrium-citrát, 0,1 mol/1 ammónium-szulfát összetételű oldattal, majd a csapadék eltávolítására centrifugáljuk. A felülúszót egy térfogat 20 mmol/1 nátrium-citrát, 2 mol/1 ammónium-szulfát összetételű oldattal keverjük össze, majd fenil-Sepharose oszlopra visszük, amit előzőleg 20 mmol/1 nátrium-citrát, 1 mol/1 ammónium-szulfát (pH=6,5) összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. A megkötött fehérjéket az oszlopról egy lineárisan csökkenő ammónium-szulfát gradienssel (1—>0 mol/1) eluáljuk. Az aFGF-et tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd 20 mmol/1 nátrium-citrát (pH=6,5) oldattal szemben dializáljuk. Ez a termék lényegében homogén, amit az a tény is igazol, hogy a Coomassie blue-val festett gélen nem láthatók más csíkok, amit a 4. ábrán mutatunk be.

2. Példa

Az aFGF analóg gélszűréses kromatográfiája

A gélszűrést szobahőmérsékleten végezzük egy Superose-12 oszloppal, egy Pharmacia FPLC rendszerben (Pharmacia, Uppsala, Svédország). Az oszlopot 0,5 ml/perc sebességgel futtatjuk, 20 mmol/1 nátrium-citrát, 0,2 mol/1 nátrium-klorid (pH=6,5) összetételű oldattal.

A gélszűréses kromatográfia azt mutatja, hogy a tisztított szarvasmarha [Alá⁴⁷] és [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógok egyetlen csúcsként eluálódnak, a ribonukleáz A-val azonos elúciós pozícióban (M_r=13700). Ez azt mutatja, hogy mindkét fehérje • · monomer, és a hidrodinamikus sugaruk egyforma, jóllehet megvan a lehetősége, hogy a fehérjének mindkét formája kölcsönhatásba lép az oszlopmátrixszal, és késlelteti sz oszlopról való elúciót.

3. Példa

Az aFGF analóg hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiája

A hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát szobahőmérsékleten végezzük, fenil-Superose oszlopot használva egy Pharmacia FPLC rendszerben. A mintát 2 mol/1 ammónium-szulfát, 20 mmol/1 nátrium-citrát (pH=6,5) összetételű oldatban visszük az oszlopra, amit előzőleg 2 mol/1 ammónium-szulfáttal hoztunk egyensúlyba. 2 mol/1 ammónium-szulfáttal végzett mosás után a megmaradt fehérjét ammónium-szulfát gradienssel (2 —> 0 mol/1) oldjuk le az oszlopról, ezt követi egy végső mosás 20 mmol/1 nátrium-citráttal (pH=6,5).

Mivel egy hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiában (HIC) az elúciós pozíció erősen függ attól, hogy a hidrofób régiók a természetes térszerkezetű formában mennyire érintkeznek a környezetükkel, ez a technika érzékeny próbája a hasonló fehérjék konformációs homogenitásának. A 3. ábrán a szarvasmarha [Alá ] es [Alá , Gly ] aFGF analógok elucios profiljai lathatók. Az [Alá ] aFGF egy fo csíkot mutat, ami 0,25 mol/l-nél eluálódik, míg az [ Alá^{* 47}, Gly⁹³] aFGF analóg 0,14 mol/1 ammónium-szulfátnál mutat egyetlen csíkot, sugallva ezzel, hogy mindkét fehérje elsődlegesen egyetlen eltérő konformációban létezik. Az, hogy az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF alacsonyabb sókoncentrációnál eluálódik, az azt mutatja, hogy egy kicsivel hidrofóbabb mint az [Alá⁴⁷] forma. Ez a megfigyelés egybeesik a 93-as pozíciójú hisztidin glicinnel való helyettesítésével, ha a fehérje konformációja olyan, hogy ez a csoport érintkezik az oldószerrel. Egy másik alternatíva az, hogy ez ebben a csoportban végzett változtatás nagy változást okoz a molekula konformációjában, ami egy sokkal hidrofóbabb struktúrát eredményez.

4. Példa

Az aFGF analóg spektroszkópiája

A cirkuláris dikroizmus spektrumokat szobahőmérsékleten határozzuk meg egy Jasco Model J-500C spektropolariméterrel (Jasco, Tokio, Japán) , ami egy Oki If 800 Model 30 számítógéppel van felszerelve (Oki, Tokió, Japán). A méréseket 1 nm-es sávszélességgel végezzük, 1 és 0,02 cm-es küvettákat alkalmazva a közeli és távoli ultraibolya tartományban. Az adatokat átlagos csoport ellipticitásban [ Θ] fejezzük ki, mindkét aFGF formánál 113-as átlagos csoportsúllyal számolva.

A szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] és [Alá⁴⁷] aFGF analógok cirkuláris dikroizmus (CD) spektruma közel azonos a közeli és távoli ultraibolya régióban, amint az a 4A. és 4B. ábrákról látható. Az analógok CD-je nagyon hasonlít a humán bFGF-re leírt spektrumhoz is [ Arakawa és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 161, 335-341 (1989)] . A spektrumnak a közeli ultraibolya régióban való hasonlósága összhangban van az FGF-ek hasonló tercier struktúrájával.

Hőátmenet

A fehérjék hőátmenetét egy Response II spektrofotométerrel határoztuk meg (Gilford, Medfield, Massachusetts), ami hőprogrammal és termosztált küvettatartóval van felszerelve. A mintákat 0,1 °C/perc vagy 0,5 °C/perc sebességgel melegítjük, majd abszorbanciájukat 287 nm-en követjük. A fehérjék koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg, a bFGF-re 0,98-as extinkciós koefficienst használva, míg mindkét aFGF analóg esetében 1,04 extinkciós koefficienst használtunk 280 nm-en, 0,1% fehérjéhez.

Az aFGF analógok hődenaturálását heparin jelenlétében és távollétében vizsgáljuk, mind pH=6,5, mind pH=7,0 mellett, 20 mmol/1 nátrium-citrátban. A hőmérséklet emelésével a fehérjék minden esetben kicsapódtak. Azt a hőmérsékletet vettük denaturációs hőmérsékletnek, aminél a hirtelen abszorbancianövekedés beállt. Heparin távollétében ez a hőmérséklet körülbelül 10 °C-szal magasabb a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógnál mint a szarvasmarha [Alá⁴⁷] aFGF analógnál. 1,4-szeres vagy 8-szoros (térf/térf) fölöslegben hozzáadott heparin mindkét formánál 14-20 °C-szal fokozta a denaturációs hőmérsékletet, az alkalmazott hőmérsékletnövekedéstől függően. A két forma denaturációs hőmérséklete közötti különbség körülbelül 10 °C maradt. Nem volt megfigyelhető hatása a heparin 1,4-szeres vagy 8-szoros (térf/térf) fölöslegének egyik fehérje DC spektrumára sem a 240-340 nm-es tartományban, bár a 8-szoros fölöslegű heparin esetében az aFGF • «·· spektrumát a 240-260 nm-es régióban elfedte a heparin abszorbciója.

Fourier-transzformációs infravörös (FTIR) spektroszkópia

Meghatároztuk a Fourier-transzformációs infravörös (FTIR) spektrumokat, hogy tovább vizsgáljuk a két aFGF konformációjának különbségét. Az FTIR spektroszkópiához a fehérjéket alaposan dializáljuk vízzel szemben. Mindegyik fehérjéből 2%-os oldatot készítünk D₂O-ban készített 20 mmol/1 koncentrációjú imidazol pufferrel (Sigma Chemical Company Co., 99,9%-os tisztaság). Az oldatokat IR cellákba tesszük, CaF₂ablakokkal és 100 pm-es távtartókkal. Mindegyik spektrumhoz

1500 interferogrammot gyűjtünk és egy Nicolet 800 FTIR rendszeren kódoljuk, ami egy germániummal borított KBr sugárszétválasztóval és egy DTGS detektorral van ellátva. Az optikai padot folyamatosan öblítjük száraz nitrogéngázzal. Kiszámítjuk a második derivált spektrumokat [ Susi és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 115, 391-397 (1988)] . Kilencpontos simító funkciót alkalmazunk a vízgőzből kivont spektrumokra.

Az 5. ábrán láthatjuk az [Alá⁴⁷] és az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] szarvasmarha aFGF analógok második derivált spektrumait az amid 1' (C=O kötés a deuterált fehérjékben) régióban. A polipeptidek és fehérjék esetében ebben a régióban a komponens csíkok gyakorisága a szekunder struktúra tartalomhoz kapcsolódik [ Surewicz és mtsai: Biochimica et Biophysica Acta 952, 115-130 (1988)] . A spektrumok erős sávokat mutatnak 1630 és 1685 cm¹··· ·« ·· ·· • · · 4 ** ·· • . » · « nél, ami azt jelzi, hogy jelentős mennyiségű β-struktúra van jelen a két fehérjében. 1647 cm^_1-hez közel egy erős csík azt mutatja, hogy szabálytalan, rendezetlen struktúrák vannak jelen. Az 1666 és 1673 cm ¹-nél levő gyengébb csúcsok csavart struktúrákból származnak. Mindkét fehérje spektrumában egy kisebb csúcs van jelen 1651 cm¹-nél. Az ennek a frekvenciának a közelében levő amid 1' komponenseket általában a-hélixekhez rendelik. Azt azonban nemrég mutatták ki, hogy ez a csík hurokstruktúrákból származhat [ Wilder és mtsai: Abstracts of the Fourth Symposium of the Protein Society, San Diego (1990)] . Amint az az 5. ábrán látható, a nagyfelbontású FTIR spektrum, a CD-vel ellentétben világosan igazolja a β-struktúrák és csavarok jelenlétét, és a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analóg valamint a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg majdnem teljesen egyforma, egymásra illeszthetők, ami ismét azt sugallja, hogy ennek a két fehérjének hasonló a konformációja.

A második derivált spektrumok láthatólag nem mutattak különbséget a két aFGF analóg konformációjában. Az azonban nyilvánvaló volt, hogy a kicserélhető fehérjék deuterálása 47 gyorsabban játszódik le a szarvasmarha [ Alá ] aFGF analógnál mint a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analógnál a liofilezett fehérje D₂O oldattal való kiegyensúlyozása során. Mivel a két fehérjének hasonló a konformációja, ezért a H-D kicserélődési sebességben megfigyelt különbség nem magyarázható a kicserélhető protonjaik különböző kitettségével. Az valószínűbb, hogy az [ Alá⁴⁷] aFGF analógnak flexibilisebb a ·· struktúrája, ami az amid protonokat hozzáférhetőbbé teszi az oldószer számára.

5. Példa

Az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg heparin kromatográf iá j a

Heparin-Sepharose-t (Pharmacia) teszünk egy 1x8 cm-es oszlopba, majd 10 mmol/1 TRIS-HCl-lel hozzuk egyensúlyba (pH=7,2). Az oszlopra felvisszük az anyagot, mossuk 10 mmol/1 TRIS-HCl-lel (pH=7,2), majd ugyanebben a pufferben készített 0 —> 2,8 mol/1 lineáris nátrium-klorid gradienssel eluáljuk 0,5 ml/per áramlási sebességgel, Pharmacia FPLC rendszert alkalmazva .

A savas és bázikus FGF-et a heparinhoz és heparin-szerű molekulákhoz való erős kötődésük különbözteti meg. Mind a [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] mind a [Alá⁴⁷] szarvasmarha aFGF analógok egyetlen csúcsban jönnek le, 1,54 mol/1 nátrium-kloridnál eluálódva 10 mmol/1 TRIS-HCl-ben (pH=7,2).

···»· ·· ··

6. Példa

Az aFGF analógok biológiai aktivitása

In vitro biológiai vizsgálatok

Az előző példákban előállított aFGF analógok NIH 3T3 sejtekre gyakorolt mitogén hatását az alábbiakban ismertetett módon határozzuk meg. Emellett a humán [Ser , Ser ] bFGF analógot [ készítését lásd a No. 88/04189 számú publikált PCT szabadalmi bejelentésben] is megvizsgáltuk a bioaktivitási tesztekben, az aFGF analógokkal együtt.

Az NIH 3T3 sejteket az ATCC-től kaptuk. A sejteket 10% borjúmagzat szérummal, 10 egység/ml penicillinnel, 2 mmol/1 glutaminnal és 10 egység/ml sztreptomicinmel kiegészített DME közegben szaporítjuk. A sejteket hetente kétszer átoltjuk 1:40 arányban. A vizsgálat első napján az egybefolyó növekedést még éppen el nem érő tenyészeteket tripszinnel diszpergáltatjuk, majd 24-lukas lemezekre visszük ki 20000 sejt/ml koncentrációban, a fenti közegből lukanként 1 ml-t alkalmazva. Az 5. napon a közeget 1 ml/luk DMEM-mel helyettesítjük, ami nem tartalmaz szérumot, de tartalmaz penicillint, sztreptomicint és glutamint, a fenti koncentrációkban. A 6. napon kísérleti mintákat adunk a közeghez, 100 μΐ-nél nem nagyobb térfogatban.

Tizennyolc órával később a sejtek 37 °C-on 1 óra hosszat triciált timidin impulzust kapnak, 1 ml fenti táptalajban 2-20 pCi triciált timidinnel. Az impulzus után a sejteket egyszer mossuk a közeggel, majd 250 mmol/1 szacharózt, 10 mmol/1 nátri30 umfoszfátot, 1 mmol/1 EDTA-t (pH=8) adunk hozzá, majd a lemezeket 10 percig 37 °C-on inkubáljuk, a sejtek felszabadításához. A sejteket Skatron berendezéssel gyűjtjük össze (Skatron, Inc., Sterling, Virginia). A szűrőlapokat megszárítjuk, szcintillációs folyadékba tesszük, majd Beckman szcintillációs számlálóban megmérjük (Beckman Instruments,

Inc., Fullerton, Kalifornia).

A szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] és [Alá⁴⁷] aFGF analógok NIH 3T3 sejtekre gyakorolt mitogén hatásáta 6. ábrán bemutatott módon vizsgáljuk. Heparin távollétében az [Alá⁴⁷] aFGF analóg a ³H-timidin felvétel dózisfüggő serkentését okozza, az 1 - 100 ng/ml tartományban, a maximális serkentés felét 25 ng/ml-nél érve el. Ugyanilyen körülmények között az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg ugyanezt a mitogén hatást sokkal alacsonyabb fehérjekoncentráció mellett érte el, a maximális serkentés felének eléréséhez szükség dózis körülbelül 1 ng/ml. A rekombináns bFGF körülbelül 4-5-ször hatékonyabb mint az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF, a maximális serkentés felének eléréséhez szükséges dózis körülbelül 220 pg/ml. Ha 4,5 pg/ml heparint adunk mindegyik analóghoz, akkor az in vitro aktivitásuk megnőtt, és az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg maradt hatékonyabb. 45 pg/ml heparin jelenlétében az aktivitások fokozódtak, úgy, hogy a három molekulának a dózis-válasza közel azonos volt, és a maximális serkentés eléréséhez szükséges dózis 90 pg/ml volt.

Az aFGF analógok stabilitását, amit a megfelelő mitogén aktivitásuk retenciója alapján lehet meghatározni, úgy vizs31 gáljuk, hogy az egyes FGF analógok 20 mmol/1 nátrium-citrátban (pH=7) készült 0,1 mg/ml koncentrációjú oldatával inkubáljuk 37 °C-on, heparin jelenlétében és hiányában. Heparin távollétében a szarvasmarha [ Alá⁴⁷] aFGF analóg gyorsan elveszti az aktivitását, felezési ideje körülbelül 13 óra, amint azt a 7. ábrán lathatjuk. Azonban heparin jelenleteben a szarvasmarha [Alá ] aFGF analóg nem veszített a biológiai aktivitásából, a kísérlet

250 órás időtartama alatt. Ezzel szemben sem a szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg, sem a humán [ Ser⁷⁰, Ser⁸⁸] bFGF analóg nem mutatott aktivitáscsökkenést 250 óra alatt, függetlenül attól, hogy a heparin jelen volt-e vagy sem.

7. Példa

Az [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg krisztallográf iáj a

A szarvasmarha [ Alá⁴⁷, Gly⁹³] aFGF analóg kristályait 0,2 mol/1 (NH₄)₂SO₄, 2 mol/1 nátrium-klorid, 0,099 mol/1 nátriumcitrát és 0,02 mol/1 nátriumfoszfát (pH=5,6) oldattal szemben végzett gőzdiffúzióval növesztjük. A fehérjecsepp azonos térfogatú rezervoár oldatot és 10 mg/ml fehérjeoldatot tartalmaz. A kristályok trigonálisak (tércsoport P3_X21, a=7,8 Á, c=115,9 Á), majd 2,5 Á feloldással diffraktáljuk. Az intenzitás-adatokat egy Siemens (Madison, Wisconsin) többvezetékes területdetektorral· gyűjtjük össze, amit egy 18 kW-os forgó anódgenerátorra szereltünk. A Siemens féle processzáló programokat használjuk a feldolgozáshoz. A többszörös izomorf • · • · ··· · · · · * · · ·· · · · ···· · · · · * · · helyettesítés (mir) fázisokat 3 Á felbontásig számítottuk két származékból, 0,68-as jósági értékig. Az oldószer eltüntetése után az aszimmetrikus egységben levő két független aFGF molekuláknak megfelelő régiókat azonosítottuk. Az ezek között a molekulák között levő általános nem-krisztallográfiás szimmetria kapcsolatokat a rotációs funkcióból, reáltéri transzlációs funkcióból és sűrűség-korrelációs vizsgálatokból határoztuk meg. Egy molekuláris burkot határoztunk meg egy átlagolt aFGF molekula körül, egy módosított B.C. Wang algoritmussal. A fázisokat iteratíven finomítottuk molekuláris átlagolással és oldószer megvonással.

Az első ábrázolások megmutattak kiterjedt β-struktúra régiókat, amelyek a hurkoknál csonkolódtak, a kis molekuláris burok miatt, amint az a 8. ábráról látható. A modellépítésnek egy végső ábrázolását mir fázisokkal számítottuk (nehéz-atom paraméterekből, átlagolt fázisokkal szemben) [Rould és mtsai: Science 246, 1135-1142 (1989)], majd iteratíven átlagoltuk egy molekuláris burokkal, amit úgy állítottunk elő, hogy 6 Á-ös gömböket helyeztünk az induló modellben levő atom-pozíciók köré. A 3 Á-ös felbontásnál átlagolva egy 17,8%-os végső R-faktor felé konvergáltak a megfigyelt struktúra-faktorok és az átlagolt valamint oldószer-megvont ábrázolásokból számított struktúra-faktorok. C. Cambillau által egy Silicon Graphics 4D80-ra implementált TOM/FRODO nevő grafikus programot használtuk arra, hogy az aFGF szekvencia 10-136-os csoportjaiból egy átlagolt elektronsűrűségi térképet építsünk.

• · • · · · • · • ··· ·· · · • · · · · · ·· ·· · ··

A krisztallográfiás eredmények alátámasztották azt a feltételezést, hogy a 90-97-es régió szerepet játszik a hurokstruktúrában. Ha ez a régió valóban szerepet játszik a receptor-kötésben [ Baird és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 2324-2328 (1988)] , bármely olyan aminosav helyettesítés, amely stabilizálja a hurkot, stabilizálhatja és/vagy fokozhatja a molekula biológiai aktivitását. Valószínűleg ez a mechanizmusa az [ Ala⁴⁷,Gly⁹³] aFGF-nél megfigyelt aktivitás-fokozódásnak.

8. ábra

A [ Gly¹¹⁶] KGF analóg előállítása

Szintézis

A [ Gly¹¹⁶] KGF analóg előállításához először egy természetes KGF-et kódoló szekvenciát állítunk elő, majd megváltoztatjuk a 116-os aminosavat kódoló kodont, hogy megkapjuk az analógot kódoló szekvenciát.

A természetes KGF-et kódoló szekvenciát humán fibroblaszt sejtekből (AG1523 sejtvonal), mint kiindulási anyagból izolált RNS-ből kapjuk, amely RNS-ből azután KGF cDNS-t készítünk a szakterületen jártas szakember számára ismert módszert alkalmazva. A KGF cDNS-t azután templátként használjuk polimeráz láncreakciókban (PCR), a KGF gén amplifikálására. A KGF génben levő belső Ndel hasítási hely miatt a PCR DNS-t két fragmens formájában állítjuk elő, amiket azután az egyedi BsmI hasítási helynél kapcsolunk össze. A 238-21 és 238-24 oligonukleotidokat (lásd alább) használjuk egy olyan DNS termék előállítására, amit azután BsmI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk, majd izoláljuk, így kapjuk a KGF-nek egy 188 bázispáros fragmensét. A 238-22 és 238-24 oligonukleotidokat használjuk egy olyan DNS termék előállítására, amit azután Ndel és BsmI restrikciós endonukleázokkal emésztünk, így kapjuk a KGFnek egy 311 bázispár méretű fragmensét. A két DNS fragmenst összeligálva kapjuk a természetes KGF-et kódoló szekvenciát, amit a 9. ábrán mutatunk be.

Ahhoz hogy a kívánt [Gly¹¹⁶] KGF analóg szekvenciáját megkapjuk, ahhoz arra van szükség, hogy a KGF génben a His¹¹⁶-os kodont gilcin kodonnal helyettesítsük. Ezt úgy érjük el, hogy PCR átfedő oligonukleotid mutagenezist alkalmazunk a 315-17 és 315-18 oligonukleotidokkal, amelyek a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg kódolásához megfelelő bázispár változásokkal rendelkeznek a His¹¹⁶ régióban. A PCR-ben használt KGF DNS templát ugyanaz, mint amit a 9. ábrán mutatunk be, azzal az eltéréssel, hogy a Kpnl és EcoRI hasítási helyek közötti DNS szekvenciát kémiailag szintetizált DNS-sel helyettesítjük, amint az a 10. ábrán látható. Bármelyik alkalmas oligonukleotid, amely megfelel a helyspecifikus mutagén változásnak a KGF 5' - és 3' -DNS régióiban, azaz például a 238-22 és a 238-24 használható külső primerként az átfedő mutagenezis PCR-ben. A [Gly¹¹⁶] KGF analógot kódoló szekvenciát tartalmazó EcoRI - BamHI fragmenst azután a korábban ismertetett pCFM1156 plazmidba ligáljuk, ami már tartalmazza a KGF gént, így helyettesítjük a KGF gén megfelelő régióját az azokat a szükséges változásokat tartalmazó

116 kódoló szekvenciával, amik ahhoz kellenek, hogy a [ Gly ] KGF ···· analógot kódolják (10. ábra). A ligáló DNS-t azután egy FM5 (ATCC 53911) gazdaszervezetbe transzformáljuk, majd telepeket izolálunk, amelyek tartalmazzák a pCFM1156 [ Gly¹¹⁶] KGF analóg plazmidot. Az FM5/pCFM1156 KGF [Gly¹¹⁶] KGF analóg törzset azután fermentáljuk és a sejttömeget szokványos fermentációs technikákkal kinyerjük.

oligo	238-21	5'
oligo	238-22	5'
oligo	238-24	5'
oligo	315-17	5'
oligo	315-18	5'

-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'

-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

-GGAAAACGGTTACAACACATATGCA-3'

-GTGTTGTAACCGTTTTCCAGAATTAG-3'

A [ Gly¹¹⁶] KGF analóg tisztítása

A [ Gly¹¹⁶] KGF analógot tartalmazó sejteket az előzőkben ismertetett fermentálás után először feltárjuk, 665 g Escherichia coli sejtmasszát körülbelül 4 liter 20 mmol/1 nátriumfoszfát pH=6,8, 0,2 mol/1 nátrium-klorid összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót háromszor átbocsátjuk egy Gaulin Homogenizer-en, 62 MPa nyomással. A szuszpenziót azután Beckman JA-10 rotorban centrifugáljuk (Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornia), 10000/perc fordulatszámmal, 30 percig, 4 °C-on.

Az ioncserélő kromatográfiát úgy hajtjuk végre, hogy a centrifugált szuszpenzió felülúszóját 25 ml/perc áramlási sebességgel egy S-Sepharose Fást Flow (Pharmacia, Uppsala, Svédország) oszlopra visszük, (5 x 23 cm, 450 ml össztérfogat), 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,5), amit 0,4 mol/1 nátrium• · · · * · · · · · · ···· ·· ·· · ·· klorid összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot azután 2 liter 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,5), 0,4 mol/1 nátrium-klorid összetételű oldattal mossuk, és a [ Gly¹¹⁶] KGF analógot 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=7,5) oldatban készített 0,4 mol/1 - 0,6 mol/1 nátrium-klorid lineáris gradienssel eluáljuk. A gradiens össztérfogata 7 liter (az oszloptérfogat körülbelül tizenhatszorosa). A KGF-et tartalmazó frakciókat körülbelül 22-szeresre töményítjük egy YM-10 membránon (Amicon), egy 400 ml-es kevertetett cellában.

Méretkizárásos kromatográfiát (SEC) végzünk, oly módon, hogy az ioncserélő kromatográfiával kapott, töményített KGF térfogatának felét (össztérfogat 80 ml) 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8), 0,5 mol/1 nátrium-klorid összetételű oldattal egyensúlyba hozott Sephadex G-75 (Pharmacia) oszlopra visszük (4,4 x 85 cm, össztérfogat 1300 ml), majd az oszlopot ezzel a pufferrel fejlesztjük ki. Az eljárást a tömény!tett.KGF készítmény második felével is elvégezzük.

Ezután egy második ioncserélő kromatográfiát végzünk, oly módon, hogy először egyesítjük a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg monomer formájának megfelelő SEC frakciókat, majd az egyesített frakciókat öt térfogat 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8), 0,2 mol/1 nátrium-klorid oldattal hígítjuk, és a hígított frakciókat egy S-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra visszük (5 x 23 cm, 450 ml össztérfogat) , amit előzőleg 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8), 0,4 mol/1 nátrium-klorid összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot azután 1,5 liter 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8), 0,4 mol/1 nátrium• · · · ···· ·· «· ·· • · · · · · • ··· ·· ·· • · · · · · • · · · · · · klorid összetételű oldattal mossuk. A tisztított [Gly¹¹⁶] KGF analógot azután 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8) összetételű oldatban készített lineáris 0,4 - 0,6 mol/1 nátrium-klorid gradienssel eluáljuk. A gradiens össztérfogata 10 liter (az oszloptérfogatnak körülbelül 22-szerese). Az SDS-PAGE alapján [ Gly ] KGF analógot tartalmazó mintákat egyesítjük, majd a KGF-tartalmat UV-elnyelés alapján határozzuk meg.

9. Példa

A KGF analóg spektroszkópiája

Fourier-transzformációs infravörös (FTIR) spektroszkópia

A mintákat úgy készítjük elő az infravörös spektroszkópiához, hogy a 20 mmol/1 nátriumfoszfát, 0,5 mol/1 nátrium-klorid (pH=6,8) összetételű oldatban levő fehérjeoldatokat diaszűrjük 20 mmol/1 nátriumfoszfát, 0,15 mol/1 nátrium-klorid pD=6,8 pufferbe, amit D₂O-ban készítettünk (Sigma, 99,9% izotópos tisztaság). A pD értékeket úgy határozzuk meg, hogy az üvegelektródos pH-mérővel meghatározott pHértékhez 0,45-öt adunk hozzá [ Covington és mtsai: Anal. Chem. 40, 700-706 (1968)] . A végső fehérjekoncentráció 30 mg/ml volt.

A fehérje-oldatokat CaF₂ ablakos IR cellákba tesszük, amik 100 pm Teflon távtartókat tartalmaznak.

A szerkezeti jellemzésekhez 256 kétoldalas interferogrammot adunk össze, majd Fourier-transzforrnáljuk egy Happgenzel apodizációs funkció alkalmazása után, egy Nicolet 800 FTIR rendszerben. A felbontást 2 cm ¹-re állítjuk. Származékspektrumokat és Fourier-dekonvolúciókat hajtunk végre, Susi és • ·· ·

Byler eljárása szerint [Susi és Byler: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 115, 391-397 (1983)] , a Nicolet szoftver alkalmazásával. A görbeillesztést a Peakfit™ programmal végezzük (Jandel Scientific Co.). A KGF infravörös spektruma erős hasonlóságot mutatott a bFGF-éhez és az aFGF-éhez, jelezve, hogy ennek a három fehérjének hasonló a szerkezete.

A természetes KGF és a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg hőstabilitási vizsgálatát úgy végezzük, hogy az IR cellákat egy elektromos fűtésű burkolatba tesszük, amit egy automatikus hőmérsékletszabályozó vezérel (Specac Inc., Fairfield, Connecticut). A hőmérsékletet 0,5 °C/perc sebességgel növeljük. Az IRspektrumokat 8 cm’¹ felbontással gyűjtjük.

Az 50 °C alatti hőmérsékleteken a spektrumok láthatóan kevésbé térnek el a szobahőmérsékleten kapott spektrumoktól. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten a spektrumok azt mutatják, hogy a természetes KGF termotróp átmeneten megy át ezen a hőmérsékleten. Az 1616 és 1658 cm’¹-hez közeli csúcsok nyilvánvalóak a spektrumokban, és 65 °C-nál ezek a csúcsok dominálnak a spektrumban, és ezzel egyidőben az 1643 cm ¹-nél levő csúcs intenzitása lecsökken. Ez a spektrális átmenet a természetes KGF háromdimenziós szerkezetének kooperatív elvesztését képviseli. A megfigyelt termális átmenet nem reverzibilis, ennek a legvalószínűbb oka az, hogy a háromdimenziós szerkezetüket elvesztő fehérjék aggregálódnak. A természetes KGF olvadási hőmérsékletét, a Tm-et 60 °C-ra becsülik, míg a [ Gly¹¹⁶] KGF analógnak a Tm értékét 65 °C-ra, azaz 5 °C-szal • · · magasabbra becsülik, mint a a természetes KGF-ét, jelezve ezzel, hogy a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg magasabb relatív stabilitással rendelkezik mint a természetes KGF.

Ultraibolya spektroszkópia

Mind a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg, mind a természetes KGF hődenaturálódását egy Response II UV-spektrofotométerrel tanulmányoztuk (Gilford, Medfield, Massachusetts) egy Peltier hőmérséklet-szabályozóval és hőmérséklet-programozóval. A 20 mmol/1 nátriumfoszfát (pH=6,8) oldatban levő KGF oldatokat azután 8 mol/1 guanidin-HCl-lel vagy 20 mmol/1 nátriumfoszfáttal keverjük össze úgy, hogy a végső fehérje-koncentráció körülbelül 0,5 mg/ml legyen, a végső guanidin-HCl koncentráció pedig 0-2 mol/1 legyen. A termális letapogatás sebességét 0,5 °C/perc-re állítjuk, és a követett hullámhossz 286 nm. Kismennyiségű guanidin-HCl hozzáadása eliminálja a fehérjék kicsapódását a hő-denaturáció során, de nem teszi reverzibilissé a denaturálódást. Ennek következtében az összehasonlítandó mintákat szimultán futtatjuk.

Az UV spektroszkópiával végzett hő-denaturációs kísérletek sikertelenek voltak 0 és 1 mol/1 guanidin-HCl jelenlétében, mivel turbiditás fejlődik ki a melegítés során. Mindazonáltal a turbiditás alacsonyabb hőmérsékleten fejlődik ki a természetes KGF-nél mint a [ Gly¹¹⁶] KGF analógnál, jelezve, hogy az előbbi fehérje alacsonyabb hőmérsékleten denaturálódik, és ennek következtében alacsonyabb hőmérsékleten aggregálódik. 1,5 mol/1 guanidin-HCl-ben a 287 nm-en mért abszorbancia csökkent, ahogy • · · · ·· ·· · • · ··« · · ·· »··· *« ·· · ·» a fehérje denaturálódott, majd nőtt, az aggregáció következtében. A hőmérséklet, amelynél az abszorbancia csökken illetve növekszik 25 illetve 44 °C a [ Gly^{* 116}] KGF analóg esetében. 2 mol/1 guanidin-HCl hozzáadása mind a természetes KGF mind a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg részleges denaturálódását eredményezi 25 °C-on. A hőmérséklet növelése a fehérjék teljes denaturálódását eredményezi, a denaturálódás körülbelül 37 °C-on áll le a természetes KGF és 46 °C-on áll le a [ Gly¹¹⁶] KGF analóg esetében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a [Gly¹¹⁶]

KGF analóg termálisan stabilabb néhány olvadáspont fokkal mérve, és az infravörös elemzéssel megegyezően a természetes KGF-hez viszonyítva körülbelül 5 °C-os növekedést jelez a [ Gly¹¹⁶] T_m értékében.

10. Példa

A [ Gly ] KGF analóg mitogén aktivitása

A [ Gly¹¹⁶] KGF analóg mitogén aktivitását Rubin és munkatársai mitogenezis esszéjével elemezzük [Rubin és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 802806 (1989)] . A [Gly¹¹⁶] KGF analóg kisebb mértékű ³H-timidin beépülést mutat mint a természetes KGF, jelezve ezzel, hogy a

116 [ Gly ] KGF analógnak kisebb a specifikus aktivitása.

• ··· ··

A SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BENYÚJTÓ: Amgen Inc.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Fokozott stabilitással és biológiai aktivitással rendelkező savas fibroblaszt növekedési faktor analógok (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 17 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Amgen Inc.

(B) UTCA: 1840 DeHavilland Drive (C) VÁROS: Thousand Oaks (D) ÁLLAM: Kalifornia (E) ORSZÁG: USA (F) POSTAI IRÁNYÍTÓSZÁM: 91320-1789 (v) SZÁMÍTÓGÉPES FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC KOMPATIBILIS (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: PATENTIN RELEASE #1.0, VERSION #1.25 (vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA:

(B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA:

(C) OSZTÁLYOZÁS:

• β « ·

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 463 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

TCTAGAAAAA	ACCAAGGAGG	TAATAAATAA	TGTTCAACCT	GCCGCTGGGT	AACTACAAAA	60
AACCTAAGCT	TCTGTACTGC	TCTAACGGCG	GTTACTTCCT	GCGCATTCTC	CCGGATGGCA	120
CTGTAGACGG	TACCAAAGAT	CGTTCCGACC	AGCACATTCA	GCTCCAGCTC	GCTGCAGAAT	180
CTATCGGTGA	AGTTTACATC	AAATCCACCG	AAACTGGTCA	GTTCCTGGCT	ATGGATACTG	240
ATGGTCTCCT	CTACGGTTCT	CAGACTCCGA	ACGAAGAGTG	CCTGTTCCTC	GAGCGTCTGG	300
AAGAAAACGG	TTACAACACC	TACATCTCCA	AAAAACACGC	TGAAAAACAC	TGGTTCGTTG	360
GTCTGAAAAA	AAACGGTCGT	TCTAAACTGG	GTCCGCGCAC	TCACTTCGGT	CAGAAAGCTA	420
TCCTGTTCCT	CCCTCTGCCG	GTTTCTTCCG	ATTAATAGGA	TCC		463

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 141 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

Met Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

10 15

Cys Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val • * • · · ·

Asp Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Alá

40 45

Alá Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin

55 60

Phe Leu Alá Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

70 75 80

Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn

90 95

Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Alá Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu

100 105 110

Lys Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly Pro Arg Thr His Phe Gly Gin

115 120 125

Lys Alá Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

130

135

140

3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 155 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia • ·

Met Alá Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Alá Leu Thr Glu Lys Phe

10 15

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Alá Ser

25 30

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

40 45

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Ser Alá Glu

55 60

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

70 75 80

Alá Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

90 95

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr

100 105 110

Ile Ser Lys Lys His Alá Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

115 120 125

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Alá

130 135 140

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

145

150

155 » ·

4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 502 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

TATGTGCAAT	GACATGACTC	CAGAGCAAAT	GGCTACAAAT	GTGAACTGTT	CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA	AGAAGTTATG	ATTACATGGA	AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA	GAAGACTCTC	120
TGTCGAACAC	AGTGGTACCT	GAGGATCGAT	AAAAGAGGCA	AAGTAAAAGG	GACCCAAGAG	180
ATGAAGAATA	ATTACAATAT	CATGGAAATC	AGGACAGTGG	CAGTTGGAAT	TGTGGCAATC	240
AAAGGGGTGG	AAAGTGAATT	CTATCTTGCA	ATGAACAAGG	AAGGAAAACT	CTATGCAAAG	300
AAAGAATGCA	ATGAAGATTG	TAACTTCAAA	GAACTAATTC	TGGAAAACCA	TTACAACACA	360
TATGCATCAG	CTAAATGGAC	ACACAACGGA	GGGGAAATGT	TTGTTGCCTT	AAATCAAAAG	420
GGGATTCCTG	TAAGAGGAAA	AAAAACGAAG	AAAGAACAAA	AAACAGCCCA	CTTTCTTCCT	480
ATGGCAATAA	CTTAATAGGA	TC				502

5. számú, szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 497 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (ix) Tulajdonság:

(A) Név/tulajdonság: (B) Lokalizáció: komplement (1..497) ·· »·♦« «· • · • · ·· · ·· · · • · · · · « · ·»·«>*· ·· * ·

(xi)	A szekvencia leírása	: 5. számú	szekvencia
CTATTAAGTT	ATTGCCATAG	GAAGAAAGTG	GGCTGTTTTT	TGTTCTTTCT	TCGTTTTTTT	60
TCCTCTTACA	GGAATCCCCT	TTTGATTTAA	GGCAACAAAC	ATTTCCCCTC	CGTTGTGTGT	120
CCATTTAGCT	GATGCATATG	TGTTGTAATG	GTTTTCCAGA	ATTAGTTCTT	TGAAGTTACA	180
ATCTTCATTG	CATTCTTTCT	TTGCATAGAG	TTTTCCTTCC	TTGTTCATTG	CAAGATAGAA	240
TTCACTTTCC	ACCCCTTTGA	TTGCCACAAT	TCCAACTGCC	ACTGTCCTGA	TTTCCATGAT	300
ATTGTAATTA	TTCTTCATCT	CTTGGGTCCC	TTTTACTTTG	CCTCTTTTAT	CGATCCTCAG	360
GTACCACTGT	GTTCGACAGA	AGAGTCTTCT	CACTCTTATA	TCCCCTCCTT	CCATGTAATC	420
ATAACTTCTT	GTGTGTCGCT	CAGGGCTGGA	ACAGTTCACA	TTTGTAGCCA	TTTGCTCTGG	480
AGTCATGTCA	TTGCACA					497

6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A)	Hossz: 164	aminosav
(B)	Típus: aminosav
(C)	Száltípus:	ismeretlen
(D)	Topológia:	ismeretlen

(ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Cys

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

25 30

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

40 45

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn ·♦·· ·· * 47

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile

70 75 80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys

90 95

Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

100 · 105 110

Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His

115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val

130 135 140

Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Ala Ile Thr

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 503 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia • · »»· ·* «· • · * «·«·· «·· · ·· tt ♦ ··

TATGTGCAAT	GACATGACTC	CAGAGCAAAT	GGCTACAAAT	GTGAACTGTT	CCAGCCCTGA	60
GCGACACACA	AGAAGTTATG	ATTACATGGA	AGGAGGGGAT	ATAAGAGTGA	GAAGACTCTT	120
CTGTCGAACA	CAGTGGTACC	TGCGTATCGA	CAAACGCGGC	AAAGTCAAGG	GCACCCAAGA	180
GATGAAAAAC	AACTACAATA	TTATGGAAAT	CCGTACTGTT	GCTGTTGGTA	TCGTTGCAAT	240
CAAAGGTGTT	GAATCTGAAT	TCTATCTTGC	AATGAACAAG	GAAGGAAAAC	TCTATGCAAA	300
GAAAGAATGC	AATGAAGATT	GTAACTTCAA	AGAACTAATT	CTGGAAAACG	GTTACAACAC	360
ATATGCATCA	GCTAAATGGA	CACACAACGG	AGGGGAAATG	TTTGTTGCCT	TAAATCAAAA	420
GGGGATTCCT	GTAAGAGGAA	AAAAAACGAA	GAAAGAACAA	AAAACAGCCC	ACTTTCTTCC	480
TATGGCAATA	ACTTAATAGG	ATC				503

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Név/kulcs: (B) Lokalizáció: komplement (1..497) ·« ·* (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia • · * · · 9 • · ··· ·» « · · » · •··· «« »* *

CTATTAAGTT	ATTGCCATAG	GAAGAAAGTG	GGCTGTTTTT	TGTTCTTTCT	TCGTTTTTTT	60
TCCTCTTACA	GGAATCCCCT	TTTGATTTAA	GGCAACAAAC	ATTTCCCCTC	CGTTGTGTGT	120
CCATTTAGCT	GATGCATATG	TGTTGTAACC	GTTTTCCAGA	ATTAGTTCTT	TGAAGTTACA	180
ATCTTCATTG	CATTCTTTCT	TTGCATAGAG	TTTTCCTTCC	TTGTTCATTG	CAAGATAGAA	240
TTCAGATTCA	ACACCTTTGA	TTGCAACGAT	ACCAACAGCA	ACAGTACGGA	TTTCCATAAT	300
ATTGTAGTTG	TTTTTCATCT	CTTGGGTGCC	CTTGACTTTG	CCGCGTTTGT	CGATACGCAG	360
GTACCACTGT	GTTCGACAGA	AGAGTCTTCT	CACTCTTATA	TCCCCTCCTT	CCATGTAATC	420
ATAACTTCTT	GTGTGTCGCT	CAGGGCTGGA	ACAGTTCACA	TTTGTAGCCA	TTTGCTCTGG	480
AGTCATGTCA	TTGCACA					497

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 164 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia

Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Alá Thr Asn Val Asn Cys

10 15

Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly

Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg

Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn «» ·»·· »· ** ·* • · · · · · · · <

♦ · «·· ·· ·« • · · »···<

• «•4 «· ·· · ··

Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Alá Val Gly Ile Val Alá Ile

70 75 80

Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Alá Met Asn Lys Glu Gly Lys

90 95

Leu Tyr Alá Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu

100 105 110

Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Alá Ser Alá Lys Trp Thr His

115 120 125

Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Alá Leu Asn Gin Lys Gly Ile Pro Val

130 135 140

Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Alá His Phe Leu Pro

145 150 155 160

Met Alá Ile Thr

10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 55 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 ·►*· «V ·· « · • « ·»· · ·· ·· • t » · * «·· ·« *· • · · · « • a · ··

11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 49 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49

12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia

GAAGAAAACC ATTACAACAC 20

13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS • · *·· ·· • · · ·««·· ···· «· »« » ·· ‘ 52 (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia

ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26

14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 27 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia

ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27

15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 31 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia

ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A ·· ft* » · * · ··· ·· ·*·* *· ·»

I • ft

I • r

16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 25 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia

GGAAAACGGT TACAACACAT ATGCA 25

17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: ismeretlen (D) Topológia: ismeretlen (ii) A molekula típusa: cDNS (xi) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia

GTGTTGTAAC CGTTTTCCAG AATTAG ·· ••w· ·· «V frt • 0 ······« * _ « ··· ·· ·· • · * ··«·· ···· ·· ·· * ·»

Claims

1. Az FGF család egy természetes fehérjéjének analógja, amelyben az említett fehérje hurokképző -Asn-His-Tyr-Asn-Thrszekvenciájában legalább egy aminosavat egy másik, erősebb hurokképző tula jdonsá'ggal rendelkező aminosawal helyettesítünk.

2. Az 1. igénypont szerinti analóg, amelynél a természetes fehérje a KGF.

3. A 2. igénypont szerinti analóg, amelyben az említett helyettesítendő aminosav a 116-os aminosav.

4. A 3. igénypont szerinti analóg, amelyben az erősebb hurokképző tulajdonsággal rendelkező aminosavat a következő csoportból választjuk: glicin, prolin, tirozin, aszparaginsav, aszparagin, szerin, glutaminsav, treonin, lizin, glutamin, arginin, fenilalanin és triptofán.

5. A 4. igénypont szerinti analóg, amelyben az erősebb hurokképző tulajdonsággal rendelkező aminosav a glicin.

6. Az 5. igénypont szerinti analóg, amelynek az aminosav szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be.

7. A 6. igénypont szerinti analóg, amelyből legalább az egyik terminális aminosavat kivágjuk, miközben az említett analóg lényegében megtartja a fokozott biológiai aktivitását.

8. A 7. igénypont szerinti analóg, amelyben a természetes KGF-nek legalább az egyik cisztein-csoportját egy semleges aminosawal helyettesítjük.

9. DNS szekvencia, amely az 1. igénypont szerinti analóg prokarióta vagy eukarióta expresszálására alkalmas.

10. A 9. igénypont szerinti DNS szekvencia, amelyben az említett analóg a 6. igénypont szerinti analóg.

11. Gyógyászati készítmény, amely terápiásán hatékony mennyiséget tartalmaz az 1. igénypont szerinti analógból, valamint tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható adjuvánst.

12. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett analóg a 6. igénypont szerinti analóg.

13. Eljárás egy seb kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett sebet az 1. igénypont szerinti analóg terápiásán hatásos mennyiségével kezeljük.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett analóg a 6. igénypont szerinti analóg.

15. Az 5. igénypont szerinti analóg, amelynek aminosav szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be.

16. Az 5. igénypont szerinti analóg, amelynek aminosav szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be.

A meghatalmazott

-........··-’

1/14

ΙΑ. ábra

rtí 0) Eh 14 Eh 14 Eh a rt? >O 0X3 0 0 Φ o rf 0] o tt 4 rH rf Η m Eh W m 0 rf r- rtj CQ 0 >1 rf 3 Eh 14 iC >1 0 r-4 rf 1-t 0 X3 »4 0 0 0 0 rf Eh 0 M Eh a rf (0 Eh a rf >1 rf co 0 r—l rf w Eh Eh 0 rf 0 rf 0 rf 0 C 0 0 Eh <0 0 4-> co 0 14 0 H Eh Φ rf rf 0 Pm 0 rf rf 2 H í>1 O 0 □ Ο 0 3 o Eh 0 r-1 rH Eh φ r· Eh Φ co 0 r4 0 0 rH 0 4 rH 0 4 CM 0 rf 0 3 Eh φ 0 3 0 3 Eh a) Eh rH rf r—( Eh Φ 0 4 rf Μ 0 0 0 4 0 O 0 tn 0 3 0 Φ U H 0 Μ Eh Φ Eh Xi 0 CM 0 rf 0 4 Eh CM 0 □ 0 □ 0 3 0 3 H Φ Eh Φ rf rH rf *H 0 4 0 4 0 0 0 0 0 G 0 Φ Eh Φ Eh >« rf m Eh χ: Eh «—1 0 r-4 rf rf Eh Ρμ rf H 0 0 0 ω 0 μ 0 CQ Eh M Η X3 rf >1 rf •H 0 X! Eh Pm ή Eh Eh 0 33 rf E4 0 4-1 Eh >1 0 3 rf 3 H Φ 0 r4 Ο rf r-1 o r-4 O rf 2 r-1 o 0 0 CM Ο 0 0 o 0 0 U3 rf 1 cn 0 >1 LO 0 (X rH 0 14 E-i 0 rH rH rf (0 CM 0 xi 0 0 0 rf rf Eh «C 0 3 0 1m 0 14 4 03 0 Φ 0 Φ E-t rf rf Eh W Eh W 4 Eh Μ Eh 0» CQ rf 0 Φ 0 14 rf Eh Eh W 0 rf rf 4 0 0 m Eh CM 0 Φ 0 0 rf m Η r-4 rf EH 0 0 rf rf H 0 0 Μ rtj m 0 14 0 rf >, rf >1 rf >1 rf Eh Εη rf 4 EH EH rf 0 □ 0 14 H r4 0 Eh Φ 0 Λ Eh (0 0 0 4 rf Eh 0 > rf Eh 3 >1 rf 3 rf O Eh Φ Ο 0 r—1 O rf r4 rf r~ 0 4 ω 0 0 cn 0 0 rf 0 (0 rH 0 a rH Eh >, rf rf >1 rf CQ 0 ·—I rf rf 4 0 rf 0 0 0 Eh Ο rf r—1 0 Φ rf 0 Μ Eh to Eh r-4 Eh 0 ΡΜ 0 > rf 1-4 0 H

uj. azenipei ·η Aüam

Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-321

2/14

IB. ábra

250 270 290

GGTCTCCTCTACGGTTCTCAGACTCCGAACGAAGAGTGCCTGTTCCTCGAGCGTCTGGAA GlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsnGluGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGlu