JP2022008474A - プロトキシン－ｉｉ変異体及びその使用方法 - Google Patents

プロトキシン－ｉｉ変異体及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】プロトキシン－ＩＩ変異体、プロトキシン－ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを製造及び使用する方法を提供する。
【解決手段】ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であって、特定のアミノ酸の置換を有し、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体を提供する。
【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）のもと、２０１５年４月２日に出願された米国特許
仮出願第６２／１４２，０６９号に対する優先権の利益を主張し、その出願の全開示内容
が参照により本明細書に援用される。
（発明の分野）
本発明は、プロトキシン－ＩＩ変異体、それをコードする合成ポリヌクレオチド、及び
それらを製造及び使用する方法に関する。
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-Gated Sodium Channel）（ＶＧＳＣ）は、心
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞中に存在し
ている。神経細胞では、ナトリウムチャネルは、閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速
な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系
における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能が種々
の医学的障害の根底にあると考えられており（Ｈｕｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｔｓｃｈ，
Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１：２４３５～４５、２００２）、そうした医学的障害
としては、例えば、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇ
ｅｔｓ ５：５８９～６０２、２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ－Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ
Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ２１：１０７～１５、２０１０
）、ミオトニー（Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｂｅａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２０
：８０～３、２０１０）、及び痛み（Ｃｒｅｇｇら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５８８：１８
９７～９０４、２０１０）が挙げられる。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニ
ットの複合体であり、その主要なものは、単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニ
ットである。
電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットのファミリーの９つの公知のメンバーが
ヒトに存在する。Ｎａｖ１．１～Ｎａｖ１．９である。Ｎａｖ１．ｘサブファミリーは、
薬理学的に、テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性及びＴＴＸ耐性の２つのグループに細分
できる。Ｎａｖ１．７（別名ＰＮ１又はｈＮＥ）は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によってコード化
され、ＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンにおいて発現される。
Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節す
る閾値チャネルとして機能する。
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状
態に関与している。男性では、Ｎａｖ１．７の機能獲得型変異が、肢端紅痛症（ＰＥ）（
四肢の焼けるような痛み及び炎症を特徴とする疾患）（Ｙａｎｇら、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎ
ｅｔ４１：１７１～４、２００４）、及び発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅ
ｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４、２００６）に関連している。この知見に
一致するように、非選択性ナトリウムチャネル遮断薬リドカイン、メキシレチン及びカル
バマゼピンによって、これらの痛みを伴う疾患の症状緩和を得ることができる（Ｌｅｇｒ
ｏｕｘ－Ｃｒｅｓｐｅｌら、Ａｎｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ １３０：４
２９～３３、２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４、２
００６）。
ヒトにおけるＮａｖ１．７の機能喪失型変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又は
不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）を
引き起こす（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４４：８９４～８，２００６；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ７１：３１１～９，２００７；Ａ
ｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６：２１１４～２１，２００
７）。
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型は、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性
の増大に関連している。例えば、ヒトＮａｖ１．７におけるＲ１１５０Ｗ置換を生じる多
型ｒｓ６７４６０３０が、変形性関節症の痛み、腰部椎間板切除術の痛み、幻想痛、及び
膵炎の痛みに関連している（Ｒｅｉｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １０７：５１４８～５３、２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ変異体Ｎａｖ１．７を発
現するＤＲＧニューロンによって、脱分極に応じた発火頻度の増加を示す（Ｅｓｔａｃｉ
ｏｎら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６：８６２～６、２００９）。線維筋痛の無効形態が
ＳＣＮ９Ａナトリウムチャネル多型ｒｓ６７５４０３１に関連しており、激しい線維筋痛
を伴う患者の中には後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有するものがあり得ることを
示している。（Ｖａｒｇａｓ－Ａｌａｒｃｏｎら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ
Ｄｉｓｏｒｄ １３：２３、２０１２）。
マウスでは、侵害受容ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａ遺伝子が欠失すると、機械的痛み
及び熱痛の閾値が低下し、並びに炎症性痛覚応答が減少又は停止する（Ｎａｓｓａｒら、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２７０６～１１、２００４
）。すべての感覚ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａを除去することで、機械的な痛み、炎症
性痛覚、及び熱に対する反射逃避応答が停止した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロ
ンの両方においてＳＣＮ９Ａを欠失させると、機械的痛み、熱痛、及び神経障害性疼痛が
停止し、Ｎａｖ１．７機能喪失型変異によってヒトに見られる無痛表現型が繰り返された
（Ｍｉｎｅｔｔら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３：７９１、２０１２）。したがって、Ｎａ
ｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に付随する広範な疼痛の治療に有用であり得る
。
クモ毒には、多数のナトリウムチャネル遮断ペプチドが含まれていることが知られてお
り、例えば、フエントキシン－ＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（Ｐｅｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ ２７７：４７５６４～７１、２００２）、プロトキシン－Ｉ、プロトキシン－Ｉ
Ｉ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１４７３４～４７、２０
０２）及びフリクソトキシン－ＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
６９：４１９～２９、２００６）が挙げられる。広範囲の疼痛を治療するための更なる
Ｎａｖ１．７遮断薬の同定に対するニーズが存在する。詳細には、Ｎａｖ１．７に対する
選択性が他の電位依存性ナトリウムチャネルイソ型の場合よりも上回る新規なＮａｖ１．
７遮断薬に対するニーズが存在する。
本発明の１つの実施形態は、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン
－ＩＩ変異体であり、プロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から
選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う
。
本発明の別の実施形態は、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、プロトキシン
－ＩＩ変異体は、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下
、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下のＩ
Ｃ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現
するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分
極アッセイを用いて測定され、プロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ
置換を有し、残基番号付けは配列番号１に従う。
本発明の別の実施形態は、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５９、６５、７８
、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２
、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２
、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２
、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２
、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６
、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７
、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０
、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１
、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７
、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８
、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３
、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３
、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３
、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３
、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３
、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３
、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０
、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８
、３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４
、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４
、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６
、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６
、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６
、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６
、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６
、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６
、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６
、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６
、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６
、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６
、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６
、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６
、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６
、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６
、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６
、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６
、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６
、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６
、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６
、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６
、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６
、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６
、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６
、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６
、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６
、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６
、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６
、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６
、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６
、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６
、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３
６のアミノ酸配列を含む、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体である。
本発明の別の実施形態は、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であって、配列番号４
２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ－ＣＯＯＨ
）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、残基の番号付けが配
列番号１に従うときに、位置７におけるＱ、位置３０におけるＬを有する。
本発明の別の実施形態は、半減期延長部分に結合した本発明のプロトキシン－ＩＩ変異
体を含む単離された融合タンパク質である。
本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体をコードする単離された
ポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである
。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体を製造する方
法であって、本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたプロトキ
シン－ＩＩ変異体を回収することとを含む、方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体又は融合タン
パク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であ
って、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、痛みの治療に有効な量
で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。
ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害するプロトキシン－ＩＩ変異体の属アミノ酸配列を示す。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩに従う。属配列番号：４０３。 ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ５０値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。ＳＥ：標準誤差。 ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ５０値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。ＳＥ：標準誤差。 ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン－ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩに従う。 ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン－ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩに従う。 ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン－ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩに従う。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示し、ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（最大可能効果（maximum possible effect））（ＭＰＥ％）として表わす。＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８－ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８－ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示し、ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ注入後（０）、及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、ペプチド投与後１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。後足の触覚閾値、ＣＦＡ前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ後（０）、及びペプチド投与後の１日目（１）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおける、ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、ペプチド投与後１日目のパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ＣＦＡ投与前後及びペプチド投与後の様々な時点におけるＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験での足逃避潜時の測定により評価される、マウスＣＦＡモデルにおける、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨを介した熱痛覚過敏の逆転の時間経過を示す。＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０～２４ｈｒ）を示す。 ＣＦＡの投与前後及びペプチド投与後の様々な時点における触覚閾値の測定により評価される、マウスＣＦＡモデルにおける、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨを介した触覚異痛症の逆転の時間経過を示す＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０～２４ｈｒ）を示す。 マウスホットプレート試験において、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨにより著しい無痛覚が生じたことを示す。熱逃避潜時の評価を、５０及び５５℃においてポンプ埋め込み前及び後に行った。ポンプ埋め込みは、制御ＰＢＳグループにおける潜時に対して影響はなかった。ポンプ後１日目に、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨによって治療されたマウスは、ＰＢＳグループと比べて長時間に渡って潜時を示した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 マウスにおいて、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ前処理が、動物をカラギーナン誘発熱痛覚過敏から保護したことを示す。足逃避潜時の測定を、ポンプ前、及びポンプ後１日目に足底内カラギーナン注射前に行った。潜時の再測定を、カラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。 野生型プロトキシン－ＩＩのＮＭＲ構造による、その表面表現を示す。左側に示す疎水性表面は、残基Ｗ５、Ｍ６、Ｗ７、Ｌ２３及びＷ２４を含む。右側に示す選択性表面は、残基Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及びＷ３０を含む。残基の番号付けは、配列番号１に従う。 ラットのテールフリック試験における、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。 ラットのテールフリック試験における、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。 ホットプレート試験における、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ラットのホルマリン試験における、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。ホルマリンのラット後足への注入により、二相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０～１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１～６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。Ｅ）では群サイズが小さかったため、統計処理を行わなかった。 ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。 ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。 ラットのホットプレート試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの有効性を示す。ホルマリンのラット後足への注入により、二相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０～１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１～６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、フェーズＩ、＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、フェーズＩＩ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。 ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。 ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．００５対ＰＢＳ、ｔ検定。 ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。 ラットのホットプレート試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、ｔ検定。 ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨの有効性を表す。ホルマリンのラット後足への注入により、ニ相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０～１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１～６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、フェーズＩ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、フェーズＩＩ、ｔ検定。 ファミリー３のシステインノット毒素ペプチドのアミノ酸アラインメントを示す。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）すべての
刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される
。
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及
び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有す
る。例示的な組成物及び方法を本明細書に記載するが、本明細書に記載されているものと
同様又は同等のあらゆる組成及び方法を、本発明を実施又は試験するために使用すること
が可能である。
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少
なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個のアミノ酸未満の小分子ポリ
ペプチドを「ペプチド」と言う場合がある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる
場合もある。
用語「ポリヌクレオチド」は、糖－リン酸骨格を介した共有結合、又は他の同等の共有
結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮ
Ａ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
用語「相補配列」は、第１の単離されたポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１の
ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第２の単離さ
れたポリヌクレオチド配列を意味する。
用語「ベクター」は、生物系内で複製することが可能である、又はそのようなシステム
間を移動できる、天然に存在しないポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオ
チドは、典型的には、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡと、生物システム内でこれら
のポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にするように機能する、複製起点、ポリアデニ
ル化シグナル又は選択マーカーなどの更なる要素を含む。そのような生物システムの例と
しては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする生物学的要素を
利用して再構成された生物システムが挙げられる。ベクターを構成するポリヌクレオチド
は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
用語「発現ベクター」は、生物系又は再構成された生物系において利用されて、発現ベ
クター内に存在するポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの翻訳を指令できる
ベクターを意味する。
用語「変異体」は、本明細書で用いられる場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドで
あって、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩポリペプチドとは異なるか、又はヌクレ
オチド又はアミノ酸の１つ又は複数の修飾（例えば、置換、挿入又は欠失）によって、配
列番号１０７の配列を有する野生型プロトキシン－ＩＩをコードするポリヌクレオチドと
は異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
明細書の全体に渡って、プロトキシン－ＩＩ変異体内で置換された残基は、配列番号１
の野生型プロトキシン－ＩＩにおけるその位置に対応して番号付けされている。例えば、
明細書における「Ｙ１Ａ」は、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩにおける位置１に
対応する残基位置におけるチロシンとアラニンとの置換を指す。
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、天然の成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列
要素の配置を、隣接するエクソンと共有する公知の合成ポリヌクレオチドを指し、ゲノム
ＤＮＡ内に存在する介在するイントロンは取り除かれている。開始剤メチオニンをコード
するコドンは、ｃＤＮＡ内に存在してもしなくてもよい。ｃＤＮＡは、例えば逆転写又は
合成遺伝子アセンブリによって合成されてもよい。
本明細書で用いられる場合、「合成」又は「非天然の」は、天然に存在しないポリヌク
レオチド又はポリペプチド分子を指す。
「Ｎａｖ１．７」（ｈＮＥ又はＰＮ１とも言う）又は「ｈＮａｖ１．７」は、本明細書
で用いられる場合、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号７
９に示す配列を有する公知のヒトナトリウムチャネルタンパク質タイプ９サブユニットα
を指す。
用語「野生型プロトキシン－ＩＩ」又は「野生型ＰｒｏＴｘ－ＩＩ」は、本明細書で用
いられる場合、タランチュラＴｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ ｐｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）毒素
ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（５０）：１
４７３４～４７，２００２）に記載されるアミノ酸配列ｙｃｑｋｗｍｗｔｃｄｓｅｒｋｃ
ｃｅｇｍｖｃｒｌｗｃｋｋｋｌｗ－ＣＯＯＨ（配列番号１）を有するもののことを指す。
用語「組み換え型プロトキシン－ＩＩ」又は「組み換え型ＰｒｏＴｘ－ＩＩ」は、本明
細書で用いられる場合、配列番号２に示すようなＧＰＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣ
ＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ－ＯＨの配列を有するプロトキシン－ＩＩ融合タンパク質
の発現及び以後の切断から得られる組み換え型プロトキシン－ＩＩを指す。組み換え型プ
ロトキシン－ＩＩは、野生型プロトキシン－ＩＩと比較して、２つのアミノ酸Ｎ末端伸長
（残基Ｇ及びＰ）を取り入れている。
「ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する」又は「ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する」は、本
明細書で用いられる場合、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体が、ベラトリジン（３－ベ
ラトロイルベラセビン）によって誘発される膜脱分極を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイにおいて約１×１０
－７Ｍ以下のＩＣ５０値で低減する能力を指し、ここで、ベラトリジン誘発脱分極は、Ｆ
ＲＥＴシグナルの減少として測定され、その測定は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現する細
胞株において、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス－（１，３－ジエチルチオバルビツール酸
）トリメチンオキソノール］）をアクセプターとして、またＰＴＳ１８（トリナトリウム
８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－トリスルホネート）をドナーとして用い、
ドナーを３９０～４２０ｎｍで励起しＦＲＥＴを５１５～５７５ｎｍで測定することによ
り行われる。ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体の能力
はまた、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイを用い、実施例３に記載のプロトコルに従い、
単一又はいくつかのプロトキシン－ＩＩ変異体濃度において測定してもよい。本発明のプ
ロトキシン－ＩＩ変異体は、実施例３に記載の分析プロトコルを用いてＱＰａｔｃｈを用
いて測定される、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のＮａｖ１．７電流
を阻害するとき、ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する。
「ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイ」は、本明細書で用いる場合、
実施例３に記載するアッセイを指す。
「ＱＰａｔｃｈアッセイ」又は「ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイ」の用語は、本明細
書で用いる場合、実施例３に記載アッセイを指す。
用語「実質的に同一である」は、本明細書で用いる場合、比較する２つのプロトキシン
－ＩＩ変異体アミノ酸配列が同一であるか又は「ごくわずかな相違」を有することを意味
する。ごくわずかな相違とは、プロトキシン－ＩＩ変異体アミノ酸配列において、ペプチ
ド特性に悪影響を与えない１、２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸の置換である。本
明細書に開示されるプロトキシン－ＩＩ変異体と実質的に同一であるアミノ酸配列は、本
出願の範囲内である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、約８０％、８１％、８２
％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上とすることができる
。同一性（％）は、例えばペアワイズアライメントによって、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ．９
．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュール
のデフォルト設定を用いて決定することができる。本発明のタンパク質配列を参照配列と
して用い、例えば、公共の又は特許情報のデータベースの検索を行い、関連配列を同定し
てもよい。このような検索を実行するために用いる例示的なプログラムは、ＸＢＬＡＳＴ
又はＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏ
ｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ，Ｗｅｓｔｂｏｒ
ｏｕｇｈ，ＭＡ）スイートであって、デフォルト設定を用いるものである。
本明細書で用いられる天然アミノ酸の略号を表１ａに示す。
Figure 2022008474000001
本発明によって、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン－ＩＩ（Ｐ
ｒｏＴｘ－ＩＩ）変異体ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、
宿主細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法が提供され
る。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化に起因する脱分極／電流を阻害するた
め、疼痛を伴う様々な症状、及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴
う症状の治療に有用であり得る。
本発明の変異体はＮａｖ１．７の強力な阻害剤である。本発明は、少なくとも部分的に
は、プロトキシン－ＩＩ中のある残基置換が選択性、合成収率及び／又は同質性を高める
ことを、生成されたプロトキシン－ＩＩ変異体の効能に悪影響を与えずに行うことを見出
したことに基づいており、具体的にはＷ７及びＭ１９、更に残基Ｙ１及びＳ１１、更に加
えて残基Ｅ１２、Ｒ２２及び（残基の番号付けは配列番号１に従う）である。例えば、位
置Ｗ７及びＷ３０の置換によりプロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディングが促進され
、収率が改善される。
位置Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及びＷ３０の置換により、得ら
れるプロトキシン－ＩＩ変異体のＮａｖ１．７への選択性が改善される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の一実
施形態は、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、このプロトキシン－ＩＩ変異体
は、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０
－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒ
トＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２
９３細胞中に２５×１０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネ
ルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを
用いて測定される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、このプロトキシン－ＩＩ変異
体は、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１
０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下のＩＣ５０値で
ヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ
２９３細胞中に２５×１０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エ
ネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイ
を用いて測定され、プロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選
択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であ
り、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少
なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ置換を有する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ３０Ｌ置換を有する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌ置換を有する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰ
ａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくと
も２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、残基の番号付けが配列番号１に従うとき
に、Ｙ１、Ｗ７、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｒ２２、Ｌ２９及びＷ３０
の１つ又は２つ以上の残基位置で置換を有する。
位置Ｙ１における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する効能が改善される。
位置Ｗ７における置換により、プロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディング及びタン
パク質の収率が改善される。
位置Ｓ１１における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｅ１２における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｋ１４における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｅ１７における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｇ１８における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｌ２９における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
位置Ｗ３０における置換により、プロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディング及びタ
ンパク質の収率及びＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ－Ｃ
ＯＯＨ（配列番号４１６）を含む単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、残基Ｙ１
、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及び／又はＷ３０は、表１で示され
る他の任意のアミノ酸又は非天然アミノ酸で置換され、Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意
に有する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ－Ｃ
ＯＯＨ（配列番号４２２）を含む単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、残基Ｙ１
、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｍ１９、Ｌ２９及び／又はＷ３０は、表１
で示される他の任意のアミノ酸又は非天然のアミノ酸で置換され、Ｎ末端伸張又はＣ末端
伸張を任意に有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は
、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含み、非天然のアミノ酸を少なくとも１つ
含む。
非天然アミノ酸としては、アミノβ－アラニン（β－Ａｌａ）、及び３－アミノプロピ
オン酸（Ｄａｐ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４－アミノ酪酸などの他
のω－アミノ酸；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ
－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシン又はサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニ
チン（Ｏｍ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（ｔ－ＢｕＡ）；ｔ－ブチル
グリシン（ｔ－ＢｕＧ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（
Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２－ナフチル
アラニン（２－ＮａＩ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｃｌ））；２－フ
ルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２－Ｆ））；３－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ
（３－Ｆ））；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｆ））；ペニシラミン（Ｐ
ｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；α－
２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｎ（ω）－メチ
ル－Ｌ－アルギニン；Ｎ（ω），Ｎ（ω）－ジメチル－Ｌ－アルギニン（非対称）；４－
グアニジノ－Ｌ－フェニルアラニン；Ｌ－Ｌｙｓ（Ｎ－ε－（Ｎ－α－パルミトイル－Ｌ
－γ－グルタミル）；Ｌ－アスパラギル－４－アミノブタン；Ｌ－グルタミル－４－アミ
ノブタン；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３－
ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ－アミノフェニルアラニ
ン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙ
ｓ）及びホモセリン（ｈＳｅｒ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４－Ｂｒ）；
５－ブロモトリプトファン（bromotryphophan）（Ｔｒｐ（５－Ｂｒ））；３－クロロチ
ロシン（Ｔｙｒ（３－Ｃｌ））又はβ－クロロアラニンが挙げられる。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４
Ｘ１５Ｘ１６ＣＸ１７ＬＷＣＸ１８ＫＫＬＸ１９（配列番号４３２）を含む単離されたプ
ロトキシン－ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＹであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ、Ｔ又はアスパラギル－４－アミノブタンであり；
Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ１５は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１７は、Ｒ、Ｔ又はＮ－ωメチル－Ｌ－アルギニンであり；並びに、
Ｘ１８は、Ｋ又はＲであり；並びに、
Ｘ１９は、Ｗ又はＬであり、
Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＱＫＷＭＱＴＣＤＸ４Ｘ５ＲＸ６ＣＣＸ７Ｘ８Ｘ９ＶＣ
ＲＬＷＣＫＫＫＸ１０Ｘ１１（配列番号７３７）を含む単離されたプロトキシン－ＩＩ変
異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
Ｘ６は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ９は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１０は、Ｌ又はＶであり；並びに、
Ｘ１１は、Ｗ又はＬである。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、プロトキシン－ＩＩ変異体は、約１×１０－７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮ
ａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３
細胞中に２５×１０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギ
ー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用い
て測定される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰ
ａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくと
も２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７
、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列
を含む。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０
、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、プロトキシン－ＩＩ変異体にリンカーを介
して結合される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又
は４０２のアミノ酸配列を含む。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７
、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列
からなる。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０
、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列からなる
。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又
は４０２のアミノ酸配列からなる。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４
ＦＸ１５ＣＸ１６ＬＷＣＸ１７ＫＫＬＷ（配列番号４０３）を含む単離されたプロトキシ
ン－ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ９は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１４は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１６は、Ｋ又はＲであり；並びに、
Ｘ１７は、Ｋ又はＲであり；
Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約１×１０－７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し
、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０
－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、強力なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換え型プロトキシン－
ＩＩ（配列番号２）は、ベラトリジン誘発脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．
７に対する約４×１０－９ＭのＩＣ５０値を有し、当該アッセイは、実施例３に記載の実
験手順を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ社）を用いて、Ｎａｖ１．７を安定発現する細胞中にＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギ
ー移動）の減少を測定する。上述のアッセイ及び実験３におけるＩＣ５０値が約３０×１
０－９Ｍ以下のとき、すなわち組み換え型プロトキシン－ＩＩの１０倍以内のときに、プ
ロトキシン－ＩＩ変異体は「強力な」Ｎａｖ１．７阻害剤であるといえる。明確にするた
めに、ＩＣ５０が３０×１０－９Ｍということは、ＩＣ５０が３．０×１０－８Ｍという
ことと同じである。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体ポリペプチドは、自動化されたペプチドシンセサイザーでの化学合
成（例えば固相ペプチド合成）により、作製されしてもよい。あるいは、無細胞発現系、
例えば網状赤血球溶解物ベースの発現系を用い、又は組み換え発現系を用いて、ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドから本発明のポリペプチドを得てもよい。当業者であ
れば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を理解するであろう。例示的な方法で
は、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は、プロテアーゼ切断可能リンカー、例えばＨＲ
Ｖ３Ｃプロテアーゼに対する認識配列（ヒトライノウイルスからの組み換え型１４３Ｃプ
ロテアーゼ）ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号８２）（ＨＲＶ３Ｃリンカー）に、グリシン－
リッチリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号８０）又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列
番号８１）を結合させたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質としてそれを発現
させ、発現された融合タンパク質をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを用いて切断して組み換え型
プロトキシン－ＩＩ変異体ペプチドを放出させることによって生成する。ヘキサヒスチジ
ン（配列番号１０８）又は他のタグを用いて、公知の方法を用いた精製を容易にしてもよ
い。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、本明細書に記載の方法を用いて精製してもよい。例示的な方法
では、ＨＳＡ融合タンパク質として発現され、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断され
た本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を、本明細書に記載する固相抽出（ＳＰＥ）を用い
て精製してもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるプロトキシン
－ＩＩ変異体の生成は、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長を任意に有し、プロトキシン－ＩＩ
変異体融合タンパク質は、典型的には核酸レベルにおいて実現される。ポリヌクレオチド
の合成は、縮重したオリゴヌクレオチドを用いて所望の変異体を生成する米国特許第６，
５２１，４２７号及び同第６，６７０，１２７号に記載された方法による化学的遺伝子合
成を用いてもよいし、又は標準的なＰＣＲクローニング及び変異誘発によってもよい。標
準的なクローニング技術によって変異体のライブラリーを生成し、プロトキシン－ＩＩ変
異体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングしてもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、配列番号１の野生型プロトキシン－ＩＩと比較したときに、更
なるＮ－及び／又はＣ末端アミノ酸を取り入れてもよく、例えばクローニング及び／又は
発現スキームによって得られる。例えば、ＨＳＡ－リンカー－ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプ
チド－プロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質として変異体の発現後にＨＳＡから切断
すると、更なる２つの残基（例えばＧ及びＰ）が各プロトキシン－ＩＩ変異体のＮ末端に
取り入れられる場合がある。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、本明細書に記載の方法を用いてそのヒトＮａｖ１．７阻害能を
試験する。例示的なアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞中にＦＲＥ
Ｔ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイが
ある。別の例示的なアッセイでは、公知のパッチクランプ技術を用い、また本明細書に記
載したように、電気生理学的な記録法を用いてＮａｖ１．７を介した電流の変化を測定す
る。
本発明の別の実施形態は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２
６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９
、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、
５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６
６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０
９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１
９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３
０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４
０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５
０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６
０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７
０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８
０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９
０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２０
０、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１
０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２
０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５，２２６、２２７、２２８、２２９、２３
０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４
０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５
０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６
１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７
１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８
１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９
１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０
１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１
１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２
１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３
１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４
１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５
１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１
、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８ ３６９、３７０、３７１
、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７
、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７
、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９
、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９
、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９
、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９
、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９
、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９
、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９
、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９
、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９
、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９
、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９
、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９
、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９
、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９
、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９
、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９
、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９
、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９
、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９
、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９
、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９
、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９
、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９
、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９
、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９
、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９
、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９
、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９
、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９
、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９
、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のアミノ酸配列を含み以
下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される単離されたプロト
キシン－ＩＩ変異体である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ、約１×１０－９以
下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の
ＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７を阻害し得る。ＩＣ５０値の範囲を示す例示的な変異体は
、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、
１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、
１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、
１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、
１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、
１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、
１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、
１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、
２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、
２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、
２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、
２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、
２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、
２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、
２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、
３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、
３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、
３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、
３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、４０８、４０９、４１０、４１１、
４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、
４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０又は４３１
に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、このプロトキシン－ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰ
ａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくと
も２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。ＱＰａｔｃｈアッセイでＮａｖ１．７
活性を少なくとも２５％阻害する例示的な変異体は、配列番号１０９、１３３、４０８、
４０９、４１０、４１２、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２３、４２４、
４２５、４２６、４２７、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３１、４３４、
４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４４、４４６、４４７、
４４８、４５０、４５２、４５３、４５５、４５６、４５９、４６０、４６１、４６２、
４６３、４６４、４６５、４６６、４６８、４６９、４７０、４７１、４７３、４７４、
４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８５、４８６、４８７、
４９０、４９１、４９２、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、
５０２、５０４、５０５、５０７、５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５１６、
５１７、５１８、５１９、５２１、５２２、５２３、５２４、５２６、５２９、５３１、
５３２、５３３、５３７、５４６、５５４、５５７、５５９、５６０、５６１、５６２、
５６３、５６６、５７１、５７９、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、
５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、
６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６２１、６２２、
６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６７０、６７１、
６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、
６８２、６８３、６８４及び６８５に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。
表２、表３、表１４、表１８及び表２は、選択されたプロトキシン－ＩＩ変異体の配列
を示す。
Figure 2022008474000002
Figure 2022008474000003
Figure 2022008474000004
Figure 2022008474000005
Figure 2022008474000006
Figure 2022008474000007
Figure 2022008474000008
Figure 2022008474000009
Figure 2022008474000010
Figure 2022008474000011
Figure 2022008474000012
Figure 2022008474000013
Figure 2022008474000014
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体は、約３×１０－８Ｍ以下のＩＣ５０
値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体は、約３×１０－８Ｍ～１×１０－９
のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ
１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＣＸ１４ＬＷＣＸ１５ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含む単離さ
れたプロトキシン－ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１２は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ１３は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１４はＲ又はＴであり；並びに
Ｘ１５はＫ又はＲである。
約３０×１０－９Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する例示的なプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１
９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３
６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５
０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７
３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９
３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７
３、２８２、３３５、４０８、４０９、４１０、４２２、４２４、４２５、４２６、４２
７及び４２８アミノ酸配列を含む変異体である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害
する。本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は、組み換え型プロトキシン－ＩＩ（配列番号
２）と比較したときに、Ｎａｖ１．７に対してより選択性である場合がある。ＱＰａｔｃ
ｈ電気生理学アッセイにおいて、組み換え型プロトキシン－ＩＩは、Ｎａｖ１．７に対す
るＩＣ５０は約２．２×１０－９Ｍであり、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０は約６２×１
０－９Ｍであり、したがってＮａｖ１．６に対するＩＣ５０対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ
５０の比は、約２８倍である。本明細書で用いられるとき、「選択性」又は「選択的な」
又は「より選択的な」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」は、プロトキ
シン－ＩＩ変異体について、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ
５０の比（ＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７））が約３０以上である
ということを指す。Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０のアッセイは、ＱＰａｔｃｈ電気生理
学アッセイにおいて、Ｎａｖ１．６を安定発現する細胞株を用いて、Ｎａｖ１．７に関し
て記載したのと同様の方法を用いて行ってもよい。
選択性を向上させるために変異誘発され得るプロトキシン－ＩＩ内の残基位置（配列番
号１に従う残基の付け）としては、残基７、１１、１２、１４、１７、１８及び１９、並
びに任意に残基１、２０、２２及び２６が挙げられる。選択性を向上させるための例示的
な置換は、Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ｒ、Ｓ１１Ａ、Ｅ１２Ｔ、Ｍ１９Ｆ、Ｖ２０Ｓ、Ｒ２
２Ｔ、及びＫ２６Ｒである。選択性が向上した例示的なプロトキシン－ＩＩ変異体は、配
列番号５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１
２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３
２５又は３２６の変異体である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列ＧＰＸ１ＣＱＫＷＭＱＸ２ＣＤＸ３Ｘ４ＲＫＣＣＸ５ＧＦＸ６ＣＸ７Ｌ
ＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含む単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であり
、
Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ４は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ７は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ８は、Ｋ又はＲであり；
プロトキシン－ＩＩ変異体は、約３×１０－８Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７
活性を阻害し、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体は、配列ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ１ＣＤ
Ｘ２Ｘ３ＲＫＣＣＸ４ＧＦＸ５ＣＸ６ＬＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ４は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ７は、Ｋ又はＲである。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列番号４２２（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷ
ＣＲＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含む単離されたプロ
トキシン－ＩＩ変異体であり、
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、位置７におけるＱ、及び
位置３０におけるＬを有し、
ポリペプチドはヒトＮａｖ１．７の活性を阻害する。
置換Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌを有するプロトキシン－ＩＩ変異体は、野生型プロトキシン－
ＩＩと比較したとき、フォールディング、収率及び選択性を向上させた。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列番号７８のアミノ酸配列（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧ
ＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ）と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含む単離されたプロト
キシン－ＩＩ変異体であり、
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、位置１におけるＱ、位置
７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ポリペプチドは、約３０×１０－９Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害
し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１
０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ
）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
ポリペプチドはＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実
施形態では、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体は、Ｃ末端にカルボン酸、アミド、メ
チルアミド又はブチルアミド基を有する。Ｃ末端の修飾は、ルーチン的な合成法により実
施できる。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１
５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、
４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５
５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８
、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１
１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１
２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１
３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１
４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１
５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１
６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１
７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１
８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１
９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２
０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２
１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２
２２、２２３、２２４、２２５，２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２
３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２
４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２
５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２
６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２
７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２
８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２
９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３
０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３
１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３
２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３
３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３
４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３
５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６
３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８ ３６９、３７０、３７１、４０８、４０
９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１
９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２
９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４
１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５
１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６
１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７
１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８
１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９
１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０
１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１
１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２
１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３
１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４
１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５
１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６
１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７
１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８
１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９
１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０
１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１
１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２
１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３
１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４
１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５
１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６
１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７
１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８
１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９
１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０
１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１
１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２
１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３
１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のプロトキシン－ＩＩ変異体を含む単離
された融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、公知のリーダー若しく
は分泌シグナル配列、又は合成配列であってもよく、例えば、クローニングステップ、又
はタグ、例えばヘキサヒスチジンタグ（配列番号１０８）由来のものでもよい。このよう
な第２のポリペプチドは、半減期延長部分であってもよい。一実施形態では、単離された
融合タンパク質には、半減期延長部分に結合された本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体が
含まれる。
使用できる例示的な半減期延長部分としては、公知のヒト血清アルブミン、トランスチ
レチン（ＴＴＲ）、サイロキシン結合グロブリン（ＴＧＢ）、アルブミン結合ドメイン、
又はＦｃ若しくはそのフラグメントが挙げられる。生物学的に好適なポリマー又はコポリ
マーを用いてもよく、例えばエチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
分子、例えばＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００、デキストラン、ポリリシン、異なる
鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル（例えばラウレート、ミリステート、ステアレート、ア
ラキデート、ベヘネート、オレエート、アラキドネート、オクタン二酸、テトラデカン二
酸、オクタデカン二酸、ドコサンニ酸、など）、オクタン又は炭水化物（デキストラン、
セルロース、オリゴ－又はポリサッカリド）である。体内分布を改善できる例示的な部分
としては、ポリアミノ化（プトレシン、スペルミン又はスペルミジン等）、ハロゲン化（
塩素、臭素、フッ素、ヨウ素）及びグリコシル化が挙げられる。これらの部分は、プロト
キシン－ＩＩ変異体ポリペプチドとの直接の融合であってもよく、また標準的なクローニ
ング及び発現技術によって生成してもよい。あるいは、公知の化学的結合法を用いて、当
該部分を本発明の組み換えにより生成されたプロトキシン－ＩＩ変異体に結合させてもよ
い。あるいは、当該部分は、固相ペプチド合成において非コードアミノ酸として組み込ま
れてもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態では、本発明の融合タンパク質の半減期延長部分は、ヒト血清アルブミン、ヒト
血清アルブミンの変異体、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される別の実施形態
では、半減期延長部分はプロトキシン－ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される。好適
なリンカーはよく知られており、配列番号８０又は８１に示される配列を有するリンカー
を含む。
本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を取り入れている例示的な融合タンパク質は、配列
番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１又は１０３のポリ
ペプチド配列を有するものである。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される、更なる部分
を取り入れた本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は、いくつかの公知のアッセイによって
官能性に関して比較してもよい。例えば、ＰＥＧに結合されたプロトキシン－ＩＩ変異体
の薬物動態学特性を、公知のインビボモデルで評価してもよい。
更なるプロトキシン－ＩＩ変異体及びプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質は、本
発明の範囲内である。本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体に対する更なる置換は、得られ
る変異体又は融合タンパク質が、親ペプチドと比較したときに同様の特徴を保持する限り
において実施できる。例示的な修飾は、例えば保存的置換がであり、それにより親分子と
同様の特徴を有するプロトキシン－ＩＩ変異体が得られる。保存的置換とは、それらの側
鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝子コードされるア
ミノ酸は、以下の４つのファミリーに分類できる：（１）酸性（アスパラギン酸塩、グル
タミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、ト
リプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システ
イン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシ
ンは、時に、芳香族アミノ酸として共に分類される。あるいは、アミノ酸のレパートリー
を、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギ
ニンヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、トレオニン）、セリン及びトレオニンは脂肪族ヒドロキシルとして別個に任
意にグループ化される）；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；並びに（６）イオウ含有（システイン
及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ
，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。プロトキシン－ＩＩ変異体の非
保存的置換（異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を伴う）を行い、プロト
キシン－ＩＩ変異体及びプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質の特性を向上させるこ
とができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすか
否かは、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾ポリペプチド又は断片が、非修飾ポリ
ペプチド又は断片と同様の様式で反応を生じる能力を評価することによって、容易に決定
できる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（複数の交換が起こる）を同様に容易に
試験できる。
本発明の別の実施形態は、配列番号１の位置Ｗ７及び／又はＷ３０に対応している位置
で少なくとも１つの置換を有する、単離されたファミリー３のクモ毒システインノットペ
プチドである。ファミリー３のクモ毒には、保存されたＣ末端領域を有する１４の毒素が
含まれ、プロトキシン－ＩＩに加えて、κ－ＴＲＴＸ－Ｇｒ２ｂ、κ－ＴＲＴＸ－Ｇｒ２
ｃ、κ－ＴＲＴＸ－Ｐｓ１ａ、κ－ＴＲＴＸ－Ｐｓ１ｂ、β－ＴＲＴＸ－Ｇｒ１ｂ、κ－
ＴＲＴＸ－Ｃｊ２ａ、κ－ＴＲＴＸ－Ｃｊ２ｂ、κ－ＴＲＴＸ－Ｅｃ２ｃ、β－ＴＲＴＸ
－Ｇｒ１ａ、κ－ＴＲＴＸ－Ｅｃ２ｂ、κ－ＴＲＴＸ－Ｅｃ２ａ及びβ／κ－ＴＲＴＸ－
Ｃｊ２ａ、並びに図１４に示されるものが挙げられる。位置Ｗ７及び／又はＷ３０におけ
る置換は、ファミリー３のクモ毒システインノットペプチドのフォールディングを改善す
ることが期待される。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む単
離された合成ポリヌクレオチドである。
ある例示的な合成ポリヌクレオチドを本明細書に開示したが、遺伝子コードの縮重又は
所定の発現系におけるコドンの選択を考慮すると、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体及
びプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする他の合成ポリヌクレオチドも、
本発明の範囲内である。例示的な合成ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８４、８６
、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２及び１０４に示されるポリヌク
レオチド配列（本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする）である
。当業者であれば、プロトキシン－ＩＩ変異体自体をコードする融合タンパク質における
ポリヌクレオチドセグメントを容易に特定できる。本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又
は融合タンパク質をコード化する合成ポリヌクレオチド配列は、目的とする宿主細胞にお
けるヌクレオチド配列の発現を可能にする１つ又は複数の調節エレメント（例えばプロモ
ーター及びエンハンサ）に操作可能に連結させてもよい。合成ポリヌクレオチドはｃＤＮ
Ａであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、自動化されたポリヌクレオチドシンセサイザーでの化学
合成、例えば固相ポリヌクレオチド合成によって作製され得る。あるいは、本発明のポリ
ヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤ
ＮＡ操作技術などの他の技術によっても作製され得る。既知の配列のポリヌクレオチドを
生成又は取得するための技術が公知である。
本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも１つの非コード配列、例えば転写だが非
翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポ
リアデニル化シグナルを含み得る。また、ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコ
ードする更なる配列を含み得る。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、マー
カー又は公知のタグ配列、例えばヘキサヒスチジン（配列番号１０８）又はＨＡタグ（融
合ポリペプチドの精製を容易にする）をコードしてもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、
プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾ
ンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンド
に本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した任意の他のベクターであってよい。例
えば、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又はプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に挿入して、発現ベクター内の制御配
列（例えば、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然の状態で結合するか又は異種の
プロモーター）、エンハンサ要素、及び転写終結配列）に操作可能に連結させ、効率的な
発現を実現してもよく、また本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又はプロトキシン－ＩＩ
変異体融合タンパク質を発現するように選抜された宿主細胞と適合するように選択する。
ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、組み込まれたポリヌクレオチドによってコー
ドされるタンパク質の高レベル発現に適する条件下に宿主を維持する。
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可
欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮ
Ａ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグ
ロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性など
の選択マーカーを含む。
好適なプロモーター及びエンハンサ因子は、当該技術分野において既知である。細菌細
胞における発現の場合、好適なプロモーターとしては、限定されないが、ｌａｃｌ、ｌａ
ｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ及びｔｒｃプロモーターが挙げられる。真核細胞に
おける発現の場合、好適なプロモーターとしては、限定されないが、免疫グロブリン軽鎖
及び／又は重鎖遺伝子プロモーター及びエンハンサ要素；サイトメガロウイルス最初期プ
ロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期及び後
期プロモーター、レトロウイルス由来の長鎖末端反復配列に存在するプロモーター、マウ
スメタロチオネイン－Ｉプロモーター、及び様々な当該技術分野に既知の組織特異的プロ
モーターが挙げられる。酵母細胞における発現の場合、好適なプロモーターは、構成的プ
ロモーター（例えばＡＤＨ１ ＰＧＫ１、ＥＮＯ又はＰＹＫ１プロモーターなど）、又は
制御可能プロモーター（例えばＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーター）である。適切なベ
クター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。
数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くが、組み換え構
築物を生成するために市販されている。例えば以下のベクターを提供する。細菌系：ｐＢ
ｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ
ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、
ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌ
ａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核細胞系：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ
１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
プロトキシン－ＩＩ変異体又はプロトキシン－ＩＩ変異体融合タンパク質の発現用の例
示的なベクターは、アンピシリン耐性選択マーカー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶイント
ロン、シグナルペプチド、ネオマイシン耐性、複製のｆ１起点、ＳＶ４０ポリアデニル化
シグナル、及び本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又はプロトキシン－ＩＩ変異体融合タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡを有するベクターである。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。用語「宿主細胞」は、ベクターが
導入された細胞を指す。当然のことながら、用語宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく
、そのような細胞の後代をも指すものとする。変異又は環境による影響のいずれかにより
、後の世代において特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同
一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内には依然と
して含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌（ar
cheal）細胞であってよい。
大腸菌、バチルス・ズブチリスなどの桿菌、並びにサルモネラ菌、セラチア属及び種々
のシュードモナス種などの他の腸内細菌が、原核宿主細胞の例である。酵母などの他の微
生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（例えば、Ｓ．セ
レビジアエ）及びピキアである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の
動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブ
リドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５
８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ
Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、
Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞系としては、Ｃ
ＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハム
スターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
ポリヌクレオチド（例えばベクター）を宿主細胞に導入することは、当業者に公知の方
法によって行うことができる。例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション
、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、顕微注入法、カチオン性脂質
を介したトランスフェクション及びエレクトロポレーション法である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の
実施形態は、本発明の宿主細胞を準備する工程と、少なくとも１つの本発明のプロトキシ
ン－ＩＩ変異体の発現に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程とを含む、本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体の製造方法である。
宿主細胞は、所定のタイプの宿主細胞を維持又は増殖させるのに適し、かつポリペプチ
ドを発現させるのに十分な任意の条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現に
とって十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。
例えば、多くの哺乳動物の細胞型を、適切に緩衝化したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で
好気的に培養できる一方、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気条件
下で３７℃で培養することができる。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の方法
において、プロトキシン－ＩＩ変異体の発現は、種々の公知の方法を用いて確認すること
ができる。例えば、ポリペプチドの発現は、検出試薬を用いて（例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ
又はＨＰＬＣを用いて）確認することができる。
本発明の別の態様は、生体組織におけるＮａｖ１．７の活性を調節する方法であり、こ
の方法は、Ｎａｖ１．７を発現する生体組織を、Ｎａｖ１．７調節量の本発明のプロトキ
シン－ＩＩ変異体と接触させることを含む。
治療方法
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、痛みの症状又は感覚ニューロン機能障害若しくは交感神経ニュ
ーロン機能障害の他の疾患の治療、低減、又は緩和が望ましい任意の療法において用いて
もよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体を用いて治療される痛みは、任意のタイプの痛み、例えば慢性の痛
み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、炎症状態に付随す
る痛み、術後の痛み、熱痛、又は疾患及び変性に付随する痛みであってもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体により治療される痛みは、Ｎａｖ１．７を介した痛みであってもよ
い。
本明細書のＮａｖ１．７を介した痛みは、Ｎａｖ１．７チャネル活性の増加に少なくと
も一部起因する痛みを指す。
本発明の方法を用いて、任意の分類に属する動物被験体を治療することができる。この
ような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げら
れる。
痛み及び／又はＮａｖ１．７を介した痛みは、例えば末梢神経障害、中枢神経障害、神
経圧迫又は絞扼性神経障害、例えば手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経圧迫、圧迫性
神経根症、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫性神経根症
及び神経根下背部痛、脊髄根損傷、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症性疾患
、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、汎胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十
二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に付随する痛み、炎症性眼疾患、炎症
性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋
炎、神経炎、膠原血管病、炎症性痛覚及び付随する痛覚過敏及び異痛症、神経障害性疼痛
及び付随する痛覚過敏及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病神経障害性
疼痛、灼熱痛、切断又は膿瘍に由来する痛み、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、Ｈ
ＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又
は他の異質粒子又は分子に対する暴露、浸潤癌、癌、化学療法、放射線療法、ホルモン療
法、火傷、先天性欠損症、歯痛、痛風の痛み、線維筋痛、脳炎、慢性アルコール中毒、甲
状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏、三叉神経痛、脳卒中、視床症候群、一般的頭
痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管症候群及び非血管症候群、交感神経依存性
疼痛、求心路遮断症候群、ぜんそく、上皮組織損傷又は機能障害、呼吸時の内臓運動能の
障害、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、血
管運動神経性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、労働及び送達中の痛
み、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１つ又は複数の原因に由来し得る。
本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体によって緩和されう得る、他の感覚ニューロン機能
障害又は交感神経ニューロン機能障害による疾患には、痒み、咳、及びぜんそくが含まれ
る。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的欠失（global deletion）が生じると、ヒス
タミン誘発性そう痒に対する完全無感覚に至る（Ｇｉｎｇｒａｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐａｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０１３及び米国特許
出願公開第２０１２／０１８５９５６号）。この知見が示唆することは、例えば皮膚若し
くは炎症性疾患；又は炎症性疾患（例えば腎臓若しくは肝胆汁性疾患）、免疫学的疾患、
薬物反応及び未知／特発の症状（例えば、皮膚炎、乾癬、湿疹、昆虫刺症若しくは刺傷）
などの種々の原因によって生じ得る痒みの治療において、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が
有用となり得ることである。Ｎａｖ１．７は、気道を刺激する感覚神経でも発現され（Ｍ
ｕｒｏｉら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ １；５８９（Ｐｔ２３）：５６６
３～７６；Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏ
ｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ａｐｒ １０）このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮
断薬が、咳（例えば急性又は慢性咳、あるいは胃食道逆流疾患からの炎症によって生じる
咳）、及び気道の炎症性疾患（例えばぜんそく及びアレルギー関連の免疫応答、気管支け
いれん、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及びしゃっくり（しゃっくり（hiccou
ghs）、しゃっくり（singultus）））の治療において有用であることを示唆している。ｓ
ｈＲＮＡを用いてモルモットの節状神経節内のＮａｖ１．７をインビボでサイレンシング
することによって、機械的プロービングによって誘発される咳反射がほぼ停止した（Ｍｕ
ｒｏｉら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．２０１３年４月１０日）。
本発明の一態様は、対象における痒み、咳、又はぜんそくを緩和又は治療する方法であ
って、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有
効量の本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、痒み、咳、又は
ぜんそくを緩和するのに十分な時間投与することによる、方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるＮａｖ１．７を介した痒み、Ｎａｖ１．７を介した
咳、又はＮａｖ１．７を介したぜんそくを緩和又は治療する方法であって、以下で列挙さ
れる番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有効量の本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、痒み、咳、又はぜんそくを緩和する
のに十分な時間投与することによる、方法である。
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介した痒みとは、Ｎａｖ１．７チャネル活
性の増加に少なくとも部分的に由来する痒みを指す。
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介した咳とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性
の増加に少なくとも部分的に由来する咳を指す。
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介したぜんそくとは、Ｎａｖ１．７チャネ
ル活性の増加に少なくとも部分的に由来するぜんそくを指す。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、本明細書で説明した動物モデル、及び神経障害性疼痛のラット
脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデル、カラギーナン誘発異痛症モデル、Ｆｒｅｕｎｄの完全ア
ジュバント（ＣＦＡ）誘発異痛症モデル、熱傷モデル、ホルマリンモデル及びＢｅｎｎｅ
ｔｔモデルなどのモデル、並びに米国特許第２０１１／０１２４７１１号及び米国特許第
７，９９８，９８０号に記載された他のモデルを用いて、痛み及び／又はＮａｖ１．７を
介した痛みの低減又は緩和効果を試験してもよい。カラギーナン誘発異痛症及びＣＦＡ誘
発異痛症は、炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合
性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを
提供する。
前述の動物モデルのいずれかを用いて、痛み及び／又はＮＡｖ１．７を介した痛みの治
療における本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体阻害剤の有効性を評価してもよい。本発明
のプロトキシン－ＩＩ変異体の有効性を、無治療又はプラシーボ対照のものと比較しても
よい。追加的に又は代替的に、有効性を、１つ又は複数の既知の鎮痛薬剤との比較により
評価してもよい。
本発明は、Ｎａｖ１．７を介した痛みを、以下で列挙される番号付けされた実施形態を
含む、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を用いて治療する方法を提供するものである。
文献における開示及び示唆とは異なり、本発明者らによる係属中の出願（米国特許出願第
６１／７８１，２７６号）において、Ｎａｖ１．７遮断ペプチドの投与が、種々の動物モ
デルの痛みにおける痛みの治療及び／又は緩和に効果的であることが見出されている。過
剰発現されたＮａｖ１．７を用いたインビトロ細胞培養モデル、又は血液神経関門がデシ
ーシング又は高張食塩水の注射により破壊されている単離されたニューロンにおいて、Ｎ
ａｖ１．７のペプチド阻害剤が有効であり、及び／又はＮａｖ１．７に対して選択的であ
ることが示されているが、痛みのインビボ動物モデルでは効果がないことが従来示されて
おり、効果がない理由として、ペプチドが血液神経関門を通過できないことが報告されて
いる。疼痛の動物モデルにおける、又は単離された神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプ
チドの有効性の欠如については、いくつかの文献に記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅ
ｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０９：Ｅ２０１８－２７、２０１２に
は、ＰｒｏＴｘ－ＩＩが単離された神経における活動電位発火を阻害することは、神経周
囲関門（このモデルにおける拡散障壁となる）が危うくならない限り、できないことが記
載されている。ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、急性及び炎症性痛覚のげっ歯類モデルにおいて効果
がないことが解っており、その説明によると、ＰｒｏＴｘ－ＩＩは血液神経関門を通過で
きないとのことである（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４
：１４７６～１４８４、２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断薬は経口バイオアベ
イラビリティが不十分であり、神経終末への送達が困難であることが提言されており、そ
れらの治療薬としての使用が制限されることを示唆するものである（Ｄｉｂ－Ｈａｊｊら
、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １４、４９～６２、２０１３）。
Ｎａｖ１．７の発現は、末梢神経系において、例えば侵害受容後根神経節（ＤＲＧ）に
おいて、具体的には侵害受容小直径ＤＲＧニューロンにおいて、特に皮膚内の末梢端にお
いて、脳内表現がほとんどない状態で行われる。Ｎａｖ１．７の分布（例えば感覚神経終
末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となってい
る。
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、以下で列
挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有効量の本発明の
プロトキシン－ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治
療するのに十分な時間投与することによる、方法である。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、Ｎａｖ１．７を介した痛み、又は他の感覚ニューロン機能障害
若しくは交感神経ニューロン機能障害の治療が望ましい任意の療法において用いてもよい
。痛みの「処置」又は「治療」には、痛みの知覚を部分的若しくは完全に防止、停止、阻
害、低減又は遅延することが含まれることを意味する。
いくつかの実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、慢性の痛み、急性の痛み、神
経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症
状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節
症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（
ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷若しくは多発性硬化症
、又は疾患及び変性に付随する痛みである。
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（Ｐ
ＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄
損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。また、慢性
的な背痛、変形性関節症、及び癌などの状態は、神経障害性関連の痛みの生成に至る場合
があり、したがって潜在的に、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を用いた治療に適して
いる。
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性
激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛
症に付随するものである。
本発明の方法において、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を第２のポリペプチドに結
合して、融合タンパク質を形成してもよい。このような融合タンパク質は、例えば、ペプ
チド阻害剤の半減期を延長するヒト血清アルブミンに対する公知のＦｃ融合である。結合
は、リンカー（例えば、グリシン－セリンリッチリンカー）を介した直接結合であっても
よい。このようなリンカーは当該技術分野では周知である。更なる部分を取り入れている
本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は、公知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、
そのＮａｖ１．７遮蔽能力及び痛みの治療又は低減における有効性について比較すること
ができる。
本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を用いて治療できる感覚ニューロン機能障害又は交
感神経ニューロン機能障害の他の疾患としては、ぜんそく、咳、胸焼け、痒み、皮膚炎、
膀胱不安定性、及びＲｅｙｎａｕｄの疾患が挙げられる。
医薬組成物
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、薬学的に許容されるビヒクル又は担体中に製剤化されてもよい
。本発明の一実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体及び薬学的に許
容される賦形剤を含む医薬組成物である。
適当なビヒクル又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の
物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食
塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。
これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば、濾
過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、
潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容され
る賦形剤を含有することができる。適当なビヒクル及びそれらの配合及びパッケージング
については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐ
ｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（
２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０ ａｎｄ ４１）に記載されている。
本発明の方法において、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は末梢投与によって投与さ
れてもよい。「末梢投与」又は「末梢に投与される」とは、中枢神経系の外側において対
象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあら
ゆる投与経路が含まれる。
末梢投与は、局所的又は全身的であってよい。関節、手術創、傷害／外傷部位、末梢神
経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器等）又は炎症組織への局所投与などの局所投与を
用いることで、治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与では、医薬組成物
は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達されることになり、更に組成物の性質によっては中
枢神経系にも送達される可能性がある。
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内、皮下、筋
肉内、関節内、又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置若しく
は製剤が含まれる。
化合物は、直接中枢神経系に投与（例えば鞘内又は嚢内投与）されてもよい。持続鞘内
投与は、脊髄注入用の埋め込み式薬剤ポンプを使用して実施できる。
本発明の医薬組成物には、本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を持続放出型又は制御放
出型の製剤中に含有させた製剤が含まれる。これらの製剤は、例えば注射可能な微小球、
生物分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション
、高分子化合物（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、ポリ
グリコール酸又はエチレンビニルアセテートコポリマー）、ビーズ又はリポソーム、ヒア
ルロン酸又は埋め込み可能な薬物送達デバイスを用いることによって実現してもよい。
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）、脳内（実質内）、鞘内
、関節内、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内投与用；持続放出システ
ムによって若しくは埋め込み装置によって、又は任意の他の投与用（特に溶液又は懸濁液
の形態での投与）；口腔又は舌下投与用（例えば錠剤又はカプセル形態）；又は鼻腔内投
与用（例えば粉末、点鼻剤、若しくはエアロゾル、又はその他の薬剤の形態）；経皮投与
用（ゲル、軟膏、ローション、クリーム若しくは粉剤、懸濁液若しくはパッチ送達システ
ムの形態）に調製されてもよい。また、経皮投与では、皮膚構造を変化させるか若しくは
経皮パッチ中の薬物濃度を増加させる、又はタンパク質及びペプチドを含む製剤を皮膚上
に塗布することを可能にする（国際公開第９８／５３８４７号）、若しくは一次的な輸送
経路を形成する（例えば電気穿孔法）、若しくは皮膚を通過する荷電薬剤の移動性を向上
させる（例えばイオン導入法）、電界の印加を可能にする、又は超音波の印加する（例え
ばソノフォレーシス）（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）
ことを可能にする、化学的促進剤を用いて調製されてもよい。組成物は、所望の分子が吸
収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与さ
れてもよい。
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、この装置は任意の適当な
組織又は臓器内に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（
timed-release bolus）、又は持続投与により行ってもよい。
このような製剤処方における本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体又はＮａｖ１．７の他
のペプチド阻害剤の濃度は、大幅に、例えば約０．１重量％、０．２重量％、０．３重量
％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９
重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１
．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％、２重量％から
、又は２重量％～５重量％、最大で１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、
５０重量％、６０重量％、又は７０重量％程度まで変えることができ、主に流体体積、粘
性率、及び選択した特定の投与方法による他の要因に基づいて選択することができる。本
発明のプロトキシン－ＩＩ変異体は、貯蔵用に凍結乾燥して、使用前に好適なビヒクル中
で再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質調製に対して効果的であるこ
とが分かっている。凍結乾燥及び再構成の技術は当該技術分野において公知である。
本発明の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ
４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ－
２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
適切な治療的に効果的な有効な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。
有効な用量は、望ましい結果をもたらすのに十分な量又は用量、すなわち任意の疼痛医学
的状態に付随する痛みの知覚を部分的若しくは完全に防止し、停止し、阻害し、低減し、
又は遅延するのに十分な量又は用量を指す。有効な量は、特定のビヒクル及び選択された
本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体に応じて変わってもよく、また治療すべき対象及び痛
みの重症度に関係する種々の要因及び状態に依存している。例えば、本発明の医薬組成物
を投与すべき対象の年齢、体重、及び健康状態などの要因、並びに前臨床動物研究におい
て得られる用量反応曲線及び毒性データが、考慮事項として挙げられる。必要に応じて、
決定された用量を、治療期間中、医師又は他の当業者（例えば、看護士、獣医、又は獣医
技師）によって適切に選択された適切な時間間隔で反復投与してもよい。所与の薬剤の有
効量又は治療的有効量の決定は、当業者の技量の範囲内である。
したがって、本発明の医薬組成物は、筋肉注射用に、１ｍＬの滅菌緩衝液、及び約１ｎ
ｇ～約１００ｍｇ、約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ～約２５ｍｇの本発明のプロ
トキシン－ＩＩ変異体を含有させて調製することができる。同様に、本発明の医薬組成物
は、静脈内注射用に、約２５０ｍＬの滅菌済みＲｉｎｇｅｒ溶液及び約１ｍｇ～約３０ｍ
ｇ又は約５ｍｇ～約２５ｍｇの本発明のプロトキシン－ＩＩ変異体を含有させて調製する
ことができる。非経口投与可能な組成物を実際に調製する方法は周知であり、例えば、「
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ
ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに詳
細に記載されている。
本発明の更なる実施形態
以下に、本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の更なる実施形態を列挙する。本明
細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、こ
れらの番号付けされた更なる実施形態のうちの１つ１つにもまた関係する。
１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ
１４ＦＸ１５ＣＸ１６ＬＷＣＸ１７ＫＫＬＷ（配列番号４０３）の配列を含む単離された
プロトキシン－ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ９は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１４は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ１７は、Ｋ又はＲであり；
Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約１×１０－７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し
、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０
－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
２）Ｎ末端伸長が、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７
８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列を含む
、請求項１に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
３）Ｃ末端伸長が、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９
１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む、請求項
１又は２に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
４）Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長が、プロトキシン－ＩＩ変異体にリンカーを介して結
合される、請求項２又は３に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体
５）リンカーが、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０
２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
６）配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１
０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５
４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６
８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７
９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９
５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１
３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３
２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６
３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７
５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８
５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９
５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０
５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１
５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２
５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４
２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、又は３６８のアミノ酸
配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体
。
７）約３×１０－８Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する、請求項１
～６のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
８）約３×１０－８Ｍ～約１×１０－９ＭのＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害
する、請求項７に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
９）アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ１０Ｘ
１１ＦＸ１２ＣＸ１３ＬＷＣＸ１４ＫＫＬＷ（配列番号：４０４）を含み、
Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１２は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１３は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ１４は、Ｋ又はＲである、請求項７又は８に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変
異体。
１０）配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２
３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３
９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５
２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７
７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９
９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２又は３
３５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
１１）変異体が、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する、請求項１～１０のいずれか一
項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
１２）配列ＧＰＸ１ＣＱＫＷＭＱＸ２ＣＤＸ３Ｘ４ＲＫＣＣＸ５ＧＦＸ６ＣＸ７ＬＷＣ
Ｘ８ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含み、
Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ４は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ７は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ８は、Ｋ又はＲである、請求項１１に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
１３）配列番号５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、
１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、
３２４、３２５又は３２６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離されたプロト
キシン－ＩＩ変異体。
１４）配列ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ１ＣＤＸ２Ｘ３ＲＫＣＣＸ４ＧＦＸ５ＣＸ６ＬＷＣＸ
８ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ４は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ７は、Ｋ又はＲである、請求項１２に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
１５）単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であって、配列番号７８（ＧＰＱＣＱＫＷ
ＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同
一性のアミノ酸配列を含み、
ａ）アミノ酸配列が、残基番号付けが配列番号１に従うときに、位置１におけるＱ、
位置７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ｂ）ポリペプチドが、約３０×１０－９Ｍ以下のＩＣ５０値でＩＣ５０値の測定を、
阻害し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５
×１０－６Ｍの３－ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、
ｃ）ポリペプチドが、Ｎａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたプロトキシン－
ＩＩ変異体。
１６）遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請
求項１～１５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
１７）半減期延長部分に結合した、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロトキシ
ン－ＩＩ変異体を含む、単離された融合タンパク質。
１８）半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（
ＡＢＤ）、Ｆｃ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１７に記載の融合
タンパク質。
１９）請求項１２又は１５に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体をコードする、単離され
たポリヌクレオチド。
２０）請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
２１）請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
２２）単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体を製造する方法であって、請求項２１に記
載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたプロトキシン－ＩＩ変異体
を回収することとを含む、方法。
２３）請求項１、６、１２、１３又は１５に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異
体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
２４）対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、請求項１～１
６のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体を、痛みの治療に有効な量で、それ
を必要とする対象に投与することを含む、方法。
２５）痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性
の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端
紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰
部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（Ｐ
ＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２４に記載の方
法。
２６）プロトキシン－ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２４に記載の方法。
２７）プロトキシン－ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末
梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２４に記載の
方法。
２８）対象がヒトである、請求項２４に記載の方法。
２９）痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項１～１６
のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
３０）痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性
の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端
紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰
部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（Ｐ
ＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２９に記載の使
用のためのプロトキシン－ＩＩ変異体。
３１）プロトキシン－ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２９又は３０に記載の
使用のためのプロトキシン－ＩＩ変異体。
３２）プロトキシン－ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末
梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２９、３０又
は３１に記載の使用のためのプロトキシン－ＩＩ変異体。
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例１：プロトキシン－ＩＩ変異体の設計及び生成
プロトキシン－ＩＩの一部位限定アミノ酸置換スキャニングライブラリーを設計し、選
択性、ペプチド収率、及び同質性をどの程度まで向上させることができるかを評価した。
プロトキシン－ＩＩ変異体を、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断可能なＨＳＡ融合タンパク
質として、Ｎ末端からＣ末端まで、６ｘＨｉｓ－ＨＳＡ－リンカー－ＨＲＶ３Ｃ切断可能
なペプチド－プロトキシン－ＩＩ変異体（配列番号１０８として開示される「６ｘＨｉｓ
」）のフォーマットで設計した。リンカーは（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
Ｓ；配列番号８０であり、ＨＳＡは配列番号１０６の配列を有し、ＨＲＶ３Ｃは配列番号
８２の配列を有する切断可能なペプチドである）。各プロトキシン－ＩＩ変異体は、ＨＳ
Ａから切断した後に、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰを有していた。
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いる膜脱分極アッセイにおいて、実施例３のＦ
ＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイで記載されるように、及びＱＰａｔｃ
ｈアッセイを用いる全細胞パッチクランプ実験において、実施例３で記載されるように、
変異体の特性評価を行った。
天然ペプチドと比較して更に向上した効能及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．
７アンタゴニストを生成する目的で、選択された単一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。
発現ベクターの構造
設計されたプロトキシン－ＩＩ変異体遺伝子の生成を、米国特許第６，５２１，４２７
号に記載された合成遺伝子構築技術を用いて行った。設計されたペプチド変異体のアミノ
酸配列を、ヒトの高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳したた。各変異体遺伝子のＤ
ＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡの一部と共に、一部が縮重コ
ドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメン
トに組み」立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣ
Ｒ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用
いて消化し、各毒素変異体遺伝子をベクター内に含まれるシグナルペプチド及び融合パー
トナ（６ｘＨｉｓ－ＨＳＡ－リンカー－ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド（配列番号１０８
として開示された「６ｘＨｉｓ」）に融合するようにして、設計した発現ベクターにクロ
ーニングした。標準的な分子生物学の手法を用いて、各設計した変異体について陽性クロ
ーンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、配列を確認し
た後、プロトキシン－ＩＩペプチド変異体融合タンパク質を標準的な方法を用いて発現さ
せた。
タンパク質発現
ＨＥＫ ２９３－Ｆ細胞を２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ Ｃａｔ＃１２３３８）内で維持し、細胞濃度が１．５～２．０×１０６細胞／ｍ
Ｌとなったときに分割した。加湿インキュベーター（３７℃及び８％ ＣＯ２に設定）内
で懸濁液を１２５ＲＰＭで振とうしながら、細胞培養を行った。ＨＥＫ ２９３Ｆ細胞を
１．０×１０６細胞／ｍＬに希釈した後、ＤＮＡ／脂質複合体を用いて一過性にトランス
フェクションした。複合体を生成するために、トランスフェクション１ｍＬ当たり１．２
５μｇのＤＮＡを１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１
２３０９）で希釈し、１．２５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェク
ション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ ＃１６４４７）を、１．０ｍＬのＯｐｔｉ
Ｐｒｏ培地で希釈した。ＤＮＡ及びＭａｘトランスフェクション試薬を一緒に混合し、細
胞に添加する前に、１０分間室温でインキュベートした。加湿インキュベーター（３７℃
及び８％ ＣＯ２に設定）内で、トランスフェクトされた細胞を、１２５ＲＰＭで振盪し
ながら４日間維持した。５，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離を行い、０．２μｍフ
ィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ＃４３１１５３）を通して濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ １０Ｋ（Ｃａｔ＃ＵＦＣ９０１０９６）を使用
して３，７５０×ｇで約１０分間遠心分離し、上澄みを細胞から分離した。
実施例２：プロトキシン－ＩＩ変異体の精製
プロトキシン－ＩＩ変異体を、実施例１に示したＨＳＡ融合タンパク質として発現させ
、プロトキシン－ＩＩ変異体ペプチドをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断した後、精
製を行った。プロトキシン－ＩＩ変異体の効率的な精製に関し、２つの方法を試験した。
タンパク質の精製
ＲＰ－ＨＰＬＣによるプロトキシン－ＩＩ変異体の精製
１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃１７－５
２４７－０１）を用い、ＩＭＡＣにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。ＡＫ
ＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配
を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテ
アーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合物）を用いて一晩消化させた。
逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８（２）カラム（Ｃａｔ＃００Ｂ
－４２５２－Ｐ０－ＡＸ）を装着したＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステムを用いて、切断さ
れたペプチド融合プールを更に精製した。０～６８％アセトニトリル（０．０５％ ＴＦ
Ａ）直線勾配を用いて、サンプルをカラムから溶出した。溶出画分をプールし、一晩凍結
乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２）に再構成した。
ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製されたプロトキシン－ＩＩ変異体の収率を表４に示す。平
均収率は０．０１６１５ｍｇ／Ｌであった。
Figure 2022008474000015
固相抽出（ＳＰＥ）によるプロトキシン－ＩＩ変異体の精製
１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃａｔ＃１７－５
２４７－０１）を用い、ＩＭＡＣにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。ＡＫ
ＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配
を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテ
アーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）を用いて一晩消化させた。切断後のサン
プルを５０ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ
８０５０９６）内に充填し、切断されたペプチドを濾液分画内に回収した。
ペプチドのプールを９６ウェルの固相抽出ブロック（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｏｎｄ Ｅｌ
ｕｔ Ｐｌｅｘａ Ａ３９６９０３０）に充填し、更に精製、脱塩及び濃縮を行った。ブ
ロックを真空マニフォールド（Ｗｈａｔｍａｎ）と共に用いた。ペプチドサンプルを０．
０５％ ＴＦＡ水溶液に充填及び洗浄し、０．０５％ ＴＦＡ水溶液を用いたアセトニト
リルの段階的勾配を用いて溶出させた。溶出画分を次に一晩凍結乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝
食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ
ｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に再構成した。
ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、
５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を
補ってペプチドを再構成し、吸光度の測定を２８０ｎｍで行った。次に、各サンプルの吸
光度係数を用いて濃度値を算出した。２μｇの各ペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕ
ＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ １５ウェルの
ゲル上に充填し、ＭＥＳ緩衝液（非還元）中で実行した。
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）分析カラム（Ｃａｔ＃００Ａ－４０４
１－Ｂ０）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ上において、０．０５％ Ｔ
ＦＡの直線勾配中の４～８０％アセトニトリルを用いて、サンプルの分析を行った。すべ
てのペプチドの濃度を標準化し、合計１．３μｇ／サンプルに対して１０μＬを注入した
。吸光度を２２０ｎｍにおいてモニターし、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて
クロマトグラム分析を行った。
ＳＰＥによって精製されたプロトキシン－ＩＩ変異体の収率（ｍｇ）を表５に示す。平
均収率（ｍｇ／Ｌ）は０．０５３５３であった。
ＳＰＥ精製プロセスの効果により、サンプルの処理が、ＲＰ－ＨＰＬＣ上での順次的処
理ではなく９６－ウェルブロック内での並列的に行われるため、精製が容易になり、スル
ープット並びに収率が向上した。ＲＰ－ＨＰＬＣの場合と比較し、ＳＰＥによって精製さ
れた変異体の収率（ｍｇ／Ｌ）は、平均で３倍超高かった。
Figure 2022008474000016
Figure 2022008474000017
実施例３：プロトキシン－ＩＩ変異体の特徴付け
選択プロトキシン－ＩＩ変異体を膜脱分極及び全細胞パッチクランプアッセイにおいて
特性評価を行い、その効能及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜における脱分極アッセイ
生成されたペプチドによる、Ｎａｖ１．７作動薬ベラトリジン（３－ベラトロイルベラ
セビン；Ｂｉｏｍｏｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＮＡ１２５）によって誘発される膜脱分極の阻
害能を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ア
ッセイを使用し、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１０１８）を電子受
容体として、ＰＴＳ１８（トリナトリウム８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－
トリスルホネート）（Ｓｉｇｍａ）をドナーとして用いて、ドナーを３９０～４２０ｎｍ
で励起して、ＦＲＥＴを５１５～５７５ｎｍで測定することによって、測定した。
１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネ
ティシン、及び１００μＭ ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補った
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１：１）において、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２
９３細胞を培養した。ポリリジンコーティングされた３８４－ウェルの黒色の透明底プレ
ート内に、５０μＬの採取細胞を２５，０００細胞／ウェル、でプレーティングした。プ
レートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした後、３７℃で一晩中インキュベート
した。インキュベートはすべて、特に明記しない限り暗所で行った。翌日、アッセイ緩衝
液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、
５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄し、
２５μＬのアッセイ緩衝液に再懸濁した。ＤＭＳＯ中の１０％プルロニックＦ１２７に色
素を１：１（ｖ／ｖ比）で懸濁させ、ＰＴＳ１８色素の２ｘストック（６μＭ）を調製し
た。２５μＬの２ｘ ＰＴＳ１８ストックをウェル内に添加し、細胞を３０分間室温で染
色した後、アッセイ緩衝液を用いて色素を洗い流した。アッセイ緩衝液（１０μＭ ＤＩ
ＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭ ＶＡＢＳＣ－１を含む）中に最終濃度の３倍の濃度と
なるようにペプチドを懸濁させ、バックグラウンド蛍光を抑制した（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ
＃２０１９８７）。２５μＬ／ウェルの懸濁されたペプチドを各ウェルに添加し、６０分
間室温でインキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジンによって（７５μＭ（３
ｘ）ストック溶液を２５μＬ／ウェルで添加することによって）脱分極を誘発し、アゴニ
ストを添加した３０～１００秒後に、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の減少を測定した。常
法に従いベラトリジンを添加した後、測定済みの各ペプチドの１．３倍希釈を行い、ＦＬ
ＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告する。
各実験系において合成プロトキシン－ＩＩ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ）の濃度反応曲線を作成し、対照として用いた。シグナルを、陰性対照（作動薬ベラ
トリジン単独に対応する）値と陽性対照（１０μＭテトラカインの存在下でのベラトリジ
ンに対応する）値との差に対して標準化することによって、各ウェルに対する蛍光カウン
トを％応答に変換した。測定を行うために、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間
均一性補正」（すべての蛍光トレースを平均初期開始強度に標準化）及び「バイアス値減
算」（初期開始強度を各トレースから減算）をオンにした。各データポイントは、各ウェ
ルにおける応答を表わしていた。すべての個々のデータポイントを非線形最小二乗法フィ
ッティングにおいて用いて、Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いてＨｉｌｌ関数に
対するベストフィットを求めた。得られた近似曲線からＩＣ５０値を算出した。陽性（Ｐ
）及び陰性（Ｎ）対照の平均応答を用いて、ウェルにおける％応答の算出を以下のように
行った：％応答＝１００＊（Ｎ－Ｒ）／（Ｎ－Ｐ）。
その日の対照アンタゴニストの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合に
、アッセイプレートを容認した。
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．５（配列番号１０５）、Ｎａｖ１．７（配列番号７９）又はＮａｖ１．
６（配列番号４０７）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペ
ニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ Ｎ
ＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１
：１）において培養した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２の条件に維持し、約５０～９０％
コンフルエンスに達した時点でアッセイを行った。テトラサイクリン誘導可能な方法（配
列番号４０７）でヒトＮａｖ１．６を安定発現するＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清、
１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬ Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ、及び
４００μｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎを補ったＨＡＭｓ Ｆ１２において培養した。細胞を３
７℃及び５％ ＣＯ２の条件に維持し、約５０～９０％コンフルエントに達した時点でア
ッセイを行った。実験の２４～４８時間前に、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを用いて
Ｎａｖ１．６発現を誘発した。
ＱＰａｔｃｈ ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）による試験の前に、最初にＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に細胞を再懸濁し、０．０５％トリプシ
ンを用いて（５分間、３７℃で）分離させ、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。
同じ培地を用いて細胞密度を１～２×１０６／ｍＬに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ ＨＴ
の細胞「ホテル」に移し、数時間に渡る試験に用いた。ギガオームシール形成及び全細胞
パッチクランプ記録の場合、細胞外溶液に、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ、
１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ＝７．４及び浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含有させた。細胞内液には、
１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌ、及び
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含有させた
。アッセイで用いた電圧プロトコルは以下のとおりである。保持電位を－７５ｍＶ（Ｎａ
ｖ１．７）、－６０ｍＶ（Ｎａｖ１．６）、又は－１０５ｍＶ（Ｎａｖ１．５）とした後
、細胞を最初に－１２０ｍＶに２秒間過分極化させ、更に０ｍＶに５ｍｓ脱分極させた後
、保持電位に戻した。このプロトコルを、液体供給時に、６０秒毎に１回繰り返した（下
記参照）。細胞は、その他の場合には、前述の電圧プロトコルが実行されなかったときに
保持電位に保持した。全細胞の記録構成を設定しる際、当該記録に用いる細胞に対して、
細胞外溶液（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を有す
る又は有さず但し最後の添加では１μＭ ＴＴＸ又は１０ｍＭリドカインを陽性対照とし
て含有していた）を計５回添加した。最初の液体供給には対照緩衝液（５μＬ）のみが含
まれていた。供給の５秒後、電圧プロトコルを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。
次の３回の液体供給（各５μＬ）には、試験化合物（３回の供給すべてにおいて同じ化合
物を同じ濃度）又は対照緩衝液（対照細胞に対してのみ）が含まれていた。これらの各供
給の５秒後に、電圧プロトコルを再度１０回実施した（同様に毎分１回）。最後の供給に
は陽性対照が含まれており（１０μＬで３回副供給、それぞれ２秒間隔）、５秒後に同じ
電圧プロトコルを２回実行してベースライン電流を得た。電流を２５ｋＨｚでサンプリン
グし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルタにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償
レベルを８０％に設定した。各細胞に対して、最初の４回の液体供給における各電流トレ
ースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、陽性対照の存在下での最後のトレースのピーク
電流振幅から最初に減算した後、最初の（対照緩衝液）供給における最後のトレースのピ
ーク電流振幅に対して、阻害率（％）として標準化した。電流のランダウン（rundown）
を調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの値（阻害率（％））を、同じ
実験中の対照細胞の平均（通常５～６個の）の阻害率（％）の値に対して更に標準化した
。最後の化合物供給における最後の２つの測定値の平均（すなわち、試験化合物の各濃度
に対する補正された阻害率（％）値）を、試験した特定の化合物濃度における各細胞に対
する％阻害値として取得した。各化合物濃度において試験したすべての細胞に対する阻害
率（％）値を平均化し、濃度応答算出において用いた。実験はすべて、室温（約２２℃）
で行った。データを平均±標準誤差として表す。野生型プロトキシン－ＩＩは、各実験に
おいて陽性対照として含めた。データは、プロトキシン－ＩＩの効能がその履歴平均の±
０．５対数単位内である場合にのみ容認した。
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いて得られた選択プロトキシン－ＩＩ変異体に
対する、Ｎａｖ１．７のＩＣ５０値を表６に示す。
Figure 2022008474000018
選択プロトキシン－ＩＩ変異体を、ＱＰａｔｃｈを用いてヒトＮａｖ１．５に対する選
択性に対して試験した。選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．５の両方のＩ
Ｃ５０値を、表７に示すＱＰａｔｃｈを用いて得た。
Figure 2022008474000019
実施例４．コンビナトリアルプロトキシン－ＩＩ変異体の生成及び特性評価
いくつかのアプローチを用いて天然ペプチドと比較して更に改善された効能及び選択性
プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成するため、コンビナトリアルラ
イブラリーを設計し、選択された単一位置ヒットによる相加的効果について試験した。
すべての非システインプロトキシン－ＩＩ位置において、多様化のためにＡ、Ｄ、Ｑ、
Ｒ、Ｋ及びＳを用いて、限定的なアミノ酸スキャンを行った。これらの実験においては、
実施例１に記載のように、プロトキシン－ＩＩを発現させ、一価のＦｃ融合タンパク質と
して試験した。このスキャンにより、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性
を向上させた置換Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ａが同定された。
位置Ｍ６及びＭ１９における全アミノ酸スキャン（ｃｙｓ及びｔｒｐを除く）も行った
。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させたＭ
１９Ｆ置換が同定された。
プロトキシン－ＩＩ／フエントキシン－ＩＶの単一位置キメラを双方向から設計した。
このライブラリーの目的は、野生型プロトキシン－ＩＩの効能及び選択性プロファイルを
保持したプロトキシン－ＩＩ変異体を得ることであり、フエントキシン－ＩＶに付随する
有用なリフォールディング特性が得られであろう。このスキャンから置換Ｒ２２Ｔ及びＥ
１２Ｎが同定された。
Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＳを用いた限定的なアミノ酸スキャンによって位置Ｙ
１を変異させ、また電荷クラスタエンジニアリングによってペプチドＮＶ１Ｇ１１５３を
更に設計し、ペプチドの三次元構造内のすべての荷電残基組（Ｄ１０／Ｅ１２、Ｋ４／Ｅ
１７、Ｄ１０／Ｅ１２／Ｒ１３）を変異させた。
作用部位に対するペプチド分布を改善し、かつ得られるペプチドの分子量を著しく増加
させることなくペプチドの半減期を改善することを目的として、Ｎ－及びＣ末端伸長を選
択されたペプチド（例えばＮＶ１Ｇ１１５３）に導入した。使用したＮ－及びＣ末端伸長
は、表８及び９にそれぞれ示すとおりであり、Ｏｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ ４３４、２６６～２７２、２００８；Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１ ２９：４、３５２～３５６；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋ
ｙら、（２０１２）１０９：４０、１６０９５～１６１００にも記載されている。また細
胞透過性ペプチドであるＨＩＶ Ｔａｔ及びポリアルギニンも用いた。種々のリンカーを
用いて、プロトキシン－ＩＩ変異体をＮ－及び／又はＣ末端伸長に結合させた。使用した
リンカーを表１０に示す。
実施例３に記載の方法を用い、各操作から得たプロトキシン－ＩＩ変異体を、Ｎａｖ１
．７に対するそれらの効能及び選択性に関して試験した。Ｎａｖ１．７を２００ｎＭ以下
のＩＣ５０値で阻害した変異体のアミノ酸配列を表３に示す。野生型プロトキシン－ＩＩ
と比較したときの選択された変異体におけるアミノ酸置換、及びＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ
アッセイにおけるＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値を表１１に示す。
Figure 2022008474000020
Figure 2022008474000021
Figure 2022008474000022
Figure 2022008474000023
Figure 2022008474000024
Figure 2022008474000025
Figure 2022008474000026
Figure 2022008474000027
Figure 2022008474000028
Figure 2022008474000029
Figure 2022008474000030
Figure 2022008474000031
野生型プロトキシン－ＩＩは、実施例３で説明したように、ＦＬＩＰＲアッセイにおい
て約４ｎＭのＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害する。著しいＮａｖ１．７の効能を保持す
る変異体を更に特性評価した。図１は、３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害
する、生成されたプロトキシン－ＩＩ変異体の配列属である。
ＱＰａｔｃｈを用いて、選択されたプロトキシン－ＩＩ変異体を、そのＮａｖ１．７の
阻害及びそのヒトＮａｖ１．６に対する選択性に関して試験した。ＱＰａｔｃｈを用いて
得られた選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６の両方に対するＩＣ５０値
を図２に示す。これらのペプチドは３０ｎＭ以下のＩＣ５０でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎ
ａｖ１．６と比較したときにＮａｖ１．７に対して少なくとも３０倍の選択性を有してい
た。
図２に示すペプチドのアミノ酸配列を図３に示す。これらのペプチドはすべて、野生型
プロトキシン－ＩＩと比較したときに、Ｗ７Ｑ及びＭ１９Ｆ置換を有していた。
プロトキシン－ＩＩ変異体の発現及び精製は、実施例１に記載のとおり行ったか、又は
標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を、野生型
プロトキシン－ＩＩの収率と比較した。表１２は、選択プロトキシン－ＩＩ変異体の収率
がプロトキシン－ＩＩの収率よりも著しく高いことを示しており、変異体のフォールディ
ング特性の向上を示している。固相合成のスケールは０．５ｍｍｏｌであった。
Figure 2022008474000032
実施例５．プロトキシン－ＩＩ変異体は、痛みのインビボモデルにおいて効果的である
。
材料及び方法
動物：雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（２４～２６ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから
発注、別個に収容）を本試験で用いた。
行動試験
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験：機械的（触覚）閾値を、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ Ｈａｉｒｓによっ
て、Ｕｐ－Ｄｏｗｎ法（Ｄｉｘｏｎ、１９８０、Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）によって
評価した。７つの段階的な刺激（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ繊維：０．０３、０．０７、０．１６
、０．４、０．６、１、２ｇ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）を用い
た。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ毛を、後足上の中央の足底領域（骨隆起の間）に対して垂直に与え
た。十分な力を印加してフィラメントをわずかに曲げて、３秒間保持した。Ｃｈａｐｌａ
ｎの論文によると、陽性応答は、フィラメントを取り除いたときに、１）急に逃避する、
又は２）即座に振り回すこととすることができる。詳細についてはＣｈａｐｌａｎらを参
照のこと。試験前に、３０～６０分間、試験チャンバー内のワイヤメッシュにマウスを順
応させた。
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：改良されたＨａｒｇｒｅａｖｅｓ ｂｏｘを用いて、熱足
逃避潜時（ＰＷＬ）を測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８、Ｐａｉｎ、３２：
７７～８８；Ｄｉｒｉｇら、１９９７、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：
１８３～１９１）。この箱は、一定温度（２７℃）に維持されたガラス製高床付きのチャ
ンバーからなる。熱侵害刺激は、ガラス表面下方の投影電球光線から発生する。光線を骨
隆起（中央の足底）間の領域に向ける。「開始」ボタンによって光照射を開始し、タイマ
ーを開始する。刺激を受けた足に動き（例えば突然の逃避）がある場合には、スイッチが
トリガーされて消灯し、タイマーが停止する。潜時（秒）が表示される。動きが起きない
場合、電球は２０秒（カットオフ）後に消灯し、組織傷害を防止する。ＰＷＬ測定前の３
０～６０分間、動物をガラス表面上で馴化させた。一定のアンペア数を試験全体に渡って
用いた結果、予備試験の足逃避潜時が８～１２秒となった（少なくとも５分間間隔を置い
て行った３～６回の読み取りに対して平均化した場合）。
ＭＰＥ％の算出：パーセント最大可能効果（ＭＰＥ％）＝（Ｔ１－Ｔ０）／（Ｔｃ－Ｔ
０）×１００％。Ｔ０：０日目の閾値（ＣＦＡ後、ポンプ前）；Ｔ１：ポンプ埋め込み後
、１日目の閾値；Ｔｃ：試験のカットオフ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験では２０秒、Ｖｏ
ｎ Ｆｒｅｙ試験では２ｇ）。
ホットプレート試験：２５ｃｍ×２５ｃｍ（１０”×１０”）の金属プレートを、４つ
のプレキシグラス壁（３８センチメートル（１５インチ）高さ）で囲んだものの上に動物
を置いた。プレートを５０又は５５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後
ろ足を振り回すか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定し、動
物をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を、４０秒後（５０℃）又は２０秒（
５５℃）後にプレートから取り除いて、起こり得るいかなる組織損傷も防止した。このト
ライアルを、１日に１５～６０分毎に２～５回繰り返した。
炎症性痛覚モデル
ＣＦＡモデル：動物をイソフルランで麻酔し（４％で誘導、及び２％維持）、５０μＬ
のハミルトンシリンジに装着した２７ゲージのニードルを用い、１００％のフロイントの
完全アジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）２０μＬを１本の後足の足底領域の中央部に注入した。
カラギーナンモデル：動物をイソフルランで麻酔し（４％で誘導、及び２％維持）、通
常の生理食塩水に溶解させた２％のλ－カラギーナン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓ
ａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む２５μＬの液体を、インシュリンシリンジ（ＢＤ；
Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて後足の足底領域の中央
部に注入した。
ミニポンプの埋め込み
Ａｌｚｅｔマイクロオスモティックミニポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ Ｍｏｄｅｌ １００３Ｄ及び２００１Ｄ）を整備し、製造業者のガイドに従い初期化
した。マウスにイソフルランを用いて麻酔した（５％誘導；２％維持）。マウスの背中を
剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭きとり、肩甲骨の間に小さい切
開を行った。一対のピンセット又は止血鉗子を用いて、皮下結合組織を広げて分離させる
ことにより小さいポケットを形成した。流量調節材が切開から離れる方向に向くようにし
て、ポンプをポケット内に挿入した。この後、７ｍｍのステープラーを用いて皮膚の切開
を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
データ解析
平均±標準誤差としてデータを表す。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、グラフ化及び統計分析を図った。時
間に対する閾値を比較するため、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ
の多重比較検定を、ｐ＜０．０５の有意水準で用いた。ホットプレート及びＭＰＥ％デー
タを一方向ＡＮＯＶＡによって分析した後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行っ
た。
結果
変異体ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３０３４－ＣＯＯＨ）、ＮＶ１Ｄ３３６８－
ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３３６８－ＣＯＯＨ）及びＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ（ＮＶ１Ｄ２７７５－
ＣＯＯＨ）の効果を、ＣＦＡモデル（炎症性痛覚モデルとして広く使用）において試験し
た。ＣＦＡを後足に注射することにより、足浮腫（図示せず）及び熱刺激（熱痛覚過敏）
に対する過敏症が誘発され、これは０日目に注射された足において熱潜時が減少したこと
により示される（図６Ａ）。ＮＶ１Ｄ３０３４－ＯＨを６８４及び１８２４μｇ／日で、
皮下浸透圧ミニポンプによって投与したとき、熱痛覚過敏が完全に逆転された（図４Ａ及
び４Ｂ）。
ＮＶ１Ｄ３３６８－ＯＨによって、６８４及び１８２４μｇ／日で、ＣＦＡ誘発熱痛覚
過敏が十分に逆転された（図５Ａ及び５Ｂ）。
ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨはＣＦＡモデルにおける強い効果を示した。熱潜時は、ＮＶ１
Ｄ２７７５投与後のカットオフに近い値に到達しており（図６Ａ及び６Ｂ、１８２４μｇ
／日）、これは、抗痛覚過敏効果に加えて強力な無痛覚効果を示唆するものである。更に
、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨによりＣＦＡ誘発触覚異痛症が逆転された（図６Ｃ及び６Ｄ、
１８２４μｇ／日）。ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの抗痛覚過敏効果は、ポンプを埋め込んで
から早くも４時間後に見られた（図７Ａ）。熱及び触覚試験の両方において８時間目にお
いて効果が最大に達し（図７Ａ及び７Ｂ）、これが２４時間維持された。熱潜時及び触覚
閾値は、ポンプ埋め込み後４８時間（ポンプが空になってから約２４時間後）でコントロ
ールのレベルに戻った（図７Ａ及び７Ｂ）。
２つの更なるペプチド、ＮＶ１Ｄ３３６８－アミド（ＮＶ１Ｄ３３６８－ＮＨ２）及び
ＮＶ１Ｄ３０３４－Ｎ－メチルアミド（ＮＶ１Ｄ３０３４－ＮＨＭｅ）により、ＣＦＡ誘
発熱痛覚過敏が容易に逆転された。熱ＭＰＥ％の試験結果を表１３にまとめる。
Figure 2022008474000033
またＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨは、ホットプレート試験において強い用量依存性有効性を
示した（図８）。５０℃及び５５℃における潜時は、１８２４μｇ／日の投与の後にカッ
トオフに近い値に達した。２２８μｇ／日において、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨは、熱潜時
がＰＢＳ対照と比較して少なめだが著しく増加した。
ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨの有効性を、炎症性痛覚の別のモデル（カラギーナンモデル）
において評価した。動物に、ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ又はＰＢＳポンプを埋め込んだ。ポ
ンプ埋め込み前及びポンプ埋め込み後１日目に熱逃避潜時の測定を行った。λ－カラギー
ナンを後足に注射し、熱潜時の再測定をカラギーナン注入の２、３、及び４時間後に行っ
た。ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨは、１８２４μｇ／日において著しい無痛覚を示した（図９
）。４時間の試験時間に渡り、λ－カラギーナンを後足に注射すると炎症が誘発され（図
示せず）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における熱足逃避潜時が短縮された（図９、ＰＢＳ
群）。ＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨを用いて１８２４μｇ／日で動物を前処理した結果、カラ
ギーナン誘発痛覚過敏から十分に保護された。
実施例６．コンビナトリアルプロトキシン－ＩＩ変異体の生成及び特性評価
プロトキシン－ＩＩのアミノ酸スキャニングライブラリーを構築した。プロトキシン－
ＩＩのすべての非システイン位置（Ｔｙｒ１、Ｇｌｎ３、Ｌｙｓ４、Ｔｒｐ５、Ｍｅｔ６
、Ｔｒｐ７、Ｔｈｒ８、Ａｓｐ１０、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ａｒｇ１３、Ｌｙｓ１４
、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｍｅｔ１９、Ｖａｌ２０、Ａｒｇ２２、Ｌｅｕ２３、Ｔｒｐ
２４、Ｌｙｓ２６、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ２８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０）において、天
然の残基の代わりに、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙ
ｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＴｙｒの残
基を置換した。
ヒト血清アルブミンに対する組み換え融合体として、変異体ペプチドを発現させ、ＨＲ
Ｖ３Ｃを用いて部位特異的・酵素的に切断し、実施例１に記載のプロトキシン－ＩＩ変異
体を生成した。各プロトキシン－ＩＩ変異体は、ＨＳＡによる切断後に、切断部位からの
Ｎ末端ＧＰの残留物を有していた。プロトキシン－ＩＩ変異体毎に、ヒトＮａｖ１．７に
対するＩＣ５０値を、実施例３に記載のプロトコルに従い、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ又は
Ｑｐａｔｃｈを用いて測定した。Ｑｐａｔｃｈ電気生理学的方法を用い、更なるｈＮａｖ
チャネルに対する選択性に関して、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ５０≦１００ｎＭを示
す変異体をカウンタースクリーニングした。選択性についてヒットしたものを同定し、組
み換え発現及び固層ペプチド合成を用いて産生させたコンビナトリアルペプチドライブラ
リーの設計に用いた。上で詳述したのと同じストラテジーを用いて、コンビナトリアル変
異体をスクリーニングした。
得られた結果によると、選択性の改善のために変異導入し得る位置として、Ｇｌｎ３、
Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ
３０が挙げられる（残基番号付けは配列番号１に従う）。
溶液中のプロトキシン－ＩＩの構造をＮＭＲで解析し、その表面表現を図１０に示す。
図の左側は、前述（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３～６
６３１）した、Ｍ６を取り囲むＴｒｐ残基のリングＷ５／Ｗ７／Ｗ２４を示す。分子の反
対側については、本試験において変異導入及びＮＭＲ構造の両方を用い、他のナトリウム
チャネルアイソフォームよりもｈＮａｖ１．７に対する選択性を向上させるために変異導
入できる複数のアミノ酸位置からなるプロトキシン－ＩＩの選択性表面を同定した。選択
性表面に存在する残基としては、残基Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７
、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０が挙げられる（残基番号付けは配列番号１に従
う）。Ｎａｖ１．７に対する選択性に関与する選択性表面及びその内部の複数の位置の同
定はこれまでに報告がない。
Ｓｅｒ１１の置換によるプロトキシンＩＩ変異体の選択性の向上は予想外である。それ
は、従来の報告では、Ｓｅｒ１１の変異が複数のＮａｖチャネルに対して影響を与え、ゆ
えに残基はプロトキシン－ＩＩのＮａｖ１．７に対する選択性には関与しないと判断され
たからである（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３～６６３
１）。
プロトキシン－ＩＩ変異体の合成的製造において鍵となるステップは、ジスルフィド対
合が形成される、直鎖状ペプチドの酸化的フォールディングである。フォールディング後
の天然のプロトキシン－ＩＩ精製のためのＲＰ－ＨＰＬＣトレースの結果、異なる滞留時
間において複数のピークが見られ、それらは、分子量は正しいものの活性レベルが異なり
、すなわち正しくフォールディングされた異性体ペプチドとそうでないものとの混合物で
あることを示すものである。
ＲＰ－ＨＰＬＣの主要なピークの相対強度、したがって正しくフォールディングされた
ペプチドの相対強度は、プロトキシン－ＩＩの様々な位置における置換により向上させる
ことができた。Ｔｒｐ７又はＴｒｐ３０の変異により、得られるプロトキシン－ＩＩ変異
体のフォールディングが改善された。Ｔｒｐ７及びＴｒｐ３０の療法の変異により、得ら
れるプロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディングが更に改善され、リフォールディング
困難なプロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディングをレスキューできた。
選択性を向上させる１つ又は２つ以上の置換（Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌ
ｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８及びＬｅｕ２９）、並びにＴｒｐ７及びＴｒｐ３０の
変異を有するコンビナトリアル変異体ペプチドの製造により、高い選択性及び好適なリフ
ォールディング特性の両方を有するペプチドが得られた。プロトキシン－ＩＩは、阻害性
システインノットペプチドのファミリー３に属する（Ｋｌｉｎｔら，Ｔｏｘｉｃｏｎ ６
０：４７８～４９１，２０１２）。Ｔｒｐ７は、すべてのファミリー３のメンバーで保存
され、別のファミリー３の阻害性システインノットペプチドであるジンザオトキシン（Ji
ngzhaotoxin）－Ｖのこの位置の置換、並びにＴｒｐ５及びＭｅｔ６の置換により効能が
低下したことから、ジンザオトキシン－Ｖの位置５、６及び７の疎水性残基が、ジンザオ
トキシン－ＶのＮａｖ１．７阻害能に必須であることを示すものである（国際公開第２０
１４／１６５２７７号）。Ｔｒｐ５／Ｍｅｔ６／Ｔｒｐ７はまた、プロトキシン－ＩＩで
も保存されており、したがって、Ｔｒｐ７の極性残基による置換が、プロトキシン－ＩＩ
活性を損なわずに顕著にリフォールディング特性を向上させ得ることは予想外であった。
Ｔｒｐ３０の置換により、変異体ペプチドのＮａｖ１．７選択性及びリフォールディング
特性が同時に向上することが示され、また個々の有利な置換が典型的に１つのパラメータ
ーのみを改善するため、予想外であった。
表１３は、選択により得られたプロトキシン－ＩＩ変異体のアミノ酸配列を示す。
Figure 2022008474000034
選択された変異体を、実施例３に記載のＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ又はＱｐａｔｃｈを用
いてそれらのＮａｖ１．７の阻害を特性評価した。表１５は得られたＩＣ５０値を示す。
いくつかの変異体については、１つの濃度（１０ｎＭ又は３０ｎＭ）における阻害能（％
）（％バルク、コントロールのパーセントブロック）のみをＱｐａｔｃｈで記録した。
Figure 2022008474000035
選択された変異体を、様々なヒトＮａｖ１．ｘチャネルに関して試験した。表１６はそ
れらの試験結果を示す。各チャネルに対するＩＣ５０値は、ＱＰａｔｃｈを用いて測定し
た。
Figure 2022008474000036
プロトキシン－ＩＩ変異体の発現及び精製は、実施例１に記載のとおり行ったか、又は
標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を、野生型
プロトキシン－ＩＩの収率と比較した。表１７は、選択プロトキシン－ＩＩ変異体の収率
がプロトキシン－ＩＩの収率よりも著しく高いことを示しており、変異体のフォールディ
ング特性の向上を示している。固相合成のスケールは０．１ｍｍｏｌであった。
Figure 2022008474000037
実施例７．プロトキシン－ＩＩ変異体は、鞘内投与後の疼痛のｉｎ ｖｉｖｏモデルに
おいて有効である。
鞘内投与後の疼痛の減少における選択プロトキシン－ＩＩ変異体の有効性を評価した。
ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ、ＮＶ１Ｄ３０３４及び６３９５５９１８を試験に用
いた。動物モデルを用い激しい熱疼痛（テールフリック及び熱いプレート）、並びに損傷
により誘発される疼痛（ホルマリンフリンチング）を測定した。
テールフリック試験：動物をテールフリック装置（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）に置いた。
当該装置は、焦点赤外光加熱領域（直径５ｍｍ）を有する。動物の尾部（遠位端部から１
／３～１／２の部分）を焦点加熱領域に置いた。ビヒクルで処理した動物で１０秒以内に
テールフリックが引き起されるよう、熱源の温度を調節した。文献に通常記載されるよう
に、１５秒のカットオフ時間を用いて、組織の損傷を防止した。熱刺激の開始と何らかの
回避反応との間の経過時間を自動的に測定し、試験群毎に記録した。
ホットプレート試験：２５ｃｍ×２５ｃｍ（１０”×１０”）の金属プレートを、４つ
のプレキシグラス壁（３８センチメートル（１５インチ）高さ）で囲んだものの上に動物
を置いた。プレートを５２．５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後ろ足
を振り回すか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定して、動物
をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を３０秒後にプレートから取り除き、起
こり得るいかなる組織損傷も防止した。
ホルマリンフリンチング：ＵＣＳＤ社製の自動「フリンチ反応」測定装置を用いて、ホ
ルマリンにより誘発される疼痛行動（すなわち足の振り回し）を測定した。当該装置は、
装置床の下に装備した動作センサーを使用して、動物の片方の後足に貼着した金属バンド
のいかなる突然の移動も検出する。ホルマリン注入の３０分～１時間前に、シアノアクリ
レートを小滴垂らし、片方の後足の足底表面に小型の金属バンドを取り付け、動物を試験
チャンバーに置き、馴化させた。金属バンドが装着された足の背側にホルマリン（２．５
％、５０μＬ）を皮下注入した。足底へのホルマリン注入の直後、特注したシリンダー（
２５×１０×２０ｃｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）中に動物を置
いた。足の振り回しを自動的に記録した。
急性熱疼痛モデルでは、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１８は、テールフリッ
ク試験（図１１Ａ及び図１１Ｂ）及びホットプレート試験（図１１Ｃ、図１１Ｄ）におい
て、鞘内単回投与後、長い潜時に示されるように、強力かつ遷延性の痛覚脱失を生じさせ
た。痛覚脱失の有意性及び持続期間は用量依存的だった。
後足へのホルマリン注入は、損傷により誘発される疼痛において通常用いられるモデル
である。注入により、特徴的な二相性のフリンチ行動が誘発され、それは試験動物におけ
る疼痛を示すものである。図１１Ｅで示すように、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５
９１８の鞘内注入の前処理を受けた動物では、ホルマリン試験においてフリンチが少なく
、損傷により誘発される疼痛の阻害が示唆される。
同様に、ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５－ＯＨ及びＮＶ１Ｄ３０３４は、テールフリック、
ホットプレート及びホルマリン試験において、鞘内単回投与後に有意な効果を示した（図
１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図
１３Ｄ、図１３Ｅ）。
実施例８．更なるプロトキシン－ＩＩ変異体の特性評価
実施例６に記載の方策及び方法を用いて、更なるプロトキシン－ＩＩ変異体を設計し、
発現させ、実施例３に記載のプロトコルに従い、ＦＬＰＲ Ｔｅｔｒａ及び／又はＱｐａ
ｔｃｈで特性評価した。
表１８は、選択により得られたプロトキシン－ＩＩ変異体のアミノ酸配列を示す。
Figure 2022008474000038
Figure 2022008474000039
Figure 2022008474000040
Figure 2022008474000041
Figure 2022008474000042
Figure 2022008474000043
Figure 2022008474000044
Figure 2022008474000045
Figure 2022008474000046
Figure 2022008474000047
選択された変異体を、実施例３に記載のＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ又はＱｐａｔｃｈを用
いてそれらのＮａｖ１．７の阻害を特性評価した。表１９は得られたＩＣ５０値を示す。
いくつかの変異体については、１つの濃度（１０ｎＭ又は３０ｎＭ）における阻害能（％
）（％ ｂｌｋ、コントロールのパーセントブロック）のみをＱｐａｔｃｈで記録した。
ｓｅ；標準誤差
Figure 2022008474000048
Figure 2022008474000049
Figure 2022008474000050
Figure 2022008474000051
Figure 2022008474000052
実施例９．変異体６３９５５９１８の生成
野生型プロトキシン－ＩＩと比較するとき、プロトキシン－ＩＩ変異体６３９５５９１
８はＷ７Ｑ及びＷ３０Ｌ置換を有する。実施例６に記載のように、Ｔｒｐ７及びＴｒｐ３
０の変異（一方又は両方）により、得られるプロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディン
グが改善され、リフォールディング困難なプロトキシン－ＩＩ変異体のフォールディング
をレスキューできた。
６３９５５９１８をバックボーンとして更なる変異体を生成し、分子の特性の更なる改
善特徴を評価した。いくつかの変異体を実施例６及び７に更に記載する。
生成された変異体及びそれらの配列を表２０に示す。
Figure 2022008474000053
Figure 2022008474000054
変異体を上記のとおり特性評価した。表２１は、ＩＣ５０値及び／又はパーセントブロ
ック（％ ｂｌｋ）を示す（コントロールサンプルとの比較による、電流の％阻害）。Ｓ
ｅ：標準誤差。
Figure 2022008474000055
実施例１０．変異体６３９５５９１８の生成
得られるペプチドの体内分布を改善するために、更なる６３９５５９１８の変異体を設
計した。
種々のファミリー３抑制性システインノットペプチドについても、Ｗ７及びＷ３０置換
を設計し、これらの変異による選択性及びリフォールディング特性の改善が、プロトキシ
ン－ＩＩを越えて他の相同性の高いペプチド配列にも見られるか否かを評価した。Ｋｌｉ
ｎｔら（Ｔｏｘｉｃｏｎ ６０：４７８～４９１，２０１２）により定義されるように、
Ｎａｖチャネル（ＮａＳｐＴｘ）を阻害するファミリー３クモ毒素を、位置７におけるＱ
の組み込み及び位置３０におけるＬの組み込みのための足場として選択した（番号付けは
配列番号１に従う）。これらの配列としては、β－セラフォトキシン－Ｇｒ１ｃ、β－セ
ラフォトキシン－Ｇｒ１ｅ、β／κ－セラフォトキシン－Ｃｇ２ａ、κ－セラフォトキシ
ン－Ｐｓ１ａ、κ－セラフォトキシン－Ｐｓ１ｂ、κ－セラフォトキシン－Ｇｒ２ｂ、κ
－セラフォトキシン－Ｇｒ２ｃ、κ－セラフォトキシン－Ｇｒ２ｄ、κ－セラフォトキシ
ン－Ｃｇ２ａ、κ－セラフォトキシン－Ｃｇ２ｂ、κ－セラフォトキシン－Ｅｃ２ｃ、β
－セラフォトキシン－Ｇｒ１ｄ、β／κ－セラフォトキシン－Ｐｍ２ａ、κ－セラフォト
キシン－Ｅｃ２ａ及びκ－セラフォトキシン－Ｅｃ２ｂが挙げられる。
変異に用いる更なるファミリー３ＮａＳｐＴｘ足場は、Ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ（
ｈｔｔｐ：／／＿＿ｗｗｗ＿ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ＿ｏｒｇ／＿＿ｍａｉｎＭｅｎ
ｕ＿ｈｔｍｌ．）において同定された。ファミリー３毒素のアラインメントを図１４に示
す。
表２２は、設計された変異体の配列を示す。
Figure 2022008474000056
Figure 2022008474000057
Figure 2022008474000058
Figure 2022008474000059
非天然アミノ酸を組み込んだ得られる変異体は、標準的な固相ペプチド合成及び酸化的
リフォールディング法により生成される。
ＰＥＧ基を有する変異体は、標準的な化学的コンジュゲーション法により生成される。
実施例３に記載のように、得られる変異体を、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃ
ｈアッセイにおいてそれらのＮａｖ１．７阻害能を試験する。
生成される変異体を、実施例３に記載の方法を用いて、それらの選択性を試験する。

Claims (34)

  1. ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であって、Ｗ７
    Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の
    番号付けは配列番号１に従う、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  2. 単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体であって、約１×１０－７Ｍ以下、約１×１０－
    ８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、
    又は約１×１０－１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、前記ＩＣ５
    ０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０－６Ｍの３－
    ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬ
    ＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、前記プロトキシン－
    ＩＩ変異体がＷ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ置換を有し、残基の番号付けが配列番号１に従う
    、単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  3. Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４
    Ｘ１５Ｘ１６ＣＸ１７ＬＷＣＸ１８ＫＫＬＸ１９（配列番号４３２）の配列を含み、
    Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
    Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
    Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
    Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＹであり；
    Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
    Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
    Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
    Ｘ８は、Ｄ、Ｔ又はアスパラギル－４－アミノブタンであり；
    Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
    Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
    Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
    Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
    Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
    Ｘ１４は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
    Ｘ１５は、Ｍ又はＦであり；
    Ｘ１６は、Ｖ又はＳであり；
    Ｘ１７は、Ｒ、Ｔ又はＮ－ωメチル－Ｌ－アルギニンであり；並びに、
    Ｘ１８は、Ｋ又はＲであり；並びに、
    Ｘ１９は、Ｗ又はＬであり、
    Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する、
    請求項１又は２に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  4. 残基の番号付けが配列番号１に従うときに、前記変異体が、Ｙ１、Ｗ７、Ｓ１１、Ｅ１
    ２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｒ２２、Ｌ２９及びＷ３０の１つ又は２つ以上の残基位置
    で置換を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  5. 配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ（配
    列番号４１６）を含み、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及
    び／又はＷ３０が、
    ａ）表１で示される他の任意のアミノ酸；又は、
    ｂ）非天然アミノ酸で置換される、
    請求項１～４のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  6. 配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ－ＣＯＯＨ（配
    列番号４２２）を含み、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｍ１９、
    Ｌ２９及び／又はＷ３０が、
    ａ）表１で示される 他の任意のアミノ酸；又は、
    ｂ）非天然アミノ酸で置換される、
    請求項１～５のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  7. 配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬ
    Ｌ－ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
    ６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
    前記プロトキシン－ＩＩ変異体が、残基番号付けが配列番号１に従うときに、位置７に
    おけるＱ、及び位置３０におけるＱを有する、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  8. 配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＱＫＷＭＱＴＣＤＸ４Ｘ５ＲＸ６ＣＣＸ７Ｘ８Ｘ９ＶＣＲＬＷＣＫ
    ＫＫＸ１０Ｘ１１（配列番号７３７）を含み、
    Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
    Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
    Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
    Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
    Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
    Ｘ６は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
    Ｘ７は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル－４－アミノブタンであり；
    Ｘ８は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
    Ｘ９は、Ｍ又はＦであり；
    Ｘ１０は、Ｌ又はＶであり；並びに
    Ｘ１１は、Ｗ又はＬである、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体、請求項１～５のいず
    れか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体 。
  9. 前記Ｎ末端伸長が、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７
    ８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列 を含
    む、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  10. 前記Ｃ末端伸長が、配列番号３７４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９
    ２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む、請求項１～９の
    いずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体。
  11. 前記Ｎ末端及び／又は前記Ｃ末端伸長が、前記プロトキシン－ＩＩ変異体にリンカーを
    介して結合される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体
  12. 前記リンカーが、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０
    ２のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変
    異体。
  13. ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０－８Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害し、前記ＩＣ５０
    値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０－６Ｍの３－ベ
    ラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩ
    ＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される、請求項１～１２のい
    ずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  14. ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０－８Ｍ～約１×１０－９ＭのＩＣ５０値で阻害す
    る、請求項１３に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  15. 実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定
    したときに、前記変異体が、Ｎａｖ１．７活性を少なくとも２５％、３０％、３５％、４
    ０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
    ０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は
    １００％阻害する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－Ｉ
    Ｉ変異体。
  16. アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ１０Ｘ１１
    ＦＸ１２ＣＸ１３ＬＷＣＸ１４ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含み、
    Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
    Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
    Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
    Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
    Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
    Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
    Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
    Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
    Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
    Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
    Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
    Ｘ１２は、Ｖ又はＳであり；
    Ｘ１３は、Ｒ又はＴであり；並びに
    Ｘ１４は、Ｋ又はＲである、
    請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  17. 配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１
    、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５
    、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５
    、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５
    、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５
    、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９
    、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０
    、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７
    、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４
    、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３
    、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４
    、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６
    、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６
    、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６
    、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６
    、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６
    、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６
    、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６
    、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１
    、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７
    、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７
    、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９
    、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９
    、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９
    、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９
    、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９
    、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９
    、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９
    、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９
    、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９
    、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９
    、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９
    、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９
    、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９
    、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９
    、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９
    、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９
    、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９
    、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９
    、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９
    、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９
    、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９
    、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９
    、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９
    、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９
    、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９
    、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９
    、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９
    、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９
    、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９
    、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９
    、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  18. 遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項１
    ～１７のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体。
  19. 半減期延長部分に結合された、請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロトキシン－
    ＩＩ変異体を含む、単離された融合タンパク質。
  20. 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（Ａ
    ＢＤ）、Ｆｃ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１９に記載の融合タ
    ンパク質。
  21. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体をコードする、単離
    されたポリヌクレオチド。
  22. 請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  23. 請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  24. 前記単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体を生成する方法であって、請求項２３に記載
    の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記プロトキシン－ＩＩ
    変異体を回収することとを含む、前記方法。
  25. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン－ＩＩ変異体又は融合
    タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  26. 対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、請求項１～２０のい
    ずれか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、前記痛みの治療に
    有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  27. 痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み
    、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症
    （ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間
    板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）
    、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記プロトキシン－ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記プロトキシン－ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢
    神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２８に記載の方
    法。
  30. 前記対象がヒトである、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項１～２０のいず
    れか一項に記載のプロトキシン－ＩＩ変異体又は融合タンパク質 。
  32. 痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み
    、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症
    （ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間
    板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）
    、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項３１に記載の使用のた
    めの プロトキシン－ＩＩ変異体。
  33. 前記プロトキシン－ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項３１又は３２に記載の使
    用のための プロトキシン－ＩＩ変異体。
  34. 前記プロトキシン－ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢
    神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項３１～３３のい
    ずれか一項に記載の使用のための プロトキシン－ＩＩ変異体。
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