ES2340857T3

ES2340857T3 - Metodo para la sintesis quimica completa y emsamblaje de genes y genomas.

Info

Publication number: ES2340857T3
Application number: ES05005266T
Authority: ES
Inventors: A. Evans Glen
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 1997-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: US6521427B1; ATE294860T1; DK1538206T3; EP1015576B1; US20030165946A1; DE69830065T2; DE69841578D1; EP1538206A2; PT1015576E; AU9393398A; DK1015576T3; PT1538206E; ES2243007T3; EP1538206A3; ATE462004T1; DE69830065D1; CY1110163T1; WO1999014318A1; EP1015576A1; EP1538206B1

Abstract

Un método para la síntesis de un polinucleótido bicatenario sin el uso de ningún ADN recombinante o de origen natural existente, que comprende los pasos de a)generar una primera serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena positiva completa de dicho polinucleótido bicatenario; b)generar una segunda serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena negativa completa de dicho polinucleótido bicatenario y c)hibridar dicha primera y segunda series de oligonucleótidos; donde el paso (c) comprende los pasos de i)hibridar el oligonucleótido del extremo 5'' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el oligonucleótido del extremo 3'' de dicha segunda serie de oligonucleótidos, ii)hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 5'' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el producto del paso (i), iii)hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 3'' de dicha segunda serie de oligonucleótidos con el producto del paso (ii), iv)repetir el proceso hasta que todos los oligonucleótidos de dichas primera y segunda serie de oligonucleótidos se hayan hibridado, donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5'' o 3'' de dicho polinucleótido bicatenario se hibridará con sólo un oligonucleótido complementario.

Description

Método para la síntesis química completa y ensamblaje de genes y genomas.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a los campos de la síntesis de oligonucleótidos. Más particularmente, se refiere al ensamblaje de genes y genomas de organismos artificiales completamente sintéticos.

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2. Descripción de la técnica relacionada

La actual investigación y las aplicaciones comerciales en biología molecular se basan en ADN recombinante desarrollado en los años setenta. Una faceta crítica del ADN recombinante es la clonación molecular en plásmidos, cubiertos por la patente seminal de Cohen y Boyer (Patente de Estados Unidos 4.740.470 "Biologically functional molecular chimeras"). Esta patente muestra un método para "cortar y empalmar" moléculas de ADN a partir de endonucleasas de restricción, de la introducción de estas moléculas "recombinantes" en células hospedadoras y su replicación en los hospedadores bacterianos. Esta técnica es la base de toda la clonación molecular con fines de investigación y comerciales llevada a cabo a lo largo de los últimos 20 años y la base del campo de la genética y la biología moleculares.

La tecnología de ADN recombinante es una tecnología poderosa, pero su utilidad se limita a modificaciones de secuencias de ADN existentes que se modifican a través de 1) sitios de escisión de enzimas de restricción, 2) cebadores PAC para amplificación, 3) mutagénesis específica del sitio y otras técnicas. La creación de una molécula totalmente nueva o la modificación sustancial de moléculas existentes, requiere mucho tiempo, resulta cara y exige pasos complejos y múltiples y en algunos casos resulta imposible. La tecnología de ADN recombinante no permite la creación de moléculas, genes, genomas u organismos totalmente artificiales, sino únicamente modificaciones de organismos de origen natural.

La actual biotecnología para producción industrial, diseño y desarrollo de fármacos, para aplicaciones potenciales de desarrollo de vacunas y terapia génica y para la utilización agrícola y medioambiental de ADN recombinante depende de organismos y moléculas de ADN de origen natural. La creación o el desarrollo de funciones nuevas o novedosas o la modificación de organismos para un uso especializado (como la producción de una hormona humana), exige manipulaciones difíciles, sustancialmente complejas, que requieren mucho tiempo, de moléculas de ADN de origen natural. En algunos casos, los cambios del ADN de origen natural son tan complejos que no resultan posibles en la práctica. De este modo, es necesaria una tecnología que permita la creación de moléculas de ADN nuevas en un solo paso sin requerir la utilización de ningún ADN recombinante o de origen natural.

WOSNICK M A ET AL se refieren a síntesis química total y expresión en E. coli de un gen de glutatión transferasa (GST) (GENE, vol. 76, 1984, páginas 153-160). L. D. BELL ET AL se refieren a síntesis química, clonación y expresión en células de mamífero de un gen que codifica activador de plasminógeno de tipo tisular humano (GENE, vol. 63, 1988, páginas 155-163). M. D. EDGE ET AL. se refieren a síntesis total de un gen de interferón de leucocito humano (NATURE, vol. 292, 20 de agosto de 1981 (20-08-1981), páginas 756-762). L. FERRETTI ET AL. se refieren a síntesis total de un gen de rodopsina bovina (PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 83, febrero de 1996 (02-1996), páginas 599-603). LASHKARI D A ET AL se refieren a un sintetizador de oligonucleótidos multiplex automatizado y el desarrollo de síntesis de ADN de alto rendimiento y bajo coste (PROCEEDINGS OF THE
NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 92, Nº 17,15 de agosto de 1995 (15-08-1995), páginas 7912-7915). L. E. SINDELAR Y J. M. JAKLEVIC describen síntesis de ADN de alto rendimiento en un formato multicanal (NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, Nº 6, 1995, páginas 982-987). S. RAYNER ET AL. describen MerMade, un sintetizador de oligodesoxirribonucleótido para producción de oligonucleótidos de alto rendimiento en placas dobles de 96 pocillos (GENOME RESEARCH, vol. 8, Nº 7, julio de 1998 (1998-07), páginas 741-
747).

El documento EP 0385410 se refiere a un método para formar un oligonucleótido que comprende los pasos de sintetizar un par de oligonucleótidos complementarios, unir el par de oligonucleótidos en las porciones de secuencia de base complementaria y polimerizar bases de ácido nucleico en el par de oligonucleótidos resultante. El documento EP 0316018 muestra la modificación de una secuencia de ADN digiriendo una secuencia de ADN de vector con una enzima de restricción, retirando cualquier nucleótido indeseado, tratando el vector escindido con exonucleasa III para crear extremos cohesivos de 5 min, mezclando con el vector tratado de este modo un número par de nucleótidos de cadena única de secuencia alterna sentido y antisentido que codifican alternativamente o que son complementarios a las secuencias deseadas en el ADN de producto y donde estos oligonucleótidos de cadena única tienen extremos que se solapan y son complementarios a extremos del oligonucleótido u oligonucleótidos adyacentes y/o los extremos cohesivos de 5 min de vector. El documento W09412632 se refiere a un método para sintetizar ácido nucléico mediante una reacción en cadena de la polimerasa realizada en una serie de cebadores solapantes que abarcan la longitud completa del ácido nucleico que se tiene que sintetizar. El documento WO 9000626 se refiere a la construcción de un conjunto de fase sólida de biopolímeros a través del ensamblaje de secuencias de biopolímero más cortas, por ejemplo, ensamblaje de genes de oligonucleótidos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a las limitaciones en las actuales manipulaciones de ácido nucleico recombinante proporcionando un medio rápido y eficaz para generar prácticamente cualquier secuencia de ácido nucleico, incluyendo genes enteros, segmentos de cromosomas, cromosomas y genomas. Habida cuenta de que este enfoque se basa en un enfoque completamente sintético, no existen limitaciones, tales como la disponibilidad de ácidos nucleicos existentes, que supongan un obstáculo para la construcción de segmentos incluso muy amplios de ácido
nucleico.

La invención proporciona un método para la síntesis de un polinucleótido sin el uso de cualquiera de una diversidad de ADN recombinante o de origen natural, que comprende los pasos de

a): generar una primera serie de oligonucleótidos correspondientes a la cadena positiva completa de dicho polinucleótido bicatenario;

b): generar una segunda serie de oligonucleótidos correspondientes a la cadena negativa completa de dicho polinucleótido bicatenario y

c): hibridar dicha primera y segunda serie de oligonucleótidos;

donde el paso (c) comprende los pasos de

i): hibridar el oligonucleótido del extremo 5' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el oligonucleótido del extremo 3' de dicha segunda serie de oligonucleótidos,

ii): hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 5' de dicha primera serie de oligonucleótidos con el producto del paso (i),

iii): hibridar el próximo oligonucleótido más cerca del extremo 3' de dicha segunda serie de oligonucleótidos con el producto del paso (ii),

iv): repetir el proceso hasta que todos los oligonucleótidos de dichas primera y segunda serie de oligonucleótidos se hayan hibridado,

donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5' o 3' de dicho polinucleótido se hibridará con sólo un oligonucleótido complemen-
tario.

La invención proporciona además un método para sintetizar un polinucleótido bicatenario, que comprende: (a) hibridar un oligonucleótido del extremo 5' con un oligonucleótido del extremo 3' de un polinucleótido bicatenario para producir un primer producto hibridado y añadir directamente un oligonucleótido siguiente 5' más terminal de dicho polinucleótido bicatenario a dicho primer producto hibridado en condiciones suficientes para hibridación para producir un segundo producto hibridado, teniendo dicho oligonucleótido siguiente más terminal una longitud de al menos aproximadamente 25 bases y (b) repetir el paso (a) una o más veces para producir en secuencia un polinucleótido bicatenario.

Se proporciona un método para la construcción de un segmento de ADN bicatenario que incluye los pasos de (i) proporcionar dos series de oligonucleótidos de cadena única, en las que (a) la primera serie comprende la cadena positiva completa de dicho segmento de ADN, (b) la segunda serie comprende la cadena negativa completa de dicho segmento de ADN y (c) siendo cada una de dicha primera serie de oligonucleótidos complementaria de dos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos, (ii) hibridar dicha primera serie y dicha segunda serie de oligonucleótidos y (iii) tratar dichos oligonucleótidos hibridados con una enzima de ligamiento. Pasos opcionales permiten la síntesis de las series de oligonucleótidos y la transformación de células hospedadoras con el segmento de ADN resultante.

En realizaciones particulares, el segmento de ADN tiene 100, 200, 300. 400, 800, 1.000, 1.500, 2.000, 4.000, 8.000, 10.000, 12.000, 18.000, 20.000, 40.000, 80.000, 100.000, 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} o más pares de bases de longitud. De hecho, se contempla que los métodos de la presente invención permitirán crear genomas artificiales completos de longitud comparable a genomas conocidos de bacterias, levaduras, virus, mamíferos, anfibios, reptiles y aves. En realizaciones más particulares, el segmento de ADN es un gen que codifica una proteína de interés. El segmento de ADN puede incluir además elementos no codificantes tales como orígenes de replicación, telómeros, promotores, potenciadores, señales de inicio y detención de transcripción y traducción, intrones, sitios de empalme de exones, componentes de armazón de cromatina y otras secuencias reguladoras. El segmento de ADN puede comprender múltiples genes, segmentos de cromosomas, cromosomas e incluso genomas completos. El segmento de ADN puede obtenerse de secuencias procariotas o eucariotas, incluyendo bacterias, levaduras, virus, mamíferos, anfibios, reptiles, aves, plantas, arqueobacterias y otros organismos vivos que contienen ADN.

Las series de oligonucleótidos están constituidas preferiblemente por oligonucleótidos de entre aproximadamente 15 y 100 bases y más preferiblemente entre aproximadamente 20 y 50 bases. Las longitudes específicas incluyen, pero no se limitan a 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100. Dependiendo del tamaño, el solapamiento entre los oligonucleótidos de las dos series puede diseñarse para estar entre 5 y 75 bases por par de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos se tratan preferiblemente con quinasa polinucleotídica, por ejemplo, quinasa polinucleotídica T4. La fosforilación puede llevarse a cabo antes de mezclar la serie de oligonucleótidos o después, pero antes de hibridar. Después de hibridar, los oligonucleótidos se tratan con una enzima que tiene una función de ligamiento. Por ejemplo, se utilizará normalmente una ligasa de ADN para esta función. No obstante, la topoisomerasa, que no requiere fosforilación 5', es rápida y funciona a temperatura ambiente y puede utilizarse en lugar de
ligasa.

Se proporciona un método para la construcción de un segmento de ADN bicatenario que comprende los pasos de (i) proporcionar dos series de oligonucleótidos de cadena única, en las que (a) la primera serie comprende la cadena positiva completa de dicho segmento de ADN, (b) la segunda serie comprende la cadena negativa completa de dicho segmento de ADN y (c) siendo cada una de dicha primera serie de oligonucleótidos complementaria de dos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos, (ii) hibridar pares de oligonucleótidos complementarios para producir una serie de primeros productos hibridados, en la que cada par comprende un oligonucleótido de cada una de dicha primera y dicha segunda series de oligonucleótidos, (iii) teniendo los pares de hibridación de los primeros productos hibridados secuencias complementarias para producir una serie de segundos productos hibridados, (iv) repetir el proceso hasta que todos los productos hibridados se hayan hibridado en un único segmento de ADN y (v) tratar dichos productos hibridados con enzima de ligamiento.

Se proporciona un método para la construcción de un segmento de ADN bicatenario con capacidad de replicación que comprende los pasos de (i) proporcionar dos series de oligonucleótidos de cadena única, en las que (a) la primera serie comprende la cadena positiva completa de dicho segmento de ADN, (b) la segunda serie comprende la cadena negativa completa de dicho segmento de ADN y (c) siendo cada una de dicha primera serie de oligonucleótidos complementaria de dos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos, (ii) hibridar dicho oligonucleótido 5' terminal de dicha primera serie de oligonucleótidos con el oligonucleótido 3' terminal de dicha segunda serie de oligonucleótidos, (iii) hibridar el siguiente oligonucleótido 5' más terminal de dicha primera serie de oligonucleótidos con el producto del paso (ii), (iv) hibridar el siguiente oligonucleótido 3' más terminal de dicha segunda serie de oligonucleótidos con el producto del paso (iii), (v) repetir el proceso hasta que todos los oligonucleótidos de dichas primera y dicha segunda series se hayan hibridado y (vi) tratar dichos oligonucleótidos hibridados con enzima de ligamiento. Unos pasos opcionales permiten la síntesis de las series de oligonucleótidos y la transformación de células hospedadoras con el segmento de ADN resultante. En una realización preferida, el oligonucleótido 5' terminal de la primera serie se une a un soporte, proceso que puede incluir el paso adicional de retirar el segmento de ADN del soporte. El soporte puede ser cualquier soporte conocido en la técnica, por ejemplo, una placa de microtitulación, un filtro, perlas de poliestireno, bandeja de poliestireno, perlas magnéticas, agarosa y
similares.

Las condiciones de hibridación pueden ajustarse sobre la base de la estrategia específica utilizada para la hibridación, el tamaño y la composición de los oligonucleótidos y el alcance del solapamiento entre los oligonucleótidos de la primera y la segunda serie. Por ejemplo, si se mezclan todos los oligonucleótidos antes de la hibridación, se conduce el calentamiento de la mezcla a 80ºC, seguido de una hibridación lenta durante 1 a 12 horas. De este modo, la hibridación puede realizarse durante aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 horas. No obstante, en otras realizaciones, el tiempo de hibridación puede llegar hasta 24 horas.

Con ayuda de un ordenador, el inventor puede dirigir la síntesis de una combinación vector/gen utilizando un sintetizador de oligonucleótidos de alto rendimiento como una serie de componentes oligonucleótidos solapados. Los oligonucleótidos se ensamblan utilizando una estrategia de ensamblaje combinatorio robótico y el conjunto se somete a ligamiento utilizando ADN ligasa o topoisomerasa, seguido de transformación en una cepa hospedadora adecuada. En una realización específica, esta invención genera una serie de cepas bacterianas que contiene un vector de expresión viable para todos los genes en una región definida del genoma. En otras realizaciones, también se contempla un sistema de vector de expresión de levadura o baculovirus para permitir la expresión de cada gen en una región cromosómica en un hospedador eucariota. En otra realización más, la presente invención permite al experto en la materia concebir una estrategia de "gen diseñador" en la que un gen o genomas o prácticamente cualquier estructura se pueden diseñar, sintetizar y expresar fácilmente. De este modo, eventualmente la tecnología descrita en este documento puede emplearse para crear genomas completos para su introducción en células hospedadoras para la creación de organismos vivos diseñadores totalmente artificiales.

En realizaciones específicas, la presente invención proporciona un método para la síntesis de un polinucleótido bicatenario con capacidad de replicación, donde el polinucleótido comprende un origen de replicación, una primera región codificante y un primer elemento regulador que dirige la expresión de la primera región codificante.

Adicionalmente el método puede comprender además el paso de amplificar el polinucleótido bicatenario. En realizaciones específicas, el polinucleótido bicatenario comprende 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 5.000, 10 x 10^{3}, 20 x 10^{3}, 30 x 10^{3}, 40 x 10^{3}, 50 x 10^{3}, 60 x 10^{3}, 70 x 10^{3}, 80 x 10^{3}, 90 x 10^{3}, 1 x 10^{4}, 1 x 10^{5}, 1 x 10^{6}, 1 x 10^{7}, 1 x 10^{8}, 1 x 10^{9} ó 1 x 10^{10} pares de bases de longitud. El primer elemento regulador puede ser un promotor. En determinadas realizaciones, el polinucleótido bicatenario comprende además un segundo elemento regulador, siendo el segundo elemento regulador una señal de poliadenilación. En otras realizaciones más, el polinucleótido bicatenario comprende una pluralidad de regiones codificantes y una pluralidad de elementos reguladores. Específicamente, se contempla que las regiones codificantes codifiquen productos que comprenden una ruta bioquímica. En realizaciones específicas la ruta bioquímica es glicólisis. Más particularmente, se contempla que las regiones codificantes codifiquen enzimas seleccionadas entre el grupo constituido por hexoquinasa, fosfohexosa isomerasa, fosfofructoquinasa-1, aldolasa, triosa-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa y enzimas piruvato quinasa de la ruta glicolítica.

En otras realizaciones, la ruta bioquímica es síntesis de lípidos, síntesis de cofactores. Se contemplan en particular síntesis de ácido lipoico, síntesis de riboflavina, síntesis de nucleótidos, el nucleótido puede ser una purina o una pirimidina.

En algunas otras realizaciones se contempla que las regiones codificantes codifiquen enzimas que participan en un proceso celular seleccionado entre el grupo que consiste en división celular, chaperona, destoxificación, secreción de péptidos, metabolismo energético, función reguladora, replicación de ADN, transcripción, procesamiento de ARN y modificación de tARN. En realizaciones preferidas, el metabolismo energético es fosforilación oxida-
tiva.

Se contempla que el polinucleótido bicatenario es un ADN o un ARN. En realizaciones preferidas, el polinucleótido bicatenario puede ser un cromosoma. El polinucleótido bicatenario puede ser una construcción de expresión. Específicamente, la construcción de expresión puede ser una construcción de expresión bacteriana, una construcción de expresión mamífera o una construcción de expresión viral. En realizaciones particulares, el polinucleótido bicatenario comprende un genoma seleccionado entre el grupo que consiste en genoma bacteriano, genoma de levadura, genoma viral, genoma de mamífero, genoma de anfibio y genoma aviar.

En las realizaciones en las que el genoma es un genoma viral, el genoma viral puede seleccionarse entre el grupo que consiste en retrovirus, adenovirus, virus de la vaccinia, virus del herpes y virus adeno-asociado.

La presente invención se puede usar para producir una partícula viral.

El método se puede usar para producir un genoma artificial, donde el cromosoma comprende todas las regiones codificantes y elementos reguladores encontrados en un cromosoma natural correspondiente. En realizaciones específicas, el cromosoma natural correspondiente es un genoma humano mitocondrial. En otras realizaciones, el cromosoma natural correspondiente es un genoma de cloroplasto.

El método se puede usar para producir un sistema genético artificial, donde el sistema comprende todas las regiones codificantes y elementos reguladores encontrados en una ruta bioquímica natural correspondiente. Dicha ruta bioquímica poseerá probablemente un grupo de enzimas que metabolizan en serie un compuesto. En realizaciones particularmente preferidas, la ruta bioquímica comprende las actividades requeridas para glicólisis. En otras realizaciones, la ruta bioquímica comprende las enzimas requeridas para transporte de electrones. Todavía en otras realizaciones, la ruta bioquímica comprende las actividades enzimáticas requeridas para fotosíntesis.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. La descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican realizaciones preferidas de la invención, se facilitan simplemente a título de ilustración.

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Breve descripción de los dibujos

Los dibujos siguientes forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este
documento.

Fig. 1. Diagrama de flujo del paradigma de Parque Jurásico para la construcción de organismos sintéticos y reensamblaje de organismos vivos.

Fig. 2. Diagrama de flujo de la estrategia de genética sintética y ensamblaje de organismos.

Fig. 3. Diagrama de flujo de la estrategia de ocho pasos para ensamblaje combinatorio de oligonucleótidos en genes o genomas completos.

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Fig. 4A-Fig. 4C. Diseño de plásmido synlux4. La secuencia de 4800 se anota con las localizaciones de los genes lux A+B, neomicina/kanamicina fosfotransferasa y secuencias pUC 19.

Fig. 5A-Fig. 5F. Lista de oligonucleótidos componentes derivados de la secuencia de Synlux4 en la Figura 4A-Fig. 4C.

Fig. 6A-Fig. 6B. Esquema para el ensamblaje combinatorio de plásmidos sintéticos de oligonucleótidos componentes.

Fig. 7A-Fig. 7G. Programa SynGen para generar oligonucleótidos solapantes suficientes para reensamblar el gen o plásmido.

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Descripción de realizaciones ilustrativas

La secuencia completa de genomas completos, incluido el genoma humano, presenta enfoques funcionales a gran escala de la genética posible. La presente invención expone un planteamiento nuevo para utilizar los resultados de la información de la secuencia genómica mediante síntesis genética dirigida por ordenador basada en informática en la base de datos del genoma humano. Específicamente, la invención describe síntesis y resíntesis químicas de genes para la transferencia de estos genes a células hospedadoras adecuadas.

La presente invención proporciona métodos que se pueden utilizar para sintetizar de novo, segmentos de ADN que codifican series de genes, bien genes de origen natural expresados a partir de construcciones de promotores naturales o artificiales o genes artificiales obtenidos de secuencias de ADN sintético, que codifican elementos de sistemas biológicos que realizan una función o atribución especificada de un organismo artificial así como genomas completos. Al producir tales sistemas y genomas, la presente invención proporciona la síntesis de un polinucleótido bicatenario con capacidad de replicación, donde el polinucleótido tiene un origen de replicación, una primera región codificante y un primer elemento regulador que dirige la expresión de la primera región codificante. Por con capacidad de replicación se entiende que el polinucleótido es capaz de dirigir su propia replicación. De este modo, se prevé que el polinucleótido poseerá todas las señales de actuación cis necesarias para facilitar su propia síntesis. A este respecto, el polinucleótido será similar a un plásmido o un virus, de forma que una vez colocado dentro de una célula, puede replicarse mediante una combinación de las funciones celulares y del polinucleótido.

De este modo, utilizando las técnicas de la presente invención, un experto en la materia puede crear un genoma artificial capaz de codificar todas las actividades necesarias para mantener su propia existencia. También se contemplan sistemas genéticos artificiales que pueden codificar enzimas y actividades de una ruta bioquímica específica. En un sistema de este tipo, será deseable tener presentes todas las actividades para que se opere toda la ruta bioquímica. La coexpresión de una serie de enzimas necesarias para una vía específica constituye un sistema genético o biológico completo. Por ejemplo, la coexpresión de las enzimas implicadas en la glicólisis constituye un sistema genético completo para la producción de energía en forma de ATP procedente de glucosa. Estos sistemas para la producción de energía pueden incluir grupos de enzimas que de manera natural o artificial metabolizan en serie una serie de compuestos.

Los tipos de rutas bioquímicas incluirían, pero no están limitados a los correspondientes a la biosíntesis de grupos prostéticos de cofactores y vehículos (síntesis del lipoato, síntesis de la riboflavina, síntesis del nucleótido piridina); la biosíntesis de las envueltas celulares (membranas, lipoproteínas, porinas, polisacáridos de superficie, lipopolisacáridos, antígenos y estructuras de superficie); procesos celulares que incluyen la división celular, chaperonas, destoxificación, secreción de proteínas, metabolismo intermediario central (producción de energía a través de compuestos de fósforo y otros); metabolismo energético incluyendo aeróbico, anaeróbico, interconversiones de fuerza motriz de protones ATP, transporte de electrones, ruta de glicólisis triosa fosfato, piruvato deshidrogenasa, metabolismo del azúcar; purina, síntesis de nucleótido pirimidina, que incluye síntesis del 2'desoxirribonucleótido, interconversión de nucleótidos y nucleósidos, salvamento de nucleósidos y nucleótidos, biosíntesis y conversión de azúcar-nucleótido; funciones reguladoras que incluyen controles transcripcionales y traduccionales, replicación del ADN que incluye degradación del ADN, replicación, modificación de restricción, recombinación y reparación del ADN; transcripción que incluye degradación del ADN, ARN polimerasa dependiente del ADN y factores de transcripción; procesamiento del ARN; traducción que incluye sintetasas del amino acil tARN, degradación de péptidos y glicopéptidos, modificación de las proteínas, síntesis y modificación de los ribosomas, modificación del tARN; transporte de factores de traducción y proteínas de unión incluyendo el transporte de aminoácidos, péptidos, aminocarbohidratos, alcoholes orgánicos, ácidos orgánicos y cationes y otros sistemas para la adaptación, función específica o supervivencia de un organismo
artificial.

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A. Definiciones

Segmento de ADN - una pieza lineal de ADN que tiene una región bicatenaria y ambos extremos 5'- y 3'-; el segmento puede tener cualquier longitud suficientemente larga para ser creado mediante la hibridación de al menos dos oligonucleótidos con regiones complementarias.

Oligonucleótidos - pequeños segmentos de ADN pequeño, monocatenarios o bicatenarios, compuestos por las bases de nucleótido A, T, G y C enlazados a través de enlaces fosfato; los oligonucleótidos varían típicamente entre aproximadamente 10 y 100 pares de bases.

Cadena positiva - por convención, la cadena única de un ADN bicatenario que comienza con el extremo 5' a la izquierda cuando se lee la secuencia.

Cadena negativa - por convención, la cadena única de un ADN bicatenario que comienza con el extremo 3' a la izquierda cuando se lee la secuencia.

Complementarios - cuando dos ácidos nucleicos tienen al menos una porción de sus secuencias, cuando se leen en dirección opuesta (5'\rightarrow3'; 3'\rightarrow5'), que emparejan nucleótidos secuenciales en la forma siguiente: A-T, G-C, T-A, G-C.

Series de oligonucleótidos - una pluralidad de oligonucleótidos que, tomados juntos, comprenden la secuencia de una cadena positiva o negativa de un segmento de ADN.

Productos hibridados - dos o más oligonucleótidos que tienen regiones complementarias, cuando están permitidas, en condiciones apropiadas, con pares de bases, produciendo de ese modo regiones bicatenarias.

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B. La Presente Invención

La presente invención describe métodos para permitir la creación de moléculas de ADN, genomas y organismos vivos totalmente artificiales basada en información solamente, sin la necesidad de genes, moléculas de ADN o genomas existentes.

Los métodos de la presente invención están diagramados en la Fig. 1 y Fig. 2 y generalmente implican los pasos siguientes. Por lo general, utilizando software informático sencillo, comprendiendo series de partes de genes y elementos funcionales se puede construir un polinucleótido virtual en el ordenador. Este polinucleótido consiste en un cordón de bases de ADN, G, A, T o C, que comprende por ejemplo, un genoma totalmente artificial en un cordón lineal. Para transferir el gen sintético a, por ejemplo, células bacterianas, el polinucleótido debe contener la secuencia para un origen de replicación bacteriano (tal como pBR322). Para transferirlo a células eucariotas, debe contener el origen de replicación de un virus, cromosoma o componente subcelular de mamífero tal como
mitocondria.

Después de la construcción, se utiliza un software informático sencillo para dividir la secuencia del genoma en una serie de nucleótidos de longitud de especificada que se solapan. Esto da lugar a una serie de secuencias de ADN más cortas que se solapan para cubrir el genoma completo en series que se solapan. Generalmente, un gen de 1000 pares de bases se dividiría en 20 100-unidades, donde 10 de estas comprenden una cadena y 10 de estas comprenden la otra cadena. Serían seleccionados para solaparse en cada cadena en 25 a 50 pares de bases.

Este paso va seguido por la dirección de síntesis química de cada una de las series de oligonucleótidos solapantes utilizando un sintetizador tipo antena y química de fosfoamidita dando lugar a una variedad de oligómeros sintetizados. El siguiente paso consiste en equilibrar la concentración de cada oligómero y combinar los oligómeros de modo que una sola mezcla contenga iguales concentraciones de cada uno. Los oligonucleótidos mezclados se tratan con T4 polinucleótido quinasa para 5' fosforilar los oligonucleótidos. El siguiente paso consiste en llevar a cabo un paso de hibridación "lenta" para cohibridar todos los oligómeros en la secuencia del gen o genoma predicho. Esto se realiza calentando la mezcla a 80ºC y dejando que se enfríe después lentamente a temperatura ambiente durante varias horas. La mezcla de oligonucleótidos se trata después con T4 ADN ligasa (o alternativamente topoisomerasa) para unir los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos se transfieren luego a células hospedadoras
competentes.

La técnica expuesta representa una estrategia de ensamblaje "combinatorio" en la que todos los oligonucleótidos se hibridan conjuntamente mediante hibridación lenta basada en la temperatura. Una variación de esta estrategia, que puede ser más adecuada para genes o genomas muy largos, tales como de una longitud final mayor de 5.000 pares de bases, es la siguiente. Utilizando software informático sencillo, que comprende series de partes de gen y elementos funcionales, se construye en el ordenador un gen o genoma virtual. Este gen o genoma consistiría en un cordón de bases de ADN, G, A, T o C, comprendiendo el genoma completo en un cordón lineal. Para transferir el gen sintético a células bacterianas, debería contener la secuencia para un origen de replicación bacteriano (tal como
pBR322).

El siguiente paso consiste en llevar a cabo una reacción en cadena de ligamiento utilizando una nueva adición de oligonucleótido en cada paso. Con este procedimiento, el primer oligonucleótido de la cadena se fija a un soporte sólido (como una perla de agarosa). El segundo se añade con ADN ligasa, se realiza la reacción de hibridación y ligamiento y se lavan las perlas. Se añade el segundo oligonucleótido solapante de la cadena opuesta, se hibrida y se lleva a cabo el ligamiento. Se añade el tercer oligonucleótido y se lleva a cabo el ligamiento. Este procedimiento se replica hasta que se han añadido y ligado todos los oligonucleótidos. Este procedimiento se realiza mejor para secuencias largas utilizando un dispositivo automatizado. La secuencia de ADN se retira del soporte sólido, se lleva a cabo una ligamiento final (es circular) y la molécula se transfiere a células hospedadoras.

Como alternativa, se contempla que si lo permite la cinética de ligamiento, todos los oligonucleótidos pueden colocarse en una mezcla y puede proseguir el ligamiento. En otra realización, una serie de polinucleótidos más pequeños puede prepararse ligando 2, 3, 4, 5, 6, ó 7 oligonucleótidos en una secuencia y añadiendo esto a otra secuencia que comprenda un número similar de partes de oligonucleótido.

La reacción de la cadena de ligasa ("LCR"), se describe en el documento EPO Nº. 320 308. En LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y, en presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a cadenas complementarias opuestas de la diana de modo que se empalmen. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. Por el ciclo de temperaturas, como en PCR^{TM}, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y sirven después como "secuencias diana" para el ligamiento de pares de sondas excedentes. La patente de Estados Unidos 4.883.750 describe un método similar al LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana. Las siguientes secciones describen estos métodos con mayor detalle.

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C. Ácidos nucleicos

La presente invención describe la síntesis artificial de genes. En una realización de la presente invención, los genes artificiales pueden transferirse a células para conferir una función particular como unidades separadas o como parte de cromosomas artificiales o genoma. Por lo general, se preferirá diseñar oligonucleótidos que tengan de 15 a 100 nucleótidos, de 25 a 200 nucleótidos o incluso más largos si se desea. Tales fragmentos pueden prepararse fácilmente sintetizando directamente el fragmento utilizando medios químicos como se describe más adelante.

Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden utilizarse por su capacidad de formar moléculas dobles con tramos de genes complementarios o ARN o de proporcionar cebadores para amplificación de ADN o ARN a partir de tejidos. Dependiendo de la aplicación prevista, será deseable emplear diferentes condiciones de hibridación para conseguir diferentes grados de selectividad de hibridación. Normalmente se favorece una alta selectividad.

Para aplicaciones que requieren una alta selectividad, normalmente será deseable emplear condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones con relativamente poca sal y/o alta temperatura, como las proporcionadas por NaCl aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran un escaso desequilibrio o ningún desequilibrio entre el oligonucleótido y la cadena de molde o diana. Por lo general se observa que las condiciones pueden hacerse más rigurosas mediante la adición de cantidades mayores de
formamida.

Para determinadas aplicaciones, por ejemplo, por analogía, sustitución de nucleótidos por mutagénesis dirigida al sitio, es conveniente utilizar condiciones de rigurosidad inferiores. En estas condiciones, la hibridación puede producirse a pesar de que las secuencias de cadena de sonda y diana no sean perfectamente complementarias, sino que tengan falta de coincidencia en una posición o más. Las condiciones pueden hacerse menos rigurosas aumentando la concentración de sal y reduciendo la temperatura. Por ejemplo, se podría proporcionar una condición de rigurosidad media con NaCl aproximadamente 0,1 a 0,25 M a temperaturas de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC, mientras que se podría proporcionar una condición de rigurosidad reducida con aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 55ºC. De este modo, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente dependiendo de los resultados
deseados.

En algunas realizaciones, será ventajoso determinar la hibridación de oligonucleótidos utilizando una etiqueta. En la técnica se conocen una amplia variedad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos o de otra índole, como avidina/biotina, que se pueden detectar. En realizaciones preferidas, se puede desear emplear una etiqueta fluorescente o una etiqueta de enzima como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos nocivos para el medio ambiente. En el caso de etiquetas de enzimas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden emplearse para proporcionar un medio de detección visible al ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar si se ha producido una hibridación específica con oligonucleótido complementario.

En realizaciones con una fase sólida, por ejemplo, el primer oligonucleótido se adsorbe o fija de otra forma a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico fijado de cadena única se somete después a hibridación con los oligonucleótidos complementarios en las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas también dependerán de las circunstancias específicas, sobre la base de criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido G+C, tipo de ácido nucleico diana, fuente de ácido nucleico, tamaño de sonda de hibridación, etc.). Tras el lavado de la superficie de hibridación para retirar los oligonucleótidos enlazados no específicamente, se puede detectar la hibridación o incluso cuantificarse, mediante la etiqueta.

Para aplicaciones en las que los segmentos de ácido nucleico de la presente invención se incorporan en vectores, tales como plásmidos, cósmidos o virus, estos segmentos pueden combinarse con otras secuencias de ADN, como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de clonación y similares, de manera que su longitud global puede variar considerablemente. Se contempla que puede emplearse un fragmento de ácido nucleico de prácticamente cualquier longitud, preferiblemente limitándose la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante preten-
dido.

Los segmentos de ADN que codifican un gen específico pueden introducirse en células hospedadoras recombinantes y emplearse para expresar una proteína reguladora o estructural específica. De forma alternativa, a través de la aplicación de técnicas de ingeniería genética, pueden emplearse subporciones o derivados de genes seleccionados. Las regiones cadena arriba que contienen regiones reguladoras tales como regiones promotoras pueden aislarse y emplearse posteriormente para la expresión del gen seleccionado.

Los ácidos nucleicos empleados pueden codificar construcciones antisentido que se hibridan, en condiciones intracelulares, en un ácido nucleico de interés. El término "construcción antisentido" tiene por objeto referirse a ácidos nucleicos, preferiblemente oligonucleótidos, que son complementarios a las secuencias de bases de un ADN diana. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula diana, enlazan específicamente con su ácido nucleico diana e interfieren con la transcripción, el procesamiento ARN, el transporte, la traducción y/o la estabilidad. Las construcciones antisentido pueden estar diseñadas para unirse al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso límites exón-intrón de un gen.

También se contemplan otras secuencias con grados menores de homología. Podría diseñarse, por ejemplo, una construcción antisentido que tuviera regiones limitadas de alta homología, pero que también contuviera una región no homóloga (por ejemplo, una ribozima). Estas moléculas, a pesar de tener menos del 50% de homología, se unirían a secuencias diana en las condiciones apropiadas.

En algunas realizaciones, puede ser deseable emplear construcciones antisentido que incluyen otros elementos, por ejemplo, las que incluyen propino pirimidinas C-5. Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen análogos propino C-5 de uridina e histidina se unen a ARN con alta afinidad y son potentes inhibidores antisentido de expresión génica (Wagner et al., 1993).

De acuerdo con la presente invención, se producirán segmentos de ADN de diferentes tamaños. Estos segmentos de ADN serán, por definición, moléculas lineales. Como tales, normalmente se modifican antes de darles otro uso. Estas modificaciones incluyen, en una realización, la restricción de los segmentos para producir uno o varios "extremos cohesivos" compatibles con extremos complementarios de otras moléculas, incluyendo aquellos presentes en vectores que pueden soportar la replicación del segmento de ADN. Esta manipulación facilita la "clonación" de los
segmentos.

Típicamente, la clonación implica la utilización de endonucleasas de restricción, que escinden en sitios específicos dentro de las cadenas de ADN, para preparar un segmento de ADN para transferencia a un vehículo de clonación. El ligamiento de los extremos compatibles (que incluyen extremos romos) utilizando ADN ligasa completa la reacción. Dependiendo de la situación, el vehículo de clonación puede incluir una porción relativamente pequeña de ADN, en comparación con el inserto. De forma alternativa, el vehículo de clonación puede ser extremadamente complejo e incluir una variedad de características que afectan a la replicación y función del segmento de ADN. En algunas realizaciones, puede introducirse un sitio de corte raro en el extremo de la secuencia polinucleotí-
dica.

Los vehículos de clonación incluyen plásmidos tales como los vectores Bluescript^{TM} de la serie pUC y una variedad de otros vehículos con sitios de clonación de múltiples fines, marcadores seleccionables y orígenes de replicación. Debido a la naturaleza de la presente invención, los vehículos de clonación pueden incluir moléculas complejas como fagémidos y cósmidos, que sostienen trozos relativamente grandes de ADN. Además, la generación de cromosomas e incluso genomas artificiales.

Tras la clonación en un vector apropiado, la construcción se transfiere a una célula hospedadora compatible. En otras partes de este documento se describe una variedad de técnicas de transferencia de gen diferentes. A continuación se indica el cultivo de las células hospedadoras con el fin pretendido (amplificación, expresión, subclo-
nación).

A lo largo de esta solicitud, el término "construcción de expresión" tiene por objeto incluir un tipo particular de vehículo de clonación que contiene un ácido nucleico que codifica un producto génico en el que se puede transcribir una parte o toda la secuencia codificante del ácido nucleico. La transcripción puede traducirse en una proteína, pero no es necesario. De este modo, en algunas realizaciones, el término expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción de ARN en un producto génico. En otras realizaciones, el término expresión sólo incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo para generar construcciones antisentido.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor. Por "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de un gen. La expresión "bajo control transcipcional" significa que el promotor se encuentra en el lugar y orientación correctos en relación con el ácido nucleico para controlar el inicio de ARN polimerasa y expresión del gen.

El término promotor se utilizará aquí para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que están agrupados en torno al sitio de inicio de la ARN polimerasa II. Gran parte de la concepción sobre cómo están organizados los promotores se obtiene de análisis de varios promotores virales, incluyendo los de la timidita-quinasa de HSV (tk) y las unidades de transcripción temprana de SV40. Estos estudios, ampliados con trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están compuestos por módulos funcionales separados, constituidos cada uno por aproximadamente 7-20 pb de ADN y que contienen uno o varios sitios de reconocimiento para el activador transcripcional o proteínas represoras.

Al menos un módulo en cada promotor funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de caja TATA, tal como el promotor del gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor de los genes SV40 tardíos, un elemento específico que subyace al propio sitio de inicio contribuye a fijar el lugar de iniciación.

Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Normalmente, éstos están situados en la región 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque algunos promotores han revelado que contienen elementos funcionales también cadena abajo del sitio de inicio. La separación entre elementos promotores es a menudo flexible, de manera que la función promotora se preserva cuando se invierten los elementos o se mueven en relación el uno con el otro. En el promotor tk, la separación entre elementos promotores puede aumentarse a 50 pb antes de que la actividad empiece a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar o bien de forma cooperativa o independientemente para activar la transcrip-
ción.

El promotor particular que se emplea para controlar la expresión de un ácido nucleico no se considera crítico, en la medida en que sea capaz de expresar el ácido nucleico en la célula diana. De este modo, cuando se apunta a una célula humana, es preferible posicionar la región codificante del ácido nucleico adyacente a y bajo el control de un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana. De forma general, dicho promotor puede incluir un promotor humano o un promotor viral. Los promotores preferidos incluyen los obtenidos a partir de HSV. Otra realización preferida es el promotor controlado por tetraciclina.

En diversas realizaciones diferentes, el promotor de gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga del virus del sarcoma Rous se pueden utilizar para obtener expresiones de alto nivel de transgenes. La utilización de otros promotores virales o celulares de mamífero o de fagos bacterianos bien conocidos en la técnica para conseguir la expresión de un transgen también se contempla, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un fin determinado. Se prevé que, en el contexto de la presente invención, se pueda emplear cualquier elemento/promotor. A continuación se incluye una lista de promotores virales, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles que podrían utilizarse en combinación con el ácido nucleico que codifica un gen de interés en una construcción de expresión. Los elementos promotores/potenciadores que se prevén para utilizar con la presente invención incluyen, pero no se limitan a Cadena Pesada de Inmunoglobulina, Inmunoglobulina Ligera, Receptor de T-Célula Cadena, HLA DQ \alpha y DQ \beta, Interferon-\beta, Interleuquina-2, Receptor de Interleuquina-2, MHC Clase II 5, MHC Clase II HLA-DR\alpha, Actina \beta, Creatina Quinasa Muscular, Prealbúmina (Transtiretina), Elastasa/, Metalotioneina, Colagenasa, Gen de Albúmina, \alpha-Fetoproteína, \tau-Globina, \beta-Globina, e-fos, c-HA-ras, Insulina, Molécula de Adhesión de Célula Neural (NCAM), \alpha1-Antitripsina, H2B (TH2B) Histona, Colágeno de Ratón o de Tipo I, Proteínas Reguladas por Glucosa (GRP94 y GRP78), Hormona del Crecimiento de la Rata, Amiloide de Suero Humano A (SAA), Troponina I (TN I), Factor de Crecimiento Derivado de las Plaquetas, Distrofia Muscular de Duchenne, SV40, Polioma, Retrovirus, Virus del Papiloma, Virus de la Hepatitis B, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Citomegalovirus y Virus de la Leucemia del Mono Gibbon. Los elementos promotores inducibles y sus inductores asociados se enumeran en la Tabla 2 a continuación. Esta lista no pretende ser exhaustiva de todos los elementos posibles que participan en la promoción de expresión de transgen, sino que se presenta a título meramente ilustrativo. Además, cualquier combinación promotor/potenciador (de acuerdo con la Base de Datos de Promotores Eucariotas EPDB) también podría utilizarse para provocar la expresión del gen. Las células eucariotas pueden soportar la transcripción citoplásmica de algunos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, como parte del complejo de suministro o como una construcción de expresión génica
adicional.

Los potenciadores se detectaron originalmente como elementos genéticos que aumentaban la transcripción a partir de un promotor situado a una posición distante de la misma molécula de ADN. Esta capacidad de actuar a larga distancia tenía pocos precedentes en los estudios clásicos de regulación transcripcional procariota. El trabajo posterior mostró que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan en gran medida como promotores. Es decir, están compuestos por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se una a una o varias proteínas transcripcionales.

La diferencia básica entre potenciadores y promotores es operativa. Una región potenciadora como un conjunto debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; esto no tiene por qué producirse en una región promotora o en sus elementos constitutivos. Por otra parte, un promotor debe tener uno o varios elementos que dirigen la iniciación de la síntesis de ARN en un sitio particular y con una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y potenciadores a menudo se solapan y son contiguos y parecen tener con frecuencia una organización modular muy similar.

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TABLA 2

2

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La utilización del sistema de baculovirus implicará una expresión de alto nivel del promotor potente poliédri-
co.

Normalmente se incluirá una señal de poliadenilación para lograr una poliadenilación adecuada de la transcripción. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se considera crucial para el éxito práctico de la invención y puede emplearse cualquier tipo de secuencia. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, que son adecuadas y se sabe que funcionan bien en varias células diana. También se contempla como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensaje y para minimizar la lectura a través del casete en otras
secuencias.

También puede ser necesaria una señal de iniciación específica para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATC y secuencias adyacentes. También puede ser necesario proporcionar señales de control traduccional exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATC. Un experto en la materia podrá determinar fácilmente esto y proporcionar las señales necesarias. Se sabe que el codón de iniciación debe estar "en fase" con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Las señales de control traduccional exógenas y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficacia de expresión puede reforzarse con la inclusión de elementos potenciadores de transcripción apropiados (Bittner et al., 1987).

En algunas realizaciones, puede ser deseable incluir regiones especializadas, conocidas como telómeros al final de una secuencia de genoma. Los telómeros son secuencias repetidas presentes en los extremos del cromosoma y se sabe desde hace tiempo que los cromosomas con extremos truncados son inestables, tienden a fusionarse con otros cromosomas y de otra forma se pierden durante la división de la célula. Algunos datos sugieren que los telómeros interaccionan en el complejo de nucleoproteína y en la matriz nuclear. Un papel supuesto de los telómeros incluye la estabilización de cromosomas y la protección de los extremos de la enzima de degradación.

Otro posible papel de los telómeros es en la replicación. De acuerdo con la presente doctrina, la replicación de ADN requiere partir de cebadores de ARN cortos hibridados en el extremo 3' de la plantilla. El resultado de este mecanismo es un "problema de replicación de extremo" en el que la región que corresponde al cebador de ARN no se replica. En muchas divisiones de células, esto tendrá como resultado el progresivo truncamiento del cromosoma. Se cree que los telómeros pueden proporcionar un tampón frente a este efecto, al menos hasta que ellos mismos son eliminados por este efecto. Otra estructura a incluirse en los segmentos de ADN es un centrómero.

En algunas realizaciones de la invención el suministro de ácido nucleico en una célula puede identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en la construcción de expresión. El marcador dará como resultado un cambio identificable de la célula transfectada lo que permite la identificación fácil de la expresión.

Se pueden utilizar algunos sistemas de selección, que incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler et al., 1977), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., 1962) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980) en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. La resistencia a antimetabolitos también puede utilizarse como base de selección para dhfr, lo que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980; H'Hare et al., 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.

Normalmente la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda a la clonación y a la selección de transformantes, por ejemplo, neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol. Alternativamente, las enzimas como por ejemplo la timidina quinasa del virus del herpes simplex (tk) (eucariota) o cloramfenicol aciltransferasa (CAT) (procariota) pueden emplearse. También pueden emplearse marcadores inmunológicos. El marcador seleccionable empleado no se considera importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Otros ejemplos de marcadores seleccionables son bien conocidos por un experto en la materia.

En algunas realizaciones de la invención, la utilización de elementos de sitios internos de unión a ribosoma (IRES) se utiliza para crear mensajes multigenes o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de desviarse del modelo de exploración de ribosoma de la traducción dependiente de cap metilado 5' e iniciar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Los elementos IRES de dos miembros de la familia picanovirus (polio y encefalomiocarditis) se han descrito (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden estar enlazados a fases de lectura abierta heterólogas. Se pueden transcribir juntas múltiples fases de lectura abierta, cada una separada por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Gracias al elemento IRES, cada fase de lectura abierta es accesible a los ribosomas para una traducción eficaz. Los genes múltiples pueden expresarse eficazmente utilizando un único promotor/potenciador para transcribir un único
mensaje.

Cualquier fase de lectura abierta heteróloga puede estar enlazada a elementos IRES. Esto incluye genes de proteínas secretadas, proteínas multi-subunidad, codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares o unidas a membrana y marcadores seleccionables. De este modo, la expresión de varias proteínas puede introducirse simultáneamente en una célula con una construcción única y un marcador seleccionable único.

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D. Proteínas Codificadas

En esta solicitud, los inventores utilizan información genética con fines creativos o sintéticos. La secuencia de genoma completa proporcionará un catálogo de todos los genes necesarios para la supervivencia, reproducción, evolución y especiación de un organismo y, con herramientas de alta tecnología adecuadas, la información del genoma puede modificarse o incluso crearse a partir de cero con el fin de sintetizar vida. De este modo, se contempla que una combinación de genes de generación de energía adecuados, genes reguladores y otros genes funcionales podrían construirse, lo que sería suficiente para generar un organismo artificial con las funcionalidades básicas que permitieran una supervivencia independiente.

Para conseguir esta diana, la presente invención utiliza secuencias conocidas de ADNc para cualquier gen para expresar proteínas en un organismo artificial. Cualquier proteína así expresada en esta invención puede modificarse para fines específicos de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo algunos residuos específicos de péptidos pueden derivatizarse o modificarse químicamente con el fin de alterar la respuesta inmune o permitir el acoplamiento del péptido a otros agentes. También es posible modificar aminoácidos específicos dentro de los péptidos sin alterar la estructura global o la antigenicidad del péptido. Estos cambios se denominan, por consiguiente, cambios "conservativos" y tienen tendencia a depender de la hidrofilicidad o polaridad del residuo. El tamaño y/o la carga de las cadenas laterales también son factores relevantes para determinar qué sustituciones son conservativas.

Una vez que se ha determinado la secuencia codificante completa de un gen, el gen puede introducirse en un sistema de expresión apropiado. El gen puede expresarse en cualquier cantidad de sistemas de expresión de ADN recombinante diferentes para generar grandes cantidades del producto polipeptídico que después puede purificarse y utilizarse para vacunar animales para generar antisuero con el que se realizarán estudios posteriores.

Ejemplos de sistemas de expresión conocidos por el experto en la materia incluyen bacterias como por ejemplo E. coli, levaduras como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, baculovirus y sistemas de expresión de mamífero como las células COS o CHO. En una realización, los polipéptidos se expresan en sistemas de expresión de E. coli y baculovirus. Se puede expresar un gen completo o, de forma alternativa, pueden producirse fragmentos del gen que codifican porciones de polipéptido.

En una realización, la secuencia génica que codifica el polipéptido se analiza para detectar secuencias transmembrana supuestas. Estas secuencias normalmente son muy hidrófobas y se detectan fácilmente mediante la utilización de un software convencional de análisis de secuencia, como por ejemplo MacVector (IBI, New Haven, CT). La presencia de secuencias transmembrana es a menudo perjudicial cuando se sintetiza una proteína recombinante en muchos sistemas de expresión, especialmente E. coli, ya que lleva a la producción de agregados insolubles que son difíciles de renaturalizar en la conformación original de la proteína. La eliminación de secuencias transmembrana normalmente no altera significativamente la conformación del resto de la estructura de proteína.

Además, las secuencias transmembrana, al estar por definición incrustadas dentro de una membrana, son inaccesibles. Por consiguiente, los anticuerpos de estas secuencias no serán útiles para estudios in vivo o in situ. La eliminación de secuencias codificantes transmembrana de los genes utilizados para expresión puede conseguirse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, los sitios de enzima de restricción situados fortuitamente pueden utilizarse para extraer el fragmento de gen deseado o puede utilizarse una amplificación tipo PCR^{TM} para amplificar únicamente la parte deseada del gen. El experto en la materia será consciente de que estos cambios deben diseñarse de manera que no alteren la fase de lectura traduccional para porciones cadena abajo de la secuencia codificante de
proteína.

En una realización, el análisis informático de la secuencia se utiliza para determinar el emplazamiento de los principales epítopos determinantes antigénicos del polipéptido. El software capaz de llevar a cabo este análisis está disponible en el mercado fácilmente, por ejemplo, MacVector (IBI, New Haven, CT). El software utiliza normalmente algoritmos convencionales tales como los métodos de Kyte/Doolittle o Hopp/Woods para localizar secuencias hidrófilas que se encuentran característicamente en la superficie de las proteínas y, por consiguiente, actúan como determinantes antigénicos.

Una vez que se ha efectuado este análisis, se pueden preparar polipéptidos que contienen al menos los rasgos esenciales del determinante antigénico y que pueden emplearse en la generación de antisuero contra el polipéptido. Los minigenes o fusiones de genes que codifican estos determinantes pueden construirse e insertarse en vectores de expresión mediante métodos convencionales, por ejemplo, utilizando metodología de PCR^{TM}.

El fragmento de gen o el gen que codifica un polipéptido puede insertarse en un vector de expresión mediante técnicas de subclonación convencionales. En una realización, un vector de expresión de E. coli se utiliza para producir el polipéptido recombinante como una proteína de fusión, lo que permite una purificación por afinidad rápida de la proteína. Los ejemplos de sistemas de expresión de proteína de fusión de este tipo son el sistema de glutatión S-transferasa (Pharmacia, Piscataway, NJ), el sistema de proteína de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA).

Algunos de estos sistemas producen polipéptidos recombinantes que portan sólo un número reducido de aminoácidos adicionales, que es poco probable que afecten a la capacidad antigénica del polipéptido recombinante. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG como el sistema 6xHis añaden únicamente secuencias cortas, que son conocidas ambas por ser poco antigénicas y que no afectan negativamente el plegado del polipéptido a su conformación nativa. Otros sistemas de fusión producen polipéptidos ahí donde es deseable extraer el compañero de fusión del polipéptido deseado. En una realización, el compañero de fusión está enlazado al polipéptido recombinante mediante una secuencia peptídica que contiene una secuencia de reconocimiento específica para una proteasa. Ejemplos de secuencias apropiadas son las reconocidas por la proteasa del virus Etch del Tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).

Las células bacterianas recombinantes, por ejemplo E. coli, se cultivan en cualquiera de una diversidad de medios adecuados, por ejemplo LB y la expresión del polipéptido recombinante se induce por adición de IPTG al medio o cambiando la incubación a una temperatura mayor. Después de cultivar la bacteria durante un período adicional entre 2 y 24 h, las células se recogen mediante centrifugación y se lavan para retirar los medios residuales. Las células bacterianas se lisan a continuación, por ejemplo, mediante alteración en un homogeneizador celular y se centrifugan para separar los cuerpos de inclusión densos y las membranas celulares de los componentes celulares solubles. La centrifugación puede realizarse en condiciones en las que los cuerpos de inclusión densos se enriquecen selectivamente mediante la incorporación de azúcares tales como la sacarosa en el tampón y centrifugación a una velocidad
selectiva.

\newpage

En otra realización, el sistema de expresión utilizado es el conducido por el promotor poliédrico de baculovirus. El gen que codifica el polipéptido puede manipularse mediante técnicas convencionales con el fin de facilitar la clonación en el vector baculovirus. Un vector baculovirus es el vector pBlueBac (Invitrogen, Sorrento, CA). El vector que transporta el gen para el polipéptido se transfecta a células de Spodoptera frugiperda (Sf9) mediante protocolos convencionales y las células se cultivan y se procesan para producir el antígeno recombinante. Véase Summers et al. A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station.

Al diseñar un gen que codifica un polipéptido en particular, el índice hidropático de aminoácidos puede tenerse en cuenta. La Tabla 3 proporciona una tabla de codón que muestra los ácidos nucleicos que codifican un aminoácido en particular. La importancia del índice de aminoácido hidropático para conferir la función biológica interactiva en una proteína es por lo general conocida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Lo que sigue es un breve análisis del índice de amino ácido hidropático para su utilización en la presente invención.

TABLA 3

3

Se acepta que la naturaleza hidropática relativa del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

En la técnica se conoce que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y siguen generando una proteína con actividad biológica similar, es decir, que sigue obteniendo una funcionalidad biológica equivalente a la proteína. Al hacer estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están comprendidos entre \pm2, los que se encuentran dentro de \pm1 se prefieren particularmente y los que se encuentran dentro de \pm0,5% son aun más particularmente preferidos.

En la técnica también se entiende que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad. La patente de Estados Unidos 4.554.101, incorporada en este documento como referencia, afirma que la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, de acuerdo con la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, corresponde a una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101 los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm1); glutamato (+3,0 \pm1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (+0,4); prolina (+0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptofano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y seguir obteniendo una replicación biológica e inmunológicamente equivalente. En estos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad se encuentran dentro de \pm2 se prefiere, los que están dentro de \pm1 se prefieren especialmente y los que se encuentran dentro de \pm0,5 son aun más particularmente preferidos.

Como se ha descrito anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan por lo general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina y valina, leucina e isoleucina.

E. Expresión y Suministro de Genes I. Expresión

Una vez que el gen de diseño, el genoma o el sistema biológico se ha realizado de acuerdo con los métodos descritos en este documento, los polinucleótidos pueden expresarse como péptidos codificados o proteínas del gen, del genoma o del sistema biológico. La creación por ingeniería genética de polinucleótidos para expresión en un sistema procariota o eucariota puede llevarse a cabo con técnicas generalmente conocidas por los expertos en expresión recombinante. Por consiguiente, los promotores y otros elementos específicos de un sistema bacteriano, de mamífero o de otra índole pueden incluirse en la secuencia polinucleotídica. Se considera que prácticamente cualquier sistema de expresión puede emplearse en la expresión de las secuencias de ácido nucleico reivindicadas.

Las secuencias polinucleotídicas generadas artificialmente son apropiadas para expresión eucariota, ya que la célula hospedadora por lo general procesará los transcritos genómicos para generar ARNm funcional para traducción en proteína. Se considera que la utilización de una versión de gen de diseño proporcionará ventajas en la medida en que el tamaño del gen por lo general será mucho más pequeño y más fácilmente empleado para transfectar la célula diana que un gen genómico, que normalmente tendrá un orden de magnitud mayor que el gen de diseño. Sin embargo, el inventor no excluye la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen particular cuando se desee.

Tal y como se utilizan en este documento, los términos células "creadas por ingeniería genética" y "recombinantes" se refieren a una célula en la que se ha introducido un polinucleótido exógeno tal y como se describe en este documento. Por consiguiente, las células creadas por ingeniería genética se distinguen de las células de origen natural que no contienen un polinucleótido exógeno introducido de forma recombinante. Las células creadas por ingeniería genética son de este modo células que tienen un gen o varios genes introducidos por la mano del hombre. Las células recombinantes incluyen las que tienen polinucleótidos introducidos y también incluyen polinucleótidos posicionados junto a un promotor que no está naturalmente asociado con el gen particular introducido.

Para expresar una proteína o un péptido codificado recombinante, mutante o de tipo silvestre, de acuerdo con la presente invención, se prepararía un vector de expresión que comprendiera uno de los ácidos nucleicos aislados reivindicados bajo el control de uno o más promotores. Para llevar a una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se posiciona el extremo 5' del sitio de iniciación traduccional de la fase de lectura generalmente entre aproximadamente 1 y 50 nucleótidos "cadena abajo" de (es decir, 3' de) el promotor elegido. El promotor "cadena arriba" estimula la transcripción del ADN insertado y promueve la expresión de la proteína recombinante codificada. Éste es el significado de "expresión recombinante" en el contexto aquí utilizado.

Hay disponibles muchas técnicas convencionales para construir vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos apropiados y las secuencias de control transcripcional/traduccional con el fin de conseguir la expresión de proteína o péptido en una variedad de sistemas de expresión hospedadores. Los tipos de célula disponibles para la expresión incluye, pero no se limitan a, bacterias como E. coli y B. subtilis transformadas con vectores de expresión recombinantes de ADN de fago, ADN de plásmido o ADN de cósmido.

Algunos ejemplos de hospedadores procariotas son E. coli cepa RR1, E. coli LE392, E. coli B. E. coli \chi 1776 (ATCC Nº 31537) así como E. coli W3110 (F-, lambda, prototrófico, ATCC Nº 273325); bacilos como Bacillus subtilis y otras enterobacteriaceas como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens y diversas especies de Pseudomonas.

Por lo general, los vectores plasmídicos que contienen secuencias de control y replicación que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora se utilizan en conexión con estos hospedadores. El vector normalmente transporta un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma a menudo utilizando pBR322, un plásmido obtenido de una especie de E. coli. El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y tetraciclina y proporciona de esta forma un medio fácil para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos o fagos microbianos también deben contener o modificarse para contener, promotores que pueden utilizarse por el organismo microbiano para la expresión de sus propias proteínas.

Además, los vectores de fago que contienen secuencias replicón y de control que son compatibles con el microorganismo hospedador pueden utilizarse como vectores de transformación en conexión con estos hospedadores. Por ejemplo, el fago lambda GEM^{TM}-11 puede utilizarse para hacer un vector fago recombinante que puede utilizarse para transformar células hospedadoras, como por ejemplo E. coli LE392.

Otros vectores útiles incluyen vectores pIN (Inouye et al., 1985) y vectores pGEX, para su utilización en proteínas de fusión soluble S-transferasa (GST) para posterior purificación y separación o escisión. Otras proteínas de fusión apropiadas son las proteínas con \beta-galactosidasa, ubiquitina o similares.

Los promotores más comúnmente utilizados en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores \beta-lactamasa (penicilinasa), lactosa y triptofano (trp). Si bien éstos son los más comúnmente utilizados, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos y se han publicado los detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo a los expertos en la técnica ligarlos funcionalmente con vectores plasmídicos.

Para expresión en Saccharomyces, por ejemplo, se utiliza comúnmente el plásmido YRp7 (Stinchcomb et al., 1979); Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plásmido contiene el gen trpl, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de célula hospedadora de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias de promoción adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzerman et al., 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., 1968, Holland et al., 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Al construir plásmidos de expresión adecuada, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también están ligadas en el vector de expresión 3' de la secuencia que se desea expresar para proporcionar la poliadenilación del ARNm y terminación.

Otros promotores adecuados, que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por condiciones de crecimiento, incluyen la región promotora para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa mencionada anteriormente y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de microorganismos, también pueden utilizarse como hospedadores cultivos de células obtenidos de organismos multicelulares. En principio, se pueden trabajar estos tipos de cultivo de células, ya sean por cultivos de vertebrados o invertebrados. Además de las células de mamífero, incluyen sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) y sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una o más secuencias codificantes.

En un sistema de insectos útil, el virus de polihidrosis nuclear de Autograph californica (aCnpv) se utiliza como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificantes de ácido nucleico aislado se clonan en regiones no esenciales (por ejemplo el gen poliédrico) del virus y se colocan bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor poliédrico). La inserción satisfactoria de las secuencias codificantes tiene como resultado la inactivación del gen poliédrico y la producción de virus recombinante no ocluida (por ejemplo, virus que carecen del revestimiento proteináceo codificado por el gen poliédrico). Estos virus recombinantes se utilizan después para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que el gen insertado se expresa (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051).

Algunos ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles son las células VERO y HeLa, las líneas de células de ovario de hámster Chino (CHO), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2. NIH3T3, RIN y MDCK. Además, se puede elegir una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico del modo específico deseado. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteína puede ser importante para la función de la proteína codificada.

Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento post-traduccional y la modificación de proteínas. Las líneas de células apropiadas o sistemas hospedadores pueden elegirse para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de las proteínas extrañas expresadas. Los vectores de expresión para su utilización en células de mamífero incluyen normalmente un origen de replicación (según sea necesario), un promotor situado delante del gen a expresar, junto con cualquier sitio de unión de ribosoma necesario, sitios de empalme de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. El origen de replicación puede proporcionarse o bien mediante la construcción del vector para incluir un origen exógeno o puede obtenerse de SV40 u otras fuentes virales (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) o pueden proporcionarse por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, lo último es con frecuencia suficiente.

Los promotores pueden obtenerse del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia). Además, también es posible y puede ser deseable, utilizar secuencias de control o promotoras normalmente asociadas con la secuencia del gen deseada, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

También pueden ser necesarias señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de las secuencias codificantes de ácido nucleico aisladas reivindicadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Las señales de control traduccional exógeno, incluyendo el codón de iniciación ATG, pueden ser también necesarias. El experto en la materia será fácilmente capaz de determinar esta necesidad y proporcionar las señales necesarias. Se sabe que el codón de iniciación debe estar dentro de marco (o en fase) con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control traduccional exógeno y codones de iniciación pueden tener una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos de potenciación de transcripción apropiados o terminadores de transcripción (Bittner et al., 1987).

En expresión eucariota, también puede ser normal querer incorporar a la unidad transcripcional un sitio de poliadenilación apropiado (por ejemplo, 5-AATAAA-3') si no hay uno dentro del segmento clonado original. Normalmente el sitio de adición poli A está situado a aproximadamente 30 a 2000 nucleótidos "cadena abajo" del sitio de terminación de la replicación en una posición anterior a la terminación de la transcripción.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo, de proteínas recombinantes se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, se pueden crear líneas celulares que expresan de forma estable construcciones que codifican proteína. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospedadoras pueden transformarse con vectores controlados por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción de ADN extraño, las células creadas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares.

Se contempla que los ácidos nucleicos de la invención pueden estar "sobreexpresados", es decir, expresados en niveles aumentados en relación con su expresión natural en células humanas o incluso en relación con la expresión de otras proteínas en la célula hospedadora recombinante. Esta sobreexpresión puede valorarse mediante diferentes métodos, incluyendo el marcaje radiactivo y/o la purificación proteínica. Sin embargo, se prefieren métodos sencillos y directos, por ejemplo, los que recurren a SDS/PAGE y tinción de proteína o transferencia de western, seguidos por análisis cuantitativos, como la exploración densitométrica del gel o mancha resultante. Un aumento específico en el nivel del péptido o la proteína recombinante en comparación con el nivel en las células humanas es una indicación de sobreexpresión, al ser una abundancia relativa de la proteína específica en relación con otras proteínas producidas por la célula hospedadora y, por ejemplo, visible en un gel.

II. Suministro

En diversas realizaciones de la invención la construcción de expresión puede comprender un virus o una construcción de ingeniería genética obtenido de un genoma viral. La capacidad de determinados virus de introducirse en células a través de endocitosis mediada por receptor y de integrarse en el genoma de la célula hospedadora y expresar genes virales de forma estable y eficazmente los convierten en candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños en células de mamífero (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus utilizados como vectores fueron virus de ADN incluyendo papovavirus (virus simio 40, virus del papiloma bovino y polioma), (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y adenovirus (Ridgaway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y virus adenoasociados. Los retrovirus también son vehículos de transferencia de gen atractivos (Nicolas y Rubenstein, 1988, Temin, 1986) como son el virus vaccinia (Ridgeway, 1988) y los virus adeno-asociados (Ridgeway, 1988). Estos vectores pueden utilizarse para (i) transformar líneas de células in vitro con el fin de expresar proteína de interés o (ii) transformar células in vitro o in vivo para proporcionar polipéptidos terapéuticos en un escenario de terapia génica. El virus del herpes simplex (HSV) es otro candidato atractivo, especialmente cuando se desea neurotropismo. El HSV también es relativamente fácil de manipular y puede cultivarse en títulos mayores. De este modo el suministro es menos problemático, tanto en cuanto a los volúmenes que se necesitan para alcanzar una MOI suficiente como en cuanto a una menor necesidad de repetir las dosificaciones.

Con el reciente reconocimiento del virus de la hepatitis B defectuoso, se conoce mejor la relación estructura-función de las diferentes secuencias virales. Estudios in vitro han demostrado que el virus puede mantener la capacidad de empaquetamiento y transcripción inversa dependiente de auxiliar a pesar de la eliminación de hasta un 80% de su genoma (Horwich et al., 1990). Esto sugería que grandes porciones del genoma podían sustituirse con material genético extraño. El hepatotropismo y la persistencia (integración) eran propiedades especialmente atractivas para la transferencia génica dirigida al hígado. Chang et al., introdujeron recientemente el gen de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) en un genoma de virus de la hepatitis B del pato en lugar de secuencias codificantes de polimerasa de superficie y presuperficie. Fue cotransfectado con virus de tipo silvestre en una línea celular de hepatoma aviar. El medio de cultivo que contenía títulos mayores de virus recombinantes se utilizaron para infectar hepatocitos de crías de pato primarios. La expresión de gen CAT fue detectada al menos 24 días después de la transfección (Chang et al., 1991).

Varios métodos no virales para la transferencia de construcciones de expresión en células de mamífero cultivadas también se contemplan en la presente invención. Incluyen precipitación de fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979) y complejos lipofectamina-ADN, sonicación celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeo genético utilizando miroproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse con éxito para utilización in vivo o ex vivo.

Una vez que la construcción de expresión se ha introducido en la célula, el ácido nucleico que codifica el gen de interés puede posicionarse y expresarse en sitios diferentes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula. Esta integración puede situarse en la ubicación y orientación afín a través de recombinación homóloga (sustitución de gen) o puede integrarse en una ubicación aleatoria, no específica (aumento de gen). En otras realizaciones, el ácido nucleico puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento episomal separado de ADN. Estos segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente de o en sincronización con el ciclo de célula hospedadora. La forma en que la construcción de expresión se suministra a una célula y el lugar en el que permanece el ácido nucleico en la célula depende del tipo de construcción de expresión empleada.

En una realización, la construcción de expresión puede consistir simplemente en ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia de la construcción puede realizarse por cualquiera de los métodos mencionados más arriba que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto se aplica en particular a la transferencia in vitro pero puede aplicarse a la utilización in vivo también. Dubensky et al., (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de precipitados de fosfato de calcio en el hígado y el bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando una replicación viral activa y una infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos de precipitado de fosfato de calcio da como resultado la expresión de genes transfectados. Se contempla que el ADN que codifica un gen de interés también puede transferirse de una forma similar in vivo y expresar el producto génico.

Otra realización de la invención para transferir una construcción de expresión de ADN desnudo o un segmento de ADN en células puede implicar bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles revestidos con ADN a una alta velocidad que les permita perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Uno de estos dispositivos depende de una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motora (Yang et al., 1990). Los microproyectiles utilizados están compuestos por sustancias biológicamente inertes como tungsteno o perlas de oro.

Se han bombardeado in vivo órganos seleccionados, incluyendo el hígado, la piel y el tejido muscular de ratas y ratones (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir la exposición quirúrgica del tejido o las células, para eliminar cualquier tejido que intervenga entre la pistola y el órgano diana, es decir tratamiento ex vivo. Una vez más, se puede suministrar ADN que codifique un gen particular a través de este método y todavía estar incorporado en la presente invención.

En otra realización de la invención, el segmento de ADN o la construcción de expresión pueden estar atrapados en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de dos capas fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas líquidas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando hay fosfolípidos suspendidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan auto-rearreglo antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawate, 1991). También se contemplan complejos de ADN-
lipofectamina.

El suministro de ácido nucleico mediado por liposoma y expresión de ADN in vitro ha tenido mucho éxito. Wong et al., (1980) demostraron la viabilidad del suministro mediado por liposoma y la expresión de ADN extraño en células de embrión de pollo cultivado, HeLa y de hepatoma. Nicolau et al., (1987) consiguieron con éxito una transferencia de gen mediada por liposoma en ratas tras inyección intravenosa.

En algunas realizaciones, el liposoma puede formar un complejo con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que éste facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada celular del ADN encapsulado en liposoma (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede formar un complejo o emplearse junto con proteínas cromosómicas no histonas nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). En otras realizaciones, el liposoma puede formar un complejo o emplearse junto con HVJ y HMG-1. Si estas construcciones de expresión se han empleado con éxito en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in vivo, entonces son aplicables a la presente invención. Cuando se emplea un promotor bacteriano en la construcción de ADN, también será deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.

Otras construcciones de expresión que pueden emplearse para suministrar un ácido nucleico que codifica un gen particular en las células son los vehículos de suministro mediados por receptor. Éstos aprovechan la captación selectiva de macromoléculas por la endocitosis mediada por receptor en casi todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica por tipo de las células de varios receptores, el suministro puede ser altamente específico (Wu y Wu, 1993).

Los vehículos destinados a genes mediados por receptor consisten por lo general en dos componentes: un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a ADN. Se han utilizado varios ligandos para la transferencia de gen mediada por receptor. Los ligandos más ampliamente caracterizados son asialoorosomucoido (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1990). Recientemente una neoglicoproteina sintética, que reconoce el mismo receptor que ASOR, se ha utilizado como vehículo de suministro de gen (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) también se han utilizado para suministrar genes a células de carcinoma escamoso (Myers, EPO 0273085).

En otras realizaciones, el vehículo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. (1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialgangliosido galactosa-terminal, incorporado en liposomas y observaron un incremento en la captación del gen de insulina por los hepatocitos. De este modo, es posible que un ácido nucleico que codifica un gen en particular pueda ser suministrado también específicamente a un tipo de célula como las células de pulmón, epiteliales o tumorales por cualquier sistema de receptor-ligando con o sin
liposomas.

En algunas realizaciones, la transferencia de genes puede realizarse más fácilmente en condiciones ex vivo. La terapia génica ex vivo se refiere a aislamiento de células de un organismo, el suministro de un ácido nucleico en las células in vitro y posteriormente el retorno de las células modificadas al organismo. Esto puede suponer la remoción quirúrgica de tejido/órganos de un animal o el cultivo primario de células y tejidos. Anderson et al., Patente de Estados Unidos 5.399.346, revela métodos terapéuticos ex vivo.

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F. Síntesis de oligonucleótidos

La síntesis de oligonucleótidos es conocida por los expertos en la técnica. Se han revelado varios mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos en por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.

La química fosforamidita (Beaucage y Layer, 1992) se ha convertido con diferencia en el método químico más ampliamente utilizado de acoplamiento para la síntesis de oligonucleótidos. Como bien saben los expertos en la técnica, la síntesis de los oligonucleótidos con fosforamidita supone la activación de precursores monómeros de fosforamidita nucleósidos mediante la reacción con un agente activador para formar intermedios activados, seguido por la adición secuencial de intermedios activados a la cadena oligonucleotídica creciente (por lo general anclada en un extremo a un soporte sólido apropiado) para formar el producto de oligonucleótido.

El tetrazol se utiliza comúnmente para la activación de monómeros de fosforamidita nucleósidos. El tetrazol tiene un protón acídico que supuestamente protona el nitrógeno básico del grupo fosfina diisopropilamino, convirtiendo de esta forma al grupo diisopropilamino en un grupo de salida. El ión tetrazolio cargado negativamente realiza entonces un ataque en el fósforo trivalente, formando una especie tetrazolida fósforo transitoria. El grupo 5'-OH del nucleósido unido al soporte sólido después ataca la especie de fósforo trivalente activa, generando la formación del enlace internucleótido. El fósforo trivalente se oxida finalmente al fósforo pentavalente. Las patentes de Estados Unidos enumeradas anteriormente describen otros activadores y soportes sólidos para la síntesis de oligonucleótidos.

La síntesis de oligonucleótidos de alto rendimiento puede conseguirse utilizando un sintetizador. El Genome Science and Technology Center, como parte del esfuerzo de desarrollo de automatización, desarrolló recientemente un sintetizador de oligonucleótidos a gran escala de alto rendimiento. Este instrumento, denominado MERMADE, está basado en un formato de placa de 96 pocillos y utiliza un control robótico para llevar a cabo síntesis paralela en 192 muestras (2 placas de 96 pocillos). Este dispositivo se ha descrito en varias ocasiones en la bibliografía y en presentaciones y está generalmente disponible en el ámbito público (bajo licencia de la Universidad de Texas y disponible bajo contrato de Avantec). El dispositivo ha registrado varias generaciones con diferentes parámetros operativos.

El dispositivo puede utilizarse para sintetizar simultáneamente 192 oligonucleótidos con un 99% de éxito. Tiene un éxito prácticamente del 100% para oligómeros inferiores a 60 pb; opera a niveles de síntesis de 20 mM y tiene un rendimiento > al 99% en síntesis completa. Utilizando estos sistemas el inventor ha sintetizado más de 10.000 oligómeros utilizados para secuenciación; amplificación por PCR^{TM} y aplicaciones de ADN recombinante. En la mayoría de los casos, incluyendo la clonación, el éxito de síntesis es tal que la purificación después de la síntesis no es
necesaria.

Una vez que el genoma se ha sintetizado utilizando los métodos de la presente invención puede ser necesario explorar las secuencias para analizar la función. El presente inventor contempla específicamente tecnologías de ADN basadas en chip como las descritas por Hacia et al. (1996) y Shoemaker et al. (1996). Brevemente, estas técnicas suponen métodos cuantitativos para analizar números elevados de genes de una forma rápida y precisa. Al etiquetar los genes con oligonucleótidos o al utilizar series de sonda fijas, se puede emplear la tecnología de chip para segregar las moléculas diana como series de alta densidad y seleccionar estas moléculas sobre la base de hibridación. Ver también Pease et al. (994); Fodor et al. (1991).

La utilización de síntesis combinatoria y series de selección de alto rendimiento también son conocidas por el experto en la materia, por ejemplo 5.807.754; 5.807.683; 5.804.563; 5.789.162; 5.783.162; 5.783.384; 5.770.358; 5.759.779; 5.747.334; 5.686.242; 5.198.346; 5.738.996; 5.733.743; 5.714.320; 5.663.046. Estas patentes revelan varios aspectos de los métodos y composiciones utilizados en el ensamblaje y análisis de actividad de series de alta densidad de diferentes polisubunidades (polinucleótidos o polipéptidos). Como tal, se contempla que los métodos y composiciones descritos en las patentes enumeradas anteriormente pueden resultar útiles en ensayos de perfiles de actividad de la composición de la presente invención.

La presente invención produce un polinucleótido con capacidad de replicación. Los virus son trozos de ADN con capacidad de replicación de origen natural, hasta el alcance en que la divulgación relacionada con los virus puede ser útil en el contexto de la presente invención, lo siguiente es una descripción de los virus. Los investigadores observan que los virus han evolucionado para ser capaces de suministrar su ADN a varios tejidos hospedadores a pesar de los diferentes mecanismos defensivos del cuerpo humano. Por este motivo, se han diseñado numerosos vectores virales por parte de investigadores que pretenden crear vehículos para el suministro génico terapéutico. Algunos de los tipos de virus que han sido creados por ingeniería genética se enumeran más adelante.

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II. Adenovirus

El adenovirus es un virus de ADN bicatenario de 36 kB lineal, que permite la sustitución de grandes trozos de ADN adenoviral con secuencias extrañas hasta 7 kB (Grunhaus y Horwitz, 1992). El ADN de adenovirus no se integra en el cromosoma de la célula hospedadora porque el ADN adenoviral puede replicarse de una forma episomal. Asimismo, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado ningún rearreglo de genoma después de una amplificación extensiva. Los adenovirus pueden infectar virtualmente todas las células epiteliales con independencia de su estado de ciclo celular. Esto significa que los adenovirus pueden infectar células que no están en división. De momento, la infección adenoviral parece estar relacionada sólo con enfermedades leves como enfermedad respiratoria aguda en seres humanos. Este grupo de virus puede obtenerse en títulos altos, por ejemplo 10^{9} - 10^{11} unidades formadoras de placa por ml y son muy inefectivos.

Ambos extremos del genoma viral contienen repeticiones invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases, que son elementos cis necesarios para la replicación y empaquetamiento de ADN viral. Las regiones tempranas (E) y tardías (L) del genoma contienen diferentes unidades de trascripción que están divididas por el inicio de la replicación de ADN viral. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la trascripción del genoma viral y algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) tiene como resultado la síntesis de las proteínas para la replicación de ADN viral. Estas proteínas participan en la replicación de ADN, expresión de gen tardía y cierre celular hospedador (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de cápside virales, se expresan sólo tras un procesamiento significativo de un transcrito primario único generado por el promotor tardío principal (MLP). El MLP (situado en 16,8 m.u.) es particularmente eficaz durante la fase tardía de infección y todos los ARNm generados por este promotor poseen una secuencia líder tripartita-5' (TPL) que hace que sean los ARN preferidos para la traducción.

La región E3 codifica proteínas que parecen ser necesarias para la lisis eficaz de células infectadas por Ad así como para prevenir citólisis mediada por TNF y lisis mediada por CTL de células infectadas. Por lo general, la región E4 codifica siete proteínas, algunas de las cuales activan el promotor E2. Se ha demostrado que bloquean el transporte de ARNm hospedador y potencian el transporte de ARN viral al citoplasma. Además el producto E4 es responsable en parte de la reducción de expresión génica temprana que se observa posteriormente en la infección. E4 también inhibe la expresión de E1A y E4 (pero no E1B) durante el crecimiento lítico. Algunas proteínas E4 son necesarias para la replicación de ADN eficaz, sin embargo el mecanismo de esta participación no se conoce. E4 también participa en los eventos post-transcripcionales en la expresión génica tardía viral, es decir el empalme alternativo del líder tripartito en crecimiento lítico. No obstante, las funciones de E4 no son en absoluto necesarias para la replicación de ADN pero su carencia retardará la replicación. Otras funciones incluyen la regulación negativa de síntesis ADN viral, inducción de reorganización subnuclear normalmente observada durante la infección por adenovirus y otras funciones que son necesarias para la replicación viral, la acumulación de ARNm viral tardía y el cierre transcripcional de la célula hospedadora.

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II. Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus ARN de cadena única caracterizados por su capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra entonces de forma estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración tiene como resultado la retención de las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env que codifican proteínas de cápside, enzima polimerasa y componentes de envuelta, respectivamente. Se construye una secuencia que se encuentra cadena arriba del gen gag, denominada componentes \Psi (Mann et al. 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con el LTR retroviral y las secuencias \Psi se introducen en esta línea celular (por ejemplo por precipitación de fosfato de calcio), la secuencia \Psi permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que se secretan entonces en el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin. 1986; Mann et al. 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recoge entonces, opcionalmente se concentra y se utiliza para transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración requiere la división de las células hospedadoras (Parking et al.,
1975).

La familia de los retrovirus incluye las subfamilias de los oncovirus, los lentivirus y los espumavirus. Dos oncovirus son los virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) y el virus de la leucemia felina (FeLV). Los lentivirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) y el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). Entre los virus murinos como el MMLV hay una clasificación adicional. Los virus murinos pueden ser ecotrópicos, xenotrópicos, politrópicos o anfotrópicos. Cada clase de virus se dirige a receptores de superficie celular diferentes para iniciar la infección.

Otros avances en el diseño de vector retroviral y métodos de concentración han permitido la producción de virus anfotrópicos y xenotrópicos con títulos de 10^{8} a 10^{9} cfu/ml (Bowles et al., 1996; Irwin et al., 1994; Jolly, 1994; Kitten et al. 1997).

Los retrovirus recombinantes sin capacidad de replicación no son patógenos agudos en los primates (Chowdhury et al. 1991). Se han aplicado con éxito en sistemas de cultivo celular para transferir el gen de CFTR y generar secreción de Cl^{-} activada por AMPc en una variedad de tipos de célula, incluyendo el epitelio de vías respiratorias humanas (Drumm et al., 1990; Olsen et al., 1992; Anderson et al., 1991; Olsen et al. 1993). Aunque hay pruebas de respuestas inmunes a las proteínas virales gag y env, esto no evita la readministración satisfactoria del vector (McCormack et al., 1997). Además, puesto que los retrovirus recombinantes no tienen productos génicos expresados diferentes del transgén, el riesgo de una respuesta inflamatoria hospedadora debido a la expresión de proteína viral es limitado (McCormack et al., 1997). En cuanto a la preocupación por la mutagenesis insercional, hasta la fecha no hay ejemplos de mutagenesis insercional que surja a partir de ensayos humanos con vectores retrovirales recombinantes.

Más recientemente, se han descrito vectores de lentivirus híbridos que combinan elementos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Naldini et al., 1996) o el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) (Poeschla et al. 1998) y MMLV. Estos vectores transducen células no divisorias en el CNS (Naldini et al., 1996; Blomer et al., 1997), el hígado (Kafri et al., 1997), el músculo (Kafri et al., 1997) y la retina (Miyoshi et al., 1997). Sin embargo, un reciente informe en modelos de xenoinjerto de epitelio de las vías respiratorias humanas sugiere que en epitelio bien diferenciado, la transferencia génica con lentivirus basado en VIH pseudotipificado VSV-G es ineficiente (Goldman et al., 1997).

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III. Virus adeno-Asociado (AAV)

Además, los AAV poseen varios rasgos únicos que los hacen más deseables que otros vectores. A diferencia de los retrovirus, los AAV pueden infectar células no divisorias; se han caracterizado AAV de tipo silvestre mediante integración, de una forma específica de sitio, en el cromosoma 19 de célula humanas (Kotin y Berns, 1989; Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulski et al., 1991) y los AAV también poseen propiedades antioncogénicas (Ostrove et al., 1981; Berns y Giraud, 1996). Los genomas de AAV recombinantes se construyen por clonación molecular de secuencias de ADN de interés entre las ITR de AAV, que eliminan todas las secuencias codificantes del genoma de AAV de tipo silvestre. Los vectores AAV así producidos carecen de cualquiera de las secuencias codificantes del AAV de tipo silvestre, aunque mantienen la propiedad de integración cromosómica estable y la expresión de genes recombinantes en la transducción tanto in vitro como in vivo (Berns, 1990; Berns y Bohensky, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996; Ponnazhagan et al., 1997a). Hasta hace poco tiempo, se creía que los AAV infectaban casi todos los tipos de células y que incluso atravesaban barreras de especies. Sin embargo se ha determinado ahora que la infección por AAV está mediada por receptor (Ponnazhagan et al., 1996: Mizukami et al., 1996).

Los AAV utilizan un ADN de cadena única lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. El genoma está flanqueado por repeticiones terminales invertidas. Están presentes dos genes dentro del genoma, que dan lugar a algunos productos génicos diferenciados. El primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión diferentes (VP), denominadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, gen rep, codifica cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o varios de estos productos de gen rep son responsables de transactivar la transcripción de AAV. La secuencia de AAV ha sido proporcionada por Srivastava et al. (1983) y en la Patente de los Estados Unidos 5.252.479 (el texto completo de la cual se incorpora específicamente a este documento por referencia).

Los tres promotores de AAV están designados por su ubicación, en unidades de mapa, en el genoma. Son de izquierda a derecha p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcritos, dos iniciados en cada uno de los tres promotores, estando empalmados uno de cada par. El sitio de empalme, obtenido de unidades de mapa 42-46 es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no estructurales se obtienen aparentemente de los transcritos más largos y las tres proteínas de virión proceden todas de los transcritos más pequeños.

Los AAV no están asociados a ninguna patología en seres humanos. De forma interesante, para una replicación eficaz, los AAV requieren funciones "auxiliares" de virus como el virus del herpes simplex I y II, el citomegalovirus, el virus de pseudorrabia y, por supuesto, el adenovirus. El auxiliar mejor caracterizado es el adenovirus y se ha observado que muchas funciones "tempranas" de este virus ayudan a la replicación de AAV. La expresión de bajo nivel de las proteínas rep de AAV se cree que mantiene a prueba la expresión estructural de AAV y se cree que la infección viral retira este bloque.

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IV. Virus vaccinia

Los virus vaccinia son un género de la familia poxvirus. Los vectores del virus vaccinia se han utilizado ampliamente debido a la facilidad de su construcción, a los niveles relativamente altos de expresión obtenidos, a la amplia gama hospedadores y gran capacidad para transportar ADN. Vaccinia contiene un genoma de ADN bicatenario lineal de aproximadamente 186 kB que muestra una marcada preferencia "A-T". El genoma está flanqueado por repeticiones terminales invertidas de aproximadamente 10,5 kB. La mayoría de los genes esenciales parecen estar cartografiados en la región central, lo que se conserva en gran medida entre los poxviruses. Las fases de lectura abiertas estimadas en el virus vaccinia ascienden a 150 a 200. Aunque ambas cadenas son codificantes, no es común un solapamiento amplio de fases de lectura. La patente de Estados Unidos 5.656.465 (específicamente incorporada por referencia) describe el suministro del gen in vivo utilizando poxvirus.

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V. Papovavirus

La familia de los papovavirus incluye los papilomavirus y los poliomavirus. Los poliomavirus incluyen el virus Simio 40 (SV40), el virus de polioma y los poliomavirus humanos BKV y JCV. Los papilomavirus incluyen los papilomavirus bovino y humano. Los genomas de poliomavirus son ADN circulares de un poco más de 5000 bases. Los productos génicos predominantes son proteínas de tres viriones (VPI-3) y antígenos T Grande y T Pequeño. Algunos tienen proteínas estructurales adicionales, la agnoproteína y otros tienen un antígeno T Mediano. Los papilomavirus son algo mayores, acercándose a 8 kB.

Se sabe poco de los receptores celulares de los poliomavirus, pero la infección por polioma puede bloquearse mediante tratamiento con sialidasa. El SV40 seguirá infectando células tratadas con sialidasa, pero el JCV no puede hemaglutinar células tratadas con sialidasa. Debido a la interacción de VP1 de polioma con la superficie celular activa c-myc y c-fos, se ha planteado la hipótesis de que el receptor de virus puede tener algunas propiedades de un receptor de factor de crecimiento. Los papilomavirus son específicamente trópicos para epitelio escamoso, aunque no se ha identificado el receptor específico.

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VI. Paramixovirus

La familia de los paramixovirus está dividida en tres géneros: paramixovirus, morbilivirus y pneumovirus. El género paramixovirus incluye el virus de paperas y el virus Sendai, entre otros, mientras que los morbilivirus incluyen el virus del sarampión y los pneumovirus incluyen virus sincitiales respiratorios (RSV). Los genomas de paramixovirus se basan en ARN y contienen una serie de seis o más genes, unidos de forma covalente en tándem. El genoma está algo por encima de 15 kB de longitud. La partícula viral tiene 150-250 nm de diámetro, con proyecciones "vellosas" o puntas que salen del mismo. Estas son glicoproteínas virales que ayudan a mediar la unión y entrada del virus en las células hospedadoras.

Una serie especializada de proteínas está implicada en la unión y entrada de paramixovirus. La unión en Paramixovirus y Morbilivirus está mediada por glicoproteínas que se unen a receptores que contienen ácido siálico. Otras proteínas anclan el virus integrando regiones hidrófobas en la bicapa lipídica de la superficie celular y muestran actividades hemaglutinante y neuraminidasa. En los Pneumovirus, la glicoproteína está fuertemente glicosilada con enlaces O-glicosídicos. Esta molécula carece de las actividades hemaglutinantes y neuraminidasa de sus parientes.

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VII. Virus del Herpes

Como el virus del herpes simplex (HSV) es neurotrópico, ha generado un considerable interés para tratar alteraciones del sistema nervioso. Además la capacidad del HSV de establecer infecciones latentes en células neuronales no divisorias sin integrarse en el cromosoma de la célula hospedadora o alterar de otra forma el metabolismo de la célula hospedadora, junto con la existencia de un promotor que es activo mientras está latente, convierten al HSV en un vector actractivo. Y aunque se ha centrado mucho la atención en aplicaciones neurotrópicas del HSV, este vector también puede explotarse para otros tejidos habida cuenta de su amplia gama de hospedador.

Otro factor que convierte el HSV en un vector atractivo es el tamaño y la organización del genoma. Como el HSV es grande, la incorporación de múltiples genes o casetes de expresión es menos problemática que con otros sistemas virales más pequeños. Además la disponibilidad de diferentes secuencias de control viral con rendimiento variable (temporal, fuerza, etc.) hace que sea posible controlar la expresión en mayor medida que en otros sistemas. También tiene la ventaja de que el virus tiene relativamente pocos mensajes empalmados, haciendo más fácil las manipulaciones genéticas.

El HSV es también relativamente fácil de manipular y puede hacerse crecer en títulos altos. De esta manera, el suministro es menos problemático, tanto en términos de volumen necesario para alcanzar una MOI suficiente como que requiere menos dosificaciones repetidas. Para una revisión del HSV como vector de terapia génica, véase Glorioso et al. (1995).

Los HSV, designados con los subtipos 1 y 2, son virus con envuelta que se encuentran entre los agentes infecciosos más comunes entre los seres humanos, infectando a millones de seres humanos en todo el mundo. El genoma grande complejo de ADN bicatenario codifica docenas de productos génicos diferentes, algunos de los cuales se obtienen de transcritos empalmados. Además de los componentes estructurales de envuelta y viriones, el virus codifica numerosas otras proteínas incluida una proteasa, una reductasa de ribonucleótidos, una ADN polimerasa, una proteína de unión a ADNss, una helicasa/primasa, una ATPasa dependiente de ADN, una dUTPasa y otras.

Los genes de HSV forman varios grupos cuya expresión está regulada de forma coordinada y ordenada de forma secuencial a modo de cascada (Honess y Roizman, 1974; Honess y Roizman 1975; Roizman y Sears, 1995). La expresión de genes \alpha, la primera serie de genes expresada después de la infección, es reforzada por la proteína de virión nº 16 o factor transductor \alpha (Post et al., 1981; Batterson y Roizman, 1983; Campbell et al., 1983). La expresión de genes \beta requiere productos funcionales de gen \alpha, en particular ICP4, que está codificado por el gen \alpha4 (Peluca et al., 1985). Los genes \gamma, un grupo heterogéneo de genes que codifica en gran medida proteínas estructurales de viriones, requiere el inicio de síntesis de ADN viral para una expresión óptima (Holland et al., 1980).

En consonancia con la complejidad del genoma, el ciclo de vida del HSV está muy involucrado. Además del ciclo lítico, que da como resultado la síntesis de partículas de virus y, eventualmente, la muerte de la célula, el virus tiene la capacidad de entrar en un estado latente en el que se mantiene el genoma en los ganglios neurales hasta que algunas señales hasta ahora no definidas activan una reaparición del ciclo lítico. Las variantes no virulentas del HSV se han desarrollado y se pueden utilizar fácilmente en contextos de terapia génica (patente de Estados Unidos
5.672.344).

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G. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Cabe observar por los expertos en la técnica que las técnicas reveladas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención y de este modo puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la actual revelación, apreciar que muchos cambios pueden hacerse en las realizaciones específicas que se revelan y seguir obteniendo un resultado parecido o similar.

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Ejemplo 1

Ensamblaje génico combinatorio

El inventor ha desarrollado una estrategia de ensamblaje de oligómeros en moléculas de ADN mayores denominada ensamblaje combinatorio. El procedimiento se lleva a cabo de la siguiente forma: se puede diseñar un plásmido utilizando cualquiera de los programas informáticos comerciales o de dominio público para contener los genes, promotores, selección de fármaco, origen de replicación, etc., requeridos. SynGene v.2.0 es un programa que genera una lista de oligonucleótidos solapantes lo suficiente para volver a ensamblar el gen o plásmido (ver Figura 7A-Figura 7G). Por ejemplo, para un gen de 5000 pb, el SynGene 2.0 puede generar dos listas de 100 componentes de 50 unidades de una cadena y 100 componentes de 50 unidades de la cadena complementaria de manera que cada par de oligómeros se solapará en 25 pares de bases. El programa comprueba la secuencia de repeticiones y produce un archivo de entrada MERMADE que programa directamente el sintetizador de oligonucleótidos. El sintetizador produce dos series de placas de 96 pocillos que contienen los oligonucleótidos complementarios. En la figura 7 se describe un programa SynGen. Este programa está diseñado para descomponer un gen de diseño o genoma en oligonucleótidos para síntesis. El programa sirve para el gen diseñador sintético completo y se basa en un programa original para formatear secuencias de ADN desarrollado por el Dr. Glen Evans.

El ensamblaje combinatorio se lleva a cabo mejor utilizando una estación de trabajo robótica programable tal como un Beckman Biomek 2000. En resumen, los pares de oligómeros que se solapan se mezclan e hibridan. Después de la hibridación, una serie más pequeña de oligómeros dúplex se genera. Éstos se emparejan e hibridan de nuevo, formando una serie más pequeña de oligómeros más grandes. De forma secuencial, se permite que los oligómeros solapados se hibriden hasta que se completa el reensamblaje entero. La hibridación puede llevarse a cabo en ausencia de ligasa o cada paso puede estar seguido de ligamiento. En una configuración, los oligómeros se hibridan en presencia de topoisomerasa 2, que no requiere la fosforilación 5' del oligómero, se produce a temperatura ambiente y es una reacción rápida (5 minutos) en contraposición con el ligamiento de 12 horas a 12º. Después del ensamblaje completo, la molécula de ADN resultante puede utilizarse para su propósito de diseño, normalmente transformación en un hospedador bacteriano para replicación. Los pasos de este ciclo se subrayan en la figura 3.

Este enfoque tiene una ventaja importante frente a la clonación basada en ADN recombinante tradicional. Si bien es técnicamente posible hacer virtualmente cualquier mutación o modificación en moléculas de ADN existentes, el esfuerzo requerido, así como el alto nivel de preparación técnica hace que algunas construcciones sean difíciles o tediosas. Este método, que se ha utilizado durante muchos años, no es aplicable a la clonación génica automatizada o a la creación a gran escala o a secuencias de ADN totalmente novedosas.

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Ejemplo 2

Producción de Genes Artificiales

En un ejemplo, la presente invención producirá un gen conocido de aproximadamente 1000 pares de bases de longitud mediante el siguiente método. Se genera una serie de oligonucleótidos, cada uno de 50 bases, de manera que la cadena positiva completa del gen esté representada. Se genera una segunda serie de oligonucleótidos, que también comprende 50 unidades para la cadena negativa. Esta serie se diseña, sin embargo, de manera que el emparejamiento complementario con la primera y la segunda series da como resultado un solapamiento de secuencias "pareadas", es decir, cada oligonucleótido de la primera serie es complementario con regiones de dos oligonucleótidos de la segunda serie (con la excepción posible de los oligonucleótidos terminales). La región de solapamiento se establece en 30 bases, dejando un saliente de 20 pares de bases para cada par. La primera serie y la segunda serie de oligonucleótidos se hibridan en una mezcla única y se tratan con una enzima de ligamiento.

En otro ejemplo, el gen que se va a sintetizar tiene aproximadamente 5000 pares de bases. Cada serie de oligonucleótidos está constituida por cincuenta 100-meros con regiones que se solapan, de oligonucleótidos complementarios, de 75 bases, dejando "extremos cohesivos" de 25 bases. En esta realización, el oligonucleótido terminal 5' de la primera serie de oligonucleótidos se hibrida con el oligonucleótido terminal 3' de la segunda serie para formar un primer producto hibridado, después el siguiente oligonucleótido terminal más 5' de la primera serie se hibrida con el primer producto hibridado para formar un segundo producto hibridado y el proceso se repite hasta que todos los oligonucleótidos de dichas primera y segunda series se han hibridado. El ligamiento de los productos puede producirse entre pasos o al final de todas las hibridaciones.

En un tercer ejemplo, un gen de 100.000 pb se sintetiza a partir de mil 100-meros. Una vez más, el solapamiento entre "pares" de oligonucleótidos positivos y negativos es de 75 bases, dejando un saliente de 25 pares de bases. En este método, un enfoque combinatorio se utiliza en el que pares correspondientes de oligonucleótidos parcialmente complementarios se hibridan en el primer paso. Después se lleva a cabo una segunda ronda de hibridación con pares de producto apropiadamente complementarios de la primera ronda. Este proceso se repite un total de 10 veces, reduciendo cada ronda de hibridación el número de productos a la mitad. El ligamiento de los productos se lleva a cabo entonces.

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Ejemplo 3

Expresión a gran escala de productos génicos humanos

Una vez caracterizado el genoma humano, el análisis funcional del genoma humano, basado en la secuencia completa requerirá una variedad de enfoques para la biología estructural, funcional y de red. El enfoque que se propone en este documento para producir una serie de construcciones de expresión que representan todos los productos génicos humanos potenciales y el ensamblaje de series de bacterias y/o levaduras que expresan estos productos proporcionará una vía importante para el principio del análisis funcional.

En segundo lugar, el enfoque que aquí se describe, cuando se desarrolle hasta su punto teórico óptimo, permitirá la transferencia a gran escala de genes a líneas celulares u organismos para análisis funcional. La meta a largo plazo de este concepto es la creación de organismos vivos totalmente basados en procesos de información y en bioinformática. Evidentemente, el conocimiento de la secuencia completa no es suficiente para valorar el abanico de conceptos biológicos inherentes a la vida.

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Ejemplo 4

Construcción de un plásmido sintético

Se diseñó una molécula de ADN utilizando partes sintéticas de plásmidos conocidos previamente. Como demostración de esta técnica, se diseñó el plásmido Synlux4. Synlux4 consta de 4800 pares de bases de ADN. Dentro de esta secuencia se incluye la secuencia de lux A y 1x B, los componentes A y B de la proteína luciferasa de Vibrio Fisherii, porciones de plásmido pUC19 incluyendo el origen de replicación y secuencias de estabilidad de replicación, el promotor y la secuencia codificante para kanamicina/neomicina fosfotransferasa de tn9. La secuencia se diseñó en un ordenador utilizando Microsoft Word y Vector NTI (InforMax, Inc.). La secuencia se recoge en las figuras 4A-4C.

Después del diseño se utilizó un programa de ordenador SynGene 2.0 para descomponer la secuencia en componentes constituidos por oligonucleótidos de 50-meros solapantes. A partir de la secuencia de 4800 pares de bases, se diseñaron 192 50-meros. Los oligonucleótidos componentes se recogen en las figuras 5A-5F. Estos oligonucleótidos componentes se sintetizaron utilizando un sintetizador de oligonucleótidos de 96 pocillos (Rayner et al.) Genome Research. 8. 741-747 (1998). Los oligonucleótidos componentes se produjeron en dos placas de microtitulación de 96 pocillos, conteniendo cada placa una serie de oligonucleótidos componente. De este modo la placa 1 mantenía los oligos de cadena directa y la placa 2 contenía los oligos de cadena inversa.

Los oligonucleótidos se ensamblaron y los ligamientos se llevaron a cabo utilizando una estación de trabajo robótica Biomek 1000 (Beckman). Las transferencias secuenciales de oligonucleótidos se hicieron mediante pipeteado de un pocillo a un segundo pocillo de la placa y se llevó a cabo una reacción de ligamiento utilizando ligasa T4. El patrón de ensamblaje se recoge en las figuras 6A-6B.

Después del ensamblaje la mezcla de ligamiento resultante se utilizó para transformar una cepa DH5a de E. coli competente. La mezcla de transformación se colocó en placas LB con 25 \mug/ml sulfato de kanamicina y se obtuvieron colonias recombinantes. Los clones recombinantes resultantes se aislaron, clonaron y se preparó ADN. El ADN se analizó en geles de agarosa al 1% para detectar las moléculas recombinantes. Los clones revelaron contener el plásmido esperado de 4800 pares de bases que contenía los genes lux A y B.

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en este documento pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente descripción. Mientras las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en este documento. Más específicamente, será evidente que algunos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden sustituirse por los agentes descritos en este documento consiguiéndose los mismos o similares resultados.

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<140> Unknown

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<151> 16-09-1997

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Plásmido sintético

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagatcaaa tgtcgaaagg tcgttttaat tttggaaccg ttcgagggct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataccataaa gattttcgag tatttggtgt tgatatggaa gagtctcgag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caattactca aaatttctac cagatgataa tggaaagctt acagacagga

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accattagct ctgatagtga ttacattcaa tttcctaagg ttgatgtata

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccaaagtg tactcaaaaa atgtaccaac ctgtatgact gctgagtccg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagtacgac agaatggcta gcaatacaag ggctaccaat ggttcttagt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggattattg gtactaatga aaaaaaagca cagatggaac tctataatga

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattgcgaca gaatatggtc atgatatatc taaaatagat cattgtatga

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttatatttg ttctgttgat gatgatgcac aaaaggcgca agatgtttgt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggagtttc tgaaaaattg gtatgactca tatgtaaatg cgaccaatat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttaatgat agcaatcaaa ctcgtggtta tgattatcat aaaggtcaat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgtgattt tgttttacaa ggacatacaa acaccaatcg acgtgttgat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatagcaatg gtattaaccc tgtaggcact cctgagcagt gtattgaaat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattcaacgt gatattgatg caacgggtat tacaaacatt acatgcggat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaagctaa tggaactgaa gatgaaataa ttgcttccat gcgacgcttt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgacacaag tcgctccttt cttaaaagaa cctaaataaa ttaettattt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatactagag ataataagga acaagttatg aaatttggat tattttttct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212>ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaactttcag aaagatggaa taacatctga agaaacgttg gataatatgg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaagactgt cacgttaatt gattcaacta aatatcattt taatactgcc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgttaatg aacatcactt ttcaaaaaat ggtattgttg gagcacctat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taccgcagct ggttttttat tagggttaac aaataaatta catattggtt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattaaatca agtaattacc acccatcacc ctgtacgtgt agcagaagaa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagtttat tagatcaaat gtcagaggga cgcttcattc ttggttttag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactgcgaa agtgatttcg aaatggaatt ttttagacgt catatctcat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggcaaca acaatttgaa gcatgctatg aaataattaa tgacgcatta

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actacaggtt attgtcatcc ccaaaacgac ttttatgatt ttccaaaggt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaattaat ccacactgtt acagtgagaa tggacctaag caatatgtat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 37

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctacatc aaaagaagtc gtcatgtggg cagcgaaaaa ggcactgcct

\hfill

50

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<210> 38

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 38

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttaacattta agtgggagga taatttagaa accaaagaac gctatgcaat

\hfill

50

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<210> 39

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 39

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\hskip-.1em\dddseqskip

tctatataat aaaacagcac aacaatatgg tattgatatt tcggatgttg

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 40

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcatcaatt aactgtaatt gcgaacttaa atgctgatag aagtacggct

\hfill

50

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

caagaagaag tgagagaata cttaaaagac tatatcactg aaacttaccc

\hfill

50

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcaaatggac agagatgaaa aaattaactg cattattgaa gagaatgcag

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttgggtctca tgatgactat tatgaatcga caaaattagc agtggaaaaa

\hfill

50

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

acagggtcta aaaatatttt attatccttt gaatcaatgt ccgatattaa

\hfill

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

agatgtaaaa gatattattg atatgttgaa ccaaaaaatc gaaatgaatt

\hfill

50

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

taccataata aaattaaagg caatttctat attagattgc ctttttgggg

\hfill

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcctctaga aatattttat ctgattaata agatgagaat tcactggccg

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 49

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc

\hfill

50

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<210> 50

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 52

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\hskip-.1em\dddseqskip

atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 53

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 54

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg

\hfill

50

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<210> 55

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 55

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct

\hfill

50

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<210> 56

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 56

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt

\hfill

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<210> 58

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatttttct aaaaagcttc acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

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<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 64

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac

\hfill

50

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<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 65

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt

\hfill

50

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<210> 66

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 66

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag

\hfill

50

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<210> 67

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 67

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\hskip-.1em\dddseqskip

acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 68

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc

\hfill

50

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<210> 69

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt

\hfill

50

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<210> 71

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg

\hfill

50

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat

\hfill

50

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<211> 50

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 78

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 82

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 83

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca

\hfill

50

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<210> 84

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 84

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccggg catgaccaaa

\hfill

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<210> 85

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 85

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\hskip-.1em\dddseqskip

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa

\hfill

50

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<210> 86

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 86

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct

\hfill

50

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<210> 87

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 87

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa

\hfill

50

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<210> 88

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 88

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat

\hfill

50

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<210> 89

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 89

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\hskip-.1em\dddseqskip

accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg

\hfill

50

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<210> 91

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 91

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg

\hfill

50

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<210> 92

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 92

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\hskip-.1em\dddseqskip

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca

\hfill

50

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<210> 93

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 93

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\hskip-.1em\dddseqskip

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 94

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg

\hfill

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 101

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta

\hfill

50

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<210> 102

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 102

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg

\hfill

50

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<210> 103

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 103

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\hskip-.1em\dddseqskip

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 104

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc

\hfill

50

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<210> 105

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 105

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg

\hfill

50

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<210> 106

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 106

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\hskip-.1em\dddseqskip

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt

\hfill

50

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<210> 107

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 109

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<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcccg gggtgggcga

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccggcgtcc

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg cggtggaatc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 117

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 118

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 119

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag

\hfill

50

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<210> 120

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 120

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 121

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\hskip-.1em\dddseqskip

caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct

\hfill

50

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<210> 122

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 122

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat

\hfill

50

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<210> 123

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 123

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 125

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 126

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 127

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac

\hfill

50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 128

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\hskip-.1em\dddseqskip

acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa

\hfill

50

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<210> 129

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 129

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\hskip-.1em\dddseqskip

tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt

\hfill

50

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<210> 130

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 130

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\hskip-.1em\dddseqskip

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc

\hfill

50

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<210> 131

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 131

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca

\hfill

50

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc

\hfill

50

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<210> 133

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 133

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt aagcccactg

\hfill

50

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<210> 134

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc

\hfill

50

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<210> 135

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 135

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc ggactggctt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 136

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctacgtgtt ccgcttcctt tagcagccct tgcgccctga gtgcttgcgg

\hfill

50

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<210> 137

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<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcgtgaag ctttttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

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<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 144

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 145

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actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg

\hfill

50

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<210> 146

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 146

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gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt

\hfill

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<210> 147

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc tcatcttatt

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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aatcagataa aatatttcta gaggatcccc aaaaaggcaa tctaatatag

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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aaattgcctt taattttatt atggtaaatt catttcgatt ttttggttca

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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acatatcaat aatatctttt acatctttaa tatcggacat tgattcaaag

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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gataataaaa tatttttaga ccctgttttt tccactgcta attttgtcga

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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ttcataatag tcatcatgag acccaactgc attctcttca ataatgcagt

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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taattttttc atctctgtcc atttgagggt aagtttcagt gatatagtct

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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tttaagtatt ctctcacttc ttcttgagcc gtacttctat cagcatttaa

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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gttcgcaatt acagttaatt gatgatcaac atccgaaata tcaataccat

\hfill

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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attgttgtgc tgttttatta tatagaattg catagcgttc tttggtttct

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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aaattatcct cccacttaaa tgttaaaggc agtgcctttt tcgctgccca

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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catgacgact tcttttgatg tagcggatac atattgctta ggtccattct

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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cactgtaaca gtgtggatta attgaaacct ttggaaaatc ataaaagtcg

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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ttttggggat gacaataacc tgtagttaat gcgtcattaa ttatttcata

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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gcatgcttca aattgttgtt gccttgatga gatatgacgt ctaaaaaatt

\hfill

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 162

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ccatttcgaa atcactttcg cagtcactaa aaccaagaat gaagcgtccc

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 163

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tctgacattt gatctaataa actggcttct tctgctacac gtacagggtg

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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atgggtggta attacttgat ttaatgaacc aatatgtaat ttatttgtta

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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accctaataa aaaaccagct gcggtaatag gtgctccaac aataccattt

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 166

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tttgaaaagt gatgttcatt aacaaaggca gtattaaaat gatatttagt

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 167

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tgaatcaatt aacgtgacag tctttaccat attatccaac gtttcttcag

\hfill

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgttattcc atctttctga aagtttagaa aaaataatcc aaatttcata

\hfill

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<210> 169

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 169

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acttgttcct tattatctct agtatcaaat aagtaattta tttaggttct

\hfill

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 170

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tttaagaaag gagcgacttg tgtcataaag cgtcgcatgg aagcaattat

\hfill

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 171

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatcttca gttccattag cttcaaatcc gcatgtaatg tttgtaatac

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50

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<210> 172

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 172

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgttgcatc aatatcacgt tgaatgattt caatacactg ctcaggagtg

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 173

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctacagggt taataccatt gctataatca acacgtcgat tggtgtttgt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 174

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtccttgt aaaacaaaat cacgccattg acctttatga taatcataac

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 175

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgagtttg attgctatca ttaaagatat tggtcgcatt tacatatgag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 176

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcataccaat ttttcagaaa ctcccgacaa acatcttgcg ccttttgtgc

\hfill

50

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<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 177

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcatcatca acagaacaaa tataagtcat acaatgatct attttagata

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 178

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatcatgacc atattctgtc gcaatttcat tatagagttc catctgtgct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 179

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\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttcat tagtaccaat aatccaacta agaaccattg gtagcccttg

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 180

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\hskip-.1em\dddseqskip

tattgctagc cattctgtcg tacttgcgga ctcagcagtc atacaggttg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 181

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtacattttt tgagtacact ttgggatata catcaacctt aggaaattga

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 182

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgtaatcac tatcagagct aatggttcct gtctgtaagc tttccattat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 183

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\hskip-.1em\dddseqskip

catctggtag aaattttgag taattgctcg agactcttcc atatcaacac

\hfill

50

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<210> 184

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 184

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\hskip-.1em\dddseqskip

caaatactcg aaaatcttta tggtatagcc ctcgaacggt tccaaaatta

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaacgacctt tcgacatttg atctaataat aaaacgtctt ctaactgtcg

\hfill

50

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<210> 186

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 186

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\hskip-.1em\dddseqskip

aactgggtgt gctgtcggaa taacaacccc catagtgcca acatttaatg

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 187

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttttagttct tcctaacagg ttagccgcag caacaaataa atttcccgta

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 188

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\hskip-.1em\dddseqskip

agaccaaact ctgtaaaatg atgttctaag gtccaatatg tatcaaaccc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 189

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\hskip-.1em\dddseqskip

tactcttctg aggcgatacc aagccgaaca aagcgatcca ttacttagct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 190

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatgagtttc acctggtggt tgatacgaaa aacaaatatt tccaaacttc

\hfill

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 191

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\hskip-.1em\dddseqskip

atactctatt cctttttggt gattctgttt atttaagcca attctaataa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 192

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttcattttca atttcatttt ttaatctacg ctccttaaca gtaatacttg

\hfill

50

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<210> 193

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido Sintético

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<400> 193

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\hskip-.1em\dddseqskip

taacgtcctc aaatcgaggt aagcttcata ggctccgccc ccctgacgag

\hfill

50

Claims

1. Un método para la síntesis de un polinucleótido bicatenario sin el uso de ningún ADN recombinante o de origen natural existente, que comprende los pasos de

a): generar una primera serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena positiva completa de dicho polinucleótido bicatenario;

b): generar una segunda serie de oligonucleótidos correspondiente a la cadena negativa completa de dicho polinucleótido bicatenario y

c): hibridar dicha primera y segunda series de oligonucleótidos;

donde el paso (c) comprende los pasos de

donde cada uno de dichos oligonucleótidos de dicha segunda serie de oligonucleótidos se solapa con e hibrida a dos oligonucleótidos complementarios de dicha primera serie de oligonucleótidos, con la excepción de que dos oligonucleótidos en el extremo 5' o 3' de dicho polinucleótido bicatenario se hibridará con sólo un oligonucleótido complementario.

2. Un método para sintetizar un polinucleótido bicatenario, que comprende: (a) hibridar un oligonucleótido del extremo 5' con un oligonucleótido del extremo 3' de un polinucleótido bicatenario para producir un primer producto hibridado y añadir directamente un oligonucleótido siguiente 5' más terminal de dicho polinucleótido bicatenario a dicho primer producto hibridado en condiciones suficientes para hibridación para producir un segundo producto hibridado, teniendo dicho oligonucleótido siguiente más terminal una longitud de al menos aproximadamente 25 bases y (b) repetir el paso (a) una o más veces para producir en secuencia un polinucleótido bicatenario.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo además los pasos de tratar dichos oligonucleótidos hibridados con una enzima de ligamiento para generar cadenas continuas de dicho polinucleótido bicatenario.

4. El método de la reivindicación 3, donde la enzima de ligamiento es topoisomerasa.

5. El método de la reivindicación 3, donde la enzima de ligamiento es ADN ligasa T4.

6. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo además el paso de amplificar dicho polinucleótido bicatenario.

7. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario comprende 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10x10^{3}, 20x10^{3}, 30x10^{3}, 40x10^{3}, 50x10^{3}, 60 x10^{3}, 70 x10^{3}, 80x10^{3}, 90x10^{3}, 1x10^{5}, 1 x 10^{6}, 1 x 10^{7} ó 1x10^{8} pares de bases de longitud.

8. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario comprende una o más secuencias codificantes y uno o más elementos reguladores.

9. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es un ADN.

10. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es un ARN.

11. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho polinucleótido bicatenario es una construcción de expresión.

12. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión bacteriana.

\newpage

13. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión de mamífero.

14. El método de la reivindicación 11, donde dicha construcción de expresión es una construcción de expresión viral.

15. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho solapamiento entre los oligonucleótidos de dicha primera y dicha segunda serie de oligonucleótidos está entre 5 pares de bases y 75 pares de bases.

16. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicho solapamiento es de 10 pares de bases, 15 pares de bases, 20 pares de bases, 25 pares de bases, 30 pares de bases, 35 pares de bases, 40 pares de bases, 45 pares de bases, 50 pares de bases, 55 pares de bases, 60 pares de bases, 65 pares de bases o 70 pares de bases.