TWI634898B - 經修飾之人類酸性纖維母細胞生長因子及其組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供酸性纖維母細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor；aFGF)組合物，其包含：(i)SEQ ID NO：1之aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖醯化(phosphogluconoylation)之SEQ ID NO：1之aFGF、(iii)具有N端葡糖醯化(gluconoylation)之SEQ ID NO：1之aFGF、(iv)SEQ ID NO：2之aFGF及(v)SEQ ID NO：3之aFGF，或其組合。本發明亦提供經修飾之酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)，其具有N端磷酸葡糖醯化或葡糖醯化。

Description

經修飾之人類酸性纖維母細胞生長因子及其組合物
本發明係關具於有磷酸葡糖醯化或葡糖醯化之經修飾之酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)。本發明亦關於aFGF組合物，其包含：(i)SEQ ID NO：1之aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iii)具有N端葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iv)SEQ ID NO：2之aFGF及(v)SEQ ID NO：3之aFGF，或其組合。
酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)，其影響各細胞類型之體外之增生及分化，係最初分離自神經組織(包括全腦及下視丘)之單鏈蛋白質。aFGF為肝素依賴性促分裂原(heparin-dependent mitogen)且其可強結合至所有四種已知之FGF受體及其剪接形式。其可位於與運動及感覺功能相關之神經元之特定亞群內，且可純化自成人大腦。經純化之aFGF為神經母細胞之促分裂原，並可促進脊髓神經元的軸突延伸。此外，aFGF經證實於培養時促進星狀細胞(astrocytes)之神經生長因子表現。
數個研究報告，FGFs對神經生理活性具有範圍廣泛之效用，不同於其於體內中樞神經系統(central nervous system；CNS)內之促分裂作用。舉例而言，當投予大腦時，aFGF可對大腦缺血所誘發之下視丘 CA1神經元退化提供保護效用(Sasaki K.et al.,Brain Res.Bull.33：505-511,1994)。FGF1據報告具有保護選擇性神經元群體，對抗與神經退化性疾病如阿茲海莫氏症(Guo,Z.,and Mattson,M.,Cereb.Cortex 10,50-57,2000)及HIV腦炎(Everall,I.P.et al.,J.Neuropathol.Exp.Neurol.60,293-301,2001)相關之分子的神經毒性之效用。
原生人類aFGF多肽係由154個胺基酸組成，其係分離自人類大腦。然而，經確認，人類aFGF N端之19個胺基酸與人類介白素-1(interleukin-1；IL-1)具有同質性。與IL-1之胺基酸一致或類似之原生人類aFGF N端之19個胺基酸可導致相同的內源性免疫反應，包括巨噬細胞活化，以及調節細胞生長停滯(G.Venkataraman et al.,P.N.A.S.,96：3658-63,1999)。此外，據報告，促發炎性細胞激素IL-1及FGF-1(aFGF)/FGF-2(bFGF)具有相同結構骨架，且競爭酪胺酸激酶結構域之相同受體結合位(A.J.Minter et al.,J.Cell Physil.,167：229-37,1996)。
數種重組型人類aFGF係商業上可購，且廣泛用於各種生物試驗。舉例而言，具有140個胺基酸的重組人類aFGF(R&D，aa 16-155，目錄編號：232-FA/CF)、具有154個胺基酸的重組人類aFGF(R&D，aa 2-155，目錄編號：231-BC/CF)、具有141個胺基酸的重組人類aFGF(Sigma，天然序列並具有額外之甲硫胺酸殘基連接至N端，目錄編號：F5542)。亦參見Osakada F et al.,Nat Protoc.2009；4(6)：811-24，及Christina Krabbe et al.,J.Neurochem.(2009)110,1908-1920。
此外，美國專利號7,956,033(於2011發佈)揭示一具有135個胺基酸之經修飾之人類aFGF，其呈現增進之穩定性，包含藉由刪除原生 人類aFGF N端之20個胺基酸之縮短之原生人類aFGF，並於縮短之原生aFGF之前加上丙胺酸(Alanine；Ala)。
在一方面，本發明提供酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)組合物，其包含：(i)SEQ ID NO：1之aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iii)具有N端葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iv)SEQ ID NO：2之aFGF及(v)SEQ ID NO：3之aFGF，或其組合。
在本發明之一具體實施例中，aFGF組合物具有下列高效能離子交換層析(high performance ion-exchange chromatography；HPIEC)尖峰：
其中該HPIEC係於下列條件進行：流速：0.5mL/min
樣本量：100μL
管柱：ProPac離子交換管柱
吸光值：220-280nm
溶析設定：
緩衝液A：20mM MES，pH 6.0-8.0
緩衝液B：20mM MES+1M NaCl，pH 6.0-8.0
另一方面，本發明提供經修飾之酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)，其具有N端磷酸葡糖醯化或葡糖醯化。
根據本發明，相較於SEQ ID NO：1之人類aFGF或野生型人類aFGF，該aFGF組合物及經修飾之aFGF呈現增進之特異活性。
配合附圖閱讀可更佳地理解前文之概述以及如後之本發明之詳細說明。在圖式中：圖1顯示aFGF135(SEQ ID NO：1)樣本之HPIEC輪廓。
圖2A-圖2C提供aFGF135、aFGF140、及aFGF154之HPIEC輪廓。圖2A顯示aFGF135之HPIEC輪廓、圖2B顯示aFGF140之HPIEC輪廓、及圖2C顯示aFGF154之HPIEC輪廓。
圖3顯示aFGF135樣本之HPIEC輪廓之五個尖峰樣本之特異活性。
除非另行定義，本文使用之所有技術性及科學性術語具有與本發明所屬領域之技藝人士一般所理解相同之意義。
除非另有明確指明，本文使用的單數形式「一」、及「該」 包括複數指涉物。因此，舉例而言，提及「一樣本」時係包含複數個此類樣本及本領域之技藝人士習知之其等同物。
本文所使用的「酸性纖維母細胞生長因子」或「aFGF」乙詞係指肝素依賴性促分裂原，且其可強結合至所有四種已知的FGF受體及其剪接形式，包括任何類型之aFGFs，較佳為人類aFGF，其可為原生、野生型、或經修飾之aFGF。在一較佳具體實施例中，該aFGF具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，如美國專利號7,956,033所揭示者，其在此併入本案作為參考資料。
本發明意外發現，相較於無磷酸葡糖醯化及葡糖醯化之aFGF、或野生型aFGF，具有N端磷酸葡糖醯化或葡糖醯化之經修飾之aFGF呈現增進之特異活性(specitic activity)。
在本發明之一具體實施例中，aFGF具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
在本發明之一較佳實例中，本發明之經修飾之aFGF係藉由將磷酸葡糖醯化作用或葡糖醯化作用加至aFGF而進行，該aFGF較佳為人類aFGF，最佳為SEQ ID NO：1之人類aFGF。本發明意外發現，經修飾之人類aFGF具有優異之特異活性。
本文所使用的「磷酸葡糖醯化」乙詞係指藉由添加一或多個6-磷酸葡糖醯基以修飾或化學修飾一分子(如蛋白質)。
本文所使用的「磷酸葡糖醯化」乙詞係指藉由添加一或多個磷酸葡糖醯基以修飾或化學修飾一分子(如蛋白質)。在本發明之一具體實施例中，aFGF之磷酸葡糖醯化之進行係藉由將一6-磷酸葡糖醯基加至aFGF。
本文所使用的「葡糖醯化」乙詞係指藉由添加一或多個葡糖醯基以修飾或化學修飾一分子(如蛋白質)。在本發明之一實例中，aFGF之葡糖醯化之進行係藉由將一6-葡糖醯基加至aFGF。此外，根據本發明，具有葡糖醯化之aFGF可來自具有磷酸葡糖醯化之aFGF之去磷酸化作用(dephosphorylation)。根據本發明之另一實例，aFGF之葡糖醯化之進行係藉由將6-磷酸葡糖醯基加至aFGF並隨後去磷酸化。根據本發明，相較於無磷酸葡糖醯化及葡糖醯化之aFGF、或野生型aFGF，具有葡糖醯化之經修飾之人類aFGF與具有磷酸葡糖醯化之經修飾之人類aFGF兩者具有增進之特異活性。
蛋白質之磷酸葡糖醯化或葡糖醯化可經由天然過程或化學修飾(如合成方法)進行。另一方面，由於大腸桿菌(Escherichia coli；「E.coli」)表現之蛋白質可能出現葡糖醯化或磷酸葡糖醯化(如α-N-6-磷酸葡糖醯化)等轉譯後修飾(Geoghegan,et al.,Anal.Biochem.267：169-184(1999)；Kim et al.,Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 57：759-762(2001)；Yan,et al.Biochemical & Biophysical Research Communications 262：793-800(1999)「Yan et al.I」；Yan,et al.,Biochemical & Biophysical Research Communications 259：271-282(1999)「Yan et al.II」)，可藉由在適當大腸桿菌菌株表現，以產生經磷酸葡糖醯化或經葡糖醯化之蛋白質。
據報告，此種轉譯後修飾可能對所表現之蛋白質之活性、穩定性、結構或免疫原性產生不良影響。然而，本發明令人驚訝地發現，相較於無磷酸葡糖醯化與葡糖醯化之人類aFGF，或野生型人類aFGF，磷酸葡 糖醯化或葡糖醯化之人類aFGF呈現增進之特異活性。在一具體實施例中，該人類aFGF為SEQ ID NO：1之人類aFGF。
本文所使用的「aFGF特異活性」或「特異活性」係指單位量之樣本的一aFGF活性，其係由生物試驗測定。
另一方面，本發明提供一酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)組合物，其包含：(i)SEQ ID NO：1之aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iii)具有N端葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iv)SEQ ID NO：2之aFGF及(v)SEQ ID NO：3之aFGF，或其組合。
SEQ ID NO：2之aFGF為經修飾之SEQ ID NO：1之aFGF，其係以離胺酸取代位置101之天冬醯胺酸。SEQ ID NO：3之aFGF為經修飾之SEQ ID NO：1之aFGF，其係以離胺酸取代位置2之天冬醯胺酸。
在本發明之一具體實施例中，aFGF組合物係由：(i)SEQ ID NO：1之aFGF、(ii)具有N端磷酸葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iii)具有N端葡糖醯化之SEQ ID NO：1之aFGF、(iv)SEQ ID NO：2之aFGF、及(v)SEQ ID NO：3之aFGF，或其組合所組成。
在本發明之一具體實施例中，該aFGF組合物具有下列HPIEC尖峰：
其中該HPIEC係於下列條件進行：流速：0.5mL/min
樣本量：100μL
管柱：ProPac離子交換管柱
吸光值：220-280nm
溶析設定：
緩衝液A：20mM MES，pH 6.0-8.0
緩衝液B：20mM MES+1M NaCl，pH 6.0-8.0
相較於SEQ ID NO：1之人類aFGF或野生型人類aFGF，本發明之aFGF組合物顯示增進之特異活性。
本發明係進一步以下列實例說明，其提供之目的在於例示而非限制。
實施例
實施例1：經修飾之SEQ ID NO：1之人類aFGF(「aFGF135」)之表現及分離
構建一載體pET3c-haFGF以表現aFGF135，如美國專利號7,956,033所描述，其所揭示者在此全部併入本案作為參考資料。
擴增pET3c-haFGF並隨後轉形至大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Germany)勝任細胞。在以IPTG誘導之前，抗安比西林之大腸 桿菌菌落係於LB培養基培養及擴增至OD600=0.3。培養16小時(±2小時)之後，收獲細菌並以5000rpm離心以移除上清液。收獲之細菌以PBS清洗二次，隨後以高壓均質機溶裂；接著流經孔徑大小0.22μm之濾膜。經過濾之培養基可用於蛋白質分離。
該aFGF135之胜肽係以三種層析管柱分離：(1)陽離子交換層析；(2)親和力層析；以及(3)粒徑排阻層析。上述管柱所使用之緩衝液為磷酸鹽溶液(Na2PO4：NaHPO3=51：49，並具0.1% EDTA-Na，pH 6.0-8.0)。
實施例2：表現之蛋白質之HPIEC(高效能離子交換層析)
將如實施例1所獲得之經分離之胜肽組合物進行HPIEC分析。層析條件如下：移動相：緩衝液A-20mM MES，pH 6.0-8.0，緩衝液B-20mM MES+1M NaCl，pH 6.0-8.0；管柱：ProPac離子交換管柱；吸光值：220-280nm；注射體積(樣本量)：100μL；流速：0.5mL/min；時間：45min.；以及溫度：25℃，其中梯度曲線為：
Balb/3T3細胞增生試驗之進行如下述。選擇生長良好之Balb/3T3細胞並計算細胞濃度。試驗係使用96孔培養盤，其中60孔(B2至G11)係加入試驗樣本，且其他周圍之孔係加入無菌PBS。細胞以每孔2 x 104 個細胞之密度種植於培養盤，其中培養基為RPMI-1640+10% FBS，並於37℃、5% CO2下培養24±2小時。製備RPMI-1640培養基+0.5% FBS之樣本稀釋緩衝液。以樣本稀釋緩衝液(RPMI-1640培養基+0.5% FBS)將實施例1取得之標準aFGF組合物稀釋成16個單位/ml，並連續稀釋2倍濃度，以取得至少經6個連續稀釋之樣本。隨後，移除96孔培養盤之培養基，將100μL之樣本加入各孔，並於37℃、5% CO2下培養24±2小時。針對活性測定，首先將培養盤置於室溫下15分鐘，接著將100μL之發光試劑加至各孔反應30分鐘。最後，檢測發光訊號，並以平行線分析法(Parallel-Line Assay)計算活性。
結果顯示於圖1及下表1。分別於滯留時間(min.)約18.165、18.504、19.131、19.419、及19.884時觀察到5個主要尖峰。
實施例3：不同人類aFGFs之HPIEC輪廓之比較
本實施例中測試三種不同的人類aFGF，即aFGF135、 aFGF140、及aFGF154。SEQ ID NO：1之aFGF135之製備係如前實施例1所述。aFGF140(具有140個胺基酸)為R&D重組酸性人類FGFaa 16-155(目錄編號：232-FA/CF)，其係購自R&D Systems,Inc.，Minneapolis，MN55413 USA。aFGF154(具有154個胺基酸)為R&D重組酸性人類FGF aa 2-155(目錄編號：231-BC/CF)，其係購自R&D Systems,Inc.，Minneapolis，MN55413 USA。層析條件與前文實施例2所述相同。
結果如圖2A-圖2C所示。圖2A顯示aFGF135之HPIEC輪廓、圖2B顯示aFGF140之HPIEC輪廓、及圖2C顯示aFGF154之HPIEC輪廓。如圖2A-圖2C所示，aFGF135、aFGF140、及aFGF154具有極不同之HPIEC輪廓。
實施例4：以LC-MS/MS確認aFGF135之HPIEC尖峰並比較其特異活性
1. Arg-C切割：首先以3kDa截留(cut-off)之Amicon超離心過濾器(Amicon Ultra Centrifugal Filter)濃縮各尖峰之樣本。所有16個樣本(10μg，取自四批次之HPIEC尖峰1、2、4、及5)以50mM碳酸氫銨緩衝液稀釋至100μL。接著，於37℃下，所有蛋白質樣本以6M尿素變性並以1μL 1M DTT還原1小時。於室溫避光下，以10μL 0.5M IAM進行30min烷化。所得之haFGF蛋白質以50mM ABC緩衝液稀釋，隨後於37℃下以0.5μg Arg-C(蛋白質：酵素=20：1)切割17小時。於切割後，所有樣本以Zip Tip(Millipore)脫鹽、以真空離心(speedvac)乾燥、及以0.1% FA重新溶解，以進行LC-MS/MS分析。
2. LC-MS/MS分析：以Q-Exactive質譜儀連接Ultimate 3000 RSLC系統，分析經切割之樣本(0.5μg)。以C18管柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm x 150mm，2μm，100Å)進行液相層析(LC)分離，其中梯度顯示如下：
(移動相A：5% ACN/0.1% FA；移動相B：95% ACN/0.1% FA)
進行全MS掃描，其範圍為m/z 380-1800，並將MS掃描中的10個最強離子進行碎斷(fragmentation)，以用於MS/MS光譜。藉由Proteome Discoverer 1.4，將原始數據處理成尖峰列表，以進行Mascot資料庫搜尋。
3. 資料庫搜尋參數：以Mascot 2.4.0進行資料庫搜尋。所使用之參數如下：資料庫：由供應商提供之序列
酵素：Arg-C*
可變修飾：磷酸葡糖醯化(蛋白質N端)；葡糖醯化(蛋白質N端)；甲基化(Asn、Ala、及Lys)
胜肽質量公差(mass tolerance)：±10ppm
碎片質量公差：±0.02Da
最大錯失切割(Max missed cleavages)：5
儀器類型：ESI-TRAP
離子截留(cut-off)值：30
Arg-C*：此酵素已被證明切割精胺醯基殘基之羧基端、Lys-Lys鍵與Lys-Arg鍵。
3. 結果： 「位置」表示haFGF之殘基編號。「觀察值」表示探測掃描所觀察到之m/z值，而「Mr(實驗值)」、「Mr(計算值)」、「ppm」分別代表實驗分子量(molecular weight；MW)、MW計算值、及觀察MW與理論MW間之差異。MC表示錯失切割。計值(scores)為直接來自Mascot資料庫搜尋引擎之胜肽離子分數。
經由LC-MS，發現尖峰3之樣本為無修飾之aFGF135。
此外，比較5個尖峰之樣本之特異活性。進行Balb/3T3細胞增生生物試驗，其方法係如前實施例2所述。如圖3所示，相較於尖峰3、4、或5之樣本，尖峰1與2之樣本呈現較高之特異活性。
據信，本發明所屬領域中具通常知識者基於本文之描述，無須進一步之說明，可最大限度利用本發明。因此，所提供之說明及申請專利範圍應理解為例示之目的，而非以任何方式限制本發明之範圍。
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<223> 修飾自人類酸性纖維母細胞生長因子(a-FGF)之胜肽
<400> 3

Claims (3)

  1. 一種經分離的酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)，其胺基酸序列由SEQ ID NO：1所組成，且其N端係經磷酸葡糖醯化(phosphogluconoylated)。
  2. 一種經分離的酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)，其胺基酸序列由SEQ ID NO：1所組成，且其N端係經葡糖醯化(gluconoylated)。
  3. 如請求項1或2之經分離的aFGF，相較於SEQ ID NO：1之人類aFGF或野生型人類aFGF，其具有增進之特異活性。
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