JP2018511326A - プロトキシン−ii変異体及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法119(e)のもと、2015年4月2日に出願された米国特許仮出願第62/142,069号に対する優先権の利益を主張し、その出願の全開示内容が参照により本明細書に援用される。
本発明は、プロトキシン−II変異体、それをコードする合成ポリヌクレオチド、及びそれらを製造及び使用する方法に関する。
X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14X15X16CX17LWCX18KKLX19(配列番号432)を含む単離されたプロトキシン−II変異体であり、
X1は、G、P、A又は欠失であり;
X2は、P、A、又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、Q、R、K、A、S又はYであり;
X5は、K、S、Q又はRであり;
X6は、M又はFであり;
X7は、T、S、R、K又はQであり;
X8は、D、T又はアスパラギル−4−アミノブタンであり;
X9は、S、A、R、I又はVであり;
X10は、E、R、N、K、T、Q、Y又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X11は、R又はKであり;
X12は、K、Q、S、A又はFであり;
X13は、E、Q、D、L、N又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X14は、G、Q又はPであり;
X15は、M又はFであり;
X16は、V又はSであり;
X17は、R、T又はN−ωメチル−L−アルギニンであり;並びに、
X18は、K又はRであり;並びに、
X19は、W又はLであり、
N末端伸張又はC末端伸張を任意に有する。
X1は、G、P、A、又は欠失であり;
X2は、P、A、又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、S、A、R、I又はVであり;
X5は、E、R、N、K、T、Q、Y又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X6は、K、Q、S、A又はFであり;
X7は、E、Q、D、L、N又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X8は、G、Q又はPであり;
X9は、M又はFであり;
X10は、L又はVであり;並びに、
X11は、W又はLである。
X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14FX15CX16LWCX17KKLW(配列番号403)を含む単離されたプロトキシン−II変異体であり、
X1は、G、P、A又は欠失であり;
X2は、P、A又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、Q、R、K、A又はSであり;
X5は、K、S、Q又はRであり;
X6は、M又はFであり;
X7は、T、S、R、K又はQであり;
X8は、D又はTであり、
X9は、S、A又はRであり、
X10は、E、R、N、K、T又はQであり、
X11は、R又はKであり;
X12は、K、Q、S又はAであり;
X13は、E、Q又はDであり;
X14は、G又はQであり;
X15は、V又はSであり;
X16は、K又はRであり;並びに、
X17は、K又はRであり;
N末端伸長又はC末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約1×10−7M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害し、このIC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定される。
X1は、Q、R、K、A又はSであり;
X2は、K、S、Q又はRであり;
X3は、M又はFであり;
X4は、T、S、R、K又はQであり;
X5は、D又はTであり、
X6は、S、A又はRであり、
X7は、E、R、N、K、T又はQであり、
X8は、R又はKであり;
X9は、K、Q、S又はAであり;
X10は、E、Q又はDであり;
X11は、G又はQであり;
X12は、F又はMであり、
X13は、V又はSであり;
X14はR又はTであり;並びに
X15はK又はRである。
X1は、Y、Q、A、S又はRであり、
X2は、T又はSであり、
X3は、S、R又はAであり、
X4は、E、T又はNであり、
X5は、E又はQであり、
X6は、V又はSであり;
X7は、R又はTであり;並びに
X8は、K又はRであり;
プロトキシン−II変異体は、約3×10−8M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害し、ヒトNav1.7を選択的に阻害する。
X1は、T又はSであり、
X2は、S、R又はAであり、
X3は、E、T又はNであり、
X4は、E又はQであり、
X5は、V又はSであり;
X6は、R又はTであり;並びに
X7は、K又はRである。
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号1に従うときに、位置7におけるQ、及び位置30におけるLを有し、
ポリペプチドはヒトNav1.7の活性を阻害する。
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号1に従うときに、位置1におけるQ、位置7におけるQ、及び位置19におけるFを有し、
ポリペプチドは、約30×10−9M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害し、このIC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定される。
ポリペプチドはNav1.7を選択的に阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−II変異体は、痛みの症状又は感覚ニューロン機能障害若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患の治療、低減、又は緩和が望ましい任意の療法において用いてもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−II変異体は、薬学的に許容されるビヒクル又は担体中に製剤化されてもよい。本発明の一実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン−II変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
以下に、本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の更なる実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの1つ1つにもまた関係する。
1)X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14FX15CX16LWCX17KKLW(配列番号403)の配列を含む単離されたプロトキシン−II変異体であり、
X1は、G、P、A又は欠失であり;
X2は、P、A又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、Q、R、K、A又はSであり;
X5は、K、S、Q又はRであり;
X6は、M又はFであり;
X7は、T、S、R、K又はQであり;
X8は、D又はTであり、
X9は、S、A又はRであり、
X10は、E、R、N、K、T又はQであり、
X11は、R又はKであり;
X12は、K、Q、S又はAであり;
X13は、E、Q又はDであり;
X14は、G又はQであり;
X15は、V又はSであり;
X16は、R又はTであり;並びに
X17は、K又はRであり;
N末端伸長又はC末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約1×10−7M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害し、このIC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定される。
2)N末端伸長が、配列番号372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384又は385のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のプロトキシン−II変異体。
3)C末端伸長が、配列番号374、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396又は397のアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のプロトキシン−II変異体。
4)N末端及び/又はC末端伸長が、プロトキシン−II変異体にリンカーを介して結合される、請求項2又は3に記載のプロトキシン−II変異体
5)リンカーが、配列番号383、392、398、399、400、401又は402のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のプロトキシン−II変異体。
6)配列番号30、40、44、52、56、56、59、65、78、109、110、111、114、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、又は368のアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
7)約3×10−8M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
8)約3×10−8M〜約1×10−9MのIC50値でヒトNav1.7活性を阻害する、請求項7に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
9)アミノ酸配列GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11FX12CX13LWCX14KKLW(配列番号:404)を含み、
X1は、Q、R、K、A又はSであり;
X2は、K、S、Q又はRであり;
X3は、M又はFであり;
X4は、T、S、R、K又はQであり;
X5は、D又はTであり、
X6は、S、A又はRであり、
X7は、E、R、N、K、T又はQであり、
X8は、R又はKであり;
X9は、K、Q、S又はAであり;
X10は、E、Q又はDであり;
X11は、G又はQであり;
X12は、V又はSであり;
X13は、R又はTであり;並びに
X14は、K又はRである、請求項7又は8に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
10)配列番号56、78、111、114、117、118、119、122、123、129、130、131、132、133、134、135、136、138、139、140、141、142、145、146、147、149、150、151、152、153、154、156、158、159、165、172、173、175、177、178、183、184、185、186、189、190、193、197、199、207、210、211、216、217、224、266、273、282又は335のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
11)変異体が、ヒトNav1.7を選択的に阻害する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
12)配列GPX1CQKWMQX2CDX3X4RKCCX5GFX6CX7LWCX8KKLW(配列番号405)を含み、
X1は、Y、Q、A、S又はRであり、
X2は、T又はSであり、
X3は、S、R又はAであり、
X4は、E、T又はNであり、
X5は、E又はQであり、
X6は、V又はSであり;
X7は、R又はTであり;並びに
X8は、K又はRである、請求項11に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
13)配列番号56、59、65、78、111、114、117、118、119、121、122、123、129、130、133、150、190、217、281、324、325又は326のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
14)配列GPQCQKWMQX1CDX2X3RKCCX4GFX5CX6LWCX8KKLW(配列番号406)を含み、
X1は、T又はSであり、
X2は、S、R又はAであり、
X3は、E、T又はNであり、
X4は、E又はQであり、
X5は、V又はSであり;
X6は、R又はTであり;並びに
X7は、K又はRである、請求項12に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
15)単離されたプロトキシン−II変異体であって、配列番号78(GPQCQKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW−COOH)のアミノ酸配列と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を含み、
a)アミノ酸配列が、残基番号付けが配列番号1に従うときに、位置1におけるQ、位置7におけるQ、及び位置19におけるFを有し、
b)ポリペプチドが、約30×10−9M以下のIC50値でIC50値の測定を、阻害し、このIC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定され、
c)ポリペプチドが、Nav1.7を選択的に阻害する、単離されたプロトキシン−II変異体。
16)遊離C末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
17)半減期延長部分に結合した、請求項1〜16のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体を含む、単離された融合タンパク質。
18)半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン(HSA)、アルブミン結合ドメイン(ABD)、Fc又はポリエチレングリコール(PEG)である、請求項17に記載の融合タンパク質。
19)請求項12又は15に記載のプロトキシン−II変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
20)請求項19に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
21)請求項20に記載のベクターを含む、宿主細胞。
22)単離されたプロトキシン−II変異体を製造する方法であって、請求項21に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたプロトキシン−II変異体を回収することとを含む、方法。
23)請求項1、6、12、13又は15に記載の単離されたプロトキシン−II変異体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
24)対象におけるNav1.7を介した痛みを治療する方法であって、請求項1〜16のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体を、痛みの治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
25)痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症(PE)、発作性高度疼痛症(PEPD)、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害(PDN)、疹後神経痛(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項24に記載の方法。
26)プロトキシン−II変異体が、末梢に投与される、請求項24に記載の方法。
27)プロトキシン−II変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項24に記載の方法。
28)対象がヒトである、請求項24に記載の方法。
29)痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項1〜16のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。
30)痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症(PE)、発作性高度疼痛症(PEPD)、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害(PDN)、疹後神経痛(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項29に記載の使用のためのプロトキシン−II変異体。
31)プロトキシン−II変異体が、末梢に投与される、請求項29又は30に記載の使用のためのプロトキシン−II変異体。
32)プロトキシン−II変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項29、30又は31に記載の使用のためのプロトキシン−II変異体。
プロトキシン−IIの一部位限定アミノ酸置換スキャニングライブラリーを設計し、選択性、ペプチド収率、及び同質性をどの程度まで向上させることができるかを評価した。
設計されたプロトキシン−II変異体遺伝子の生成を、米国特許第6,521,427号に記載された合成遺伝子構築技術を用いて行った。設計されたペプチド変異体のアミノ酸配列を、ヒトの高頻度コドンを用いてDNA配列に逆翻訳したた。各変異体遺伝子のDNA配列を、DNAクローニング部位を含むベクターDNAの一部と共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のDNAフラグメントに組み」立てた。組み立てられたDNAフラグメントをPCRにより増幅した後、PCR産物をプールとしてクローニングした。プールしたPCR産物を、適切な制限酵素を用いて消化し、各毒素変異体遺伝子をベクター内に含まれるシグナルペプチド及び融合パートナ(6xHis−HSA−リンカー−HRV3C切断可能なペプチド(配列番号108として開示された「6xHis」)に融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標準的な分子生物学の手法を用いて、各設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドDNAを精製し、配列を確認した後、プロトキシン−IIペプチド変異体融合タンパク質を標準的な方法を用いて発現させた。
HEK 293−F細胞を293 Freestyle(商標)培地(Invitrogen Cat#12338)内で維持し、細胞濃度が1.5〜2.0×106細胞/mLとなったときに分割した。加湿インキュベーター(37℃及び8% CO2に設定)内で懸濁液を125RPMで振とうしながら、細胞培養を行った。HEK 293F細胞を1.0×106細胞/mLに希釈した後、DNA/脂質複合体を用いて一過性にトランスフェクションした。複合体を生成するために、トランスフェクション1mL当たり1.25μgのDNAを1.0mLのOptiPro培地(Invitrogen Cat#12309)で希釈し、1.25mLのFreestyle(商標)Maxトランスフェクション試薬(Invitrogen Cat #16447)を、1.0mLのOptiPro培地で希釈した。DNA及びMaxトランスフェクション試薬を一緒に混合し、細胞に添加する前に、10分間室温でインキュベートした。加湿インキュベーター(37℃及び8% CO2に設定)内で、トランスフェクトされた細胞を、125RPMで振盪しながら4日間維持した。5,000×gにおいて10分間遠心分離を行い、0.2μmフィルタ(Corning;Cat#431153)を通して濾過した後、Amicon Ultra Concentrator 10K(Cat#UFC901096)を使用して3,750×gで約10分間遠心分離し、上澄みを細胞から分離した。
プロトキシン−II変異体を、実施例1に示したHSA融合タンパク質として発現させ、プロトキシン−II変異体ペプチドをHRV3Cプロテアーゼによって切断した後、精製を行った。プロトキシン−II変異体の効率的な精製に関し、2つの方法を試験した。
RP−HPLCによるプロトキシン−II変異体の精製
1mLのHisTrapHPカラム(GE Healthcare Cat#17−5247−01)を用い、IMACにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。AKTA Xpressを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、HRV3Cプロテアーゼ(1μgプロテアーゼ/150μg融合物)を用いて一晩消化させた。
1mLのHisTrapHPカラム(GE Healthcare Cat#17−5247−01)を用い、IMACにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。AKTA Xpressを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、HRV3Cプロテアーゼ(1μgプロテアーゼ/150μg融合)を用いて一晩消化させた。切断後のサンプルを50kDa分子量カットオフ遠心フィルタユニット(Millipore UFC805096)内に充填し、切断されたペプチドを濾液分画内に回収した。
選択プロトキシン−II変異体を膜脱分極及び全細胞パッチクランプアッセイにおいて特性評価を行い、その効能及びNav1.7に対する選択性を評価した。
生成されたペプチドによる、Nav1.7作動薬ベラトリジン(3−ベラトロイルベラセビン;Biomol、Catalog#NA125)によって誘発される膜脱分極の阻害能を、FLIPR(登録商標)Tetra上のFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)アッセイを使用し、DISBAC2(3)(Invitrogen、K1018)を電子受容体として、PTS18(トリナトリウム8−オクタデシルオキシピレン−1,3,6−トリスルホネート)(Sigma)をドナーとして用いて、ドナーを390〜420nmで励起して、FRETを515〜575nmで測定することによって、測定した。
ヒトNav1.5(配列番号105)、Nav1.7(配列番号79)又はNav1.6(配列番号407)を安定発現するHEK293細胞を、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、400μg/mLジェネティシン、及び100μM NEAA(試薬はすべてInvitrogen社製)を補ったDMEM/F−12培地(1:1)において培養した。細胞を37℃、5% CO2の条件に維持し、約50〜90%コンフルエンスに達した時点でアッセイを行った。テトラサイクリン誘導可能な方法(配列番号407)でヒトNav1.6を安定発現するCHO細胞を、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10μg/mL Blasticidin、及び400μg/mL Zeocinを補ったHAMs F12において培養した。細胞を37℃及び5% CO2の条件に維持し、約50〜90%コンフルエントに達した時点でアッセイを行った。実験の24〜48時間前に、1μg/mLのテトラサイクリンを用いてNav1.6発現を誘発した。
いくつかのアプローチを用いて天然ペプチドと比較して更に改善された効能及び選択性プロファイルを有するNav1.7アンタゴニストを生成するため、コンビナトリアルライブラリーを設計し、選択された単一位置ヒットによる相加的効果について試験した。
材料及び方法
動物:雄のC57Bl/6マウス(24〜26g)(Charles Riverから発注、別個に収容)を本試験で用いた。
Von Frey試験:機械的(触覚)閾値を、Von Frey Hairsによって、Up−Down法(Dixon、1980、Chaplanら、1994)によって評価した。7つの段階的な刺激(von Frey繊維:0.03、0.07、0.16、0.4、0.6、1、2g;Stoelting,Wood Dale,IL)を用いた。Von Frey毛を、後足上の中央の足底領域(骨隆起の間)に対して垂直に与えた。十分な力を印加してフィラメントをわずかに曲げて、3秒間保持した。Chaplanの論文によると、陽性応答は、フィラメントを取り除いたときに、1)急に逃避する、又は2)即座に振り回すこととすることができる。詳細についてはChaplanらを参照のこと。試験前に、30〜60分間、試験チャンバー内のワイヤメッシュにマウスを順応させた。
CFAモデル:動物をイソフルランで麻酔し(4%で誘導、及び2%維持)、50μLのハミルトンシリンジに装着した27ゲージのニードルを用い、100%のフロイントの完全アジュバント(CFA;Sigma−Aldrich;Saint Louis,MO)20μLを1本の後足の足底領域の中央部に注入した。
Alzetマイクロオスモティックミニポンプ(Durect Corporation Model 1003D及び2001D)を整備し、製造業者のガイドに従い初期化した。マウスにイソフルランを用いて麻酔した(5%誘導;2%維持)。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭きとり、肩甲骨の間に小さい切開を行った。一対のピンセット又は止血鉗子を用いて、皮下結合組織を広げて分離させることにより小さいポケットを形成した。流量調節材が切開から離れる方向に向くようにして、ポンプをポケット内に挿入した。この後、7mmのステープラーを用いて皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
平均±標準誤差としてデータを表す。Prism(Graphpad Software Inc.,La Jolla,CA)を用いて、グラフ化及び統計分析を図った。時間に対する閾値を比較するため、双方向ANOVA及びそれに続くBonferroniの多重比較検定を、p<0.05の有意水準で用いた。ホットプレート及びMPE%データを一方向ANOVAによって分析した後、Bonferroniの多重比較検定を行った。
変異体NV1D3034−OH(NV1D3034−COOH)、NV1D3368−OH(NV1D3368−COOH)及びNV1D2775−OH(NV1D2775−COOH)の効果を、CFAモデル(炎症性痛覚モデルとして広く使用)において試験した。CFAを後足に注射することにより、足浮腫(図示せず)及び熱刺激(熱痛覚過敏)に対する過敏症が誘発され、これは0日目に注射された足において熱潜時が減少したことにより示される(図6A)。NV1D3034−OHを684及び1824μg/日で、皮下浸透圧ミニポンプによって投与したとき、熱痛覚過敏が完全に逆転された(図4A及び4B)。
プロトキシン−IIのアミノ酸スキャニングライブラリーを構築した。プロトキシン−IIのすべての非システイン位置(Tyr1、Gln3、Lys4、Trp5、Met6、Trp7、Thr8、Asp10、Ser11、Glu12、Arg13、Lys14、Glu17、Gly18、Met19、Val20、Arg22、Leu23、Trp24、Lys26、Lys27、Lys28、Leu29及びTrp30)において、天然の残基の代わりに、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val及びTyrの残基を置換した。
鞘内投与後の疼痛の減少における選択プロトキシン−II変異体の有効性を評価した。
実施例6に記載の方策及び方法を用いて、更なるプロトキシン−II変異体を設計し、発現させ、実施例3に記載のプロトコルに従い、FLPR Tetra及び/又はQpatchで特性評価した。
野生型プロトキシン−IIと比較するとき、プロトキシン−II変異体63955918はW7Q及びW30L置換を有する。実施例6に記載のように、Trp7及びTrp30の変異(一方又は両方)により、得られるプロトキシン−II変異体のフォールディングが改善され、リフォールディング困難なプロトキシン−II変異体のフォールディングをレスキューできた。
得られるペプチドの体内分布を改善するために、更なる63955918の変異体を設計した。
Claims (34)
- ヒトNav1.7活性を阻害する単離されたプロトキシン−II変異体であって、W7Q及びW30Lからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは配列番号1に従う、単離されたプロトキシン−II変異体。
- 単離されたプロトキシン−II変異体であって、約1×10−7M以下、約1×10−8M以下、約1×10−9M以下、約1×10−10M以下、約1×10−11M以下、又は約1×10−12M以下のIC50値でヒトNav1.7活性を阻害し、前記IC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定され、前記プロトキシン−II変異体がW7Q及び/又はW30L置換を有し、残基の番号付けが配列番号1に従う、単離されたプロトキシン−II変異体。
- X1X2X3CX4X5WX6QX7CX8X9X10X11X12CCX13X14X15X16CX17LWCX18KKLX19(配列番号432)の配列を含み、
X1は、G、P、A又は欠失であり;
X2は、P、A又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、Q、R、K、A、S又はYであり;
X5は、K、S、Q又はRであり;
X6は、M又はFであり;
X7は、T、S、R、K又はQであり;
X8は、D、T又はアスパラギル−4−アミノブタンであり;
X9は、S、A、R、I又はVであり;
X10は、E、R、N、K、T、Q、Y又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X11は、R又はKであり;
X12は、K、Q、S、A又はFであり;
X13は、E、Q、D、L、N又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X14は、G、Q又はPであり;
X15は、M又はFであり;
X16は、V又はSであり;
X17は、R、T又はN−ωメチル−L−アルギニンであり;並びに、
X18は、K又はRであり;並びに、
X19は、W又はLであり、
N末端伸張又はC末端伸張を任意に有する、
請求項1又は2に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。 - 残基の番号付けが配列番号1に従うときに、前記変異体が、Y1、W7、S11、E12、K14、E17、G18、R22、L29及びW30の1つ又は2つ以上の残基位置で置換を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。
- 配列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW−COOH(配列番号416)を含み、残基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、L29及び/又はW30が、
a)表1で示される他の任意のアミノ酸;又は、
b)非天然アミノ酸で置換される、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。 - 配列YCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL−COOH(配列番号422)を含み、残基Y1、S11、E12、K14、E17、G18、M19、L29及び/又はW30が、
a)表1で示される 他の任意のアミノ酸;又は、
b)非天然アミノ酸で置換される、
請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。 - 配列番号422(GPYCQKWMQTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLL−COOH)のアミノ酸配列と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を含み、
前記プロトキシン−II変異体が、残基番号付けが配列番号1に従うときに、位置7におけるQ、及び位置30におけるQを有する、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。 - 配列X1X2X3CQKWMQTCDX4X5RX6CCX7X8X9VCRLWCKKKX10X11(配列番号737)を含み、
X1は、G、P、A又は欠失であり;
X2は、P、A又は欠失であり;
X3は、S、Q、A、R又はYであり;
X4は、S、A、R、I又はVであり;
X5は、E、R、N、K、T、Q、Y又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X6は、K、Q、S、A又はFであり;
X7は、E、Q、D、L、N又はグルタミル−4−アミノブタンであり;
X8は、G、Q又はPであり;
X9は、M又はFであり;
X10は、L又はVであり;並びに
X11は、W又はLである、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体、請求項1〜5のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体 。 - 前記N末端伸長が、配列番号372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384又は385のアミノ酸配列 を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。
- 前記C末端伸長が、配列番号374、386、388、389、390、391、392、393、394、395、396又は397のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。
- 前記N末端及び/又は前記C末端伸長が、前記プロトキシン−II変異体にリンカーを介して結合される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体
- 前記リンカーが、配列番号383、392、398、399、400、401又は402のアミノ酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体。
- ヒトNav1.7活性を、約3×10−8M以下のIC50値で阻害し、前記IC50値は、ヒトNav1.7を安定発現するHEK293細胞中に25×10−6Mの3−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いたFLIPR(登録商標)Tetra膜脱分極アッセイを用いて測定される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
- ヒトNav1.7活性を、約3×10−8M〜約1×10−9MのIC50値で阻害する、請求項13に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
- 実施例3に記載のプロトコルに従いQPatch分析を用いてNav1.7活性を測定したときに、前記変異体が、Nav1.7活性を少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%阻害する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
- アミノ酸配列GPQCX1X2WX3QX4CX5X6X7X8X9CCX10X11FX12CX13LWCX14KKLL(配列番号433)を含み、
X1は、Q、R、K、A又はSであり;
X2は、K、S、Q又はRであり;
X3は、M又はFであり;
X4は、T、S、R、K又はQであり;
X5は、D又はTであり、
X6は、S、A又はRであり、
X7は、E、R、N、K、T又はQであり、
X8は、R又はKであり;
X9は、K、Q、S又はAであり;
X10は、E、Q又はDであり;
X11は、G又はQであり;
X12は、V又はSであり;
X13は、R又はTであり;並びに
X14は、K又はRである、
請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。 - 配列番号30、40、44、52、56、59、65、78、109、110、111、114、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、178、179、180、182、183、184、185、186、189、190、193、195、197、199、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、224、226、227、231、232、243、244、245、247、249、252、255、258、261、263、264、265、266、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、332、334、335、336、337、339、340、341、342、346、351、358、359、364、366、367、368、369、370、371、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735又は736のアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
- 遊離C末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体。
- 半減期延長部分に結合された、請求項1〜18のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体を含む、単離された融合タンパク質。
- 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン(HSA)、アルブミン結合ドメイン(ABD)、Fc又はポリエチレングリコール(PEG)である、請求項19に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項21に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項22に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記単離されたプロトキシン−II変異体を生成する方法であって、請求項23に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記プロトキシン−II変異体を回収することとを含む、前記方法。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−II変異体又は融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 対象におけるNav1.7を介した痛みを治療する方法であって、請求項1〜20のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体又は融合タンパク質を、前記痛みの治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
- 痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症(PE)、発作性高度疼痛症(PEPD)、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害(PDN)、疹後神経痛(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項26に記載の方法。
- 前記プロトキシン−II変異体が、末梢に投与される、請求項27に記載の方法。
- 前記プロトキシン−II変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項28に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項26〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項1〜20のいずれか一項に記載のプロトキシン−II変異体又は融合タンパク質 。
- 痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症(PE)、発作性高度疼痛症(PEPD)、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害(PDN)、疹後神経痛(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項31に記載の使用のための プロトキシン−II変異体。
- 前記プロトキシン−II変異体が、末梢に投与される、請求項31又は32に記載の使用のための プロトキシン−II変異体。
- 前記プロトキシン−II変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項31〜33のいずれか一項に記載の使用のための プロトキシン−II変異体。
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