CN114846020A - 逆向-反转肽 - Google Patents

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CN114846020A CN202080088948.0A CN202080088948A CN114846020A CN 114846020 A CN114846020 A CN 114846020A CN 202080088948 A CN202080088948 A CN 202080088948A CN 114846020 A CN114846020 A CN 114846020A
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Abstract

本公开涉及非常规神经营养因子的领域，和治疗退行性、慢性或进行性疾病和障碍以及具有ER应激作为致病化合物的单基因遗传性疾病的领域。更特别地，本公开涉及经修饰的肽，特别是逆向‑反转肽。本公开还涉及包含所述肽的药物组合物。此外，本公开还涉及用作药物和用于治疗退行性、慢性或进行性疾病和障碍以及具有ER应激作为致病化合物的单基因遗传性疾病的所述肽和药物组合物，以及用于治疗所述疾病和障碍的方法。

Description

逆向-反转肽
技术领域
本公开涉及非常规神经营养因子和内质网(ER)定位蛋白的领域，以及治疗退行性、慢性或进行性疾病和障碍的领域。更特别地，本公开涉及逆向-反转肽。本公开还涉及包含所述肽的药物组合物。此外，本公开还涉及用作药物和用于治疗退行性、慢性或进行性疾病和障碍以及具有ER应激作为致病化合物的单基因遗传性疾病的所述肽和药物组合物，以及用于治疗所述疾病和障碍的方法。
背景技术
神经营养因子(NTF)是生长因子的一个亚组，其促进神经元的存活和分化，并具有神经保护和神经恢复特性(Hefti,1994)。NTF是支持发育和成熟神经元的生长、存活和分化的小蛋白质，并保护它们免受损伤和毒素。大脑多巴胺神经营养因子(CDNF)及其最近的相对中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)形成了一个新的非常规NTF家族，其在结构和机制上都不同于其他生长因子(Lindholm和Saarma,2010；Huttunen和Saarma,2019)。CDNF和MANF是分子量为大约18kDa的小单体蛋白质，分别是161和158个氨基酸的成熟蛋白，在中枢神经系统还有非神经元组织中表达。CDNF和MANF主要定位于内质网(ER)腔。它们含有N末端信号肽，将它们引导至ER。CDNF和MANF二者还含有C末端KDEL(SEQ ID NO:31)样ER滞留信号，所述信号典型地在预定用于分泌的生长因子中是不存在的。它们与ER蛋白(诸如BiP/GRP78)相互作用，调节未折叠蛋白反应(UPR)信号传导，并保护细胞免受ER应激诱导的细胞死亡。CDNF和MANF二者都积聚在健康细胞的ER腔中，并且破坏C末端ER滞留信号导致它们的分泌。在正常人血清中发现了可检测水平的CDNF和MANF，并且在脑脊液(CSF)中也发现了MANF。基于这些特征，CDNF和MANF被认为是一般的应激保护蛋白，而不是高度特异性的神经营养因子(Huttunen和Saarma,2019)。MANF也被描述为心肌因子(Glembotski,2011)。
CDNF和MANF是目前用于治疗帕金森病大鼠6-OHDA模型中退化多巴胺神经元的最有效蛋白质(Lindholm和Saarma,2010)。当在毒素之前应用时，这两种因子有效地防止了6-OHDA诱导的多巴胺神经元损失和帕金森病样运动症状(Lindholm等人,2007；Voutilainen等人,2009)。更重要的是，当在6-OHDA诱导的帕金森病症状已经非常严重的阶段应用时，损伤后施用任一因子有效地恢复了纹状体的正常运动行为和多巴胺能神经支配(Lindholm等人,2007；Voutilainen等人,2011)。CDNF还在帕金森病的小鼠MPTP模型中保护和修复多巴胺神经元(Airavaara等人,2012)，并且在严重的6-OHDA模型中，它比胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)更有效(Airavaara等人,2012；Voutilainen等人2011)。这些因子的神经元保护背后的机制尚不完全清楚，但已表明它们激活了旨在减轻氧化应激和ER应激并抑制凋亡细胞死亡的途径。许多病理生理状况(包括糖尿病和神经退行性疾病(诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病(AD)和肌萎缩性侧索硬化(ALS))都与ER应激相关。因此，CDNF和MANF的作用已在各种中枢神经系统疾病中显示出来(WO 2009133247；WO 2007068803；和Airavaara等人,2009)。非细胞自主机制，包括免疫和胶质细胞反应的调节，已被证明有助于CDNF和MANF的细胞保护作用(Sousa-Victor等人,2018)。具体地，CDNF和MANF已被证明抑制神经炎症，所述神经炎症涉及大多数(如果不是全部)CNS疾病和损伤的病理生理学(Nadella等人,2014；Zhao等人,2013)。
CDNF和MANF共享大约60％的氨基酸序列同源性，但它们具有高度相似的三维结构。CDNF和MANF二者都是由两个独立折叠的结构域通过一个灵活的环区连接而构成(Lindholm和Saarma,2010)。二级结构主要是α螺旋，其中N末端结构域中有五个α螺旋，并且C末端结构域中有三个α螺旋。三个二硫桥稳定N末端结构域，而CDNF中的C末端CRAC(SEQ IDNO:32)序列、MANF中的CKGC(SEQ ID NO:33)形成内部二硫桥。这种CXXC(SEQ ID NO:34)二硫桥在CDNF和MANF二者中均有发现，并在这些蛋白质的神经保护活性方面起重要作用。
CDNF在脑中表达，但也在许多其他组织中表达，包括例如骨骼肌、肝脏、心脏、肺、胰腺、睾丸、唾液腺和肠神经系统(Lindholm等人,2007)。MANF在脑中表达，但也在外周组织(诸如胰腺和心脏)中表达。
天然肽(诸如在出版物WO 2013/3034805和WO 2018/202957中公开的那些)很少可以用作药物产品。
文献WO 2013/3034805 A1公开了长度为4-40个氨基酸的MANF和CDNF片段，包含序列CKGC(SEQ IN NO:33)或CRAC(SEQ ID NO:32)。文献WO 2018/202957A1公开了长度为至少50个氨基酸的CDNF片段。Hellmann等人,2011，公开了包含残基96-158的MANF的活性C末端片段构建体。Fletcher和Hughes 2006公开了一种含有CRAC(SEQ ID NO:32)的脑源性神经营养因子(BDNF)源性肽，其具有用于环生成的工程化半胱氨酸。因此，本领域仍然需要具有改善的代谢稳定性和分布特性的治疗剂。
发明内容
本公开的一个目的是提供新的经修饰的逆向-反转肽。本公开的另一个目的是提供所述新型肽的用途。
本公开通过以新颖和创造性的方式利用肽，尤其是逆向-反转肽，提供了具有这些前述特性的工具。
本发明人发现，线性天然CDNF和MANF肽是很差的药物分子，因为当施用至人或动物时，特别是肠胃外施用时，它们的代谢快且分布差。因此，天然未修饰肽(诸如现有技术中公开的那些)很少可以用作药物产品。本发明人开发了来源于CDNF和MANF的新型稳定肽，其概括了CDNF和MANF的细胞保护作用，但非常适合于非侵入性外周施用。如本公开的数据所显示，本发明人发现CDNF和MANF肽的逆向-反转异构化显著改善了它们的代谢稳定性和分布特性，而没有损失它们的细胞保护活性。另外，本发明的经修饰肽比现有技术中公开的那些肽更短。
CDNF/MANF的生物活性局限于蛋白质的C末端结构域。本公开描述了来源于CDNF和MANF的C末端结构域的8-32个氨基酸的肽，特别是为逆向-反转异构化的形式。CXXC(SEQ IDNO:34)基序周围的短的未修饰的八肽显示了与全长CDNF/MANF蛋白相当的细胞保护活性和如本文所公开的体外穿透细胞膜的能力。
本发明人首次表明，具有CXXC(SEQ ID NO:34)基序或特定类型的CXXXC(SEQ IDNO:21)基序的CDNF/MANF肽的逆向-反转异构化具有显著改善的药物特性，例如代谢稳定性、血脑屏障(BBB)渗透性和体内药代动力学。这些逆向-反转异构化肽可以用于开发用于退行性、慢性和/或进行性疾病和障碍，或具有ER应激作为致病组分的单基因遗传性疾病的药物。
本公开提供了一种长度为8-32个氨基酸的肽或其药学上可接受的盐，其包含C-X1-X2-X3-C(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；并且
X3选自由以下项组成的组：A、G和S。
在一些方面，所述肽是伪肽。在一些情况下，所述肽具有以下特性中的至少一种(例如，1、2、3、4、5、6或7种)：(i)所述肽可以剂量依赖性地保护TH阳性神经元免受MPP+毒性；(ii)所述肽减少TH阳性神经元中α-突触核蛋白内含物的数量；(iii)与其母体对应物相比，所述肽在血浆中具有改善的稳定性；(iv)与其母体对应物相比，所述肽在肝细胞中具有改善的稳定性；或(v)与其母体对应物相比，所述肽具有改善的穿过血脑屏障的能力。
本公开进一步提供了用作药物的所述肽。
本公开进一步提供了所述肽，用于治疗退行性疾病或障碍、慢性疾病或障碍、或进行性疾病或障碍(诸如神经退行性疾病或障碍)，或具有ER应激作为致病组分的单基因遗传性疾病。
本公开进一步提供了一种药物组合物，其包含所述肽和以下中的至少一种：药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、稳定剂和/或稀释剂。
本公开进一步提供了用作药物的药物组合物。
本公开进一步提供了一种药物组合物，用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如神经退行性疾病或障碍)，或具有ER应激作为致病组分的单基因遗传性疾病。
本公开进一步提供了一种用于在有需要的受试者中治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如神经退行性疾病或障碍)，或具有ER应激作为致病组分的单基因遗传性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用包含前述肽的药物组合物。
下面将通过优选实施方案更详细地描述本发明。
附图说明
图1示出了所研究化合物的列表。展示了化合物编号、SEQ ID NO、指示Cys-Cys二硫键的氨基酸序列、序列长度、修饰的描述和单一同位素质量(Da)。列5示出了在MS光谱中看到的详细的带电质量峰，并且列6展示了化合物的单一同位素质量。
图2A-2B示出了CDNF对MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓)损伤的多巴胺能TH(酪氨酸羟化酶)阳性神经元的神经保护作用，以及对TH阳性神经元中α-突触核蛋白聚集的作用。数据表示为对照非损伤条件的百分比，即平均值+/-SEM(n＝4-6；在多个研究中收集的MPP+阴性对照n＝122-127)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001Brown-Forsythe和WelchANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较，相比于MPP+阴性对照。
图2A示出了在rhCDNF浓度增加的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。上面的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的对照水平(100％)；较低的虚线代表从未经化合物另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平。
图2B示出了在rhCDNF浓度增加的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。上面的虚线代表从未经CDNF另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平；较低的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的阴性对照水平(100％)。
图3A-3H示出了母体和逆向-反转化合物(分别具有SEQ ID NO:1-8的化合物1-8)对MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓)损伤的多巴胺能TH(酪氨酸羟化酶)阳性神经元的神经保护作用，以及它们对TH阳性神经元中α-突触核蛋白聚集的作用。数据表示为对照非损伤条件的百分比，即平均值+/-SEM(n＝4-6；在多个研究中收集的MPP+阴性对照n＝122-127)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001Brown-Forsythe和Welch ANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较，相比于MPP+阴性对照。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001相同浓度的母体和相应的逆向-反转化合物之间的Brown-Forsythe和Welch ANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较。
图3A示出了在存在化合物1(SEQ ID NO:1)和化合物2(SEQ ID NO:2)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。上面的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的对照水平(100％)；较低的虚线代表从未经化合物另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平。
图3B示出了在存在化合物1(SEQ ID NO:1)和化合物2(SEQ ID NO:2)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。上面的虚线代表从未经化合物另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平；较低的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的阴性对照水平(100％)。
图3C示出了在存在化合物3(SEQ ID NO:3)和化合物4(SEQ ID NO:4)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图3D示出了在存在化合物3(SEQ ID NO:3)和化合物4(SEQ ID NO:4)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图3E示出了在存在化合物5(SEQ ID NO:5)和化合物6(SEQ ID NO:6)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图3F示出了在存在化合物5(SEQ ID NO:5)和化合物6(SEQ ID NO:6)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图3G示出了在存在化合物7(SEQ ID NO:7)和化合物8(SEQ ID NO:8)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图3H示出了在存在化合物7(SEQ ID NO:7)和化合物8(SEQ ID NO:8)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图4A-4L示出了母体和逆向-反转化合物(分别具有SEQ ID NO:9-20的化合物9-20)对MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶鎓)损伤的多巴胺能TH(酪氨酸羟化酶)阳性神经元的神经保护作用，以及它们对TH阳性神经元中α-突触核蛋白聚集的作用。数据表示为对照非损伤条件的百分比，即平均值+/-SEM(n＝4-6；在多个研究中收集的MPP+阴性对照n＝122-127)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001Brown-Forsythe和Welch ANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较，相比于MPP+阴性对照。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001相同浓度的母体和相应的逆向-反转化合物之间的Brown-Forsythe和Welch ANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较。
图4A示出了在存在化合物9(SEQ ID NO:9)和化合物10(SEQ ID NO:10)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。上面的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的对照水平(100％)；较低的虚线代表从未经化合物另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平。
图4B示出了在存在化合物9(SEQ ID NO:9)和化合物10(SEQ ID NO:10)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。上面的虚线代表从未经化合物另外处理的MPP+损伤的细胞获得的参数的阴性对照水平；较低的虚线代表从非损伤细胞获得的参数的阴性对照水平(100％)。
图4C示出了在存在化合物11(SEQ ID NO:11)和化合物12(SEQ ID NO:12)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图4D示出了在存在化合物11(SEQ ID NO:11)和化合物12(SEQ ID NO:12)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图4E示出了在存在化合物13(SEQ ID NO:13)和化合物14(SEQ ID NO:14)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图4F示出了在存在化合物13(SEQ ID NO:13)和化合物14(SEQ ID NO:14)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图4G示出了在存在化合物15(SEQ ID NO:15)和化合物16(SEQ ID NO:16)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图4H示出了在存在化合物15(SEQ ID NO:15)和化合物16(SEQ ID NO:16)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图4I示出了在存在化合物17(SEQ ID NO:17)和化合物18(SEQ ID NO:18)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图4J示出了在存在化合物17(SEQ ID NO:17)和化合物18(SEQ ID NO:18)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图4K示出了在存在化合物19(SEQ ID NO:19)和化合物20(SEQ ID NO:20)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物中TH神经元的数量、TH神经元的总神经突网络和TH神经突上突触的数量。
图4L示出了在存在化合物19(SEQ ID NO:19)和化合物20(SEQ ID NO:20)的情况下，MPP+损伤后，中脑细胞的原代培养物的TH神经元中的α-突触核蛋白(aSyn)聚集。
图5A示出了与化合物14复合的GRP78(GRP78-NBD)的核苷酸结合结构域的计算分子模型。GRP78-NBD连同它的卡通痕迹在半透明的表面模型中示出。化合物14(SEQ ID NO:14)中的Cys-Cys键以棒状显示。
图5B以列表方式示出了一组代表性肽对GRP78-NBD的结合亲和力(Kd，以μM为单位)。结合亲和力通过基于微量热泳的无细胞测定法获得。
图5C示出了化合物14(SED ID NO:14)和20(SEQ ID NO:20)的神经保护活性对未折叠蛋白反应(UPR)途径信号传导活性的依赖性。GSK2606414用于抑制PERK信号传导，并且KIRA6用于抑制IRE1α信号传导。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001单向ANOVA测试和事后Fisher's LSD测试用于成对比较，相比于MPP+阴性对照。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001单向ANOVA测试和事后Fisher's LSD测试，用于单独的化合物及其与UPR信号抑制剂组合的效果之间的成对比较。
图6A-6B示出了大鼠血浆中母体和逆向-反转化合物(具有SEQ ID NO:1-8、13-14和19-20的化合物1-8、13-14和19-20)和人血浆中(具有SEQ ID NO:1-8的化合物1-8)的体外代谢稳定性。
图6A基于大鼠血浆中的化合物消失情况计算的半衰期。
图6B基于人血浆中的化合物消失情况计算的半衰期。柱上的标记和数字反映了逆向-反转化合物与相应母体化合物相比的半衰期变化。ND，由于技术问题在测定中未检测到。789分钟处的最大计算半衰期反映了实验截止时间的限制。
图7A-7B示出了大鼠肝细胞中母体和逆向-反转化合物(分别具有SEQ ID NO:1-8、13-14和19-20的化合物1-8、13-14和19-20)和人肝细胞中(具有SEQ ID NO:1-8的化合物1-8)的体外代谢稳定性。
图7A基于大鼠肝脏肝细胞中的化合物消失情况计算的半衰期。
图7B基于人肝脏肝细胞中的化合物消失情况计算的半衰期。柱上的标记和数字反映了逆向-反转化合物半衰期的变化，以相应母体化合物的百分比表示。395分钟处的最大计算半衰期反映了实验截止时间的限制。
图8示出了母体和逆向-反转化合物(分别具有SEQ ID NO:1–14和17-20的化合物1–14和17-20)通过血脑屏障的3D体外模型的渗透。穿过人工血脑屏障的化合物的量以化合物原始应用浓度的百分比表示。数据表示为平均值+/-SEM(n＝3-4)。****p<0.0001，n.s.不显著，母体和相应的逆向-反转化合物之间的Brown-Forsythe和Welch ANOVA测试，以及事后不成对t测试和Welch相关成对比较。
图9A示出了以5mg/kg的剂量静脉内施用至大鼠后，在2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时测量的逆向-反转化合物6、12、14和20(SEQ ID NO:6、12、14和20)、天然化合物13(SEQ ID NO:13)和天然对照化合物的血浆浓度。数据表示为平均值+/-SEM(n＝3)。
图9B示出了10mg/kg静脉内推注后，化合物20(SEQ ID NO:18)的脑间质液(ISF；纹状体)分布动力学。ISF浓度已通过微透析过滤器回收率-％(如通过体外实验所测定)归一化。使用LC-MS/MS从ISF和血浆中检测到所述化合物。
图10示出了CDNF和MANF的C末端结构域的成对比对。使用以下Genbank检索的序列进行比对：人CDNF登录号NP_001025125.2，和人MANF登录号NP_006001.5。CXXC基序显示为灰色背景，并且示出了三个α螺旋的位置。
图11示出了来自10个不同物种(分别为SEQ ID NO:47-66)的CDNF和MANF(61-63aa)的C末端结构域的ClustalW多序列比对。Genbank登录号在序列比对中示出。CXXC基序显示为灰色背景，并且示出了三个α螺旋的位置。这些代表性序列(在CDNF和MANF二者中)之间保守的残基以粗体显示。在序列比对下面，示出了在每个位置的代表性10个物种中发现的天然变体。所展示的序列和物种列表可以用于鉴定保守和可变位置，并表明对于大多数非必需氨基酸残基而言，仅有限的变异是可能的。
图12示出了化合物17-20(分别为SEQ ID NO:17-20)的结构式。作为标准缩写的氨基酸名称与序列顺序(天然肽中的NH2至COOH和逆向-反转肽中的COOH至NH2)一起在公式下方示出。灰色箭头指向每个化合物中的单个肽键，以便说明由L-氨基酸组成的线性肽和由D-氨基酸组成的逆向-反转肽的酰胺肽键中胺和羰基的不同顺序。
序列表
SEQ ID NO:1 MRVAELKQILHSWGEECRACAEK
SEQ ID NO:2 KEACARCEEGWSHLIQKLEAVRM
SEQ ID NO:3 LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK
SEQ ID NO:4 KEACGKCTEGWDDLIKKLEKVRL
SEQ ID NO:5 GEECRACAEKT
SEQ ID NO:6 TKEACARCEEG
SEQ ID NO:7 GETCKGCAEKS
SEQ ID NO:8 SKEACGKCTEG
SEQ ID NO:9 GEECRGACAEKT
SEQ ID NO:10 TKEACAGRCEEG
SEQ ID NO:11 GETCKGGCAEKS
SEQ ID NO:12 SKEACGGKCTEG
SEQ ID NO:13 EECRACAEK
SEQ ID NO:14 KEACARCEE
SEQ ID NO:15 ETCKGCAEK
SEQ ID NO:16 KEACGKCTE
SEQ ID NO:17 EECRACAE
SEQ ID NO:18 EACARCEE
SEQ ID NO:19 ETCKGCAE
SEQ ID NO:20 EACGKCTE
SEQ ID NO:21 C-X1-X2-X3-C
SEQ ID NO:22 E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E
SEQ ID NO:23 X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
SEQ ID NO:24X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-I-L-X5X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
SEQ ID NO:25 RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA，天然人CDNF肽
SEQ ID NO:26 RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA，天然人MANF肽
SEQ ID NO:27X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
SEQ ID NO:28X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10
SEQ ID NO:29X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9
SEQ ID NO:30X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E
SEQ ID NO:31 KDEL
SEQ ID NO:32 CRAC
SEQ ID NO:33 CKGC
SEQ ID NO:34 CXXC
SEQ ID NO:35 ETCKGCAE
SEQ ID NO:36 TCKGCA
SEQ ID NO:37 MWCASPVAVV AFCAGLLVSH PVLTQGQEAG GRPGADCEVC KEFLNRFYKSLIDRGVNFSL DTIEKELISF CLDTKGKENR LCYYLGATKD AATKILSEVT RPMSVHMPAM KICEKLKKLDSQICELKYEK TLDLASVDLR KMRVAELKQI LHSWGEECRA CAEKTDYVNL IQELAPKYAA THPKTEL全长CDNF(NCB参考序列：NP_001025125.2)
SEQ ID NO:38 MRRMWATQGL AVALALSVLP GSRALRPGDC EVCISYLGRF YQDLKDRDVTFSPATIENEL IKFCREARGK ENRLCYYIGA TDDAATKIIN EVSKPLAHHI PVEKICEKLK KKDSQICELKYDKQIDLSTV DLKKLRVKEL KKILDDWGET CKGCAEKSDY IRKINELMPK YAPKAASART DL全长MANF(NCBI参考序列：NP_006001.5)
SEQ ID NO:39TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA(49aaCDNF)
SEQ ID NO:40 RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA(37 aa CDNF)
SEQ ID NO:41 TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT(35aa CDNF)
SEQ ID NO:42 LASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT(32CDNF)
SEQ ID NO:43QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA(49aaMANF)
SEQ ID NO:44 RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA(37 aa MANF)
SEQ ID NO:45 QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS(35aa MANF)
SEQ ID NO:46 LSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS(32 aaMANF)
SEQ ID NO:47KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYAATHPKTEL，人CDNF(NP_001025125.2)
SEQ ID NO:48KYEKKLDLASVDLLKMRVAELKQILNSWGEECRACAEKSDYVNLIKELAPKYAAMHPKTEL，马CDNF(XP_001498617.2)
SEQ ID NO:49KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHGWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYAATHPQTEL，野牛CDNF(XP_010858254.1)
SEQ ID NO:50KYEKKLDLASVDLSKMRVAELQILYSWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYTETPPQTEL，猪CDNF(XP_003130787.1)
SEQ ID NO:51KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHSWGEECIACAEKTDYVNLITELAPKYAAAHPKTEL，狗CDNF(XP_848954.2)
SEQ ID NO:52KYGKKLDLASVDLWKMRVAELKQILQRWGEECRACAEKSDYVNLIRELAPKYVEIYPQTEL，小鼠CDNF(NP_808315.1)
SEQ ID NO:53NYEKKLDLASVDLWKMRDAELKQILHSWGEECRACAEKNDYVNLIKELAPKYVEIHPQIEL，仓鼠CDNF(XP_027261009.1)
SEQ ID NO:54KYERKLDLTSVDLSKMRVAELRKILDSWGEVCKACIEKTEFVNLIKELAPKYAPPNSRADL，短吻鳄CDNF(XP_019343086.1)
SEQ ID NO:55KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILYSWGEECRACVEKTDYVNLIKELAPKYTATYPKTEL，海豚CDNF(XP_026977721.1)
SEQ ID NO:56RYERLVLDWSTDALSKMRALELKRVLASWGEECRACLEKSEFIALIQEVAPKHSASEHRAHTEEF，斑马鱼CDNF(NP_001116753.1)
SEQ ID NO:57KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL，人MANF(NP_006001.5)
SEQ ID NO:58KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，马MANF(NP_001184244.1)
SEQ ID NO:59KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，野牛MANF(XP_010850093.1)
SEQ ID NO:60KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，猪MANF(NP_001231584.1)
SEQ ID NO:61KYDKQIDLRTVDLKKLRVRELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，狗MANF(XP_003639808.2)
SEQ ID NO:62KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL，小鼠MANF(NP_083379.2)
SEQ ID NO:63KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL，仓鼠MANF(RLQ67668)
SEQ ID NO:64KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，短吻鳄MANF(XP_014455597.1)
SEQ ID NO:65KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASSRTDL，海豚MANF(XP_026976745.1)
SEQ ID NO:66KYDKQVDLSSVDLKKLKVKDLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYAPSAAKARTDL，斑马鱼MANF(NP_001070097.1)
具体实施方式
术语“经修饰的肽”是指已被修饰或合成的肽或多肽。肽修饰或合成选项包括例如逆向-反转异构化肽、环肽、肽模拟物、点击化学、钉合肽、N末端修饰、C末端修饰、同位素标记的肽、生物素化和标记的肽、荧光染料标记的肽、肽二聚体、翻译后修饰、内部淬灭/FRET肽、接头/间隔区/聚乙二醇化、肽汇集、蛋白质缀合、免疫原性肽和非天然氨基酸的并入。“非天然编码氨基酸”是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可以与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然氨基酸(non-natural amino acid、unnatural amino acid)”、“非天然存在的氨基酸”及其各种带有连字符和未带有连字符型式。术语“非天然编码氨基酸”还包括但不限于通过天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)的修饰(例如翻译后修饰)而出现，但本身并不能通过翻译复合物天然地并入增长的多肽链中的氨基酸。此类非天然存在的氨基酸的例子包括但不限于N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
术语“逆向-反转”是指一种肽序列，其中一个或多个氨基酸是D氨基酸(反转)，并且所述肽序列是逆序的(逆向)。在一些实施方案中，可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个D氨基酸。在一些实施方案中，逆向-反转肽包括具有交替手性的氨基酸。在某些实施方案中，逆向-反转肽包括所有D氨基酸。如本文所用，手性是指氨基酸的D和L异构体。为了说明，具有序列CX1X2X3C的逆向-反转肽将被反转以具有序列CX3X2X1C，其中至少一个或多个氨基酸是D氨基酸。由D-氨基酸制成的肽在代谢上是稳定的，因为它们是蛋白酶的不良底物，所述蛋白酶已进化到降解由L-氨基酸制成的蛋白质和肽。然而，D-肽在例如螺旋结构中具有逆向旋向性，即氨基酸侧链被定位成镜像。逆转D-肽中的序列顺序提供了一种在侧链方向上模拟L-肽类似物的结构，换句话说，就是逆向-反转异构化。短的非螺旋逆向-反转肽可以在功能上模拟它们在靶结合中的天然L-蛋白对应物。
逆向-反转异构化的原理是，例如当线性肽是
NH2-Gly-L-Glu-L-Glu-L-Cys-L-Arg-L-Ala-L-Cys-L-Ala-L-Glu-L-Lys-L-Thr-COOH(SEQ ID NO:5)时
逆向-反转异构化形式是
NH2-D-Thr-D-Lys-D-Glu-D-Ala-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Cys-D-Glu-D-Glu-Gly-COOH(SEQ ID NO:6)
化合物17-20(分别为SEQ ID NO:17-20)的逆向-反转异构化原理的例子也在图12中展示。
术语“伪肽”是指天然肽或蛋白质中不存在的氨基酸的酰胺，尤其是引入多肽链中的氨基酸的酰胺。伪肽或氨基键替代物是可以用于描述骨架修饰肽的多种术语之一。肽的这些合成类似物具有各种潜在的用途，但这些领域中最扩大的兴趣集中在它们开发代谢稳定的和可能口服活性的肽激素类似物或具有增强生物效能的酶抑制剂的潜力上。所述术语具体地包括本领域技术人员已知的肽骨架修饰(即，酰胺键模拟物)。此类修饰包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修饰、酰胺键的完全替代、延伸、缺失或骨架交联。几种肽骨架修饰是已知的，包括ψ[CH2S]、ψ[CH2NH]、ψ[CSNH2]、ψ[NHCO]、ψ[COCH2]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。在以上使用的术语中，ψ表示不存在酰胺键。替代酰胺基的结构在括号内说明。
如本文所用，当两个实体彼此“缀合”时，它们通过直接或间接的共价或非共价相互作用连接。在某些方面，缔合是共价的。在其他方面，所述缔合是非共价的。非共价相互作用包括氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性相互作用、静电相互作用等。间接共价相互作用是当两个实体共价连接时，任选地通过接头基团。“缀合”在本文中意指与可检测的化学或生化部分或PEG或用于延长血浆半衰期的其他部分缀合或偶联的肽。在一些情况下，本文公开的一种或多种肽可以例如与载体蛋白缀合。此类缀合组合物可以是单价或多价的。例如，缀合组合物可以包括与载体蛋白缀合的本文公开的一种肽。可替代地，缀合组合物可以包括与载体缀合的本文公开的两种或更多种肽。
“血脑屏障”或“BBB”是高度选择性的半透膜屏障，其将循环血液与中枢神经系统中的脑和细胞外液分离。BBB由毛细血管壁的内皮细胞、包裹毛细血管的星形胶质细胞端脚和嵌入毛细血管基底膜中的周细胞形成。所述系统允许一些分子通过被动扩散通过，以及对神经功能至关重要的分子(诸如葡萄糖、水和氨基酸)的选择性转运。大分子(诸如蛋白质)典型地不可以通过BBB。然而，一些肽可以通过各种机制穿过BBB，并且还有一些含有位于脑血管内皮细胞表面处的转运蛋白特异性识别基序的蛋白质也可以穿过BBB转运。
如本文所用，“药学上可接受的载体”可以包括对于用于配制药物(诸如适于施用至人类的药物)可接受的一种或多种溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。也可以将补充性活性成分并入组合物中。
CDNF和MANF共享大约60％的氨基酸序列同源性(图10和11)，但它们具有高度相似的三维结构。CDNF和MANF二者都是由两个独立折叠的结构域通过一个灵活的环区连接而构成。二级结构主要是α螺旋，其中N末端结构域中有五个α螺旋，并且C末端结构域中有三个α螺旋。三个二硫桥稳定N末端结构域，而CDNF中的C末端CRAC(SEQ ID NO:32)序列、MANF中的CKGC(SEQ ID NO:33)形成内部二硫桥。这种CXXC(SEQ ID NO:34)二硫桥在CDNF和MANF二者中均有发现。CXXC基序有益于MANF和CDNF的神经保护活性。然而，这里展示的数据显示CXXC(SEQ ID NO:34)基序可以适应一些修饰，诸如添加小氨基酸(例如甘氨酸和丝氨酸)，即也可以使用CXXXC基序的特定类型。在一些方面，CDNF具有来源于NP_001025125.2(SEQ IDNO:37)的序列。在一些方面，MANF具有来源于NP_006001.5(SEQ ID NO:38)的序列。
除了来源于MANF和CDNF肽的天然存在的等位基因变体之外，可以通过突变将改变引入MANF/CDNF序列中，这导致经编码的MANF/CDNF肽的氨基酸序列的改变。可以在MANF/CDNF肽的序列中进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸取代的核苷酸取代。包含一个或多个“非必需”取代的MANF/CDNF肽或其功能片段可以被视为本文公开的野生型MANF/CDNF肽的等价物。
每种氨基酸均可以是天然或非天然氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指一种有机化合物，其是天然氨基酸的同类物，因为它具有与天然氨基酸相似的结构，使得它模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其不是20种常见天然存在的氨基酸或罕见的天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。
合适的氨基酸的例子包括但不限于丙氨酸、别异亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、环己基丙氨酸、2,3-二氨基丙酸、4-氟苯丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、高脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、萘丙氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、苯甘氨酸、六氢吡啶羧酸、脯氨酸、焦谷氨酸、肌氨酸、丝氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、衍生物或其组合。
术语“药学上可接受的”在本文中用于指代在合理的医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的盐”旨在意指本文所代表的化合物的游离酸或碱的盐，其是无毒的、生物可耐受的或以其他方式生物学上适于施用至受试者。一般参见，S.M.Berge等人,“Pharmaceutical Salts[药用盐],”J.Pharm.Sci.[药物科学杂志],1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是在药理学上有效并且适于与受试者的组织接触而没有过度的毒性、刺激或变态反应的那些盐。本文所述的化合物可以具有足够酸性的基团、足够碱性的基团、两种类型的官能团，或每种类型多于一个的官能团，并且因此与许多无机或有机碱以及无机和有机酸反应，以形成药学上可接受的盐。
对于本文所述的含有碱性基团(诸如胺)的化合物，可以通过本领域可用的任何合适方法制备药学上可接受的盐，例如用无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、硼酸、磷酸等)或用有机酸(诸如乙酸、苯乙酸、丙酸、硬脂酸、乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酰乙酸、羟乙磺酸、琥珀酸、戊酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、油酸、棕榈酸、月桂酸、吡喃糖苷酸(诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α-羟基酸(诸如扁桃酸、柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(诸如苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、萘甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如月桂基磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸或乙磺酸))，或酸(诸如本文中作为例子给出的那些)的任何相容混合物，以及根据本技术领域普通技术水平被视为等同物或可接受的取代物的任何其他酸及其混合物处理游离碱。
对于本文所述的含有酸性基团(诸如羧酸基团)的化合物，可以通过本领域可用的任何合适方法制备碱加成盐，例如用足量的所期望碱(纯碱或在合适的惰性溶剂中)处理这种化合物。药学上可接受的碱加成盐的例子包括但不限于锂、钠、钾、钙、铵、锌或镁盐，或其他金属盐；有机氨基盐，诸如烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。
药学上可接受的盐的其他例子包括但不限于樟脑磺酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐和扁桃酸盐。其他合适的药学上可接受的盐的列表可见于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第17版,宾夕法尼亚州伊斯顿的Mack出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.),1985。
化合物的中性形式优选地通过使所述盐与碱或酸接触并且以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式在某些物理特性(诸如在极性溶剂中的溶解度)方面不同于各种盐形式，但在其他方面，所述盐出于本申请的目的等效于化合物的母体形式。
在本公开的实施方案中，所述肽或片段的长度在8-32个氨基酸的范围内，其中所述肽或其片段包含如本文所述的CX1X2X3C(SEQ ID NO:21)。在某些实施方案中，优选的肽或片段可以由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸组成。在某些实施方案中，所述肽或片段的长度在8-23、11-23、12-23、8-11或8-12个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，所述肽或片段的长度在8-31、8-29、8-27、8-25、8-23、8-21、8-19、8-17、8-15、11-27、11-25、11-23、11-21、11-19、11-17、11-15、12-25、12-23、12-21、12-19、12-17、12-15、23-27、24-27或25-27个氨基酸的范围内。所述片段可以包含任何天然存在的氨基酸，诸如丙氨酸[Ala(A)]、精氨酸[Arg(R)]、天冬酰胺[Asn(N)]、天冬氨酸[Asp(D)]、半胱氨酸[Cys(C)]、谷氨酰胺[Gln(Q)]、谷氨酸[Glu(E)]、甘氨酸[Gly(G)]、组氨酸[His(H)]、异亮氨酸[Ile(I)]、亮氨酸[Leu(L)]、赖氨酸[Lys(K)]、蛋氨酸[Met(M)]、苯丙氨酸[Phe(F)]、脯氨酸[Pro(P)]、丝氨酸[Ser(S)]、苏氨酸[Thr(T)]、色氨酸[Trp(W)]、酪氨酸[Tyr(Y)]和缬氨酸[Val(V)]，以及非天然或经修饰的氨基酸。
环肽是从植物中分离的富含二硫化物的小肽。环肽典型地含有28-37个氨基酸，它们具有头部至尾部环化的肽骨架和三个二硫键的互锁布置。虽然植物环肽的家族可能含有具有潜在CXXC和CXXXC基序的环肽，但还不知道它们在哺乳动物细胞中具有与CDNF和MANF相似的细胞保护特性，即保护免受ER应激诱导的细胞功能障碍或细胞死亡，诸如凋亡。
在一个实施方案中，本公开中要求保护的肽与植物环肽或植物环肽家族无关。
优选地，本公开中公开的肽不是来自硫氧还蛋白和/或蛋白质的蛋白质二硫化物异构酶家族。
本公开提供了一种由长度为8-32个氨基酸组成的肽或其药学上可接受的盐，其包含C-X1-X2-X3-C(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；并且
X3选自由以下项组成的组：A、G和S。
在优选的实施方案中，所述肽包含E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；并且
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G
基于不同物种(人、马、野牛、猪、狗、小鼠、仓鼠、短吻鳄、海豚和斑马鱼CDNF和MANF用作图11中的示例序列)中CDNF和MANF序列的天然变异，与人序列相比，所述肽序列关于X-基团的有限变化可以被适应而不丧失生物活性。
在另一个优选的实施方案中，所述肽包含X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G；
X5不存在或选自由以下项组成的组：H、D、Q、R、Y、N和S；
X6不存在或选自由以下项组成的组：S、D、G、N和R；
X7不存在或是W；
X8不存在或是G；
X9不存在或是K；
X10不存在或选自由以下项组成的组：T、S、A、I和N；并且
X11不存在或选自D和E。
在另一个优选的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列的逆向-反转形式，其在
X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列内。
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G；
X5不存在或选自由以下项组成的组：H、D、Q、R、Y、N和S；
X6不存在或选自由以下项组成的组：S、D、G、N和R；
X7不存在或是W；
X8不存在或是G；
X9不存在或是K；
X10不存在或选自由以下项组成的组：T、S、A、I和N；并且
X11不存在或选自D和E，
X12不存在或选自由以下项组成的组：L、I和V；
X13不存在或是D；
X14不存在或选自L和W；
X15不存在或选自由以下项组成的组：A、S、T、E和N；
X16不存在或选自S和T；
X17不存在或选自V和D；
X18不存在或选自D和A；
X19不存在或是L；
X20不存在或选自由以下项组成的组：R、K、S和W；
X21不存在或是K；
X22不存在或选自由以下项组成的组：M、L、I和V；
X23不存在或是R；
X24选自由以下项组成的组：A、K、T、L和V；
X25选自由以下项组成的组：Q、K和R；并且
X26选自I和V。
在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:24内的8-23个氨基酸长的肽，其中所述肽包含CX1X2X3C(SEQ ID NO:21)基序。
在另一个优选的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列的逆向-反转形式，其在选自由以下项组成的组的氨基酸序列内：
X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:35)、
X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10(SEQ ID NO:36)、
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9(SEQ ID NO:37)和
X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E(SEQ ID NO:38)。在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:35-38之一内的8-23个氨基酸长的肽，其中所述肽包含CX1X2X3C(SEQ ID NO:21)基序。
在某些情况下，所述肽包含可以在氨基酸序列SEQ ID NO:39或氨基酸序列SEQ IDNO:43内的氨基酸序列。
优选地，所述肽，特别是D-肽由选自由以下项组成的组的序列组成：KEACARCEEGWSHLIQKLEAVRM(SEQ ID NO:2)、KEACGKCTEGWDDLIKKLEKVRL(SEQ ID NO:4)、TKEACARCEEG(SEQ ID NO:6)、SKEACGKCTEG(SEQ ID NO:8)、TKEACAGRCEEG(SEQ ID NO:10)、SKEACGGKCTEG(SEQ ID NO:12)、KEACARCEE(SEQ ID NO:14)、KEACGKCTE(SEQ ID NO:16)、EACARCEE(SEQ ID NO:18)和EACGKCTE(SEQ ID NO:20)，其中所述肽的所有氨基酸都是D-氨基酸。
在一个实施方案中，所述肽保护免受内质网(ER)应激诱导的细胞功能障碍或细胞死亡，诸如凋亡。
在一些实施方案中，所述肽的N末端被乙酰化。在一些实施方案中，所述肽的C末端被酰胺化。在一些实施方案中，所述肽的N末端被乙酰化，并且所述肽的C末端被酰胺化。
在一些实施方案中，所述肽是伪肽。
在一个实施方案中，所述肽是环状的。
在某些情况下，所述肽的长度为11-32个氨基酸。在某些情况下，所述肽的长度为12-32个氨基酸。在某些情况下，所述肽的长度为12-23个氨基酸。在某些情况下，所述肽的长度为8-23个氨基酸。在某些情况下，所述肽的长度为8-13个氨基酸。在某些情况下，所述肽的长度为8-12个氨基酸。
在优选的实施方案中，在经修饰的肽中，半胱氨酸(C)为还原形式或二硫桥形式。
在某些实施方案中，本文所述的肽与GRP78结合。
在一些方面，本文所述的肽比其母体对应物更稳定至少1.5倍。在一个实施方案中，本文所述的肽比其母体对应物更稳定至少2倍、3倍或4倍。在一些方面，所述肽的半衰期比其母体对应物高至少1.5倍。在一个实施方案中，本文所述肽的半衰期比其母体对应物高至少2倍、3倍或4倍。
在一些方面，所述肽可以包含将肽的N末端连接到C末端的键。
在一些方面，所述肽的N末端可以被乙酰化。在一些方面，所述肽的C末端被酰胺化。在一些方面，所述肽的N末端可以被乙酰化，并且所述肽的C末端可以被酰胺化。
在另一个优选的实施方案中，所述肽与可检测的部分、化学部分或生化部分或聚乙二醇(PEG)缀合。
所述肽可以与可检测的化学或生化部分诸如荧光团(例如荧光素或罗丹明)缀合。可以使用所述肽的放射性标记，例如用于SPECT或PET成像。如本文所用，“可检测的化学或生化部分”意指出于促进肽的检测的目的，表现出氨基酸序列或可检测的化学或生化部分的化学标签；诸如选自以下的可检测分子：可见的、荧光的、化学发光的或其他可检测的化学标签；在底物存在下可检测的酶，例如具有NBT加BCIP的碱性磷酸酶或具有合适底物的过氧化物酶；可检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白。优选地，所述标签不阻止或阻碍片段穿透到靶细胞中，或以其他方式改变化合物的生物活性。
还优选对C末端CDNF片段或C末端MANF片段进行N和/或C末端修饰，以进一步增加所述肽或片段的稳定性和/或细胞渗透性。CDNF片段或MANF片段末端的乙酰化-酰胺化(即N末端乙酰化和C末端酰胺化)是本领域已知的选择之一(参见例如Marino等人2015,ACSChem.Biol.[ACS化学生物学]10:1754-1764)。
在一些情况下，如本文所述的肽具有以下特性中的至少一种(例如，1、2、3、4、5、6或7种)：(i)所述肽可以剂量依赖性地保护TH阳性神经元免受MPP+毒性；(ii)所述肽减少TH阳性神经元中α-突触核蛋白内含物的数量；(iii)与其母体对应物相比，所述肽在血浆中具有改善的稳定性；(iv)与其母体对应物相比，所述肽在肝细胞中具有改善的稳定性；或(v)与其母体对应物相比，所述肽具有改善的穿过血脑屏障的能力。
一个实施方案提供了用作药物的如本文所述的肽。
由于CDNF/MANF肽有效地保护了多巴胺神经元免于死亡，现有技术诸如WO2009133247和EP 1969003显示，所述肽可以用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(PD)、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、享廷顿氏病(HD)、创伤性脑损伤、药物成瘾和中风。
CDNF和MANF调节未折叠蛋白反应(UPR)途径的信号传导，并且保护细胞免受ER应激相关的细胞死亡。已知ER应激在多种慢性疾病(诸如神经退行性和代谢性疾病和急性损伤)中发挥重要的病理生理作用(Wang和Kaufman,2016)。GRP78(又名BiP和HSPA5)是主要的ER腔伴侣和UPR的主要调节者(Bertolotti等人,2000；Wang和Kaufman,2016)。GRP78与UPR受体IRE1α、PERK和ATF6的动态缔合和解离是调节ER应激下UPR受体信号传导活性的关键步骤。MANF与GRP78的相互作用调节其细胞活动(Yan等人,2019)。
因此，本公开涉及一种用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如CNS疾病或障碍)，或单基因遗传性疾病(具有ER应激作为致病组分)的方法，其中向患者施用药学有效量的长度为8-32个氨基酸的肽，其包含序列C-X1-X2-X3-C(SEQ ID NO:21)、E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E(SEQ ID NO:22)、X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:23)或X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:24)，其中所述肽是所述氨基酸序列的逆向-反转形式。
另一个实施方案提供了所述肽，用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍，诸如神经退行性疾病或障碍。
所述神经退行性疾病或障碍优选地是选自由以下项组成的组的中枢神经系统疾病：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、进行性核上性麻痹、皮克病、单纯性自主神经衰竭、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、脊髓小脑性共济失调、双相情感障碍和周围神经病变，及其疾病和障碍的范围。
神经退行性疾病可以是部分重叠的、动态的、非线性进行性“维度”，存在于广泛的脑蛋白病中。中枢神经系统内多种蛋白病的几种组合的表达可能出现变异性。因此，可能在患者中观察到混合神经病理学的共存。神经退行性疾病的遗传谱可能不同，例如不同的疾病可能在具有相同基因型的同卵双胞胎中表现出来。
另一个实施方案提供了所述肽，用于治疗选自由以下项组成的组的单基因遗传性疾病：Wolcott-Rallison综合征、Wolfram综合征、
Figure BDA0003703486710000271
综合征、Machado-Joseph病和变性视网膜疾病诸如色素性视网膜炎，以及遗传性肾病综合征诸如原发性肾病综合征和常染色体显性多囊肾病。所述单基因遗传性疾病是具有ER应激作为致病组分的疾病。
一个实施方案提供了根据本公开供使用的肽，其中所述肽通过外周施用诸如静脉内、动脉内、皮下、鼻内、眼内、鼓室内或局部施用、肠内、肠胃外或局部途径，包括口服、直肠、舌下或口腔施用、腹膜内、肌肉内、关节内、经皮、耳蜗内、局部眼内或吸入施用，或颅内、鞘内、硬膜外或病变内施用来施用。
在一个实施方案中，所述肽通过皮下施用来施用。
药物组合物
本文公开的一种或多种肽可以被配制用作药物组合物或用于药物组合物中。此类组合物可以被配制或调整，以经由任何途径，例如由适当当局批准的任何途径，施用至受试者。
一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的肽和以下中的至少一种：药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、稳定剂和/或稀释剂。
在一个实施方案中，本公开进一步涉及一种包含长度为8-32个氨基酸的肽的药物组合物，所述肽包含序列C-X1-X2-X3-C(SEQ ID NO:21)、E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E(SEQ IDNO:22)、X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:23)或X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:24)，其中所述肽是任何前述序列的氨基酸序列的逆向-反转形式。
在一些情况下，药物组合物可以包含有效量的一种或多种肽。如本文所用的术语“有效量”和“有效治疗”是指一段时间(包括急性或慢性施用以及周期性或连续施用)内使用的本文所述的一种或多种化合物或药物组合物的量或浓度，其在施用的情况下对于产生预期效果或生理结果是有效的。
在本发明的一个实施方案中，所述肽可以并入到药物组合物中。通过将具有所需纯度的肽与任选的生理学上可接受的载体(诸如纳米载体)、赋形剂、缓冲剂或稳定剂混合来制备本公开的此类组合物用于储存(Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,Allen,Loyd V.,Jr编,(2012))，形式为冻干饼或水性溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如吐温、普朗尼克、聚乙二醇(PEG)，或用于增强鼻至脑递送的赋形剂，诸如壳聚糖、甲基化果胶、基于烷基糖的粘膜吸收增强剂和PEG的羟基脂肪酰基酯。
向患者施用的肽的实际剂量(例如，有效量)可以由物理和生理因素决定，诸如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时进行的治疗性干预、患者的自发病和施用途径。负责施用的医师可以确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一种或多种适当剂量。
还可以将所述肽包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或包埋在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第22版,Allen,Loyd V.,Jr编,(2012)中。还可以应用控释凝胶配制品。
在一个实施方案中，药物组合物可以包含例如，至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可以例如占单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及其中可推导出的任何范围。
在其他非限制性例子中，药物组合物或配制品的剂量可以包含每次施用约1ng/kg/体重的肽、约5ng/kg/体重、约10ng/kg/体重、约50ng/kg/体重、约100ng/kg/体重、约200ng/kg/体重、约350ng/kg/体重、约500ng/kg/体重、1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重至约1000mg/kg/体重的肽或更多，以及其中可推导出的任何范围。在本文所列数值的可推导范围的非限制性例子中，可以基于上述数值，施用一系列约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重的肽等。
本文的方法考虑了施用有效量的化合物或化合物组合物以实现期望的或所述的效果。典型地，本公开的药物组合物将每天施用约1至约6次，诸如每天1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4或2-5次，或者可替代地，作为连续输注。所述药物组合物可以每天施用例如1、2、3、4、5或6次。这种施用可以用作慢性或急性疗法。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和特定施用方式而变化。典型的制剂将含有约5％至约95％的活性化合物(w/w)。可替代地，此类制剂含有约20％至约80％的活性化合物。
可以使用各种技术来确定剂量。所选择的剂量水平可以取决于多种因素，包括例如，所采用的特定化合物的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄或代谢速率，治疗持续时间，与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和/或既往病史，以及医学领域熟知的类似因素。剂量值还可以随着待缓解病症的严重程度而改变。对于任何特定的受试者，可以根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间推移来调整具体的剂量方案。
在一些方面，本公开的化合物的合适日剂量可以是化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。将在给定患者中产生最有效治疗的任何特定化合物的精确施用时间和量将取决于特定化合物的活性、药代动力学和生物利用度、患者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量和药物类型的反应)、施用途径等。
医生或兽医可以开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以按照比为了实现所期望治疗效果所需的水平更低的水平作为药物组合物中所采用的本公开化合物的开始剂量，并逐渐增加剂量直至实现所期望效果。
本文所述的药物组合物可以为适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，配制品被分成含有适量一种或多种化合物的单位剂量。所述单位剂量可以为含有离散量的配制品的包装的形式。非限制性的例子是小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可以包装在单一剂量的不可重新关闭的容器中。例如，可以与防腐剂组合使用多剂量可重新关闭的容器。用于肠胃外注射的配制品可以以单位剂型呈现，例如在安瓿中或含有防腐剂的多剂量容器中。
术语“药学上可接受的载体或佐剂”是指可以与本发明的化合物一起施用至患者，并且在以足以递送治疗量所述化合物的剂量施用时不破坏其药理学活性且无毒的载体或佐剂。
可以在本公开的药物组合物中使用的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)诸如D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、用于药物剂型的表面活性剂，诸如吐温类或其他类似聚合物递送基质、血清蛋白，诸如人血清白蛋白、缓冲物质，诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本公开的药物组合物可以含有任何常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在一些情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲液来调节配制品的pH，以增强所配制的化合物或其递送形式的稳定性。如本文所用的术语肠胃外包括肠胃外、硬膜外、皮下、皮肤内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、硬膜内、病灶内和颅内注射或输注技术。
本公开化合物的有效量可以通过任何可接受的施用方式，以单剂量或多剂量(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或任何合适量的剂量)施用。剂量的数量可以在由上述值中的任两个定义的范围内。无论选择何种施用途径，本公开的化合物和/或本公开的药物组合物都被配制成药学上可接受的剂型。根据本公开的化合物可以通过类推其他药物被配制用于以任何方便的方式施用以在人或兽医学中使用。
在一个方面，本公开提供了药物配制品，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效剂量的一种或多种上述化合物。在一个方面，本文所述的一种或多种化合物被配制用于肠胃外施用。对于肠胃外施用，本文所公开的一种或多种化合物可以被配制成水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂或无菌粉末，它们可以在使用前被重新配制成无菌可注射溶液或分散体。此类配制品可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮或增稠剂。这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物对主题化合物的作用。还可能期望在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。如果期望，所述配制品可以在使用前用例如等渗盐水溶液或右旋糖溶液稀释。在一些实施例中，将化合物配制成水性溶液并静脉内施用。
药物组合物可以为注射用溶液或粉末的形式。此类组合物可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(例如像Tween 80)以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在非毒性的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是甘露醇、水、林格氏溶液以及等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌的非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物同天然的药学上可接受的油诸如橄榄油或蓖麻油(尤其是它们的聚氧乙烯化形式)一样可用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(诸如乳液和/或悬浮液)的类似分散剂。其他常用的表面活性剂诸如吐温类或司盘类(Spans)和/或其他类似乳化剂或生物利用度增强剂(通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型)也可以用于配制目的。
药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、乳液和水性悬浮液、分散体和溶液。在供口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式进行口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用水性悬浮液和/或乳液时，活性成分可以悬浮或溶解在与乳化剂和/或悬浮剂结合的油相中。如果期望，可以添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
本公开的药物组合物还可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。这些组合物可以通过将本公开的组合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，并且因此将在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
可替代地或另外，药物组合物可以通过鼻气雾剂或吸入来施用。此类组合物根据药物配制领域熟知的技术来制备，并且可以被制备成盐水溶液，其采用苄醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂(以提高生物利用度)、氟碳化合物，和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。
在一些情况下，本文公开的一种或多种肽可以例如与载体蛋白缀合。此类缀合组合物可以是单价或多价的。例如，缀合组合物可以包括与载体蛋白缀合的本文公开的一种肽。可替代地，缀合组合物可以包括与载体缀合的本文公开的两种或更多种肽。
本文提供了使用本文所述肽的方法。例如，本文提供的方法可以包括向患者施用如本文所述的肽。患者可以包括哺乳动物和非哺乳动物二者。
可以基于所选择的施用途径和标准药学实践来选择药学上可接受的载体。例如，可以将组合物配制成合适的药物制剂，诸如用于口服施用的溶液、悬浮液、片剂、分散片、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配制品或酏剂，或者用于肠胃外施用和腹膜内注射的无菌溶液或悬浮液，以及透皮贴剂制剂、干粉吸入剂和软膏剂(参见例如，Ansel,Introduction toPharmaceutical Dosage Forms[药物剂型介绍],第四版1985,126)。可以根据药物制剂领域的标准实践将肽和/或免疫球蛋白配制成剂型。参见Alphonso Gennaro编,Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版(1990),宾西法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,Pa)。
对于肠胃外施用，药物组合物可以包含合适的载体或稀释剂，诸如水、油(特别是植物油)、乙醇、盐溶液、水性右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液、甘油或二醇，诸如丙二醇或聚乙二醇。用于肠胃外施用的溶液优选地含有肽和/或活性剂的水溶性盐。还可以添加稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。合适的抗氧化剂包括亚硫酸盐、抗坏血酸、柠檬酸及其盐和EDTA钠。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和三氯叔丁醇。用于肠胃外施用的组合物可以采取水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液的形式。
对于口服施用，药物组合物可以包含一种或多种固体非活性成分，用于制备片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂或其他合适的口服剂型。例如，药物组合物可以包含至少一种赋形剂，诸如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂或润滑剂。
本公开的特征还在于一种可以进一步包含神经细胞的药物组合物。所述神经细胞可以是例如神经元、神经干细胞或神经元前体细胞。
本公开涉及用作药物的药物组合物，其包含如本文所述的肽和以下中的至少一种：药学上可接受的载体、赋形剂、防腐剂、稳定剂和/或稀释剂。
在治疗方法中，向患者施用药学有效量的如本文所定义的肽。换句话说，根据本公开的肽用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍，诸如CNS疾病或障碍、单基因遗传性疾病(具有ER应激作为致病组分)。
所述药物组合物用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍，诸如神经退行性疾病或障碍。
所述神经退行性疾病或障碍是选自由以下项组成的组的中枢神经系统疾病：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、进行性核上性麻痹、皮克病、单纯性自主神经衰竭、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、脊髓小脑性共济失调和周围神经病变。
在一个实施方案中，所述药物组合物通过皮下施用来施用。
肽的施用途径符合已知的方法，以及通过静脉内、动脉内、皮下、鼻内、眼内、鼓室内或局部施用、肠内、肠胃外或局部途径，包括口服、直肠、舌下或口腔施用、颅内、鞘内或硬膜外、腹膜内、肌肉内、关节内、经皮、耳蜗内、局部眼内、病变内或吸入施用，或如下所述的持续释放系统进行的注射或输注的一般途径。
持续释放制剂的合适例子包括含有所述肽的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为成型制品(例如，膜)或微胶囊的形式。持续释放基质的例子包括如由Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究],15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.[化学技术],12:98-105(1982)所述的聚酯、水凝胶，或聚乙烯醇、聚乳酸(美国专利号3,773,919、EP 58,481)或不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人,见上文)。
本公开还涉及用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如CNS疾病或障碍)、单基因遗传性疾病(具有ER应激作为致病组分)的方法，其中向患者施用药学有效量的如本文所定义的肽。优选地，所述片段通过外周施用。口服施用也是优选的施用形式。
本公开还涉及如本文所定义的肽用于制造治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如CNS疾病或障碍)，或单基因遗传性疾病(具有ER应激作为致病组分)的药物的用途。
本公开涉及一种用于在有需要的受试者中治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如神经退行性疾病或障碍)的方法，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述肽的药物组合物。
在一个实施方案中，用于治疗神经退行性疾病或障碍，诸如选自由以下项组成的组的中枢神经系统疾病的方法包括向受试者施用包含如本文所述肽的药物组合物：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、进行性核上性麻痹、皮克病、单纯性自主神经衰竭、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、脊髓小脑性共济失调和周围神经病变。
本公开涉及一种用于治疗选自由以下项组成的组的单基因遗传性疾病的方法：Wolcott-Rallison综合征、Wolfram综合征、
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综合征、Machado-Joseph病和变性视网膜疾病诸如色素性视网膜炎)，以及遗传性肾病综合征诸如原发性肾病综合征和常染色体显性多囊肾病)，所述方法包括向受试者施用包含如本文所述肽的药物组合物。所述单基因遗传性疾病具有ER应激作为致病组分。
有需要的受试者可以是人类。
本公开的肽或包含所述肽的药物组合物可以通过输注或推注连续施用。一般来说，在障碍允许的情况下，应配制和给药所述片段用于位点特异性递送。施用可以是连续的或周期性的。施用可以通过恒定或可编程流动的可植入泵或通过周期性注射来完成。外周或全身施用是优选的，因为本公开显示，逆向-反转肽能够有效穿透神经元细胞膜并穿过体外和体内血脑屏障(BBB)(分别为图8和9B)。其他优选的施用途径是皮下、鞘内、脑室内、鼻内或经皮施用。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于促进多巴胺能神经元存活的方法，所述方法包括使多巴胺能神经元与包含序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的8-32个氨基酸的肽接触的步骤，其中所述肽包含所述氨基酸序列的逆向-反转形式。优选地，所述方法在体外进行，如下文实验部分所示。所述多巴胺能神经元优选地是经培养的非人神经元，诸如小鼠或大鼠交感神经元，或来源于诱导多能细胞(iPSC)的人神经元。
基于由本公开所提供的结果，本公开还涉及一种长度为8-32个氨基酸的肽，其包含序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24，其中所述肽包含所述氨基酸序列的逆向-反转形式，用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍(诸如CNS疾病或障碍)、单基因遗传性疾病(具有ER应激作为致病组分)。
制备肽的方法
合成本公开化合物的方法是本领域已知的。可以使用以下示例性方法。应当理解，各个步骤可以以交替的顺序或次序进行，以得到所期望的化合物。用于合成本文所述化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和脱保护)是本领域已知的并且包括例如，诸如在以下文献中所述的方法：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH Publishers[VCH出版商](1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis[有机合成中的格林保护基团],第3版,John Wiley andSons[约翰威利父子公司](1999)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagentsfor Organic Synthesis[Fieser和Fieser的有机合成试剂],John Wiley and Sons[约翰威利父子公司](1994)；和L.Paquette编,Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis[有机合成试剂百科全书],John Wiley and Sons[约翰威利父子公司](1995)，及其后续版本。
本公开的肽可以通过化学合成方法制备，所述方法是普通技术人员熟知的。参见例如，Fields等人,Synthetic Peptides:A User's Guide[合成肽：用户指南]中的第3章,Grant编,美国纽约的W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],1992,第77页。
制备本文所述肽的一种方式是使用固相肽合成(SPPS)。C末端氨基酸经由与接头分子的酸不稳定键连接到交联的聚苯乙烯树脂。这种树脂不溶于用于合成的溶剂，使得洗去过量的试剂和副产物相对简单和快速。N末端被Fmoc基团保护，所述Fmoc基团在酸中稳定，但可被碱去除。任何侧链官能团都被碱稳定、酸不稳定的基团保护。
本文使用的出版物和其他材料阐明了本发明的背景，特别是提供了关于其实施的另外细节，通过引用并入本文。
对于本领域技术人员来说，显而易见的是，随着技术的进步，本公开的基本思想可以以各种方式实现。因此，本公开及其实施方案不限于以下实施例，而是它们可以在权利要求的范围内变化。
实施例
实施例1
母体和逆向-反转化合物对MPP+损伤的多巴胺能TH阳性神经元的神经保护作用
在体外模型中测试化合物1-20(SEQ ID NO:1-20，母体和逆向-反转)的神经保护作用，其中将大鼠胚胎中脑神经元的原代培养物用神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的活性代谢物MPP+应激。MPP+经由多种毒性机制杀死多巴胺能(TH阳性)神经元，所述机制包括线粒体功能障碍、产生过氧亚硝酸盐、氧化应激、ER应激和诱导凋亡。由于来源于CDNF和MANF的C末端结构域的肽被修饰成逆向-反转肽，因此在这样的模型中测试它们的神经保护活性：全长CDNF蛋白已显示出保护TH+多巴胺神经元的神经保护作用，它们的突触和神经突网络免受MPP+诱导的损伤(图2A)并减少TH+神经元中α-突触核蛋白聚集物的积聚(图2B)。
材料与方法
合成和表征肽的材料与方法。
标准固相肽合成方法用于产生线性(L-aa)和逆向-反转(D-aa)肽。
用于合成肽的通用方案-SPPS
在自动肽合成仪(Biotage Initiator+Alstra或Activotec Activo-P11)上进行固相肽合成。标准Fmoc保护的氨基酸用于肽延伸：Ala、Arg(Pbf)、Asp(tBu)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Gly、His(Trt)、Ile、Lys(Boc)、Leu、Met、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Val和Cys(StBu)。使用在DMF中的20％哌啶进行Fmoc基团的去除，在微波辐射下使用4当量相应氨基酸、3.9当量HBTU、4当量HOBt和8当量DIPEA进行偶联。通过用TFA/H2O/iPr3SiH处理2小时，随后在冷的Et2O中沉淀，将粗肽去保护并从树脂上切下。
在逆向反转肽的情况下，使用标准Fmoc保护的D-氨基酸代替Fmoc保护的L-氨基酸。在启动Biofage起始肽合成仪之前，注意逆向序列，以便获得所需的逆向-反转肽。
使用标准液相色谱-质谱方法获得肽的质量控制。图1(第5列)示出了在肽的MS分析中鉴定的峰。
中脑神经元的培养。
如由Visanji等人,2008所述地培养大鼠多巴胺能神经元。简言之，解剖从15天大的大鼠胚胎(Janvier，法国)获得的中脑，并将中脑曲的腹侧部分(发育中的脑中富含多巴胺能神经元的区域)用于细胞制备。在37℃(溶液的最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA)下，通过胰蛋白酶消化20分钟解离中脑细胞。通过添加含有DNA酶I级II(0.5mg/mL)和10％胎牛血清(FCS)的杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)来终止反应。然后通过流经10ml移液管3次将细胞机械解离。然后将细胞在L15培养基中的BSA(3.5％)层上于+4℃下以180x g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于由补充有B27(2％)、L-谷氨酰胺(2mM)和2％PS溶液以及10ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF)和1ng/mL神经胶质源性神经营养因子(GDNF)的Neurobasal(英杰公司(Invitrogen))组成的确定培养无血清培养基中。使用台盼蓝排除测试在Neubauer血细胞计数器中计数活细胞。将细胞以40 000个细胞/孔的密度接种在96孔板(预先用聚-L-赖氨酸包被)中，并在5％CO2/95％空气气氛中，保持在37℃下的潮湿培养箱中。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。在96孔板上，仅使用60个孔。为了避免任何边缘效应，第一和最后一行和列不用于培养，并且填充无菌水。
测试化合物和MPP+暴露。
在培养的第6天，将CDNF或化合物1-20(SEQ ID NO:1-20，母体和逆向-反转)溶解在培养基中，然后在MPP+应用之前与中脑神经元预孵育4小时。在预孵育化合物后4小时，添加MPP+至4μM的最终浓度，在仍存在化合物的对照培养基中稀释48小时。
免疫染色：TH神经元存活神经突网络和TH神经元中的α-syn聚集。
在中毒后48小时，通过4％多聚甲醛在PBS中的溶液(pH 7.3)在室温下固定细胞20分钟。将细胞在PBS中洗涤两次，然后在室温下用含有0.1％皂苷和1％FCS的PBS溶液封闭透性化和非特异性位点15分钟。接下来，将细胞与(a)在小鼠中产生的稀释度为1:10000的单克隆抗体抗酪氨酸羟化酶(TH)和(b)在兔中产生的稀释度为1:400的多克隆抗体抗α-突触核蛋白(aSyn)抗体在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中在室温下孵育2小时。在室温下，在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中，用稀释度为1:800的第二抗体Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG和稀释度为1:400的Alexa 568山羊抗兔IgG暴露这些抗体1小时。
突触免疫染色：TH神经元和PSD-95(TH/PSD-95神经元之间的重叠)。
在中毒后48小时，除去细胞培养物上清液，并且通过4％多聚甲醛在PBS中的溶液(pH 7.3)在室温下固定细胞20分钟。将细胞在PBS中洗涤两次，然后在室温下用含有0.1％皂苷和1％FCS的PBS溶液封闭透性化和非特异性位点15分钟。然后，将细胞a)在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1:10000的稀释度与小鼠中产生的单克隆抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体在室温下孵育2小时，和b)在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1:200的稀释度与兔中产生的多克隆抗突触后密度蛋白-95(PSD-95)抗体在室温下孵育2小时。这种抗体专门染色突触。在室温下，在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中，用稀释度为1:800的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG和稀释度为1:400的Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG暴露这些抗体1小时。
对于每种情况，使用ImageXpress(Molecular device公司)以10x(对于TH和a-syn为20张照片)或40x放大倍(对于TH和PSD-95为60张照片)自动获取代表整个孔区域的照片。使用定制模块编辑器(Molecular Devices公司)自动确定以下读出：
-TH神经元(TH阳性神经元)总数的分析，
-TH阳性神经元的总神经突网络(以μm为单位)
-aSyn聚集(TH和aSyn染色之间的重叠)
-突触TH阳性神经元的数量(TH和PSD95的重叠，以μm2为单位)。
TH+神经元的总数、TH+神经元的总神经突网络和TH+神经元的突触数量在图2A(CDNF)、图3A(化合物1和2)、图3C(化合物3和4)、图3E(化合物5和6)、图3G(化合物7和8)、图4A(化合物9和10)以及图4C(化合物11和12)、图4E(化合物13和14)、图4G(化合物15和16)、图4I(化合物17和18)、图4K(化合物19和20)中展示。
MPP+损伤后中脑细胞原代培养物的TH阳性神经元中的α-突触核蛋白聚集在图2B(CDNF)、图3B(化合物1和2)、图3D(化合物3和4)、图3F(化合物5和6)、图3H(化合物7和8)、图4B(化合物9和10)以及图4D(化合物11和12)、图4F(化合物13和14)、图4H(化合物15和16)、图4J(化合物17和18)、图L(化合物19和20)中展示。
数据显示，许多逆向-反转肽保护TH阳性神经元及其神经突和突触免受MPP+毒性。此外，这些逆向-反转化合物有效地减少了TH阳性神经元中aSyn内含物的数量，所述aSyn内含物的积聚由MPP+强烈诱导。在大多数情况下，逆向-反转肽(化合物2、4、6、8、10、12、14、16、18和20)的效力与其母体化合物(分别为化合物1、3、5、7、9、11、13、15、17和19)和全长CDNF蛋白相当(图2)。
实施例2
与ER应激反应途径的相互作用
CDNF和MANF通过调节细胞对ER应激的反应来保护细胞免受ER应激诱导的细胞功能障碍或细胞死亡，诸如凋亡。Yan等人(2019)表明，MANF的C末端与GRP78的核苷酸结合结构域(NBD)结合，并调节其细胞活性。此数据表明，MANF(和CDNF)与GRP78(ER腔中最丰富的伴侣蛋白)具有调节性相互作用，而不是底物样的相互作用。使用纯化的重组GRP78-NBD和合成的肽，在无细胞结合测定中评估化合物与GRP78-NBD的结合。由于GRP78还充当未折叠蛋白反应(UPR)途径的三种受体IRE1α、PERK和ATF6的关键配体，因此还测试了化合物的神经保护作用对UPR信号传导的依赖性。图5A示出了GRP78-NBD的MANF结合口袋中化合物6的分子建模。图5B示出了在无细胞结合测定中所选择的化合物与GRP78-NBD的结合亲和力。图5C显示在存在PERK(GSK2606414)和IRE1α(KIRA6)的药理学抑制剂的情况下，化合物14和20的神经保护作用被消除。
材料与方法
分子建模。
经由MAESTRO界面，使用Schrodinger套件版本2018-4(Schrodinger有限公司，美国)的PRIME模块，基于先前求解的GRP78-NBD:MANF复合物的结构，对与这里提到的不同化合物复合的GRP78-NBD(图5B)进行建模。使用模板结构对生成的模型进行人工检查(PDB:6HAB,Yan等人,2019)。还通过查看其Ramachandran图验证所述模型。
无细胞结合测定。
从大肠杆菌(E.coli)细胞中重组过量表达并纯化His标记的GRP78-NBD，并使用NHS-红色染料(Nanotemper Technologies股份有限公司)标记。使用TEV蛋白酶将His标签从蛋白质切下。在PBS环境中，使用Monolith N.A.装置(Nanotemper Technologies股份有限公司)在高功率下，在Monolith N.T标准毛细管中测量不同肽(连续稀释)与经标记的无标签GRP78-NBD的结合。图5B示出了从MST结合实验获得的列表数据。
中脑神经元的培养。
如实施例1中进行神经元细胞培养、MPP+中毒、免疫染色和化合物的神经保护作用分析。在添加测试化合物前1小时，将PERK抑制剂GSK2606414(2μM，西格玛公司(Sigma)或IRE1α抑制剂KIRA6(2μM，西格玛公司)添加至培养物中。
此数据表明，逆向-反转异构化合物与关键的ER应激调节靶分子GRP78结合，并且逆向-反转异构化合物的神经保护作用依赖于UPR信号传导活性。
实施例3
大鼠血浆中母体和逆向-反转化合物的体外代谢稳定性
使用大鼠血浆在120分钟的时间段内研究逆向-反转肽和天然对照肽的代谢稳定性，其中初始测试浓度为1μM。使用LC/QE-orbitrap-MS分析样品。计算的半衰期是基于大鼠血浆中的化合物消失情况。
材料与方法
在37℃下，以浓度1μM将母体或逆向-反转化合物1-8、13-14和19-20(SEQ ID NO:1-8、13-14和19-20)与大鼠血浆(Spraque-Dawley，雄性；400μl)孵育不同的时间点(0、20、40、60或120分钟)。通过乙腈终止孵育。将收集的样品以2272×g离心20分钟并进行分析。使用50％DMSO制备储备溶液，并将化合物以1/100掺入孵育，以具有0.5％的最终DMSO含量。通过使用高分辨率质谱(DDI模式下的QE-Orbitrap-MS)的UHPLC/PDA分析样品，以监测化合物的消失情况。为了分析化合物13-14和19-20，用PBS制备储备溶液，并通过UHPLC-ToF质谱分析样品。将1μM的依那普利用作消失率对照。通过使用母体化合物优化分析方法，以获得最佳色谱特性(峰形和保留时间)和质谱电离。使用具有5mDa窗口的经计算的单一同位素精确质量，从总离子色谱图中提取离子色谱图。消失情况基于LC/MS峰面积，将0分钟标记为100％。使用Excel软件，从时间相比于对数(剩余化合物的％)图的斜率获得代谢的一级速率常数k(分钟-1)。研究化合物的体外半衰期(t1/2)定义为：t1/2＝ln2/k。
在图6A中，每对棒示出未修饰肽(母体)和相应的经修饰肽(逆向-反转)的数据。与它们的母体化合物(分别为化合物7、13和19)相比，一些经测试的逆向-反转肽(化合物8、14和20)在大鼠血浆中显示出显著提高的稳定性。
实施例4
人血浆中母体和逆向-反转化合物的体外代谢稳定性
使用人血浆在120分钟的时间段内研究代谢稳定性，其中初始测试浓度为1μM。使用LC/QE-orbitrap-MS分析样品。计算的半衰期是基于人血浆中的化合物消失情况。
材料与方法
在37℃下，以浓度1μM将母体或逆向-反转化合物1-8(SEQ ID NO:1-8)与人血浆(混合性别，400μl)孵育不同的时间点(0、20、40、60或120分钟)。通过乙腈终止孵育。将收集的样品以2272×g离心20分钟并进行分析。通过使用高分辨率质谱(DDI模式下的QE-Orbitrap-MS)的UHPLC/PDA分析样品，以监测化合物的消失情况。将1uM的溴丙胺太林用作消失率对照。通过使用母体化合物优化分析方法，以获得最佳色谱特性(峰形和保留时间)和质谱电离。使用具有5mDa窗口的经计算的单一同位素精确质量，从总离子色谱图中提取离子色谱图。消失情况基于LC/MS峰面积，将0分钟标记为100％。使用Excel软件，从时间相比于对数(剩余化合物的％)图的斜率获得代谢的一级速率常数k(分钟-1)。研究化合物的体外半衰期(t1/2)定义为：t1/2＝ln2/k。
在图6B中，每对棒示出未修饰肽(母体)和相应的经修饰肽(逆向-反转)的数据。
与大鼠血浆中的稳定性相比，人血浆中的线性肽和逆向-反转肽的稳定性更好，如人血浆中最大报告半衰期所示(特定测试的最大半衰期为795分钟)。与它的母体化合物(化合物7)相比，一种经测试的逆向-反转化合物(化合物8)在大鼠和人血浆中显示出提高的稳定性。
实施例5
大鼠肝细胞中母体和逆向-反转化合物的体外代谢稳定性
使用大鼠(Spraque-Dawley，雄性)肝脏肝细胞研究代谢稳定性0-60分钟(n＝2)，其中初始测试浓度为1μM。使用LC/QE-orbitrap-MS分析样品。计算的半衰期是基于化合物消失情况。
材料与方法
在37℃下，以浓度1μM将母体或逆向-反转化合物1-8、13-14和19-20(SEQ ID NO:1-8、13-14和19-20)与合并的冷冻保存的大鼠肝细胞(Spraque-Dawley，雄性；400μl，对于化合物1-8为100万个活细胞/ml或100μl，对于化合物13-14和19-20为10万个活细胞/ml)孵育不同的时间点(0、10、20、40或60分钟)。通过台盼蓝排除法测定细胞密度和活力。通过乙腈终止孵育。将收集的样品以2272×g离心20分钟并进行分析。通过使用高分辨率质谱(DDI模式下的QE-Orbitrap-MS)(化合物1-8)或HHPLC-ToF质谱(对于化合物13-14和19-20)的UHPLC/PDA分析样品，以监测化合物的消失情况。将1uM的维拉帕米用作消失率对照。通过使用母体化合物优化分析方法，以获得最佳色谱特性(峰形和保留时间)和质谱电离。使用具有5mDa窗口的经计算的单一同位素精确质量，从总离子色谱图中提取离子色谱图。消失情况基于LC/MS峰面积，将0分钟标记为100％。使用Excel软件，从时间相比于对数(剩余化合物的％)图的斜率获得代谢的一级速率常数k(分钟-1)。研究化合物的体外半衰期(t1/2)定义为：t1/2＝ln2/k。
在图7A中，每对棒示出未修饰肽(母体)和相应的经修饰肽(逆向-反转)的数据。
与它们的母体化合物(分别为化合物1、3、5、7、13和19)相比，所有经测试的逆向-反转肽(化合物2、4、6、8、14和20)均在大鼠肝细胞中显示出显著提高的稳定性。
实施例6
人肝细胞中母体和逆向-反转化合物的体外代谢稳定性
使用大鼠(混合性别，雄性)肝脏肝细胞研究代谢稳定性0-60分钟(n＝2)，其中初始测试浓度为1μM。使用LC/QE-orbitrap-MS分析样品。计算的半衰期是基于化合物消失情况。
材料与方法
在37℃下，以浓度1μM将母体或逆向-反转化合物1-8(SEQ ID NO:1-8)与合并的冷冻保存的人肝细胞(混合性别；400μl，100万个活细胞/ml)孵育不同的时间点(0、10、20、40或60分钟)。通过台盼蓝排除法测定细胞密度和活力。通过乙腈终止孵育。将收集的样品以2272×g离心20分钟并进行分析。通过使用高分辨率质谱(DDI模式下的QE-Orbitrap-MS)的UHPLC/PDA分析样品，以监测化合物的消失情况。将1uM的维拉帕米用作消失率对照。通过使用母体化合物优化分析方法，以获得最佳色谱特性(峰形和保留时间)和质谱电离。使用具有5mDa窗口的经计算的单一同位素精确质量，从总离子色谱图中提取离子色谱图。消失情况基于LC/MS峰面积，将0分钟标记为100％。使用Excel软件，从时间相比于对数(剩余化合物的％)图的斜率获得代谢的一级速率常数k(分钟-1)。研究化合物的体外半衰期(t1/2)定义为：t1/2＝ln2/k。
在图7B中，每对棒示出未修饰肽(母体)和相应的经修饰肽(逆向-反转)的数据。
与它们的母体化合物(分别为化合物1、3、5和7)相比，所有经测试的逆向-反转肽(化合物2、4、6和8)均在人肝细胞中显示出显著提高的稳定性。
实施例7
血脑屏障的3D体外模型中母体和逆向-反转化合物的渗透特性
由于开发用于通过外周施用途径治疗CNS疾病的CDNF和MANF源性肽的兴趣，在已建立的血脑屏障体外模型中测试化合物通过血脑屏障的能力。为此目的，在双室体外血脑屏障模型(n＝4)中，以500nM将逆向-反转和母体化合物1-14和17-20(SEQ ID NO:1-14和17-20)孵育2小时，随后收集样品并进行LC-MS/MS分析。
在图8中，每对棒示出未修饰肽(母体)和相应的经修饰肽(逆向-反转)的数据。与母体化合物相比，观察到逆向-反转化合物2、4、6和12(SEQ ID NO:2、4、6和12)具有更好的BBB通过。
与它们的母体化合物(分别为化合物1、3、5和11)相比，四种经测试的逆向-反转化合物(化合物2、4、6和12)显示出改善的通过体外血脑屏障的能力。
材料与方法
星形胶质细胞的原代培养。
从E15胚胎制备大鼠星形胶质细胞。简言之，将妊娠15天的怀孕雌性大鼠(Wistar，Janvier实验室)在(CO2室)中深度麻醉，然后通过颈椎脱臼处死。收集胎儿并立即置于冰冷的L15 Leibovitz培养基中，所述培养基含有2％青霉素(10,000U/mL)和链霉素(10mg/mL)溶液(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)。以0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的最终浓度，将全脑在37℃下用胰蛋白酶-EDTA溶液处理20分钟。将解离的细胞在DMEM 10％胎牛血清中培养。在第4代(P4)使用纯化的星形胶质细胞。
人内皮细胞的培养。在特定的第8代(P8)使用一小瓶HBMEC(原代人脑微血管内皮细胞，ACBRI 376)。
皮层神经元的原代培养。如由Callizot等人,2013所述地培养大鼠皮层神经元，但进行了修改。简言之，将妊娠15天的怀孕雌性大鼠(Wistar，Janvier实验室)在CO2室中深度麻醉，然后通过颈椎脱臼处死。收集胎儿并立即置于冰冷的L15 Leibovitz培养基中，所述培养基含有2％青霉素(10,000U/mL)和链霉素(10mg/mL)溶液(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)。以0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的最终浓度，将皮质在37℃下用胰蛋白酶-EDTA溶液处理20分钟。通过添加含有DNAse I等级II(最终浓度0.5mg/mL)和10％胎牛血清(FCS)的具有4.5g/L葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)来终止解离。通过强制流经10-ml移液管的尖端三次来机械解离细胞。在4℃下，将细胞以515xg离心10分钟。将沉淀重悬于确定培养基中，所述培养基由含有2％B27补充剂溶液、2mmol/L L-谷氨酰胺、2％PS溶液、10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排除测试，在Neubauer血细胞计数器中计数活细胞。在具有插入物的24孔板中，将皮质神经元以255,000个/孔的密度接种在预包被有聚-L-赖氨酸的孔底部，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。每隔一天更换一次培养基。
内皮细胞、星形胶质细胞和原代皮质神经元的共培养。如先前公布(Xue等人,2013但进行了修改，Callizot等人,2017)地进行所述程序。简言之，在第0天，将纯化的星形胶质细胞(P4)在37℃水浴中快速解冻。将细胞立即放入含有10％FCS的DMEM中。将细胞悬浮液在4℃下以515x g离心5分钟，并将沉淀悬浮在含有10％FCS的DMEM F12中。将细胞以45,000个细胞/插入物的密度接种在插入膜(PET，1μm)的外侧，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。在星形胶质细胞接种后三十六(36)小时，将HBMEC(P8)在37℃下的水浴中快速解冻，并立即放入含有10％FCS的DMEM中。将细胞悬浮液在4℃下以515x g离心5分钟，并将沉淀悬浮在EGM-2子弹试剂盒中，所述试剂盒含有5％FCS、1％PS溶液、1.4μM氢化可的松、5μg/mL酸性抗坏血酸、1％脂质混合物、10mM HEPES、1ng/mL bFGF。将细胞以50,000个细胞/插入物的密度接种在插入膜(PET，1μm)的内侧，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。在HBMEC接种后三十六(36)小时(在星形胶质细胞接种后72小时)，将皮质神经元以170,000个/孔的密度接种在聚-L-赖氨酸预包被的孔底部，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。
母体或逆向-反转化合物应用。
在HBMEC接种后五(5)天，在第一次测试内皮细胞层的完整性后，将测试化合物1-14和17-20(SEQ ID NO:1-14和17-20)添加至腔室，并以浓度500nM孵育2小时。
测试化合物的定量。
通过质谱(MS)分析进一步进行近腔上清液中每种化合物的检测和定量。在样品解冻后，通过由质谱定量肽来分析每个细胞培养样品的100μL等分试样。
计算的通过百分比代表应用于近腔室的化合物的百分比，所述百分比是在应用结束时在近腔室中测量的。
实施例8
外周施用至大鼠后逆向-反转化合物的体内药代动力学特征
肽的清除和消除可以由体内多个过程介导，包括代谢和肾脏消除(Li等人,2015；Lin等人,2009)。由于体外研究表明逆向-反转肽的代谢稳定性提高，因此通过外周(静脉内)施用单剂量水平的化合物，然后在外周给药后的不同时间点测定化合物在血浆中的存在，来测试它们的体内药代动力学特性。
图9A表示静脉内施用后的不同时间点，逆向-反转化合物、一种天然化合物和一种天然27个氨基酸对照化合物的血浆浓度。与天然化合物相比，所有经测试的逆向-反转化合物均显示出增加的血浆保留时间。
表1公开了在向大鼠静脉内施用后，逆向-反转化合物和天然27-氨基酸对照化合物的体内药代动力学特性。
表1.在对雄性Sprague-Dawley大鼠进行5mg/kg静脉内推注后，逆向-反转化合物和对照天然肽的体内药代动力学。
Figure BDA0003703486710000471
Figure BDA0003703486710000481
图9B示出了化合物20在雄性Sprague-Dawley大鼠中的脑分布动力学。通过植入引导套管将微透析探针插入大鼠腹侧纹状体，并用aCSF灌注。将化合物18以单次10mg/kg静脉内推注施用，并在4小时内以20分钟的间隔收集微透析样品。通过LC-MS/MS测定化合物的脑间质液(ISF)浓度，并将其归一化为微透析膜的回收率-％(通过体外实验测定)。
与由27个L-氨基酸组成的对照天然肽相比，所有经测试的逆向-反转化合物都显示出改善的血浆半衰期、分布体积和平均停留时间。此外，脑微透析研究显示，在单次静脉内推注后，化合物20渗透至脑实质。
材料与方法
以5mg/kg将测试化合物静脉内(i.v.)施用至雄性Spraque-Dawley大鼠(约6周龄大，每种化合物n＝3)。在化合物施用后2分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时，通过将留置导管(250μl血液)植入到含有抗凝血剂(肝素)的经标记聚丙烯管内，从颈静脉收集血液样品，并在湿冰上保持最多30分钟。将血液样品离心用于血浆分离(4℃，21100G，5分钟)。将含有在乙腈或MeCN中的10％TFA的500ng/ml甲苯磺丁脲用作内标溶液。通过分别将基质掺入到浓度为2-10 000ng/ml的分析物中，将标准样品制备成大鼠血浆，否则作为样品处理。向样品血浆的50μl等分试样中添加200μl内标。将样品混合(150rpm，15分钟)并离心(3000rpm，15分钟)。针对反应监测色谱(峰形和保留时间)偏移和质谱特性(电离效率、MS/MS检测)优化所述分析方法。使用电喷雾电离通过UHPLC-TOF质谱分析上清液。
以0.5mg/kg将测试化合物静脉内(i.v.)施用至雄性Spraque-Dawley大鼠(n＝3)。施用的化合物是化合物6(SEQ ID NO:6)、化合物12(SEQ ID NO:12)、化合物13(SEQ ID NO:13)、化合物14(SEQ ID NO:14)、化合物20(SEQ ID NO:18)和由27种L-氨基酸组成的母体对照化合物。收集血浆样品，随后进行LC-MS/MS分析。由不同时间点的血浆浓度计算药代动力学参数。
对用化合物20(SEQ ID NO:20)静脉内处理的清醒动物的单独组进行脑微透析研究。在微透析实验前一周，在纹状体中以如下坐标给Sprague-Dawley大鼠植入引导套管：AP+0.6mm；L-3.0mm；V-2.8mm，从而为微透析探针的尖端提供最终V-6.8mm。在实验当天，将微透析探针(Eicom A-I：0.22mm O.D.，4mm膜长度，截止50kDa)插入到引导套管中，并用人工脑脊液(aCSF)溶液以0.1μL/分钟的恒定流速灌注。在120-150分钟的稳定期后，将化合物18以单次10mg/kg静脉内推注施用，并在4小时内以20分钟的间隔收集样品。通过UHPLC-MS/MS分析所述化合物的脑组织内液体浓度。当在与体内测试相似的条件下用aCSF灌注时，进行另外的体外测试以确定测试化合物从管、连接器和微透析探针中的回收。将测定的回收百分比(27.4％)用于校正微透析研究中获得的数据。
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序列表
<110> 赫兰提斯制药公司
<120> 逆向-反转肽
<130> P4702EP00
<150> EP19218611.2
<151> 2019-12-20
<160> 66
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(17..20)
<400> 1
Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu
1 5 10 15
Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(4..7)
<400> 2
Lys Glu Ala Cys Ala Arg Cys Glu Glu Gly Trp Ser His Leu Ile Gln
1 5 10 15
Lys Leu Glu Ala Val Arg Met
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(17..20)
<400> 3
Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr
1 5 10 15
Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys
20
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 二硫化物
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<400> 4
Lys Glu Ala Cys Gly Lys Cys Thr Glu Gly Trp Asp Asp Leu Ile Lys
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Val Arg Leu
20
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
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<400> 5
Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
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<400> 6
Thr Lys Glu Ala Cys Ala Arg Cys Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 二硫化物
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<400> 7
Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> 二硫化物
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<400> 8
Ser Lys Glu Ala Cys Gly Lys Cys Thr Glu Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
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<400> 9
Gly Glu Glu Cys Arg Gly Ala Cys Ala Glu Lys Thr
1 5 10
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(5..9)
<400> 10
Thr Lys Glu Ala Cys Ala Gly Arg Cys Glu Glu Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(4..8)
<400> 11
Gly Glu Thr Cys Lys Gly Gly Cys Ala Glu Lys Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(5..9)
<400> 12
Ser Lys Glu Ala Cys Gly Gly Lys Cys Thr Glu Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 13
Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(4..7)
<400> 14
Lys Glu Ala Cys Ala Arg Cys Glu Glu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 15
Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(4..7)
<400> 16
Lys Glu Ala Cys Gly Lys Cys Thr Glu
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 17
Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 18
Glu Ala Cys Ala Arg Cys Glu Glu
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自然序列 (L-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 19
Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆向序列 (D-aa)
<220>
<221> 二硫化物
<222> 连接(3..6)
<400> 20
Glu Ala Cys Gly Lys Cys Thr Glu
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 二硫化物
<222> 4
<223> X3 = A, G或S
<400> 21
Cys Xaa Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I,或S
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X3 = A, G或S
<400> 22
Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X5 = 无, H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X2 = 无, G, A R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> X3 = A, G或S
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> X9 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> X10 = 无, T, S, A, I或N
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> X11 = 无, D或E
<400> 23
Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X12 = 无, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X13 = 无或D
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X14 = 无, L或W
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X15 = 无, A, S, T, E或N
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X16 = 无, S或T
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X17 = 无, V或D
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> X18 = 无, D或A
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X19 = 无或L
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X20 = 无, R, K, S或W
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> X21 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> X22 = 无, M, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> X24 = A, K, T, L或V
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> X25 = Q, K或R
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> X26 = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> X5 = H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 28
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 29
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 30
<223> X3 = A, G或S
<220>
<221> 变体
<222> 34
<223> X9 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 35
<223> X10 = 无,或T, S, A, I或N
<220>
<221> 变体
<222> 36
<223> X11 = 无, D或E
<400> 24
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu
1 5 10 15
Lys Xaa Ile Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala
20 25 30
Glu Xaa Xaa Xaa
35
<210> 25
<211> 37
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 自然人CDNF肽
<400> 25
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys
1 5 10 15
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu
20 25 30
Ala Pro Lys Tyr Ala
35
<210> 26
<211> 37
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 自然人MANF 肽
<400> 26
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
1 5 10 15
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
20 25 30
Met Pro Lys Tyr Ala
35
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X16 = 无, S或T
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X17 = 无, V或D
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X18 = 无, D或A
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X19 = 无或L
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X20 = 无, R, K, S或W
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X21 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> X22 = 无, M, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> X24 = A, K, T, L或V
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> X25 = Q, K或R
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> X26 = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> X5 = 无, H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> X3 = A, G或S
<220>
<221> 变体
<222> 30
<223> X9 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 31
<223> X10 = 无, T, S, A, I或N
<220>
<221> 变体
<222> 32
<223> X11 = 无, D或E
<400> 27
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X15 = 无, A, S, T, E或N
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X16 = 无, S或T
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X17 = 无, V或D
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X18 = 无, D或A
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X19 = 无或L
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X20 = 无, R, K, S或W
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> X21 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X22 = 无, M, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> X24 = A, K, T, L或V
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> X25 = Q, K或R
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> X26 = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> X5 = 无, H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> X3 = A, G或S
<220>
<221> 变体
<222> 31
<223> X9 = 无或K
<400> 28
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa
20 25 30
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X14 = 无, L或W
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X15 = 无, A, S, T, E或N
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X16 = 无, S或T
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X17 = 无, V或D
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X18 = 无, D或A
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X19 = 无或L
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> X20 = 无, R, K, S或W
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X21 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X22 = 无, M, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> X24 = A, K, T, L或V
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> X25 = Q, K或R
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> X26 = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> X5 = 无, H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 24
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 26
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 28
<223> X3 = A, G或S
<220>
<221> 变体
<222> 32
<223> X9 = 无或K
<400> 29
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa
20 25 30
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> X13 = 无或D
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X14 = 无, L或W
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X15 = 无, A, S, T, E或N
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> X16 = 无, S或T
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> X17 = 无, V或D
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> X18 = 无, D或A
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> X19 = 无或L
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> X20 = 无, R, K, S或W
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> X21 = 无或K
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> X22 = 无, M, L, I或V
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> X23 = 无或R
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> X24 = A, K, T, L或V
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> X25 = Q, K或R
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> X26 = I或V
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> X5 = 无, H, D, Q, R, Y, N或S
<220>
<221> 变体
<222> 21
<223> X6 = 无, S, D, G, N或R
<220>
<221> 变体
<222> 22
<223> X7 = 无或W
<220>
<221> 变体
<222> 23
<223> X8 = 无或G
<220>
<221> 变体
<222> 25
<223> X4 = E, T, V, D, M或G
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> X1 = R, K, I, G, A或S
<220>
<221> 变体
<222> 28
<223> X2 = 无, G, A, R, K, I或S
<220>
<221> 变体
<222> 29
<223> X3 = A, G或S
<400> 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys
1 5 10 15
Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu
20 25 30
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 31
Lys Asp Glu Leu
1
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 32
Cys Arg Ala Cys
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 33
Cys Lys Gly Cys
1
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> X1 = K或R
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> X2 = G或A
<400> 34
Cys Xaa Xaa Cys
1
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 35
Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu
1 5
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 36
Thr Cys Lys Gly Cys Ala
1 5
<210> 37
<211> 187
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 全长CDNF (NCBI参考序列: NP_001025125.2)
<400> 37
Met Trp Cys Ala Ser Pro Val Ala Val Val Ala Phe Cys Ala Gly Leu
1 5 10 15
Leu Val Ser His Pro Val Leu Thr Gln Gly Gln Glu Ala Gly Gly Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Asp Cys Glu Val Cys Lys Glu Phe Leu Asn Arg Phe Tyr
35 40 45
Lys Ser Leu Ile Asp Arg Gly Val Asn Phe Ser Leu Asp Thr Ile Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Ile Ser Phe Cys Leu Asp Thr Lys Gly Lys Glu Asn Arg
65 70 75 80
Leu Cys Tyr Tyr Leu Gly Ala Thr Lys Asp Ala Ala Thr Lys Ile Leu
85 90 95
Ser Glu Val Thr Arg Pro Met Ser Val His Met Pro Ala Met Lys Ile
100 105 110
Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr
115 120 125
Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val
130 135 140
Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala
145 150 155 160
Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu
180 185
<210> 38
<211> 182
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 全长MANF (NCBI参考序列: NP_006001.5)
<400> 38
Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val
20 25 30
Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp
35 40 45
Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys
50 55 60
Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala
65 70 75 80
Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu
85 90 95
Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys
100 105 110
Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser
115 120 125
Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu
130 135 140
Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr
145 150 155 160
Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala
165 170 175
Ser Ala Arg Thr Asp Leu
180
<210> 39
<211> 49
<212> PRT
<213> 人类
<400> 39
Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu
1 5 10 15
Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala
20 25 30
Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr
35 40 45
Ala
<210> 40
<211> 37
<212> PRT
<213> 人类
<400> 40
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys
1 5 10 15
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu
20 25 30
Ala Pro Lys Tyr Ala
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> 人类
<400> 41
Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu
1 5 10 15
Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala
20 25 30
Glu Lys Thr
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 42
Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr
20 25 30
<210> 43
<211> 49
<212> PRT
<213> 人类
<400> 43
Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala
20 25 30
Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr
35 40 45
Ala
<210> 44
<211> 37
<212> PRT
<213> 人类
<400> 44
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
1 5 10 15
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
20 25 30
Met Pro Lys Tyr Ala
35
<210> 45
<211> 35
<212> PRT
<213> 人类
<400> 45
Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala
20 25 30
Glu Lys Ser
35
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人类
<400> 46
Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys
1 5 10 15
Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser
20 25 30
<210> 47
<211> 61
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 人CDNF (NP_001025125.2)
<400> 47
Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 48
<211> 61
<212> PRT
<213> 马属
<220>
<223> 马CDNF (XP_001498617.2)
<400> 48
Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Asn Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Met His Pro Lys Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 49
<211> 61
<212> PRT
<213> 牛属
<220>
<223> 野牛CDNF (XP_010858254.1)
<400> 49
Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Gly Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Gln Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 50
<211> 61
<212> PRT
<213> 猪属
<220>
<223> 猪CDNF (XP_003130787.1)
<400> 50
Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Tyr Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Thr Glu Thr Pro Pro Gln Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 51
<211> 61
<212> PRT
<213> 犬属
<220>
<223> 狗CDNF (XP_848954.2)
<400> 51
Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Ile Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Thr Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Ala His Pro Lys Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 52
<211> 61
<212> PRT
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠CDNF (NP_808315.1)
<400> 52
Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Gln Arg Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Val Asn Leu Ile Arg Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Val Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 53
<211> 61
<212> PRT
<213> 仓鼠属
<220>
<223> 仓鼠CDNF (XP_027261009.1)
<400> 53
Asn Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Arg Asp Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Val Glu Ile His Pro Gln Ile Glu Leu
50 55 60
<210> 54
<211> 61
<212> PRT
<213> 短吻鳄属
<220>
<223> 短吻鳄CDNF (XP_019343086.1)
<400> 54
Lys Tyr Glu Arg Lys Leu Asp Leu Thr Ser Val Asp Leu Ser Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Arg Lys Ile Leu Asp Ser Trp Gly Glu Val Cys
20 25 30
Lys Ala Cys Ile Glu Lys Thr Glu Phe Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Ala Pro Pro Asn Ser Arg Ala Asp Leu
50 55 60
<210> 55
<211> 61
<212> PRT
<213> 海豚属
<220>
<223> 海豚CDNF (XP_026977721.1)
<400> 55
Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met
1 5 10 15
Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Tyr Ser Trp Gly Glu Glu Cys
20 25 30
Arg Ala Cys Val Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu
35 40 45
Ala Pro Lys Tyr Thr Ala Thr Tyr Pro Lys Thr Glu Leu
50 55 60
<210> 56
<211> 65
<212> PRT
<213> 斑马鱼
<220>
<223> 斑马鱼CDNF (NP_001116753.1)
<400> 56
Arg Tyr Glu Arg Leu Val Leu Asp Trp Ser Thr Asp Ala Leu Ser Lys
1 5 10 15
Met Arg Ala Leu Glu Leu Lys Arg Val Leu Ala Ser Trp Gly Glu Glu
20 25 30
Cys Arg Ala Cys Leu Glu Lys Ser Glu Phe Ile Ala Leu Ile Gln Glu
35 40 45
Val Ala Pro Lys His Ser Ala Ser Glu His Arg Ala His Thr Glu Glu
50 55 60
Phe
65
<210> 57
<211> 63
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<223> 人MANF (NP_006001.5)
<400> 57
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 58
<211> 63
<212> PRT
<213>马属
<220>
<223>马MANF (NP_001184244.1)
<400> 58
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 59
<211> 63
<212> PRT
<213> 野牛属
<220>
<223> 野牛MANF (XP_010850093.1)
<400> 59
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 60
<211> 63
<212> PRT
<213> 猪属
<220>
<223> 猪MANF (NP_001231584.1)
<400> 60
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 61
<211> 63
<212> PRT
<213> 犬属
<220>
<223> 狗MANF (XP_003639808.2)
<400> 61
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Arg Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Arg Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 62
<211> 63
<212> PRT
<213> 小鼠属
<220>
<223> 小鼠MANF (NP_083379.2)
<400> 62
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Met Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 63
<211> 63
<212> PRT
<213> 仓鼠属
<220>
<223> 仓鼠MANF (RLQ67668)
<400> 63
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Met Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 64
<211> 63
<212> PRT
<213> 短吻鳄属
<220>
<223> 短吻鳄MANF (XP_014455597.1)
<400> 64
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 65
<211> 63
<212> PRT
<213> 海豚属
<220>
<223> 海豚MANF (XP_026976745.1)
<400> 65
Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu
50 55 60
<210> 66
<211> 63
<212> PRT
<213> 斑马鱼
<220>
<223> 斑马鱼MANF (NP_001070097.1)
<400> 66
Lys Tyr Asp Lys Gln Val Asp Leu Ser Ser Val Asp Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Lys Val Lys Asp Leu Lys Lys Ile Leu Glu Glu Trp Gly Glu Ser Cys
20 25 30
Lys Gly Cys Val Glu Lys Ser Asp Phe Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu
35 40 45
Met Pro Lys Tyr Ala Pro Ser Ala Ala Lys Ala Arg Thr Asp Leu
50 55 60

Claims (28)

1.一种由长度为8-32个氨基酸组成的肽或其药学上可接受的盐，其包含C-X1-X2-X3-C(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；并且
X3选自由以下项组成的组：A、G和S。
2.根据权利要求1所述的肽，其包含E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；并且
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其包含X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G；
X5不存在或选自由以下项组成的组：H、D、Q、R、Y、N和S；
X6不存在或选自由以下项组成的组：S、D、G、N和R；
X7不存在或是W；
X8不存在或是G；
X9不存在或是K；
X10不存在或选自由以下项组成的组：T、S、A、I和N；并且
X11不存在或选自D和E。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肽，其包含X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的逆向-反转形式，
其中
X1选自由以下项组成的组：R、K、I、G、A和S；
X2不存在或选自由以下项组成的组：G、A、R、K、I和S；
X3选自由以下项组成的组：A、G和S；
X4选自由以下项组成的组：E、T、V、D、M和G；
X5不存在或选自由以下项组成的组：H、D、Q、R、Y、N和S；
X6不存在或选自由以下项组成的组：S、D、G、N和R；
X7不存在或是W；
X8不存在或是G；
X9不存在或是K；
X10不存在或选自由以下项组成的组：T、S、A、I和N；并且
X11不存在或选自D和E，
X12不存在或选自由以下项组成的组：L、I和V；
X13不存在或是D；
X14不存在或选自L和W；
X15不存在或选自由以下项组成的组：A、S、T、E和N；
X16不存在或选自S和T；
X17不存在或选自V和D；
X18不存在或选自D和A；
X19不存在或是L；
X20不存在或选自由以下项组成的组：R、K、S和W；
X21不存在或是K；
X22不存在或选自由以下项组成的组：M、L、I和V；
X23不存在或是R；
X24选自由以下项组成的组：A、K、T、L和V；
X25选自由以下项组成的组：Q、K和R；并且
X26选自I和V。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的肽，其由选自由以下项组成的组的序列组成：
KEACARCEEGWSHLIQKLEAVRM(SEQ ID NO:2)、
KEACGKCTEGWDDLIKKLEKVRL(SEQ ID NO:4)、
TKEACARCEEG(SEQ ID NO:6)、
SKEACGKCTEG(SEQ ID NO:8)、
TKEACAGRCEEG(SEQ ID NO:10)、
SKEACGGKCTEG(SEQ ID NO:12)、
KEACARCEE(SEQ ID NO:14)、
KEACGKCTE(SEQ ID NO:16)、
EACARCEE(SEQ ID NO:18)和
EACGKCTE(SEQ ID NO:20)，
其中所述肽的所有氨基酸都是D-氨基酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽保护免受内质网(ER)应激诱导的细胞功能障碍或细胞死亡。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的肽，其中所述肽与GRP78结合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的肽，其中半胱氨酸为还原形式或二硫桥形式。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的肽，其中所述肽的N末端被乙酰化。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的肽，其中所述肽的C末端被酰胺化。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的肽，其中所述肽的N末端被乙酰化，并且所述肽的C末端被酰胺化。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的肽，其中所述肽是伪肽。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的肽，其中所述肽是环肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的肽，其与可检测的化学部分、生化部分或聚乙二醇(PEG)缀合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的肽，其中所述肽具有以下特性中的至少一种：
(i)可以剂量依赖性地保护TH阳性神经元免受MPP+毒性；
(ii)减少TH阳性神经元中α-突触核蛋白内含物的数量；
(iii)与其母体对应物相比，在血浆中具有改善的稳定性；
(iv)与其母体对应物相比，在肝细胞中具有改善的稳定性；
(v)与其母体对应物相比，具有改善的穿过所述血脑屏障的能力。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的肽，其用作药物。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的肽，其用于治疗退行性疾病或障碍、慢性疾病或障碍、或进行性疾病或障碍，诸如神经退行性疾病或障碍。
18.根据权利要求17所述的供使用的肽，其中所述神经退行性疾病或障碍是选自由以下项组成的组的中枢神经系统疾病：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、进行性核上性麻痹、皮克病、单纯性自主神经衰竭、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、脊髓小脑性共济失调和周围神经病变，及其疾病和障碍的范围。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的肽，其用于治疗具有内质网(ER)应激作为致病组分的单基因遗传性疾病，所述单基因遗传性疾病选自由以下项组成的组：Wolcott-Rallison综合征、Wolfram综合征、
Figure FDA0003703486700000051
综合征、Machado-Joseph病和变性视网膜疾病诸如色素性视网膜炎，以及遗传性肾病综合征诸如原发性肾病综合征和常染色体显性多囊肾病。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的供使用的肽，其中所述肽通过外周施用诸如静脉内、动脉内、皮下、鼻内、眼内、鼓室内或局部施用、肠内、肠胃外或局部途径，包括口服、直肠、舌下或口腔施用、腹膜内、肌肉内、关节内、经皮、耳蜗内、局部眼内或吸入施用，或颅内、鞘内、硬膜外或病变内施用来施用。
21.根据权利要求20所述的供使用的肽，其中所述肽通过皮下施用来施用。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的肽和以下中的至少一种：药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂、防腐剂、稳定剂和/或稀释剂。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其用作药物。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，其用于治疗退行性、慢性或进行性疾病或障碍，诸如神经退行性疾病或障碍。
25.根据权利要求24所述的供使用的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或障碍是选自由以下项组成的组的中枢神经系统疾病：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶变性、路易体痴呆、轻度认知障碍、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、创伤性脊髓损伤、进行性核上性麻痹、皮克病、单纯性自主神经衰竭、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、脊髓小脑性共济失调和周围神经病变，及其疾病和障碍的范围。
26.根据权利要求22所述的药物组合物，其用于治疗具有内质网(ER)应激作为致病化合物的单基因遗传性疾病，所述单基因遗传性疾病选自由以下项组成的组：Wolcott-Rallison综合征、Wolfram综合征、
Figure FDA0003703486700000061
综合征、Machado-Joseph病和变性视网膜疾病诸如色素性视网膜炎，以及遗传性肾病综合征诸如原发性肾病综合征和常染色体显性多囊肾病。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的供使用的药物组合物，其中所述组合物通过外周施用诸如静脉内、动脉内、皮下、鼻内、眼内、鼓室内或局部施用、肠内、肠胃外或局部途径，包括口服、直肠、舌下或口腔施用、腹膜内、肌肉内、关节内、经皮、耳蜗内、局部眼内或吸入施用，或颅内、鞘内、硬膜外或病变内施用来施用。
28.根据权利要求27所述的供使用的药物组合物，其中所述组合物通过皮下施用来施用。
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