KR20180002782A - 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도 - Google Patents

전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도 Download PDF

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로사 카르도소
마이클 디엠
프랑수아 고뎃
샬롬 골드버그
벤자민 씨. 하먼
라이너스 현
스티븐 제이콥스
도나 클레인
잉제 리
진쿠앙 루오
로난 맥데이드
제니퍼 네메스-세이
카린 오닐
스티븐 씨. 포머랜츠
라오 갈라 찬드라
트레이시 스핀카-돔스
알렉세이 테플야코프
생-쥔 우
질 무니
레오폴도 루이스트로
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Abstract

FN3 도메인이 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)과 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 부위가 CD3과 면역특이적으로 결합하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 또한, 융합 단백질 및 제공된 융합 단백질을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 및 제공된 융합 단백질을 발현하는 세포가 기재된다. 게다가, 제공된 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 사용하는 방법이 기재된다.

Description

전립선 특이적 막 항원(PSMA) 이중특이성 결합제 및 그의 용도
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2016년 5월 3일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI5066WOPCT_SL.txt이며, 크기가 195,436 바이트이다.
기술분야
본 명세서에 제공된 본 발명은, 인간 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen)(PSMA)과 특이적으로 결합하고 클러스터 결정인자 3(CD3)과 면역특이적으로 결합하는 다중특이성 작용제, 및 기재된 작용제의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.
글루타메이트 카르복시펩티다제 II 또는 N-아세틸화 알파-연결 산성 다이펩티다제 1로도 알려진 전립선 특이적 막 항원(PSMA)은 이량체 2형 막관통 당단백질이다. PSMA는 엽산염 및 N-아세틸-L-아스파르틸-L-글루타메이트를 포함한 몇몇 기질을 절단하고, 다수의 조직에서 발현되는데, 이때 최고의 발현은 전립선에서 나타나고, 더 적은 정도로 소장, 중추 및 말초 신경계, 신장 및 폐에서 나타난다. PSMA는 클라트린 피막 홈(clathrin coated pit)을 통해 구성적으로 내재화된다.
PSMA는, 일부 전립선 세포가 비정상적으로 보이고 거동하기 시작한 질환인 전립선 상피내 신생종(PIN); 원발성 및 전이성 전립선암; 및 다른 고형 종양(예를 들어, 유방, 폐, 방광, 신장)의 신생혈관계에서 빈번하게 과발현되는 전립선암 관련 세포막 항원이다. PSMA 발현은 질병 진행 및 글리슨 점수(Gleason score)와 상관된다. PSMA 발현은 전이성 질병, 호르몬 불응성 사례, 및 더 높은 등급의 병변에서 증가되고, 그것은 안드로겐-불감성 종양에서 추가로 상향조절된다.
전립선암은 남성 중에서의 암의 주요 원인이고, 암-유도 사망의 두 번째 주요 원인이다. 전세계적으로, 매해마다 대략 1,100,000건의 새로운 사례 및 300,000건의 사망이 있으며, 이는 모든 암 사망의 약 4%에 해당된다. 6명의 남성마다 1명은 이 질병으로 진단될 것으로 추정된다. 미국에서는, 전립선암의 90% 초과가 국소기 또는 국부기에서 발견된다. 이들 초기 단계에서, 5년 생존율은 100%에 가깝다. 그러나, 암이 전이되었을 때, 5년 생존율은 약 28%로 감소된다.
전립선암에 대한 현재의 치료는 수술, 방사선, 호르몬 및 항체-약물 접합체(ADC) 요법을 포함한다. 그러나, 종양 세포는 종종 안드로겐 불감성이 되었고, 이것이 일어나는 경우, 제한된 치료 선택사항이 남게 된다. 전형적으로, 방사성 약제학적 작용제인 암 백신 시풀류셀(sipuleucel)-T(예컨대, 라듐-223 클로라이드), 2차 호르몬 요법(예컨대, 아비라테론 또는 엔잘루타미드), 및/또는 화학요법(도세탁셀 및 카바지탁셀)이 순차적으로 호르몬 요법에 첨가된다.
이들 치료 각각은 수개월 동안 암의 성장을 지연시키고 이 질병에 의해 야기된 증상을 고식시킬 수 있지만, 이 질병은 궁극적으로 그들에 저항성을 갖게 된다.
따라서, 전립선암 및 PSMA를 과발현하는 다른 암을 치료하기 위한 추가의 그리고 개선된 치료제에 대한 필요성이 남아 있다.
항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 단리된 다중특이성 항원-결합 분자("CD3 × PSMA 다중특이성 분자") 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재된다. 일 실시 형태에서, PSMA에 특이적으로 결합하는 단리된 다중특이성 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 제공된다. 일 실시 형태에서, 결합되는 PSMA는 서열 번호 144의 아미노산 서열을 포함한다.
FN3 도메인
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 PSMA-특이적 도메인은 인간 PSMA와 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 PSMA-특이적 도메인은 마카카 파스키쿨라리스(Macaca fascicularis) PSMA 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) PSMA와 교차 반응한다. 바람직한 실시 형태에서, CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 단리된 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 a) FN3 도메인; b) 경쇄(LC); 및 c) 중쇄(HC)를 포함하며, FN3 도메인은 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)과 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하고, HC와 LC가 쌍을 이루어서 CD3과 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하거나, 또는 그의 PSMA-결합 FN3 도메인 x CD3 이중특이성 항원-결합 단편이 제공된다. 다른 실시 형태에서, CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 발현하는 단리된 세포가 제공된다. 일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 FN3 도메인(또는 "PSMA-특이적 아암(arm)")은 서열 번호 1의 텐콘(Tencon) 서열 또는 서열 번호 4의 텐콘27로부터 유래되며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 및/또는 86에서 치환을 선택적으로 갖거나; FN3 도메인은 본 명세서에 기재된 서열 번호 2, 3, 5, 6, 7, 또는 8의 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다. 이들 서열을 갖는 FN3 도메인의 예가 표 1에 열거되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
다른 실시 형태에서, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 FN3 도메인은 표 2에 열거된 서열들로부터 선택될 수 있다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
다른 실시 형태에서, 서열 번호 144의 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 89% 동일하거나, 또는 서열 번호 41의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 서열 번호 144의 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 FN3 도메인은 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 140의 아미노산 서열을 포함한다.
융합 단백질
본 발명의 다른 실시 형태는 중쇄; FN3 도메인; 및 링커를 포함하는 융합 단백질이다. 중쇄 Fc 영역은 IgG4 PAA일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태는 Fc 영역; FN3 도메인; 및 링커를 포함하는 융합 단백질이다. 링커 및 FN3 도메인은 Fc 영역의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 부착될 수 있다. 링커는 서열 번호 175 (GGGGSGGGGS)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태는 중쇄; FN3 도메인; 및 링커를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 중쇄 Fc 영역은 IgG4 PAA일 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태는 Fc 영역; FN3 도메인; 및 링커를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 링커 및 FN3 도메인은 Fc 영역의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 부착될 수 있다. 링커는 서열 번호 175 (GGGGSGGGGS)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
CD3-결합 아암
일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 CD3-결합 아암(또는 "CD3-특이적 아암")은 마우스 IgG3/람다 동종형인 마우스 단일클론 항체 SP34로부터 유래된다(문헌[K.R. Abhinandan and A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839]). 일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 CD3-결합 아암은 표 3으로부터 선택되는 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 포함한다. 표 3은 CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편의 일부 중쇄 및 경쇄의 예의 요약을 제공한다.
[표 3]
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시 형태에서, CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편은 표 4로부터의 중쇄 및 표 4로부터의 경쇄를 포함한다. 표 4는 CD3-특이적 항체 및 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄의 매트릭스의 요약을 제공한다.
[표 4]
Figure pct00007
IgG 부류는 인간에서 하기의 4가지 동종형으로 분류된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 이들은 Fc 영역의 아미노산 서열에서 95% 초과의 상동성을 공유하지만, 힌지 영역의 아미노산 조성 및 구조에서 큰 차이를 나타낸다. Fc 영역은 효과기 기능, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 매개한다. ADCC에서는, 항체의 Fc 영역이 자연 살해세포 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상의 Fc 수용체(FcgR)에 결합하여, 표적화된 세포의 식세포작용 또는 용해로 이어진다. CDC에서는, 항체가 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발시킴으로써 표적화된 세포를 사멸시킨다.
치료적 항체의 많은 응용에 있어서, Fc-매개 효과기 기능은 작용 기전의 일부가 아니다. 이들 Fc-매개 효과기 기능은 탈기전 독성을 야기함으로써 유해할 수 있고 잠재적으로 안전성 위험을 제기할 수 있다. Fc 영역을 조작하여 FcgR 또는 보체 인자에 대한 그의 결합을 감소시킴으로써 효과기 기능의 변형이 달성될 수 있다. 활성화 FcgR(FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa 및 FcgRIIIb) 및 억제성 FcgR(FcgRIIb) 또는 제1 보체 성분(C1q)에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치된 잔기에 의존한다. 일부 경우에, Fc 기능성을 감소 또는 침묵시키기 위해 돌연변이가 IgG1, IgG2 및 IgG4에 도입되어 왔다.
일 실시 형태에서, 항체는 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 Fc 영역을 포함한다: (a) 모(parent) Fc와 비교할 때 감소된 효과기 기능; (b) Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb 및/또는 Fcg RIIIa에 대한 감소된 친화성; (c) FcgRI에 대한 감소된 친화성; (d) FcgRIIa에 대한 감소된 친화성; (e) FcgRIIb에 대한 감소된 친화성; (f) Fcg RIIIb에 대한 감소된 친화성; 또는 (g) FcgRIIIa에 대한 감소된 친화성.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, CD3-결합 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 IgG1 항체의 Fc 영역은 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 F405L 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG4 또는 그의 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, CD3-결합 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 IgG4 항체의 Fc 영역은 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어, CD3-결합 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 IgG4 항체의 Fc 영역은 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, L235A, 및 F405L 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG-AA Fc-L234A, L235A, 및 F405L(여기서, L234A, L235A, 및 F405L은 돌연변이임)이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 T 세포 및/또는 1차 사이노몰거스 T 세포 상의 CD3ε에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항체의 CD3-특이적 아암의 유래가 되는 CD3-특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 1차 인간 CD4+ T 세포 및/또는 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포를 활성화한다.
CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 추가로 제공된다.
일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자는 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자는 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자는 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함한다.
CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 사용 방법
기재된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 사용 방법이 또한 개시된다. 예를 들어, CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 PSMA-과발현 질병(PSMA-overexpressing disease)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 PSMA-과발현 질병의 치료에 유용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 질병은 암, 바람직하게는 PSMA-과발현 암이다. 일부 실시 형태에서, PSMA-과발현 질병은 일부 전립선 세포가 비정상적으로 보이고 거동하기 시작한 질환인 전립선 상피내 신생종(PIN)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 원발성 및 전이성 전립선암 및 다른 고형 종양(예를 들어, 유방, 폐, 방광, 신장)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전립선암, 결직장암, 위암, 투명 세포 신장 암종(clear cell renal carcinoma), 방광암, 폐암, 자궁내막암 또는 신장암이다. 일부 실시 형태에서, PSMA-과발현 암은 구강의 편평 세포 암종, 교종 및 유방암과 같은 암의 혈관신생 또는 혈관계와 관련된다.
일부 실시 형태에서, 암은 신생혈관성 장애, 예컨대 고형 종양 성장을 특징으로 하는 암이다. PSMA 과발현을 특징으로 하고 본 발명에 따른 치료에 적합한 종양 혈관계를 갖는 예시적인 암은, 예를 들어 투명 세포 신장 암종(CCRCC), 결직장암, 유방암, 방광암, 폐암, 및 췌장암을 포함한다(예를 들어, 문헌[Baccala et al., Urology 70:385.390, 2007](CCRCC에서의 PSMA의 발현); 문헌[Liu et al., Cancer Res. 57:3629-3634, 1997](신장암, 요로암, 폐암, 결장암, 유방암, 및 간에 대한 선암종을 포함한 다양한 비전립선암에서의 PSMA의 발현); 및 문헌[Milowsky et al., J. Clin. Oncol. 25:540-547, 2007] 참조).
PSMA-과발현 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 PSMA-과발현 장애를 치료하는 기재된 방법은 기재된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. PSMA-과발현 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법의 바람직한 실시 형태가 제공되는데, 본 방법은 PSMA-과발현 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의한다.
암 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 제공되는데, 본 방법은 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 의한다.
T 세포를 PSMA-발현 암 세포로 방향전환(redirecting)시키는 방법이 본 명세서에 또한 제공되는데, 본 방법은 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 투여하여 T 세포를 암으로 방향전환시키는 것에 의한다.
CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 키트
개시된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 포함하는 키트가 본 명세서에 기재된다. 기재된 키트는 본 명세서에 제공된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 사용하는 방법, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 및 PSMA 발현 암을 치료하는 데 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 중 하나 이상, 및 사용 중이 아닐 때 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 담기 위한 용기, 및/또는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
도 1. 도 1은 수컷 NSG 마우스에서의 정맥내 주사 후의 비표적화된 89Zr-표지 FN3 도메인의 생체내분포(biodistribution)를 나타낸다.
도 2. 도 2a는 사이노몰거스 PSMA 이량체와 복합체를 형성한 P233FR9_H10 PSMA 결합 FN3 도메인(H10)의 전체 결정 구조를 나타내는데, 이는 H10이 PSMA 활성 부위 부근의 영역에 결합함을 보여준다. 아연 원자(Zn)는 PSMA 활성 부위의 위치를 나타낸다. PSMA 및 H10 분자의 N- 및 C-말단이 복합체들 중 하나에 대해 표시되어 있다. 세포막의 대략적인 위치가 표시되어 있다. 도 2b는 사이노몰거스 PSMA와 복합체를 형성한 H10 FN3 도메인의 결정 구조를 나타낸다. H10 FN3 도메인 내의 A, B, C, D, E, F 및 G 베타 가닥이 나타나 있다. PSMA 활성 부위의 양으로 하전된 입구 내로 삽입되는 H10의 CD 루프 내의 음으로 하전된 잔기(잔기 W38, D39, D40, D41 및 E43)가 나타나 있다. H10 잔기 넘버링은 서열 번호 41에 따른다. 도 2c는 사이노몰거스 PSMA와 복합체를 형성한 H10 FN3 도메인의 결정 구조를 나타낸다. H10 접촉 잔기 W38, D39, D40, D41 및 E43이 도면에 나타나 있다. 사이노 PSMA 잔기들 중 일부는 H10과 접촉하거나(R511, K514 및 K545), 아연 원자를 배위하거나(H377, D387, E424, E425, D453, 및 H553), 또는 활성 부위 공동(cavity)을 구성하는(R536 및 R534) 것으로 나타나 있다. H10 베타 가닥 C, D, F 및 G가 도면에 표시되어 있다. H10 및 사이노몰거스 PSMA 잔기 넘버링은 각각 서열 번호 41 및 141에 따른다.
도 3. 도 3a는 H10 FN3 도메인과 사이노몰거스 PSMA 사이의 결정 구조 결합 부위의 상세도를 나타낸다. H10 FN3 도메인 접촉 잔기 A32, W36, W38-D41, E43, A44, V46, G64, P68, Y70, A72, W79, F81, P82, A85, 및 I86이 나타나 있다. 사이노 PSMA 접촉 잔기 Y460, K499-P502, P504, R511, K514, N540, W541, K545, F546, F488, K610, N613, 및 I614가 나타나 있다. H10 및 사이노몰거스 PSMA 잔기 넘버링은 각각 서열 번호 41 및 141에 따른다. 도 3b는 H10 FN3 도메인 접촉 잔기와 사이노몰거스 PSMA 접촉 잔기 사이의 상호작용 맵을 나타낸다. 4 Å의 거리 컷오프(cut-off)를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다. FN3 도메인 잔기 및 사이노 PSMA 잔기는 각각 회색 및 백색 박스로 표시되어 있고, 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. 잔기 넘버링은 서열 번호 41(H10) 및 서열 번호 141(사이노 PSMA)에 따른다.
도 4. 도 4a는 인간(h) PSMA 세포외 도메인과 사이노몰거스(c) PSMA 세포외 도메인 사이의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. H10 접촉 잔기는 밑줄 그어져 있고 볼드체이다. 인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA 사이의 상이한 잔기들은 음영처리되어 있다. H10과 상호작용하는 모든 사이노(cyno) PSMA 잔기는 하기를 제외하고는 인간 PSMA에서 보존된다: N613. 인간 PSMA ECD; 서열 번호 143. 사이노 PSMA ECD: 서열 번호 32. 도 4b는 사이노몰거스 PSMA와 접촉된 H10 FN3 도메인 잔기를 나타낸다. 접촉 잔기는 밑줄 그어져 있고 볼드체이다. H10 아미노산 서열은 서열 번호 41에 나타나 있다.
도 5. 도 5는, 사이노몰거스 PSMA에 결합된 H10의 결정 구조에서, 화학적 접합이 가능한 부위인, H10 FN3 도메인 잔기 N6, R11, T22, D25, A26, S52, E53, K62, 및 N- 및 C-말단의 위치를 나타낸다. FN3 도메인/PSMA 접촉 영역이 흑색으로 나타나 있다. H10 베타 가닥 C, D, F 및 G가 도면에 표시되어 있다. 잔기 넘버링은 서열 번호 41(H10)에 따른다.
도 6. 도 6은 항 PSMA PE-접합된 FN3 도메인(흑색) 및 항 PSMA 항체-PE(백색)로 염색된 상이한 종양 세포주들의 평균 형광 세기(MFI)의 비교를 나타낸다.
도 7. 도 7a 내지 도 7d는 DAPI, 항 사이토케라틴-FITC, 항-CD45-APC 및 항-PSMA FN3 도메인-PE로 염색된 상이한 종양 세포들에 대한 일련의 CellTracks Analyzer II 브라우저 이미지를 나타낸다. 섬네일(thumbnail) 이미지들은 우측에서 좌측으로 PSMA-PE 염색, CD45-APC 신호, DAPI 염색된 핵, 사이토케라틴-FITC 반응성, 및 마지막으로 사이토케라틴-FITC 및 DAPI 염색의 오버레이를 나타낸다. 세포는 핵을 가져야 하고, 사이토케라틴을 발현해야 하고, 순환 종양 세포(CTC)로서 계수되는 CD45에 대해 음성이어야 한다. CTC는 PSMA 양성 CTC로서 점수화되는 PSMA에 대해 양성 신호를 가져야 한다. 도 7a는 LNCaP 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타낸다. 도 7b는 22Rv1 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타낸다. 도 7c는 PC3 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타낸다. 도 7d는 SKBR3 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타낸다.
도 8. 도 8은 순차적 넘버링을 갖는 SP34의 아미노산 서열을 나타낸다. AbM 정의에서의 CDR은 밑줄 그어져 있다. Ser230이 파파인-절단된 Fab에 존재하는 마지막 HC 잔기이다. 잔기 231-455는 IGHG3_MOUSE(마우스 IgG3, 아이소형(isoform) 2)로부터 유래된다.
도 9. 도 9는 도시된 VL/VH 계면에서 중요 잔기를 갖는 SP34의 가변 도메인을 나타낸다. VL 내의 잔기 38, 48, 및 51(표시됨)은 CDR-H3과 접촉 상태이다.
도 10. 도 10은 VH에 대한 인간 프레임워크 적응화("HFA") 변이체(보이는 순서대로 각각 서열 번호 233 및 184-187) 및 VL에 대한 인간 프레임워크 적응화 변이체(보이는 순서대로 각각 서열 번호 234 및 188-190)를 나타낸다. 넘버링은 순차적이며; AbM 정의에서의 CDR은 밑줄 그어져 있고; SP34와 상이한 잔기는 볼드체로 강조되어 있고; HFA 변이체에서의 복귀 돌연변이는 볼드체이고 밑줄 그어져 있다.
도 11. 도 11은 1차 인간 T 세포에 대한 SP34 HFA 변이체의 결합을 나타낸다.
도 12. 도 12는 사이노몰거스 1차 T 세포에 대한 SP34 HFA 변이체의 결합을 나타낸다.
도 13. 도 13은 SP34 HFA 변이체가 1차 인간 T 세포를 시험관내(in vitro)에서 활성화함을 나타낸다. 음성 대조군은 백색으로 나타나 있고 양성 대조군은 흑색으로 나타나 있다.
도 14. 도 14는 SP34 HFA 변이체가 1차 사이노몰거스 T 세포를 시험관내에서 활성화함을 나타낸다. 음성 대조군은 백색으로 나타나 있고 양성 대조군은 흑색으로 나타나 있다.
도 15. 도 15는 SP34 HFA 변이체에 의한 결합과 활성화의 상관관계를 나타낸다. 인간(도 15의 a) 및 사이노몰거스(도 15의 b)에 대한 평균 결합 및 CD69 평균 형광 세기("MFI") 값이 서로에 대해 도표로 나타나 있다.
도 16. 도 16은 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 작제물의 설계를 나타낸다.
도 17. 도 17은 PSMA + LNCAP 세포 상에서의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자에 대한 T-세포 매개 세포독성 검정의 결과를 나타낸다.
도 18. 도 18은 PBMC 인간화 NSG 마우스에서 B219xCW6 Mabtyrin으로 처리된 HEK293-PSMA 이종이식편의 종양원성의 예방을 나타낸다. HEK293-PSMA 세포를 보유하는 PBMC 인간화 마우스에 0.004 mg/㎏, 0.04 mg/㎏ 및 0.4 mg/㎏의 B219xCW6을 iv 투여하였다(투여는 화살표로 나타냄). Sc 종양을 주 2회 측정하였으며, 결과는 각각의 군의 ㎣ ± 평균 표준 오차(SEM)로 표현된 평균 종양 부피로서 제시되어 있다.
도 19. 도 19는 B219xCW6 Mabtyrin으로 처리된 HEK293-PSMA 이종이식편을 보유하는 PBMC-인간화 NSG 마우스의 체중을 나타낸다. HEK293-PSMA 세포를 보유하는 PBMC 인간화 NSG 마우스에 0.004 mg/㎏, 0.04 mg/㎏ 및 0.4 mg/㎏의 B219xCW6을 iv 투여하였다(투여는 화살표로 나타냄). 체중은 g ± 평균 표준 오차(SEC)로 표현된 군 평균으로서 제시되어 있다.
정의
상세한 설명의 태양과 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등을 지칭할 때 용어 "약"은 지정된 값으로부터 최대 ±10%의 변동을 포함함을 의미하는데, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 근사치로, 이는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변동될 수 있다. 적어도, 그리고 청구범위의 범주와 동등한 원칙의 응용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 개수를 고려하여 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범주를 나타내는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 기재된 수치들은 가능한 한 정확하게 기록하였다. 그러나, 임의의 수치는 그들 각자의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 유래하는 소정의 오차를 본질적으로 포함한다.
"단리된"은 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이, 그러한 성분이 천연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들, 즉 다른 염색체 또는 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 따로 생성되거나, 또는 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이 실질적으로 없는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편을 지칭하고자 한다.
"폴리뉴클레오티드" - 동의어로 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 지칭됨 - 는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하거나 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하는 혼성(hybrid) 분자를 포함한다. 게다가, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상이 아닌 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 이에 따라, "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 쇄를 또한 포함한다.
"실질적으로 동일한"이라는 의미는 그 용어가 사용되는 문맥에 따라 상이할 수 있다. 중쇄 및 경쇄, 그리고 그들을 인코딩하는 유전자 중에서 존재할 가능성이 높은 천연 서열 변이로 인해, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 아미노산 서열 또는 유전자 내에는 약간의 수준의 변이가 발견될 것으로 예측될 것인데, 이때 이러한 변이는 그들의 고유 결합 특성(예를 들어, 특이성 및 친화도)에 대해 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 그러한 예측은 유전자 코드의 축퇴성뿐만 아니라, 보존적 아미노산 서열 변이의 진화적 성공에도 부분적으로 기인되는데, 이때 이는 인코딩된 단백질의 성질을 크게 변경시키지 않는다. 따라서, 핵산 서열과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 65% 동일성을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 70% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 91% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 93% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 94% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 96% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 그리고 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성을 지칭한다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 × 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 기능에 대해 실질적인 영향을 주지 않고서 단백질의 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있는 변이의 정도는 핵산 서열의 변이의 정도보다 훨씬 더 낮은데, 동일한 축퇴성 원리가 아미노산 서열에는 적용되지 않기 때문이다. 따라서, 항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 기재된 항체 또는 항원-결합 단편과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다.
"벡터"는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드, 또는 바이러스이며, 이것 내에 다른 핵산 절편이 작동가능하게 삽입되어 절편의 복제 또는 발현을 일으키도록 할 수 있다.
"클론"은 단세포 또는 공통된 조상으로부터 유사분열에 의해 유래된 세포들의 집단이다. "세포주"는 많은 세대 동안 시험관내에서 안정한 성장이 가능한 1차 세포의 클론이다. 본 명세서에 제공된 일부 예에서는, 세포를 DNA로 형질감염시킴으로써 세포가 형질전환된다.
용어 "발현하다" 및 "생성하다"는 본 명세서에서 동의어로 사용되고, 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이들 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이들 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA의 번역을 포함하고, 모든 천연 발생 전사 후 및 번역 후 변형을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현 또는 생성은 세포의 세포질 내에서 행해지거나, 또는 세포외 환경, 예컨대 세포 배양의 성장 배지 내로 행해질 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 손상, 병리 또는 상태의 약화 또는 개선의 임의의 성공 또는 성공 징후를 지칭하는 것으로, 이에는 증상의 감퇴, 관해, 감소와 같은, 또는 상태를 환자가 더 참을 수 있게 하거나, 퇴화 또는 저하 속도를 늦추거나, 퇴화의 최종점을 덜 쇠약하게 하거나, 대상체의 신체적 또는 정신적 웰빙(well-being)을 개선하거나, 생존 기간을 연장시키는, 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터가 포함된다. 치료는 신체 검사, 신경학적 검사, 또는 정신 감정의 결과를 포함한 객관적 또는 주관적 파라미터에 의해 평가될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료적 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 항체가 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 또한, 치료적 유효량은 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 효과 또는 유해 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다.
"항체"는, 달리 명시되지 않는 한, 다양한 단량체 형태, 중합체 형태 및 키메라 형태를 포함한 면역글로불린의 모든 동종형(IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, 및 IgY)을 지칭한다. 구체적으로, 용어 "항체"에는 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb), 및 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다.
항원-결합 단편은 특정 항원에 대해 결합 친화성을 나타낼 수 있는 임의의 단백질성 구조(proteinaceous structure)이다. 항원-결합 단편은 임의의 알려진 기법, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성, 및 재조합 기법에 의해 제공된 것들을 포함한다. 일부 항원-결합 단편은 모 항체 분자의 항원-결합 특이성을 보유하는 온전한 항체의 일부분으로 구성된다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 특정 항원에 결합하는 것으로 알려진 항체의 적어도 하나의 가변 영역(중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 적합한 항원-결합 단편의 예에는, 제한 없이, 다이아바디(diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라, Fab, F(ab')2, Fc, Fabc, 및 Fv 분자, 단일쇄(Sc) 항체, 개별 항체 경쇄, 개별 항체 중쇄, 항체 쇄 또는 CDR과 다른 단백질, 단백질 스캐폴드 사이의 키메라 융합, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 이량체, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 국제 특허 출원 공개 WO2007059782호에 기재된 바와 같은 1가 항체, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)]) - 이는 VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 도메인 항체로도 불림(문헌[Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90]); 카멜리드(camelid) 또는 나노바디(nanobody)(문헌[Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24]); 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 등도 포함한다. 모든 항체 동종형이 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 항원-결합 단편은 주어진 관심 항원에 대해 친화성을 부여하는 배향으로 폴리펩티드 절편을 성공적으로 도입시킬 수 있는 비항체 단백질성 프레임워크, 예컨대 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합적으로 생성되거나 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 어구 "항체 또는 그의 항원-결합 단편"은 주어진 항원-결합 단편이 이 어구에 언급된 항체의 하나 이상의 아미노산 절편을 포함함을 나타내기 위해 사용될 수 있다.둘 이상의 항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "~와 경쟁한다" 또는 "~와 교차-경쟁한다"는 둘 이상의 항체 또는 항원-결합 단편이 결합을 위하여 경쟁함을 나타낸다. 항체 또는 항원-결합 단편의 일부 쌍의 경우, 실시예의 검정에서의 경쟁 또는 차단이 하나의 항체가 플레이트 상에 코팅되고 다른 하나가 경쟁하기 위해 사용되는 경우에만 단지 관찰되고, 역으로는 성립되지 않는다. 문맥에 의해 달리 정의되거나 부인되지 않는 한, 본 명세서에서 사용될 때 용어 "~와 경쟁한다" 또는 "~와 교차-경쟁한다"는 또한 그러한 쌍의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하고자 한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 갖는다. 입체형태 및 비입체형태 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되나 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되거나 덮이는 아미노산 잔기(다시 말하면, 이러한 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있음)를 포함할 수 있다.
항체 또는 항체 단편과 관련하여 사용될 때, "면역특이적 결합" 또는 그의 파생어는, 혼합된 분자 집단을 함유하는 샘플 중의 다른 분자에 우선적으로 결합하지 않고서, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 인코딩된 도메인을 통한 관심 단백질의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정될 때 약 1×10-8 M 미만의 Kd로 동종 항원에 결합한다. "[항원]-특이적" 항체(예를 들어, CD3-특이적 항체)와 같은 어구는 언급된 항체가 언급된 항원에 특이적으로 결합함을 나타내고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피브로넥틴 III형(FN3) 도메인"(FN3 도메인)은 피브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토카인 수용체 및 원핵생물성 효소를 포함하는 단백질에서 자주 나타나는 도메인을 지칭한다(문헌[Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89: 8990-8994, 1992]; 문헌[Meinke et al., J Bacteriol 175, 1910-1918, 1993]; 문헌[Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990]). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 피브로넥틴(FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 및 예를 들어 미국 특허 제8,278,419호에 기재된 바와 같은 비천연 합성 FN3 도메인이다. 개별적인 FN3 도메인은 도메인 번호 및 단백질 명칭(예를 들어, 테나신의 제3 FN3 도메인(TN3), 또는 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10))에 의해 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "센티린(Centyrin)"은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인들의 공통 서열(consensus sequence)에 기초한 FN3 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이화하는" 또는 "돌연변이화된"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변이체를 생성시키기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실, 또는 삽입하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "무작위화하는" 또는" 무작위화된" 또는 "다양화된(diversified)" 또는 "다양화하는"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내에 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 실행하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변이체"는 하나 이상의 변형(modification), 예를 들어 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 본 발명의 FN3 도메인이 일정 해리 상수(KD)로 사전결정된 항원에 결합하는 능력을 지칭하는데, 이때 해리 상수는 약 1×10-6 M 이하, 예를 들어 약 1×10-7 M 이하, 약 1×10-8 M 이하, 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 약 1×10-12 M 이하, 또는 약 1×10-13 M 이하이다. 전형적으로, 본 발명의 FN3 도메인은, 예를 들어 Proteon 기기(BioRad)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정할 때 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카세인)에 대한 그의 KD보다 적어도 10배 더 적은 KD로 사전결정된 항원(즉, 인간 PSMA)에 결합한다. 그러나, 인간 PSMA에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 FN3 도메인은 다른 관련 항원들과의, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 마카카 파스키쿨라리스(사이노몰거스 원숭이, 사이노) 또는 판 트로글로디테스(침팬지)로부터의 동일한 사전결정된 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있다.
용어 "라이브러리"는 변이체들의 수집을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변이체들로 구성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은 분자가 그의 정상적인 기능적 활성들 중 적어도 하나, 예를 들어 인간 PSMA와 같은 사전결정된 항원에 결합하는 활성을 유지하도록, 생리학적 조건 하에서 접힌 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 인간 PSMA는 짧은 세포내 도메인(잔기 1-18), 막관통 도메인(잔기 19-43) 및 세포외 도메인(잔기 44-750)을 갖는 약 100 kD의 잘 알려진 II형 당단백질을 지칭한다. 성숙 인간 PSMA의 아미노산 서열은 서열 번호 144에 나타나 있다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, "과발현", "과발현된" 및 "과발현하는"은 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 표면 상에 측정가능할 정도로 더 높은 수준의 PSMA를 갖는 암 또는 악성 세포를 지칭한다. 그러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. PSMA 과발현은 잘 알려진 검정, 예를 들어 살아 있거나 또는 용해된 세포에 대해 ELISA, 면역형광, 유세포측정 또는 방사면역검정을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PSMA 핵산 분자의 수준이, 예를 들어 형광 계내 혼성화(in situ hybridization), 서던 블롯팅(Southern blotting), 또는 PCR 기법을 사용하여 세포에서 측정될 수 있다. 세포의 표면 상에서의 PSMA의 수준이 정상 세포와 비교할 때 적어도 1.5배 초과인 경우, PSMA는 과발현된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "텐콘"은, 서열 번호 1에 나타내고 미국 특허 출원 공개 제2010/0216708호에 기재된 서열을 갖는 합성 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암 세포" 또는 "종양 세포"는 생체내(in vivo)에서의, 생체외(ex vivo)에서의, 그리고 조직 배양물에서의 암성, 전-암성(pre-cancerous) 또는 형질전환된 세포를 지칭하며, 이러한 세포는 자발적 또는 유도된 표현형 변화를 갖는데, 이러한 변화는 반드시 새로운 유전 물질의 흡수를 수반하지는 않는다. 형질전환이 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 도입, 또는 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있기는 하지만, 이는 또한 자발적으로 또는 발암물질에 대한 노출 후에 일어날 수 있으며, 그럼으로써 내인성 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 시험관내에서, 생체내에서, 그리고 생체외에서 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주에서 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 비정상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성종양, 종양 특이적 마커 수준, 침습성, 종양 성장 또는 억제에 의해 예시된다(문헌[Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)]).
(예를 들어, 세포, 예컨대 종양 세포와 관련하여) "성장을 억제한다"는, 치료제 또는 치료제들 또는 약물의 병용물과 접촉될 때 시험관내 또는 생체내 세포 성장에 있어서, 당업자에게 잘 알려진 적절한 제어 조건에서 성장된 동일한 세포의 성장과 대비할 때, 측정가능한 감소를 지칭한다. 시험관내 또는 생체내 세포 성장의 억제는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 세포 성장의 억제는 다양한 기전에 의해, 예를 들어 아폽토시스(apoptosis), 괴사에 의해, 또는 세포 증식의 억제, 또는 세포 용해에 의해 일어날 수 있다.
용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있는 또는 그러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예에는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템이 포함될 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합가(valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 수의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "와 병용하여"는 둘 이상의 치료제가 대상체에게 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 또는 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
"상승효과", "상승작용" 또는 "상승적"은 병용물의 예측된 부가적 효과보다 더 높은 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "kd"(sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값으로 지칭되기도 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ka"(M-1 sec-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KA"(M-1)는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, ka를 kd로 나눔으로써 얻어진다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 지칭하며, 비인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다. 기재된 방법의 많은 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된, 유사한 유체, 세포, 또는 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함)의 수집물뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 유체, 세포, 또는 조직도 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 생물학적 유체이다. 생물학적 유체는 전형적으로 생리학적 온도의 액체이고, 대상체 또는 생물학적 공급원에 존재하거나, 그로부터 적출되거나, 발현되거나 달리 추출되는 천연 발생 유체를 포함할 수 있다. 소정의 생물학적 유체는 특정 조직, 기관 또는 국부 영역으로부터 유래되고, 소정의 다른 생물학적 유체는 대상체 또는 생물학적 공급원 내에 더 전체적으로 또는 전신적으로 위치될 수 있다. 생물학적 유체의 예에는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 타액, 낭액(cystic fluid), 눈물, 대변, 가래, 분비성 조직 및 기관의 점막 분비물, 질 분비물, 복수, 예컨대 비고형 종양과 관련된 것들, 흉막, 심막, 복막, 복부 및 기타 체강의 유체, 기관지 세척액에 의해 수집된 유체 등이 포함된다. 생물학적 유체는 또한 대상체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액, 예를 들어, 세포 및 기관 배양 배지 - 세포 또는 기관 컨디셔닝된 배지를 포함함 -, 세척액 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 적출된 물질 또는 대상체에 존재하는 물질을 포함한다.
용어 "CD3"은 인간 CD3 단백질 다중-하위단위(multi-subunit) 복합체를 지칭한다. CD3 단백질 다중-하위단위 복합체는 6개의 독특한 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 이들은 CD3γ 쇄(SwissProt P09693), CD3δ 쇄(SwissProt P04234), 2개의 CD3ε 쇄(SwissProt P07766), 및 하나의 CD3ζ 쇄 동종이량체(SwissProt 20963) - 그리고 이는 T 세포 수용체 α 및 β 쇄와 관련됨 - 를 포함한다. 용어 "CD3"은, 달리 기재되지 않는 한, 임의의 CD3 변이체, 아이소형 및 종 상동체를 포함하는데, 이는 세포(T 세포를 포함함)에 의해 천연 발현되거나 또는 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 또는 cDNA로 형질감염된 세포 상에서 발현될 수 있다.
"CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편"은 FN3 도메인; 경쇄(LC); 및 중쇄(HC)를 포함하는 다중특이성 분자, 선택적으로 CD3 × PSMA-이중특이성 항원 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이며,
FN3 도메인은 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)과 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하고, HC와 LC가 쌍을 이루어서 CD3과 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성한다.
CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 2개의 상이한 항원-결합 영역을 포함하는데, 이들 중 하나는 항원 PMSA에 특이적으로 결합하고, 이들 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합한다. 다중특이성 항체는 이중특이성 항체, 다이아바디, 또는 유사한 분자일 수 있다(예를 들어, 다이아바디에 대한 설명을 위해 문헌[PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)]을 참조한다).
"참조 샘플"은 다른 샘플, 예컨대 시험 샘플과 대비될 수 있는 샘플인데, 이러한 대비는 비교된 샘플의 특성화를 가능하게 한다. 참조 샘플은 시험 샘플과의 비교를 위한 기초로서의 역할을 하는 일부 특성화된 특성을 가질 것이다. 예를 들어, 참조 샘플은 암을 갖는 대상체를 나타내는 PSMA 수준에 대한 벤치마크로서 사용될 수 있다. 참조 샘플은 반드시 시험 샘플과 동시에 분석되어야 하는 것은 아니며, 이에 따라 일부 경우에, 참조 샘플은 주어진 조건을 특성화하도록 미리 결정된 수치값 또는 수치 범위, 예컨대 대상체에서 암을 나타내는 PSMA 수준일 수 있다. 이 용어는 또한 생리학적 상태 또는 질병 상태, 예컨대 PSMA-발현 암과 관련된 것으로 알려져 있지만 미지량의 PSMA를 갖는, 비교 목적으로 사용되는 샘플을 포함한다.
PSMA-발현 암의 진행과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "진행"은 덜 심각한 상태로부터 더 심각한 상태로의 암의 변화를 포함한다. 이는 종양의 수 또는 중증도, 전이 정도, 암이 성장하거나 퍼지는 속도 등의 증가를 포함할 수 있다. 예를 들어, "결장암의 진행"은 덜 심각한 상태로부터 더 심각한 상태로의 그러한 암의 진행, 예컨대 I 기로부터 II 기로의 진행, II 기로부터 III 기로의 진행 등을 포함한다.
PSMA-발현 암의 퇴행과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "퇴행"은 더 심각한 상태로부터 덜 심각한 상태로의 암의 변화를 포함한다. 이는 종양의 수 또는 중증도, 전이 정도, 암이 성장하거나 퍼지는 속도 등의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, "결장암의 퇴행"은 더 심각한 상태로부터 덜 심각한 상태로의 그러한 암의 퇴행, 예컨대 III 기로부터 II 기로의 진행, II 기로부터 I 기로의 진행 등을 포함한다.
안정된 PSMA-발현 암과 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "안정된"은 진행성 암 또는 퇴행성 암인 것으로 간주되기까지 임상적으로 관련된 기간에 걸쳐 충분히 상당히 변화되지 않거나 변화되어 오지 않은 질병 상태를 기재하고자 한다.
본 명세서에 기재된 실시 형태는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 이들은 물론 다양할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 또는 그의 유도체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 동종형이다. 항체가 IgG1 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 L234A, L235A, 및 K409R 치환(들)을 함유한다. 항체가 IgG4 동종형을 갖는 일부 실시 형태에서, 항체는 그의 Fc 영역 내에 S228P, L234A, 및 L235A 치환을 함유한다.
재조합 항원-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 폴리뉴클레오티드(및 이것이 인코딩하는 펩티드)는 리더(leader) 서열을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 리더 서열은 제한 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
PSMA 결합 분자
본 발명의 FN3 도메인은, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 또는 키넥사 방법(Kinexa method)에 의해 결정될 때, 약 1×10-7 M 미만, 예를 들어 약 1×10-8 M 미만, 약 1×10-9 M 미만, 약 1×10-10 M 미만, 약 1×10-11 M 미만, 약 1×10-12 M 미만, 또는 약 1×10-13 M 미만의 해리 상수(KD)로 인간, 마카카 파스키쿨라리스 및/또는 판 트로글로디테스 PSMA와 결합할 수 있다. 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, FN3 도메인은 인간 PSMA와 특이적으로 결합하며, FN3 도메인은 인간 PSMA 효소 활성을 억제한다. PSMA 효소 활성은 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, PSMA의 검출가능하거나 표지화된 PSMA 기질의 가수분해가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 PSMA 기질은 N-아세틸 아스파르틸 글루타메이트(NAAG), 폴레이트 폴리글루타메이트, 메토트렉세이트 트라이-감마 글루타메이트, 메토트렉세이트 다이-감마 글루타메이트, 프테로일펜타글루타메이트 및 이들의 유도체이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 적어도 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열 번호 1의 잔기 위치 6, 11, 22, 25, 26, 52, 53, 61에 상응하는 적어도 하나의 잔기 위치에서, 또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 실시 형태에서, FN3 도메인은 인간 PSMA에 결합하기 위하여 서열 번호 41의 FN3 도메인과 특이적으로 경쟁한다.
일부 실시 형태에서, FN3 도메인은 인간 PSMA의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 및 NWETNKF(서열 번호 160)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 인간 PSMA 에피토프는 서열 번호 159 또는 서열 번호 160에 나타낸 아미노산 서열 내의 잔기들 중 일부 또는 모두를 포함한다. 본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 에피토프는 인간 PSMA(서열 번호 144)의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 및 NWETNKF(서열 번호 160) 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 에피토프는 인간 PSMA(서열 번호 144)의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 내의 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 및 영역 NWETNKF(서열 번호 160) 내의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인은 잔기 K499, K500, S501, P502, P504, R511, K514, N540, W541, E542, N544, K545 및 F546(잔기 넘버링은 서열 번호 144에 따름)에서 인간 PSMA와 결합한다.
본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인은 잔기 R181, Y460, F488, K610 및/또는 I614에서 인간 PSMA와 추가로 결합한다.
FN3 도메인 P233FR9_H10의 결정 구조는 사이노PSMA와 복합체를 형성한 상태에서 해석하였다. 인간 PSMA와 사이노 PSMA 사이의 접촉 잔기들은 하나의 잔기를 제외하고는 동일하기 때문에, P233FR9_H10은 동일한 에피토프 잔기들에서 사이노 PSMA와 결합하기보다는 인간 PSMA와 결합할 것으로 예상된다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 바와 같이, CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 투여를 위한 대상체는 PSMA 과발현을 특징으로 하는 특정 장애의 발생에 대해 고위험에 있는 환자뿐만 아니라 기존에 그러한 장애를 갖는 환자를 포함한다. 전형적으로, 대상체는 치료가 모색되고 있는 장애를 갖는 것으로 진단받아 왔다. 또한, 대상체는 장애의 임의의 변화에 대하여(예를 들어, 장애의 임상 증상의 증가 또는 감소에 대하여) 치료 과정 동안 모니터링될 수 있다.
예방적 응용에서는, 약제학적 조성물 또는 의약품이 특정 장애에 취약하거나 달리 위험에 있는 환자에게 장애의 위험을 제거하거나 감소시키기에 또는 그의 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 응용에서는, 조성물 또는 의약품이 그러한 장애가 의심되거나 그러한 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 장애 및 그의 합병증의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이것을 달성하기에 적절한 양은 치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량으로 지칭된다. 예방적 및 치료적 계획(regime) 둘 모두에서는, 작용제가 충분한 반응(예를 들어, 부적절한 혈관생성 활성의 억제)이 달성될 때까지 수회 투여량으로 통상 투여된다. 전형적으로, 반응은 모니터링되고, 원하는 반응이 감쇠(fade)되기 시작한다면 반복된 투여량이 제공된다.
본 발명의 방법에 따른 치료의 대상 환자를 확인하기 위하여, 허용된 스크리닝 방법이 특정 장애와 관련된 위험 인자를 결정하는 데 또는 대상체에서 확인된 기존 장애의 상태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 개체가 특정 장애를 갖는 것으로 진단받아 온 친족들을 갖는지의 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 또한, 예를 들어, 유전성 구성요소(heritable component)를 갖는 것으로 알려진 특정 장애에 대하여 가족성 상태(familial status)를 결정하기 위하여 종래의 워크업(work-up)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 암이 또한 소정의 유전성 구성요소를 갖는 것으로 알려져 있다. 암의 유전성 구성요소는, 예를 들어 형질전환을 나타내는 다수의 유전자(예를 들어, Ras, Raf, EGFR, cMet, 및 기타)에서의 돌연변이, 소정의 HLA 및 살해 억제 수용체(killer inhibitory receptor)(KIR) 분자의 존재 또는 부재, 또는 암 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 NK 세포 및 T 세포와 같은 세포의 면역 억제를 조절할 수 있는 기전을 포함한다(예를 들어, 문헌[Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007]; 문헌[Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007] 참조). 이 목적을 위하여, 뉴클레오티드 프로브가 관심 있는 특정 장애와 관련된 유전자적 마커를 갖는 개체를 확인하는 데 일상적으로 사용될 수 있다. 게다가, 특정 장애에 대한 마커를 확인하는 데 유용한 매우 다양한 면역학적 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 단일클론 항체 프로브를 사용하여 특정 종양과 관련된 항원을 검출하는 다양한 ELISA 면역검정 방법이 이용가능하고 당업계에 잘 알려져 있다. 스크리닝은 알려진 환자 증상, 연령 인자, 관련 위험 인자 등에 의해 나타나는 바와 같이 구현될 수 있다. 이들 방법은 임상의가 치료를 위하여 본 명세서에 기재된 방법을 필요로 하는 환자를 일상적으로 선택할 수 있게 한다. 이들 방법에 따르면, 병리학적 PSMA-발현 세포의 표적화가 독립적인 치료 프로그램으로서 또는 다른 치료에 대한 추적(follow-up), 보조적, 또는 협동적 치료 계획으로서 구현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 방법에서, 본 발명의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 제2 치료제와 병용하여 전립선암을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 방법에서, CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 제2 치료제에 의한 치료에 대해 저항성을 나타내거나 저항성을 획득한 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
제2 치료제는 전립선암의 치료에 대한 승인된 약물, 예컨대 아비라테론 아세테이트(Abiraterone Acetate)(자이티가(Zytiga)), 바이칼루타미드(Bicalutamide), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 카소덱스(Casodex)(바이칼루타미드), 데가렐릭스(Degarelix), 도세탁셀(Docetaxel), 엔잘루타미드(Enzalutamide), 고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate), 제브타나(Jevtana)(카바지탁셀), 류프롤라이드 아세테이트(Leuprolide Acetate), 루프론(Lupron)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포(Lupron Depot)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-3개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-4개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-페드(Ped)(류프롤라이드 아세테이트), 미톡산트론 하이드로클로라이드(Mitoxantrone Hydrochloride), 프레드니손(Prednisone), 프로벤지(Provenge)(시풀류셀(Sipuleucel)-T), 라듐 223 다이클로라이드, 시풀류셀-T, 탁소테레(Taxotere)(도세탁셀), 비아두르(Viadur)(류프롤라이드 아세테이트), 조피고(Xofigo)(라듐 223 다이클로라이드), 엑스탄디(Xtandi)(엔잘루타미드) 또는 졸라덱스(Zoladex)(고세렐린 아세테이트)일 수 있다(출처: 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)).
대상체는 치료에 대해 저항성을 나타내거나, 저항성이 발생되었거나, 또는 저항성 발생에 취약한지를 결정하기 위해 다양한 정성적 및/또는 정량적 방법이 사용될 수 있다. 저항성과 관련될 수 있는 증상은, 예를 들어 환자의 웰빙(well-being)의 감소 또는 정체, 종양 크기의 증가, 종양 성장의 정지성 또는 지연성 감소, 및/또는 체내에서 한 위치로부터 다른 기관, 조직 또는 세포로의 암성 세포의 확산을 포함한다. 암과 관련된 다양한 증상의 재확립 또는 악화는 또한, 대상체가 치료에 대해 저항성이 발생되었거나 또는 저항성 발생에 취약하다는 것을 나타낼 수 있으며, 예컨대 식욕부진, 인지 기능이상, 우울증, 호흡곤란, 피로, 호르몬 교란, 호중구감소증, 통증, 말초 신경병증, 및 성기능이상이다. 암과 관련된 증상은 암의 유형에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 전립선암과 관련된 증상은 소변이 시원찮거나 잦은 소변 욕구, 통증성 배뇨, 소변 또는 정액 중 혈액, 골반, 허리 및/또는 엉덩이에서의 계속되는 통증을 포함할 수 있다. 폐암과 관련된 증상은 지속적인 기침, 객혈, 숨참, 천명, 흉통, 식욕 상실, 시도 없이도 체중 감량, 및 피로를 포함할 수 있다. 종양학에서 숙련된 자는 특정 암 유형과 관련된 증상을 용이하게 확인할 수 있다.
투여/약제학적 조성물
본 발명은 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체의 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 도메인 또는 분자의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 분자의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만, 통상 적어도 약 1 중량%부터 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 이러한 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐; 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 투여로서, 이러한 투여에서는 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태의 제형, 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 담긴 제형; 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편을 함유하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(IV) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 환자에게 투여될 수 있다. IV 주입은 짧게는 15분에 걸쳐서, 그러나 더 흔하게는 30분, 60분, 90분 또는 심지어 2시간 또는 3시간 동안 제공될 수 있다. 본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 또한 질병 부위 내로 직접 주사될 수 있다. 암을 갖는 환자에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하며("치료적 유효량"), 때때로 0.1 내지 10 mg/㎏ 체중, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 클 수 있으며, 예를 들어 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다. 고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적을 기준으로, 예를 들어 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m2일 수 있다. 암을 치료하기 위해 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 10회, 12회, 20회 또는 그 이상의 용량이 제공될 수 있다. 본 발명의 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다.
예를 들어, 정맥내 주입을 위한 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 약제학적 조성물은 80 ㎏의 환자에 대한 투여의 경우 약 200 ml의 멸균 링거액, 및 약 8 mg 내지 약 2400 mg, 약 400 mg 내지 약 1600 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 800 mg의 PSMA 결합 FN3 도메인을 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 방법이 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 저장 동안 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 단회 용량으로 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는, 예를 들어 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월 또는 3개월 후에 투여가 반복될 수 있다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 그 이상 반복될 수 있다.
본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 전술된 바와 같은 제2 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 별개로 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은, 선택적으로 제2 치료제와 병용하여, 외부 빔 방사, 세기 조절 방사선 요법(intensity modulated radiation therapy)(IMRT) 및 임의의 형태의 방사선 수술 - 감마 나이프(Gamma Knife), 사이버나이프(Cyberknife), 리낙(Linac), 및 조직내 방사(interstitial radiation)(예를 들어, 이식된 방사성 시드, 글리아사이트 벌룬(GliaSite balloon))를 포함함 - 을 포함하는 임의의 형태의 방사선 요법과 함께 그리고/또는 수술과 함께 투여될 수 있다.
고형 종양의 치료에 특히 관련하여, 종점 및 항종양 활성을 평가하기 위한 프로토콜이 당업계에 잘 알려져 있다. 각각의 프로토콜은 종양 반응 평가들을 상이하게 규정할 수 있지만, RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response evaluation Criteria in solid tumors)) 기준이 현재 미국 국립 암 연구소에 의한 종양 반응의 평가를 위한 권장된 가이드라인인 것으로 여겨진다(문헌[Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000] 참조). RECIST 기준에 따르면, 종양 반응은 모든 측정가능한 병변 또는 전이의 감소 또는 제거를 의미한다. 질병은, 종래의 기법을 사용하여 그것의 적어도 하나의 치수가 20 mm 이상이거나 나선 CT 스캔을 사용하여 10 mm 이상인 것으로 정확하게 측정될 수 있으면서, 의학적 사진 또는 X-선, 컴퓨터 축 단층촬영(CT), 자기 공명 이미징(MRI), 또는 임상 조사(병변이 표재성인 경우)에 의한 명확하게 규정된 주변부를 갖는 병변을 포함하는 경우, 측정가능한 것으로 대체로 여겨진다. 측정 불가능한 질병은, 질병이 종래의 기법으로 20 mm 미만의 또는 나선 CT 스캔으로 10 mm 미만의 병변, 및 (너무 작아서 정확하게 측정할 수 없는) 진정으로 측정 불가능한 병변을 포함함을 의미한다. 측정 불가능한 질병은 흉막 삼출물, 복수, 및 간접 증거에 의해 문서에 기재된 질병을 포함한다.
객관적인 상태에 대한 기준은 고형 종양 반응을 평가하기 위한 프로토콜을 필요로 한다. 대표적인 기준은 하기를 포함한다: (1) 모든 측정가능한 질병의 완전한 소멸; 새로운 병변이 없음; 질병 관련 증상이 없음; 측정 불가능한 질병에 대한 증거가 없음으로 규정된 완전 반응(CR); (2) 표적 병변들의 최장 직경의 합에 있어서의 30% 감소로 규정된 부분 반응(PR); (3) 표적 병변들의 최장 직경의 합에 있어서의 20% 증가 또는 임의의 새로운 병변의 출현으로 규정된 진행성 질병(PD); (4) CR, PR, 또는 진행성 질병이 아닌 것으로 규정된 안정된 반응 또는 무반응(상기 문헌[Therasse et al.] 참조).
종양학 기술 내에서 받아들여져 있는 추가의 종점은 전체 생존율(OS), 무질병 생존율(DFS), 객관적 반응 속도(ORR), 진행까지의 시간(TTP), 및 무진행 생존율(PFS)을 포함한다(문헌[Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, Md.] 참조).
약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 단회 또는 다회 용량을 위한 주사용 용액의 형태로, 또는 주사 전에 재구성될 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 그러한 키트는 약제학적 조성물의 투여를 위한 건조-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 네뷸라이저를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 약제학적 조성물에 대한 지시사항 및 용법에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 융합 단백질의 발현은 강력한 구성적 프로모터, 예컨대 하기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓여 있다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 기타. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)(EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다.
본 명세서에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커, 예를 들어 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자), 글루타메이트 신타제 유전자, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK, HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸푸린 선택을 위한 세균성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
본 명세서에 기재된 벡터는 다양한 세포를 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 유전자로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 융합 단백질-생성 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양은 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 기재되고 예시된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 특징으로 한다.
세포 내로의 외래 유전자의 도입을 위한 다수의 기법이 당업계에 알려져 있고, 본 명세서에 기재되고 예시된 다양한 실시 형태에 따라, 기재된 방법을 수행하려는 목적을 위하여 재조합 세포를 작제하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 기법은 숙주 세포로의 이종 유전자 서열의 안정한 전달을 제공하여, 이종 유전자 서열이 세포의 자손에 의해 상속가능하고 발현가능하도록, 그리고 수령 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 파괴되지 않도록 해야 한다. 사용될 수 있는 기법은 염색체 전달(예를 들어, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로 세포 매개 유전자 전달), 물리적 방법(예를 들어, 형질감염, 스페로플라스트 융합, 현미주사(microinjection), 전기천공, 리포솜 담체), 바이러스성 벡터 전달(예를 들어, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스) 등(문헌[Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)]에 기재됨)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 인산칼슘 침전 및 세균 프로토플라스트(bacterial protoplast)와 포유류 세포의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-유도 융합이 또한 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 융합 단백질의 발현에 사용하기에 적합한 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더 바람직하게는 식물, 설치류, 또는 인간 기원의 세포, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 특히 NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 세포, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L 세포, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 골수종 세포, 및 BHK 세포주이다. 게다가, 항체의 발현은 하이브리도마 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 하이브리도마를 생성하기 위한 방법이 당업계에 잘 확립되어 있다.
본 명세서에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합-양성 세포는 원하는 표현형, 예컨대 고수준 발현, 향상된 성장 특성, 또는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해 원하는 생화학적 특성을 갖는 단백질을 산출하는 능력을 나타내는 하위클론을 위해 증폭 및 스크리닝된다. 이들 표현형은 주어진 하위클론의 고유 특성에 기인하거나 돌연변이에 기인할 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 불일치 수복의 억제, 또는 그러한 방법들의 조합의 사용을 통해 달성될 수 있다.
다중특이성의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
바람직한 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이 표 21에 제공되어 있다.
상이한 포맷의 이중특이성 항체들이 기재되어 왔고, 최근에는 문헌[Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276]에 의해 검토되었다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 다이아바디, 크로스-바디(cross-body), 또는 본 발명에 기재된 것들로서의 제어된 Fab 아암 교환을 통해 획득된 이중특이성 항체이다.
일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체는, 이종이량체화를 강제로 일으키는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자 - 여기서는, 분자의 2개의 측 각각이 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유함 -; IgG 융합 분자 - 여기서는, 전장(full length) IgG 항체가 추가 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합됨 -; Fc 융합 분자 - 여기서는, 단일쇄 Fv 분자 또는 안정화된 다이아바디가 중쇄 불변-도메인, Fc-영역 또는 이들의 일부에 융합됨 -; Fab 융합 분자 - 여기서는, 상이한 Fab-단편들이 함께 융합됨 -; ScFv- 및 다이아바디-기반 및 중쇄 항체(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디) - 여기서는, 상이한 단일쇄 Fv 분자들 또는 상이한 다이아바디 또는 상이한 중쇄 항체들(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디)이 서로 또는 다른 단백질 또는 담체 분자에 융합됨 - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상보적 CH3 도메인 분자를 갖는 IgG-유사 분자는 Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), 놉-인투-홀(Knob-into-Hole) (Genentech), CrossMAb (Roche) 및 정전기적으로 일치된 항체(electrostatically-matched) (Amgen), LUZ-Y (Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) 및 DuoBody (Genmab A/S)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자는 이중 표적화(Dual Targeting)(DT)-Ig (GSK/Domantis), 투-인-원 항체(Two-in-one Antibody) (Genentech), 가교결합된(Cross-linked) Mab (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) 및 CovX-바디 (CovX/Pfizer)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, IgG 융합 분자는 이중 가변 도메인(Dual Variable Domain)(DVD)-Ig (Abbott), IgG-유사 이중특이성 항체(IgG-like Bispecific (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) 및 BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) 및 TvAb (Roche)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 융합 분자는 ScFv/Fc 융합(Fusion) (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), 이중 친화성 재표적화 기술(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DART) (MacroGenics) 및 이중(Dual)(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fab 융합 이중특이성 항체는 F(ab)2 (Medarex/AMGEN), 이중-작용(Dual-Action) 또는 Bis-Fab (Genentech), 독-앤드-록(Dock-and-Lock)(DNL) (ImmunoMedics), 2가 이중특이성 항체(Bivalent Bispecific) (Biotecnol) 및 Fab-Fv (UCB-Celltech)를 포함한다. ScFv-, 다이아바디-기반 및 도메인 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(Bispecific T Cell Engager)(BITE) (Micromet), 탠덤 다이아바디(Tandem Diabody)(Tandab) (Affimed), 이중 친화성 재표적화 기술(DART) (MacroGenics), 단일쇄 다이아바디(Single-chain Diabody) (Academic), TCR-유사 항체(TCR-like Antibody) (AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합(Human Serum Albumin ScFv Fusion) (Merrimack) 및 COMBODY (Epigen Biotech), 이중 표적화 나노바디(dual targeting nanobody) (Ablynx), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화물-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프, 즉 PSMA 상의 에피토프 및 CD3 상의 에피토프와 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"놉-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호 참조)이 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내의 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 하기와 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
하나의 CH3 표면에서 양으로 하전된 잔기를, 그리고 제2 CH3 표면에서 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 제2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
전술된 방법에 더하여, 본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 W02011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이들 방법에서, 제1 단일특이성 FN3 도메인 및 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 항-CD3 항체)는 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 갖도록 조작되며; 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
또한, PMSA-발현 세포를 사멸하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 방법은 이를 필요로 하는 환자에게, 상기 PMSA에 결합하고 T 세포를 동원하여 상기 PMSA-발현 세포를 사멸할 수 있는(즉, T 세포 방향전환) 다중특이성 항체를 투여함에 의한다. 본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 중 임의의 것이 치료적으로 사용될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편은 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 더 바람직한 실시 형태에서, 상기에 개시되고 본 발명의 다중특이성 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물들 중 하나가 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치료에 사용된다. 일 실시 형태에서, 장애는 암이다.
유사하게, 선택된 세포 집단의 성장을 억제하기 위한 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 본 방법은 PMSA-발현 표적 세포, 또는 그러한 표적 세포를 함유하는 조직을, 단독으로의 또는 다른 세포독성제 또는 치료제와 병용된 본 발명의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다중특이성 항원-결합 분자는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편이다. 선택된 세포 집단의 성장을 억제하기 위한 방법은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 실시될 수 있다.
키트
본 명세서에는 키트가 또한 제공되며, 본 키트는, 예를 들어 기재된 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 특정 세포 유형의 사멸을 위한 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이성의 단리된 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편, 및 더 바람직하게는 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편. 설명서는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 것에 대한 지시사항을 포함할 수 있다.
전형적으로, 키트는 단리된 CD3 × PSMA-다중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 다중특이성 항원-결합 단편이 담긴 구획을 가질 것이다. 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동결건조된 형태, 액체 형태, 또는 키트에 포함되기에 적합한 다른 형태일 수 있다. 키트는 또한 키트 내의 설명서에 기재된 방법을 실시하는 데 필요한 추가 요소들, 예컨대 동결건조된 분말을 재구성하기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하기 위한 추가 작용제, 및 다중특이성 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 데 도움이 되는 도구를 수용할 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 앞서의 개시내용을 보충하기 위해 그리고 본 명세서에 기재된 발명 요지에 대한 더 우수한 이해를 주기 위해 제공된다. 이들 실시예는 기재된 발명 요지를 한정하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 명백할 것이고, 이는 본 발명의 진정한 범주 내에 포함되어야 하고 그로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 이해된다.
시약 및 작제물:
사이노몰거스(사이노 원숭이 단백질 데이터베이스 ref# EHH56646.1, 서열 번호 32) 및 침팬지(Uniprot, Ref#H2Q3K5, 서열 번호 33) PSMA의 세포외 도메인을 6His 및 Avi 태그와 함께 pUnder 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 단백질을 293HEK-expi 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 상층액을 수거하고 원심분리에 의해 청징화하였다. 단백질을 2-단계 정제 공정을 사용하여 정제하였다: 1) HisTrap HP 컬럼에 의한 IMAC 정제 및 2) PSMA 이량체화를 안정화하기 위한 크기 배제 정제(Superdex 200), 여기서는 용리 완충액이 Mg2+, Ca2+, 및 0.5 mM ZnCl2를 함유하는 DPBS임. 관심 단백질을 함유하는 분획들을 풀링하고, 단백질 농도를 A280에 의해 결정하였다.
S. 아우레우스(S. aureus) 소르타제(sortase) A를 인코딩하는 유전자를 DNA2.0에 의해 생성하고, T5 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pJexpress401 벡터(DNA2.0) 내로 하위클로닝하였다. 가용성 발현을 위한 소르타제 작제물은 25개 아미노산으로 이루어진 천연 단백질의 N-말단 도메인이 결여되어 있는데, 이 도메인은 막 관련 도메인이기 때문이다(문헌[Ton-That et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96: 12424-12429, 1999]). 소르타제를 N-말단 His6-태그(HHHHHH, 서열 번호 34)로서 발현시킨 후, 태그 제거를 위한 TEV 프로테아제 부위(ENLYFQS, 서열 번호 54)로서 발현시켜, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 소르타제를 생성하였다. 사용된 소르타제 단백질은 또한 야생형 단백질(서열 번호 53)과 비교할 때 효소의 촉매 효율을 증가시키는 것으로 보고된 5개의 돌연변이 서열을 포함한다(문헌[Chen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11399-11404, 2011]). 플라스미드를 발현을 위하여 E.coli BL21 Gold 세포(Agilent) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 취출하고, 카나마이신이 보충된 루리아 브로스(Luria Broth)(Teknova) 중에서 성장시키고 37℃, 250 RPM으로 18시간 인큐베이션하였다. 카나마이신이 보충된 테리픽 브로스(Terrific Broth)(Teknova) 250 mL를 이들 계대배양물로부터 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 약 4시간 동안 성장시켰다. 1 mM IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하고, 단백질을 30℃에서 18시간 동안 발현시켰다. 세포를 6000 g로 원심분리하여 수거하고, 정제될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동결된 세포 펠릿을 실온에서 30분 동안 해동시키고, 세포 페이스트 g당 5 ml로, 30 mL당 1 uL의 재조합 라이소자임(EMD Millipore)이 보충된 BugBusterHT 단백질 추출 시약(EMD Millipore) 중에 현탁시키고, 실온에서 진탕기 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 30분 동안 74,600 g로 원심분리에 의해 청징화하였다.
상층액을 완충액 A(0.5 M NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0)로 사전-평형을 이룬 3 mL의 Qiagen Superflow Ni-NTA 수지로 패킹된 중력 컬럼(gravity column) 상에 적용하였다. 로딩 후에, 컬럼을 100 mL의 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A로 용출시키고, PBS(Gibco) 중에서 평형을 이룬 분취용 겔-여과 컬럼, TSK Gel G3000SW 21.5 × 600 mm(Tosoh) 상에 로딩하였다. 겔-여과 크로마토그래피를 AKTA-AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 10 ml/min의 유량으로 PBS 중에서 실온에서 수행하였다. 이어서, 정제된 소르타제를 TEV 프로테아제로 분해(digest)하여 His6 태그를 제거하였다. 28 mg의 소르타제를 30℃에서 2시간 동안 1 mM DTT가 보충된 공급 완충액 중에서 3000 단위의 AcTEV 프로테아제(Invitrogen)와 함께 10 mL 중에서 인큐베이션하였다. 태그 없는 소르타제를 Ni-NTA 수지로 정제하였다. 반응물을 PD-10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 TBS 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) 중으로 교환하고, 완충액 A로 사전-평형을 이룬 0.5 mL의 Qiagen Superflow Ni-NTA 수지로 패킹된 중력 컬럼 상에 적용하였다. 통과액(flowthrough)을 수집하고, 수지를 3 mL의 완충액 A로 세척하였으며, 이것을 통과액에 첨가하였다. 통과액을 10 kDa 컷오프를 갖는 Amicon 15 농축기(EMD Millipore) 내에서 약 0.5 mL로 농축시켰다. 추가의 TBS 완충액을 첨가하고, 샘플을 (2회 반복하여) 다시 농축시켜 완충액을 TBS로 교환시켰다. 1/3 부피의 40% 글리세롤을 첨가하고(10% 글리세롤의 최종 농도), 소르타제를 단기간 동안 -20℃ 또는 장기간 동안 -80℃에서 저장하였다.
실시예 1. 무작위화된 루프를 갖는 텐콘 라이브러리의 작제
텐콘(서열 번호 1)은 인간 테나신-C로부터의 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된, 면역글로불린-유사 스캐폴드 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인이다(문헌[Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012]; 미국 특허 제8,278,419호). 텐콘의 결정 구조는 7개의 베타-가닥을 연결시키는 6개의 표면-노출된 루프를 보여준다. 이들 루프, 또는 각각의 루프 내의 선택된 잔기들은, 특정 표적에 결합하는 신규한 분자들을 선택하는 데 사용될 수 있는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위하여 무작위화될 수 있다.
텐콘:
Lpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt (서열 번호 1):
텐콘 스캐폴드 및 다양한 설계 전략을 사용하여 다양한 라이브러리를 생성하였다. 일반적으로, 라이브러리 TCL1 및 TCL2는 우수한 결합제를 생성하였다. TCL1 및 TCL2 라이브러리의 생성이 국제 특허 출원 공개 WO2014081944A2호에 상세히 기재되어 있다.
TCL1 라이브러리의 작제
텐콘(서열 번호 1)의 FG 루프만을 무작위화하도록 설계된 라이브러리, TCL1을 cis-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위해 작제하였다(문헌[Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012]). 이 시스템에서는, Tac 프로모터를 위한 서열들, 텐콘 라이브러리 코딩 서열, RepA 코딩 서열, cis-요소, 및 ori 요소를 도입시킨 단일-가닥 DNA를 생성한다. 시험관내 전사/번역 시스템에서의 발현 시에, 텐콘-RepA 융합 단백질의 복합체를 생성하는데, 이는 cis에서 그것을 인코딩하는 DNA에 결합된다. 이어서, 표적 분자에 결합하는 복합체를 단리하고 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는데, 이는 하기에 기재된 바와 같다.
cis-디스플레이와 함께 사용하기 위한 TCL1 라이브러리의 작제를 PCR의 연속 라운드에 의해 2개의 절반 부분에서 최종 선형 이중 가닥 DNA 분자를 생성함으로써 달성하였으며; 5' 단편은 프로모터 및 텐콘 서열을 함유하며, 한편 3' 단편은 repA 유전자와 cis- 및 ori 요소를 함유한다. 전체 작제물을 생성하기 위하여 제한 분해(restriction digest)에 의해 이들 2개의 절반 부분을 조합한다. 텐콘의 FG 루프, KGGHRSN(서열 번호 55)에만 무작위 아미노산을 도입시키도록 TCL1 라이브러리를 설계하였다. 이 라이브러리의 작제에서는 NNS 코돈을 사용하였으며, 그 결과 FG 루프 내로의 모두 20개의 아미노산 및 하나의 정지 코돈의 도입이 가능하게 되었다. TCL1 라이브러리는 6개의 별개의 서브-라이브러리를 함유하며, 이들 각각은 다양성을 더욱 증가시키기 위하여 7 내지 12개 잔기의 상이한 무작위화된 FG 루프 길이를 갖는다.
TCL1 라이브러리(서열 번호 2)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고; X8, X9, X10, X11 및 X12는 임의의 아미노산이거나 결실된다.
TCL2 라이브러리의 작제
텐콘의 BC 루프 및 FG 루프 둘 모두를 무작위화하고 각각의 위치에서의 아미노산들의 분포를 엄격하게 제어한 TCL2 라이브러리를 작제하였다. 표 6은 TCL2 라이브러리 내의 원하는 루프 위치들에서의 아미노산 분포를 나타낸다. 설계된 아미노산 분포는 2가지 목적을 가졌다. 첫째, 텐콘 결정 구조의 분석에 기초하여 그리고/또는 상동성 모델링으로부터 텐콘 접힘 및 안정성에 있어서 구조적으로 중요할 것으로 예측되는 잔기들 쪽으로 라이브러리를 편향시켰다. 예를 들어, 단지 소수성 아미노산들의 서브세트이도록 위치 29를 고정시켰는데, 이는 이 잔기를 텐콘 접힘부의 소수성 코어 내에 매립하였을 때이다. 설계의 제2 단계는, 고친화성 결합제(high-affinity binder)를 효율적으로 생성하기 위해, 항체의 중쇄 HCDR3에서 우선적으로 발견되는 잔기들의 아미노산 분포 쪽으로 아미노산 분포를 편향시키는 것을 포함하였다(문헌[Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008]; 문헌[Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007]). 이러한 목적을 위하여, 표 5에서의 "설계된 분포"는 하기와 같은 분포를 지칭한다: 6% 알라닌, 6% 아르기닌, 3.9% 아스파라긴, 7.5% 아스파르트산, 2.5% 글루탐산, 1.5% 글루타민, 15% 글리신, 2.3% 히스티딘, 2.5% 아이소류신, 5% 류신, 1.5% 라이신, 2.5% 페닐알라닌, 4% 프롤린, 10% 세린, 4.5% 트레오닌, 4% 트립토판, 17.3% 티로신, 및 4% 발린. 이 분포에는 메티오닌, 시스테인, 및 정지 코돈이 없다.
TCL2 라이브러리(서열 번호 3)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT; 상기 식에서, X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고; X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고; X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
[표 5]
Figure pct00008
후속으로, 이들 라이브러리를 다양한 방식으로 개선하였는데, 이러한 방식에는 야생형 텐콘과 비교할 때 치환 E11R/L17A/N46V/E86I(텐콘27; 서열 번호 4)를 포함하는, 안정화된 텐콘 프레임워크 상에의 라이브러리의 구축(미국 특허 제8,569,227호)뿐만 아니라, BC 및 FG 루프에서 무작위화된 위치의 변경이 포함된다. 텐콘27이 국제 특허 출원 공개 WO2013049275호에 기재되어 있다. 이로부터, 텐콘의 FG 루프(라이브러리 TCL9)만을, 또는 BC 및 FG 루프의 조합(라이브러리 TCL9)을 무작위화하도록 설계된 새로운 라이브러리를 생성하였다. 이들 라이브러리를 cis-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위하여 작제하였다(문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004]). 이 설계의 세부사항이 하기에 나타나 있다:
안정화된 텐콘(텐콘27)(서열 번호 4)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL7(무작위화된 FG 및 BC 루프)(서열 번호 5)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT; 상기 식에서,
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.
TCL9(무작위화된 FG 루프)(서열 번호 6)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT; X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.
라이브러리 작제를 위하여, 무작위화된 BC 루프(길이 6-9 위치) 또는 FG 루프(길이 7-12 위치)를 인코딩하는 DNA 단편을, 라이브러리의 아미노산 분포를 제어하고 정지 코돈을 제거하도록 하기 위하여 Slonomics 기술(Sloning Biotechnology GmbH)을 사용하여 합성하였다. BC 루프 또는 FG 루프를 무작위화하는 DNA 분자들의 2개의 상이한 세트를 독립적으로 합성하고, 추후에 PCR을 사용하여 조합시켜 완전한 라이브러리 생성물을 생성하였다.
FG 루프 라이브러리(TCL9)의 작제
5' Tac 프로모터에 뒤이어서 FG 루프 내의 무작위화된 코돈들을 제외한 텐콘의 완전한 유전자 서열로 이루어진 합성 DNA 분자들의 세트를 생성하였다(서열 번호 26-31). FG 루프 무작위화를 위하여, 시스테인 및 메티오닌을 제외한 모든 아미노산을 동일한 백분율로 인코딩하였다. 다양화된 부분의 길이는, 이러한 길이가 FG 루프 내의 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산을 인코딩하도록 하는 것이다. 각각의 길이 변이의 서브-라이브러리들을 2 ug의 규모로 개별적으로 합성하고, 이어서 올리고 Sloning-FOR(서열 번호 9) 및 Sloning-Rev(서열 번호 10)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.
이 라이브러리의 3' 단편은 디스플레이를 위한 요소들을 함유하는 불변 DNA 서열이며, 이러한 요소들은 PspOMI 제한 부위, repA 유전자의 코딩 영역, 그리고 cis- 및 ori 요소를 포함한다. M13 순방향 및 M13 역방향 프라이머를 이용하여, 주형으로서 플라스미드(pCR4Blunt)(Invitrogen)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 이 단편을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 PspOMI에 의해 하룻밤 분해하고 겔 정제하였다. 라이브러리 DNA의 5' 부분을 repA 유전자를 함유하는 3' DNA에 연결하기 위하여, 37℃에서 하룻밤 NotI 및 PspOMI 효소 및 T4 리가제의 존재 하에서 2 pmol(약 540 ng 내지 560 ng)의 5' DNA를 등몰량(약 1.25 ㎍)의 3' repA DNA에 연결하였다. 연결된 라이브러리 생성물을 올리고 POP2250(서열 번호 11)과 DigLigRev(서열 번호 12)를 이용하여, 12회 사이클의 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 각각의 서브-라이브러리의 경우, 12회의 PCR 반응으로부터 생성된 DNA를 조합하고 Qiagen 스핀 컬럼에 의해 정제하였다. TCL9의 각각의 서브-라이브러리에 대한 산출량은 32 내지 34 ㎍의 범위였다.
FG/BC 루프 라이브러리(TCL7)의 작제
TCL7 라이브러리는 무작위화된 텐콘 BC 및 FG 루프를 갖는 라이브러리를 제공한다. 이 라이브러리에서, 길이 6-9 아미노산의 BC 루프들을 길이 7-12 아미노산의 무작위화된 FG 루프들과 조합적으로 혼합하였다. BC 루프가 6, 7, 8, 또는 9개의 무작위화된 아미노산으로 대체되도록 잔기 VX를 포함하여 최대로 잔기 VX까지 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 텐콘 유전자를 포함하도록 합성 텐콘 단편 BC6, BC7, BC8, 및 BC9(서열 번호 13-16)를 생성하였다. 이들 단편을 L17A, N46V 및 E83I 돌연변이(CEN5243)의 발견 전에 합성하였지만, 이들 돌연변이를 하기에 기재된 분자 생물학 단계에서 도입하였다. 이 단편을 무작위화된 FG 루프들을 인코딩하는 단편들과 조합하기 위하여, 하기 단계들을 실시하였다.
먼저, Tac 프로모터 및 아미노산 A17을 인코딩하는 뉴클레오티드(130mer-L17A, 서열 번호 17)에 이르기까지의 텐콘의 5' 서열을 인코딩하는 DNA 단편을 올리고 POP2222ext(서열 번호 18) 및 LS1114(서열 번호 19)를 사용하여 PCR에 의해 생성하였다. 이것을 행하여 라이브러리 내에 L17A 돌연변이(CEN5243)를 포함시켰다. 다음으로, 무작위화된 BC 루프들을 포함하는 텐콘 잔기 R18-V75를 인코딩하는 DNA 단편들을, 주형으로서 BC6, BC7, BC8, 또는 BC9를 그리고 올리고 LS1115(서열 번호 20) 및 LS1117(서열 번호 21)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 PCR 단계는 3' 말단에 BsaI 부위를 도입시켰다. 이들 DNA 단편을, 프라이머로서 올리고 POP2222ext 및 LS1117을 사용하여 중첩(overlapping) PCR에 의해 순차적으로 결합시켰다. 240 bp의 생성된 PCR 생성물을 풀링하고 Qiagen PCR 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 DNA를 BsaI-HF로 분해하고, 겔 정제하였다.
FG 루프를 인코딩하는 단편들을, 올리고뉴클레오티드 SDG10(서열 번호 22) 및 SDG24(서열 번호 23)를 이용하여, 주형으로서 FG7, FG8, FG9, FG10, FG11, 및 FG12(서열 번호 26-31)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜, BsaI 제한 부위 및 N46V 및 E86I 변이(CEN5243)를 도입시켰다.
분해된 BC 단편들 및 FG 단편들을 3-방향 연결을 사용하여 단일 단계로 함께 연결하였다. 16개의 가능한 조합 중 4개의 연결 반응을 셋업하였으며, 이때 각각의 연결 반응은 2개의 BC 루프 길이를 2개의 FG 루프 길이와 조합하였다. 각각의 연결은 약 300 ng의 총 BC 단편 및 300 ng의 FG 단편을 함유하였다. 이어서, 이들 4개의 연결 풀을 올리고 POP2222(서열 번호 24) 및 SDG28(서열 번호 25)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, 7.5 ㎍의 각각의 반응 생성물을 Not1로 분해하고, Qiagen PCR 정제 컬럼으로 세정하였다. 5.2 ㎍의 이 DNA를 PspOMI로 분해된 등몰량의 RepA DNA 단편(약 14 ㎍)에 연결하고, 생성물을 올리고 POP2222를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.
실시예 2: 대체 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 생성
특정 라이브러리 설계에서 무작위화될 잔기의 선택은 생성되는 상호작용 표면의 전반적인 형상을 지배한다. BC, DE, 및 FG 루프가 무작위화된 라이브러리로부터 말토스 결합 단백질(MBP)에 결합하도록 선택된 스캐폴드 단백질을 함유하는 FN3 도메인의 X-선 결정학적 분석은 MBP의 활성 부위에 적합되는 대체로 만곡된 계면을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 6632-6637, 2007]). 대조적으로, MBP에 결합하도록 선택된 안키린 반복 스캐폴드 단백질은 훨씬 더 평면인 상호작용 표면을 갖고 활성 부위로부터 멀리 떨어진 MBP의 외측 표면에 결합하는 것으로 확인되었다(문헌[Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575-582, 2004]). 이들 결과는, 어느 표적 단백질 또는 그들 표적 단백질 상의 특이적 에피토프가 스캐폴드에 의해 효과적으로 결합될 수 있는지를 스캐폴드 분자의 결합 표면의 형상(곡면 대 평면)이 좌우할 수 있다는 것을 시사한다. 단백질 결합을 위한 FN3 도메인을 함유하는 단백질 스캐폴드의 조작을 둘러싼 공개된 노력은 표적 결합을 위해 인접한 루프를 조작함으로써 만곡된 결합 표면을 생성시키는 것에 의존해 왔다. 이러한 접근법은 이러한 스캐폴드에 의해 접근가능한 표적 및 에피토프의 수를 제한할 수 있다.
텐콘 및 다른 FN3 도메인은 분자의 대향면 상에 있는 2개 세트의 CDR-유사 루프를 함유하며, 제1 세트는 BC, DE, 및 FG 루프에 의해 형성되고, 제2 세트는 AB, CD, 및 EF 루프에 의해 형성된다. 2개의 루프 세트는 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타-가닥에 의해 분리된다. 텐콘의 이미지가 90도 회전된다면, 대체 표면이 시각화될 수 있다. CD 및 FG 루프 및 2개의 역평행 베타-가닥, C 및 F 베타-가닥에 의해 이러한 약간 오목한 표면이 형성되며, 본 명세서에서는 이를 C-CD-F-FG 표면이라고 칭한다. C-CD-F-FG 표면을 주형으로 사용하여, 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계할 수 있다. 베타-가닥은, 하나 걸러서 잔기의 측쇄가 단백질의 표면에 노출된 반복 구조를 갖는다. 따라서, 베타 가닥 내의 표면 노출된 잔기의 일부 또는 전부를 무작위화함으로써 라이브러리를 제조할 수 있다. 베타-가닥 내의 적절한 잔기를 선택함으로써, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 독특한 스캐폴드 표면을 제공하면서도 텐콘 스캐폴드의 내재적 안정성의 훼손을 최소화해야 한다.
라이브러리 TCL14(서열 번호 7)를 텐콘27 스캐폴드(서열 번호 4) 내로 설계하였다.
이 라이브러리를 작제하는 데 사용되는 방법에 대한 충분한 설명이 미국 특허 출원 공개 제2013/0226834호에 기재되어 있다.
TCL14 라이브러리(서열 번호 7):
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12 및 X13은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W,Y, C 또는 M이다.
텐콘27 내의 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 2개의 베타 가닥은 무작위화될 수 있는 하기의 총 9개의 표면 노출된 잔기를 가지며: C-가닥: S30, L32, Q34, Q36; F-가닥: E66, T68, S70, Y72, 및 V74, 한편 CD 루프는 하기의 6개의 잠재적 잔기를 가지며: S38, E39, K40, V41, G42, 및 E43; FG 루프는 하기의 7개의 잠재적 잔기를 갖는다: K75, G76, G77, H78, R79, S80, 및 N81. 선택된 잔기는, 22개 잔기 전부가 무작위화되었을 경우에 라이브러리의 이론적 크기가 더 크기 때문에 TCL14 설계 내에 포함되도록 선택되었다.
텐콘 내의 13개의 위치를 무작위화를 위해 선택하였다: C-가닥 내의 L32, Q34, 및 Q36, CD-루프 내의 S38, E39, K40, 및 V41, F-가닥 내의 T68, S70, 및 Y72, FG-루프 내의 H78, R79, 및 N81. C 및 F 가닥 내에서 S30 및 E66은 무작위화하지 않았는데, 이는 그들이 CD 및 FG 루프 바로 너머에 있고, 외견상 C-CD-F-FG 표면의 일부인 것으로 보이지 않기 때문이다. CD 루프의 경우, G42 및 E43은 무작위화되지 않았는데, 이는 유연성을 제공하는 글리신이 루프 영역 내에서 유익할 수 있고, E43이 표면의 접합부에 있기 때문이다. FG 루프에서 K75, G76, G77, 및 S80은 배제되었다. 글리신은 상기 이유로 배제된 반면에, 결정 구조의 신중한 조사에 의해 S80이 코어와 중요한 접촉을 이루어서 안정한 FG 루프의 형성을 돕는 것으로 밝혀졌다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면으로부터 다른 쪽을 향하며, 무작위화를 위해 덜 흥미로운 후보였다. 원래의 TCL14 설계에서 상기 잔기는 무작위화되지 않았지만, 그들은 후속의 라이브러리 설계에 포함되어 드노보 선택을 위해, 또는 예를 들어, 선택된 TCL14 표적 특이적 히트(target specific hit)에 대한 친화성 성숙 라이브러리(affinity maturation library)를 위해, 부가적인 다양성을 제공할 수 있을 것이다.
TCL14의 생성에 후속하여, 유사한 설계의 3개의 추가 텐콘 라이브러리를 생성하였다. 이들 2개의 라이브러리, TCL19, TCL21 및 TCL23을 TCL14와 동일한 위치에서 무작위화하지만(상기 참조), 이들 위치에서 발생하는 아미노산의 분포는 변경된다(표 6) TCL19 및 TCL21은, 단지 시스테인 및 메티오닌을 제외한 모든 위치에서(각각 5.55%) 18개의 천연 아미노산의 동일한 분포를 포함하도록 설계하였다. TCL23은 각각의 무작위화된 위치가 표 6에 기재된 바와 같이 기능성 항체의 HCDR3 루프에서 발견된 아미노산 분포와 근사해지도록 설계하였다(문헌[Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008]). TCL21 라이브러리와 마찬가지로, 시스테인 및 메티오닌을 제외시켰다.
제3의 추가의 라이브러리를 구축하여 다른 라이브러리의 잠재적인 표적 결합 표면을 확대시켰다. 이 라이브러리, TCL24에서는, 라이브러리 TCL14, TCL19, TCL21, 및 TCL23과 대비하여 4개의 추가의 텐콘 위치를 무작위화하였다. 이들 위치는 D 가닥으로부터의 N46 및 T48 그리고 G 가닥으로부터의 S84 및 I86을 포함한다. 위치 46, 48, 84, 및 86을 특별히 선택하였는데, 이들 잔기의 측쇄가 베타-가닥 D 및 G로부터 표면 노출되어 있고 C 및 F 가닥의 무작위화된 부분에 구조적으로 인접하게 놓여 있어서, 이에 따라 표적 단백질에 결합하기 위해 접근가능한 표면적을 증가시키기 때문이다. TCL24의 경우 각각의 위치에서 사용된 아미노산 분포는 표 6에서의 TCL19 및 TCL21에 대해 기재된 것과 동일하다.
TCL24 라이브러리(서열 번호 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16 및 X17은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V Y 또는 W이다.
[표 6] TCL21, TCL23, 및 TCL24에 대한 각각의 무작위화된 위치에서의 아미노산 빈도(%).
[표 6]
Figure pct00009
TCL21, TCL23, 및 TCL24 라이브러리의 생성
아미노산 분포를 제어하기 위하여 Colibra 라이브러리 기술(Isogenica)을 사용하여 TCL21 라이브러리를 생성하였다. 아미노산 분포를 제어하기 위하여 Slonomics 기술(Morphosys)을 사용하여 TCL19, TCL23, 및 TCL24 유전자 단편을 생성하였다. PCR을 사용하여 초기 합성 후의 각각의 라이브러리를 증폭시킨 후, RepA에 대한 유전자에 연결하여, CIS-디스플레이 시스템을 사용하는 선택에 사용되도록 하였는데(Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004), 이는 루프 라이브러리에 대해 전술된 바와 같다.
실시예 3: PSMA와 결합하는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 선택
플레이트-기반 선택
CIS-디스플레이를 사용하여 TCL7, TCL9, TCL19, 및 TCL21 라이브러리로부터 PSMA 결합 FN3 도메인을 선택하였다. 시험관내 전사 및 번역(ITT)을 위해, 3 ㎍의 라이브러리 DNA를, 50 μL의 총 부피로 0.1 mM 완전 아미노산, 1X S30 프리믹스 성분들, 및 15 μL의 S30 추출물(Promega)과 함께 30℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 375 μL의 블로킹 용액(1x TBS pH 7.4, 0.01% I-블록(Life Technologies, #T2015), 100 ug/ml 청어 정자 DNA)을 첨가하고, 반응물을 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. ITT 반응물을 재조합 단백질인 침팬지(pan 229) 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA(pan 230), 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA-Fc 융합체(pan 231)와 함께 인큐베이션하였으며, 이것을 항-인간 PSMA 항체(Lifespan Bioscience, 카탈로그 # LC-C150527) 코팅된 96웰 Maxisorb 플레이트 상에 고정화하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝(panning) 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성(washing stringency)을 증가시킴으로써 고친화성 결합제를 단리하였다.
패닝 후에, 선택된 FN3 도메인을 PCR에 의해 증폭시키고, 리가제 비의존성 클로닝 부위를 포함하도록 변형된 pET 벡터 내로 하위클로닝하고, 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 E. 콜라이(E. coli) 내에서의 가용성 발현을 위하여 BL21-GOLD(DE3)(Stratagene) 세포 내로 형질전환시켰다. C-말단 폴리-히스티딘 태그를 인코딩하는 유전자 서열을 각각의 FN3 도메인에 부가하여 정제 및 검출을 가능하게 하였다. 37℃에서 1 mL 96웰 블록들 내에서, 100 ㎍/mL의 카르베니실린이 보충된 TB 배지 중에서 배양물을 0.6 내지 0.8의 광학 밀도로 성장시켰으며, 그 후에 IPTG를 1 mM까지 첨가하였으며, 이 시점에서 온도를 30℃로 감소시켰다. 세포를 원심분리에 의해 대략 16시간 후에 수거하고, -20℃에서 동결시켰다. 45분 동안 실온에서 진탕하면서 0.6 mL의 BugBuster® HT 용해 완충액(Novagen EMD Biosciences) 중에서 각각의 펠릿을 인큐베이션함으로써 세포 용해를 달성하였다.
비드-기반 선택
비드-기반 포획 셋업을 사용하여 FN3 도메인을 또한 선택하였다. ITT 반응물을 전술된 바와 같이 제조하고, 이어서 비오티닐화 재조합 단백질인 침팬지 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA와 함께 인큐베이션하였다. 비오티닐화 재조합 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성을 증가시킴으로써 고친화성 결합제를 단리하였다.
해리 속도(off-rate) 선택
비드-기반 선택의 제5 라운드로부터의 산출물을 4회 라운드의 해리 속도 선택에 적용시켰다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 침팬지 또는 사이노몰거스 원숭이 단백질과 함께 인큐베이션한 후에, 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하고, TBST 중에서 광범위하게 세척하고, 결합된 복합체를 5 μM 차가운 재조합 PSMA 단백질 중에서 1시간 동안 세척하였다. 이어서, 비드에 결합된 ITT를 TBST 및 TBS 중에서 광범위하게 세척한 후 용출시켰다. 비오티닐화 표적 항원 농도를 라운드 6 및 7에서의 25 nM로부터 라운드 8 및 9에서의 2.5 nM까지 단계적으로 낮추었다. 라운드 7 및 9로부터의 선택 산출물을 발현 및 스크리닝을 위하여 변형된 pET15 벡터 내로 하위클로닝하였다.
친화성 성숙 라이브러리 선택
클론 P229CR9P819-H11(서열 번호 40)의 서열을 기반으로 한 친화성 성숙 라이브러리(TCL25)를 Morphosys(독일 뮌휀 소재)에서 Slonomics 기술을 사용하여 생성하였는데, 이 기술에서는 BC 루프로부터의 위치 23-30 및 FG 루프로부터의 위치 78-83을 무작위화하였다. 각각의 무작위화된 위치에서 65%의 목표 빈도로 모 아미노산(P229CR9P819-H11 유래)을 인코딩하는 뉴클레오티드를 도핑함으로써, 라이브러리에서의 표적 결합의 유지를 달성하였다. 나머지 35%의 뉴클레오티드는, 포함되지 않은 시스테인 및 메티오닌을 제외하고, 동일한 확률의 모든 다른 20개의 천연 아미노산을 인코딩하는 코돈들의 혼합을 함유하도록 설계하였다. 표 7은 TCL25 성숙 라이브러리의 설계를 나타낸다. 표에서, 괄호 안의 숫자는 각각의 위치에서 상응하는 아미노산을 함유하도록 설계된 라이브러리 내의 분자들의 백분율을 나타낸다.이러한 도핑 계획(14개의 위치에서 65% 모)은 모 분자와 대비하여 대개 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 변화를 함유하는 분자들의 이론상의 분포를 생성한다.
[표 7]
Figure pct00010
CIS-디스플레이를 사용하여 TCL25 라이브러리로부터 PSMA 결합 FN3 도메인을 선택하였다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 단백질인 침팬지 또는 사이노 원숭이 PSMA와 함께 인큐베이션하였다. 비오티닐화 재조합 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성을 증가시킴으로써 FN3 도메인 결합제를 단리하였다.
제2 라운드 선택으로부터의 산출물을 4회 라운드의 해리 속도 선택에 적용시켰다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 PSMA 단백질과 인큐베이션한 후에, 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하고, TBST 중에서 광범위하게 세척하고, 결합된 복합체를 5 μM 차가운 재조합 PSMA 단백질 중에서 1시간 동안 세척하였다. 이어서, 비드에 결합된 ITT를 TBST 및 TBS 중에서 광범위하게 세척한 후 용출시켰다. 비오티닐화 표적 항원 농도를 라운드 3 및 4에서의 25 nM로부터 라운드 5 및 6에서의 2.5 nM까지 단계적으로 낮추었다. 라운드 7 및 9로부터의 선택 산출물을 발현 및 스크리닝을 위하여 변형된 pET15 벡터 내로 하위클로닝하였다.
PSMA와 결합하는 FN3 도메인에 대한 생화학적 스크리닝
뉴트라비딘-코팅된 플레이트를 Starting Block T20(Pierce) 중에서 1시간 동안 블로킹하고, 이어서 1시간 동안 비오티닐화 PSMA(패닝에서와 동일한 항원을 사용함) 또는 음성 대조군으로 코팅하였다. 플레이트를 TBST로 헹구고, 희석된 용해물을 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 추가 헹굼 후, 웰들을 HRP-접합된 항-FN3 도메인 항체(PAB25)로 1시간 동안 처리하고, 이어서 POD(Roche)로 검정하였다. 백그라운드보다 적어도 10배 큰 신호를 갖는 FN3 도메인을 추가 분석을 위하여 선택하였다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 PSMA 결합 FN3 도메인의 응집 상태를 결정하였다. 각각의 정제된 FN3 도메인의 분취물들(10 μL)을 PBS pH 7.4의 이동상에서 0.3 mL/min의 유량으로 Superdex 75 5/150 컬럼(GE Healthcare) 상에 주입하였다. 컬럼으로부터의 용출을 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 야생형 텐콘을 대조군으로서 각각의 실시에 포함시켰다. Agilent ChemStation 소프트웨어(Rev. B. 04.02)를 사용하여 용출 프로파일을 분석하였다. 동일한 실시에서 야생형 단백질과 유사한 용출 프로파일을 갖는 단백질만을 추가의 특성화에 대해 고려하였다.
FN3 도메인의 대용량(high-throughput) 발현, 접합 및 정제
생화학적 결합 ELISA에 의해 확인된 특유의 히트로부터 단리된 클론을 96웰 블록 플레이트에서의 성장을 위하여 단일 히트 플레이트 내로 조합하였으며; 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 1 mL의 배양물(선택을 위하여 카나마이신이 보충된 LB 배지) 중에서 클론은 성장하였다. 96-블록 플레이트 내에서의 단백질 발현을 위하여, 카나마이신이 보충된 1 mL의 TB 배지를 50 uL의 하룻밤 배양물로 접종시키고, OD600이 0.6 내지 1이 될 때까지 300 rpm으로 연속 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 일단 목표 OD에 도달하였으면, IPTG를 1 mM까지 첨가하여 단백질 발현을 유도하였으며; 플레이트를 하룻밤 성장을 위하여 30℃(300 rpm)로 옮겼다. 하룻밤 배양물을 원심분리하여 세포를 수거하였으며; 세균 펠릿을 사용할 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 양성 및 음성 대조군 둘 모두를 플레이트마다 반복 실시로 포함시켰다.
소르타제 태그에 대한 접합을 위하여, 세균 펠릿을 해동시키고, 재현탁하고, 재조합 인간 라이소자임(EMD, 카탈로그 # 71110)이 보충된 BugBusterHT(EMD 카탈로그 #70922) 중에 용해시켰다. 용해는 온화하게 교반하면서 실온에서 진행되었으며, 이후에 플레이트를 42℃로 옮겨서 숙주 단백질을 침전시켰다. 잔해(debris)를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상층액을 소르타제-촉매 표지화를 위하여 새로운 블록 플레이트에 옮겼다. Gly3-vc-MMAF(Concortis), 태그 없는 소르타제A, 및 소르타제 완충액(Tris, 염화나트륨, 및 염화칼슘)을 함유하는 마스터 믹스를 2X 농도로 제조하고, 용해물 상층액에 등부피로 첨가하였다. 표지화 반응을 실온에서 2시간 동안 진행하였으며, 이후에 Ni-NTA 멀티-트랩 HP 플레이트(GE 카탈로그 #28-4009-89)를 사용하여 단백질을 정제하였다. 단백질 접합체를 이미다졸-함유 용출 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 250 mM 이미다졸)에 의한 단계적 용출에 의해 회수하고, 필터 멸균하고, 세포 기반 세포독성 검정에 직접 사용하였다.
FN3 도메인-약물 접합체의 대용량 세포독성 검정
96웰 흑색 조직 배양물-코팅된 플레이트(BD/Corning 카탈로그 # 353219)에 검정 배지(5% 소태아 혈청이 보충된 페놀 레드-무함유 RPMI(Life Technologies 카탈로그 #11835-030)) 중에서 10,000개 세포/웰의 밀도로 LNCaP FGC 세포(ATCC, 카탈로그 #CRL-1740)를 시딩(seeding)하였다. 시딩된 플레이트를 5% CO2 하에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 세포 부착을 가능하게 하였다. 24시간 후에, CDC를 검정 배지 중에 희석시키고(1:100, 1:300, 1:1000, 또는 1:3000), LNCaP 세포에 직접 적용하였다. 이어서, LNCaP 세포를 37℃, 5% CO2에서 66 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. CellTiter-Glo 시약(Promega, 카탈로그 #G7571)을 사용하여 세포 독성을 평가하였는데; 100 μL의 준비된 시약을 처리된 웰에 직접 첨가하고, 광으로부터 보호된 상태에서 온화하게 진탕하면서 10분 동안 인큐베이션하였다. SpectraMax M5 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정하였다. 값들을 비처리 대조군에 대해 정규화하고, 50% 초과의 독성이 달성되었다면 추가의 분석을 위해 선택하였다.
실시예 4: 항-PSMA FN3 도메인의 특성화
대규모 발현 및 정제
FN3 도메인 돌연변이체를 인코딩하는 유전자 서열을 패닝을 통해 찾아내고 T7 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pET15b 벡터 내로 클로닝하거나 또는 DNA2.0에 의해 생성하고 T5 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pJexpress401 벡터(DNA2.0) 내로 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 발현을 위하여 E.coli BL21 Gold(Agilent) 또는 BL21DE3 Gold(Agilent) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 취출하고, 카나마이신이 보충된 루리아 브로스(Teknova) 중에서 성장시키고 37℃, 250 RPM으로 18시간 인큐베이션하였다. 카나마이신이 보충된 테리픽 브로스(Teknova) 1 리터를 이들 계대배양물로부터 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 일단 600 nm의 흡광도에서의 광학 밀도가 1.0에 도달하면, 단백질 발현을 1 mM IPTG로 유도하였다. 단백질을 37℃에서 4시간 동안 또는 30℃에서 18시간 동안 발현시켰다. 세포를 6000 g로 원심분리하여 수거하고, 정제될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동결된 세포 펠릿(약 15 내지 25 g)을 실온에서 30분 동안 해동시키고, 세포 페이스트 g당 5 ml로, 0.2 mg/ml의 재조합 라이소자임(Sigma)이 보충된 BugBusterHT 단백질 추출 시약(EMD Millipore) 중에 현탁시키고, 실온에서 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 25분 동안 74,600 g로 원심분리에 의해 청징화하였다. AKTA AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 4 ml/min의 유량으로 얼음 중에 침지된 5 ml의 Qiagen Ni-NTA 카트리지 상에 상층액을 적용하였다. 모든 다른 Ni-NTA 크로마토그래피 단계를 5 ml/min의 유량으로 수행하였다. Ni-NTA 컬럼을 0.5 M NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0(완충액 A) 25.0 ml 중에서 평형에 이르게 하였다. 로딩 후에, 컬럼을 100 ml의 완충액 A에 이어서, 10 mM 이미다졸, 1% CHAPS 및 1% n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 표면활성제(detergent)를 함유하는 100 ml의 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0, 및 100 ml의 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A로 용출시키고, PBS(Gibco) 중에서 평형을 이룬 분취용 겔-여과 컬럼, TSK Gel G3000SW 21.5 × 600 mm(Tosoh) 상에 로딩하였다. 겔-여과 크로마토그래피를 AKTA-AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 10 ml/min의 유량으로 PBS 중에서 실온에서 수행하였다.
열 안정성의 결정
열 안정성을 모세관 DSC에 의해 측정하였다. 각각의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 1 mg/ml의 농도로 희석시켰다. 오토샘플러가 장착된 VP-DSC 기기(MicroCal, LLC)를 사용하여 이들 샘플에 대하여 용융 온도를 측정하였다. 샘플을 10℃로부터 95℃ 또는 100℃까지 1℃/분의 속도로 가열하였다. 적분용 기준선을 계산하기 위하여 각각의 샘플 스캔 사이에 완충제 단독 스캔을 완료하였다. 완충제 단독 신호를 차감한 후 데이터를 2-상태 풀림 모델에 적합시켰다. 각각의 샘플을 셀로부터 제거하지 않으면서 그에 대한 스캔을 반복함으로써 열 변성의 가역성을 결정하였다.
PSMA+ 세포에 대한 항-PSMA FN3 도메인 약물 접합체의 선택적 세포독성
FN3 도메인을 시스테인-말레이미드 화학(문헌[Brinkley, Bioconjugate Chemistry 3: 2-13, 1992])을 통해 또는 전술된 소르타제 반응을 사용하여 vc-MMAF에 접합시켰다. FN3 도메인-vcMMAF 접합체의 세포독성을 시험관내에서 LNCaP, VCAP, MDA-PC-2B, 및 PC3 세포에서 평가하였다. 세포를 24시간 동안 96웰 흑색 플레이트 내에서 플레이팅하고, 이어서 가변 용량의 FN3 도메인-vcMMAF 접합체로 처리하였다. 세포를 66 내지 72시간 동안 FN3 도메인 약물 접합체(FDDC)와 함께 인큐베이션되게 하였다. 전술된 바와 같이, CellTiterGlo를 사용하여 독성을 평가하였다. 발광 값들을 엑셀로 내보내기 하였으며, 그래픽 분석을 위하여 이로부터 그들을 Prism에 복사 및 붙여넣기 하였다. 데이터를 X=Log(x)를 사용하여 변환시키고, 이어서 3-파라미터 모델을 적용하여 비선형 회귀를 사용하여 분석하여 IC50을 결정하였다.
표 8은 다수의 서열 패밀리들을 스패닝하는, 패닝을 통해 확인된 특유의 히트들을 요약한다. FN3 도메인은 55° 내지 85℃에서 열 안정성을 나타내었으며, 22.6 내지 0.38 nM의 IC50 값으로 vcMMAF에 접합될 때 LNCaP 세포에 대해 세포독성을 나타내었다. 표 9, 표 10 및 표 11은 선택된 클론들의 BC, C, CD, F 및 FG 루프 아미노산 서열을 나타낸다. 표 12는 클론들의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00011
[표 9]
Figure pct00012
[표 10]
Figure pct00013
[표 11]
Figure pct00014
[표 12]
Figure pct00015
선택된 약물 접합체들을 세포주 패널 전체에 걸쳐 시험하였다. 표 13은 vcMMAF에 접합된 몇몇 FN3 도메인에 대한 IC50 값을 나타낸다. 데이터는 1개의 곡선 적합과 9개의 곡선 적합 사이의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. CDC가 고수준의 PSMA를 발현하는 것으로 알려진 세포주인 LNCaP 세포에서 가장 강력하다. CDC는 또한 더 낮은 수준의 PSMA를 갖는 전립선암 세포주인 MDA-PCA-2B 및 VCAP 세포에서 활성이었다. PSMA 음성 세포주인 PC3 세포에서는 활성이 관찰되지 않았는데, 이는 선택성을 입증한다.
[표 13]
Figure pct00016
실시예 5: 항-PSMA FN3 도메인의 조작
시스테인 스캔
항-PSMA FN3 도메인인, 시스테인 잔기가 단백질 내의 다양한 위치에 도입된 P233FR9_10을 인코딩하는 유전자를 DNA2.0으로부터 획득하고, 이를 사용하여 전술된 바와 같은 단백질을 발현 및 정제하였다. 생성된 FN3 도메인을 전술된 바와 같이 열 안정성(vcMMAF 접합의 존재 및 부재 하에서) 및 LNCaP 세포독성에 대해 평가하였다. 결과가 표 14에 요약되어 있다.
[표 14]
Figure pct00017
실시예 6: 비표적화된 FN3 도메인의 생체내분포의 이미징
위치 62에 시스테인을 함유하도록 조작된 표적 항원에 대한 특이적 결합을 갖지 않는 FN3 도메인을 DOTA에 접합하고, 이어서 IsoTherapeutics Group, LLC(미국 텍사스주 앵글턴 소재)에서 지르코늄-89 방사성 동위원소를 접합하였다. 거세된 수컷 NSG 마우스(Jackson laboratories)를 1.5% 아이소푸란으로 마취하고, Siemens Inveon microPET/CT에서 이미징하였다. 마우스에 꼬리 정맥 주사(차가운 FN3 도메인을 사용하여 최대 1 mg/㎏ 용량으로 행해짐)를 통해 대략 0.2 mCi [89Zr] FN3 도메인(서열 번호 51)을 투여하고, FN3 도메인의 주사 후 처음 60분 동안, 그리고 이어서 3, 6 및 14시간째에 연속해서 이미징하였다.
3차원 PET 이미지를 2D 배열된-부분집합 기대값 최대화 알고리즘(2D ordered-subsets expectation maximization algorithm)(미국 테네시주 녹스빌 소재의 Siemens Healthcare)을 사용하여 복셀(voxel) 크기가 0.107 mm × 0.107 mm × 0.107 mm인 768 × 768 × 512 토포그래픽 부피(tomographic volume)로 재작성하였다. 이미지를 처리하고, PMOD v3.0 소프트웨어(스위스 취리히 소재의 PMOD Technologies)를 사용하여 분석하였다. 알려진 활성의 실린더를 PET 스캐너에서 스캐닝하여, 용량 보정기에 의해 측정된 주사된 용량과 PET 이미지에서의 복셀당 카운트 사이의 교차-보정을 제공하였다. 각각의 PET 이미지를 PMOD 이미지 융합 소프트웨어를 사용하여 CT-이미지에 코-레지스터(co-register)하여, 해부학적 레퍼런스를 제공하였다. 관심 영역(region of interest)(ROI)을 분석되는 각각의 조직에 대하여 4번째 섹션마다 그 주위에 그렸다. 복셀당 평균 카운트를 도출하고, 알려진 활성의 보정 실린더로부터 도출된 보정 계수를 사용하여 체중 그램당 주사된 용량(%)으로 변환시켰다. 방사능의 모든 측정치를 Zr-89의 알려진 반감기(78.41시간)를 사용하여 감쇠에 대해 보정하였다.
도 1은 시간 경과에 따른 방사성 표지 FN3 도메인의 조직 분포를 나타낸다. 신장 및 방광에서는 신속한 누적이 관찰되며, 간에서는 단지 제한된 누적이 관찰되는데, 이는 FN3 도메인이 신장을 통해 제거됨을 시사한다.
실시예 7: 사이노 PSMA와 복합체를 형성한 항-PSMA P233FR9-H10의 결정 구조
His-태깅된 P233FR9-H10 FN3 도메인(본 명세서에서는 H10 FN3 도메인으로 칭해짐)을 E. 콜라이에서 발현시키고, 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. FN3 도메인을 dPBS, pH 7.2 중에 수용하였다.
huIgG1 Fc 도메인에 대한 C-말단 융합체로서의 사이노몰거스 PSMA 세포외 도메인을 GnTI- 세포에서 발현시키고, 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 융합 단백질을 dPBS, 0.5 mM ZnCl2, pH 7.2 중에 수용하였다. 이어서, Prescission 프로테아제 처리 후 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 Fc 도메인을 제거하였다. 단리된 사이노몰거스 PSMA(사이노PSMA) 세포외 도메인을 dPBS, 0.5 mM ZnCl2, pH 7.2 중에 저장하였다.
20 mM Hepes pH 7.0, 0.5 mM ZnCl2에 대해 4℃에서 48시간 동안 투석하면서 사이노PSMA를 H10 FN3 도메인과 1:3(과량의 FN3 도메인)의 몰비로 혼합함으로써 H10 FN3 도메인/사이노PSMA 복합체를 제조하였다. 이어서, 복합체를 48 내지 68 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.5, 10% 글리세롤의 구배로 monoS 컬럼으로부터 용출시키고, 3.4 mg/mL로 농축시켰다. 20℃에서 시팅 드롭 증기-확산법(sitting drop vapor-diffusion method)을 사용하여 25% PEG 3 kDa, 0.2 M NH4Cl, 0.1 M 소듐 아세테이트 pH 4.5로부터 X-회절에 적합한 결정을 얻었다.
X-선 데이터 수집을 위하여, 결정을 20% 글리세롤이 보충된 모액을 함유하는 동결보호 용액 중에 수초 동안 액침하고, 이어서 액체 질소 중에서 동결시켰다. 아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory)에 있는 APS(Advanced Photon Source)의 빔라인 17-ID의 Dectris Pilatus 6M 픽셀 어레이(Pixel Array) 검출기를 사용하여 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 회절 데이터를 프로그램 HKL2000(문헌[Otwinowski & Minor,1997])을 사용하여 처리하였다. X-선 데이터 통계가 표 15에 제공되어 있다.
이 구조를 Phaser(문헌[Read, 2001])를 사용하여 분자 대체(molecular replacement)(MR)에 의해 해석하였다. MR에 대한 검색 모델은 인간 PSMA(PDB 코드 2C6G)의 결정 구조 및 P114AR7P94-A3 W33A FN3 도메인의 구조였다. PHENIX(문헌[Adams et al, 2004])를 사용하여 구조를 정밀화하고, COOT(문헌[Emsley & Cowtan, 2004])를 사용하여 모델 조정을 수행하였다. 모든 다른 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 제품군(suite)(문헌[CCP4, 1994])을 사용하여 수행하였다. 모든 분자 그래픽은 PyMol(문헌[DeLano, 2002])을 사용하여 생성하였다. 구조 정밀화 통계가 표 15에 제공되어 있다.
[표 15]
Figure pct00018
동종이량체성 사이노PSMA의 구조는 프로테아제(잔기 57-116 및 352-590), 정점(잔기 117-351) 및 나선(잔기 591-750) 도메인에 상응하는 잔기 57-750, 및 이량체 하위단위당 11개의 가능한 N-연결 글리칸 중 8개(Asn-76, -121, -140, -195, -459, -476, -613, 및 -638에서)를 포함한다. 사이노PSMA 활성 부위는 3개의 도메인들 사이의 계면에 위치해 있고, 그것은 히스티딘(H377 및 H553) 및 글루타메이트/아스파르테이트(D387, 촉매적 E424, E425, 및 D453) 잔기 및 물 분자에 의해 배위된 2개의 아연 원자를 함유한다. H10 FN3 도메인(서열 번호 41) 구조는 잔기 2-92를 함유한다. H10 잔기는 서열 번호 41에 따라 순차적으로 넘버링된다. 사이노PSMA 잔기는 서열 번호 141의 전장 사이노 PSMA 서열에 따라 넘버링된다. 성숙 사이노PSMA(신호 펩티드를 갖지 않음)는 서열 번호 141의 잔기 44에서 시작한다.
하나의 H10 FN3 도메인이 각각의 PSMA 하위단위에 결합된 비대칭 단위 내에는 하나의 사이노PSMA 동종이량체가 있다(도 2a). 2개의 FN3 도메인/PSMA 복합체는 PSMA 하위단위들 내의 모든 등가의 원자들의 중첩에 대해 0.72 Å의 제곱평균제곱근 편차(r.m.s.d.)에 의해 나타나는 바와 같이 구조적으로 매우 유사하다. 또한, 인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA 사이에는 고도의 구조적 유사성이 있고, FN3 도메인 복합체 내의 사이노PSMA 분자와 결합되지 않은 인간 PSMA(PDB 코드 2OOT, 1.6Å 분해능에서의 구조) 사이의 Cα 원자 중첩에 대하여 0.5 Å의 r.m.s.d에 의해 나타나는 바와 같이 FN3 도메인 결합에 의해 유도된 큰 입체구조 변화가 부재한다. 흥미로운 특징은 루프 영역 541-547이 FN3 도메인과의 상호작용을 통한 루프 입체구조의 안정화로 인해 단지 사이노몰거스 단백질에서만 가시적이라는 것이다.
FN3 도메인/PSMA 결합 부위는 2F obs-F calc 전자 밀도 맵에 의해 명확한데, 이는 결합 잔기들의 신뢰성 있는 위치결정을 가능하게 한다. B 쇄와 C 쇄(각각 PSMA 쇄 및 FN3 도메인 쇄) 사이의 상호작용만이 다음 섹션에 기재된다.
H10 FN3 도메인은 PSMA 활성 부위 부근의 영역에 결합하고(도 2a), 약 1,170 Å2의 사이노PSMA 영역을 커버한다. 구체적으로는, FN3 도메인은 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 프로테아제(Y460, F488, K499-P502, P504, R511, K514, N540-E542, 및 N544-F546), 정점(잔기 R181), 및 나선(잔기 K610, N613, 및 I614) 도메인 내의 사이노PSMA 잔기를 인식한다.
FN3 도메인의 면(face)은 PSMA 표면 상의 β-시트 팩들을 네 가닥화하였는데, 이때 CD 루프가 활성 부위 입구 내로 깊숙이 삽입되었다(도 2b 및 도 2c). 구체적으로는, PSMA 결합에 관여하는 H10 FN3 도메인 잔기는 C(A32 및 G34), D(V46), F(G64, P68, Y70, 및 A72), 및 G(S84-I86) β-가닥 및 CD(W36, W38-D41, E43, 및 A44) 및 FG 루프(W79, F81, 및 P82) 내에 위치된다. 잔기 D39, D40, D41, 및 E43은 FN3 도메인 CD 루프에 음전하를 부여하고, 이들 잔기는, 활성 부위 내의 아연 이온으로 이어지는, 약 20 Å 깊이의 양으로 하전된 퓨넬(funnel) 내로 삽입되어, 퓨넬 내로의 기질 입구 및 PSMA 효소 활성을 차단할 가능성이 높다(도 2b 및 도 2c). 그러나, FN3 도메인은 아연 이온 또는 그의 배위 잔기와 직접 상호작용하지는 않는다.
보존된 PSMA 잔기 W541, Y460, F488, P502 및 P504는 FN3 도메인 잔기 W36, P68, Y70, W79, F81, 및 P82와의 코밍 부위(combing site)를 가로질러 방향족 클러스터를 형성한다(도 3a). 보존된 R511은 결합 부위의 중심 위치 내에 있고, H는 FN3 도메인 네 가닥 β-시트의 중심 잔기인 Y70과 결합한다. 도 3b는 파라토프 및 에피토프 잔기의 간략도를 나타낸다.
인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA는 97% 동일하며, S613N 변경을 제외하고, H10과 상호작용하는 모든 잔기는 2개의 종 사이에서 보존된다(도 4). S613N 변경은 사이노PSMA에서의 N613 글리코실화 및 이 탄수화물과 FN3 도메인 잔기 E66, I86, T88(F 및 G β-가닥) 사이의 반데르 발스 접촉의 획득(gain)을 가져오는데, 이는 인간 효소에서는 존재하지 않을 것이다.
접합을 위한 FN3 도메인 잔기
결합 부위 외측의 다양한 H10 FN3 도메인 잔기는 PSMA 결합 또는 FN3 도메인 접힘을 방해하지 않고서 소분자(독성 페이로드(payload))의 접합을 위하여 변형될 수 있다. 시스테인은 (His-태그 이후의) C-말단에서 그리고 위치 R11, E53, 및 K62에서 페이로드에 이미 위치시키고 접합하였으며, 이들 변이체 모두는 유사하게 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 입증되었다. 게다가, BC 루프 내의 잔기 T22, D25, 및 A26, DE 루프 내의 말단 잔기 N6, 및 S52는 돌연변이생성 후 화학적 접합을 위한 잠재적으로 우수한 부위이다(도 5). 이러한 용매 노출 잔기들은 FN3 도메인/PSMA 계면으로부터 떨어져 있고, 구조적으로 유연한 영역에 위치되어 있다.
더욱이, N- 및 C-말단 영역 둘 모두는 다른 단백질 도메인과의 융합에 있어서 자유롭다. N-말단은 PSMA 프로테아제 도메인을 향해 배향되고 융합 링커를 사용하여 도달가능하며, 한편, 또한 접근가능한 C-말단은 PSMA 나선 도메인을 향해 간다. FN3 도메인 융합 파트너에 대한 최적의 링커 길이는 융합 파트너의 구조 및 표적 분자 상의 그의 결합 부위의 위치에 좌우될 것이다.
작용 기전
H10 FN3 도메인은 FN3 도메인/PSMA 복합체의 내재화에 기인하는 전립선암 세포 내로의 페이로드(독성 소분자, 핵산 등)의 표적화된 전달을 위한 후보이다. 더욱이, H10 FN3 도메인은 다중특이성 포맷인 경우 전립선암 세포로의 면역 세포의 방향전환을 위한 후보이다.
H10 FN3 도메인은, 감소된 세포 피트니스(fitness) 및 생존율에 기여할 수 있는 PSMA의 효소 활성을 또한 억제할 가능성이 높다. FN3 도메인/사이노PSMA 구조는 활성 부위의 입구에 결합된 FN3 도메인을 나타내는데, 이는 입체 폐색(steric occlusion) 및 결합 부위에 대한 직접적인 경쟁을 통하여 PSMA와의 기질 상호작용을 방지할 수 있다.
실시예 8: 추가의 항-PSMA FN3 도메인 변이체의 생성
선택된 항-PSMA FN3 도메인을 추가로 조작하여 모 FN3 도메인의 특성을 개선하였다. 이는, PSMA에 결합하는 FN3 도메인을 전술된 라이브러리를 사용하여 생성하고, PSMA에 대한 그들의 결합에 대해 시험하였다.
표 16은 생성된 분자의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 16]
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 9: 형광 염료에 접합된 항 PSMA FN3 도메인을 사용하여 종양 세포 상에서의 PSMA 발현의 검출
이 실시예는 형광 염료에 접합된 항 PSMA FN3 도메인을 사용하여 세포 상에 존재하는 PSMA를 검출하는 것을 나타낸다. 아미노산 53에 유리 시스테인을 갖는 C-말단 His-태깅된 항 PSMA FN3 도메인 P233FR9_H10(서열 번호 49)을 R-피코에리트린(PE)(Prozyme 카탈로그 # PB31)에 접합시켰다. PE를 60분 동안 설포-SMCC(Pierce 카탈로그 # 22122)를 사용하여 활성화하고, 활성화된 PE를 Sephadex G25 및 PBS/EDTA 완충액을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 설포-SMCC로부터 분리하였다. FN3 도메인을 30분 동안 TCEP(Sigma, cat. # 646547)를 사용하여 환원시켰다. 환원된 FN3 도메인을 Sephadex G25 및 PBS/EDTA 완충액을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 TCEP로부터 분리하였다. 활성화된 PE를 환원된 FN3 도메인에 90분 동안 공유 결합시킨 후, 20분 동안 N-에틸말레이미드(Sigma 카탈로그# 04260)를 사용하여 켄칭하였다. "PE-접합된 FN3 도메인"을 AKTA Explorer FPLC(General Electric) 상에서 100 mM 인산나트륨, 100 mM 황산나트륨, 0.05% 아지드화나트륨, pH 6.5 중에서 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼을 사용하여 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하였다.
PE-접합된 FN3 도메인을 유세포측정 및 CellSearch 순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell)(CTC) 검정에 의해 PSMA 양성 및 음성 세포주를 사용하여 감수성 및 특이성에 대해 시험하였다. 하기의 전립선 세포주를 ATCC로부터 구매하고, 항-PSMA FN3 도메인의 특이성을 검증하는 데 사용하였다: LNCaP(고 PSMA 발현), 22Rv1(저 PSMA 발현) 및 PC3(PSMA 발현 없음).
유세포측정에 의한 세포주 상의 PSMA의 검출
표준 세포 배양 절차를 사용하여 전립선 세포주를 수거하였다. 세포(약 30,000개)를 PE-접합된 FN3 도메인으로 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.1 ml의 PBS 중에서 20분 동안 염색하였다. Biolegend로부터의 항 PSMA 항체-PE 접합체(클론 LNI-17 카탈로그 # 342504)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 후에, 3 ml의 PBS/BSA 완충액을 첨가하고, 결합되지 않은 PE 접합체를 5분 동안 800 g로 원심분리에 의해 제거하였다. 상층액을 흡인하고, 세포를 0.3 ml의 PBS/BSA 중에 재현탁시켰다. 샘플을 BD Biosciences FACSCalibur에 의해 분석하였다. 각각의 세포주로부터의 PSMA 염색의 평균 형광 세기(MFI)를 결정하고, 항 PSMA 항체에 의한 MFI와 대비하였다. MFI는 PSMA 발현 수준에 직접 관련되어서, 높은 PSMA 발현 세포주로부터의 MFI가 더 높다. 도 6은 항 PSMA PE-접합된 FN3 도메인에 의해 검출된 상이한 세포주들로부터의 MFI 값을 항 PSMA 항체-PE에 의한 MFI 값과 대비한 것을 나타낸다.
결과는 항-PSMA PE-접합된 FN3 도메인이 PSMA 양성 세포주에 결합하고, PSMA 음성 세포에 비특이적으로 결합하지 않음을 나타낸다. MFI는, 예상된 바와 같이, 낮은 PSMA 발현 세포주(22Rv1)의 경우 낮은 MFI에 비하여 높은 PSMA 발현 세포주(LNCaP)의 경우 더 높다. PSMA 음성 세포주(PC3)의 경우의 MFI는 백그라운드 신호에 가깝다. 게다가, 상이한 세포주들에 결합함에 있어서의 FN3 도메인-PE의 성능은, FN3 도메인 및 항체 접합체 둘 모두에 대해 유사한 MFI 값이 획득된 바와 같이, 항-PSMA 항체-PE와 유사하다. 이 실시예는 항 PSMA PE-접합된 FN3 도메인이 종양 세포 상의 PSMA의 검출에 있어서 감수성 및 특이성을 보여줌을 나타낸다.
순환 종양 세포 검정에 의한 PSMA의 검출
CELLSEARCH 검정에서 항-PSMA PE-접합된 FN3 도메인을 시험하여 7.5 ml의 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)를 검출 및 계수함으로써 상기 결과를 추가로 확인하였다. CELLSEARCH 시스템(미국 뉴저지주 라리탄 소재의 Janssen Diagnostics)을 사용한 순환 종양 세포 계수를 제조자의 프로토콜 및 트레이닝에 따라 수행하였다. CellSearch 검정은, 포획을 위하여 페로플루이드(ferrofluid) 자성 입자에 접합된 항-EpCAM을 사용하고, CTC의 시각화를 위하여 플루오레세인에 접합된 사이토케라틴 8, 18 및 19에 특이적인 항-사이토케라틴을 사용한다. CELLSEARCH 검정은 샘플 제조를 위한 AutoPrep 및 분석을 위한 CELLTRACKS Analyzer II®(CTA II)를 사용한다. CTA II는 4색 반자동화 형광 현미경이고, CTC를 확인 및 계수하는 데 3개의 색을 사용한다. CTA II 상에서의 제4 색은 추가의 관심 마커를 사용하여 표현형 CTC에 이용가능하다. 이 실시예에서는, 조직 배양된 종양 세포를 정상 혈액 중으로 스파이킹하여 혈액 중 CTC를 모방하였다. 대략 500개의 종양 세포(LNCaP, 22Rv1, PC3 또는 SKBR3 세포)를 CellSave 튜브(Janssen Diagnostics) 내에 수집된 7.5 ml의 정상 공여자 혈액 중으로 스파이킹하였다. 유방암 세포주(SKBR3)는 또한 PSMA 음성 세포주로서 사용하였다. CELLSEARCH CXC 키트 및 마커로서의 항 PSMA PE-접합된 FN3 도메인을 사용하여 샘플을 AutoPrep 상에서 처리하였다. AutoPrep 샘플 제조 시스템은 항 EpCAM 페로플루이드를 사용하여 종양 세포를 포획함으로써 종양 세포를 풍부화한다. CTC 풍부화된 샘플을, 핵산 염료(DAPI)로 염색하여 핵형성 세포를 확인하고, 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)에 접합된 항-사이토케라틴 항체로 염색하여 종양 세포를 확인하고, 알로피코시아닌(APC)에 접합된 항-백혈구 항체로 염색하여 백혈구를 확인하였다. 샘플을 0.32 ml의 최종 부피로 처리하고, MagNest® 세포 제시 장치 내에 있는 상태로 샘플 챔버에 옮겼다. MagNest® 장치는 CELLTRACKS Analyzer II®에 의한 분석을 위하여 자성 표지 세포를 제시한다. 샘플을 CTA II를 사용하여 분석하여 CTC를 계수하고 CTC 상의 PSMA를 검출하였다. 분석기는 샘플을 자동으로 분석하고, 후보 종양 세포들을 제시하는데, 후보 종양 세포들은 검토를 위한 섬네일 이미지로서 DAPI 및 사이토케라틴에 대해 양성이다. CELLSEARCH 검정에서 항 PSMA PE-접합된 FN3 도메인으로 염색된 종양 세포들로부터의 결과가 도 7에 나타나 있다.
도 7a는 LNCaP 종양 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타내고, 이들 세포의 100%는 PSMA에 대해 양성이다. 낮은 PSMA 발현 세포주(22Rv1)는 PSMA에 대해 26% 양성이다(도 7b). 한편, PSMA 음성 세포주(PC3-9 및 SKBR3)는 PSMA에 대해 음성이다(도 7c 및 도 7d). 이들 결과는 유세포측정 결과와 일치한다. 이 실시예는 항 PSMA FN3 도메인이 CTC 상에서의 PSMA 발현을 검출하고, 항 PSMA FN3 도메인의 감수성 및 특이성을 추가로 확인하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 10: 항-CD3 Fab의 결정 구조
SP34 Fab의 결정 구조를 2.1 Å 분해능에서 결정하였다. 이것은 완전한 아미노산 서열을 보여주었고, SP34 mAb의 유래가 되는 가능한 마우스 생식세포계열을 확인시켜 주었다. 이 구조를 사용하여 인간 프레임워크 적응화를 이끌었다.
재료
마우스 IgG3/람다 동종형인 SP34 mAb를 BD Biosciences Pharmingen(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)(Cat. No. 556611)로부터 구매하였다. 기술 데이터 시트에 따라, 그것을 조직 배양 상층액으로부터 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 4℃에서 저장하였다. Fab 단편을 mAb의 파파인 분해에 의해 생성하고(Pierce, Cat # 44985, Thermofisher), 제조사의 프로토콜에 따라 Nab 단백질 A 플러스 스핀(Protein A Plus Spin) 컬럼(Pierce, Cat # 44985, Thermofisher)을 사용하여 Fc로부터 분리하였다. Fab를 20 mM MES, pH 6.5(완충액 A)로 평형화된 MonoS 컬럼(GE Healthcare) 상에서 추가로 정제하였다. 50 컬럼 부피 중에서 1 M NaCl의 13 내지 28% 구배로 완충액 A를 사용하여 용출을 수행하였다. 주 피크에 상응하는 분획들을 풀링(pooling)하고, 9.2 mg/mL로 농축시키고, 결정화에 사용하였다.
결정화
Oryx4 로봇(Douglas Instruments) 및 Mosquito 로봇(TTP Labtech)을 사용하여 20℃에서 증기 확산 방법에 의해 결정화를 수행하였다. 실험은 96웰 Corning 3550 플레이트에서의 시팅 드롭 포맷으로의 등부피의 단백질 및 저장소 용액으로 구성되었다. PEGs 키트(Qiagen) 및 사내 스크린 IH1 및 IH2를 사용하여 초기 스크리닝을 수행하였다. IH2 스크린으로부터 초기 스크리닝 후에 얻어진 Fab 시드를 사용한 MMS 최적화는 다양한 조건 하에서 다수의 결정을 생성하였다. X-선 분석에 사용되는 Fab 결정을 12% PEG 3350, 0.2 M K/Na 주석산염(pH 7.4), 3% 아이소프로판올 및 3% 다이옥산(완충액 없음)으로부터 얻었다. 결정 데이터는 표 17에 주어져 있다.
[표 17]
Figure pct00022
X-선 데이터 수집 및 구조 결정
X-선 데이터 수집을 위하여, 하나의 결정을 20% 글리세롤이 보충된 모액 중에 수초 동안 액침하고, 액체 질소 중에서 급속 동결시켰다. 회절 데이터를 Pilatus CCD 검출기를 사용하여 Advanced Photon Source(미국 일리노이주 아르곤 소재) IMCA 빔라인에서 수집하였다. 1/2도 이미지당 0.5초 노출로 180° 결정 회전에 걸쳐 회절 세기를 검출하고, 프로그램 XDS로 처리하였다(문헌[Kabsch W. 2010. XDS. Acta Crystallogr. D66:125-132]). X-선 데이터 통계가 표 17에 제공되어 있다.
이 구조를 IgG3/카파 동종형인 마우스 항-톰젠-프리덴라이히(Thomsen-Friedenreich) 항원 항체 Jaa-F11(PDB 3gnm)로부터 작제된 Fab 모델을 사용하여 분자 대체에 의해 해석하였다. 모든 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 제품군을 사용하여 수행하였다(문헌[1994, Acta Crystallogr. D50:760-763]). 모델 조정은 프로그램 COOT를 사용하여 수행하였다(문헌[Emsley P, and Cowtan K. 2004. Acta Crystallogr. D60:2126-2132]). 정밀화 통계가 표 17에 제공되어 있다.
생식세포계열 정보가 SP34에 대한 서열 결정을 이끌었다. X-선 데이터는 몇몇 체세포 돌연변이뿐만 아니라, 생식세포계열의 일부가 아닌 CDR-H3의 전체 서열의 확인을 가능하게 하였다. D/N, E/Q, T/V를 배정하는 것의 모호성은, 가능하다면, H-결합 네트워크들 및 원자 B-인자들 - 이들은 일부 경우에 원자 C, N 및 O 사이에서 구별될 수 있음 - 에 기초하여 해결하였다.
체세포 돌연변이는 VL의 위치 40, 97 및 98에서 그리고 VH의 위치 35, 55, 56, 57 및 80에서 확인되었다.
5개의 이황화물이 예상된 바와 같이 Fab 구조에서 관찰되었다: 경쇄에서 22-90 및 137-196, 중쇄에서 22-98 및 152-207, 및 사슬간 이황화물 214(L)-140(H).
결정에서의 Fab들 사이에서의 상호작용
이 결정에서는, Fab 분자들이 헤드-투-테일(head-to-tail)로 패킹되며, 이에 따라 하나의 Fab의 CDR이 다른 Fab의 중쇄의 C-말단 부분과 결합한다. C-말단은 데드-엔드 모드에서 VL과 VH 사이의 깊은 틈(deep crevice)에 들어맞게 된다. S230의 말단 카르복실 기는 VH의 N35 및 R50 및 VL의 W98에 대한 수소 결합을 형성한다. 이는 여분의 잔기에 대한 여지를 남기지 않고, mAb의 파파인 절단이 힌지 영역의 S230과 T231 사이에서 일어났음을 나타낸다.
추정 파라토프
본 구조에서의 CDR의 입체구조 및 전술된 C-말단 인식의 모드는 항원 결합에 관여될 가능성이 가장 높은 잔기들의 선택을 가능하게 하였다. 이들은 하기와 같다:
CDR-L1: Y34; CDR-L2: 없음; CDR-L3: W93;
CDR-H1: T31, Y32, A33; CDR-H2: R50, R52, Y55, N56; CDR-H3: N103, G105, S107, Y108, S110
상호작용들의 대부분은 VH에서 일어날 가능성이 높으며, 주된 기여는 CDR-H2 및 CDR-H3으로부터 기인된다.
SP34의 서열은 도 8에 나타나 있으며(서열 번호 160 및 161), 이때 잔기 231 ― 455는 IGHG3_MOUSE(마우스 IgG3, 아이소형 2)로부터 유래된다.
실시예 11: 항-CD3 항체 SP34의 인간 프레임워크 적응화
항-CD3 뮤린 항체 SP34를 인간 프레임워크 적응화 방법에 의해 인간화하였다(문헌[Fransson, et al, JMB, 2010]). 4개의 상이한 중쇄를 3개의 상이한 경쇄와 조합하여 12개의 인간화 변이체를 생성하였다.
SP34 인간화 및 친화성 성숙
인간 생식세포계열의 선택
인간 프레임워크 적응화(HFA) 방법[16]을 사용하여 SP34를 인간화하였다. 4개의 인간 중쇄 및 3개의 경쇄 가변 영역 서열의 매트릭스를 시험을 위하여 선택하였다. 인간 생식세포계열의 선택은 프레임워크 영역(FR)에서의 SP34와의 전체 서열 유사성에만 오로지 기초하였다. CDR 서열도, 그의 길이 또는 표준 구조도 이들 어느 것도 이 선택에서는 고려하지 않았다.
중쇄에 대한 가장 근접한 매치는 인간 GL IGHV3-72 및 IGHV3-73이다. 다른 GL, IGHV3-23을, 인간 B-세포 레퍼토리에서의 그의 높은 발생 빈도로 인해 선택하였다.
경쇄에 대한 가장 근접한 매치는 인간 람다 GL IGLV7-43 (aka 7a), IGLV7-46 (aka 7b) 및 IGLV1-51 (aka 1b)이다. IGLV7-46은 IGLV7-43과 실질적으로 동일하지만, 위치 2에 있는 Ala의 이점을 갖는데, 즉 이는 SP34에서와 같다.
선택된 J-영역은 하기와 같다: 중쇄에 대해서는 IGHJ1; 람다 경쇄에 대해서는 IGLJ3.
복귀 돌연변이
SP34의 결정 구조에 기초하여, HFA 변이체의 모델을 구축하였다. 이 모델은 잠재적인 충돌을 갖는 VL 내의 몇몇 FR 위치들을 밝혀주었는데, 가장 현저하게는 위치 Val38, Gly48 및 Gly51이다(도 9). 마우스 잔기는 CDR-H3의 입체구조를 보존하기 위하여 모든 3개의 위치에서 유지되어야 한다. 이들 돌연변이를 돌연변이 계획 내로 추가하였다.
중쇄의 위치 57에 있는 Asn은 이러한 구조에서 우수한 측쇄 밀도를 갖지 않는다. 이는 또한 CDR-H2의 중간에 놓여 있고, 전형적인 결합 위치로부터 멀어지는 쪽으로 향한다. 이러한 분석에 기초하여, 그것은 결합에 유의하게 기여할 수 없다. 게다가, 골격 기하학적 형태는 라마찬드란 도표에서 Gly 잔기에 대해 가장 유리한 영역 내에 놓여 있다. 따라서, 그것을 돌연변이 계획에서 Gly까지 절두하여, 필요한 융통성을 가능하게 하고, 결합에 영향을 미치지 않으면서 (비-글리신 관련 국소 구조적 변형을 감소시킴으로써) 안정성을 잠재적으로 개선하였다.
친화성 돌연변이 설계에서는 고려해야 할 몇몇 다른 사항이 있었다. 먼저, 인간 GL IGLV7-46 및 IGLV7-43은 원치 않는 산화 잠재성을 가지면서 위치 59에 Trp을 도입한다. 2개의 다른 GL들은 이 위치에 Gly를 갖는데, 이는 마우스 서열에 상응한다. 따라서, Gly59를 IGLV7-46 및 IGLV7-43 변이체 둘 모두에서 보존하였다. 마지막으로, VH의 위치 49에 있는 Ala은 본질적이다. 또한, 위치 99에 있는 잔기(SP34에서의 Val)는 항원 결합에 영향을 미칠 수 있다. 이들 위치를 시험하기 위하여, 일부 변이체에 복귀 돌연변이를 도입하였다(도 10).
HFA 매트릭스
HFA 매트릭스는 4개의 VH 변이체 및 3개의 VL 변이체로 구성된다(도 10). HFA의 목적상, AbM CDR 정의가 사용된다(짧은 CDR-H2, 긴 CDR-L1).
VH에 대한 변이체:
CD3H141(서열 번호 163): 마우스 CDR + Gly49Ala을 갖는 IGHV3-72*01
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H142(서열 번호 164): 마우스 CDR + Ser49Ala을 갖는 IGHV3-23*01
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H143(서열 번호 165): 마우스 CDR + Ser49Ala, Ala99Val을 갖는 IGHV3-23*01
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H144(서열 번호 166): 마우스 CDR + Asn57Gly를 갖는 IGHV3-73*01
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
VL에 대한 변이체:
CD3L63(서열 번호 167): 마우스 CDR + F38V, A48G, Y51G, W59G를 갖는 IGLV7-46*01
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L64(서열 번호 168): 마우스 CDR + Y38V, L48G, Y51G를 갖는 IGLV1-51*01
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVTTSNYANWVQQLPGTAPKGLIGGTNKRAPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L66(서열 번호 169): 마우스 CDR + F38V, A48G, Y51G, W59G를 갖는 IGLV7-43*01
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
[표 18] CD3 중쇄 및 경쇄의 매트릭스
(모두 L234A, L235A, 및 F405L을 함유하는 IgG1-AA Fc를 사용하여 제조함)
[표 18]
Figure pct00023
아미노산 서열을 DNA로 역번역하고, cDNA를 유전자 합성 기법을 사용하여 제조하였다(미국 특허 제6,670,127호; 미국 특허 제6,521,427호). 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 L234A, L235A, 및 F405L 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1-AA Fc 상에 중쇄(HC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 인간 람다(λ) 불변 영역 상에 경쇄(LC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 Expi293F 세포(Invitrogen) 내로 형질감염시키고, mAb를 발현시켰다. 단백질 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe 컬럼)을 사용하여 표준 방법에 의해 정제하였다. 용출 후, 풀들을 D-PBS, pH 7.2 내로 투석하였다.
[표 19]
Figure pct00024
Figure pct00025
서열 번호 163의 VH 및 서열 번호 167의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A, F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB143을 생성하였다. 서열 번호 163의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB144를 생성하였다. 서열 번호 163의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB146을 생성하였다. 서열 번호 164의 VH 및 서열 번호 167의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB147을 생성하였다. 서열 번호 164의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB148을 생성하였다. 서열 번호 164의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB150을 생성하였다. 서열 번호 165의 VH 및 서열 번호 167의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB151을 생성하였다. 서열 번호 165의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB152를 생성하였다. 서열 번호 165의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB154를 생성하였다. 서열 번호 166의 VH 및 서열 번호 167의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB155를 생성하였다. 서열 번호 166의 VH 및 서열 번호 168의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB156을 생성하였다. 서열 번호 166의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 L234A, L235A 및 F405L 치환을 갖는 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 CDB158을 생성하였다.
실시예 12: 1차 T 세포에 대한 인간화 항-CD3 히트들의 내인성 세포 결합
항-CD3 항체들의 생성된 패널을 1차 인간 T 세포 상의 세포-표면 CD3ε에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이렇게 하기 위하여, 발현 상층액으로부터의 항체의 결합을 다중클론 항-인간 2차 항체를 사용하여 시각화하고 유세포측정에 의해 분석하였다. 간략하게 말하면, 음성 선택에 의해 정제된 1차 인간 T 림프구(Biological Specialty, 미국 콜마 소재)를 사용하여 유세포측정에 의해 세포-표면 CD3ε에 대한 항-CD3 항체의 결합을 평가하였다. 발현 상층액 또는 정제된 항체를 각각 배지 또는 FACS 완충액(BD BioSciences) 중에 10 ㎍/ml로 정규화하였다. 2×105개 세포를 표지화를 위하여 96웰 둥근바닥 플레이트(CoStar)의 웰 내로 분취하였다. 발현 상층액 중의 항체를 세포에 첨가하고, 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 3분 동안 1300 rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후에, 50 μL의 항-인간 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 2차 항체(Life technologies Inc.)를 직사광선을 피해서 4℃에서 30분 동안 10 ㎍/mL의 최종 농도로 세포와 인큐베이션하였다. 세척 후에, 30 μL의 FACS 완충액(BD BioSciences) 중에 재현탁하였다. ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 Intellicyt HTFC 시스템 상에서 샘플 수집을 수행하였다. 녹색 또는 적색 고정가능 Llive/Dead 염료(Life Technologies Inc.) 및 전방/측방 산란(forward/side scatter) 면적 및 높이 파라미터를 각각 사용하여, 결합의 분석 전에 생존 단세포를 게이팅하였다. 평균 형광 세기 값을 사용하여 GraphPad Prism 버전 5에서 그래프를 생성하였다.
적정 시리즈를 실시하였지만, 명확함을 위하여 중간 농도가 도 13에 제시되어 있다. 치료적 항체와 동일한 Fc 영역을 갖는 하기의 2개의 사내 파지-유래 항체를 대조군으로서 사용하였다: 비-사이노 교차-반응성, 효능 항체인 G11(HC 서열 번호 176, LC 서열 번호 177)을 양성 대조군으로서 사용하고, 비-결합제/비-효능 항체인 CD3B94(HC - 서열 번호 178, LC ― 서열 번호 179)를 비특이적 결합을 평가하기 위해 사용하였다. 시판 SP34 항체는 이 검정에서 비교물로서 사용하지 않았는데, 이것은 마우스 항체이고 상이한 2차 검출 시약의 사용은 시험되는 변이체들과의 직접 비교를 불가능하게 할 것이기 때문이다.
데이터는 인간화 항-CD3 히트들의 패널에서의 다수의 결합능을 입증하는데, 이때 2개의 항체(CD3B144, CD3B152)는 인간 T 세포에 대한 결합의 완전한 손실을 보여준다. 나머지 항체들은 임의적인 역치로서의 G11 결합을 사용하여 강한 결합제 및 약한 결합제로 광범위하게 분리될 수 있는 일정 범위의 결합능을 보여주었다. 이들 파라미터를 사용하여, 7개의 강한 결합제 및 7개의 약한 결합제를 변이체들의 패널로부터 확인하였다(도 13).
이어서, 교차-반응성의 보유를 평가하기 위해 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포에 대한 항-CD3 히트들의 결합 분석을 시험하였다. 사이노몰거스 원숭이(Zen Bio, 미국 트라이앵글 리서치 파크 소재)의 말초 혈액으로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 사용하였다. 검정 프로토콜은 전술된 것들과 유사하였다. G11은 사이노몰거스 CD3ε과 교차-반응하지 않기 때문에, 인간 IgG1 Fc 및 뮤린 프레임워크와 함께 SP34의 VH 및 VL을 갖는, 사내 키메라 SP34-유래 항체인 CD3B124를 이 검정에서 양성 대조군으로서 사용하였다(도 14). 흥미롭게도, 몇몇 변이체는 인간 세포에 대해 관찰된 것과 비교하여 감소된 결합능을 보여주었다. 이는 강한 결합제 CD3B150, CD3B151 및 CD3B154 - 여기서는, 결합이 감소되었음 - 및 몇몇 약한 결합제 - 여기서는, 백그라운드에 비하여 결합이 더 이상 검출될 수 없었음 - 를 포함하였다. 이러한 결합 손실은 특정 면역글로불린 쇄에 관련되지 않았는데, 이는 중쇄 및 경쇄의 조합이 교차-반응성의 손실에서 역할을 하였음을 시사한다. 이와 함께, 이들 검정은 인간 CD3ε과 사이노몰거스 CD3ε 사이에 종 교차-반응성이 유지된 변이체의 확인을 가능하게 하였다.
실시예 13: 1차 T 세포에서의 인간화 항-CD3 히트들의 기능 분석
결합 분석은 인간화 항-CD3 히트들의 패널이 인간 및 사이노몰거스 T-세포에 대한 광범위한 결합능을 보여줌을 입증하였다. 각각의 변이체가 CD3ε 가교결합을 통해 활성화를 유도하는 능력을 조사하기 위하여, 1차 T-세포를 비드-접합된 항체의 존재 하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하고 항-CD69 항체로 표지화하여 활성화를 측정하였다(도 13). 인간화 항-CD3 항체를, 10 ㎍/m의 항체와 함께 하룻밤 인큐베이션에 의해 단백질 A 코팅된 자성 비드(SpheroTech, 미국 레이크 포레스트 소재)에 결합시켰다. 다음날, 2×105개 1차 인간 T 세포를 둥근바닥 세포 배양 플레이트에서 3회 반복하여 플레이팅하고, 2×105개 코팅 비드를 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 배양 후에, 세포를 수거하고, 항-CD69 Alexa Fluor 488 항체(클론 FN50; Biolegend)로 표지화하여 이 활성화 마커의 상향조절을 평가하였다. 결합에 대해 전술된 바와 같이 샘플 수집 및 분석을 수행하였다. 몇몇 음성 대조군에 대해 실시하였는데, 이에는 T-세포 단독, 코팅되지 않은 비드를 갖는 T-세포, 및 동종형 대조군(CD3B94)-코팅된 비드를 갖는 T-세포가 포함되었다. 이들 모두는 무염색 T-세포에 비견되는 유사한 평균 형광 세기 값을 보여주었으며, 이는 백그라운드가 이 검정에서 낮았음을 나타낸다. 비교를 위해 몇몇 양성 대조군에 대해 실시하였는데, 이에는 OKT3(미국 특허 제5929212호) 및 구매가능한 SP34-2 항체가 포함되었다.
이어서, 인간화 항-CD3 히트들을 동일한 검정에서 1차 사이노몰거스 CD4+ T 세포(Zen Bio, 미국 트라이앵글 리서치 파크 소재)를 활성화하는 그들의 능력에 대해 시험하였다(도 14). FN50 항-CD69 항체는 비인간 단백질과 교차-반응하는 것으로 기재되어 왔으며, 이에 따라 이들 세포의 활성화를 시험하는 데 사용될 수 있었다.
인간 및 사이노몰거스 활성화 데이터는, 히트들의 패널이 광범위한 활성화능(activation potential)을 나타내었다는 점에서 결합 데이터와 상관되었다. 다수의 강한 결합제는 구매가능한 SP34-2와 비교할 때 동등하거나 더 큰 정도로 인간 T-세포를 활성화하는 능력을 보여주었다. 몇몇 변이체는 SP34-2와 비교하여 더 낮은 활성화능을 보여주었으며, 한편 일부 결합제는 CD69 자극의 증거를 보여주지 않았다. 활성화 불능은, 약한 결합을 보여주거나 결합을 전혀 보여주지 않은 변이체에서만 관찰되었고, 모든 강한 결합제는 어떤 수준의 활성화를 보여주었는데, 이는 인간(도 15의 a) 및 사이노몰거스(도 15의 b) 둘 모두에 대한 결합능과 활성화능 사이의 상관관계를 시사한다.
실시예 15. IgG4 S228P L234A, L235A에서 이중특이성 포맷의 다중특이성 항원-결합 분자의 제조
(국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 바와 같이) 시험관내 Fab 아암 교환에서 FN3 도메인 융합체의 존재 하의 그리고 부재 하의 CD3 mAb 아암 및 단일특이성 PSMA Fn3 도메인 FC 융합체를 결합함으로써 이중특이성 PSMA × CD3 다중특이성 항원-결합 분자를 생성하였다. 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 이중특이성의 단리된 다중특이성 항원-결합 분자를 생성하기 위하여, 항-PSMA FN3 도메인(P233FR9-H10, 서열 번호 41)을 다수의 배향으로 항-CD3 mAb를 갖는 융합 단백질로서 생성하여, 세포독성 T-세포를 활성화하고 그것을 PSMA 발현 세포주에 대해 표적화하는 이들 분자의 능력에 대한 그러한 배향의 영향을 평가하였다.
CD3 mAb B219의 발현
단일특이성 CD3 항체들 중 하나인 CDB146을, 그들의 Fc 영역 내에 Fc 치환 S228P, F234A, L235A F405L 및 R409K(넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 갖는 IgG4로서 발현시켰다. 단일특이성 항체를 HEK293 세포에서 일시적 형질감염에 의해 생성하였다.
서열 번호 163의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역 및 S228P, L234A, L235A, F405L, 및 R409K 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 단일특이성 항-CD3 항체 B219를 생성하였다. 단일특이성 항-CD3 항체 B219는 서열 번호 170의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 171의 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
PSMA FN3 도메인 융합체의 설계
작제물을 1가 CD3 상호작용: B219(서열 번호 170, 171) X CW5(서열 번호 172), B219(서열 번호 170, 171) X CW6(서열 번호 173), B221(서열 번호 170, 174) X CW5(서열 번호 172) 또는 2가 CD3 상호작용: B221(서열 번호 170, 174)을 생성하도록 설계하였다. 마찬가지로, 1가 PSMA 상호작용이 가능한 분자: B219(서열 번호 170, 171) X CW6(서열 번호 173), B219(서열 번호 170, 171) X CW5(서열 번호 172), 또는 2가 PSMA 상호작용: B221(서열 번호 170, 174), B221(서열 번호 170, 175) X CW5(서열 번호 172)를 설계하였다. 최종 변이는 중쇄에 대한 FN3 도메인의 위치인데, 이때 N-말단 및 C-말단 융합체 둘 모두가 생성되었다. A (GGGGS)2 링커(서열 번호 175)를 모든 분자 내의 중쇄 불변 영역과 P233FR9-H10 사이에 도입시켰다. 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 설계된 단리된 다중특이성 항원-결합 분자의 간략 다이어그램이 도 16에 나타나 있다.
[표 20]
Figure pct00026
아미노산 서열을 DNA로 역번역하고, cDNA를 유전자 합성 기법을 사용하여 제조하고(미국 특허 제6,670,127호; 미국 특허 제6,521,427호), 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터와 함께 사내 발현 벡터를 사용하여 단백질을 발현시켰다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 L234A, L235A, 및 F405L 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4-AA Fc 상에 중쇄(HC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 갖는 사내 발현 벡터를 사용하여 인간 람다(λ) 불변 영역 상에 경쇄(LC) 가변 영역을 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 Expi293F 세포(Invitrogen) 내로 형질감염시키고, mAb를 발현시켰다. 단백질 A 컬럼(HiTrap MabSelect SuRe 컬럼)을 사용하여 표준 방법에 의해 정제하였다. 용출 후, 풀들을 D-PBS, pH 7.2 내로 투석하였다.
S228P, L234A 및 L235A의 치환을 갖는 IgG4 불변 영역의 C-말단에 링커(서열 번호 175)에 의해 연결된 항-PSMA FN3 도메인 P233FR9-H10(서열 번호 41)을 포함하는 항-PSMA FN3 도메인 융합체 CW5를 생성하였으며, 이때 융합체의 아미노산 서열은 서열 번호 172를 포함한다. S228P, L234A 및 L235A의 치환을 갖는 IgG4 불변 영역의 N-말단에 링커(서열 번호 175)에 의해 연결된 항-PSMA FN3 도메인 P233FR9-H10(서열 번호 41)을 포함하는 항-PSMA FN3 도메인 융합체 CW6을 생성하였으며, 이때 융합체의 아미노산 서열은 서열 번호 173을 포함한다. 서열 번호 163의 VH 및 서열 번호 169의 VL을 갖는 VH 및 VL 영역, 및 서열 번호 174를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 170을 포함하는 경쇄를 갖는 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 항-PSMA X CD3 단리된 다중특이성 항원-결합 분자의 아미노산 서열인, 항원 CD3 및 PSMA P233FR9-H10(서열 번호 41)과 결합하는 항-PSMA 단리된 다중특이성 항원-결합 분자에 링커(서열 번호 175)에 의해 중쇄의 C-말단에서 융합된 S228P, L234A, L235A, F405L 및 K409R 치환을 갖는 IgG4 불변 영역을 포함하는 항-CD3 mAb B219를 포함하는, 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 단리된 이중특이성 항-PSMA X CD3 항원-결합 분자, B221을 생성하였다.
항원 CD3 및 PSMA 단백질과 결합하는 단리된 다중특이성 항원-결합 분자인 B219XCW5, B219XCW6 및 B221XCW5를 부분 환원 및 제어된 Fab 아암 교환에 의해 제조하였는데, 이때 표 17에 기재된 바와 같은 모 분자들의 조합을 사용하였다. 간략하게 말하면, 모 분자들을 1.08:1 B219/B221 대 W5/W6의 몰비로 약 1 내지 20 mg/ml로 혼합하고, 2-MEA(PBS 중 750 mM의 스톡 농도)를 75 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 반응물을 31℃에서 5시간 인큐베이션한 후, PBS 내로 투석하였다. 이어서, 단백질을 수집하고, 멸균 여과하고, 280 nm에서의 흡광도, 양이온 교환 HPLC, 크기 배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 순도 및 농도를 측정하였다.
서열 번호 163 및 169의 VL 및 VH 아미노산 서열을 포함하는 B219 항-CD3 중쇄 및 경쇄와 쌍을 형성한 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CW5 항-PSMA FN3 도메인 융합 아암을 포함하는, 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 이중특이성의 항-PSMA X CD3 단리된 다중특이성 항원-결합 분자, B219XCW5를 생성하였다. 서열 번호 171 및 170의 아미노산 서열을 포함하는 B219 항-CD3 중쇄 및 경쇄와 쌍을 형성한 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 CW6 항-PSMA FN3 도메인 융합 아암을 포함하는, 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 이중특이성의 항-PSMA X CD3 단리된 다중특이성 항원-결합 분자, B219XCW6을 생성하였다. 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 B221 항-CD3 X 항-PSMA FN3 도메인 중쇄 융합체 및 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 쌍을 형성한 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 CW5 항-PSMA FN3 도메인 융합 아암을 포함하는, 이중특이성의 항-PSMA X CD3 단리된 다중특이성 항원-결합 분자, B221XCW5를 생성하였다.
[표 21]
Figure pct00027
실시예 16: 기능적 세포 사멸 검정에서 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 이중특이성의 단리된 다중특이성 항원-결합 분자의 평가
24시간 표준 크롬 방출 검정을 사용하여, PSMA 양성 LNCAP 종양 표적(ATCC CRL-1740)을 사멸하는 데 있어서의 항원 CD3 및 PSMA과 결합하는 단리된 다중특이성 항원-결합 분자의 기능을 결정하였다. 동결된 정상 공여자 pan-T 세포(All Cells Cat# PB900-1F)를 1 ㎍/ml의 OKT3(미국 특허 제5929212호) 및 20 U/ml의 IL2(Peprotech Cat#200-02)로 12 내지 24시간 동안 사전활성화하였다. 이어서, T 세포를 세척하고, 크롬으로 표지된 RPMI 중에서 LNCAP 종양 표적 세포(Perkin-Elmer, 카탈로그 # NEZ030S001MC)와 5:1 이펙터 대 표적 비로 공동-배양하였다. 항원 CD3 및 PSMA와 결합하는 단리된 다중특이성 항원-결합 분자를, 최고 용량에서의 웰 내의 최종 농도가 10 ㎍/ml이고 1:20 희석물들을 사용한 7-포인트 적정 곡선을 따르도록 첨가하고, 18 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 상층액을 수거하고 감마-카운터 상에서 판독하였다. 표적 세포로부터의 크롬의 자발적 방출을 위한 대조군으로서, 표적을 단지 배지와만 함께 배양하고, 상층액을 수집하였다. Trition-X-100을 첨가하여 모든 표적들을 용해시킴으로써 최대 방출을 결정하였다. 분당 카운트를 감마 카운터를 사용하여 수집하고, 하기 식에서 사용하여 % 세포독성을 결정하였다. 모든 샘플은 3회 반복하여 수집하였다.
% 세포독성에 대한 계산 = (실험 카운트 - 자발적 방출) (최대 방출 - 자발적 방출) × 100%.
% 세포독성을 3회 반복 실시 각각에 대해 계산하고, 3회 반복 실시의 평균 % 세포독성 +SEM으로 도표로 나타낸다.
도 17은 2개의 독립적인 실험의 대표적인 그래프를 나타낸다. 이 데이터는 모든 CD3B219xPSMA 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 구성이 종양 세포 사멸을 가져왔으며, B219XCW6이 가장 강력하고, B221 및 B219xCW5가 그 뒤를 잇는다는 것을 입증한다. 하기 표 22는 각각의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자에 대한 EC50뿐만 아니라 이들 EC50 및 R-제곱 값에 대한 95% 신뢰 범위를 나타낸다.
[표 22]
Figure pct00028
실시예 17: PBMC-인간화 NSG 마우스에서의 HEK293-PSMA 이종이식편의 종양발생 예방에서 Mabtyrin, B219xCW6의 항-종양 효능
수컷 NSG 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmlWjl/SzJ, 미국 메인주 바 하버 소재의 Jackson Laboratories) 내의 접종된 인간 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 HEK293-PSMA 인간 이종이식편의 종양발생의 예방에 의해 B219xCW6의 효능을 평가하였다(예방적 모델). 마우스의 외측 꼬리 정맥에 종양 세포 이식 7일 전(일수 -7)에 1 × 107 인간 PBMC를 정맥내(iv) 주사하였다. 마우스의 우측 뒷 옆구리에 1 × 107 HEK293-PSMA 세포를 일수 0에 피하(sc) 이식하였다. 종양 이식 당일에 시작하여, PBS(인산염 완충 식염수) 대조군 및 B219xCW6을 일수 0, 3, 5, 7 및 10에 총 5회의 용량에 대하여 q2d 내지 q3d로 0.004 mg/㎏, 0.04 mg/㎏, 0.4 mg/㎏(각각 마우스 25 그램당 0.1 ㎍, 1 ㎍ 및 10 ㎍과 등가임)로 iv 투여하였다.
하기 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였으며: 종양 부피(㎣) = (a × b2/2) (여기서, 'a'는 종양의 길이를 나타내고, 'b'는 종양의 폭을 나타내며, 이들은 캘리퍼 측정에 결정된 바와 같음); 연구 과정 전체에 걸쳐 주 2회 모니터링하였다. % 종양 성장 억제(TGI)를 처리군 및 대조군(PBS)의 평균 종양 부피들 사이의 차이로서 정의하였으며, TGI = [((TVc-TVt)/TVc)*100]으로 계산되며, 여기서 TVc는 주어진 대조군의 평균 종양 부피이고, TVt는 처리군의 평균 종양 부피이다. NCI 기준에 의해 규정된 바와 같이, 60% 이상의 TGI가 생물학적으로 유의한 것으로 간주된다(문헌[Johnson JI, et al (2001) Br J Cancer 84(10):1424-31]). 최대 종양 부피가 1500 ㎣에 도달하였을 때 동물들을 연구로부터 제거하였다.
인간 PBMC의 생착은 궁극적으로 마우스에서 이식편-대-숙주 질병(GVHD)으로 이어지는데, 여기서는 생착된 공여자 T 세포가 활성화되게 되고 숙주 조직을 침윤시켜, 체중 손실, 기관 부전, 및 필연적으로, 사망으로 이어진다. GVHD의 개시 및 중증도를 모니터링하기 위하여, 체중을 매주 2회 기록하고 그램(g)으로 표현하였다. 하기 식을 사용하여 % 체중 변화를 계산하였다: 체중 변화 = [((Bt B0)/B0)*100] (여기서, Bt는 주어진 연구 날짜의 체중이고, B0는 치료 개시 시의 체중임). 초기 체중의 20% 초과의 체중 손실을 지속한 동물은 빈사 상태인 것으로 간주하고 연구로부터 제거하였다.
Graph Pad Prism 소프트웨어(버전 6)를 사용하여 던넷 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison)을 사용한 다중 비교와 함께 일원 ANOVA를 사용하여 통계학적 유의성을 평가하였다. 지시된 연구에 대한 추가의 통계학적 분석은 연구 노트(laboratory notebook)에서 찾을 수 있다.
모든 생체내 연구는 문헌[The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals]에 따라 수행하였으며, 미국 펜실베이니아주 스프링 하우스 소재의 Institutional Animal Care and Use Committee of Janssen R & D에 의해 승인받았다.
B219xCW6 Mabtyrin 처리는 종양발생을 효과적으로 지연시키고, 이식된 HEK293-PSMA 세포의 종양 성장을 억제하였다(도 18). 작지만 촉진가능한 HEK293-PSMA 종양이 연구 일수 16(마지막 치료적 처리 후 6일째)에 PBS 처리군에서 8 마리의 마우스 중 7 마리에서 검출가능하였으며, 한편 0.4 mg/㎏ CD3B250 처리군의 모든 8 마리의 마우스에는 종양이 없었다. 8 마리의 마우스 중 2 마리가 0.04 mg/㎏ B219xCW6 처리군에서 촉진가능한 종양을 가졌고, 8 마리의 마우스 중 1 마리가 0.004 mg/㎏ B219xCW6 군에서 작은 종양을 가졌다. 종양 성장 억제를 치료 중단 후 32일째(종양 이식후 일수 42)에 평가하였는데, 이 시점에서도 여전히 군당 7 마리 또는 8 마리의 동물이 있었다. 고용량 B219xCW6(0.4 mg/㎏, n=8) 처리군에서의 종양 성장은 PBS-처리 대조군 대비 85%로 억제되었다(p<0.001). B219xCW6의 중간 용량(0.04 mg/㎏)은 PBS 대조군 대비 통계학적으로 유의한 방식으로 종양 성장을 억제하였다(TGI=67%, n=7)(p< 0.0001). 마지막으로, B219xCW6의 최저 용량, 0.004 mg/㎏은 또한 대조군 PBS 처리된 종양과 대비하여 HEK293-PSMA 종양 성장을 78%로 억제하는 데 효능이 있다(p<0.0001).
PBMC를 제공받은 동물군은 진행성 GVHD에 결국 굴복하지만, 체중 손실은 본 연구에서 약간 일어났다(도 19). 1 ug B219xCW6 군 내의 단지 1 마리의 마우스만이 상당한 체중을 가졌고, 일수 30에서 GVHD에 굴복하였다. 일수 42까지, PBS 처리군에서의 종양의 대부분은 1500 ㎣ 종양 부피 종점을 초과하였으며, 이 시점에서 연구를 종료하였다.
서열
서열 번호 1= 원래의 텐콘 서열
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
서열 번호 2= TCL1 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7-12PLSAEFTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7은 임의의 아미노산이고; X8, X9, X10, X11 및 X12는 임의의 아미노산이거나 결실된다.
서열 번호 3= TCL2 라이브러리
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT; 상기 식에서, X1은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X2는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X3은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X4는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X5는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X6은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X7은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고; X8은 Asp, Glu 또는 Thr이고; X9는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X10은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X11은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X12는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X13은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X14는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고; X15는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
서열 번호 4= 안정화된 텐콘
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
서열 번호 5= TCL7(FG 및 BC 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT; X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 및 X16은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; X7, X8, X9, X17, X18 및 X19는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.
서열 번호 6= TCL9 (FG 루프)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10X11X12SNPLSAIFTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고; X8, X9, X10, X11 및 X12는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.
서열 번호 7= TCL14 라이브러리 LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12 및 X13은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이다.
서열 번호 8= TCL24 라이브러리
TCL24 라이브러리(서열 번호 8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT; 상기 식에서, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16 및 X17은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, Y 또는 W이다.
서열 번호 9 = Sloning-FOR
GTGACACGGCGGTTAGAAC
서열 번호 10 = Sloning-REV
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
서열 번호 11 = POP2250
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
서열 번호 12 = DigLigRev
CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
서열 번호 13 = BC9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 14 = BC8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 15 = BC7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 16 = BC6
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
서열 번호 17 = 130mer-L17A
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTG
서열 번호 18 = POP222ext
CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC
서열 번호 19 = LS1114
CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
서열 번호 20 = LS1115
CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG
서열 번호 21 = LS1117
CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
서열 번호 22 = SDG10
CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT
서열 번호 23 = SDG24
GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG
서열 번호 24 = POP2222
CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
서열 번호 25 = SDG28
AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAGAC
서열 번호 26 = FG12
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 27 = FG11
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 28 = FG10
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 29 = FG9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 30 = FG8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 31 = FG7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
서열 번호 32 = PSMW1 (N'-AviTag-HisTag-GS-사이노 PSMA_ECD)
KSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA
서열 번호 33 = PSMW8 (N'-AviTag-HisTag-GS-침프 PSMA_ECD)
KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVLDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFTERLQDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGDVKRQISVAAFTVQAAAETLSEVA
서열 번호 34 헥사히스티딘 태그
HHHHHH
서열 번호 35 = P258AR6P1071_G03
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT
서열 번호 36 = P258AR6P1070_A05
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT
서열 번호 37 = P258AR6P1071_F04
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWVIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT
서열 번호 38 = P258AR6P1070_F09
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT
서열 번호 39 = P258AR6P1071_D02
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWAIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT
서열 번호 40 = P229CR5P819_H11
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSSNPLSAIFTT
서열 번호 41 = P233FR9_H10
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 42= P233FR9P1001_B5-5
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFTIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 43 = P233FR9P1001_H3-1
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFPIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYHVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 44 = P233FR9P1001_D9
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFPIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 45 = P234CR9_A07
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWGEQFTIFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGASGYEWFHAFGSSNPLSAIFTT
서열 번호 46 = P234CR9_H01
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWEWWVIPGDFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVVNSGQWNDTSNPLSAIFTT
서열 번호 47 = P233FR9_H10 (cterm cys) lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfaigywewdddgeaivltvpgsersydltglkpgteypvyiagv㎏gqwsfplsaifttc
서열 번호 48 = P233FR9_H10 (K62C)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLCPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 49 = P233FR9_H10 (E53C)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSCRSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 50 = P233FR9_H10 (R11C)
LPAPKNLVVSCVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT
서열 번호 51 = 비표적화된 FN3 도메인 (K62C)
LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTTGGHHHHHH
서열 번호 52 = 소르타제 A
MSHHHHHHSSGENLYFQSKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVEVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFVATEVK
서열 번호 53 = 태그 없는 소르타제 A
SKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVEVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFVATEVK
서열 번호 54 TEV 프로테아제 절단 부위
ENLYFQS
텐콘의 서열 번호 55 FG 루프
KGGHRSN
서열 번호 56 BC 루프
DIDEQRDW
서열 번호 57 BC 루프
TIDEQRDW
서열 번호 58 BC 루프
VIDEQRDW
서열 번호 59 BC 루프
AIDEQRDW
서열 번호 60 BC 루프
EWWVIPGD
서열 번호 61 BC 루프
GEQFTI
서열 번호 62 BC 루프
TAPDAA
서열 번호 63 C 루프
FDSFLIQYQE
서열 번호 64 C 루프
FESFLIQYQE
서열 번호 65 C 루프
FDSFAIGYWE
서열 번호 66 C 루프
FDSFPIGYWE
서열 번호 67 C 루프
FDSFTIGYWE
서열 번호 68 CD 루프
SEKVGE
서열 번호 69 CD 루프
WDDDGE
서열 번호 70 F 루프
TEYTVSIYGV
서열 번호 71 F 루프
TEYTVSIYG
서열 번호 72 F 루프
TEYPVYIAGV
서열 번호 73 F 루프
TEYWVYIAGV
서열 번호 74 F 루프
TEYHVYIAGV
서열 번호 75-140은 상기 표들에 있다
서열 번호 141 전장 사이노PSMA
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKY
>142 링커
AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA
>143 인간 PSMA ECD
KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
>144 신호 서열을 갖는 인간 FL PSMA
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
>145 테나신 C의 제3 FN3 도메인
DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT
>146 피브콘(Fibcon)
Ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyritytpsngpgepkeltvppsstsvtitgltpgveyvvslyalkdnqespplvgtqtt
>147 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT
>148
GSGS
>149
GGGSGGGS
>150
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
>151
APAP
>152
APAPAPAPAP
>153
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
>154
APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP
>155 알부민 변이체
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
>156 cDNA H10
CTGCCAGCCCCGAAGAATTTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAGGACTCTGCACGTCTGAGCTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTCGACAGCTTTGCAATCGGCTACTGGGAGTGGGATGATGACGGCGAGGCCATTGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACCGGTCTGAAGCCGGGTACGGAATATCCGGTGTATATTGCGGGCGTGAAGGGTGGCCAGTGGAGCTTCCCGCTGAGCGCGATCTTTACCACC
>157 cDNA P258AR6P1071_D02
CTGCCGGCTCCGAAAAACCTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAAGATTCTGCACGCTTGAGCTGGGCGATCGACGAGCAGCGTGACTGGTTTGAGAGCTTCCTGATTCAGTATCAAGAATCGGAAAAAGTTGGCGAGGCCATCGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTATGATCTGACGGGTCTGAAGCCAGGCACCGAGTATACGGTGAGCATTTACGGTGTCTACCATGTGTACCGTAGCAATCCGCTGAGCGCGATCTTCACCACC
>158 cDNA
P233FR9P1001_H3-1
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>159 PSMA 에피토프
KKSPSPEFSGMPRISK
>160 PSMA 에피토프
NWETNKF
>161 SP34 경쇄
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>162 SP34 중쇄
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>170. B219 경쇄
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>171. B219 중쇄
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>172. CW5 C-말단 FN3 도메인 FC 융합체
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>173. CW6 N-말단 FN3 도메인 FC 융합
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>174. B221 중쇄
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>175
GGGGSGGGGS
>176 G11 mAb 중쇄
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVSG INGGGGSKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKTS AQRFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
>177 G11 mAb 경쇄
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSLPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
>178 CD3B94 mAb 중쇄
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARDP ARLYSYYFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFLLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
>179 CD3B94 mAb 경쇄
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFN
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. JACOBS, STEVEN KLEIN, DONNA O'NEIL, KARYN DIEM, MICHAEL HYUN, LINUS GOLDBERG, SHALOM CARDOSO, ROSA SPINKA-DOMS, TRACY MOONEY, JILL ANDERSON, GLENN MARK LUISTRO, LEOPOLDO <120> PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> JBI5066WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2016-05-06 <150> 62/157,789 <151> 2015-05-06 <160> 179 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(86) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(86) <223> This region may encompass 7-12 residues <400> 2 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 90 <210> 3 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(27) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Phe, Ile, Leu, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Asp, Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(79) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(82) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <400> 3 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Xaa Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu 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Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <400> 7 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 8 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(41) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <400> 8 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu Xaa 35 40 45 Val Pro Gly Ser 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(198)..(224) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 13 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttygac tctttcctga 240 tccagtacca ggaatctgaa aaagttggtg aagcgatcaa cctgaccgtt ccgggttctg 300 aacgttctta cgacctgacc ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg 360 gtgttcttag aagcttccca aaggc 385 <210> 14 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(221) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 14 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttygactct ttcctgatcc 240 agtaccagga atctgaaaaa gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac 300 gttcttacga cctgaccggt ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg 360 ttcttagaag cttcccaaag gc 382 <210> 15 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(218) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 15 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ygactctttc ctgatccagt 240 accaggaatc tgaaaaagtt ggtgaagcga tcaacctgac cgttccgggt tctgaacgtt 300 cttacgacct gaccggtctg aaaccgggta ccgaatacac cgtttctatc tacggtgttc 360 ttagaagctt cccaaaggc 379 <210> 16 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(215) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnttyga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatca acctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttctta 360 gaagcttccc aaaggc 376 <210> 17 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cggcggttag aacgcggcta caattaatac ataaccccat ccccctgttg acaattaatc 60 atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacaggat 120 ctaccatgct g 131 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccaagacaga cgggcagagt cttcggtaac gcgagaaaca accaggtttt tcggcgccgg 60 cagcatggta gatcctgttt c 81 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccgaagactc tgcccgtctg tcttgg 26 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 cagtggtctc acggattcct ggtactggat caggaaagag tcgaa 45 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 catgcggtct cttccgaaaa agttggtgaa gcgatcgtcc tgaccgttcc gggt 54 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ggtggtgaag atcgcagaca gcgggttag 29 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cggcggttag aacgcggcta c 21 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 aagatcagtt gcggccgcta gactagaacc gctgccaccg ccggtggtga agatcgcaga 60 c 61 <210> 26 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(392) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 26 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntctaaccc gctgtctgcg atcttcacca 420 ccggcggtca ccatcaccat caccatggca gcggttctag tctagcggcc gcaactgatc 480 ttggc 485 <210> 27 <211> 482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(389) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 27 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt ctaacccgct gtctgcgatc ttcaccaccg 420 gcggtcacca tcaccatcac catggcagcg gttctagtct agcggccgca actgatcttg 480 gc 482 <210> 28 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(386) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 28 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntcta acccgctgtc tgcgatcttc accaccggcg 420 gtcaccatca ccatcaccat ggcagcggtt ctagtctagc ggccgcaact gatcttggc 479 <210> 29 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(383) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 29 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntctaacc cgctgtctgc gatcttcacc accggcggtc 420 accatcacca tcaccatggc agcggttcta gtctagcggc cgcaactgat cttggc 476 <210> 30 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(380) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 30 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tctaacccgc tgtctgcgat cttcaccacc ggcggtcacc 420 atcaccatca ccatggcagc ggttctagtc tagcggccgc aactgatctt ggc 473 <210> 31 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(377) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 31 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnntct aacccgctgt ctgcgatctt caccaccggc ggtcaccatc 420 accatcacca tggcagcggt tctagtctag cggccgcaac tgatcttggc 470 <210> 32 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Lys Ser Ser Ser Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys 1 5 10 15 Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu His 20 25 30 Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln 35 40 45 Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser 50 55 60 Val Glu Leu Thr His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr 65 70 75 80 His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe 85 90 95 Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser 100 105 110 Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu 115 120 125 Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys 130 135 140 Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala 145 150 155 160 Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu 165 170 175 Ala Gly Ala Thr Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Asp Asp 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Glu Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Ala Tyr 65 70 75 80 Arg Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 85 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Glu Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Val Ala 65 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Ala Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Asp Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Val Tyr 65 70 75 80 Arg Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 94 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Arg Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 139 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Thr 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 140 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 140 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Tyr 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala 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Synthetic polypeptide <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 164 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 164 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 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10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Ala Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Pro Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp 65 70 75 80 Ser Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 100 105 110 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 115 120 125 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 130 135 140 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 145 150 155 160 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 165 170 175 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 180 185 190 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 195 200 205 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 210 215 220 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 225 230 235 240 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 245 250 255 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 260 265 270 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 275 280 285 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 290 295 300 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320 Gly Lys <210> 174 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 174 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Leu 450 455 460 Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser Ala 465 470 475 480 Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala Ile 485 490 495 Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr Val 500 505 510 Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly Thr 515 520 525 Glu Tyr Pro Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser Phe 530 535 540 Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 545 550 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 176 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 176 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Ser Ala Gln Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 177 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 177 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 178 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 178 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 179 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 179 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn 210

Claims (46)

  1. a. FN3 도메인;
    b. 경쇄(LC); 및
    c. 중쇄(HC)를 포함하며,
    상기 FN3 도메인은 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 부위를 형성하고, 상기 HC와 상기 LC가 쌍을 이루어서 CD3과 면역특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 부위를 형성하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PSMA는 서열 번호 144를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PSMA는 서열 번호 144인, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 마카카 파스키쿨라리스(Macaca fascicularis) PSMA 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) PSMA와 교차-반응하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 마카카 파스키쿨라리스 PSMA는 서열 번호 32를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 판 트로글로디테스는 서열 번호 33을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    a) 상기 FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘(Tencon) 서열 또는 서열 번호 4의 텐콘27 서열에 기초하며, 상기 서열 번호 1 또는 서열 번호 4는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 및/또는 86에서 치환을 선택적으로 갖거나; 또는
    b) 상기 FN3 도메인은 서열 번호 2, 3, 5, 6, 7, 또는 8의 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호 1의 잔기 위치 6, 11, 22, 25, 26, 52, 53, 62에 상응하는 적어도 하나의 잔기 위치에서, 또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 갖는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형(isotype)을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, IgG4 동종형을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 인간 PSMA 효소 활성을 억제하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호 41을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호 41인, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 인간 PSMA의 에피토프 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 및 NWETNKF(서열 번호 160)에 결합하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 적어도 89% 동일하거나, 또는 서열 번호 41의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FN3 도메인의 N-말단에 메티오닌을 추가로 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  17. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 하기를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 40의 아미노산 서열;
    b. 서열 번호 35의 아미노산 서열;
    c. 서열 번호 36의 아미노산 서열;
    d. 서열 번호 37의 아미노산 서열;
    e. 서열 번호 38의 아미노산 서열;
    f. 서열 번호 39의 아미노산 서열;
    g. 서열 번호 46의 아미노산 서열;
    h. 서열 번호 45의 아미노산 서열;
    i. 서열 번호 41의 아미노산 서열;
    j. 서열 번호 44의 아미노산 서열;
    k. 서열 번호 42의 아미노산 서열; 또는
    l. 서열 번호 43의 아미노산 서열.
  18. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 하기를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 47의 아미노산 서열;
    b. 서열 번호 51의 아미노산 서열;
    c. 서열 번호 50의 아미노산 서열; 또는
    d. 서열 번호 49의 아미노산 서열.
  19. 제1항에 있어서, 상기 FN3 도메인은 하기를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 75의 아미노산 서열;
    b. 서열 번호 76의 아미노산 서열;
    c. 서열 번호 77의 아미노산 서열;
    d. 서열 번호 78의 아미노산 서열;
    e. 서열 번호 79의 아미노산 서열;
    f. 서열 번호 80의 아미노산 서열;
    g. 서열 번호 81의 아미노산 서열;
    h. 서열 번호 82의 아미노산 서열;
    i. 서열 번호 83의 아미노산 서열;
    j. 서열 번호 84의 아미노산 서열;
    k. 서열 번호 85의 아미노산 서열;
    l. 서열 번호 88의 아미노산 서열;
    m. 서열 번호 87의 아미노산 서열;
    n. 서열 번호 88의 아미노산 서열;
    o. 서열 번호 89의 아미노산 서열;
    p. 서열 번호 90의 아미노산 서열;
    q. 서열 번호 91의 아미노산 서열;
    r. 서열 번호 92의 아미노산 서열;
    s. 서열 번호 93의 아미노산 서열;
    t. 서열 번호 94의 아미노산 서열;
    u. 서열 번호 95의 아미노산 서열;
    v. 서열 번호 96의 아미노산 서열;
    w. 서열 번호 97의 아미노산 서열;
    x. 서열 번호 98의 아미노산 서열;
    y. 서열 번호 99의 아미노산 서열;
    z. 서열 번호 100의 아미노산 서열;
    aa. 서열 번호 101의 아미노산 서열;
    bb. 서열 번호 102의 아미노산 서열;
    cc. 서열 번호 103의 아미노산 서열;
    dd. 서열 번호 104의 아미노산 서열;
    ee. 서열 번호 105의 아미노산 서열;
    ff. 서열 번호 106의 아미노산 서열;
    gg. 서열 번호 107의 아미노산 서열;
    hh. 서열 번호 108의 아미노산 서열;
    ii. 서열 번호 109의 아미노산 서열;
    jj. 서열 번호 110의 아미노산 서열;
    kk. 서열 번호 111의 아미노산 서열;
    ll. 서열 번호 112의 아미노산 서열;
    mm. 서열 번호 113의 아미노산 서열;
    nn. 서열 번호 114의 아미노산 서열;
    oo. 서열 번호 115의 아미노산 서열;
    pp. 서열 번호 116의 아미노산 서열;
    qq. 서열 번호 117의 아미노산 서열;
    rr. 서열 번호 118의 아미노산 서열;
    ss. 서열 번호 119의 아미노산 서열;
    tt. 서열 번호 120의 아미노산 서열;
    uu. 서열 번호 121의 아미노산 서열;
    vv. 서열 번호 122의 아미노산 서열;
    ww. 서열 번호 123의 아미노산 서열;
    xx. 서열 번호 124의 아미노산 서열;
    yy. 서열 번호 125의 아미노산 서열;
    zz. 서열 번호 126의 아미노산 서열;
    aaa. 서열 번호 127의 아미노산 서열;
    bbb. 서열 번호 128의 아미노산 서열;
    ccc. 서열 번호 129의 아미노산 서열;
    ddd. 서열 번호 130의 아미노산 서열;
    eee. 서열 번호 131의 아미노산 서열;
    fff. 서열 번호 132의 아미노산 서열;
    ggg. 서열 번호 133의 아미노산 서열;
    hhh. 서열 번호 134의 아미노산 서열;
    iii. 서열 번호 135의 아미노산 서열;
    jjj. 서열 번호 136의 아미노산 서열;
    kkk. 서열 번호 137의 아미노산 서열;
    lll. 서열 번호 138의 아미노산 서열;
    mmm. 서열 번호 139의 아미노산 서열; 또는
    nnn. 서열 번호 140의 아미노산 서열.
  20. 제1항에 있어서, 상기 LC는 하기를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 167의 아미노산 서열;
    b. 서열 번호 168의 아미노산 서열; 또는
    c. 서열 번호 169의 아미노산 서열.
  21. 제1항에 있어서, 상기 HC는 하기를 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편:
    a. 서열 번호 163의 아미노산 서열;
    b. 서열 번호 164의 아미노산 서열;
    c. 서열 번호 165의 아미노산 서열; 또는
    d. 서열 번호 166의 아미노산 서열.
  22. 제1항에 있어서,
    a. 상기 HC는 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b. HC는 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하거나;
    c. HC는 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하거나;
    d. HC는 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하거나;
    e. HC는 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하거나;
    g. HC는 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하거나;
    h. HC는 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하거나;
    i. HC는 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하거나;
    j. HC는 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하거나;
    k. HC는 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하거나;
    l. HC는 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하거나;
    f. HC는 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    g. HC는 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고 상기 LC는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  23. PSMA-과발현 암(PSMA-overexpressing cancer)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 상기 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. PSMA-과발현 암 세포의 성장 또는 증식의 억제를 필요로 하는 대상체에서 PSMA-과발현 암 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위한 방법으로서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. T 세포의 PSMA-과발현 암 세포로의 방향전환(redirecting)을 필요로 하는 대상체에서 T 세포를 PSMA-과발현 암 세포로 방향전환시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제23항, 제24항, 또는 제25항에 있어서, 상기 암은 고형 종양인, 방법.
  27. 제23항, 제24항, 또는 제25항에 있어서, 상기 암은 신생혈관성 장애인, 방법.
  28. 제23항, 제24항, 또는 제25항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 결직장암, 위암, 투명 세포 신장 암종(clear cell renal carcinoma), 방광암, 폐암, 편평 세포 암종, 교종, 유방암 또는 신장암인, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 암은 전립선암인, 방법.
  30. 제23항, 제24항, 또는 제25항에 있어서, 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 치료제는 화학치료제 또는 표적화된 항암 요법인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 화학치료제 또는 표적화된 항암 요법은 아비라테론 아세테이트(Abiraterone Acetate)(자이티가(Zytiga)), 바이칼루타미드(Bicalutamide), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 카소덱스(Casodex)(바이칼루타미드), 데가렐릭스(Degarelix), 도세탁셀(Docetaxel), 엔잘루타미드(Enzalutamide), 고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate), 제브타나(Jevtana)(카바지탁셀), 류프롤라이드 아세테이트(Leuprolide Acetate), 루프론(Lupron)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포(Lupron Depot)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-3개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-4개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-페드(Ped)(류프롤라이드 아세테이트), 미톡산트론 하이드로클로라이드(Mitoxantrone Hydrochloride), 프레드니손(Prednisone), 프로벤지(Provenge)(시풀류셀(Sipuleucel)-T), 라듐 223 다이클로라이드, 시풀류셀-T, 탁소테레(Taxotere)(도세탁셀), 비아두르(Viadur)(류프롤라이드 아세테이트), 조피고(Xofigo)(라듐 223 다이클로라이드), 엑스탄디(Xtandi)(엔잘루타미드) 또는 졸라덱스(Zoladex)(고세렐린 아세테이트)인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제는 상기 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편과 동시에, 순차적으로, 또는 별개로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 및 그에 대한 패키징을 포함하는, 키트.
  36. a. 중쇄;
    b. FN3 도메인;
    c. 링커를 포함하는, 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 상기 중쇄 Fc 영역은 IgG4 PAA인, 융합 단백질.
  38. a. Fc 영역;
    b. FN3 도메인;
    c. 링커를 포함하는, 융합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 링커 및 FN3 도메인은 상기 Fc 영역의 아미노-말단에 부착되는, 융합 단백질.
  40. 제38항에 있어서, 상기 링커 및 FN3 도메인은 상기 Fc 영역의 카르복실-말단에 부착되는, 융합 단백질.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  42. 제1항에 있어서, 상기 중쇄는 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  43. 제1항에 있어서, 상기 중쇄는 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  44. 제1항에 있어서, 상기 중쇄는 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하고, FN3 도메인은 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편.
  45. 제43항 및 제44항의 단리된 CD3 × PSMA-이중특이성 항원-결합 분자 또는 그의 이중특이성 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  46. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는, 단리된 합성 폴리뉴클레오티드.
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