JP2022068193A - 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）二重特異性結合剤及びその使用 - Google Patents

前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）二重特異性結合剤及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】前立腺がん、及びＰＳＭＡを過剰発現するその他のがんを治療するための、更なる向上した医薬品を提供する。【解決手段】ａ．ＦＮ３ドメインと、ｂ．軽鎖（ＬＣ）と、ｃ．重鎖（ＨＣ）と、を含む、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子であって、前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記ＨＣと前記ＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを提供する。【選択図】なし

Description

(配列表)本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該
配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、
２０１６年５月３日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０６６ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ
であり、そのサイズは１９５，４３６バイトである。
本明細書に提供される本開示は、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合
しクラスター決定基３（ＣＤ３）に免疫特異的に結合する多重特異性薬剤、並びに当該記
載した薬剤の製造方法及び使用方法に関する。
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ又はＮ－アセチル化α－結合酸性ジペプチダ
ーゼＩとしても周知である前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、二量体のＩＩ型膜貫通糖
タンパク質である。ＰＳＭＡは、葉酸塩及びＮ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グル
タミン酸を含むいくつかの基質を開裂させ、また、前立腺内の多数の組織において最も高
発現し、小腸、中枢及び末梢神経系、腎臓、並びに肺内において多少発現する。ＰＳＭＡ
は、クラスリン被覆ピットを介して恒常的に内部移行される。
ＰＳＭＡは、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）内においてしばしば過剰発現する前立腺がん
関連細胞膜抗原であり、一部の前立腺細胞が異常に見え始めたり異常にふるまい始めたり
する状態であり、原発性及び転移性の前立腺がんであり、また、その他固体腫瘍（例えば
、乳がん、肺がん、膀胱がん、腎がん）の新生血管系である。ＰＳＭＡの発現は、疾患進
行及びグリーソンスコアと関連している。ＰＳＭＡの発現は、転移性疾患、ホルモン不応
性患者、及びより悪性度の高い病変において増加し、アンドロゲン不応性腫瘍内において
更に上方制御される。
前立腺がんは、男性におけるがん発病の主原因であり、また死につながるがんの２番目
の主原因である。世界的に、毎年約１，１００，０００件の新たな症例及び３００，００
０件の死亡数が存在し、換算すると、がんによる全死者数の約４％となる。男性の６人に
１人が当該疾患と診断されると推定されている。アメリカ合衆国内では、前立腺がんの９
０％超が局所又は領域ステージで発見されている。これら初期ステージにおける５年生存
率は、ほぼ１００％である。しかしながら、がんが転移した場合、５年生存率は約２８％
にまで低下する。
前立腺がんにおける現行の治療法としては、外科手術、放射線治療、並びにホルモン及
び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）療法が挙げられる。しかしながら、腫瘍細胞は多くの場合ア
ンドロゲン不応性となってしまい、これが起こると、残された治療の選択肢が限られるこ
とになる。一般的に、がんワクチンのシプリューセル－Ｔ、放射性医薬品（塩化ラジウム
－２２３など）、二次ホルモン療法（アビラテロン又はエンザルタミドなど）、及び／又
は化学療法（ドセタキセル及びカバジタキセル）が、ホルモン療法に続き順に追加される
。
これら治療剤のそれぞれは、がんの成長を数ヵ月間遅らせ、当該疾患により生じた症状
を緩和させることができるが、当該疾患は最終的にこれら治療剤に耐性を持つようになる
。
したがって、前立腺がん、及びＰＳＭＡを過剰発現するその他のがんを治療するための
、更なる向上した医薬品に対する要望は依然として存在している。
本明細書において、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する、単離された多重特異性抗
原結合分子（「ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性分子」）、又はその多重特異性抗原結合フラ
グメントが記載されている。一実施形態では、ＰＳＭＡに対して特異的に結合する、単離
された多重特異性分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態
では、結合するＰＳＭＡは、配列番号：１４４のアミノ酸配列を含む。
ＦＮ３ドメイン
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメン
トのＰＳＭＡ特異的ドメインは、ヒトＰＳＭＡに結合する。一部の実施形態では、多重特
異性又はその多重特異性抗原結合フラグメントのＰＳＭＡ特異的ドメインは、カニクイザ
ルＰＳＭＡ又はチンパンジーＰＳＭＡと交差反応する。好ましい実施形態では、ＣＤ３×
ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、ＣＤ３×
ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。一部
の実施形態では、単離された抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、
ａ）ＦＮ３ドメインと、ｂ）軽鎖（ＬＣ）と、ｃ）重鎖（ＨＣ）と、を含み、ＦＮ３ドメ
インは、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する第１の抗原結合部位を
形成し、ＨＣとＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成
し、又は、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン×そのＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントを
提供する。別の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその二重特
異性抗原結合フラグメントを発現する、単離された細胞を提供する。一部の実施形態では
、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの
ＦＮ３ドメイン（又は「ＰＳＭＡ特異性アーム」）は、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列
又は配列番号：４のＴｅｎｃｏｎ２７に由来し、配列番号：１又は配列番号：４は、残基
位置１１、１４、１７、３７、４６、７３及び／又は８６において置換を任意選択的に有
しており、あるいは、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載する配列番号：２、３、５、６
、７又は８の配列を含むライブラリから単離されている。これら配列を有するＦＮ３ドメ
インの例を、表１に列挙する。
Figure 2022068193000001
別の実施形態では、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重
特異性抗原結合フラグメントのＦＮ３ドメインは、表２に列挙する配列から選択してもよ
い。
Figure 2022068193000002
Figure 2022068193000003
Figure 2022068193000004
Figure 2022068193000005
別の実施形態では、配列番号：１４４のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する、単離された
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの単
離ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と８９％同一であるか、又は配列番
号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は
１１カ所の置換を有する、アミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、配列番号：１４４のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する、ＣＤ３×Ｐ
ＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＦＮ３ドメイ
ンは、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５
、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、
８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９
５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０
６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１
６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２
６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３
６、１３７、１３８、１３９又は１４０のアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質
本発明の別の実施形態は、重鎖と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タン
パク質である。重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡであってもよい。本発明の別の実施形
態は、Ｆｃ領域と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タンパク質である。リ
ンカー及びＦＮ３ドメインを、Ｆｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結させて
もよい。リンカーは、配列番号：１７５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含ん
でいてもよい。本発明の別の実施形態は、重鎖と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含
む、融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。重鎖Ｆｃ領域は
、ＩｇＧ４ ＰＡＡであってもよい。本発明の別の実施形態は、Ｆｃ領域と、ＦＮ３ドメ
インと、リンカーと、を含む、融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチ
ドである。リンカー及びＦＮ３ドメインを、Ｆｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端
に連結させてもよい。リンカーは、配列番号：１７５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ
酸配列を含んでいてもよい。本本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含
むベクターである。本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
ＣＤ３結合アーム
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗
原結合フラグメントのＣＤ３結合アーム（又は「ＣＤ３特異性アーム」）は、マウスモノ
クローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる（Ｋ．Ｒ．
Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．４５，３８３２～３８３９）。一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性
抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＣＤ３結合アームは、表３から
選択される１つのＶＨドメイン及び１つのＶＬドメインを含む。表３は、ＣＤ３特異性抗
体及び抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖の一部の例の概要を提供する。
Figure 2022068193000006
Figure 2022068193000007
一部の実施形態では、ＣＤ３特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、表４の重鎖と、
表４の軽鎖と、を含む。表４は、ＣＤ３特異性抗体及び抗原結合フラグメントの重鎖及び
軽鎖のマトリクスの概要を提供する。
Figure 2022068193000008
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３
、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列におい
て、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な
差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、
免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受
容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をも
たらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリ
ガーすることにより殺傷する。
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの
一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起
こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エ
フェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子へ
の結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、
ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は
補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ド
メイン中に位置する残基により決まる。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇ
Ｇ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフ
ェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ
、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下
した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対
する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）Ｆｃ
ｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗
体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、多
重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメン
トは、ＩｇＧ１又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アーム
が得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ
２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特
異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４又はその
誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性
ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、
Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アー
ムが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性
抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｉ
ｇＧ－ＡＡ Ｆｃである。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが
得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ－ＡＡ Ｆｃ－Ｌ２３４
Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ（ここで、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌは
変異である）である。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得ら
れるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞及び／又は初代カニ
クイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３
特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４
＋Ｔ細胞及び／又は初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
本明細書において、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原
結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物が更に提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７１
のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメイ
ンは、配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７１
のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメイ
ンは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７４
のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメイ
ンは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む。
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの
使用方法
記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグ
メントの使用方法もまた開示する。例えば、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又
はその二重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＰＳＭＡ過
剰発現疾患の治療に有用であり得る。一部の実施形態では、疾患は、がん、好ましくは、
ＰＳＭＡ過剰発現がんである。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ過剰発現疾患は、前立腺上
皮内腫瘍（ＰＩＮ）であり、また、一部の前立腺細胞が異常に見え始めたり異常にふるま
い始めたりする状態である。一部の実施形態では、がんは、原発性及び転移性の前立腺が
ん、並びに、その他固体腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、膀胱がん、腎がん）である。一
部の実施形態では、がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱が
ん、肺がん、子宮内膜がん、又は腎がんである。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ過剰発現
がんは、がん、例えば、口腔扁平上皮がん、神経膠腫、及び乳がんの血管新生又は脈管系
に関係している。
一部の実施形態では、がんは、血管新生疾患、例えば、固体腫瘍の増殖を特徴とするが
んである。ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とし、本発明による治療の対象となる、腫瘍の血管新
生を伴う例示的ながんとしては、例えば、腎明細胞がん（ＣＣＲＣＣ）、結腸直腸がん、
乳がん、膀胱がん、肺がん、及び膵がんが挙げられる（例えば、Ｂａｃｃａｌａ ｅｔ
ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ ７０：３８５．３９０，２００７（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ ＰＳＭＡ ｉｎ ＣＣＲＣＣ）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５
７：３６２９～３６３４，１９９７（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＳＭＡ ｉｎ ｖ
ａｒｉｏｕｓ ｎｏｎ－ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｒｅ
ｎａｌ，ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ，ｌｕｎｇ，ｃｏｌｏｎ，ｂｒｅａｓｔ，ａｎｄ ａｄｅ
ｎｏｃａｒｃｉｎａｏｍａ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ）、及びＭｉｌｏｗｓｋｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：５４０～５４７，２００７を参照のこと）
。
それを必要とする対象においてＰＳＭＡ過剰発現疾患を治療する記載する方法は、治療
的に有効な量の、記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
抗原結合フラグメントを、当該対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は
、哺乳類、好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態では、治療的に有効な量のＣＤ３
×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、それを
必要とする患者に、がんを治療するのに十分な時間投与することにより、ＰＳＭＡ過剰発
現がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
本明細書では、治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその
二重特異性抗原結合フラグメントを投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することによ
り、がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法を更に提供する。
また本明細書では、治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又は
その二重特異性抗原結合フラグメントを投与し、Ｔ細胞をがんへと再指向させることによ
り、Ｔ細胞をＰＳＭＡ発現がん細胞へと再指向させる方法を提供する。
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの
キット
本明細書では、開示するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
抗原結合フラグメント又はその二重特異性抗原結合フラグメントを含むキットについて記
載する。記載するキットを使用して、本明細書で提供するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗
原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に周知
のその他方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載するキットは、本明細書に
記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメ
ント、及びＰＳＭＡ発現がんの治療に用いる試薬を含んでいてもよい。そのため、記載す
るキットは、本明細書に記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重
特異性抗原結合フラグメント、使用しない際にＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子
又はその二重特異性抗原結合フラグメントを収容するための容器、及び／又は、単離され
たＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの
取扱説明書のうち１つ又は２つ以上を含んでいてもよい。
静注後の雄ＮＳＧマウスにおける、非標的８９Ｚｒ標識ＦＮ３ドメインの体内分布を示す図である。 カニクイザルＰＳＭＡ二量体と複合体を形成し、ＰＳＭＡ活性部位に近い領域に結合するＨ１０を示す、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０ ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン（Ｈ１０）の全体的な結晶構造を示す図である。亜鉛原子（Ｚｎ）は、ＰＳＭＡ活性部位の位置を示している。ＰＳＭＡ分子及びＨ１０分子のＮ末端及びＣ末端は、複合体の１つを示している。細胞膜に近い位置を示している。 カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成するＨ１０ ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す図である。Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン内のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧβストランドを示す。正に荷電したＰＳＭＡ活性部位の入口へと挿入された、Ｈ１０のＣＤループ内の負に荷電した残基（残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３）を示す。Ｈ１０残基の番号付けは、配列番号：４１に従う。 カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成するＨ１０ ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す図である。Ｈ１０接触残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３を図内に示す。Ｈ１０（Ｒ５１１、Ｋ５１４及びＫ５４５）と接触するか、亜鉛原子（Ｈ３７７、Ｄ３８７、Ｅ４２４、Ｅ４２５、Ｄ４５３及びＨ５５３）と配位結合するか、あるいは、活性部位のくぼみ（Ｒ５３６及びＲ５３４）を構成する、ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ（カニクイザルＰＳＭＡ）残基の一部を示す。Ｈ１０ βストランドＣ、Ｄ、Ｆ及びＧを図内に表示する。Ｈ１０残基及びカニクイザルＰＳＭＡ残基の番号付けはそれぞれ、配列番号：４１及び１４１に従う。 Ｈ１０ ＦＮ３ドメインとカニクイザルＰＳＭＡとの間の結合部位を示す結晶構造の拡大図である。Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン接触残基Ａ３２、Ｗ３６、Ｗ３８－Ｄ４１、Ｅ４３、Ａ４４、Ｖ４６、Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０、Ａ７２、Ｗ７９、Ｆ８１、Ｐ８２、Ａ８５、及びＩ８６を示す。ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ接触残基Ｙ４６０、Ｋ４９９－Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０、Ｗ５４１、Ｋ５４５、Ｆ５４６、Ｆ４８８、Ｋ６１０、Ｎ６１３及びＩ６１４を示す。Ｈ１０残基及びカニクイザルＰＳＭＡ残基の番号付けはそれぞれ、配列番号：４１及び１４１に従う。 Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン接触残基とカニクイザルＰＳＭＡ接触残基との間の相互作用マップを示す図である。４Åのカットオフ距離を用いて、接触残基を定義した。ＦＮ３ドメイン残基及びｃｙｎｏ ＰＳＭＡ残基をそれぞれ、グレーのボックス及び白色のボックスで示し、ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示し、かつ骨格原子を指している。残基の番号付けは、配列番号：４１（Ｈ１０）及び配列番号：１４１（ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ）に従う。 ヒト（ｈ）ＰＳＭＡ細胞外ドメインとカニクイザル（ｃ）ＰＳＭＡ細胞外ドメインとの間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。Ｈ１０接触残基には、下線及び太字を施してある。ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとの間で異なる残基には、陰を付けてある。Ｈ１０と相互作用する全てのｃｙｎｏ ＰＳＭＡ残基（Ｎ６１３を除く）は、ヒトＰＳＭＡに保存されている。ヒトＰＳＭＡ ＥＣＤ：配列番号：１４３。ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ ＥＣＤ：配列番号：３２。 カニクイザルＰＳＭＡと接触するＨ１０ ＦＮ３ドメイン残基を示す図である。接触残基には、下線及び太字を施してある。Ｈ１０アミノ酸配列を、配列番号：４１に示す。 Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン残基Ｎ６、Ｒ１１、Ｔ２２、Ｄ２５、Ａ２６、Ｓ５２、Ｅ５３及びＫ６２、並びにＮ末端及びＣ末端の位置を示す図である。これらは、カニクイザルＰＳＭＡに結合したＨ１０の結晶構造中における、化学的コンジュゲートが生じ得る部位である。ＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ接触領域を、黒で示す。Ｈ１０ βストランドＣ、Ｄ、Ｆ及びＧを図内に表示する。残基の番号付けは、配列番号：４１（Ｈ１０）に従う。 抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメイン（黒）及び抗ＰＳＭＡ抗体－ＰＥ（白）で染色した異なる腫瘍細胞株における、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を示す図である。 ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５－ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン－ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ－ＰＥ染色、ＣＤ４５－ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン－ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン－ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。 ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５－ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン－ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ－ＰＥ染色、ＣＤ４５－ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン－ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン－ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。２２Ｒｖ１細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。 ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５－ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン－ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ－ＰＥ染色、ＣＤ４５－ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン－ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン－ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＰＣ３細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。 ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５－ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン－ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ－ＰＥ染色、ＣＤ４５－ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン－ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン－ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＳＫＢＲ３細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。 連番を振ってあるＳＰ３４のアミノ酸配列を示す図である。ＡｂＭ定義におけるＣＤＲには下線を引いている。Ｓｅｒ２３０は、パパイン開裂Ｆａｂに存在する最後のＨＣ残基である。残基２３１～４５５は、ＩＧＨＧ３＿マウス（マウスＩｇＧ３、アイソフォーム２）からのものである。 図示したＶＬ／ＶＨ界面における重要な残基を有するＳＰ３４の可変ドメインを示す図である。（標識された）ＶＬ中の残基３８、４８、及び５１は、ＣＤＲ－Ｈ３と接触している。 ＶＨ（配列番号：２３３及び１８４～１８７、それぞれ表示順）及びＶＬ（配列番号：２３４及び１８８～１９０、それぞれ表示順）についての、ヒトフレームワーク適合（「ＨＦＡ」）変異体を示す図である。ナンバリングは、連番であり、ＡｂＭ定義におけるＣＤＲに下線を引いていて、ＳＰ３４とは異なる残基は太字で強調され、ＨＦＡ変異体における逆突然変異は、太字にし、下線を引いている。 ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体の初代ヒトＴ細胞への結合性を示す図である。 ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体の初代カニクイザルＴ細胞への結合性を示す図である。 ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体がインビトロにおいて初代ヒトＴ細胞を活性化することを示す図である。ネガティブコントロールを、白色で示し、ポジティブコントロールを、黒色で示す。 ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体がインビトロにおいて初代カニクイザルＴ細胞を活性化することを示す図である。ネガティブコントロールを、白色で示し、ポジティブコントロールを、黒色で示す。 ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体による結合性と活性化との相関を示す図である。ヒト（図１５Ａ）及びカニクイザル（図１５Ｂ）についての、平均結合性の値及びＣＤ６９の平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）の値を互いに対してプロットした。 ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子構築物の設計を示す図である。 ＰＳＭＡ＋ＬＮＣＡＰ細胞の、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子における、Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイの結果を示す図である。 ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスのＢ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎを用いて治療した、ＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ異種移植片の腫瘍化抑制を示す図である。ＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞を有するＰＢＭＣヒト化マウスに対して、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇでＢ２１９×ＣＷ６の静脈投与を行った（投与を矢印で示す）。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。 Ｂ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎを用いて治療した、ＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ異種移植片を有するＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスの体重を示す図である。ＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞を有するＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスに対して、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇでＢ２１９×ＣＷ６の静脈投与を行った（投与を矢印で示す）。群の平均として提示された体重を、ｇ±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用され
る。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意
味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される
定義と一致する様式で解釈されるものとする。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａ
ｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象
を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞
の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」
という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に
、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明
細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わ
す全ての数字は、「約」という用語により、全ての事例において修飾されていると理解さ
れたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の
範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得られるのが求められる所望の特性に
応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等
論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数
字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきで
ある。
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例
中で説明された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測
定において見出される標準偏差を必然的に生じる、一定の誤差を本質的に含有する。
「単離された」は、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、こ
れらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外
ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成
され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」さ
れている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及び
タンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部で
あることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一
部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発
現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含
する。本明細書で使用されるとき、「単離された」ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合
分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントとは、異なる抗原特異性を有する、その他
のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを
実質的に含まない、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特
異性抗原結合フラグメントについて言及することを意味している。
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と
呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポ
リリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド
」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本
鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及び
ＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び
二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポ
リヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領
域を意味する。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又は
ＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも
含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含
む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチ
ド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾
された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包
含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオ
チドと呼ばれる）も包含する。
「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。天
然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存
在するために、幾らかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又
は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるで
あろう。ただし、固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）にはほとんど影響しない
か、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ
酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク
質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「
実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好まし
くは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、
少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましく
は、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ま
しくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より
好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、
より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一
性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の
同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間
の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有さ
れる同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の
総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２
つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ
ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４，１１～１７
（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧ
Ｎプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テー
ブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つ
のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４～４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決
定されてもよい。
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生
じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい
。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又
は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原
結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味す
る。
「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメント
を操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイ
ルスのことである。
「クローン」は、有糸分裂により、単一の細胞又は共通する祖先から得られる細胞集団
である。「細胞株」は、多くの世代の間、インビトロにおいて安定して増殖させることが
できる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞を
ＤＮＡでトランスフェクションすることにより、形質転換される。
「発現する」及び「生成する」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺
伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。ま
た、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全て
の天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発
現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよ
い。
「治療すること」又は「治療」という用語は、損傷、病態、又は病状の減弱又は改善に
おける、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、症状の寛解、緩解、減少、病状
を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は減退速度を遅くすること、変性
による最終的な衰弱を和らげること、患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、ある
いは生存期間の長さを延ばすことなどの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。
治療は、客観的又は主観的なパラメータにより評価されてもよい。同パラメータには、身
体的検査、神経学的検査、又は精神医学評価の結果が挙げられる。
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、必要とされる用量及び期間において、所望の
治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重
特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、個々の病態、年齢、性
別及び体重などの因子、及び個々における望む応答を引き出す抗体の能力に従って種々で
あってよい。治療的に有効な量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害作用より
、治療的に有益な作用が上回る量でもある。
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を意味し、種々の単量体、多量体、及びキメ
ラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプ
チド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される
。
抗原結合フラグメントは、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る、任意のタンパク
質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペ
プチド合成、及び組換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメント
は、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成される
。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少
なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若し
くは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボ
ディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、
一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはＣＤＲと他のタ
ンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しくは二
量体、軽鎖単量体若しくは二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、Ｖ
Ｈ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７
８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２
つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的に
なるＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦ
ｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になりドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ
ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ．；２１（１１）
：４８４～９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１
，５４４～５４６（１９８９））、ラクダ若しくはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａ
ｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ．；５（１）：１
１１～２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）等が挙げられるが、これらに限定さ
れない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されても
よい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与す
る方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非抗体タンパク質性フレームワ
ーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、
組換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂により
生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、所与の抗原結
合フラグメントがこの表現において言及された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメ
ントを組み込むことを示すのに使用されてもよい。２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメ
ントの文脈において本明細書で使用される場合、「～と競合する」又は「～と交差競合す
る」という用語は、２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントが結合において競合するこ
とを示す。抗体又は抗原結合フラグメントのいくつかのペアについて、一方の抗体がプレ
ート上にコートされ、他方が競合させるために使用される場合、また、その逆の場合、実
施例のアッセイにおいて競合又はブロックのみが観察される。文脈において別段に定義さ
れるか、又は否定されない限り、本明細書で使用されるとき、「～と競合する」又は「～
と交差競合する」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントのこのようなペアに及ぶ
ことも意図している。
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を
意味する。エピトープは、通常、分子の表面グルーピング、例えば、アミノ酸又は糖側鎖
からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の荷電特性を有する。構造的及び非構
造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するとい
う点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与
しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的にブロ
ックされるか、又は覆われるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に
結合するペプチドのフットプリント内にある）とを含んでもよい。
抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「免疫特異的な結合」又は
それらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによ
りコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子に優
先的に結合することなく、対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合
することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッ
セイにより測定された場合、約１×１０－８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する
。「［抗原］特異性」抗体（例えば、ＣＤ３特異性抗体）等の表現は、列挙された抗体が
列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
本明細書で使用される用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３
ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイ
ン受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質においてしばしば存在するドメインを意味
する（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８９：８９９０～８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０～１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９～１５６６５，１９９０）。例示的
なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、ヒト
フィブロネクチン（ＦＮ）に存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特
許第８，２７８，４１９号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ
３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称で呼ばれ、例えばテネイシンの３番目の
ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０
）と呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、「センチリン（Centyrin）」は、ヒトテネイシンＣに存在
する異なる１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくＦＮ３ドメインを意味す
る。
本明細書で使用される用語「置換する」、又は「置換した」、又は「変異する」、又は
「変異した」は、その配列の変異体を生成するために、ポリペプチド又はポリヌクレオチ
ドの配列に１つ又は２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変化させること、欠失させる
こと、又は挿入することを指す。
本明細書で使用される用語「無作為化する」、又は「無作為化した」、又は「多様化し
た」、又は「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少なくとも１つ
の置換、挿入、又は欠失を作製することを指す。
本明細書で使用する場合、「変種」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、置換、挿入
、又は欠失によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプ
チド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約１×１０－
６Ｍ若しくはそれより低い、例えば約１×１０－７Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０
－８Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０－９Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０－１
０Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０－１１Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０－１
２Ｍ若しくはそれより低い、又は約１×１０－１３Ｍ若しくはそれより低い解離定数（Ｋ
Ｄ）で、本発明のＦＮ３ドメインが既定の抗原に結合する能力を指す。典型的に、本発明
のＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を
用いる表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又は
カゼイン）に対するそのＫＤより少なくとも１０倍低いＫＤで既定の抗原（すなわち、ヒ
トＰＳＭＡ）に結合する。しかしながら、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する本発明の単離
されたＦＮ３ドメインは、他の関連抗原、例えば、他の種由来の同じ既定の抗原（ホモロ
グ）、例えば、Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又
はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）に対して交差反応性を有し得る。
用語「ライブラリ」は、変種のコレクションを指す。ライブラリは、ポリペプチド又は
ポリヌクレオチド変種で構成され得る。
本明細書で使用される用語「安定性」は、例えばヒトＰＳＭＡなどの既定の抗原に対す
る結合などの、その正常な機能活性のうちの少なくとも１つを保持するように、生理学的
条件下で分子が折り畳み状態を維持できること指す。
本明細書で使用されるとき、ヒトＰＳＭＡは、短い細胞内ドメイン（１～１８残基）、
膜貫通ドメイン（１９～４３残基）、及び細胞外ドメイン（４４～７５０残基）を有する
約１００ｋＤの周知のＩＩ型糖タンパク質を指す。成熟ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列は、
配列番号：１４４に示される。
本明細書で互換的に使用される「過剰発現する」、「過剰発現された」、及び「過剰発
現している」は、同じ組織タイプの正常細胞と比較して表面上に測定可能な高レベルのＰ
ＳＭＡを有するがん細胞又は悪性細胞を指す。そのような過剰発現は、遺伝子増幅、又は
転写若しくは翻訳の増加によって、引き起こされ得る。ＰＳＭＡ過剰発現は、周知のアッ
セイを用いて、例えば生存細胞又は溶解細胞におけるＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイ
トメトリー、又はラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。あるいは又は加
えて、ＰＳＭＡ核酸分子のレベルは、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
、サザンブロッティング、又はＰＣＲ技術を用いて細胞中で測定され得る。ＰＳＭＡは、
正常細胞と比較して、細胞表面上のＰＳＭＡのレベルが少なくとも１．５倍高いとき、過
剰発現されている。
本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号：１に示され、米国特許出願公開
第２０１０／０２１６７０８号に記述される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインを指す。
本明細書で使用される「がん細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、及び
組織培養のいずれかにおいて、新しい遺伝材料の取り込みを必ずしも伴わない自発的又は
人為的な表現型の変化を有するがん様、前がん様、又は形質転換細胞を指す。形質転換は
、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込
みにより発生し得るが、自然に又は発がん物質に対する暴露後にも発生して、それによっ
て内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／がんは、例えば、インビトロ、インビボ、
及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、
増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主
における腫瘍の増殖又は抑制等によって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。
「増殖を阻害する」（例えば、腫瘍細胞などの細胞に言及する場合）は、当業者に周知
の適切な対照条件で増殖された同一の細胞の増殖と比較して、治療薬又は治療薬若しくは
薬剤の組み合わせと接触されるときのインビトロ又はインビボでの細胞増殖における測定
可能な減少を指す。インビトロ又はインビボでの細胞の増殖の阻害は、少なくとも約１０
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、又は
１００％であり得る。細胞増殖の阻害は、種々の機構、例えば、アポトーシス、壊死、細
胞増殖の阻害、又は細胞溶解により生じ得る。
用語「ベクター」は、生物系の内部で複製され得る、又はこうした系の間を移動するこ
とができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系
においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、
ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。そのような生
物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする生物
学的要素を利用して再構成された生物系が挙げられる。ベクターを構成するポリヌクレオ
チドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコ
ードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用
することができるベクターを意味する。
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプ
チドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のア
ミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
本明細書で使用される「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記され
た数存在することを指す。そのため、用語「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」
はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在
することを指す。
本明細書で使用する場合、「～と組み合わせて」という用語は、２つ又は３つ以上の治
療薬が、対象に混合物の状態で一緒に、それぞれ単独の薬剤として同時に、又はそれぞれ
単独の薬剤として任意の順番で順次に投与できることを意味する。
「相乗」、「相乗作用」又は「相乗的な」は、組み合わせることで得られると予想され
る相加効果を超えることを意味する。
本明細書で使用されるとき、「ｋｄ」（秒－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互
作用の解離速度定数を意味する。値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、「ｋａ」（Ｍ－１秒－１）という用語は、特定の抗体－抗
原相互作用の会合速度定数を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用
の解離平衡定数を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ＫＡ」（Ｍ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互
作用の会合平衡定数を意味し、ｋａをｋｄで割ることにより得られる。
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳
類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、
ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態にお
いて、対象はヒトである。
本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から単離された、類似す
る流体、細胞、又は組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む
生検）の収集物、並びに対象内に存在する流体、細胞、又は組織を意味する。一部の実施
形態では、サンプルは、体液である。体液は、典型的には、生理学的温度において液体で
あり、対象又は生物学的ソース中に存在し、これらから採取され、これらから外に出され
、又は他の方法で抽出された自然発生する流体を含んでもよい。特定の組織、臓器、又は
局所的な領域から得られた特定の体液及び特定の他の体液は、対象又は生物学的ソースに
おいて、より全体的に又は全身的に適していてもよい。体液の例には、血液、血清及び漿
膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞、痰、分泌組織及び臓器の粘膜分泌物、
膣分泌物、腹水液、例えば、非固体腫瘍に関連するもの、肋膜、心膜、腹膜、腹部及び他
の体腔の流体、気管支洗浄により収集された流体等が挙げられる。体液はまた、対象又は
生物学的ソースと接触した溶液、例えば、細胞又は臓器順化培地を含む細胞及び臓器培養
培地、洗浄液等を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は
、対象から取り出された材料又は対象中に存在する材料を包含する。
「ＣＤ３」という用語は、ヒトＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体を意味する
。ＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体は、６つの区別できるポリペプチド鎖から
構成される。これらは、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖
（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０
７７６６）、及び１つのＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ２０９６３）を含
み、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖と会合する。「ＣＤ３」という用語は、特に断らない限り、
細胞（Ｔ細胞を含む）により本来発現されているか、又はそれらのポリペプチドをコード
する遺伝子若しくはｃＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞上に発現され得る任
意のＣＤ３変異体、アイソフォーム、及び種間ホモログを含む。
「ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメント
」は、多重特異性分子であり、任意選択的に、ＦＮ３ドメインと、軽鎖（ＬＣ）と、重鎖
（ＨＣ）と、を含む、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原であって、ＦＮ３ドメインは、ヒ
ト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、Ｈ
ＣとＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、ＣＤ
３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは
、２つの異なる抗原結合領域を含み、一方の抗原結合領域は、抗原ＰＭＳＡに特異的に結
合し、もう一方の抗原結合領域は、ＣＤ３に特異的に結合する。多重特異性抗体は、二重
特異性抗体、ディアボディ、又は類似する分子であり得る（ディアボディの説明について
は、例えば、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０（１４），６４４４～８（１９９３）を参照のこと
）。
「参照サンプル」は、別のサンプル、例えば、試験サンプルに対して比較され、比較さ
れたサンプルの特徴を決定することができるサンプルである。参照サンプルは、試験サン
プルとの比較の基礎として機能する、いくつかの特徴付けられた特性を有するであろう。
例えば、参照サンプルは、がんを有する対象を示すＰＳＭＡレベルについてのベンチマー
クとして使用することができる。参照サンプルは、試験サンプルと平行して解析されるこ
とを必ずしも必要としない。このため、一部の例では、参照サンプルは、所与の条件を特
徴付けるために予め決定された数値又は範囲、例えば、対象中のがんを示すＰＳＭＡレベ
ルでもよい。この用語はまた、生理学的状態又は病態、例えば、ＰＳＭＡ発現がんに関連
することが周知であるが、未知量のＰＳＭＡを有する、比較目的で使用されるサンプルを
含む。
ＰＳＭＡ発現がんの進行の文脈において使用されるとき、「進行」という用語は、より
重篤でない状態からより重篤な状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度
、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の増大を含むことができる。例えば、「結
腸がんの進行」には、このようながんの、より重篤でない状態からより重篤な状態への進
行、例えば、ステージＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩＩＩへ等の進
行が挙げられる。
ＰＳＭＡ発現がんの退行の文脈において使用されるとき、「退行」という用語は、より
重篤な状態からより重篤でない状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度
、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の低下を含むことができると考えられる。
例えば、「結腸がんの退行」には、このようながんの、より重篤な状態からより重篤でな
い状態への退行、例えば、ステージＩＩＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステー
ジＩへ等の進行が挙げられる。
安定したＰＳＭＡ発現がんの文脈において使用されるとき、「安定した」という用語は
、進行性がん又は退行性がんであるとみなすのに臨床的意義のある期間にわたり有意に十
分に変化しない、又は変化していなかった病態を説明することを意図している。
本明細書に記載された実施形態は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に
限定されるものではなく、当然、変動し得る。
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例え
ば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ
１アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＫ
４０９Ｒ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有する一部
の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領
域中に含有する。
組換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内であ
る。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコ
ードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー
配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げるこ
とができるが、これらに限定されない。
ＰＳＭＡ結合分子
本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎ
ｅｘａ法によって決定する場合、約１×１０－７Ｍより低い、例えば約１×１０－８Ｍよ
り低い、約１×１０－９Ｍより低い、約１×１０－１０Ｍより低い、約１×１０－１１Ｍ
より低い、約１×１０－１２Ｍより低い、又は約１×１０－１３Ｍより低い解離定数（Ｋ
Ｄ）で、ヒトＰＳＭＡ、カニクイザルＰＳＭＡ、及び／又はチンパンジーＰＳＭＡに結合
可能である。特定のＦＮ３ドメイン－抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる
条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定すれば、異なり得る。したがって、親和
性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、標準化さ
れたタンパク質スキャフォールド及び抗原溶液、並びに本明細書に記載する緩衝液などの
標準化された緩衝液を用いて行われる。
本発明の別の実施形態では、ＦＮ３ドメインはヒトＰＳＭＡに特異的に結合し、当該Ｆ
Ｎ３ドメインはヒトＰＳＭＡの酵素活性を阻害する。ＰＳＭＡの酵素活性は、標準的な方
法を用いて測定することができる。例えば、ＰＳＭＡの検出可能な又は標識されたＰＳＭ
Ａ基質を加水分解することを利用してもよい。使用可能な例示的なＰＳＭＡ基質は、Ｎ－
アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）、葉酸ポリグルタミン酸、メトトレキサ
ートトリ－γグルタミン酸、メトトレキサートジ－γグルタミン酸、プテロイルペンタグ
ルタミン酸及びこれらの誘導体である。
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１
のアミノ酸配列と少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１
のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１カ所
の置換を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦ
Ｎ３ドメインは、配列番号：１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６
１に対応する少なくとも１つの残基位置において、又はＣ末端において、システイン残基
を含む。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のＦＮ３ドメインを有するヒ
トＰＳＭＡへの結合に特異的に競合する。
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡの領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭ
ＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に特異的に結
合する。
本発明のＦＮ３ドメインが結合したヒトＰＳＭＡエピトープは、配列番号：１５９又は
配列番号：１６０に示すアミノ配列中の残基の一部又は全てを含む。本明細書で開示する
一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインが結合したエピトープは、ヒトＰＳＭ
Ａ（配列番号：１４４）の領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）
及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に少なくとも１つのアミノ酸を含む。本明細書
で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインが結合したエピトープは、
ヒトＰＳＭＡ（配列番号：１４４）の領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号
：１５９）に少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸を含み、また
ヒトＰＳＭＡ（配列番号：１４４）の領域ＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に少なく
とも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのアミノ酸を含む。
本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、残基Ｋ４９
９、Ｋ５００、Ｓ５０１、Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０、Ｗ５４
１、Ｅ５４２、Ｎ５４４、Ｋ５４５及びＦ５４６（残基の番号付けは、配列番号：１４４
に従う）においてヒトＰＳＭＡと結合する。
本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、残基Ｒ１８
１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ６１０及び／又はＩ６１４においてヒトＰＳＭＡと更に結合
する。
ｃｙｎｏ ＰＳＭＡと複合体を形成するＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０の結晶
構造を解析した。ヒトＰＳＭＡとｃｙｎｏ ＰＳＭＡとの間の接触残基が１つの残基を除
いて同一であるため、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０がｃｙｎｏ ＰＳＭＡと結合する同一エピ
トープ残基において、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０がヒトＰＳＭＡと結合することが予想され
る。
治療方法
本明細書に記載の、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原
結合フラグメントを投与する対象としては、ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする特定の疾患を
発症するリスクの高い患者に加え、このような疾患を既に発症している患者が挙げられる
。一般的に、対象は、治療が求められる疾患を有すると診断されている。更に、対象に対
し、治療期間中、疾患のあらゆる変化（例えば、疾患の臨床症状における上昇及び低下）
をモニターすることができる。
特定の疾患を発症しやすい、あるいは発症するリスクの高い患者に、予防薬用途として
、医薬組成物又は薬物を、当該疾患の発症リスクを排除又は抑制するのに、あるいは当該
疾患の発症を遅らせるのに十分な量で投与する。治療用途において、かかる疾患が疑われ
るか又は既に罹患している患者に、組成物又は薬物を、疾患の症状及びその合併症を治療
、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与する。これを達成する適切な量は
、治療有効投与量又は治療有効量と呼ばれている。予防薬と治療の両方式において、薬剤
は通常、十分な応答（例えば、不適切な血管新生活性の阻害）が達成されるまで数回の用
量で投与される。一般的に、応答はモニターされ、所望の応答が減退し始めた場合に反復
投与が行われる。
本発明の方法による治療を行う対象患者を同定するために、一般に認められているスク
リーニング法を用いて、特定の疾患と関連するリスク因子を明らかにしてもよく、あるい
は対象において同定済みの既に発症している疾患の状態を測定してもよい。このような方
法としては、例えば、個人に、特定の疾患と診断された親類がいるかどうかを確認するこ
とを挙げることができる。スクリーニング法としてはまた、例えば、遺伝要素を有するこ
とが周知な特定の疾患について家族構成を確認するための、通常の精密検査を挙げること
ができる。例えば、種々のがんはまた、特定の遺伝要素を有していると知られている。が
んの遺伝要素としては、例えば、変化する複数の遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧ
ＦＲ、ｃＭｅｔ及びその他）における変異、特定のＨＬＡ及びキラー細胞抑制受容体（Ｋ
ＩＲ）分子の有無、あるいは、がん細胞が、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの細胞の免疫抑制を
直接的又は間接的のいずれかで調節可能な機構が挙げられる（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅ
ｎ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３２９～
３３９，２００７；Ｂｏｙｔｏｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４９：１～８，２００７を参照のこと）。この目的のため、慣例的にヌクレ
オチドプローブを用い、目的とする特定の疾患に関連する遺伝マーカーを有する個人を特
定することができる。更に、特定の疾患におけるマーカーを同定するのに有用な、多種多
様な免疫学的方法が、当技術分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体プロ
ーブを用いて特定の腫瘍に関連する抗原を検出する種々のＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が
利用可能であり、かつ当該技術分野において周知である。既知の患者の総合的症状、年齢
因子、関連リスク因子などを指定することにより、スクリーニングを行うことができる。
これらの方法により、医師は慣例的に、治療のための本明細書記載の方法を必要とする患
者を選別することができる。これら方法に従い、独立した治療プログラム、経過観察、補
助治療、又はその他治療と協調した治療レジメンとして、標的病理学的なＰＳＭＡ発現細
胞を構築することができる。
本明細書に記載する一部の方法では、第２の治療法と組み合わせて、本発明のＣＤ３×
ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを用い、前立
腺がんを有する対象を治療することができる。
本明細書に記載する一部の方法では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はそ
の多重特異性抗原結合フラグメントを用い、第２の治療法を用いた治療に対して耐性を有
する又は耐性を獲得した対象を治療することができる。
第２の治療法は、前立腺がんの治療に用いる承認薬であってもよく、それは例えば、ア
ビラテロンアセテート（ザイティガ）、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス（
ビカルタミド）、デガレリクス、ドセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリンアセテート
、ジェブタナ（カバジタキセル）、ロイプロリドアセテート、リュープロン（ロイプロリ
ドアセテート）、リュープロンデポ（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ－３
ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ－４ヵ月（ロイプロリドアセテート
）、リュープロンデポ－ペッド（ロイプロリドアセテート）、ミトキサントロン塩酸塩、
プレドニゾン、プロベンジ（シプリューセル－Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプリュー
セル－Ｔ、タキソテール（ドセタキセル）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、
ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、又はゾラデッ
クス（ゴセレリンアセテート）である（出典：国立がん研究所）。
種々の質的及び／又は量的な方法を用いて、対象が、治療に対して耐性を有しているか
、耐性を発症しているか、又は耐性を発症しやすいかを判定することができる。耐性に関
連し得る症状としては、例えば、患者の健康状態の低下若しくはプラトー状態、腫瘍サイ
ズの増加、腫瘍の増殖低減の停止若しくは増殖低減の緩徐化、及び／又は、１つの部位か
ら他の臓器、組織若しくは細胞への体内のがん性細胞の拡がりが挙げられる。がんに関連
する種々の症状の回復又は悪化はまた、対象が、食欲不振、認知機能不全、うつ病、呼吸
困難、疲労、ホルモン障害、好中球減少症、痛み、末梢神経障害、及び性的機能不全など
の治療に対して耐性を発症しているか又は耐性を発症しやすいか、が指標となり得る。が
んに関連する症状は、がんの種類に応じて様々であり得る。例えば、前立腺がんに関連す
る症状としては、排尿障害又は頻繁な切迫尿意、痛みを伴う排尿、血尿又は血精液、並び
に、骨盤、背中及び／又は臀部の苦しい痛み、を挙げてもよい。肺がんに関連する症状と
しては、持続性のせき、喀血、息切れ、喘鳴胸痛、食欲不振、意図しない体重低下、及び
疲労を挙げてもよい。腫瘍学に精通する当業者は、特定のがんのタイプに関連する症状を
容易に識別することができる。
投与／医薬組成物
本発明は、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラ
グメントの医薬組成物、及び医薬的に許容される担体を提供する。治療的使用として、Ｃ
Ｄ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、医
薬的に許容される担体内の活性成分として、有効量のドメイン又は分子を含有する医薬組
成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤
、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱
油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体で
あってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。
これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌
技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づける
ために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤
、増粘剤、滑剤及び着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子
濃度は幅広く変化してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％
から最大で１５又は２０重量％まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に
従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適な
ビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば
、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐ
ｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃ
ｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎ
ｇ ｐｐ ６９１～１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
したがって、本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗
原結合フラグメントの治療的使用における投与方法は、非経口投与、例えば、皮膚内、筋
肉内、腹腔内、静脈内若しくは皮下、肺、又は経粘膜（口内、鼻腔内、膣内、直腸）で、
錠剤、カプセル剤、水剤、散剤、ゲル剤、粒剤状の製剤を用いて、また注射器、移植した
デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ内に収容させて、又は当該技術
分野において周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適
な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、
軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨
盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑
液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内
、又は経皮送達によって達成され得る。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ～約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ～約２
５ｍｇの、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグ
メントを含むように調製することができる。
本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグ
メントは、任意の好適な経路、例えば、非経口的に静脈内（ＩＶ）注射又はボーラス注射
で、筋肉内で、皮下内で、又は腹腔で、患者に投与されてもよい。ＩＶ注射は、わずか１
５分間にわたり行うことができるが、多くの場合、３０分間、６０分間、９０分間、ある
いは更に２時間又は３時間にわたり行われ得る。本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二
重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントはまた、疾患部位に直接
注射することができる。がんを有する患者に与えられる用量は、治療する疾患を緩和又は
少なくとも部分的に阻止するのに十分な量であり（「治療的に有効な量」）、時に、０．
１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８，９、又は１０ｍｇ
／ｋｇであってもよいが、更に高くてもよく、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、５０、１００
、２００、５００、又は１０００ｍｇの固定単位用量でもまた与えられてもよく、あるい
は用量は、例えば、４００、３００、２５０、２００、又は１００ｍｇ／ｍ２の患者の体
表面積に基づいていてもよい。がんを治療するのに通常、１回～８回の用量（例えば、１
、２、３、４、５、６、７、又は８）で投与されるが、１０、１２、２０又はそれ以上の
用量で投与してもよい。本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重
特異性抗原結合フラグメントの投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、
２週間、３週間、１ヵ月、５週間、６週間、７週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、
６ヵ月、又はそれよりも長い期間の後に繰り返すことができる。治療過程を繰り返すこと
も可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量である
か、又は異なる用量であってよい。
例えば、静脈内注射用の、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はそ
の二重特異性抗原結合フラグメントの医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与するために、
約２００ｍＬの減菌リンガー液、及び約８ｍｇ～約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約１６
００ｍｇ、又は約４００ｍｇ～約８００ｍｇのＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインを含むように
調製され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば
、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５
ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
）に、より詳細に記載されている。
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原
結合フラグメントは、保管用に凍結乾燥されていてもよく、また使用に先立ち適切な容器
内で戻してもよい。この技術は、通常のタンパク調製物に関して有効であることが示され
ており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解技術を用いることができる。
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原
結合フラグメントを、対象に１回投与してもよく、又は投与を、例えば１日後、２日後、
３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヵ月後、５週間後
、６週間後、７週間後、２ヵ月後、又は３ヵ月後に繰り返してもよい。反復投与は、同じ
用量又は異なる用量で行うことができる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回
、７回、８回、９回、１０回、又はそれより多く繰り返してもよい。
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原
結合フラグメントを、上記で説明したように第２の治療剤と組み合わせて、同時に、連続
的に又は別々に投与してもよい。
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原
結合フラグメントは、任意選択的に第２の治療剤と組み合わせて、任意の形態の放射線療
法、及び任意の形態の放射線手術、及び／又は外科手術と共に投与され得るが、そのよう
な放射線療法には、体外照射療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）が挙げられ、放射線
手術には、ガンマナイフ、サイバーナイフ、Ｌｉｎａｃ、及び組織内放射線照射（例えば
、放射性シードの埋め込み、ＧｌｉａＳｉｔｅバルーン）が挙げられる。
とりわけ固体腫瘍の治療に関して、終点及び抗腫瘍活性を評価するためのプロトコルは
、当該技術分野において周知である。それぞれのプロトコルは異なる腫瘍反応評価を定義
し得るが、ＲＥＣＩＳＴ（固体腫瘍の効果判定基準）基準は現在、国立がん研究所が推奨
する、腫瘍反応を評価するためのガイドラインであるとみなされている（Ｔｈｅｒａｓｓ
ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２：２０５～２１６，２
０００を参照のこと）。ＲＥＣＩＳＴ基準によると、腫瘍反応とは、あらゆる測定可能な
病巣又は転移部の縮小又は除去を意味する。疾患が、通常の手法を用いて≧２０ｍｍの、
あるいは医療用撮影又はＸ線により明確に画定されたマージンを有するスパイラルＣＴス
キャン、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、又は診察（病
巣が表在性である場合）を用いて≧１０ｍｍの、少なくとも１つの寸法を正確に測定可能
な病巣を含む場合、疾患は通常、測定可能であるとみなされている。測定不能な疾患とは
、通常の手法を用いて＜２０ｍｍの、あるいはスパイラルＣＴスキャンを用いて＜１０ｍ
ｍの病巣、及び実際に測定不能な病巣（正確に測定するには小さすぎる）を含む疾患のこ
とを意味する。測定不能な疾患としては、胸水、腹水、及び間接証拠により文書化された
疾患が挙げられる。
客観的な状態の基準は、固体腫瘍の反応を評価するプロトコルに必要とされる。代表的
な基準としては、以下の基準が挙げられる。（１）完全寛解（ＣＲ）：あらゆる測定可能
な疾患部が完全に消失すること、新規病巣がないこと、疾患関連症状がないこと、及び測
定不能な疾患の証拠がないことと定義される。（２）部分寛解（ＰＲ）：標的病巣の最大
直径の合計が３０％減少することと定義される。（３）進行性疾患（ＰＤ）：標的病巣の
最大直径の合計が２０％増加すること、又は任意の新規病巣が出現することと定義される
。（４）安定又は反応なし：ＣＲ、ＰＲ又は進行性疾患にはあてはまらないことと定義さ
れる。（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと。）
腫瘍学分野において一般に認められている別の終点としては、全生存期間（ＯＳ）、無
病生存期間（ＤＦＳ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、及び無増悪生
存期間（ＰＦＳ）が挙げられる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｐｐｒｏｖａｌ ｏ
ｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ａｐｒｉｌ ２００５，
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
ＦＤＡ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．を参照のこと）。
医薬組成物は、本明細書に記載の医薬組成物を含む容器を含むキットとして提供するこ
とができる。医薬組成物は、例えば、単回又は複数回分の用量の注射用液剤形態、又は注
射前に戻される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、
医薬組成物を投与するための、乾燥粉末分散装置、リキッドエアロゾル発生器、又は噴霧
器を含むことができる。このようなキットは、医薬組成物に関する表示及び用法を記載し
た文書を更に含むことができる。
一部の実施形態では、融合タンパク質の発現は、強力な構成的プロモータ、例えば、下
記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシン
デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒ
ト筋肉クレアチンなどのためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルス
プロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態での使用に適している
。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモ
ータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモー
タ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイ
ルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復
配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられ
るが、これらに限定されない。
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク
質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つ又
は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。同部位は、前
述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネント
は、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供する
ように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより）配置さ
れてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲ
ＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーに
は、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン
抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイク
リン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシク
ロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌
のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．１７３８～１７４３（２０００））が挙げられる。選択マーカーをコードする
核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はク
ローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメント
をコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使
用して、融合タンパク質生成細胞を作製することができる。したがって、別の態様は、融
合タンパク質、例えば、本明細書で記載及び例示する融合タンパク質をコードする核酸配
列を含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞を特徴とする。
外来性遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であ
り、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目
的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝
子配列を宿主細胞に適切に形質転換されるべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細
胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生
理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば
、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（
例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エ
レクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮ
Ａウイルス、組換えＲＮＡウイルス）等が挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９ Ｐｈａｒｍａ
ｃ．Ｔｈｅｒ．６９～９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。哺乳類細胞
による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
本明細書に記載された融合タンパク質の発現に使用するのに適した細胞は、好ましくは
、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞である。これらの細
胞には、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ－ｔｓ１３、ＢＨＫ
、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ－１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株等が挙げられるが
、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成さ
れてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において十分確立され
ている。
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載され
た抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現について選択され、又はスクリーニングさ
れてもよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望
の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有す
るタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングさ
れる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は
、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又
はこのような方法の組み合わせにより得られる。
多重特異性の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
抗原結合フラグメント
好ましい、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗
原結合フラグメントを表２１に提示する。
種々のフォーマットの二重特異性抗体が記載されてきており、Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ
Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｄｅｖ １２：２７６
に近年レビューされた。
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明において記載されたもの等の
制御されたＦａｂアーム交換により得られたディアボディ、クロスボディ、又は二重特異
性抗体である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体には、ヘテロ二量体化する相補性ＣＨ３ドメイン
を有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子（この分子の２つの側面はそ
れぞれ少なくとも２種類の抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含
有する）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体がエクストラＦａｂフラグメント又はＦａｂ
フラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ディ
アボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分
子（異なるＦａｂフラグメントが互いに融合されている）、ＳｃＦｖ－及びディアボディ
－ベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又
は異なるディアボディ若しくは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が
互いに又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。
一部の実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子には、Ｔｒｉｏ
ｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡ
ｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的マッチされた抗体（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅ
ｎｔｅｃｈ）、ストランド交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅ
ｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ
Ａ／Ｓ）が挙げられる。
一部の実施形態では、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子には、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａ
ｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ－ｂ
ｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
一部の実施形態では、ＩｇＧ融合分子には、Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉ
ｎ（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｉｎ
ｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及び
ＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）
、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
一部の実施形態では、Ｆｃ融合分子には、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳ
ｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ
Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）
（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）．ｓｕｂ．２－Ｆａｂ（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
一部の実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体には、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ
／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ
）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌ
ｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃ
ｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ－、ディアボディ－ベース及びドメイン抗体に
は、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍ
ｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ
Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（Ｍ
ａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ）、ＴＣＲ－ｌｉｋｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃ
ｓ）、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＳｃＦｖ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉ
ｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、デュアル標的化ナ
ノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、デュアル標的化重鎖単一ドメイン抗体が挙げられるが、これ
らに限定されない。
本発明の全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単特異性二価抗体間でのＦａｂアーム
交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロでのセルフリー環境において又は共発現
を使用するかのいずれか一方において、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の好まし
いヘテロ二量体形成のために、各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することに
より生成されてもよい。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ
３ドメインの解離－会合の結果である。親単特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスル
フィド結合は減少する。親単特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の
親単特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗
体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ド
メインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られた産物
は、それぞれが異なるエピトープ、すなわち、ＰＳＭＡ上のエピトープ及びＣＤ３上のエ
ピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する、単離されたＣＤ３×ＰＳ
ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。
本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体化」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する
２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一
のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体化」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を
有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」
は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
「ノブ－ｉｎ－ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照の
こと）が、全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に、ヒトＩｇＧに
おけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進
するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな
側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入
され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重
鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖
と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホール
を形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５
Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３
６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８
Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重
鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面に
おける負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量
体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２
００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特
許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されたように使用されてもよい。他の戦
略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特
許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されたように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿
Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５
Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３
５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ
Ｋ４０９Ｆ Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４
０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の
第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改
変位置として表現）により促進されてもよい。
上記された方法に加えて、本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分
子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、国際公開第２０１１／１３１７４６号に
記載された方法に従って、セルフリー環境でのインビトロにおいて、２つの単特異性ホモ
二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還
元条件下において、２つの親単特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を
形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単特異性ＦＮ３ドメイ
ン及び単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進する
ＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作され、これらの抗体は、ヒンジ領
域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下において
共にインキュベートされ、これにより、Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体が生成さ
れる。インキュベーション条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用されて
もよい例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボ
キシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノ
ール、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２
－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少な
くとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭ ２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも
０．５ｍＭジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７
．４において、少なくとも９０分のインキュベーションが使用されてもよい。
また、本明細書において、当該ＰＭＳＡに結合し、Ｔ細胞を補充して、当該ＰＭＳＡ発
現細胞を殺傷すること（すなわち、Ｔ細胞の再指向）が可能な多重特異性抗体を、それを
必要とする患者に投与することにより、ＰＭＳＡ発現細胞を殺傷するための方法が提供さ
れる。本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
抗原結合フラグメントのいずれかを、治療的に使用してもよい。
好ましい実施形態では、本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子
又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置する
ために使用される。より好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグ
メントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち１つは、哺乳類における過剰増殖
性障害を処置するために使用される。一実施形態において、この障害は、がんである。
同様に、本明細書において、選択した細胞集団の成長を阻害する方法が更に提供される
。当該方法は、その他の細胞傷害剤又は治療剤を単独で又は組み合わせるかのいずれかに
おいて、ＰＭＳＡ発現標的細胞又はこのような標的細胞を含有する組織を、本発明の有効
量の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フ
ラグメントと接触させることを含む。好ましい実施形態では、多重特異性抗原結合分子は
、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラ
グメントである。選択された細胞集団の成長を阻害するための方法は、インビトロ、イン
ビボ、又はエクスビボにおいて実施され得る。
キット
また、本明細書において、例えば、記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグ
メント、及び、特定の細胞タイプを殺傷するための単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異
性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを使用するための取扱説明書を
含むキットも提供される。好ましい実施形態では、本明細書に記載する多重特異性の単離
されたＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメン
トであり、より好ましくは、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はそ
の二重特異性抗原結合フラグメントである。取扱説明書は、多重特異性抗体又はその抗原
結合フラグメントを、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて使用するための指
示を含んでもよい。
一般的に、キットは、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多
重特異性抗原結合フラグメントを収容する区画を有するであろう。多重特異性抗体又はそ
の抗原結合フラグメントは、凍結乾燥状態、液状、又はキットに含ませるのに修正可能な
他の形態でもよい。キットはまた、キットの取扱説明書に記載された方法を実施するのに
必要とされる、更なる要素を含有してもよい。同要素は、例えば、凍結乾燥粉末を再構成
するための滅菌溶液、患者への投与の前に多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント
と組み合わせるための更なる薬剤、及び多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを
患者に投与するのを支援するツールである。
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供す
るために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきで
ない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、
それらを考慮して種々の改変又は変更が、当業者に明らかであろう。また、本明細書に記
載された実施例及び実施形態は、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲を逸脱
することなくなされ得ることが理解される。
試薬及び構築物
カニクイザルＰＳＭＡ（カニクイザルタンパク質データベース参照番号：ＥＨＨ５６６
４６．１、配列番号：３２）及びチンパンジーＰＳＭＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号：Ｈ２
Ｑ３Ｋ５、配列番号：３３）の細胞外ドメインを、６Ｈｉｓタグ及びＡｖｉタグと共にｐ
Ｕｎｄｅｒ発現ベクターにクローニングした。タンパク質を、２９３ＨＥＫ－ｅｘｐｉ細
胞内で一時的に発現させた。上清を回収し、遠心分離により透明にした。タンパク質を、
１）ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを用いたＩＭＡＣ精製、及び２）サイズ排除精製（Ｓｕ
ｐｅｒｄｅｘ ２００）の二段階の精製プロセスを用いて精製した。ここでの溶出緩衝液
は、ＰＳＭＡの二量化を安定させるための、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、及び０．５ｍＭのＺｎ
Ｃｌ２を含有するＤＰＢＳである。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、タンパ
ク質濃度をＡ２８０で測定した。
黄色ブドウ球菌のソルターゼＡをコードする遺伝子をＤＮＡ２．０で作製し、Ｔ５プロ
モータ下で発現するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にサブクローニ
ングした。可溶性発現用のソルターゼ構築物は、２５個のアミノ酸からなる天然タンパク
質のＮ末端ドメインを欠いている。なぜなら、このドメインが膜に会合しているからであ
る（Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ
Ａ ９６：１２４２４～１２４２９，１９９９）。ソルターゼを、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ
（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号：３４）に続くタグ除去用のＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬ
ＹＦＱＳ、配列番号：５４）で発現させ、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するソルタ
ーゼを得た。用いたソルターゼタンパク質はまた、野生型タンパク質（配列番号：５３）
と比較すると酵素の触媒効率を向上させると報告されている５つの変異を有する配列を含
む（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １
０８：１１３９９～１１４０４，２０１１）。プラスミドを、発現用の大腸菌ＢＬ２１
Ｇｏｌｄ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。単一コロニーを選択して、カナマイシ
ンを補足したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）内で培養し、３７℃、２５０Ｒ
ＰＭで１８時間インキュベートした。カナマイシンを補足した２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆ
ｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を、これら継代培養から播種し、３７℃で振とうし
ながら約４時間培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。タンパ
ク質を３０℃で１８時間発現させた。６０００ｇの遠心分離で細胞を回収し、精製するま
で－２０℃で保存した。凍結細胞ペレットを室温で３０分間解凍し、３０ｍＬあたり１μ
Ｌの組換えリゾチーム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、細胞ペースト１ｇあたり５ｍ
Ｌで補足したタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）中に懸濁させ、振とう器を用いて室温で３０分間インキュベートした。７４，６００ｇ
の遠心分離を３０分間行い、溶解液を透明にした。
上清を、３ｍＬのＱｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｎｉ－ＮＴＡレジンを充填した
自然落下式カラムに添加した。当該レジンは、緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含む）を用いて予め平
衡化した。添加後、カラムを１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾー
ルを補足した緩衝液Ａを用いてタンパク質を溶出し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて平衡
化した分取用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ ２１．５×６００ｍｍ
（Ｔｏｓｏｈ）に添加した。ＡＫＴＡ－ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを用いて
、ＰＢＳ中、流速１０ｍＬ／分、室温でゲル濾過クロマトグラフィーを行った。それから
、ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたソルターゼを消化し、Ｈｉｓ６タグを除去した
。２８ｍｇのソルターゼを、１ｍＭのＤＴＴを補足した添付緩衝液中の、３０００ユニッ
トを含む１０ｍＬのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３０℃で２
時間インキュベートした。Ｎｉ－ＮＴＡレジンを用いて、タグを含まないソルターゼを精
製した。ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、反応液をＴＢＳ緩
衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に交換し、緩衝液Ａを用い
て予め平衡化した、０．５ｍＬのＱｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｎｉ－ＮＴＡレジ
ンを充填した自然落下式カラムに添加した。フロースルーを回収し、フロースルーに加え
た３ｍＬの緩衝液Ａを用いて、レジンを洗浄した。このフロースルーを、Ａｍｉｃｏｎ
１５濃縮器（カットオフ１０ｋＤａ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、約０．
５ｍＬに濃縮した。追加のＴＢＳ緩衝液を加え、サンプルを再度濃縮し（２度繰り返した
）、緩衝液をＴＢＳに交換した。４０％グリセロールの１／３容量を加え（終濃度１０％
グリセロール）、短期使用向けに－２０℃で、長期使用向けに－８０℃でソルターゼを保
存した。
実施例１．無作為化したループを有するＴｅｎｃｏｎライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号：１）は、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインの
コンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様スキャフォールドのフィブロネクチ
ンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７－
１１７，２０１２、米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７
個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択され
た残基を無作為化して、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構
築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択するこ
とができる。
Ｔｅｎｃｏｎ：
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒ
ｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号：１）
Ｔｅｎｃｏｎスキャフォールド及び種々の設計戦略を用いて、種々のライブラリを作製
した。通常、ライブラリＴＣＬ１及びＴＣＬ２は、良好なバインダーを生成する。ＴＣＬ
１及びＴＣＬ２ライブラリの作製については、国際公開第２０１４０８１９４４（Ａ２）
号に詳細が記載されている。
ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号：１）のＦＧループのみを無作為化するように設計されたライ
ブラリＴＣＬ１を、ｃｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｊａｃｏｂｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２）。このシステムにおいて、Ｔａｃ
プロモータ、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメン
ト、及びｏｒｉエレメントの配列を組み入れる一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写
／翻訳系で発現させると、それがコードされるＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃ
ｏｎ－ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体
を単離して、以下に記述されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する
。
ｃｉｓディスプレイで用いるためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウン
ドによって得られ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が二等分して産生された；２ｍ（
５’）フラグメントは、プロモータとＴｅｎｃｏｎ配列とを含むが、１ｍ（３’）フラグ
メントはｒｅｐＡ遺伝子とｃｉｓ及びｏｒｉエレメントとを含む。これらの二等分分子を
制限酵素消化によって結合させて、完全な構築物を産生する。ＴＣＬ１ライブラリは、Ｔ
ｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号：５５）のみにランダムアミノ酸を
組み込むように設計された。このライブラリの構築にＮＮＳコドンを用い、それによって
２０個全てのアミノ酸及び１つの終止コドンが、ＦＧループに組み入れられ得る。ＴＣＬ
１ライブラリは、多様性を更に増加させるために、それぞれが異なる長さの、７～１２残
基の無作為化ＦＧループを有する、６個の個別のサブライブラリを含む。
ＴＣＬ１ライブラリ（配列番号：２）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ７～１２
ＰＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ
酸であり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠損である。
ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方が無作為化されて、それぞれの位置でのアミ
ノ酸の分布が厳密に制御されているＴＣＬ２ライブラリを構築した。表６は、ＴＣＬ２ラ
イブラリにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は
２つの目的を有した。第一に、ライブラリを、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析及び／又はホ
モロジーモデリングに基づいて、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性にとって構
造的に重要となると予測される残基に向けて偏らせた。例えば、２９番目の位置は、Ｔｅ
ｎｃｏｎが折り畳まれた際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブ
セットのみとなるように固定した。第２の設計は、高親和性バインダーを効率よく生成す
るために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に認められる残基の分布となるようにアミノ酸
分布を偏らせることを含んだ（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
３７７：１５１８～２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｃｉ １６：４７６～８４，２００７）。この目標に向かって、表５の「設計された分布
」は、以下の分布を指す：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．
５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２
．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フ
ェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファ
ン、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及
び終止コドンが含まれない。
ＴＣＬ２ライブラリ（配列番号：３）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦ
ＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩ
ＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ２は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ４は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ５は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ６は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｐ
ｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒで
あり、Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉ
ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで
あり、Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、
Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ
であり、Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ
、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａ
ｌであり、Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉ
ｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶ
ａｌであり、Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈ
ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又は
Ｖａｌであり、Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、
Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又
はＶａｌであり、Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ
、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
又はＶａｌである。
Figure 2022068193000009
 ＊残基の番号付けは、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づく。
その後、これらのライブラリを種々の方法を用いて改良した。改良方法としては、野生
型Ｔｅｎｃｏｎと比較して安定化させた、置換Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ
（Ｔｅｎｃｏｎ２７、配列番号：４）を組み込んだＴｅｎｃｏｎフレームワーク（米国特
許第８，５６９，２２７号）上にライブラリを構築することと、ＢＣ及びＦＧループにお
いて無作為化した位置を変えることと、が挙げられる。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際公開第
２０１３０４９２７５号に記載されている。これにより、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ（ラ
イブラリＴＣＬ９）のみの、あるいは、ＢＣ及びＦＧループの組み合わせ（ライブラリＴ
ＣＬ７）の無作為化を目的とした新規ライブラリを作製した。これらのライブラリを、ｃ
ｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１：２８０６～２８１０，２０
０４）。この設計の詳細を以下に示す。
安定化させたＴｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号：４）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
ＴＣＬ７（無作為化したＦＧ及びＢＣループ）（配列番号：５）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹ
ＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰ
ＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２
、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ
、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９
は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠
損である。
ＴＣＬ９（無作為化したＦＧループ）（配列番号：６）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ
３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ
２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ
、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、Ａ
、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損であ
る。
ライブラリ構築では、ライブラリのアミノ酸分布を制御するために、かつ終止コドンを
除去するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ＧｍｂＨ）を用いて、無作為化したＢＣループ（長さ６～９の位置）又はＦＧループ
（長さ７～１２の位置）をコードするＤＮＡフラグメントを合成した。ＢＣループ又はＦ
Ｇループのいずれかを無作為化する２つの異なるＤＮＡ分子のセットを別々に合成し、そ
の後ＰＣＲを用いて結合し、完全なライブラリ産物を作製した。
ＦＧループライブラリ（ＴＣＬ９）の構築
２ｍ（５’）Ｔａｃプロモータに続く、ＦＧループにおいて無作為化したコドンを除く
Ｔｅｎｃｏｎの完全な遺伝子配列からなる合成ＤＮＡ分子のセットを作製した（配列番号
：２６～３１）。ＦＧループの無作為化において、システイン及びメチオニン以外の全て
のアミノ酸は、同一の割合でコードされた。多様化した部位の長さは、ＦＧループにおけ
る７個、８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸をコードするようになってい
る。それぞれに長さを変化させたサブライブラリを２μｇのスケールで別々に合成してか
ら、Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ（配列番号：９）及びＳｌｏｎｉｎｇ－Ｒｅｖ（配列番号：
１０）のオリゴを用いたＰＣＲで増幅した。
ライブラリの１ｍ（３’）フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子の
コード領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメン
トを含む一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応を行い、Ｍ１３フォワードプライマー及び
Ｍ１３リバースプライマーを有するプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を鋳型として用いて、このフラグメントを増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、
ＰｓｐＯＭＩで終夜消化して、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの２ｍ（５’）部分を、
ｒｅｐＡ遺伝子を含む１ｍ（３’）ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌ（約５４
０ｎｇ～５６０ｎｇ）の２ｍ（５’）ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ
４リガーゼの存在下で、等モル（約１．２５μｇ）の１ｍ（３’）ｒｅｐＡ ＤＮＡに、
３７℃で一晩ライゲートした。オリゴＰＯＰ２２５０（配列番号：１１）及びＤｉｇＬｉ
ｇＲｅｖ（配列番号：１２）を用いた１２サイクルのＰＣＲを使用することにより、ライ
ゲートしたライブラリ産物を増幅した。それぞれのサブライブラリにおいて、１２サイク
ルのＰＣＲ反応により得られたＤＮＡを混合し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを用いて精製
した。ＴＣＬ９のそれぞれのサブライブラリの収量は、３２～３４μｇの範囲であった。
ＦＧ／ＢＣループライブラリ（ＴＣＬ７）の構築
ＴＣＬ７ライブラリは、無作為化したＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループを含むライブ
ラリを提供する。このライブラリでは、６～９アミノ酸長のＢＣループを、無作為化した
７～１２アミノ酸長のＦＧループと組み合わせて混合した。タンパク質のＮ末端部分を上
流にコードし、かつＢＣループが６個、７個、８個又は９個の無作為化したアミノ酸のい
ずれかで置換されるような残基ＶＸを含む、Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子を導入するために、合成
ＴｅｎｃｏｎフラグメントＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８及びＢＣ９（配列番号：１３～１６）
を作製した。Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８３Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）の発見に先立って
これらのフラグメントを合成したが、これらの変異を、以下に記載する分子生物学の工程
を用いて導入した。このフラグメントを、無作為化したＦＧループをコードするフラグメ
ントと結合させるために、以下の工程を行った。
最初に、アミノ酸Ａ１７（１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ、配列番号：１７）をコードするヌ
クレオチド上流の、ＴｅｎｃｏｎのＴａｃプロモータ及び２ｍ（５’）配列をコードする
ＤＮＡフラグメントを、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号：１８）及びＬＳ１１１
４（配列番号：１９）を用いたＰＣＲにより作製した。これを行うことにより、ライブラ
リ内にＬ１７Ａ変異（ＣＥＮ５２４３）を導入した。次に、無作為化したＢＣループを含
む、Ｔｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８－Ｖ７５をコードするＤＮＡフラグメントを、鋳型としての
ＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８又はＢＣ９、並びにオリゴＬＳ１１１５（配列番号：２０）及び
ＬＳ１１１７（配列番号：２１）を用いたＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ工程により
、１ｍ（３’）末端にＢｓａＩ部位を導入した。続いて、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ及
びＬＳ１１１７をプライマーとして用いたオーバーラッピングＰＣＲ法により、これらの
ＤＮＡフラグメントを連結させた。２４０ｂｐの得られたＰＣＲ産物をプールし、Ｑｉａ
ｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製したＤＮＡをＢｓａＩ－ＨＦで消化し
、ゲル精製した。
オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号：２２）及びＳＤＧ２４（配列番号：２３）
を含むＦＧ７、ＦＧ８、ＦＧ９、ＦＧ１０、ＦＧ１１及びＦＧ１２（配列番号：２６～３
１）を鋳型として用いたＰＣＲにより、ＦＧループをコードするフラグメントを増幅し、
ＢｓａＩ制限部位、並びにＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）を組み込んだ。
３ウェイライゲーションを用いた単一工程で、消化したＢＣフラグメント及びＦＧフラ
グメントを共にライゲートした。１６組の可能な組み合わせに対して４回のライゲーショ
ン反応（それぞれのライゲーション反応では、２つのＢＣループ長を２つのＦＧループ長
と連結させる）を準備した。それぞれのライゲーションは、約３００ｎｇの総ＢＣフラグ
メント及び３００ｎｇのＦＧフラグメントを含有していた。それから、オリゴＰＯＰ２２
２２（配列番号：２４）及びＳＤＧ２８（配列番号：２５）を用いたＰＣＲにより、これ
ら４つのライゲーションプールを増幅した。その後、７．５μｇのそれぞれの反応産物を
ＮｏｔＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムを用いて洗浄した。５．２μ
ｇのこのＤＮＡを、ＰｓｐＯＭＩを用いて消化した等モル量のＲｅｐＡ ＤＮＡフラグメ
ント（約１４μｇ）とライゲートし、その産物を、オリゴＰＯＰ２２２２を用いたＰＣＲ
により増殖させた。
実施例２：別の結合表面を有するＴｅｎｃｏｎライブラリの作製
特定のライブラリ設計において無作為化させる残基を選択することにより、作製した相
互作用表面の全体的な形状が決まる。ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループが無作為化されたライブ
ラリからマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合させるために選択したスキャフォー
ルドタンパク質を収容するＦＮ３ドメインのＸ線結晶構造解析を行うことにより、ＭＢＰ
の活性部位に適合する大きく湾曲した界面を有することが示された（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４：６６３２～６６
３７，２００７）。対照的に、ＭＢＰと結合させるために選択したアンキリン反復スキャ
フォールドタンパク質は、遥かに平坦な相互作用表面を有し、ＭＢＰの外側表面（活性部
位から離れた）に結合することを見出した（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ ２２：５７５～５８２，２００４）。これらの結果は、スキャフォールド
分子の結合表面の形状（湾曲対平坦）が、標的タンパク質上のどの標的タンパク質又は特
定エピトープがスキャフォールドに効果的に結合可能かについて決定し得ることを示唆し
ている。タンパク質結合において、ＦＮ３ドメインを収容するタンパク質スキャフォール
ドの改変に関して公開された試みは、標的結合のための隣接したループを改変することに
基づいており、そのため湾曲した結合表面を作製していた。このアプローチでは、このよ
うなスキャフォールドが接触可能な標的及びエピトープの数が制限される場合がある。
Ｔｅｎｃｏｎ及びその他のＦＮ３ドメインは、分子の向かい合う面上に位置する２セッ
トのＣＤＲ様ループを有しており、第１のセットはＢＣ、ＤＥ及びＦＧループで形成され
ており、第２のセットはＡＢ、ＣＤ及びＥＦループで形成されている。２セットのループ
は、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドにより分離されている。Ｔｅｎｃｏｎの画
像を９０度回転させると、別の表面を見ることができる。このわずかに凹状の表面は、Ｃ
Ｄ及びＦＧループ並びに２本の逆平行βストランド（Ｃ及びＦβストランド）により形成
され、本明細書では、Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面と呼んでいる。Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面を
鋳型として用い、表面を形成する残基のサブセットを無作為化することにより、タンパク
質スキャフォールド相互作用表面のライブラリを設計することができる。βストランドは
、その他全ての残基がタンパク質表面に露出した側鎖を有する反復構造を有している。そ
れゆえ、βストランド内で表面に露出した残基の一部又は全てを無作為化することにより
、ライブラリを作製することができる。βストランド内の適切な残基を選択することによ
って、Ｔｅｎｃｏｎスキャフォールドに固有の安定性が損なわれることを最小限に留める
必要があるが、一方で、その他タンパク質と相互作用する独特なスキャフォールド表面が
提供される。
ライブラリＴＣＬ１４（配列番号：７）を、Ｔｅｎｃｏｎ２７スキャフォールド（配列
番号：４）の設計に組み込んだ。
このライブラリを構築するために用いた方法の詳細な記述は、米国特許公開第２０１３
／０２２６８３４号に記述されている。
ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号：７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９
ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２及びＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ
、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｃ又はＭである。
Ｔｅｎｃｏｎ２７内でＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面を形成する２本のβストランドは、無作
為化させることが可能なトータルで９つの表面に露出した残基、Ｃストランド（Ｓ３０、
Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６）、及びＦストランド（Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２及びＶ
７４）を有しており、一方で、ＣＤループは、潜在的な６つ残基（Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４
０、Ｖ４１、Ｇ４２及びＥ４３）を有しており、ＦＧループは、潜在的な７つの残基（Ｋ
７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０及びＮ８１）を有している。全２２残基
が無作為化された場合の、ライブラリのより大きな理論的サイズによって、ＴＣＬ１４設
計中に含有させるための選択残基を選択した。
無作為化のため、Ｔｅｎｃｏｎ内の１３ヵ所を選択した：Ｃストランド内のＬ３２、Ｑ
３４及びＱ３６、ＣＤループ内のＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０及びＶ４１、Ｆストランド内の
Ｔ６８、Ｓ７０及びＹ７２、並びにＦＧループ内のＨ７８、Ｒ７９及びＮ８１。Ｃ及びＦ
ストランド内のＳ３０及びＥ６６は、ＣＤ及びＦＧループを越えた位置に存在し、明らか
にＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の一部であるようには見えないため、無作為化させなかった。
ＣＤループ内のＧ４２及びＥ４３は、グリシンがループ領域において有用であり（可撓性
を提供する）、Ｅ４３が表面の連結部に存在するため、無作為化させなかった。ＦＧルー
プ内のＫ７５、Ｇ７６、Ｇ７７及びＳ８０についても除外した。上記理由によりグリシン
を除外したが、結晶構造を慎重に検査することによって、Ｓ８０が、安定したＦＧループ
の形成を補助するためにコアと重要な接触を行っていることが判明した。Ｋ７５は、Ｃ－
ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の表面から離れて面しており、無作為化の候補としては魅力に欠けて
いた。オリジナルのＴＣＬ１４設計では上述した残基を無作為化させなかったが、それら
を続くライブラリ設計に組み込み、新しい選択の、又は例えば、選択ＴＣＬ１４標的特異
性ヒットにおける親和性成熟ライブラリの、更なる多様性を提供することが可能である。
ＴＣＬ１４を作製した後に、類似した設計の、３つの別のＴｅｎｃｏｎライブラリを作
製した。これら２つのライブラリを用いて、ＴＣＬ１４と同一位置（上記を参照のこと）
において、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３を無作為化させるが、これらの位置で
生じるアミノ酸の分布は異なる（表６）。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１を設計し、１８個の
天然アミノ酸を全ての位置において等しい分布（それぞれ５．５５％）で導入した（シス
テイン及びメチオニンだけは除外）。無作為化したそれぞれの位置が、表６に記載の機能
性抗体のＨＣＤＲ３ループ（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
３７７：１５１８～１５２８，２００８）において見られるアミノ酸分布に近似するよう
に、ＴＣＬ２３を設計した。ＴＣＬ２１ライブラリと同様に、システイン及びメチオニン
は除外した。
その他のライブラリにおける潜在的な標的結合表面を拡大するために、３番目の別のラ
イブラリを構築した。このライブラリ、ＴＣＬ２４では、ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣ
Ｌ２１及びＴＣＬ２３ライブラリと比較して、４ヵ所の別のＴｅｎｃｏｎ位置を無作為化
させた。これらの位置には、Ｄストランド由来のＮ４６及びＴ４８、並びにＧストランド
由来のＳ８４及びＩ８６が含まれている。これらの残基の側鎖がβストランドＤ及びＧか
ら露出した表面であり、かつＣ及びＦストランドの無作為化した位置と構造的に隣接した
位置に存在することから、位置４６、４８、８４及び８６がとりわけ選択された。それゆ
え、標的タンパク質に結合するための接触可能な表面積が増加する。ＴＣＬ２４のそれぞ
れの位置で用いたアミノ酸分布は、表６のＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１について記載した分
布と同一である。
ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号：８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０
ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；式中、Ｘ
１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、
Ｘ１６及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、
Ｖ Ｙ又はＷである。
表６．ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４のそれぞれの無作為化した位置における
アミノ酸頻度（％）
Figure 2022068193000010
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４ライブラリの作製
アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリ技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ
）を用いてＴＣＬ２１ライブラリを作製した。アミノ酸分布を制御するために、Ｓｌｏｎ
ｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を用いて、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２
４の遺伝子フラグメントを作製した。冒頭の合成に続いてＰＣＲを用いてそれぞれのライ
ブラリを増幅し、その後、ループライブラリについて上記したとおり、ＣＩＳディスプレ
イシステム（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ １０１：２８０６～２８１０，２００４）を用いた選択に使用するために、
ＲｅｐＡ遺伝子にライゲートした。
実施例３：ＰＳＭＡと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
プレートベース選択
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ７、ＴＣＬ９、ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１ライブ
ラリからＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインを選択した。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）の
ために、完全アミノ酸（０．１ｍＭ）、１Ｘ Ｓ３０プレミックス成分、及びＳ３０抽出
液（１５μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）（総容積５０μＬ）を用いて、ライブラリＤＮＡ（３
μｇ）を３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキング溶液（３７５μＬ）（１
Ｘ ＴＢＳ、ｐＨ７．４、０．０１％ Ｉ－ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，＃Ｔ２０１５）、１００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ）を添加し、反応液を氷上
で１５分間インキュベートした。抗ヒトＰＳＭＡ抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＬＣ－Ｃ１５０５２７）をコートした９６ウェルＭａｘｉｓ
ｏｒｂプレート上に固定化した、組換えタンパク質、チンパンジーＰＳＭＡ（ｐａｎ ２
２９）若しくはカニクイザルＰＳＭＡ（ｐａｎ ２３０）、又はカニクイザルＰＳＭＡ－
Ｆｃ融合（ｐａｎ ２３１）を用いて、ＩＴＴ反応液をインキュベートした。非結合ライ
ブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄
後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質からＤＮＡを溶出させ、更なる
パニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた。それぞれのラウンドにおいて、標
的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄のストリン
ジェンシーを高めることによって、高親和性バインダーを単離した。
パニング後、選択したＦＮ３ドメインをＰＣＲを用いて増殖し、リガーゼ非依存的クロ
ーニング部位を含めるように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングして、標準的
な分子生物学的手法を用いて大腸菌において可溶性で発現させるために、ＢＬ２１－ＧＯ
ＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。精製及び検出を可能にす
るために、Ｃ－末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインに
付加した。１ｍＬの９６ウェルブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補
足したＴＢ培地中で、培養物を３７℃で吸光度が０．６～０．８となるまで増殖させた後
、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、その時点で温度を３０℃に低下させた。およそ
１６時間後に細胞を遠心分離させて回収し、－２０℃で凍結した。それぞれのペレットを
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で、室温で４５分間振とうさせながらインキュベートするこ
とによって細胞溶解物を得た。
ビーズベース選択
ＦＮ３ドメインはまた、ビーズベースの捕捉配列を用いて選択した。ＩＴＴ反応液を上
述のように調製した後、ビオチン化組換えタンパク質（チンパンジーＰＳＭＡ又はカニク
イザルＰＳＭＡ）を用いてインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び結合ラ
イブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビー
ズ上に捕捉した。非結合ライブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗浄する
ことによって除去した。洗浄後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質か
らＤＮＡを溶出させ、更なるパニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた。それ
ぞれのラウンドにおいて、標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連続的に
低下させて、洗浄のストリンジェンシーを高めることによって、高親和性バインダーを単
離した。
オフレート選択
ビーズベース選択の５回目のラウンドにおける産物を、４ラウンドのオフレート選択に
供した。ＩＴＴ後、ビオチン化組換えチンパンジー又はカニクイザルタンパク質を用いて
反応液をインキュベートした。タンパク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラア
ビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴで広範囲に
わたって洗浄した。結合複合体を、冷却した５μＭの組換えＰＳＭＡタンパク質で１時間
洗浄した。それから、ビーズに結合したＩＴＴをＴＢＳＴ及びＴＢＳで広範囲にわたって
洗浄し、その後溶出した。ビオチン化標的抗原の濃度を、２５ｎＭ（ラウンド６及び７）
から２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）へと低下させた。ラウンド７及び９の選択産物を、
発現及びスクリーニング用の改変ｐＥＴ１５ベクターにサブクローニングした。
親和性成熟ライブラリ選択
ＢＣループ由来の２３～３０位及びＦＧループ由来の７８～８３位を無作為化させた、
Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術を用い
て、クローン配列Ｐ２２９ＣＲ９Ｐ８１９－Ｈ１１（配列番号：４０）に基づいた親和性
成熟ライブラリ（ＴＣＬ２５）を作製した。親アミノ酸（Ｐ２２９ＣＲ９Ｐ８１９－Ｈ１
１由来）をコードするヌクレオチドを、６５％の標的頻度でそれぞれの無作為化した位置
にドープすることにより、ライブラリにおける標的結合の維持を達成した。含有しないシ
ステイン及びメチオニンを除外して、その他２０個の天然アミノ酸全てを等しい確率でコ
ードするコドンの組み合わせを含有するように、残り３５％のヌクレオチドを設計した。
表７にＴＣＬ２５成熟ライブラリの設計を示す。表において、括弧内の数字は、それぞれ
の位置に対応するアミノ酸を含有するように設計されたライブラリ中の分子の割合を表す
。このドーピングスキーム（１４ヵ所の位置に、６５％の親）により、親分子と比較して
ほとんどの場合３、４、５、６又は７つの変更を含む、理論上の分子分布が生じる。
Figure 2022068193000011
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ２５ライブラリからＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン
を選択した。ビオチン化組換えタンパク質（チンパンジーＰＳＭＡ又はカニクイザルＰＳ
ＭＡ）を用いて、ＩＴＴ反応液をインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び
結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁
性ビーズ上に捕捉した。非結合ライブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗
浄することによって除去した。洗浄後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパ
ク質からＤＮＡを溶出させ、更なるパニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた
。それぞれのラウンドにおいて、標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連
続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを高めることによって、ＦＮ３ドメインバ
インダーを単離した。
２回目のラウンドの選択における産物を、４ラウンドのオフレート選択に供した。ＩＴ
Ｔ後、ビオチン化組換えＰＳＭＡタンパク質を用いて反応液をインキュベートした。タン
パク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコ
ートした磁性ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴで広範囲にわたって洗浄した。結合複合体を、
冷却した５μＭの組換えＰＳＭＡタンパク質で１時間洗浄した。それから、ビーズに結合
したＩＴＴをＴＢＳＴ及びＴＢＳで広範囲にわたって洗浄し、その後溶出した。ビオチン
化標的抗原の濃度を、２５ｎＭ（ラウンド３及び４）から２．５ｎＭ（ラウンド５及び６
）へと低下させた。ラウンド７及び９の選択産物を、発現及びスクリーニング用の改変ｐ
ＥＴ１５ベクターにサブクローニングした。
ＰＳＭＡと結合するＦＮ３ドメインの生化学的スクリーニング
ニュートラアビジンでコートしたプレートをＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（
Ｐｉｅｒｃｅ）中で１時間ブロッキングし、その後、ビオチン化ＰＳＭＡ（パニングの際
と同一の抗原を用いて）又は陰性コントロールで１時間コートした。プレートをＴＢＳＴ
でリンスし、希釈した溶解物をプレートに１時間添加した。更にリンスを行った後、ＨＲ
Ｐコンジュゲート抗ＦＮ３ドメイン抗体（ＰＡＢ２５）でウェルを１時間処理し、それか
らＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアッセイした。少なくとも１０倍超のバックグラウンド
でシグナルを有するＦＮ３ドメインを、更なる解析用に選択した。
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインの凝集状態を決
定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５
／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速０．３ｍＬ／分でｐＨ７．４のＰ
ＢＳを移動相として注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍの吸光度によってモニタ
ーした。野生型Ｔｅｎｃｏｎを、それぞれのランにおいてコントロールとして含めた。Ａ
ｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０２）を用い
て溶出特性を解析した。同一のランにおいて野生型タンパク質の溶出特性と類似した溶出
特性を有するタンパク質のみを、更なるキャラクタリゼーション用として検討した。
ＦＮ３ドメインのハイスループット発現、コンジュゲート及び精製
生化学的結合ＥＬＩＳＡで同定した、ユニークヒット由来の単離クローンを、９６ウェ
ルブロックプレート中の増殖用単一ヒットプレートと混合させ、クローンを１ｍＬの培養
液中（選択用にカナマイシンを補足したＬＢ培地）、３７℃で一晩振とうさせながら増殖
させた。９６ブロックプレート中でのタンパク質発現用として、カナマイシンを補足した
ＴＢ培地（１ｍＬ）に、一晩培養した培養物（５０μＬ）を播種し、ＯＤ６００＝０．６
－１となるまで３００ｒｐｍで連続振とうを行いつつ３７℃で増殖させた。目的のＯＤに
到達次第、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加してタンパク質発現を誘導させ、プレート
を終夜増殖用に、３０℃（３００ｒｐｍ）に移した。一晩培養した培養物を遠心分離にか
けて細胞を回収し、細菌ペレットを、使用できる状態になるまで－８０℃で保存した。陽
性コントロール及び陰性コントロールの両方を、複製用の全てのプレートに含ませた。
ソルターゼタグへのコンジュゲート用として、細菌ペレットを解凍し、組換えヒトリゾ
チーム（ＥＭＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７１１１０）を補足したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（Ｅ
ＭＤ Ｃａｔａｌｏｇ＃７０９２２）内で再懸濁及び溶解させた。穏やかに攪拌しながら
室温で溶解を進めた後、プレートを４２℃に移し、宿主タンパク質を沈殿させた。デブリ
を遠心分離で沈殿させ、上清を、ソルターゼ触媒標識用の新しいブロックプレートに移し
た。Ｇｌｙ３－ｖｃ－ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）、タグを含まないソルターゼＡ、
及びソルターゼ緩衝液（トリス、塩化ナトリウム及び塩化カルシウム）を含有するマスタ
ーミックスを２倍濃縮で調製し、等容積で溶解上清液に添加した。室温で２時間標識化反
応を進めた後、Ｎｉ－ＮＴＡマルチトラップＨＰプレート（ＧＥ Ｃａｔａｌｏｇ＃２８
－４００９－８９）を用いてタンパク質を精製した。イミダゾール含有溶出緩衝液（５０
ｍＭトリスｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いた段階
的溶出により、タンパク質コンジュゲートを回収し、フィルターを滅菌して細胞ベースの
細胞傷害性アッセイに直接用いた。
ＦＮ３ドメイン－薬物コンジュゲートのハイスループット細胞傷害性アッセイ
培養組織でコートした９６ウェル黒色プレート（ＢＤ／Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏ
ｇ＃３５３２１９）に、ＬＮＣａＰ ＦＧＣ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＣＲＬ－
１７４０）を、アッセイ培地（５％ウシ胎児血清を補足したフェノールレッドフリーＲＰ
ＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ＃１１８３５－０３０））
内において細胞１０，０００個／ウェルの密度で蒔いた。細胞吸着用とするため、蒔いた
プレートを、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、ＣＤＣをア
ッセイ培地中で希釈（１：１００、１：３００、１：１０００又は１：３０００）し、Ｌ
ＮＣａＰ細胞へと直接添加した。それからＬＮＣａＰ細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で６
６～７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｇ７５７１）を用いて、細胞毒性を評価した。１００μＬの調製試薬を
、処理したウェルに直接添加し、穏やかに攪拌しながら１０分間インキュベートし、光か
ら保護した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いて、蛍光を測定した。
数値を未処理コントロールに正規化し、５０％超の毒性が達成された場合、更なる解析用
に選択した。
実施例４：抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインのキャラクタリゼーション
大規模発現及び精製
ＦＮ３ドメイン変異をコードする遺伝子配列をパニングにより発見し、Ｔ７プロモータ
下で発現するか、あるいはＤＮＡ２．０により作製されるｐＥＴ１５ｂベクターにクロー
ニングし、それから、Ｔ５プロモータ下で発現するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（
ＤＮＡ２．０）にサブクローニングした。得られたプラスミドを、発現用の大腸菌ＢＬ２
１ Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）又はＢＬ２１ＤＥ３ Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形
質転換した。単一コロニーを選択して、カナマイシンを補足したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ
（Ｔｅｋｎｏｖａ）内で培養し、３７℃、２５０ＲＰＭで１８時間インキュベートした。
カナマイシンを補足した１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）
を、これら継代培養から播種し、３７℃で振とうしながら４時間培養した。６００ｎｍの
吸収での吸光度が１．０に到達次第、１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導し
た。３７℃、４時間で又は３０℃、１８時間でタンパク質を発現させた。６０００ｇの遠
心分離により細胞を回収し、精製するまで－２０℃で保存した。凍結細胞ペレット（約１
５ｇ～２５ｇ）を室温で３０分間解凍し、０．２ｍｇ／ｍＬの組換えリゾチーム（Ｓｉｇ
ｍａ）を、細胞ペースト１ｇあたり５ｍＬで補足したタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔ
ｅｒＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に懸濁させ、振とう器を用いて室温で１時間
インキュベートした。７４６００ｇ、２５分間の遠心分離により、溶解液を透明にした。
ＡＫＴＡ ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを用いて、上清を流速４ｍＬ／分で氷
に挿したＱｉａｇｅｎ Ｎｉ－ＮＴＡカートリッジ（５ｍＬ）に添加した。その他全ての
Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー工程を、流速５ｍＬ／分で行った。２５．０ｍＬの５０
ｍＭトリス－ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾール
を含む）（緩衝液Ａ）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを平衡化した。添加後、カラムを１
００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄し、続いて、１００ｍＬの５０ｍＭトリス－ＨＣＬ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、１０ｍＭイミダゾール、１％ＣＨＡＰＳ及び１％ｎ－オクチル－β－Ｄ－グル
コピラノシド界面活性剤、を含む）及び１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。２５０ｍＭの
イミダゾールを補足した緩衝液Ａを用いてタンパク質を溶出し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を
用いて平衡化した分取用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ ２１．５×
６００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）に添加した。ＡＫＴＡ－ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステ
ムを用いて、ＰＢＳ中、流速１０ｍＬ／分、室温でゲル濾過クロマトグラフィーを行った
。
熱安定性測定
キャピラリＤＳＣを用いて熱安定性を測定した。それぞれのサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）中に１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈した。オートサンプラー（Ｍｉｃｒｏ
Ｃａｌ，ＬＬＣ）を備えたＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して、これらサンプルの融解温度を測
定した。サンプルを、１０℃から９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速度で加熱した。統
合に用いるベースラインを算出するために、各サンプルスキャン間の緩衝液のみのスキャ
ンを完了させた。データを、２つの状態のアンフォールディングモデルにフィッティング
させ、続いて緩衝液のみのシグナルを差し引いた。セルから取り出さずに各サンプルのス
キャンを繰り返すことにより、熱変性の可逆性を測定した。
ＰＳＭＡ＋細胞における、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン－薬物コンジュゲートの選択的
細胞傷害性
システイン－マレイミド間の化学反応（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：２～１３，１９９２）を介して、あるいは上記のソルターゼ
反応を用いて、ＦＮ３ドメインをｖｃ－ＭＭＡＦにコンジュゲートした。ＬＮＣａＰ、Ｖ
ＣＡＰ、ＭＤＡ－ＰＣ－２Ｂ及びＰＣ３細胞における、ＦＮ３ドメイン－ｖｃＭＭＡＦコ
ンジュゲートの細胞傷害性をインビトロで評価した。９６ウェル黒色プレートで細胞を２
４時間培養し、その後、異なる量のＦＮ３ドメイン－ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートで処理
した。ＦＮ３ドメイン－薬物コンジュゲート（ＦＤＤＣ）で、細胞を６６～７２時間イン
キュベートした。上述したように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを用いて毒性を評価した。
蛍光値をエクセルにインポートし、そこから蛍光値を、グラフ解析用のＰｒｉｓｍへとコ
ピー及びペーストした。Ｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）を用いてデータを変換してから、非線形回帰を
用いて解析し、ＩＣ５０を測定するために３パラメータモデルを適用した。
表８は、多数の配列ファミリーに対してパニング及びスパニングを行うことにより同定
したユニークヒットについてまとめている。ＦＮ３ドメインは、５５℃～８５℃において
熱安定性を示し、２２．６～０．３８ｎＭのＩＣ５０値でｖｃＭＭＡＦにコンジュゲート
した際、ＬＮＣａＰ細胞に対して細胞傷害性を示した。表９、表１０及び表１１は、選択
クローンのＢＣ、Ｃ、ＣＤ、Ｆ及びＦＧループのアミノ酸配列を示す。表１２は、クライ
ンのアミノ酸配列を示す。
Figure 2022068193000012
Figure 2022068193000013
Figure 2022068193000014
Figure 2022068193000015
Figure 2022068193000016
細胞株パネルに対して、選択薬物コンジュゲートを試験した。表１３は、ｖｃＭＭＡＦ
にコンジュゲートしたＦＮ３ドメインのいくつかにおけるＩＣ５０値を示す。データは、
１～９つのカーブフィッティングの平均値を表す。データは、平均値±ＳＥＭで提示され
ている。ＣＤＣは、高濃度のＰＳＭＡを発現することが周知な株であるＬＮＣａＰ細胞に
おいて最も強力であった。ＣＤＣはまた、低濃度のＰＳＭＡの前立腺がん株であるＭＤＡ
－ＰＣＡ－２Ｂ細胞及びＶＣＡＰ細胞において活性であった。ＰＳＭＡ陰性細胞株である
ＰＣ３細胞において活性は観察されず、選択性を示していた。
Figure 2022068193000017
実施例５：抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの改変
システインスキャニング
タンパク質中の種々の位置に導入されたシステイン残基を有する、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３
ドメイン（Ｐ２３３ＦＲ９＿１０）をコードする遺伝子をＤＮＡ２．０から入手し、上記
で説明したように、タンパク質を発現及び精製するのに用いた。上記のとおり、熱安定性
（ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの有無両方の場合）及びＬＮＣａＰ細胞傷害性について、
得られたＦＮ３ドメインを評価した。結果は、表１４にまとめられている。
Figure 2022068193000018
実施例６：非標的ＦＮ３ドメインの体内分布イメージング
６２位にシステインを含むように遺伝子操作した、標的抗原に特異的結合を示さないＦ
Ｎ３ドメインを、ＤＯＴＡにコンジュゲートし、その後、ＩｓｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｓ Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＣ（Ａｎｇｌｅｔｏｎ，ＴＸ）にてジルコニウム－８９放射性同位
体を結合させた。去勢雄ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に
１．５％イソフルラン麻酔を行い、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ／
ＣＴでイメージングを行った。マウスに、約０．２ｍＣｉの［８９Ｚｒ］ＦＮ３ドメイン
（配列番号：５１）を尾静脈から静注することにより投与し（冷却したＦＮ３ドメインを
最大１ｍｇ／ｋｇの投与量で）、最初の６０分間にわたり連続的にイメージングを行い、
その後、ＦＮ３ドメインの注入から３、６及び２４時間後にイメージングを行った。
２Ｄサブセット化による期待値最大化アルゴリズム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、３次元ＰＥＴ画像を、０．１０７ｍｍ×
０．１０７ｍｍ×０．１０７ｍｍのボクセルサイズで７６８×７６８×５１２の断層撮影
容積に再構成した。ＰＭＯＤ ｖ３．０ソフトウェア（ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、画像を処理及び解析した。周
知の活性のシリンダをＰＥＴスキャナにスキャンし、ドーズキャリブレータで測定した注
入ドーズとＰＥＴ画像内のボクセルあたりのカウントとの間のクロスキャリブレーション
を行った。それぞれのＰＥＴ画像をＣＴ画像へと共に登録し、ＰＭＯＤ画像融合ソフトウ
ェアを用いて解剖学的基準化を行った。解析するそれぞれの組織の４番目のセクション毎
に、関心領域（ＲＯＩ）を囲んだ。ボクセルあたりの平均カウントを抽出し、周知の活性
のキャリブレーションシリンダから導いた補正係数を用いて、体重１ｇあたりの注入ドー
ズの割合へと変換した。周知のＺｒ－８９半減期（７８．４１時間）を用いて、放射活性
の全測定値に対して減衰補正を行った。
図１に、経時的な、放射能標識ＦＮ３ドメインの組織分布を示す。腎臓及び膀胱への急
速な集積が観察され、肝臓への集積はわずかに限られている。このことは、ＦＮ３ドメイ
ンが腎臓通過時に取り除かれることを示唆している。
実施例７：ｃｙｎｏ ＰＳＭＡと複合体を形成した抗ＰＳＭＡ Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１
０の結晶構造
Ｈｉｓタグを付加したＰ２３３ＦＲ９－Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン（本明細書ではＨ１０
ＦＮ３ドメインと呼ぶ）を大腸菌内で発現させ、親和性クロマトグラフィー及びサイズ
排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にＦＮ３ドメイン
を加えた。
ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ領域にＣ末端融合するカニクイザルＰＳＭＡ細胞外ドメインを、Ｇ
ｎＴＩ－細胞内で発現させ、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーを用いて精製した。ｄＰＢＳ（０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２）中に融合タンパ
ク質を加えた。その後、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ処理によりＦｃ領域を除去
し、続いて親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを行った。単離
されたカニクイザルＰＳＭＡ（ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ）細胞外ドメインを、ｄＰＢＳ（０．
５ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２）中で保存した。
ｃｙｎｏ ＰＳＭＡとＨ１０ ＦＮ３ドメインをモル比１：３（ＦＮ３ドメインが過剰
）で混合し、同時に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２）を用
いて４℃で４８時間透析を行うことにより、Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン／ｃｙｎｏ ＰＳＭ
Ａ複合体を調製した。その後、グラジエント（４８～６８ｍＭ ＮａＣｌ）、Ｈｅｐｅｓ
（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）及びグリセロール（１０％）で、複合体をモノＳカラムから溶
出させてから、３．４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃
で用いて、Ｘ線回折に適した結晶を、２５％ ＰＥＧ（３ｋＤａ）、ＮＨ４Ｃｌ（０．２
Ｍ）及び酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）から得た。
Ｘ線データ収集のために、結晶を、２０％グリセロールを補足した母液を含む抗凍結溶
液中に数秒間浸してから、液体窒素中で凍結させた。アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）ビームライン１７－ＩＤにおいて、Ｄｅ
ｃｔｒｉｓ Ｐｉｌａｔｕｓ ６Ｍ画素配列検出装置を用いて、Ｘ線回折データを収集し
た。ＨＫＬ２０００プログラム（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ＆ Ｍｉｎｏｒ，１９９７）を
用いて、回折データを処理した。Ｘ線データの統計値を表１５に示す。
Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，２００１）を用いた分子置換（ＭＲ）で構造を解析した。Ｍ
Ｒ用のサーチモデルは、ヒトＰＳＭＡ（ＰＤＢコード２Ｃ６Ｇ）の結晶構造及びＰ１１４
ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３ Ｗ３３Ａ ＦＮ３ドメインの構造であった。ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａ
ｍｓ ｅｔ ａｌ，２００４）を用いて構造を精密化し、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ＆
Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を用いてモデルの調整を行った。ＣＣＰ４プログラムスーツ（
ＣＣＰ４，１９９４）を用いて、その他全ての結晶学的計算を行った。ＰｙＭｏｌ（Ｄｅ
Ｌａｎｏ，２００２）を用いて、全ての分子グラフィックスを生成した。構造精密化の統
計値を表１５に示す。
Figure 2022068193000019
 ＊最外郭の値は（）内に示す。
ホモ二量体のｃｙｎｏ ＰＳＭＡの構造は、二量体サブユニット毎に、プロテアーゼド
メイン（残基５７～１１６及び３５２～５９０）、アピカルドメイン（残基１１７～３５
１）及びヘリカルドメイン（残基５９１～７５０）、並びに、１１個の生じ得るＮ－結合
型グリカンのうちの８個（Ａｓｎ－７６、－１２１、－１４０、－１９５、－４５９、－
４７６、－６１３及び－６３８）に対応する残基５７～７５０を含む。ｃｙｎｏＰＳＭＡ
活性部位は、３ドメイン間の界面に位置しており、当該活性部位は、ヒスチジン残基（Ｈ
３７７及びＨ５５３）及びグルタミン酸／アスパラギン酸残基（Ｄ３８７、触媒性のＥ４
２４、Ｅ４２５及びＤ４５３）、並びに水分子に配位する２個の亜鉛原子を含んでいる。
Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン（配列番号：４１）の構造は、残基２～９２を含む。Ｈ１０残基
の番号付けは、配列番号：４１に従い連番で付けられる。ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基の番号付
けは、配列番号：１４１のｃｙｎｏ ＰＳＭＡ配列の完全長に従い付けられる。成熟ｃｙ
ｎｏＰＳＭＡ（シグナルペプチドを有さない）は、配列番号：１４１の残基４４から始ま
る。
それぞれのＰＳＭＡサブユニットに結合した１つのＨ１０ ＦＮ３ドメインを有する非
対称ユニットには、１つのｃｙｎｏＰＳＭＡホモ二量体が存在する（図２Ａ）。ＰＳＭＡ
サブユニット内の全同価原子の重ね合わせにおける０．７２Åの根平均二乗偏差（ｒ．ｍ
．ｓ．ｄ．）によって示されるように、２組のＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ複合体は、構造
的に非常に類似している。また、ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとの間には高度な
構造類似性がある。ＦＮ３ドメイン複合体内のｃｙｎｏＰＳＭＡ分子と非結合ヒトＰＳＭ
Ａ（ＰＤＢコード２ＯＯＴ、１．６Åの解像度における構造）との間の、Ｃα原子の重ね
合わせにおける０．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．によって示されるように、ＦＮ３ドメイン結
合により生じる大きなコンフォメーション変化はない。興味深い特性は、ＦＮ３ドメイン
との相互作用を介したループコンフォメーションの安定化のために、ループ領域５４１～
５４７がカニクイザルタンパク質内でのみ可視であることである。
ＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ結合部位は、２Ｆｏｂｓ－Ｆｃａｌｃ電子密度マップにより
はっきりと規定され、結合残基の確実な位置決めが可能となる。Ｂ鎖とＣ鎖（それぞれＰ
ＳＭＡドメイン鎖、ＦＮ３ドメイン鎖）との間の相互作用についてのみ、次のセクション
で説明する。
Ｈ１０ ＦＮ３ドメインは、ＰＳＭＡ活性部位に近い領域に結合し（図２Ａ）、約１，
１７０Å２のｃｙｎｏＰＳＭＡ領域を覆う。とりわけ、ＦＮ３ドメインは、図３及び図４
に示すとおり、プロテアーゼドメイン（Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ４９９－Ｐ５０２、Ｐ５
０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０－Ｅ５４２及びＮ５４４－Ｆ５４６）、アピカルド
メイン（残基Ｒ１８１）及びヘリカルドメイン（残基Ｋ６１０、Ｎ６１３及びＩ６１４）
において、ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基を認識する。
ＦＮ３ドメイン４本鎖βシートの表面は、ＣＤループを活性部位の入口へと深く挿入さ
せた状態で、ＰＳＭＡ表面上を包み込む（図２Ｂ及び図２Ｃ）。具体的には、ＰＳＭＡ結
合に関わるＨ１０ ＦＮ３ドメイン残基は、Ｃ（Ａ３２及びＧ３４）、Ｄ（Ｖ４６）、Ｆ
（Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０及びＡ７２）及びＧ（Ｓ８４－Ｉ８６）βストランド、並びに
ＣＤループ（Ｗ３６、Ｗ３８－Ｄ４１、Ｅ４３及びＡ４４）及びＦＧループ（Ｗ７９、Ｆ
８１及びＰ８２）に位置する。残基Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３は、ＦＮ３ドメイ
ンのＣＤループに負電荷を付与し、これら残基は、基質がファネルに入ること及びＰＳＭ
Ａの酵素活性を妨げるように、活性部位内の亜鉛イオンとなる正に荷電したファネルへと
約２０Åの深さで挿入される（図２Ｂ及び図２Ｃ）。しかしながら、ＦＮ３ドメインは、
亜鉛イオン又はその配位残基と直接相互作用することはない。
保存ＰＳＭＡ残基Ｗ５４１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｐ５０２及びＰ５０４は、結合部位
間において、ＦＮ３ドメイン残基Ｗ３６、Ｐ６８、Ｙ７０、Ｗ７９、Ｆ８１及びＰ８２と
芳香族クラスターを形成する（図３Ａ）。保存残基Ｒ５１１は結合部位と水素結合Ｙ７０
との中心位置に存在し、ＦＮ３ドメイン４本鎖βシートの中心残基である。図３Ｂは、パ
ラトープ及びエピトープ残基の略画を示す。
ヒトＰＳＭＡ及びカニクイザルＰＳＭＡは９７％同一であり、Ｈ１０と相互作用する全
ての残基（Ｓ６１３Ｎ変異を除く）は、２種間において保存されている（図４）。Ｓ６１
３Ｎ変異はｃｙｎｏＰＳＭＡ内でのＮ６１３のグリコシル化をもたらし、ヒト酵素中には
存在しない、炭水化物とＦＮ３ドメイン残基（Ｅ６６、Ｉ８６、Ｔ８８）（Ｆ及びＧβス
トランド）との間のファンデルワールス接触が得られる。
コンジュゲート用のＦＮ３ドメイン残基
ＰＳＭＡの結合又はＦＮ３ドメインのフォールディングを阻害させずに小分子（毒性搭
載物）をコンジュゲートさせるため、結合部位の外側にある種々のＨ１０ ＦＮ３ドメイ
ン残基を改変することができる。Ｃ末端（Ｈｉｓタグの後ろ）及び位置Ｒ１１、Ｅ５３及
びＫ６２に、システインを既に配置し搭載物にコンジュゲートした。これら変異の全ては
、同様に強力な細胞傷害性を示した。加えて、ＢＣループ内の残基Ｔ２２、Ｄ２５及びＡ
２６、末端残基Ｎ６、並びにＤＥループ内のＳ５２は、変異誘発に続く化学的コンジュゲ
ートのための潜在的に良好な部位である（図５）。溶媒に曝されたこれらの残基は、ＦＮ
３ドメイン／ＰＳＭＡ界面から離れて構造的に柔軟な領域に配置される。
更に、Ｎ末端領域及びＣ末端領域の両方は、その他タンパク質ドメインと融合しない。
Ｎ末端はＰＳＭＡプロテアーゼドメインの方向に向けられ、融合リンカーと接触させるこ
とができる。一方で、接触可能なＣ末端もまた、ＰＳＭＡヘリカルドメインの方向に向い
ている。ＦＮ３ドメイン融合パートナーとの最適リンカー長は、標的分子上の融合パート
ナーの構造及び結合部位の位置によって決まる。
作用機序
Ｈ１０ ＦＮ３ドメインは、搭載物（毒性小分子、核酸など）をＦＮ３ドメイン／ＰＳ
ＭＡ複合体の内部移行により前立腺がん細胞へと送達する際の標的候補である。更に、Ｈ
１０ ＦＮ３ドメインは、多重特異性フォーマットの場合、免疫細胞を前立腺がん細胞へ
と再指向させる際の候補である。
Ｈ１０ ＦＮ３ドメインはまた、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害するものと考えられ、それ
により細胞適応度及び細胞生存率の低下がもたらされ得る。ＦＮ３ドメイン／ｃｙｎｏＰ
ＳＭＡ構造は、活性部位の入口に結合したＦＮ３ドメインを示し、それにより、結合部位
における立体遮断及び直接競合による基質のＰＳＭＡとの相互作用が阻害され得る。
実施例８：別の抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン変異体の作製
選択抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを更に改変し、親ＦＮ３ドメインの特性を向上させた
。それから、上記のライブラリを用いてＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインを作製し、Ｐ
ＳＭＡへの結合性を試験した。
表１６は、作製した分子のアミノ酸配列を示す。
Figure 2022068193000020
Figure 2022068193000021
Figure 2022068193000022
Figure 2022068193000023
実施例９：蛍光染料にコンジュゲートした抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いた、腫瘍
細胞におけるＰＳＭＡ発現の検出
本実施例は、蛍光染料にコンジュゲートした抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いた、細
胞上に存在するＰＳＭＡの検出について示す。アミノ酸５３に遊離システインを有する、
Ｃ末端にＨｉｓタグを付加した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（配
列番号：４９）を、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ ｃａｔａｌｏｇ＃
ＰＢ３１）にコンジュゲートした。スルホ－ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ＃
２２１２２）を用いてＰＥを６０分間活性化させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５及びＰＢＳ
／ＥＤＴＡ緩衝液を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、活性化させたＰＥを遊離
スルホ－ＳＭＣＣから分離した。ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃６４６５４７）を用
いて、ＦＮ３ドメインを３０分間還元した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５及びＰＢＳ／ＥＤ
ＴＡ緩衝液を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、還元したＦＮ３ドメインを遊離
ＴＣＥＰから分離した。活性化させたＰＥを還元したＦＮ３ドメインに９０分間共有結合
させ、続いて、Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ＃０４２６０）を用
いて２０分間反応を停止させた。ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣ（Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）に取り付けたＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム
（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウ
ム、ｐＨ６．５）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、「ＰＥコン
ジュゲートＦＮ３ドメイン」を精製した。
フローサイトメトリー及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）アッセイに
おいて、ＰＳＭＡに対して陽性及び陰性を示す細胞株を用い、ＰＥコンジュゲートＦＮ３
ドメインの感度及び特異性を試験した。次の前立腺細胞株：ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ高発現
）、２２Ｒｖ１（ＰＳＭＡ低発現）及びＰＣ３（ＰＳＭＡ発現なし）をＡＴＣＣから購入
し、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの特異性を確認するために使用した。
フローサイトメトリーを用いた、細胞株におけるＰＳＭＡの検出
標準的な細胞培養法を用いて、前立腺細胞株を回収した。ＰＥコンジュゲートＦＮ３ド
メインを含む０．１ｍＬのＰＢＳ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有）中で、細
胞（約３０，０００）を２０分間染色した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（クローンＬＮＩ－１７
ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３４２５０４）の抗ＰＳＭＡ抗体－ＰＥコンジュゲートを、陽性
コントロールとして用いた。インキュベート後、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液（３ｍＬ）を加え
、非結合ＰＥコンジュゲートを遠心分離（８００ｇ、５分間）により除去した。上清を吸
引し、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．３ｍＬ）中に細胞を再懸濁させた。サンプルをＦＡＣＳＣａ
ｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。それぞれの細胞株におけるＰ
ＳＭＡ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、抗ＰＳＭＡ抗体のＭＦＩと比較した。Ｍ
ＦＩは、ＰＳＭＡ高発現細胞株由来の高いＭＦＩを有するＰＳＭＡの発現レベルと直接関
連している。図６は、抗ＰＳＭＡ抗体－ＰＥのＭＦＩ値と比較した、抗ＰＳＭＡ ＰＥコ
ンジュゲートＦＮ３ドメインで検出された異なる細胞株におけるＭＦＩ値を示す。
結果は、抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインが、ＰＳＭＡ陽性細胞株に結
合し、ＰＳＭＡ陰性細胞には非特異的に結合しないことを示している。ＭＦＩは、予想ど
おり、ＰＳＭＡ低発現細胞株（２２Ｒｖ１）の低いＭＦＩと比較して、ＰＳＭＡ高発現細
胞株（ＬＮＣａＰ）で高い。ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３）のＭＦＩは、バックグラウン
ドシグナルに近い。更に、ＦＮ３ドメイン－ＰＥの異なる細胞株への結合特性は、抗ＰＳ
ＭＡ抗体－ＰＥと類似しており、ＦＮ３ドメインコンジュゲート及び抗体コンジュゲート
の両方において同様のＭＦＩ値が得られた。本実施例は、抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲー
トＦＮ３ドメインが、腫瘍細胞上のＰＳＭＡ検出において感度及び特異性を有しているこ
とを示す。
循環腫瘍細胞アッセイを用いた、ＰＳＭＡの検出
ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイで抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインを試
験し、７．５ｍＬの血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し数えることにより、上記の
結果について更に確認した。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨシステム（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた循環腫瘍細胞の計数は、製造
業者のプロトコル及びトレーニングに従い行った。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈアッセイでは、
捕捉用に、磁性粒子（強磁性流体）にコンジュゲートした抗ＥｐＣＡＭを用い、またＣＴ
Ｃの可視化用に、フルオレセインにコンジュゲートしたサイトケラチン（８、１８及び１
９）に特異的な抗サイトケラチンを用いる。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイでは、サンプ
ル調製用にＡｕｔｏＰｒｅｐを用い、解析用にＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ
ＩＩ（登録商標）（ＣＴＡ ＩＩ）を用いる。ＣＴＡ ＩＩは４色の半自動蛍光顕微鏡
であり、ＣＴＣを同定して数えるために３色を用いる。ＣＴＡ ＩＩの４番目の色は、別
の目的マーカーを有するＣＴＣの表現型に用いることができる。本実施例では、組織培養
した腫瘍細胞を正常血液にスパイクし、血液中のＣＴＣをミミックした。約５００個の腫
瘍細胞（ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ３又はＳＫＢＲ３細胞）を、ＣｅｌｌＳａｖｅチ
ューブ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に採取した正常ドナーの血液（７．
５ｍＬ）にスパイクした。ＰＳＭＡ陰性細胞株として、乳がん細胞株（ＳＫＢＲ３）もま
た用いた。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ ＣＸＣキット、及びマーカーとしての抗ＰＳＭＡ Ｐ
ＥコンジュゲートＦＮ３ドメインを用いたＡｕｔｏＰｒｅｐでサンプルを処理した。Ａｕ
ｔｏＰｒｅｐサンプル調製システムでは、抗ＥｐＣＡＭ強磁性流体を用いて腫瘍細胞を捕
捉することにより、腫瘍細胞を濃縮する。有核細胞を同定するために、ＣＴＣを濃縮した
サンプルを核酸染料（ＤＡＰＩ）で染色し、腫瘍細胞を同定するために、抗サイトケラチ
ン抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートし、また白血
球を同定するために、抗白血球抗体をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートし
た。サンプルを最終容量０．３２ｍＬに処理してから、サンプルチャンバ、更にはＭａｇ
Ｎｅｓｔ（登録商標）細胞提示デバイスの内部へと移した。ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）
デバイスは、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ（登録商標）で解析するた
めの磁気的に標識した細胞を提供する。ＣＴＡ ＩＩを用いてサンプルを解析しＣＴＣを
計数して、ＣＴＣ上のＰＳＭＡを検出した。解析装置は自動的にサンプルを解析し、確認
用のサムネイル画像で、ＤＡＰＩ及びサイトケラチンに対して陽性を示す候補腫瘍細胞を
提示する。抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインで染色した腫瘍細胞のＣＥＬ
ＬＳＥＡＲＣＨアッセイでの結果を、図７に示す。
図７ＡはＬＮＣａＰ腫瘍細胞におけるＰＳＭＡの発現を示し、これら細胞の１００％は
ＰＳＭＡに対して陽性である。ＰＳＭＡ低発現細胞株（２２Ｒｖ１）は、ＰＳＭＡに対し
て２６％陽性である（図７Ｂ）。また一方で、ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３－９及びＳＫ
ＢＲ３）はＰＳＭＡに対して陰性である（図７Ｃ及び図７Ｄ）。これらの結果は、フロー
サイトメトリーの結果と一致する。本実施例は、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いてＣ
ＴＣにおけるＰＳＭＡの発現を検出可能であること、更に抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの
感度及び特異性を確認可能であることを示す。
実施例１０：抗ＣＤ３ Ｆａｂの結晶構造
ＳＰ３４ Ｆａｂの結晶構造を、２．１Å解像度で決定した。完全なアミノ酸配列が明
らかにされ、ＳＰ３４ ｍＡｂが得られる可能性のあるマウス生殖細胞系が特定された。
構造を用いてヒトフレームワーク適合を誘導した。
材料
ＳＰ３４ ｍＡｂであるマウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５
６６１１）から購入した。技術データシートに従って、同アイソタイプを、親和性クロマ
トグラフィーにより組織培養上清から精製し、４℃で保存した。Ｆａｂフラグメントを、
ｍＡｂ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ ＃ ４４９８５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）のパパイ
ン消化により生成し、Ｎａｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｌｕｓ Ｓｐｉｎカラム（Ｐｉｅ
ｒｃｅ，Ｃａｔ＃４４９８５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用し、製造業者のプロト
コルに従って、Ｆｃから分離した。Ｆａｂを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５（緩衝液Ａ
）で平衡化したＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で更に精製した。緩衝
液Ａで、５０カラム体積において、１Ｍ ＮａＣｌの１３～２８％グラジエントで溶出を
行った。主なピークに対応する画分をプールし、９．２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に使
用した。
結晶化
Ｏｒｙｘ４ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＭｏｓｑｕｉｔ
ｏロボット（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いた蒸気拡散法により、２０℃で結晶化を行
った。実験は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ ３５５０プレートにおいて、シッティングド
ロップ形式で、等しい体積のタンパク質及びリザーバ溶液で構成された。初期スクリーニ
ングは、ＰＥＧキット（Ｑｉａｇｅｎ）、並びに自社製スクリーンＩＨ１及びＩＨ２を用
いて行った。ＩＨ２スクリーンでの初期スクリーニング後に得られたＦａｂシードを用い
たＭＭＳ最適化により、種々の条件下における多数の結晶を作製した。Ｘ線解析に用いる
Ｆａｂ結晶を、１２％ ＰＥＧ ３３５０、０．２Ｍ Ｋ／Ｎａ酒石酸（ｐＨ７．４）、
３％イソプロパノール、及び３％ジオキサン（緩衝液なし）から得た。結晶データを表１
７に示す。
Figure 2022068193000024
 ＊括弧内の数字は、最高解像シェルについてのものである。
Ｘ線データ収集及び構造決定
Ｘ線データ収集のために、１つの結晶を、２０％グリセロールを補足した母液中に数秒
間浸し、液体窒素中で瞬間冷凍した。回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ
Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）ＩＭＣＡビームラインで、Ｐｉｌａｔｕｓ ＣＣ
Ｄ検出器を使用して収集した。０．５°の像毎に０．５秒露光で１８０°の結晶回転にわ
たり回折強度を検出し、ＸＤＳプログラムを用いて処理した［Ｋａｂｓｃｈ Ｗ．２０１
０．ＸＤＳ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６６：１２５～１３２．］。Ｘ線デ
ータの統計値を表１７に示す。
マウス抗Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原抗体Ｊａａ－Ｆ１１（ＰＤＢ
３ｇｎｍ）から構築されたＦａｂモデルを使用する分子置換により構造を解いた。Ｊａ
ａ－Ｆ１１は、ＩｇＧ３／カッパアイソタイプである。全ての結晶学的計算を、ＣＣＰ４
プログラムスーツ［１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０～７
６３．］により行った。プログラムＣＯＯＴ［Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ，ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ
Ｋ．２００４．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６～２１３２．］
を使用して、モデル調節を行った。精密化統計値を表１７に示す。
生殖細胞系の情報を用いて、ＳＰ３４の配列決定を行った。Ｘ線データにより、いくつ
かの体細胞変異の同定に加え、ＣＤＲ－Ｈ３の全配列（生殖細胞系の一部ではない）の同
定が可能となった。水素結合ネットワーク及び原子のＢ因子（場合により、原子Ｃ、Ｎ及
びＯ間で異なり得る）を基準にして、割り当てＤ／Ｎ、Ｅ／Ｑ、Ｔ／Ｖのアンビギュイテ
ィについて可能なものは全て解析した。
ＶＬの４０、９７及び９８位、並びにＶＨの３５、５５、５６、５７及び８０位におけ
る体細胞変異を同定した。
予想どおり、Ｆａｂ構造内に５ヵ所のジスルフィドが観察された（軽鎖内の２２～９０
及び１３７～１９６、重鎖内の２２～９８及び１５２～２０７、並びに鎖間ジスルフィド
の２１４（Ｌ）－１４０（Ｈ））。
結晶内Ｆａｂ間の相互作用
結晶内において、Ｆａｂ分子は、一方のＦａｂのＣＤＲがもう一方の重鎖のＣ末端部分
と結合するように頭尾結合で束ねられている。Ｃ末端は、ＶＬとＶＨとの間にある深い凹
部にデッドエンド方式で収まる。Ｓ２３０の末端カルボキシル基は、ＶＨのＮ３５及びＲ
５０並びにＶＬのＷ９８と水素結合を形成する。これにより、余分な残基のための空間が
残らず、ｍＡｂのパパイン開裂がヒンジ領域のＳ２３０とＴ２３１との間で生じたことを
示す。
推定上のパラトープ
本発明の構造中のＣＤＲコンフォメーション、及び上記のＣ末端認識様式により、抗原
結合に最も関与しやすい残基の選択が可能となる。それら残基としては、以下のものが挙
げられる。
ＣＤＲ－Ｌ１：Ｙ３４、ＣＤＲ－Ｌ２：なし、ＣＤＲ－Ｌ３：Ｗ９３、
ＣＤＲ－Ｈ１：Ｔ３１、Ｙ３２及びＡ３３、ＣＤＲ－Ｈ２：Ｒ５０、Ｒ５２、Ｙ５５及
びＮ５６、並びに、ＣＤＲ－Ｈ３：Ｎ１０３、Ｇ１０５、Ｓ１０７、Ｙ１０８及びＳ１１
０。
相互作用の大部分は、主にＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３が寄与するＶＨにおいて生じ
やすい。
ＩＧＨＧ３＿マウス（マウスＩｇＧ３、アイソフォーム２）由来の残基２３１～４５５
を有する、ＳＰ３４の配列（配列番号：１６０及び１６１）を図８に示す。
実施例１１：抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４のヒトフレームワーク適合
抗ＣＤ３マウス抗体ＳＰ３４を、ヒトフレームワーク適合法（Ｆｒａｎｓｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ，ＪＭＢ，２０１０）によりヒト化した。４種類の重鎖を、３種類の異なる軽鎖と
組み合わせて、１２個のヒト化変異体を生成した。
ＳＰ３４のヒト化及び親和性成熟
ヒト生殖細胞系の選択
ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）法［１６］を用いてＳＰ３４をヒト化した。４つの
ヒト重ｖ領域及び３つの軽ｖ領域配列のマトリクスを、試験のために選択した。ヒト生殖
細胞系の選択は、フレームワーク領域（ＦＲ）における、ＳＰ３４に対する全体的な配列
類似性のみに基づいた。ＣＤＲ配列も、その長さ又は標準構造も、この選択には考慮しな
かった。
重鎖について最も近いマッチは、ヒトＧＬ ＩＧＨＶ３－７２及びＩＧＨＶ３－７３で
ある。ヒトＢ細胞レパートリーにおけるその高い発生頻度のために、別のＧＬであるＩＧ
ＨＶ３－２３を選択した。
軽鎖について最も近いマッチは、ヒトラムダＧＬ ＩＧＬＶ７－４３（ａｋａ ７ａ）
、ＩＧＬＶ７－４６（ａｋａ ７ｂ）、及びＩＧＬＶ１－５１（ａｋａ １ｂ）である。
ＩＧＬＶ７－４６は、仮想的にＩＧＬＶ７－４３と同一であるが、２位におけるＡｌａの
利点を有する、すなわち、ＳＰ３４におけるのと同様である。
選択されたＪ領域は、下記：重鎖に対してＩＧＨＪ１、ラムダ軽鎖に対してＩＧＬＪ３
である。
逆突然変異
ＳＰ３４の結晶構造を基準として、ＨＦＡ変異体モデルを構築した。モデルにより、Ｖ
Ｌ内の、電位が一致しないいくつかのＦＲ位置が明らかとなり、最も顕著な位置は、Ｖａ
ｌ３８、Ｇｌｙ４８及びＧｌｙ５１である（図９）。ＣＤＲ－Ｈ３のコンフォメーション
を維持させるために、マウス残基は、３つの位置（ａｋａ「逆突然変異」）全てにおいて
保持される必要がある。これら突然変異を、成熟計画に加えた。
重鎖の５７位におけるＡｓｎは、この構造における良好な側鎖密度を有さない。同Ａｓ
ｎはまた、ＣＤＲ－Ｈ２の中間に位置し、典型的な結合部位から離れて位置している。こ
の分析に基づいて、同Ａｓｎは、結合に有意に影響し得ない。加えて、骨格の幾何形状は
、ＲａｍａｃｈａｄｒａｎプロットにおけるＧｌｙ残基に最も好ましい領域にある。この
ため、同Ａｓｎを、必須のフレキシビリティを実現し、（非グリシン関連位置構造歪みを
減少させることにより）安定性を潜在的に改善する一方で、結合性に影響を及ぼさないた
めに、成熟計画において、Ｇｌｙにトランケートした。
親和性成熟設計に関して検討された、いくつかの他の考察が存在した。まず、ヒトＧＬ
ＩＧＬＶ７－４６及びＩＧＬＶ７－４３は、望ましくない酸化電位を有する５９位にＴ
ｒｐを導入する。２つの他のＧＬは、この位置にＧｌｙを有する。このＧｌｙは、マウス
配列に対応する。したがって、Ｇｌｙ５９を、ＩＧＬＶ７－４６及びＩＧＬＶ７－４３の
両方の変異体において保持した。最後に、ＶＨの４９位におけるＡｌａは必須である。ま
た、９９位における残基（ＳＰ３４ではＶａｌ）は、抗原結合性に影響を及ぼし得る。こ
れらの位置を試験するために、逆突然変異を、一部の変異体に導入した（図１０）。
ＨＦＡマトリクス
ＨＦＡマトリクスは、４つのＶＨ変異体及び３つのＶＬ変異体から構成される（図１０
）。ＨＦＡの目的のために、ＡｂＭ ＣＤＲ定義を用いる（短いＣＤＲ－Ｈ２、長いＣＤ
Ｒ－Ｌ１）。
ＶＨについての変異体：
ＣＤ３Ｈ１４１（配列番号：１６３）：マウスＣＤＲ＋Ｇｌｙ４９Ａｌａを有するＩＧ
ＨＶ３－７２＊０１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
ＣＤ３Ｈ１４２（配列番号：１６４）：マウスＣＤＲ＋Ｓｅｒ４９Ａｌａを有するＩＧ
ＨＶ３－２３＊０１
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮ
ＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
ＣＤ３Ｈ１４３（配列番号：１６５）：マウスＣＤＲ＋Ｓｅｒ４９Ａｌａ、Ａｌａ９９
Ｖａｌを有するＩＧＨＶ３－２３＊０１
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮ
ＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
ＣＤ３Ｈ１４４（配列番号：１６６）：マウスＣＤＲ＋Ａｓｎ５７Ｇｌｙを有するＩＧ
ＨＶ３－７３＊０１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＧＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
ＶＬについての変異体：
ＣＤ３Ｌ６３（配列番号：１６７）：マウスＣＤＲ＋Ｆ３８Ｖ、Ａ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇ、
Ｗ５９Ｇを有するＩＧＬＶ７－４６＊０１
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＣＤ３Ｌ６４（配列番号：１６８）：マウスＣＤＲ＋Ｙ３８Ｖ、Ｌ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇを
有するＩＧＬＶ１－５１＊０１
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＬＰＧＴＡＰＫＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧ
ＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＣＤ３Ｌ６６（配列番号：１６９）：マウスＣＤＲ＋Ｆ３８Ｖ、Ａ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇ、
Ｗ５９Ｇを有するＩＧＬＶ７－４３＊０１
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
表１８ ＣＤ３の重鎖及び軽鎖のマトリクス
（全て、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌを含有するＩｇＧ１－ＡＡ Ｆｃに
より調製）
Figure 2022068193000025
アミノ酸配列を、ＤＮＡに逆翻訳させ、遺伝子合成手法（米国特許第６，６７０，１２
７号、米国特許第６，５２１，４２７号）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ＣＭＶプロ
モータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、重鎖
（ＨＣ）ｖ領域を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ変異を含有するヒトＩｇＧ
１－ＡＡ Ｆｃ上にサブクローニングした。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクター
を使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、軽鎖（ＬＣ）可変領域を、ヒトラムダ
（λ）定常領域上にサブクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細
胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にトランスフェクションし、ｍＡｂを発現させた。プロテ
インＡカラム（ｈｉＴｒａｐ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的
な方法により精製した。溶出後、プールを、Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．２内へ透析した。
Figure 2022068193000026
Figure 2022068193000027
配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並び
に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異
性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４３を作製した。配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６８
のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換
を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４４を作製した。配列番
号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２
３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ
３抗体ＣＤＢ１４６を作製した。配列番号：１６４のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを
有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有する
ＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４７を作製した。配列番号：１６
４のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、
Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体Ｃ
ＤＢ１４８を作製した。配列番号：１６４のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶ
Ｈ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１
定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５０を作製した。配列番号：１６５のＶＨ
及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５
Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５
１を作製した。配列番号：１６５のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶ
Ｌ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域
を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５２を作製した。配列番号：１６５のＶＨ及び配列
番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ
４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５４を作製
した。配列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、
並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単
特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５５を作製した。配列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１
６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ
置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５６を作製した。配
列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗
ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５８を作製した。
実施例１２：初代Ｔ細胞に対するヒト化抗ＣＤ３ヒットの内因性細胞結合
抗ＣＤ３抗体の得られたパネルを、初代ヒトＴ細胞上の細胞表面ＣＤ３εに対する結合
性について試験した。この試験を行うために、ポリクローナル抗ヒト二次抗体を使用して
、発現上清からの抗体の結合を可視化し、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔に
、細胞表面ＣＤ３εに対する抗ＣＤ３抗体の結合性を、陰性選択により精製された初代ヒ
トＴリンパ球（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ，Ｃｏｌｍａｒ，ＵＳＡ）を
使用するフローサイトメトリーにより評価した。発現上清又は精製抗体をそれぞれ培地又
はＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）中において１０μｇ／ｍＬに正規化
した。２×１０５個の細胞を、９６ウェル丸底プレート（ＣｏＳｔａｒ）のウェルに、標
識化のためにアリコートした。発現上清中の抗体を、細胞に加え、４℃で４５分間インキ
ュベートした。１３００ｒｐｍで３分間の遠心分離及び上清の除去後、５０μＬの抗ヒト
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、終濃度１０μｇ／ｍＬで、４℃において、直接光を避けて、
細胞と共に３０分間インキュベートした。続けて、洗浄し、３０μＬのＦＡＣｓ緩衝液（
ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁させた。サンプル収集を、ＦｏｒｅＣｙｔソ
フトウェアを使用するＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨＴＦＣシステムにおいて行った。結合分
析の前に、緑色又は赤色のｆｉｘａｂｌｅ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）と、前方／側方散乱面積及び高さパラメータをそれぞれ
使用して、生きた単一の細胞をゲーティングした。平均蛍光強度値を使用して、Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５においてグラフ化した。
滴定系列をランしたが、中間濃度を、明確性のために、図１３に表わす。治療抗体とし
て、同一のＦｃ領域を有する２つの自社製ファージ由来抗体；Ｇ１１（ＨＣ配列番号：１
７６、ＬＣ配列番号：１７７）（非ｃｙｎｏ交差反応性、アゴニスト抗体を、陽性コント
ロールとして使用した）、及びＣＤ３Ｂ９４（ＨＣ配列番号：１７８、ＬＣ配列番号：１
７９）（非バインダー／非アゴニスト抗体を、非特異的結合を評価するのに使用した）を
、コントロールとして使用した。市販のＳＰ３４抗体を、このアッセイでは比較対象とし
て使用しなかった。ＳＰ３４抗体は、マウス抗体であり、異なる二次検出試薬の使用は、
試験された変異体との直接的な比較を妨げるであろうためである。
データから、ヒト化抗ＣＤ３ヒットのパネル内での結合可能性のアレイが証明される。
ここで、２つの抗体（ＣＤ３Ｂ１４４、ＣＤ３Ｂ１５２）は、ヒトＴ細胞に対する結合性
の完全な損失を示す。残りの抗体は、任意の閾値としてＧ１１結合を使用して強いバイン
ダーと弱いバインダーとに広く分割され得る結合可能性の範囲を示した。これらのパラメ
ータを使用して、７つの強いバインダーと、７つの弱いバインダーとを、変異体のパネル
から特定した（図１３）。
それから、初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗ＣＤ３ヒットの結合性解析を、
交差反応性の保持を評価するために試験した。カニクイザルの末梢血から精製されたＣＤ
４＋Ｔ細胞（Ｚｅｎ Ｂｉｏ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，ＵＳＡ
）を使用した。アッセイプロトコルは、上記されたものと同様とした。Ｇ１１は、カニク
イザルＣＤ３ε（ＣＤ３Ｂ１２４）と交差反応しないため、マウスフレームワーク及びヒ
トＩｇＧ１ Ｆｃを有するＳＰ３４のＶＨ及びＶＬを有する自社製キメラＳＰ３４由来抗
体を、このアッセイにおける陽性コントロールとして使用した（図１４）。興味深いこと
に、複数の変異体が、ヒト細胞について見られた結合可能性と比較して、低下した結合可
能性を示した。これには、強いバインダーであるＣＤ３Ｂ１５０、ＣＤ３Ｂ１５１、及び
ＣＤ３Ｂ１５４が含まれ、結合性が低下した。複数の弱いバインダーは、もはや、バック
グラウンドを上回って結合を検出することができなかった。結合性のこの損失は、特定の
免疫グロブリン鎖に関係しなかった。このことは、重鎖と軽鎖との組み合わせが、交差反
応性の損失において役割を果たすことを示唆している。まとめると、これらのアッセイに
より、ヒトＣＤ３εとカニクイザルのＣＤ３εとの間での種間交差反応性を保持した変異
体の特定が可能となった。
実施例１３：初代Ｔ細胞におけるヒト化抗ＣＤ３ヒットの機能性解析
結合性分析により、ヒト化抗ＣＤ３ヒットのパネルが、ヒト及びカニクイザルＴ細胞に
対する結合可能性の範囲を示したことが証明された。ＣＤ３ε架橋を介して活性化を誘引
する各変異体の能力を調査するために、初代Ｔ細胞を、ビーズコンジュゲート抗体の存在
下において、一晩培養した。翌日、細胞を回収し、抗ＣＤ６９抗体で標識し、活性化を測
定した（図１３）。ヒト化抗ＣＤ３抗体を、プロテインＡコート磁性ビーズ（Ｓｐｈｅｒ
ｏＴｅｃｈ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ，ＵＳＡ）に、１０μｇ／ｍＬでの抗体と一晩イン
キュベートすることにより結合させた。翌日、２×１０５個の初代ヒトＴ細胞を、丸底細
胞培養プレートに３連で播種し、２×１０５個のコートビーズを加えた。３７℃で一晩培
養した後、細胞を回収し、抗ＣＤ６９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（クローン
ＦＮ５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識して、この活性化マーカーの上方制御を評価した
。サンプルの収集及び分析を、結合性について上記されたように行った。複数の陰性コン
トロールをランした。同コントロールには、Ｔ細胞単独、Ｔ細胞と非コートビーズ、及び
Ｔ細胞とアイソタイプコントロール（ＣＤ３Ｂ９４）コートビーズが挙げられる。これら
は全て、非染色Ｔ細胞と比較して、同様の平均蛍光強度値を示した。このことは、バック
グラウンドがこのアッセイにおいて低かったことを示している。複数の陽性コントロール
を、比較のためにランした。同コントロールには、ＯＫＴ３（米国特許第５９２９２１２
号）及び市販のＳＰ３４－２抗体が挙げられる。
それから、ヒト化抗ＣＤ３ヒットを、同一のアッセイにおいて、初代カニクイザルＣＤ
４＋Ｔ細胞（Ｚｅｎ Ｂｉｏ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，ＵＳＡ
）を活性化するその能力について試験した（図１４）。ＦＮ５０抗ＣＤ６９抗体は、非ヒ
トタンパク質と交差反応性であると説明されてきたため、これらの細胞の活性化を試験す
るために使用することができた。
ヒト及びカニクイザルでの活性化データは、ヒットのパネルが活性化の可能性の範囲を
示した結合データと関連した。数多くの強いバインダーが、市販のＳＰ３４－２と比較し
て同等又は上回る程度に、ヒトＴ細胞を活性化する能力を示した。複数の変異体は、ＳＰ
３４－２と比較して低い活性化可能性を示した。一方、一部のバインダーは、ＣＤ６９刺
激の証拠を示さなかった。活性化能がないのは、結合性がないか又は弱い結合性を示した
変異体においてのみ見られ、強いバインダーは全て、あるレベルの活性化を示した。この
ことは、ヒト（図１５Ａ）及びカニクイザル（図１５Ｂ）の両方についての、結合性と活
性化との間の相関性を示唆している。
実施例１５．ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａにおける二重特異性フ
ォーマットでの多重特異性抗原結合分子の調製
ＣＤ３ ｍＡｂアーム（ＦＮ３ドメイン融合があるもの及びないもの）と、インビトロ
Ｆａｂアーム交換（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載）での単特異性ＰＳＭＡ
Ｆｎ３ドメインＦＣ融合とを組み合わせることにより、二重特異性のＰＳＭＡ×ＣＤ３
多重特異性抗原結合分子を作製した。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する二重特異性
の単離された多重特異性抗原結合分子を作製するために、抗ＣＤ３ ｍＡｂを複数の方向
に有する融合タンパク質としての抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン（Ｐ２３３ＦＲ９－Ｈ１０
、配列番号：４１）を作製し、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させてＰＳＭＡ発現細胞株へと
向けさせるこれらの分子の能力に関して、かかる方向の効果を評価した。
ＣＤ３ ｍＡｂ Ｂ２１９の発現
単特異性ＣＤ３抗体の１つであるＣＤＢ１４６を、Ｆｃ領域内にＦｃ置換Ｓ２２８Ｐ、
Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ（番号付けは、ＥＵインデックスに
従う）を有するＩｇＧ４として発現させた。ＨＥＫ２９３細胞に対して一過性トランスフ
ェクションを行うことにより、単特異性抗体を作製した。
配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並び
に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有するＩｇ
Ｇ４定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体Ｂ２１９を作製した。単特異性抗ＣＤ３抗体Ｂ
２１９は、配列番号：１７０の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：１７１の重鎖アミノ酸
配列を含んでいる。
ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合の設計
一価のＣＤ３相互作用又は二価のＣＤ３相互作用のいずれか一方を生じさせる構築物を
設計した。一価のＣＤ３相互作用としては、Ｂ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×
ＣＷ５（配列番号：１７２）、Ｂ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ６（配列
番号：１７３）及びＢ２２１（配列番号：１７０及び１７４）×ＣＷ５（配列番号：１７
２）があり、二価のＣＤ３相互作用としては、Ｂ２２１（配列番号：１７０及び１７４）
がある。同様に、一価のＰＳＭＡ相互作用を生じさせることが可能な分子：Ｂ２１９（配
列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ６（配列番号：１７３）及びＢ２１９（配列番号：１
７０及び１７１）×ＣＷ５（配列番号：１７２）、又は二価のＰＳＭＡ相互作用を生じさ
せることが可能な分子：Ｂ２２１（配列番号：１７０及び１７４）及びＢ２２１（配列番
号：１７０及び１７５）×ＣＷ５（配列番号：１７２）を設計した。最後のバリエーショ
ンは重鎖に関連するＦＮ３ドメインの位置であり、Ｎ末端及びＣ末端の両方を有する融合
を作製した。全ての分子において、Ａ（ＧＧＧＧＳ）２リンカー（配列番号：１７５）を
、Ｐ２３３ＦＲ９－Ｈ１０と重鎖定常領域との間に導入した。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗
原に結合する設計した単離された多重特異性抗原結合分子の略図を図１６に示す。
Figure 2022068193000028
アミノ酸配列を、ＤＮＡに逆翻訳させ、遺伝子合成手法（米国特許第６，６７０，１２
７号、米国特許第６，５２１，４２７号）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ＣＭＶプロ
モータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、タン
パク質を発現させた。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分
子生物学的手法を使用して、重鎖（ＨＣ）ｖ領域を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４
０５Ｌ変異を含有するヒトＩｇＧ４－ＡＡ Ｆｃ上にサブクローニングした。ＣＭＶプロ
モータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、軽鎖
（ＬＣ）可変領域を、ヒトラムダ（λ）定常領域上にサブクローニングした。得られたプ
ラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にトランスフェクション
し、ｍＡｂを発現させた。プロテインＡカラム（ｈｉＴｒａｐ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ Ｓ
ｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法により精製した。溶出後、プールを、Ｄ－ＰＢＳ
、ｐＨ７．２内へ透析した。
抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ５を作製した。当該抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン
融合ＣＷ５は、リンカー（配列番号：１７５）でＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ
置換を有するＩｇＧ４定常領域のＣ末端と連結した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２３３
ＦＲ９－Ｈ１０（配列番号：４１）、及び配列番号：１７２を含む融合のアミノ酸配列を
含む。抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ６を作製した。当該抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメ
イン融合ＣＷ６は、リンカー（配列番号：１７５）でＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３
５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域のＮ末端と連結した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２
３３ＦＲ９－Ｈ１０（配列番号：４１）、及び配列番号：１７３を含む融合のアミノ酸配
列を含む。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する単離された二重特異性の抗ＰＳＭＡ×
ＣＤ３抗原結合分子であるＢ２２１を作製した。当該Ｂ２２１は、重鎖のＣ末端において
、リンカー（配列番号：１７５）でＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｐ２３３ＦＲ９－Ｈ１０
（配列番号：４１）に結合する抗ＰＳＭＡ単離多重特異性抗原結合分子と融合した、配列
番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びにＳ２
２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ４定常
領域を含む、抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｂ２１９と、配列番号：１７４を含む重鎖及び配列番号
：１７０を含む軽鎖によりＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３
単離多重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列と、を含む。
表１７に記載の親分子の組み合わせを用いた部分的な還元及び制御されたＦａｂアーム
交換により、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原タンパク質（Ｂ２１９×ＣＷ５、Ｂ２１９×Ｃ
Ｗ６及びＢ２２１×ＣＷ５）に結合する、単離された多重特異性抗原結合分子を調製した
。簡潔に、親分子を約１～２０ｍｇ／ｍＬでモル比１．０８：１（Ｂ２１９／Ｂ２２１：
Ｗ５／Ｗ６）で混合し、２－ＭＥＡ（ＰＢＳ中７５０ｍＭの原液）を７５ｍＭの終濃度と
なるように添加した。反応液を３１℃で５時間インキュベートし、続いてＰＢＳで透析し
た。それからタンパク質を回収して滅菌濾過し、２８０ｎｍの吸光度で純度及び濃度を測
定してから、陽イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した
。
ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｂ２１９×ＣＷ５に結合する、二重特異性の抗ＰＳＭＡ×
ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子を作製した。当該分子は、配列番号：１６３及び１６
９のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を含むＢ２１９抗ＣＤ３重鎖及び軽鎖と対になった配列番
号：１７２のアミノ酸配列を含むＣＷ５抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含む。
ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｂ２１９×ＣＷ６に結合する、二重特異性の抗ＰＳＭＡ×Ｃ
Ｄ３単離多重特異性抗原結合分子を作製した。当該分子は、配列番号：１７１及び１７０
のアミノ酸配列を含むＢ２１９抗ＣＤ３重鎖及び軽鎖と対になった配列番号：１７３のア
ミノ酸配列を含むＣＷ６抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含む。二重特異性の抗
ＰＳＭＡ×ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子であるＢ２２１×ＣＷ５を作製した。当該
分子は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含むＢ２２１抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ ＦＮ３
ドメイン重鎖融合と対になった配列番号：１７２のアミノ酸配列と、配列番号：１７０の
アミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、ＣＷ５抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含
む。
Figure 2022068193000029
Figure 2022068193000030
実施例１６：機能性細胞殺傷アッセイを用いた、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合す
る二重特異性の単離された多重特異性抗原結合分子の評価
２４時間の標準的なクロム放出アッセイを用いて、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣＡＰ腫瘍標的（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０）を殺傷する機能を有するＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結
合する、単離された多重特異性抗原結合分子を決定した。１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３（米国
特許第５９２９２１２号）及び２０Ｕ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃２
００－０２）を用いて、正常ドナーの凍結汎Ｔ細胞（Ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ Ｃａｔ＃ＰＢ
９００－１Ｆ）を１２～２４時間で予め活性化させた。その後Ｔ細胞を洗浄してから、ク
ロムで標識したＲＰＭＩ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃ＮＥＺ０３０Ｓ００１Ｍ
Ｃ）中、エフェクター：標的比率５：１でＬＮＣＡＰ腫瘍標的細胞と共培養した。投与量
最大時のウェル内終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に
結合する単離された多重特異性抗原結合分子を添加した。その後、１：２０希釈溶液を用
いた７点の滴定曲線を作製し、１８～２４時間インキュベートした。培養液の上清を回収
し、ガンマカウンターの測定値を読んだ。標的細胞からのクロムの自然放出を制御するた
めに、標的を培地だけで培養してから、上清を回収した。Ｔｒｉｔｉｏｎ－Ｘ－１００を
添加して全標的を溶解させ、最大放出を測定した。ガンマカウンターを用いて１分あたり
のカウントを収集し、次式を用いて％細胞傷害性を測定した。全てのサンプルに対して３
回行った。
％細胞傷害性の算出＝（実験カウント－自然放出）（最大放出－自然放出）×１００％
。
％細胞傷害性をそれぞれに対し３回算出し、３回の％細胞傷害性の平均＋ＳＥＭをプロ
ットする。
図１７は、２回の独立した実験における代表的なグラフを示す。データは、Ｂ２１９×
ＣＷ６による腫瘍細胞殺傷をもたらすＣＤ３Ｂ２１９×ＰＳＭＡ単離ＣＤ３×ＰＳＭＡ二
重特異性抗原結合分子の全ての構造が最も強力であり、Ｂ２２１及びＢ２１９×ＣＷ５が
それに続くことを示している。以下の表２２は、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性
抗原結合分子のそれぞれに対するＥＣ５０、これらＥＣ５０の９５％信頼区間、及びＲ二
乗値を示している。
Figure 2022068193000031
実施例１７：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスを用いたＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ異種移植片
の腫瘍化抑制における、Ｍａｂｔｙｒｉｎ Ｂ２１９×ＣＷ６の抗腫瘍効果
雄ＮＳＧマウスに播種したヒトドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＨＥＫ２９
３－ＰＳＭＡヒト異種移植片の腫瘍化抑制（予防モデル）により、Ｂ２１９×ＣＷ６の効
果を評価した（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ，
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。腫瘍細胞
移植の７日前（－７日目）に、外側尾静脈から、１×１０７個のヒトＰＢＭＣをマウスに
静注（ｉｖ）した。０日目に、１×１０７個のＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞をマウスの右
後脇腹に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍移植の初日に、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍ
ｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ（２５ｇマウスあたり、それぞれ０．１μｇ、１μｇ及び１
０μｇに相当）でＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）コントロール及びＢ２１９×ＣＷ６を静注
投与し、１日おきから２日おきに、０日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目にトー
タルで５回の投与を行った。
腫瘍容積を、次式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ａ」はノギス測
定により求められた腫瘍の長さを表し、「ｂ」はノギス測定により求められた腫瘍の幅を
表す）を用いて算出し、試験中、週２回モニターした。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）を、治
療群の平均腫瘍容積とコントロール群（ＰＢＳ）の平均腫瘍容積との間の差と定義し、Ｔ
ＧＩ＝［（（ＴＶｃ－ＴＶｔ）／ＴＶｃ）＊１００］（式中、ＴＶｃは、任意のコントロ
ール群における平均腫瘍容積であり、ＴＶｔは、治療群における平均腫瘍容積である）を
用いて算出した。ＮＣＩ基準で定義されるように、≧６０％ ＴＧＩは生物学的に有意と
考えられている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＩ，ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅ
ｒ ８４（１０）：１４２４～３１）。最大腫瘍容積が１５００ｍｍ３に達したとき、動
物を試験から除外した。
ヒトＰＢＭＣの移植は最終的に、マウスの移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらす。こ
の場合、移植されたドナーＴ細胞は活性化され、宿主組織に浸潤し、体重減少及び臓器不
全をもたらし、必然的に死亡する。ＧＶＨＤの発症及び重症度をモニターするために、体
重を１週間に２回記録し、グラム（ｇ）単位で表した。体重変化率を、次式：体重変化＝
［（（Ｂｔ Ｂ０）／Ｂ０）＊１００］（式中、Ｂｔは、試験の任意の日における体重で
あり、Ｂ０は、治療開始時の体重である）を用いて算出した。当初の体重に対し２０％超
の体重減少を維持した動物は瀕死であるとみなされ、試験から除外した。
Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージ
ョン６）を使用）を利用した、多重比較１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて、統計的有意性
を評価した。指定した試験用の別の統計解析法は、実験ノートに記載されている。
全インビボ試験は、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｊａｎｓｓｅｎ
Ｒ ＆ Ｄ（Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，ＰＡ）により承認された。
Ｂ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎ治療により、腫瘍化が効果的に遅延し、移植した
ＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞の腫瘍増殖を阻害した（図１８）。小さいが触知可能なＨＥ
Ｋ２９３－ＰＳＭＡ腫瘍は、試験１６日目（最後の治療処置から６日後）のＰＢＳ治療群
におけるマウスの８匹中７匹で検出可能であった。それに対し、ＣＤ３Ｂ２５０（０．４
ｍｇ／ｋｇ）治療群のマウス全８匹において腫瘍は見られなかった。Ｂ２１９×ＣＷ６（
０．０４ｍｇ／ｋｇ）治療群のマウスでは、８匹中２匹が触知可能な腫瘍を有し、Ｂ２１
９×ＣＷ６（０．００４ｍｇ／ｋｇ）群マウスでは、８匹中１匹が小さな腫瘍を有してい
た。各群あたり依然として７匹又は８匹いる状態で、治療終了から３２日後（腫瘍移植後
４２日目）に腫瘍増殖抑制を評価した。Ｂ２１９×ＣＷ６高投与（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｎ
＝８）治療群における腫瘍増殖は、ＰＢＳ治療コントロールと比較して８５％阻害された
（ｐ＜０．００１）。Ｂ２１９×ＣＷ６中間投与（０．０４ｍｇ／ｋｇ）では、ＰＢＳコ
ントロールと比較して統計的に有意な方法（ＴＧＩ＝６７％、ｎ＝７）で腫瘍増殖を阻害
した（ｐ＜０．０００１）。最後に、Ｂ２１９×ＣＷ６最低投与（０．００４ｍｇ／ｋｇ
）でもまた、腫瘍に対してＰＢＳ治療を施したコントロールと比較して７８％、ＨＥＫ２
９３－ＰＳＭＡ腫瘍の増殖を効果的に阻害した（ｐ＜０．０００１）。
本試験においてＰＢＭＣを投与された動物群は結局、進行性ＧＶＨＤで死亡したが、体
重減少はわずかであった（図１９）。Ｂ２１９×ＣＷ６（１μｇ）群のうち１匹のマウス
だけ著しく体重が増加し、３０日目にＧＶＨＤで死亡した。４２日目までに、ＰＢＳ治療
群における腫瘍の大部分が１５００ｍｍ３の腫瘍容積指標を超え、その時点で本試験を終
了させた。

以下の態様を包含し得る。
［１］ ａ．ＦＮ３ドメインと、
ｂ．軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ．重鎖（ＨＣ）と、を含む、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子で
あって、
前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し
、前記ＨＣと前記ＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形
成する、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結
合フラグメント。
［２］ 前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ
３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［３］ 前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４である、上記［１］に記載の単離されたＣＤ
３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［４］ 前記ＦＮ３ドメインは、カニクイザルＰＳＭＡ又はチンパンジーＰＳＭＡと交差
反応する、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又は
その二重特異性抗原結合フラグメント。
［５］ カニクイザルＰＳＭＡは、配列番号：３２を含む、上記［４］に記載の単離され
たＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［６］ 前記チンパンジーＰＳＭＡは、配列番号：３３を含む、上記［４］に記載の単離
されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメン
ト。
［７］ ａ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号：４
のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、前記配列番号：１又は配列番号：４は、残基位置１１
、１４、１７、３７、４６、７３及び／又は８６において置換を任意選択的に有する、又
は、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブ
ラリから単離されている、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗
原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［８］ 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、
５２、５３、６２に対応する少なくとも１つの残基位置において、又はＣ末端において、
システイン残基を有する、上記［１］～［７］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重
特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［９］ 前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラ
グメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、上記［１
］～［８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子
又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１０］ 前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フ
ラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプを含む、上記［９］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰ
ＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１１］ 前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡ酵素活性を阻害する、上記［１］～［１
０］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はそ
の二重特異性抗原結合フラグメント。
［１２］ 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１を含む、上記［１］～［１２］のいず
れか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異
性抗原結合フラグメント。
［１３］ 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１である、上記［１］～［１３］のいず
れか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異
性抗原結合フラグメント。
［１４］ 前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡのエピトープＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰ
ＲＩＳＫ（配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に結合する、上
記［１］～［１４］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原
結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１５］ 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と少なくとも８９％同
一であるか、又は前記配列番号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０又は１１カ所の置換を有する、アミノ酸配列を含む、上記［１］
～［１５］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子
又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１６］ 前記ＦＮ３ドメインのＮ末端においてメチオニンを更に含む、上記［１］～［
１６］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又は
その二重特異性抗原結合フラグメント。
［１７］ 前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：４０のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：３５のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：３６のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：３７のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：３８のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：３９のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：４６のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：４５のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：４１のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：４４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：４２のアミノ酸配列、又は、
ｌ．配列番号：４３のアミノ酸配列、を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘ
ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１８］ 前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：４７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：５１のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：５０のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：４９のアミノ酸配列、を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘ
ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［１９］ 前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：７５のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：７６のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：７７のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：７８のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：７９のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：８０のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：８１のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：８２のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：８３のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：８４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：８５のアミノ酸配列、
ｌ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｍ．配列番号：８７のアミノ酸配列、
ｎ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｏ．配列番号：８９のアミノ酸配列、
ｐ．配列番号：９０のアミノ酸配列、
ｑ．配列番号：９１のアミノ酸配列、
ｒ．配列番号：９２のアミノ酸配列、
ｓ．配列番号：９３のアミノ酸配列、
ｔ．配列番号：９４のアミノ酸配列、
ｕ．配列番号：９５のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号：９６のアミノ酸配列、
ｗ．配列番号：９７のアミノ酸配列、
ｘ．配列番号：９８のアミノ酸配列、
ｙ．配列番号：９９のアミノ酸配列、
ｚ．配列番号：１００のアミノ酸配列、
ａａ．配列番号：１０１のアミノ酸配列、
ｂｂ．配列番号：１０２のアミノ酸配列、
ｃｃ．配列番号：１０３のアミノ酸配列、
ｄｄ．配列番号：１０４のアミノ酸配列、
ｅｅ．配列番号：１０５のアミノ酸配列、
ｆｆ．配列番号：１０６のアミノ酸配列、
ｇｇ．配列番号：１０７のアミノ酸配列、
ｈｈ．配列番号：１０８のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：１０９のアミノ酸配列、
ｊｊ．配列番号：１１０のアミノ酸配列、
ｋｋ．配列番号：１１１のアミノ酸配列、
ｌｌ．配列番号：１１２のアミノ酸配列、
ｍｍ．配列番号：１１３のアミノ酸配列、
ｎｎ．配列番号：１１４のアミノ酸配列、
ｏｏ．配列番号：１１５のアミノ酸配列、
ｐｐ．配列番号：１１６のアミノ酸配列、
ｑｑ．配列番号：１１７のアミノ酸配列、
ｒｒ．配列番号：１１８のアミノ酸配列、
ｓｓ．配列番号：１１９のアミノ酸配列、
ｔｔ．配列番号：１２０のアミノ酸配列、
ｕｕ．配列番号：１２１のアミノ酸配列、
ｖｖ．配列番号：１２２のアミノ酸配列、
ｗｗ．配列番号：１２３のアミノ酸配列、
ｘｘ．配列番号：１２４のアミノ酸配列、
ｙｙ．配列番号：１２５のアミノ酸配列、
ｚｚ．配列番号：１２６のアミノ酸配列、
ａａａ．配列番号：１２７のアミノ酸配列、
ｂｂｂ．配列番号：１２８のアミノ酸配列、
ｃｃｃ．配列番号：１２９のアミノ酸配列、
ｄｄｄ．配列番号：１３０のアミノ酸配列、
ｅｅｅ．配列番号：１３１のアミノ酸配列、
ｆｆｆ．配列番号：１３２のアミノ酸配列、
ｇｇｇ．配列番号：１３３のアミノ酸配列、
ｈｈｈ．配列番号：１３４のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号：１３５のアミノ酸配列、
ｊｊｊ．配列番号：１３６のアミノ酸配列、
ｋｋｋ．配列番号：１３７のアミノ酸配列、
ｌｌｌ．配列番号：１３８のアミノ酸配列、
ｍｍｍ．配列番号：１３９のアミノ酸配列、又は、
ｎｎｎ．配列番号：１４０のアミノ酸配列、を含む、上記［１］に記載の単離されたＣ
Ｄ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［２０］ 前記ＬＣは、
ａ．配列番号：１６７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６８のアミノ酸配列、又は、
ｃ．配列番号：１６９のアミノ酸配列、を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３
ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［２１］ 前記ＨＣは、
ａ．配列番号：１６３のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６４のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：１６５のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：１６６のアミノ酸配列、を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３
ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［２２］ ａ．前記ＨＣは、配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列
番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｂ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１
６８のアミノ酸配列を含む、
ｃ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１
６９のアミノ酸配列を含む、
ｄ．ＨＣは、配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
６７のアミノ酸配列を含む、
ｅ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｇ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｈ．ＨＣは、配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
６７のアミノ酸配列を含む、
ｉ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｊ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｋ．ＨＣは、配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
６７のアミノ酸配列を含む、
ｌ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｆ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
：１６９のアミノ酸配列を含む、又は、
ｇ．ＨＣは、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１７０
のアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原
結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
［２３］ ＰＳＭＡ過剰発現がんを有する対象を治療するための方法であって、
治療的に有効な量の、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３
ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対
象に、前記がんを治療するのに十分な時間投与することを含む、方法。
［２４］ それを必要とする対象においてＰＳＭＡ過剰発現がん細胞の成長又は増殖を阻
害するための方法であって、
治療的に有効な量の、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３
ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対
象に投与することを含む、方法。
［２５］ それを必要とする対象においてＴ細胞をＰＳＭＡ過剰発現がん細胞へと再指向
させる方法であって、
治療的に有効な量の、上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３
ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対
象に投与することを含む、方法。
［２６］ 前記がんは、固体腫瘍である、上記［２３］、［２４］又は［２５］に記載の
方法。
［２７］ 前記がんは、血管新生疾患である、上記［２３］、［２４］又は［２５］に記
載の方法。
［２８］ 前記がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、
肺がん、扁平上皮がん、神経膠腫、乳がん又は腎がんである、上記［２３］、［２４］又
は［２５］に記載の方法。
［２９］ 前記がんは、前立腺がんである、上記［２７］に記載の方法。
［３０］ 第２の治療剤を投与することを更に含む、上記［２３］、［２４］又は［２５
］に記載の方法。
［３１］ 前記第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療である、上記［３０］
に記載の方法。
［３２］ 前記化学療法剤又は標的化抗がん治療は、アビラテロンアセテート（ザイティ
ガ）、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリクス、
ドセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリンアセテート、ジェブタナ（カバジタキセル）
、ロイプロリドアセテート、リュープロン（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデ
ポ（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ－３ヵ月（ロイプロリドアセテート）
、リュープロンデポ－４ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ－ペッド（
ロイプロリドアセテート）、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ（シプ
リューセル－Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプリューセル－Ｔ、タキソテール（ドセタ
キセル）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２
３）、イクスタンジ（エンザルタミド）又はゾラデックス（ゴセレリンアセテート）であ
る、上記［３１］に記載の方法。
［３３］ 前記第２の治療剤は、前記単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分
子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと同時に、連続的に又は別々に、前記対象に
投与される、上記［３０］～［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］ 上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二
重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される
担体と、を含む、医薬組成物。
［３５］ 上記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二
重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、同分子又はフラグメ
ントのための包装と、を含む、キット。
［３６］ ａ．重鎖と、
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
［３７］ 前記重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡである、上記［３６］に記載の融合タ
ンパク質。
［３８］ ａ．Ｆｃ領域と、
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
［４０］ 前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のアミノ末端に連結されて
いる、上記［３８］に記載の融合タンパク質。
［４１］ 前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に連結
されている、上記［３８］に記載の融合タンパク質。
［４２］ 前記リンカーは、配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む、上記［３６］～［
４１］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［４３］ 前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号
：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７２のアミノ酸配列を
含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその
二重特異性抗原結合フラグメント。
［４４］ 前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号
：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を
含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその
二重特異性抗原結合フラグメント。
［４５］ 前記重鎖は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号
：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を
含む、上記［１］に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその
二重特異性抗原結合フラグメント。
［４６］ 上記［４３］～［４５］のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ
二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され
る担体と、を含む、医薬組成物。
［４７］ 上記［３６］～［４２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする
、単離された合成ポリヌクレオチド。
配列
配列番号：１＝オリジナルのＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
配列番号：２＝ＴＣＬ１ライブラリ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ（Ｘ）７－
１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のア
ミノ酸であり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠損であ
る。
配列番号：３＝ＴＣＬ２ライブラリ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦ
ＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩ
ＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ２は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ４は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ５は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ６は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｐ
ｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒで
あり、Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉ
ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌで
あり、Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、
Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ
であり、Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ
、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａ
ｌであり、Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉ
ｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶ
ａｌであり、Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈ
ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又は
Ｖａｌであり、Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、
Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又
はＶａｌであり、Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ
、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
又はＶａｌである。
配列番号：４＝安定化させたＴｅｎｃｏｎ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：５＝ＴＣＬ７（ＦＧ及びＢＣループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹ
ＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰ
ＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２
、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ
、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９
は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠
損である。
配列番号：６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ
３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ
２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ
、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、Ａ
、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損であ
る。
配列番号：７＝ＴＣＬ１４ライブラリ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９
ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２及びＸ１３は、Ａ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹである。
配列番号：８＝ＴＣＬ２４ライブラリ
ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号：８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３
ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０
ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；式中、Ｘ
１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５
、Ｘ１６及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ
、Ｖ、Ｙ又はＷである。
配列番号：９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣ
配列番号：１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＲＥＶ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧ
配列番号：１１＝ＰＯＰ２２５０
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣ
配列番号：１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ
ＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡ
配列番号：１３＝ＢＣ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ
ＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡ
ＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣ
ＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣ
ＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
配列番号：１４＝ＢＣ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣ
ＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣ
ＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧ
ＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴ
ＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
配列番号：１５＝ＢＣ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧ
ＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡ
ＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴ
ＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴ
ＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
配列番号：１６＝ＢＣ６
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴ
ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
配列番号：１７＝１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡ
ＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴ
ＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡ
ＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧ
配列番号：１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ
ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＡＣ
配列番号：１９＝ＬＳ１１１４
ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＡＣ
ＧＣＧ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ
ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＴＣ
配列番号：２０＝ＬＳ１１１５
ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧ
配列番号：２１＝ＬＳ１１１７
ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＡＴ
ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＧＡＡ
配列番号：２２＝ＳＤＧ１０
ＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＣ
ＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号：２３＝ＳＤＧ２４
ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＡＧ
配列番号：２４＝ＰＯＰ２２２２
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣ
配列番号：２５＝ＳＤＧ２８
ＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣ
ＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣ
配列番号：２６＝ＦＧ１２
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣ
ＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡ
ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴ
ＣＴＴＧＧＣ
配列番号：２７＝ＦＧ１１
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣ
ＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ
ＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴ
ＧＧＣ
配列番号：２８＝ＦＧ１０
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴ
ＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡ
ＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
配列番号：２９＝ＦＧ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧ
ＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ
ＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
配列番号：３０＝ＦＧ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡ
ＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧ
ＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
配列番号：３１＝ＦＧ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ
ＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣ
ＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧ
ＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴ
ＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧ
ＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
配列番号：３２＝ＰＳＭＷ１（Ｎ’－ＡｖｉＴａｇ－ＨｉｓＴａｇ－ＧＳ－Ｃｙｎｏ
ＰＳＭＡ＿ＥＣＤ）
ＫＳＳＳＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＨＮＦＴＱＩＰＨ
ＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＴＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫ
ＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＡＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳ
ＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩ
ＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＴＧＶＩＬＹＳＤＰＤＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹ
ＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧ
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ＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬ
ＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦ
ＧＭＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬ
ＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＥ
ＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥ
ＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＳＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶ
ＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＶＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶ
ＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩ
ＡＳＫＦＳＥＲＬＲＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰ
ＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳ
ＱＡＷＧＥＶＫＲＱＩＳＩＡＴＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号：３３＝ＰＳＭＷ８（Ｎ’－ＡｖｉＴａｇ－ＨｉｓＴａｇ－ＧＳ－Ｃｈｉｍｐ
ＰＳＭＡ＿ＥＣＤ）
ＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨ
ＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫ
ＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＬＤＩＶＰＰＦＳ
ＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩ
ＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹ
ＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＨＧ
ＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳ
ＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬ
ＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦ
ＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬ
ＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＫ
ＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥ
ＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶ
ＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶ
ＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩ
ＡＳＫＦＴＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰ
ＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳ
ＫＡＷＧＤＶＫＲＱＩＳＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
配列番号：３４＝ヘキサヒスチジンタグ
ＨＨＨＨＨＨ
配列番号：３５＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｇ０３
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：３６＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７０＿Ａ０５
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：３７＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｆ０４
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＶＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：３８＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７０＿Ｆ０９
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＩＤＥＱＲＤＷＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：３９＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＡＩＤＥＱＲＤＷＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：４０＝Ｐ２２９ＣＲ５Ｐ８１９＿Ｈ１１
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
ＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶ
ＹＲＳＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：４１＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０
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ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
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配列番号：４２＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｂ５－５
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＴＩＧＹＷＥＷＤ
ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
ＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：４３＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３－１
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥＷＤ
ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＨＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
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配列番号：４４＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｄ９
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ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＷＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
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配列番号：４５＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ａ０７
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配列番号：４６＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ｈ０１
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配列番号：４７＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｃ末端ｃｙｓ）
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配列番号：４８＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｋ６２Ｃ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤ
ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＣＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
ＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：４９＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｅ５３Ｃ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤ
ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＣＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
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配列番号：５０＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｒ１１Ｃ）
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ＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷ
ＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
配列番号：５１＝非標的ＦＮ３ドメイン（Ｋ６２Ｃ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
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配列番号：５３＝タグを含まないソルターゼＡ
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配列番号：５４＝ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位
ＥＮＬＹＦＱＳ
配列番号：５５＝ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ
ＫＧＧＨＲＳＮ
配列番号：５６＝ＢＣループ
ＤＩＤＥＱＲＤＷ
配列番号：５７＝ＢＣループ
ＴＩＤＥＱＲＤＷ
配列番号：５８＝ＢＣループ
ＶＩＤＥＱＲＤＷ
配列番号：５９＝ＢＣループ
ＡＩＤＥＱＲＤＷ
配列番号：６０＝ＢＣループ
ＥＷＷＶＩＰＧＤ
配列番号：６１＝ＢＣループ
ＧＥＱＦＴＩ
配列番号：６２＝ＢＣループ
ＴＡＰＤＡＡ
配列番号：６３＝Ｃループ
ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
配列番号：６４＝Ｃループ
ＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥ
配列番号：６５＝Ｃループ
ＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥ
配列番号：６６＝Ｃループ
ＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥ
配列番号：６７＝Ｃループ
ＦＤＳＦＴＩＧＹＷＥ
配列番号：６８＝ＣＤループ
ＳＥＫＶＧＥ
配列番号：６９＝ＣＤループ
ＷＤＤＤＧＥ
配列番号：７０＝Ｆループ
ＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
配列番号：７１＝Ｆループ
ＴＥＹＴＶＳＩＹＧ
配列番号：７２＝Ｆループ
ＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶ
配列番号：７３＝Ｆループ
ＴＥＹＷＶＹＩＡＧＶ
配列番号：７４＝Ｆループ
ＴＥＹＨＶＹＩＡＧＶ
配列番号：７５～１４０は、上記表内に示す。
配列番号：１４１＝完全長ｃｙｎｏＰＳＭＡ
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ＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
＞１４５テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン
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ＰＧＤＲＴＴＩＤＬＴＥＤＥＮＱＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＳＲＲＧＤＭＳＳ
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ｓｐｐｌｖｇｔｑｔｔ
＞１４７フィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン
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ＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧ
ＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ
＞１４８
ＧＳＧＳ
＞１４９
ＧＧＧＳＧＧＧＳ
＞１５０
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
＞１５１
ＡＰＡＰ
＞１５２
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
＞１５３
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
＞１５４
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ
Ｐ
＞１５５アルブミン変異体
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨ
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＞１５７ ｃＤＮＡ Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２
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＞１５８ ｃＤＮＡ
Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３－１
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＞１５９ ＰＳＭＡエピトープ
ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ
＞１６０ ＰＳＭＡエピトープ
ＮＷＥＴＮＫＦ
＞１６１ ＳＰ３４軽鎖
ＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧ
ＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴ
ＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴ
ＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴ
ＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＳＲＡＤＣＳ
＞１６２ ＳＰ３４重鎖
ＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳ
ＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＡＡＴＴＴＡＰＳＶＹＰＬＶＰＧＣＳＤＴＳＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰ
ＥＰＶＴＶＫＷＮＹＧＡＬＳＳＧＶＲＴＶＳＳＶＬＱＳＡＦＹＳＬＳＳＬＶＴＶＰＳＳＴ
ＷＰＳＱＴＶＩＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＥＬＩＫＲＩＥＰＲＩＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＣＰＰ
ＧＮＩＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＡＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰ
ＤＶＨＶＳＷＦＶＤＮＫＥＶＨＴＡＷＴＱＰＲＥＡＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱ
ＤＷＭＲＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＲＡＱＴＰＱＶＹＴＩ
ＰＰＰＲＥＱＭＳＫＫＫＶＳＬＴＣＬＶＴＮＦＦＳＥＡＩＳＶＥＷＥＲＮＧＥＬＥＱＤＹ
ＫＮＴＰＰＩＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＫＬＴＶＤＴＤＳＷＬＱＧＥＩＦＴＣＳＶＶＨＥＡ
ＬＨＮＨＨＴＱＫＮＬＳＲＳＰＧＫ
＞１６３ ＣＤ３Ｈ１４１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
＞１６４ ＣＤ３Ｈ１４２
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮ
ＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
＞１６５ ＣＤ３Ｈ１４３
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮ
ＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳ
＞１６６ ＣＤ３Ｈ１４４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡ
ＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＧＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴ
ＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬ
ＶＴＶＳＳ
＞１６７ ＣＤ３Ｌ６３
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
＞１６８ ＣＤ３Ｌ６４
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＬＰＧＴＡＰＫＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧ
ＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
＞１６９ ＣＤ３Ｌ６６
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
＞１７０．Ｂ２１９軽鎖
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱ
ＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧ
ＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴ
ＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫ
ＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴ
ＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
＞１７１．Ｂ２１９重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰ
ＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳ
ＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡ
ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱ
ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳ
ＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ
ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ
ＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
＞１７２．ＣＷ５ Ｃ末端ＦＮ３ドメインＦＣ融合
ＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶ
ＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶ
ＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱ
ＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥ
ＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶ
ＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＬＰＡＰ
ＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡ
ＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳ
ＡＩＦＴＴ
＞１７３．ＣＷ６ Ｎ末端ＦＮ３ドメインＦＣ融合
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷ
ＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱ
ＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ
ＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ
ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ
ＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳ
ＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ
ＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳ
ＬＧＫ
＞１７４．Ｂ２２１重鎖
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮ
ＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴ
ＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰ
ＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳ
ＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡ
ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱ
ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳ
ＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ
ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ
ＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳ
ＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹ
ＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
＞１７５
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
＞１７６ Ｇ１１ ｍＡｂ重鎖
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷ
ＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ ＩＮＧＧＧＧＳＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤ
ＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＴＳ ＡＱＲＦＤＹＷＧＱＧ
ＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ ＡＬＧＣＬＶＫ
ＤＹＦ ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳ
ＶＶＴＶＰＳ ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ ＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥ
ＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥ
ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ Ｐ
ＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ
Ｋ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦ
ＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳ
ＬＳＰＧＫ
＞１７７ Ｇ１１ ｍＡｂ軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ ＳＹＬＮＷＹ
ＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬ
ＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＳＹＳＬＰＬＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ
ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ ＰＲＥＡＫＶＱ
ＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ
ＤＹＥＫＨＫ ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ ＲＧＥＣ
＞１７８ ＣＤ３Ｂ９４ ｍＡｂ重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ ＳＹＡＩＳＷ
ＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ ＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩ ＴＡＤ
ＥＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰ ＡＲＬＹＳＹＹＦＤＹ
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧ
ＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬ
ＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳ
ＣＤＫＴＨＴＣ ＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ
ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ ＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱ
ＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧ ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ ＡＬＰＡＰＩＥ
ＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰ ＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴ ＣＬＶＫ
ＧＦＹＰＳＤ ＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ ＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳ
ＫＬＴＶＤＫＳＲ ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳ ＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹ ＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
Ｇ Ｋ
＞１７９ ＣＤ３Ｂ９４ ｍＡｂ軽鎖
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱ
ＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳ
ＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶ
ＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬ
ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡ
ＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ

Claims (46)

  1. ａ．ＦＮ３ドメインと、
    ｂ．軽鎖（ＬＣ）と、
    ｃ．重鎖（ＨＣ）と、を含む、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子で
    あって、
    前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し
    、前記ＨＣと前記ＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形
    成する、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結
    合フラグメント。
  2. 前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳ
    ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  3. 前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４である、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳ
    ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  4. 前記ＦＮ３ドメインは、カニクイザルＰＳＭＡ又はチンパンジーＰＳＭＡと交差反応す
    る、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重
    特異性抗原結合フラグメント。
  5. カニクイザルＰＳＭＡは、配列番号：３２を含む、請求項４に記載の単離されたＣＤ３
    ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  6. 前記チンパンジーＰＳＭＡは、配列番号：３３を含む、請求項４に記載の単離されたＣ
    Ｄ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  7. ａ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号：４のＴｅ
    ｎｃｏｎ２７配列に基づき、前記配列番号：１又は配列番号：４は、残基位置１１、１４
    、１７、３７、４６、７３及び／又は８６において置換を任意選択的に有する、又は、
    ｂ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブ
    ラリから単離されている、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原
    結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  8. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、
    ５３、６２に対応する少なくとも１つの残基位置において、又はＣ末端において、システ
    イン残基を有する、請求項１～７に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結
    合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  9. 前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメン
    トは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項１～８の
    いずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重
    特異性抗原結合フラグメント。
  10. 前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメン
    トは、ＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項９に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重
    特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  11. 前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡ酵素活性を阻害する、請求項１～１０のいずれか
    一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗
    原結合フラグメント。
  12. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載
    の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラ
    グメント。
  13. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１である、請求項１～１３のいずれか一項に記載
    の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラ
    グメント。
  14. 前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡのエピトープＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ
    （配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に結合する、請求項１～
    １４のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はそ
    の二重特異性抗原結合フラグメント。
  15. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と少なくとも８９％同一である
    か、又は前記配列番号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７
    、８、９、１０又は１１カ所の置換を有する、アミノ酸配列を含む、請求項１～１５のい
    ずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特
    異性抗原結合フラグメント。
  16. 前記ＦＮ３ドメインのＮ末端においてメチオニンを更に含む、請求項１～１６のいずれ
    か一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
    抗原結合フラグメント。
  17. 前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ．配列番号：４０のアミノ酸配列、
    ｂ．配列番号：３５のアミノ酸配列、
    ｃ．配列番号：３６のアミノ酸配列、
    ｄ．配列番号：３７のアミノ酸配列、
    ｅ．配列番号：３８のアミノ酸配列、
    ｆ．配列番号：３９のアミノ酸配列、
    ｇ．配列番号：４６のアミノ酸配列、
    ｈ．配列番号：４５のアミノ酸配列、
    ｉ．配列番号：４１のアミノ酸配列、
    ｊ．配列番号：４４のアミノ酸配列、
    ｋ．配列番号：４２のアミノ酸配列、又は、
    ｌ．配列番号：４３のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰ
    ＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  18. 前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ．配列番号：４７のアミノ酸配列、
    ｂ．配列番号：５１のアミノ酸配列、
    ｃ．配列番号：５０のアミノ酸配列、又は、
    ｄ．配列番号：４９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰ
    ＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  19. 前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ．配列番号：７５のアミノ酸配列、
    ｂ．配列番号：７６のアミノ酸配列、
    ｃ．配列番号：７７のアミノ酸配列、
    ｄ．配列番号：７８のアミノ酸配列、
    ｅ．配列番号：７９のアミノ酸配列、
    ｆ．配列番号：８０のアミノ酸配列、
    ｇ．配列番号：８１のアミノ酸配列、
    ｈ．配列番号：８２のアミノ酸配列、
    ｉ．配列番号：８３のアミノ酸配列、
    ｊ．配列番号：８４のアミノ酸配列、
    ｋ．配列番号：８５のアミノ酸配列、
    ｌ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
    ｍ．配列番号：８７のアミノ酸配列、
    ｎ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
    ｏ．配列番号：８９のアミノ酸配列、
    ｐ．配列番号：９０のアミノ酸配列、
    ｑ．配列番号：９１のアミノ酸配列、
    ｒ．配列番号：９２のアミノ酸配列、
    ｓ．配列番号：９３のアミノ酸配列、
    ｔ．配列番号：９４のアミノ酸配列、
    ｕ．配列番号：９５のアミノ酸配列、
    ｖ．配列番号：９６のアミノ酸配列、
    ｗ．配列番号：９７のアミノ酸配列、
    ｘ．配列番号：９８のアミノ酸配列、
    ｙ．配列番号：９９のアミノ酸配列、
    ｚ．配列番号：１００のアミノ酸配列、
    ａａ．配列番号：１０１のアミノ酸配列、
    ｂｂ．配列番号：１０２のアミノ酸配列、
    ｃｃ．配列番号：１０３のアミノ酸配列、
    ｄｄ．配列番号：１０４のアミノ酸配列、
    ｅｅ．配列番号：１０５のアミノ酸配列、
    ｆｆ．配列番号：１０６のアミノ酸配列、
    ｇｇ．配列番号：１０７のアミノ酸配列、
    ｈｈ．配列番号：１０８のアミノ酸配列、
    ｉｉ．配列番号：１０９のアミノ酸配列、
    ｊｊ．配列番号：１１０のアミノ酸配列、
    ｋｋ．配列番号：１１１のアミノ酸配列、
    ｌｌ．配列番号：１１２のアミノ酸配列、
    ｍｍ．配列番号：１１３のアミノ酸配列、
    ｎｎ．配列番号：１１４のアミノ酸配列、
    ｏｏ．配列番号：１１５のアミノ酸配列、
    ｐｐ．配列番号：１１６のアミノ酸配列、
    ｑｑ．配列番号：１１７のアミノ酸配列、
    ｒｒ．配列番号：１１８のアミノ酸配列、
    ｓｓ．配列番号：１１９のアミノ酸配列、
    ｔｔ．配列番号：１２０のアミノ酸配列、
    ｕｕ．配列番号：１２１のアミノ酸配列、
    ｖｖ．配列番号：１２２のアミノ酸配列、
    ｗｗ．配列番号：１２３のアミノ酸配列、
    ｘｘ．配列番号：１２４のアミノ酸配列、
    ｙｙ．配列番号：１２５のアミノ酸配列、
    ｚｚ．配列番号：１２６のアミノ酸配列、
    ａａａ．配列番号：１２７のアミノ酸配列、
    ｂｂｂ．配列番号：１２８のアミノ酸配列、
    ｃｃｃ．配列番号：１２９のアミノ酸配列、
    ｄｄｄ．配列番号：１３０のアミノ酸配列、
    ｅｅｅ．配列番号：１３１のアミノ酸配列、
    ｆｆｆ．配列番号：１３２のアミノ酸配列、
    ｇｇｇ．配列番号：１３３のアミノ酸配列、
    ｈｈｈ．配列番号：１３４のアミノ酸配列、
    ｉｉｉ．配列番号：１３５のアミノ酸配列、
    ｊｊｊ．配列番号：１３６のアミノ酸配列、
    ｋｋｋ．配列番号：１３７のアミノ酸配列、
    ｌｌｌ．配列番号：１３８のアミノ酸配列、
    ｍｍｍ．配列番号：１３９のアミノ酸配列、又は、
    ｎｎｎ．配列番号：１４０のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ
    ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  20. 前記ＬＣは、
    ａ．配列番号：１６７のアミノ酸配列、
    ｂ．配列番号：１６８のアミノ酸配列、又は、
    ｃ．配列番号：１６９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘ
    ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  21. 前記ＨＣは、
    ａ．配列番号：１６３のアミノ酸配列、
    ｂ．配列番号：１６４のアミノ酸配列、
    ｃ．配列番号：１６５のアミノ酸配列、又は、
    ｄ．配列番号：１６６のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘ
    ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  22. ａ．前記ＨＣは、配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１
    ６７のアミノ酸配列を含む、
    ｂ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１
    ６８のアミノ酸配列を含む、
    ｃ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１
    ６９のアミノ酸配列を含む、
    ｄ．ＨＣは、配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
    ６７のアミノ酸配列を含む、
    ｅ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６８のアミノ酸配列を含む、
    ｇ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６９のアミノ酸配列を含む、
    ｈ．ＨＣは、配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
    ６７のアミノ酸配列を含む、
    ｉ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６８のアミノ酸配列を含む、
    ｊ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６９のアミノ酸配列を含む、
    ｋ．ＨＣは、配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１
    ６７のアミノ酸配列を含む、
    ｌ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６８のアミノ酸配列を含む、
    ｆ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号
    ：１６９のアミノ酸配列を含む、又は、
    ｇ．ＨＣは、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１７０
    のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結
    合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
  23. ＰＳＭＡ過剰発現がんを有する対象を治療するための方法であって、
    治療的に有効な量の、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳ
    ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に、
    前記がんを治療するのに十分な時間投与することを含む、方法。
  24. それを必要とする対象においてＰＳＭＡ過剰発現がん細胞の成長又は増殖を阻害するた
    めの方法であって、
    治療的に有効な量の、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳ
    ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投
    与することを含む、方法。
  25. それを必要とする対象においてＴ細胞をＰＳＭＡ過剰発現がん細胞へと再指向させる方
    法であって、
    治療的に有効な量の、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳ
    ＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投
    与することを含む、方法。
  26. 前記がんは、固体腫瘍である、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記がんは、血管新生疾患である、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
  28. 前記がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、肺がん、
    扁平上皮がん、神経膠腫、乳がん又は腎がんである、請求項２３、２４又は２５に記載の
    方法。
  29. 前記がんは、前立腺がんである、請求項２７に記載の方法。
  30. 第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
  31. 前記第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療である、請求項３０に記載の方
    法。
  32. 前記化学療法剤又は標的化抗がん治療は、アビラテロンアセテート（ザイティガ）、ビ
    カルタミド、カバジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリクス、ドセタキ
    セル、エンザルタミド、ゴセレリンアセテート、ジェブタナ（カバジタキセル）、ロイプ
    ロリドアセテート、リュープロン（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ（ロイ
    プロリドアセテート）、リュープロンデポ－３ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュー
    プロンデポ－４ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ－ペッド（ロイプロ
    リドアセテート）、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ（シプリューセ
    ル－Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプリューセル－Ｔ、タキソテール（ドセタキセル）
    、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イ
    クスタンジ（エンザルタミド）又はゾラデックス（ゴセレリンアセテート）である、請求
    項３１に記載の方法。
  33. 前記第２の治療剤は、前記単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はそ
    の二重特異性抗原結合フラグメントと同時に、連続的に又は別々に、前記対象に投与され
    る、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結
    合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む
    、医薬組成物。
  35. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結
    合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、同分子又はフラグメントのための包
    装と、を含む、キット。
  36. ａ．重鎖と、
    ｂ．ＦＮ３ドメインと、
    ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
  37. 前記重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
  38. ａ．Ｆｃ領域と、
    ｂ．ＦＮ３ドメインと、
    ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
  39. 前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のアミノ末端に連結されている、請
    求項３８に記載の融合タンパク質。
  40. 前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に連結されてい
    る、請求項３８に記載の融合タンパク質。
  41. 前記リンカーは、配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む、請求項３６～４１のいずれ
    か一項に記載の融合タンパク質。
  42. 前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０
    のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
    抗原結合フラグメント。
  43. 前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０
    のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む、請
    求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
    抗原結合フラグメント。
  44. 前記重鎖は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０
    のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む、請
    求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性
    抗原結合フラグメント。
  45. 請求項４３～４５のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原
    結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含
    む、医薬組成物。
  46. 請求項３６～４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された合
    成ポリヌクレオチド。
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