CN1169158A - 具有增强稳定性和生物活性的酸性成纤维细胞增长因子类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了FGF家族的蛋白质类似物。这些类似物比相应的天然存在的蛋白质更加稳定。增强的稳定性是通过在蛋白质氨基酸序列的一个已鉴定为环形成区域，用至少一个具有较高环形成潜能的氨基酸替代一个具有较低环形成势能的氨基酸来获得的。本发明的类似物特别适用于治疗。

Description

具有增强稳定性和生物活性的酸 性成纤维细胞增长因子类似物
背景技术
有时被称为软组织生长因子的许多蛋白质因子可介导组织损伤如创伤或烧伤之后的复杂的愈合过程，新细胞生长和分化需要这些因子用于替代损伤的组织。这类软组织生长因子包括一个成纤维细胞生长因子(FGFs)的蛋白质家族。对于各种上皮、间质、神经起源的细胞FGFs是促有丝分裂和趋药性的。另外，FGFs是促血管形成的，即他们能刺激血管的形成。FGFs家族的成员包括酸性FGF，碱性FGF、KGF、Int-2、HST、FGF-S和FGF。
酸性FGF(aFGF)和碱性FGF(bFGF)被认为是FGF家族的两个“原始”成员。已经确定aFGF和bFGF起源于同一祖先基因，除具有相同的内含子/外显子结构外，两个分子具有大约55％的序列等同性。尽管不排除存在特殊的aFGF和bFGF受体，但是酸性FGF和bFGF结合于同样受体也是已知的。在不同组织中发现了几种分子量形式的aFGF和bFGF。然而，Southern印迹试验表明对于aFGF和bFGF各自只有一个基因，这些分子之间的差别可能是由于翻译后的加工造成的。在体外和体内，对于许多种类的中胚层和神经外胚层起源的细胞类型酸性和碱性FGF是分裂素，并能诱导血管形成(参见，例如Gospodarowicz等(1979))，Exp.Eye.Res，28：501-514。尽管在大多数生物测试系统中bFGF比aFGF大约有高出十倍的效力，这两类的生物学活性的范围接近相同。
对于多种细胞KGF显示了强有力的促有丝分裂活性并且它结合于aFGF和bFGF也可能结合的Balb/mk角蛋白细胞上的细胞表面受体(Bottaro et al(1990)，J.Biol.Chem.265：12767-12770)，但是，KGF与已知的FGFs(即aFGF和bFGF)的区别在于它对于成纤维细胞或内皮细胞不能促有丝分裂。Rubin et al.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：802-806。在NIH/3T3成纤维细胞上还有不同于aFGF和bFGF受体的KGF受体该受体不能与KGF相互作用。Bottaro et al.。
aFGF和bFGF的一个共同的明显的特性是这些因子与肝素紧密结合的趋势。aFGF具有一个阴离子等电点，它表现出来的与肝素的亲和力比bFGF弱(Thomas et al(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA82：6409-6413)。aFGF和bFGF的这一独特的肝素结合特性大大有利于这些因子的纯化。
FGFs对固定化的肝素具有强亲和力这一发现鼓舞了对FGFs体内生物学上类肝素分子的调节作用的研究。尽管肝素的整个功能范围还没有确定，肝素可以以几种方式调节FGF功能是已知的(Lobb(1988)，Eur.J.Chin Invest.，18：321-326)，例如，类肝素分子在FGF功能上能起一个直接作用，包括aFGFs的激活和增效作用(Uhllrich等(1986)，Biochem Biophys.Res.Comm.，137：1205-1213)。
但是，在FGF对固定化肝素的亲和性它被可溶性肝素增效的能力之间没有直接的相互作用。在这一点上，肝素的增效作用力似乎是有选择地针对aFGF的。例如Uhllrich et al(1986)，同上，发现纯aFGF的增效作用程度大约是纯bFGF的十倍，把aFGF的增效力提高到大约与bFGF同样的水平。但是在存在胎儿小牛血清时，发现肝素的增效作用效果明显下降(Uhllrich et al.，sbs(1986)，同上)。
据信利用FGF蛋白能有效促进属于外伤的组织的愈合。FGFs的独特的促血管形成特性使这些因子在深度创伤的治疗上特别有价值。bFGFs天然蛋白质曾经被断言对治疗心肌梗塞有用(美国专利号4,296,100和4,378,347)。另外，已经发现人bFGF能提高胎鼠海马神经元中的神经元存活力和轴突的伸展，这表明这些因子同时也可能对治疗衰退的神经紊乱，如Alzheimer’s疾病和Parkinson’s疾病有用(Wallicke etal，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3012-3016)。
在治疗应用上，aFGF的有效应用的一个主要障碍物似乎与它与bFGF相比明显低的生物学活性有关。虽然用肝素研究表明所观察到的aFGF和bFGF之间效力上的差异可以通过利用肝素提高aFGF的活性到一个可与bFGF相当的水平来消除。但是药学制备上肝素的利用并不总是令人满意的。在这点上，重要的是要注意肝素是一个异源结构的高度硫酸盐化的葡糖胺聚糖，是已知为通过加快抗凝血酶III失活内环境稳定的蛋白酶的速度而起作用的抗凝血剂(Jacques(1980)，Pharmacol Rev.31：99-166)。还不知道在治疗深度创伤的药物制备中利用肝素是否有害，其中某些程度的凝结可能是获得适当愈合所需要的。
另外，可以实际地考虑把肝素掺入治疗创伤的药物制剂中。药物释放事项包括控制进入病人机体的药物制剂的组成(含有aFGF和肝素的组合物)，此外，胎儿小牛血清在肝素对aFGF的增效作用的负影响(Uhllrich et al观察到)表明任何通过把肝素包括在药物制剂中作为aFGF的激活或增效因子获得的优点，一旦与病人自己的血清接触后可以完全无效或丧失。
本发明的一个目的是提供一种与天然存在的蛋白质形式相比具有增强的稳定性的来自FGF家族的蛋白质类似物。本发明的另一目的是在缺乏肝素时提供一个具有增强的稳定性和生物活性的aFGF的类似物。本发明的另一目的是提供用于治疗的aFGF类似物。
发明概述
本发明在FGF家族中提供新的蛋白质类似物。一种这样的类似物是一个在缺乏肝素时比天然存在的aFGF更加稳定并具有更高生物活性的aFGF类似物。另一种这样的类似物是与天然存在的KGF相比具有增强的热稳定性的KGF类似物。增强的稳定性是通过在天然存在的蛋白质的
环形成序列Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr中或其周围至少用一个较高环形成潜能的氨基酸替代一个较低环形成潜能的氨基酸残基来获得的。在aFGF情况下，这个环形成序列存在于大约氨基酸92到96的区域内。在KGF的情况下，这个环形成区存在于大约氨基酸115-119的区域内。本发明的一个优选类似物包括将一个具有高环形成潜能的氨基酸对环形成序列中组氨酸残基进行取代。
附图的简要说明
附图1显示重组牛〔Ala47，Gly93〕的aFGF的核酸和氨基酸序列。
附图2显示重组人〔Gly93〕的aFGF的氨基酸序列。
附图3显示利用疏水作用层析的牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的洗脱曲线。
附图4A和4B  显示了牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的圆二色性光谱。
附图5  显示了在酰胺I′(C＝O在次生蛋白质中伸展(strech)区中牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的第二衍生物FTIR光谱。
附图6显示牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物和人〔Ser70，Ser88〕bFGF浓度的对数值相对最大刺激百分数的曲线。
附图7图解显示与人〔Ser70，Ser88〕bFGF相比，在缺少肝素时牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物其活性随着时间而丧失的情况。
附图8显示了如X-射线晶体衍射法测定的，本发明的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的结构。
附图9显示天然存在的KGF的核酸和氨基酸序列。
附图10显示重组〔Gly116〕KGF的核酸和氨基酸序列。
本发明的详细说明
本发明提供了FGF家族的新的类似物。与相应的天然存在的蛋白质相比，这些类似物具有提高的稳定性。对于本发明的aFGF类似物，该类似物在缺少肝素时具有增强的稳定性和生物活性。对于本发明的KGF类似物，该类似物具有增强的热稳定性。本发明的类似物在天然存在形式中发现的环形成序列Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr中，或其周围至少有一个不同于相应的天然存在蛋白质的氨基酸。就aFGF而言，环形成序列存在于大约氨基酸残基92到96的区域(基于牛aFGF的已知氨基酸序列的编号，如图1所示)。就FGF而言，环形成序列存在于大约氨基酸残基的115-119的区域，如图9和10所示。为了使类似物的这个区域稳定，选择不同的氨基酸以得到的较高的环形成潜能。具有相对高的环形成潜能的氨基酸包括甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、和丝氨酸〔Leszcynski et al(1986)Science，234：849-855(1986))。(根据在天然存在分子的环结构中出现的频率分配环形成潜能的相对值)〕。优选地，一个具有较高环形成潜能的不同的氨基酸替代了环形成序列中的组氨酸残基。更优选地，用一个甘氨酸残基替代了环形成序列中的组氨酸。
对于本发明的类似物可以进行其它的加入，替代和/或缺失。例如，类似物也可以非强制性地包括一个对非保守半胱氨酸残基(如：牛aFGF分子的47位的半胱氨酸残基和人aFGF分子的16位的半胱氨酸残基)的氨基酸取代。另外，在E.coli寄主细胞中表达的本发明的类似物可以包括一个起始的甲硫氨酸氨基酸残基(即，在位-1，如图1所示)。另一种可选择的方法，正如本领域熟练技术人员所知，从DNA序列中可以缺失一个或多个末端氨基酸残基，但基本上保留了相应于天然存在的蛋白质的增强的生物学活性。
同时也提供了编码本发明的全部或部分类似物的DNA序列。这样的序列优选地可以包括掺入了被所选择的E.coli寄主菌株优选表达的密码子(“E.coli表达密码子”)，提供限制性内切酶切割位点，和/或提供了便于构建容易表达的载体的附加起始，末端或中间DNA序列。这些新的DNA序列包括用于保证在真核和原核寄主细胞如大肠杆菌中表达本发明类似物的序列。
更详细地说，本发明的DNA序列可以包括图1中阐明的DNA序列，其中至少一个编码在大约氨基酸92到96的区域的一个氨基酸残基的密码子被一个编码具有更高环形成潜能的不同氨基酸残基的密码子替代(在下文中称为“aFGF类似物序列”或“类似物序列”)，包括一个与一个类似物序列或其片段杂交的DNA序列，和一个如果不是遗传密码的简并性，将和一个类似物序列杂交的DNA序列。
相应地，本发明的DNA序列可以包括图10中列出的DNA序列，其中至少一个为位于大约氨基酸115到119区域的一个氨基酸残基编码的密码子被编码具有更高环形成潜能的不同的氨基酸残基的一个密码子所取代(在下文中称为“FGF类似物序列”或“类似物序列”)也包括一个与一个类似物序列或其片段杂交的DNA序列，和一个如果不是遗传密码的简并性，将和类似物序列之一杂交的，得到的DNA序列。
本发明的类似物可以通过本领域内技术熟练人员已知的许多重组技术方法中的任何一个来编码，表达和纯化。优选的生产方法将依赖于许多因素和考虑而变化，包括材料的费用和可获得性和其它经济考虑。通过最小实验本领域内技术熟练人员将明白对于一个给定条件的最适生产过程。利用大肠杆菌寄主细胞，本发明的类似物可以以特别高的水平表达。随后利用本领域已知技术以将所得到的表达产物纯化到接近同质。一个典型的纯化过程包括首先将含有类似物的包含体溶解，接着用离子交换层析方法，然后再折叠蛋白质，最后，进行疏水作用层析。
本发明的类似物具有一个惊人程度的增强的稳定性。与天然存在的aFGF不同，本发明的aFGF类似物在缺乏肝素时具有增强的稳定性和生物活性。已知可以通过在某些半胱氨酸残其位用丝氨酸或其它中性氨基酸进行替代来获得更稳定的bFGF类似物(例如，在公开的PCT专利申请No.88/04189中公开的)，而仅对天然存在的牛aFGF的47位的非保守半胱氨酸残基进行替代相信不会显著增强aFGF类似物生物活性和/或稳定性。通过将牛〔Ala47〕aFGF类似物(半胱氨酸被替代)显示的低活性及牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物(在aFGF分子的残基92到96区域有所期望的氨基酸替代)相比可证明了这一点，正如下面的实施例中所阐述的。具体地说，尽管与bFGF相比牛〔Ala47，Gly93〕类似物仍然效力较小，但已发现它大约比牛〔Ala47〕aFGF类似物效力高十倍。在加入45μg/ml的肝素之后，所有三种形式的FGF的生物活性都增强，牛〔Ala47，Gly93〕类似物，牛〔Ala47，Gly93〕类似物，和人〔Ser20，Ser88〕bFGF类似物具有基本上相同的效力。
在缺乏肝素时相对于牛〔Ala47〕aFGF而言牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的促有丝分裂活性和稳定性增强的原因至今不清楚。甘氨酸对93位的组氨酸残基的替代似乎使aFGF分子更加具疏水性，但它显然不激烈改变它的三级结构，如圆二色性和FTIR光谱所确定的。然而，牛〔Ala47〕aFGF类似物(只在47位有替代)和牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的体外生物测定中观察到的活性的相对差异表明牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的氨基酸93位的甘氨酸替代可能在或接近负责受体结合的区域。虽然aFGF中的受体结合区还没有确定，aFGF的93位是对应于据报道是在或接近受体结合区域的bFGF的一个区域，(Baird etal(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：2324-2328)。
另外，与牛〔Ala47〕类似物不同，在缺少肝素的250小时过程中，本发明的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物具有增强的稳定性，保持了它的初始的促有丝分裂活性，而牛〔Ala47〕类似物很快失去了活性。
将牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物结晶，得到结晶可以通过X-射线晶体衍射研究。对这些晶体研究获得的X-射线晶体学数据支持了来自疏水作用层析资料的假设即：残基93暴露于溶剂中，也即，93位的甘氨酸替代组氨酸后使分子降低亲水性。详细研究93残基附近的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物序列显示出从大约90位的谷氨酸残基到大约97位的酪氨酸残基区域的具有高环形成潜能的一个约8个氨基酸簇。氨基酸的相对环形成潜能已经被报道，甘氨酸被鉴别为在所有氨基酸中具有最高环形成潜能的氨基酸。(Leszcynski et al，同上)。所以，由于与组氨酸相比甘氨酸残基具有更高的环形成潜能，因而确信甘氨酸对组氨酸进行取代可稳定假定的环。
本发明的KGF类似物也证实了KGF中相应的区域是一个暴露于溶剂的环，这个环可能参与受体结合。更详细地说，已经发现本发明的〔Gly116〕KGF类似物与天然存在的KGF相比具有改变的下降的促有丝分裂活性，如下面的实施例中阐述的。同时还发现〔Gly116〕KGF类似物相对于天然存在的KGF具有5-7℃较高热稳定性。
除了本文详细阐述的优选的〔Gly93〕aFGF和〔Gly116〕KGF类似物之外，本发明的仔细考虑了其它类似物。这些其它类似物通过本文酸提供的下面的技术可以容易地由本领域技术熟练人员得到。例如，存在不少于15个据报道比组氨酸具有更高环形成潜能的氨基酸(Leszcynskiet al(1986)同上)。这些氨基酸是(以环形成潜能下降的顺序排列)甘氨酸、脯氨酸或酪氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。预期在天然存在蛋白质的环形成序列中任何这些残基对组氨酸残基的替代可以导致产生具有增强稳定性的本发明的一个类似物。当然，优选的是用具有最高可能的环形成潜能的氨基酸替代环形成序列的组氨酸残基，而不产生任何潜在的负效应，如通过插入另外的半胱氨酸或胱氨酸残基形成不需要的二硫健。所以，在环形成序列中替代组氨酸残基的其它优选的氨基酸(即：除了甘氨酸之外)可以包括脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺，丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
本发明也仔细考虑了用一个具有高环形成潜能的氨基酸替代天然存在的aFGF的氨基酸92到96区(即，氨基酸92和94-96)和天然存在的aFGF的氨基酸115到119区(即，氨基酸92和115-117-119)之间的其它氨基酸残基。本发明的aFGF类似物包括，例如，按优先顺序用甘氨酸、脯氨酸或酪氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺、丝氨酸或谷氨酸替代在天然存在aFGF的96位的苏氨酸残基得到的aFGF类似物，尽管由于两种氨基酸相似的环形成潜能，预期谷氨酸对苏氨酸的替代有最小的稳定性和/或生物活性的增强。
天然存在的aFGF中的位92、94、95和97的氨基酸残基(分别为天冬酰胺、酪氨酸、天冬酰胺和酪氨酸)具有足够高的环形成潜能以致对这些特殊残基进行替代仅得到最小利益是可想象得到的。
本发明的类似物包括人和动物(即：牛)起源的类似物，以及具有下面环形成氨基酸序列的所有形式蛋白质：
92   93  94  95  96    (aFGF)
-Asn-His-Tyr-Asn-Thr-
115  116 117 118 119   (KGF)
例如，人和牛的aFGF形式是已知的，并已经被鉴定为在92到96位具有相同的氨基酸顺序(上面所示)。此外，在人和牛aFGF之间大约有92％的序列等同性和97％的“相似性”(即在两个aFGF类型之间的总的8％的变化中5％是“保守的”)。天然存在的人和牛aFGF类型基本上具有相同的体外促有丝分裂活性。
由于它们在缺乏肝素时具有增强的稳定性和生物活性，本发明的新的生物活性aFGF类似物特别适用于医生和/或兽医对哺乳种类的许多类型的创伤的进行治疗的药物制剂。由于它们增强的热稳定性，本发明的KGF类似物可能也特别适用于药物制剂。当然，用于这样的治疗的生物活性类似物的量依赖于所治疗的创伤的严重性，所选择的给药途径，类似物的比活或纯度而定，并由参加的医生或兽医决定。术语“类似物治疗有效”的量指在一个哺乳动物中确定产生治疗效果的类似物的量。这样的治疗有效量是很容易由本领域任一技术人员确定的。
本发明的类似物可以通过适于待治疗创伤或治疗条件的任何途径给药。用本发明的类似物的医疗应用能有益治疗的条件包括但不限于，表面创伤的愈合，骨愈合，血管形成，神经再生，器官形成和/或再生。
对于兽用和人用，本发明的药剂制剂包括治疗有效量类似物和其一种或多种的药学可接受载体，并且可选择地含有其它治疗成分。载体必须是与其它配方成分的相容性意义上“可接受”的并对其接受者不是有害的。该药剂可以方便地以单位剂量形式存在并可以任何本领域技术人员已知的方法制备。所有的方法都包括将活性成分与构成一个或更多附加成分的载体结合的步骤。一般地说，通过均匀地和紧密地将类似物与液体载体或精细分散的母体载体或两者结合制备的。
提供下面的实施例目的在于帮助理解本发明和提供附加的权利要求中阐述的真实的范围。可以理解的是在阐述的程序中可以作一些修饰而不偏离本发明的精神。
实施例1
〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的生产合成
利用定点诱变可制备一个〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物和一个〔Gly116〕KGF类似物。然而，本发明的这些和其他类似物亦可以通过其它方法包括化学合成制备。就〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物而言，利用到一个牛序列。具体地说，〔Ala47，  Gly93〕aFGF类似物制备如下：
在下面的实施例中制备和检查了本发明一个牛aFGF类似物。这个类似物，牛〔Ala47，Gly93〕aFGF被构建为含有一个在aFGF分子的残基92到96环形成序列中的所期望的氨基酸替代(在93位甘氨酸替代组氨酸)和在47位由另外的丙氨酸对非保守的半胱氨酸残基的氨基酸取代，如图1所示。也可制备仅具有丙氨酸对半胱氨酸的氨基酸取代的一个牛〔Ala47〕aFGF类似物用作为所需要的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的一个对照。虽然这些实施例显示了本发明的一个牛aFGF类似物，但对于高度同源的人aFGF类似物也可以获得同样的结果。例如，本发明相应的人〔Gly93〕aFGF类似物的氨基酸序列显示于图2。
将一个编码牛aFGF〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的合成基因由总数为28个组分的寡核苷酸组装为两个片段，Gimenez-Gallego et al(1985)，Science，230：1385-1388的氨基酸序列被用作这个基因的基础，密码子的选择以在E.coli中类似物最适表达来选择(Gimenez-Gallego et al(1985)，同上)。片段I是从16个寡核苷酸组装而来产生一个287个核苷酸的片段，可以将其在XbaI和XhoI限制酶位点插入一个质粒质体中。片段II是从12个寡核苷酸组装而得的170个核苷酸的片段，该片段是经XhoI和BamHI的相容性末端结合。将这两部分插入表达质粒pCEM1156，质粒先前已经在一个3组分的连接中用XbaI和BamHI消化，产生了整个处于λpL启动子的控制下的aFGF基因。
从已知质粒pCFM836制备了质粒pCFM1156。在U.S.专利No.4,710,473中叙述了质粒pCFM836的制备；说明书的有关部分特别是实施例1-7被引入本文作为参考文献。为了从pCFM836制备pCFM1156，切开了两个内源的NdeI限制性位点，用T4聚合酶填充暴露的末端，并且填充后的末端是平齐末端。
然后用ClaI和KpnI消化得到的质粒并用下面序列的一个DNA寡核苷酸替代切下的DNA片段：
5 ′-CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC-3′
3′-TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC-5′
用这个质粒转化的E.coli细胞生长于一个16升的发酵罐中(如Foxet al(1988)，J.Biol.Chem.，263：18452-18458中叙述的)。
利用寡聚定点突变把编码牛〔Ala47，Gly93〕aFGF的基因转化成〔Ala47〕形式。aFGF基因首先被转移进入噬菌体载体M13mp 18，并制备了用作突变反应的模板的单链DNA。大约0.5μg该DNA与5微微mol的突变引物(5′-GAAGAAAACCATTAACAACAC-3′)和用于DNA序列分析的M13通用引物混合，加热到65℃，3分钟，慢慢冷却。退火的模板-引物与ATP，一个dNTP混合物，DNA聚合酶I大片段和T4DNA连接酶混合，然后在1 5℃温育4小时。这一反应混合物的等分试样被加到感受态大肠杆菌JM101细胞中并在0.7％L-agar上平板培养。产生的噬菌斑被影印到硝酸纤维滤纸上，滤纸与32P标记的突变引物杂交。将从杂交的噬菌斑制备的DNA进行测序分析来证实成功地完成了所期望的突变过程。然后合成的基因被转移回到PCFM1156载体来表达重组蛋白质。aFGF类似物纯化
从机械裂解的表达重组蛋白的E.coli细胞离心而获得的不溶部分纯化牛〔Ala47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF类似物。将沉淀部分溶解于8M尿素，0.1M甘氨酸，pH25并离心除去不溶物质，上清液上样到一个用6M尿素，10mM甘氨酸，pH3.0平衡并用6M尿素，20mM柠檬酸钠pH6.5洗过的S-琼脂糖Sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweelen)柱上，用在20mM柠檬酸钠中pH6.5的0到0.5M的NaCl线性梯度洗脱结合到柱上的蛋白质。将含有aFGF的组分合并，用20mM柠檬酸钠，0.1硫酸铵稀释20倍，并离心除去任何沉淀。上清液与一倍体积的20mM柠檬酸钠，2M硫酸铵，混合，加到一个用20mM柠檬酸钠，1M硫酸铵，pH6.5平衡过的苯基-Sepharose琼脂糖柱上。用线性下降梯度(1M到0M)的硫酸铵从柱上洗脱结合的蛋白质。含有aFGF的组分合并并在20mM柠檬酸钠pH6.5中透析。正如SDS凝胶上显示没有其它的考马斯亮兰染色谱带的事实所证明，如图4中所显示的，这些产物基本上是同源的。
实施例2
aFGF类似物的凝胶过滤层析
在一个Pharmacia FPLC系统(Pharmacia，Uppsala，Swedem)中利用一个Sepharose12柱在室温下进行凝胶过滤，在20mM柠檬酸钠，0.2M NaCl pH6.5以0.5ml/min洗柱。
凝胶过滤层析显示在相同于核糖核酸酶A(Mr＝13,700)的洗脱位纯化的牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物在以单一峰洗脱。这表明两个蛋白质是单体的并具有同样的流体半径，尽管有可能两种形式的蛋白质与柱基质相互作用并导致一个从柱中的迟延的洗脱。
实施例3
aFGF类似物的疏水作用层析
在Pharmacia FPLC系统中利用一个苯基-Sepharose柱在室温进行疏水作用层析。在2M硫酸铵，20mM柠檬酸钠，pH6.5中的样品加到已经用2M硫酸铵平衡过的柱上。在用2M硫酸铵洗之后，用一个从2M到0M下降梯度的硫酸铵洗脱残留的蛋白质，最后用20mM柠檬酸钠pH6.5洗涤。
由于一个蛋白质在疏水作用层析(HIC)中的洗脱位强烈、地依赖于折叠态疏水区的暴露，该技术提供了一个相似蛋白质的构象均一性的灵敏探测。图3显示了牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的洗脱曲线。〔Ala47〕aFGF在以0.25M硫酸铵处洗脱出一个主要的洗脱峰，而〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物在以0.13M硫酸铵洗脱时显示一个单一峰，表明两个蛋白质主要以一个单一独特构象存在。〔Ala47，Gly93〕在低盐浓度的洗脱指出它比〔Ala47〕形式略具疏水性。如果蛋白质的构象是使残基暴露于溶剂中，那么这一观察所得与93位甘氨酸替代组氨酸残基是一致的。另一种可选择方法，这一残基的变化可以诱导分子构象的整个变化来产生一个更加疏水的结构。
实施例4
aFGF类似物光谱学圆二色性
在一个用Oki If800型30计算机(Oki，Tokyo，日本)装备的Jasco型J-500C分光偏振仪(Jasco，Tokyo，日本)在室温下测定圆二色性光谱。测量是分别对近和远紫外区用1和0.02cm的杯在一个宽为1nm的带中进行。数据表达为平均残基椭圆率，〔θ〕，用两种形式的aFGF的113平均残基重来计算。
如图4A和4B所示，在近和远紫外区牛〔Ala47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF类似物的圆二色性光谱接近相同。类似物的CD也非常相似于对人bFGF报道的光谱(Arakawa et al(1989)，BBRC，161：335-341)。在近紫外区的光谱的相似性与FGFs相似的三级结构是一致的。热转换
在一个用热程序和持热杯器装备的ResponstII分光光度计(Gilford，Medfield，Massachusetts)上测定蛋白质的热转换。样品以一个0.1℃/min或0.5℃/min的增长量加热并在287nm处测定吸光值。利用在280nm处，就0.1％的蛋白质而言，对bFGF为0.98，对两个牛aFGF类似物为1.04的消光系数，用分光光度计测定蛋白质浓度。
在存在和缺乏肝素时，在pH6.5和7.0，20mM柠檬酸钠中测定aFGF类似物的热变性。在所有情况下，随着温度的增加，蛋白质沉淀。光吸收值突然增加的温度是变性温度。在缺乏肝素时，这一温度对牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物大约是高于牛〔Ala47〕aFGF类似物10℃。加入1.4倍或8倍过量(w/w)的肝素根据所用温度增长的速度，将两种形式的变性温度增加14-20℃。两种形式的变性温度的差异保持在约10℃。虽然在8倍过量的肝素存在时，在240-260nm区域的aFGF光谱被肝素本身的吸光值掩盖，但在240-340nm范围超过1.4倍或8倍(w/w)的肝素对每个蛋白质的CD光谱没有明显效果。傅立叶转化红外(FTIR)光谱检测
通过测定傅立叶转化红外光谱进一步测定两个aFGFs的构象的相似性。对于FTIR光谱学，蛋白质在水中完全透析。以在用水制备的20mM咪唑缓冲液(Sigma Chemical Co，99.9％同位素纯度)的2％溶液制备每种蛋白质。溶液被放在具有CaF2窗和100μm隔离片的IR室中。对于每个光谱，收集了1500个干涉图并在装备了一个锗包被的KBr光束分离器和一个DTGS探测器的一个NiColet800  FTIR系统上编码，用干燥氮气体连续清洁光学工作台，计算次生(second)衍生物光谱(如SuSiet al(1988)，Biochem，Biophys Res.Comm.，115：391-397中叙述的)。一个9点平滑函数被用于水蒸汽扣除(water vapor-subtracted)光谱，图5显示了在酰胺I′(C＝0在次生蛋白质中伸展)区〔Ala47〕和〔Ala47， Gly93〕牛aFGF类似物的次生衍生物光谱。对于多肽和蛋白质，在这个区域内的组分带的出现频率与二级结构含量有关Surewicz et al，(1988)，Biochem.Biophys，Acta，952：115-130。光谱在1630和1685cm-1处显示了强带指示了两个蛋白质中，显著含量的β-结构，一个接近1647cm-1处的强带指示了存在不规则或无序结构，由转角结构产生了接近1666和1673cm-1处的弱峰，在两个蛋白质的光谱的接近1651cm-1处存在一个小峰，接近这个频率的酰胺I′组分被典型地归结于α-螺旋。但是，最近表明这条带可能是由环结构产生的，Wilder et al，(1990)，Abstracts of the Fourth Symposiumof the Protein Soliety，San Diego，如图5所示，不象CD，高分辨的FTIR光谱清楚地证实了β-结构和转角的存在。牛〔Ala47〕aFGF类似物和牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的光谱几乎是可重叠的，又一次表示这两上蛋白质具有相似的构象。
次生衍生物光谱清楚地表明了两个aFGF类似物之间在构象上没有差别，但是，显然在用D2O溶液平衡冷冻干燥的蛋白质过程中对于牛〔Ala47〕aFGF类似物可变换质子的再生比〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物发生得更快。由于两个蛋白质具有相同的构象，不能从它们之间可交换质子暴露程度的差异来解释所观察到的H-D交换速度的不同。更可能〔Ala47〕aFGF类似物具有一个更柔性的结构，使酰胺质子更易接近溶剂。
实施例5
〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的肝素层析
肝素-琼脂糖(Pharmacia)被装进一个1×8cm的柱中并用10mMTris-HCl pH7.2平衡，用10mM Tris-HCl pH7.2，装载，洗柱。并用一个在同样缓中液中0到2.8M梯度系列的NaCl以0.5ml/min的流速在一个Pharmacia FPtC系统中洗脱。
通过与肝素和类肝素分子的密切结合可区别酸性和碱性FGF。牛〔Ala47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF类似物显示了一个在1.54M  NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.2中洗脱的单一峰。
实施例6
aFGF类似物的生物活性体外测定
来自先前实施例的aFGF类似物对NIH 3T3细胞的促有丝分裂活性测定如下，另外，一个如公开PCT专利申请No.88/04189中叙述制备的人〔Ser70，Ser88〕bFGF类似物在生物活性测定中，与aFGF类似物一并被测定。
从ATCC获得NIH3T3细胞，细胞生长在供应了10％牛血清，10单位/ml的青霉素，2mM谷氨酰胺和10单位/ml的链霉素的DME中。细胞以1∶40的比率每星期两次传代。在第1天的测试中，几乎铺满的培养物被胰蛋白酶分解并以在上述培养基中20,000细胞/ml，1ml/每孔的浓度铺在24孔的平板中，在第五天，用1ml/孔不含血清但含有上述浓度的青霉素，链霉素和谷氨酰胺的DMEM替代培养基，在第六天，实验样品以体积不大于100μm加到培养基中。18小时后，用1ml含有2-10μCi的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷的上述培养基在37℃脉冲细胞1小时，脉冲之后，用培养基洗细胞一次，然后加入250mM蔗糖，10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH8，平板在37℃温育10分钟释放细胞。在一个Skatron收集器上收集细胞(Skatron Inc.Stering，Virgmia)滤纸被干燥，放入闪烁液中，并在一个Beckman闪烁计数器中计数(Beckman仪器，Inc.，Fullerton，Califomia)。
牛〔Ala47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF类似物对NIH3T3细胞的促有丝分裂活性被检测。如图6所示，在缺少肝素时，〔Ala47〕aFGF类似物产生一个1到100ng/ml范围中的3H-胸腺嘧啶吸收的剂量依赖型刺激，50％最大刺激为25ng/ml。在同样的测试条件下，〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物能在一个更低的蛋白质浓度，50％最大剂量大约为1ng/ml时产生同样的促有丝分裂效果。重组bFGF比〔Ala47，Gly93〕aFGF有4-5倍高的潜力，具有一个50％最大剂量为220pg/ml，当4.5μg/ml肝素加到两种类似物中，它们的体外活性增加，〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物保留更高潜能，在存在45μg/ml肝素时，活性增强以致所有三种分子的剂量反应接近相同，具有一个50％最大剂量为90pg/ml。
正如通过保留他们各自的促有丝分裂活性确定的，通过在存在和缺乏1mg/ml肝素时，在37℃在20mM柠檬酸钠，pH7温育每个FGF类似物的0.1mg/ml溶液来检测aFGFs类似物的稳定性。在缺乏肝素时，牛〔Ala47〕aFGF类似物快速失去活性，具有一个大约13小时的半寿期，如图7所示。然而，在存在肝素时，在实验的250小时过程中牛〔Ala47〕aFGF没有失去生物活性。相反，不管有或没有肝素存在，牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物和人〔Ser70，Ser88〕bFGF类似物250小时都没有失去任何活性。
实施例7
〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的结晶学
使用0.2M NH4SO4，2M NaCl，0.099M柠檬酸钠，和0.02M磷酸钾钠，pH5.6采用气相扩散的方式生长牛〔Ala47，Gly93〕aFGF类似物的晶体，蛋白质液滴含有等体积的外液和10mg/ml的蛋白质溶液，晶体是三方晶体(空间群p3121，a＝78.6A，c＝1159A)衍射的数据是25A的分辨率下收集到的。使用18KW转靶X光源和Siemens(Madison，Wisconsin)多丝正比面探器收集强度数据，Siemens软件包被用于数据回归，把来自两个衍生物的同晶置换衍生物(mir)3A分辨率的数据合并，在其多原子峰合并几率图上，以几率最大处为其起始相位，。在溶剂过滤处理之后，对应于不对称单位中的两个独立的aFGF分子的区域是相同的，从旋转函数，实空间平移函数以及密度修正，对分子间的非晶体学对称性进行研究。分子壳层修正是用修饰的B.CWang算法作分子平均，并对相位进行多轮分子平均和溶剂过滤修正。
由于一个小的分子壳层，将折叠区截成平面，最初的图揭示了β-片层的伸展结构，如图8所示。分子模型最终的图以多对同晶置换法所得相位建立(来自对平均相位反复修正的重原子参数，如Rould et al(1989)，Science，246：1135-1142中叙述〕使用该模型在6A范围内对初始模型进行原子构建，对3A分辨率数据进行归并，最终，R因子为17.8％，(R因子是从平均的核对溶液过滤的图的计算值和观测值之差的百分比〕。，aFGF序列的残基10到135位氨基酸的电子密度图采用C.Cambillan的备有TOM/FRODO制图软件的Silicon Graphics 4D80工作站进行计算。
结晶学结果支持了90-97区包含于一个环结构中的假设，如果事实上，这个区参与了受体结合(如Baircl et al(1988)建议的，上述)，任何稳定环的氨基酸替代可以稳固和或增强分子的生物活性，这是观察到的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF获得的活性的增强的假设机制。
实施例8
〔Gly116〕KGF类似物的生产合成
为了制造〔Gly116〕KGF类似物，首先获得一个天然存在的KGF的编码序列，然后为了获得类似物的编码序列在氨基酸116的密码子处改变。
利用把人成纤维细胞(细胞素AG1523)作为利用本领域已知的标准技术制造KGF的cDNA的起始材料来分离得到的RNA获得天然存在的KGF的编码序列。然后KGF CDNA被用作聚合酶链式反应(PCR)的一个模板来放大KGF基因，由于在KGF基因中存在一个内部的NdeI位点，PCR DNA被制成两个片段，然后在一个单一的BsmI位点连接在一起，寡聚核苷酸238-231和238-24(下面所示)被用于制造随后用BsmI和BamHI切割的DNA产物，并分离产生一个188碱基对的KGF片段，低聚核苷酸238-22和238-24被用于制造一个随后用NdeI和BsmI的DNA产物，产生一个311个碱基对的KGF片段，这两个DNA片段连接在一起产生天然存在的KGF基因，如图9中所示。
为了获得一个所期望的〔Gly116〕KGF类似物的编码序列，必须在KGF基因中用一个甘氨酸密码子替代His116密码子，这是利用寡聚核苷酸315-17和315-18的PCR重叠寡聚核苷酸诱变，编码对应于具有合适碱基对变化的His116区的KGF DNA序列来编码〔Gly116〕KGF类似物达到的。除了如图10中所示的KpnI和EcoRI位点之间的DNA序列被化学合成的DNA替代，PCR的KGF DNA模板与图9中所示的相同，任何对应于定点突变变化的KGF DNA区域5′-和3′-的合适的寡聚核苷酸，如寡聚核苷酸238-22和238-24可以用于提供重叠诱变PCR的外部引物，为了用一个含有必需变化的编码序列的区域替代KGF基因的相应区域来编码〔Gly116〕KGF类似物(图10)，一个含有〔Gly116〕KGF类似物编码序列的EcoRI到BamHI DNA片段随后被连接进入先前叙述的已经含有KGF基因的表达质粒pCFM1156连接的DNA然后被转化进一个FM5(ATCC#539117寄主并且分离克隆含有pCFM1156〔Gly116〕KGF类似物质粒，然后发酵FM5/pCFM1156〔Gly116〕KGF类似物。菌株并用标准发酵技术收获细胞糊。
oligo 238-21 5′-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3′
oligo 238-22 5′-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3 ′
oligo 238-24 5′-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3′
oligo 315-17 5′-GGAAAACGGTTACAACACATATGCA-3′
oligo 315-18 5′-GTGTTGTAACCGTTTTCCAGAATTAG-3′〔Gly116〕KGF类似物的纯化
首先通过在大约4升20mM磷酸钠，pH6.8，0.2M NaCl中悬浮665gE.coli细胞糊打碎上面提到的来自发酵含有〔Gly116〕KGF类似物的细胞，并把悬浮液在9,000psi通过一个Gaulin均化器3次，然后在一个Beckman JA-10离心机(Beckman仪器，Fullerton，California)中，10,000rpm 4℃离心悬浮液30分钟。
通过把来自离心的悬浮液的上清液加到一个用20mM磷酸钠，pH7.5，0.2M NaCl平衡过的S-琼脂糖快流(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱(5×23cm，450ml总体积)以一个25ml/min的流速进行离子交换层析，然后用2升20mM磷酸钠中的0.M到0.6M NaCl的线性梯度洗脱〔Gly116〕KGF类似物。总的梯度体积为7升(大约16倍的柱体积)，含有KGF的部分合并并在一个400ml的搅拌室内在一个XM-10膜上浓缩22倍。
通过把一半体积的从离子交换层析得到的浓缩KGF(总体积为80ml)加到用20mM磷酸钠，pH6.8，0.5M NaCl平衡过的一个琼脂糖G-75(Pharmalia)柱(4.4×85cm，总体积为1300ml)中进行分子排除层析(SEC)，并用这一缓冲液展开柱。然后，对第二个一半的浓缩KGF制备物重复这一过程。
通过首先合并对应于〔Gly116〕KGF类似物的单体形式的SEC部分，然后用5个体积的20mM磷酸钠，pH6.8，0.2M NaCl稀释合并的部分并把稀释部分加到20mM磷酸钠，pH6.8，0.4M NaCl平衡过的S-琼脂糖快流(Pharmacia)柱(5×23cm，450ml总体积)来进行第二次离子交换层析过程，然后用大约1.5升的20mM磷酸钠，pH6.8，0.4NaCl洗柱，用20mM磷酸钠中pH6.8中的0.4M到0.6M NaCl线性梯度洗脱纯化的〔Gly116〕KGF类似物。总梯度体积为10L(大约22倍的柱体积)。如SDS-PAGE确定的含有〔Gly116〕KGF类似物的样品合并，用UV吸收测定KGF的含量。
实施例9
KGF类似物的光谱学傅立叶转换红外(FTIR)光谱
通过将含20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH68蛋白质溶液透析过滤至含20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pD＝6.8的氘代水溶液中(Sigma，99.9％+同位素纯度〕制备红外光谱分析的样品，根据Covmgton et al.，(1968)，Anal Chem 40：700-706，pD值为玻璃电极PH计的PH读数加0.45。蛋白质终浓度为30mg/ml的蛋白质溶液被放入带有CaF2窗和100μM Teflon隔离片的LR室。
采用一个Nicolet 800FTIR系统进行结构鉴定，首先应用Happ-genzel变迹函数，之后对256个双边干涉图共加和傅立叶转换，分辨率被确定在2cm-1，根据Susi和BylerBiochem，Biophys Res，Comm，115：391-397，利用Nicolet软件操作衍生物的光谱和傅立叶自我解旋，利用程序PeadfitTM(Jandel科学公司)进行曲线装配，KGF的红外光谱显示了与bFGF和aFGF强烈的相似性，表明这三种蛋白质的同样的结构。
通过把IR室放在一个自动温度控制器控制的电热套中进行天然存在的KGF和〔Gly116〕KGF类似物的热稳定性研究，以一个0.5℃/min的速度增加温度，以8cm-1的分辨率收集IR光谱。
温度低于50℃时，光谱与处于室温时的光谱几乎没有差别，在温度高于50℃时，光谱表明天然存在的KGF历经一个热致转变。其证据是，在光谱上接近1616和1685cm-1处有一峰，在65℃，这些峰成为谱线的主峰，而在1643cm-1处有一相应的强度下降，这一光谱转变代表了天然存在的KGF协同解折叠。所观察到的热转变是不可逆的，原因很可能是解折叠的蛋白产生偏聚。天然存在的KGF的Tm估计是60℃，而〔Gly116〕KGF类似物Tm估计为65℃，高出天然存在的KGF5℃，表明〔Gly116〕KGF类似物比天然存在的KGF有一个更高的相对热稳定性。紫外光谱
利用一个具有Reltier温度控制器和热程序计的Resporse II UV分光光度计(Gilford，Medfield，Massachusetts)研究〔Gly116〕KGF类似物和天然存在的KGF的热变性，在20mM磷酸钠，pH6.8中的KGF溶液与8M盐酸胍或20mM磷酸钠混合到一个最后的蛋白质浓度大约为0.5mg/ml和一个最后的盐酸胍浓度0到2M，热扫描速度确定在0.5℃/min，检测的波长为286nm在热变性过程中加入少量的去除盐酸胍的蛋白质沉淀，但不使变性可逆，所以，所比较的样品同时进行。
由于加热过程中混浊度的出现，盐酸胍浓度为0至1M盐酸胍中利用UV光谱学的热变性实验是不成功的。然而，天然存在的KGF比〔Gly116〕KGF类似物发生混浊的温度更低，表明前面的蛋白质变性并偏聚在一个更低的温度。在1.5M的盐酸胍中，随着蛋白质变性287nm处的吸光值下降，然后由于聚集而增高，发生吸光值下降和增高的温度对〔Gly116〕KGF类似物分别为25和44℃，在25℃加入2M盐酸胍导致天然存在KGF和〔Gly116〕KGF类似物的部分变性。增加温度导致蛋白质的完全变性，对于天然存在的KGF变性结束在37℃，对于〔Gly116〕KGF类似物为46℃。这些结果表明从熔点看，〔Gly116〕KGF类似物具有高出几度的热稳定性，这与红外分析表明〔Gly116〕KGF类似物的Tm高出天然KGF大约5℃的结果是一致的。
实施例10
〔Gly116〕KGF类似物的促有丝分裂活性
利用Rubin et al(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：802-806的有丝分裂发生测试分析了〔Gly116〕KGF类似物的促有丝分裂活性，〔Gly116〕KGF类似物展示了比对天然存在的KGF观察到的更少的3H-胸腺嘧啶掺入，表明〔Gly116〕KGF类似物的一个更低的专一活性。
                           序列表(1)一般的信息：(i)申请人：Amgen Inc.(ii)发明题目：具有增强稳定性和生物活性的酸性成纤维细胞生长因子的类似物(iii)序列数：17(iv)通信地址：
(A)通信人：Amgen Inc.
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(C)分类：(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
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(A)长度：141个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr1               5                   10                  15Cys Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val
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    115                 120                 125Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp
130                 135                 140(2)SEQ  ID  NO：3的资料：(i)序列特征：
(A)长度：155个氨基酸
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(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1               5                   10                  15Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Ala Ser
        20                  25                  30Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly
    35                  40                  45Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu
 50                 55                  60Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu65                  70                  75                  80Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu
            85                  90                  95Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr
        100                 105                 110Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys
    115                 120                 125Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala
130                 135                 140Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145                 150                 155(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征：
(A)长度：502个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA      60GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTC      120TGTCGAACAC AGTGGTACCT GAGGATCGAT AAAAGAGGCA AAGTAAAAGG GACCCAAGAG      180ATGAAGAATA ATTACAATAT CATGGAAATC AGGACAGTGG CAGTTGGAAT TGTGGCAATC      240AAAGGGGTGG AAAGTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG      300AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA      360TATGCATCAG CTAAATGGAC ACACAACGGA GGGGAAATGT TTGTTGCCTT AAATCAAAAG      420GGGATTCCTG TAAGAGGAAA AAAAACGAAG AAAGAACAAA AAACAGCCCA CTTTCTTCCT      480ATGGCAATAA CTTAATAGGA TC                                               502(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：
(A)长度：497个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位：编制数(1..497)(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CTATTAAGTT ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT      60TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT      120CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAATG GTTTTCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTTACA      180ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG CAAGATAGAA      240TTCACTTTCC ACCCCTTTGA TTGCCACAAT TCCAACTGCC ACTGTCCTGA TTTCCATGAT      300ATTGTAATTA TTCTTCATCT CTTGGGTCCC TTTTACTTTG CCTCTTTTAT CGATCCTCAG      360GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT CACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC      420ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG      480AGTCATGTCA TTGCACA                                                     497(2)SEQ ID NO：6的资料：  (i)序列特征：
(A)长度：164个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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        100                 105                 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His
    115                 120                 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val
130                 135                 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145                 150                 155                 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO：7的资料：(i)序列特征：
(A)长度：503个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA      60GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT      120CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA      180GATGAAAAAC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT      240CAAAGGTGTT GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA      300GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACG GTTACAACAC      360ATATGCATCA GCTAAATGGA CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA      420GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC      480TATGGCAATA ACTTAATAGG ATC                                              503(2)SEQ ID NO：8的资料：(i)序列特征：
(A)长度：497个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键词：-
(B)位：编制数(1..497)(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CTATTAAGTT ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT      60TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT      120CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAACC GTTTTCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTTACA      180ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG CAAGATAGAA      240TTCAGATTCA ACACCTTTGA TTGCAACGAT ACCAACAGCA ACAGTACGGA TTTCCATAAT      300ATTGTAGTTG TTTTTCATCT CTTGGGTGCC CTTGACTTTG CCGCGTTTGT CGATACGCAG      360GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT CACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC      420ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG      480AGTCATGTCA TTGCACA                                                     497(2)SEQ ID NO：9的资料：  (i)序列特征：
(A)长度：l64个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1               5                   10                  15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly
        20                  25                  30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg
    35                  40                  45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn
50                  55                  60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65                  70                  75                  80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys
            85                  90                  95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu
        100                 105                 110Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His
    115                 120                 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val
130                 135                 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145                 150                 155                 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO：10的资料：(i)序列特征：
(A)长度：55个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC       55(2)SEQ ID NO：11的资料：(i)序列特征：
(A)长度：49个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT              49(2)SEQ ID NO：12的资料：(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
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GAAGAAAACC ATTACAACAC                                              20(2)SEQ ID NO：13的资料：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
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ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA                                       26(2)SEQ ID NO：14的资料：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
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ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA                                      27(2)SEQ ID NO：15的资料：(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A                                 31(2)SEQ ID NO：16的资料：(i)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
GGAAAACGGT TACAACACAT ATGCA                                        25(2)SEQ ID NO：17的资料：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：未知
(D)拓朴结构：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GTGTTGTAAC CGTTTTCCAG AATTAG                                           26

Claims (16)

1.一种FGF家族中天然存在蛋白质的类似物，其中在所说的天然存在的蛋白质中的环形成序列-Asn-His-Tyr-Asn-Thr-中的至少一个氨基酸被一个具有更高环形成潜能的不同的氨基酸残基替代。
2.根据权利要求1所述的类似物，其中所说的天然存在的蛋白质是KGF。
3.根据权利要求2所述的类似物，其中所说的替代氨基酸是氨基酸116。
4.根据权利要求3所述的类似物，其中所说的具有一个更高环形成潜能的氨基酸选自甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
5.根据权利要求4所述的类似物，其中所说的具有更高环形成潜能的氨基酸是甘氨酸。
6.根据权利要求5所述的类似物，它具有图10中阐述氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的类似物，其中至少一个末端氨基酸残基被缺失，而所说的类似物实际上保留了所说的增强的生物活性。
8.根据权利要求7所说的类似物，其中至少一个所说的天然存在的KGF的半胱氨酸残基被一个中性氨基酸残基替代。
9.一个编码原核生物或真核生物表达的权利要求1所述的类似物的DNA序列。
10.根据权利要求10所说的DNA序列，其中所说的类似物是权利要求6的类似物。
11.一种药物组合物，它含有有治疗有效量的权利要求1所述的类似物和一种或多种可药用佐剂。
12.根据权利要求11的药物组合物，其中所说的类似物为权利要求6的类似物。
13.一种治疗创伤的方法，包括给所说的创伤施用治疗有效量的权利要求1所说的类似物。
14.根据权利要求13的方法，其中所说的类似物是权利要求6的类似物。
15.根据权利要求5的类似物，它具有附图1中阐述的氨基酸序列。
16.根据权利要求5中的类似物，它具有附图2中阐述酸的氨基酸序列。
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