JP7377590B2

JP7377590B2 - 抗ｃｄ３イプシロン抗体およびそれを使用する方法

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Publication number: JP7377590B2
Application number: JP2020548663A
Authority: JP
Inventors: ニコラスフィッシャー; ジョヴァンニマジストレッリ; フランクゲノー; ウララヴン
Original assignee: ノビミューンエスアー
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: US20190284297A1; JP2024010066A; EP3765520A1; WO2019175658A1; US11203646B2; JP2021515786A; CA3093330A1; CN112334484A; AU2019235523A1

Description

関連出願
本出願は、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年3月14日に出願された米国特許仮出願62/643,095号の恩典を主張する。

参照による配列表の組み入れ
2019年3月14日に作成され、かつ25.5 KBのサイズである、「NOVI-046_001WO_SequenceListing_ST25.txt」との名前のファイルの内容は、それらの全体が、参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本開示は、CD3イプシロン（CD3ε）に特異的に結合する、モノクローナル抗体、およびそれらの抗原結合断片、バリアント、多量体型、または二重特異性抗体に関連するとともに、様々な治療的、診断的、および予防的な適応において、これらの抗CD3ε抗体およびそれらの抗原結合断片を作製および使用する方法にも関連する。

発明の背景
CD3は、T細胞受容体に伴ってT細胞上に発現される、細胞表面上の複合体である。CD3複合体は、CD8+ Tリンパ球およびCD4+ Tリンパ球の活性化に不可欠である。それは、異なっているが高度に関連性を有している3種類の鎖：1本のCD3ガンマ鎖、1本のCD3デルタ鎖、および2本のCD3イプシロン鎖から形成され、これらの鎖は互いに会合して、CD3イプシロン／ガンマヘテロ二量体、およびCD3イプシロン／デルタヘテロ二量体を形成する。2種類のCD3ヘテロ二量体は、T細胞受容体（TCR）およびシグナル伝達ゼータ鎖ホモ二量体とともに、T細胞受容体複合体を形成する。

T細胞再ターゲティング（retargeting）（またはT細胞再指向化（redirecting））二重特異性抗体（biAb）は、新規なクラスの治療物質であり、T細胞を腫瘍細胞へと動員することができ、そして、腫瘍に特異的な（しかしMHCとは無関係な）、T細胞による細胞傷害の活性化を、誘導することができる。典型的には、T細胞再ターゲティングbiAbは、T細胞の動員のための、CD3に結合するアーム、および腫瘍関連抗原（TAA）に対して特異的な、腫瘍を標的とするアームを含む。そのような二重特異性の設計は、T細胞が標的腫瘍細胞に近接して接触することを可能にして、免疫シナプスの形成、局所的なT細胞の活性化、ならびにそれに続く、T細胞の細胞傷害性顆粒から放出されるパーフォリンおよびグランザイムによる、標的細胞の破壊をもたらす。ここ数年において、T細胞再ターゲティングbiAbは臨床試験において著しい有望性を示しており、悪性腹水症の処置についてカツマキソマブ（商品名レモバブ）、およびB-ALL（B細胞急性リンパ芽球性白血病）の処置についてブリナツモマブ（商品名ビーリンサイト）という、2種類の分子の監督官庁の承認に至っている。ビーリンサイトによって示されるように、T細胞による細胞傷害性応答の、biAbに媒介される再指向化は、有意な割合のB-ALL患者において、腫瘍細胞の、骨髄からの完全な消失、および持続的な分子的寛解を誘導することができ、したがって、この治療アプローチの能力を証明している。

したがって、T細胞再ターゲティングにおける使用のための、完全ヒト型モノクローナル抗体およびそれらの抗原結合配列が、必要とされている。

本発明は、CD3イプシロン（CD3ε）に結合する、抗体または抗原結合断片を提供する。CD3εは、ヒトCD3εまたはカニクイザルCD3εである。抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、または多量体型抗体である。抗体または抗原結合断片は、カニクイザルの、キメラの、ヒト化された、または完全ヒト型のものである。抗体またはその抗原結合断片は、IgG1アイソタイプなどの、IgGアイソタイプである。

モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、例えば、一本鎖抗体（scAb）、Fab断片、F(ab’)₂断片、一本鎖可変断片（scFv）、scFv-Fc断片、多量体型抗体、または二重特異性抗体である。

様々な局面において、本発明はモノクローナル抗体または抗原結合断片を提供し、該モノクローナル抗体または抗原結合断片は、GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRH3）を含む可変重鎖領域；ならびにTGAVTTSNY（SEQ ID NO: 11）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRL1）、GTN（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRL2）、ならびに

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む可変軽鎖領域を有する。

他の局面において、本発明は二重特異性抗体を提供し、該二重特異性抗体は、CD3εに結合する、第一のアームであって、GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む可変軽鎖領域を含む、第一のアーム；ならびにCD3εに結合しない第二のアームを有する。

いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する。

いくつかの態様において、二重特異性抗体は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を有する。

いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、hIGHV3-73フレームワーク領域を含む重鎖領域を有する。例えば、可変重鎖領域は、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、hIGLV7-46フレームワーク領域を含む可変軽鎖領域を有する。例えば、可変軽鎖領域は、SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、二重特異性抗体の第二のアームは、腫瘍関連抗原に結合する。

いくつかの態様において、適したTAAは、非限定的な例として、CD20、HER2、HER3、EGFR、IGF1R、c-Met、PDGFR1、CD40、CD40L、CD30、CS1、CD70、グリピカン、メソテリン、PSMA、PSCA、MUC1、CA125、CEA、FRA、EpCAM、DR5、HGFR1、および／または5T4を含む。

いくつかの態様において、二重特異性抗体は、単一の重鎖ポリペプチドの2つのコピーならびに第一の軽鎖および第二の軽鎖を含み、ここで第一の軽鎖と第二の軽鎖とは異なる。

いくつかの態様において、第一の軽鎖の少なくとも一部分はκ型であり、かつ第二の軽鎖の少なくとも一部分はλ型であり、二重特異性抗体はこれらを含む。いくつかの態様において、第一の軽鎖は、少なくともκ定常領域を含む。いくつかの態様において、第一の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。いくつかの態様において、第一の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。いくつかの態様において、第二の軽鎖は、少なくともλ定常領域を含む。いくつかの態様において、第二の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。いくつかの態様において、第二の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。いくつかの態様において、第一の軽鎖は、κ定常領域およびκ可変領域を含み、かつここで、第二の軽鎖は、λ定常領域およびλ可変領域を含む。

本発明に従う抗体もしくは抗原結合断片または二重特異性抗体を含む、薬学的組成物もまた、本発明に包含される。

さらに、それを必要とする対象に、本発明に従う抗体を含む薬学的組成物を投与することによって、症状もしくは疾患を緩和する方法が、またはそれによってT細胞を再ターゲティングする方法が、本発明によって提供される。疾患は、例えばがんである。
[本発明1001]
（a）GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRH3）を含む、可変重鎖領域；ならびに
（b）TGAVTTSNY（SEQ ID NO: 11）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRL1）、GTN（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRL2）、ならびに

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む、可変軽鎖領域
を含み、
CD3εに結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
可変重鎖領域が、hIGHV3-73フレームワーク領域を含む、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1003]
可変軽鎖領域が、hIGLV7-46フレームワーク領域を含む、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1005]
CD3εが、ヒトCD3εまたはカニクイザルCD3εである、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1006]
モノクローナル抗体、一本鎖抗体（scAb）、Fab断片、F(ab’) ₂ 断片、一本鎖可変断片（scFv）、scFv-Fc断片、多量体型抗体、または二重特異性抗体である、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1007]
カニクイザル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト型抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1008]
IgGアイソタイプである、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1009]
IgG1アイソタイプである、本発明1001の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1010]
（a）CD3εに結合する、第一のアームであって、
（i）GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRH3）を含む、可変重鎖領域；ならびに
（ii）TGAVTTSNY（SEQ ID NO: 11）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRL1）、GTN（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRL2）、ならびに

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む、可変軽鎖領域
を含む、第一のアーム；ならびに
（b）CD3εに結合しない、第二のアーム
を含む、二重特異性抗体。
[本発明1011]
SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、本発明1010の二重特異性抗体。
[本発明1012]
第二のアームが腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、本発明1010の二重特異性抗体。
[本発明1013]
腫瘍関連抗原（TAA）が、EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1、または5T4である、本発明1010の二重特異性抗体。
[本発明1014]
前記二重特異性抗体が、単一の重鎖ポリペプチドの2つのコピーならびに第一の軽鎖および第二の軽鎖を含み、第一の軽鎖と第二の軽鎖とが異なる、本発明1010の二重特異性抗体。
[本発明1015]
第一の軽鎖の少なくとも一部分がκ型であり、かつ第二の軽鎖の少なくとも一部分がλ型である、本発明1014の二重特異性抗体。
[本発明1016]
第一の軽鎖が、少なくともκ定常領域を含む、本発明1015の二重特異性抗体。
[本発明1017]
第二の軽鎖が、少なくともλ定常領域を含む、本発明1016の二重特異性抗体。
[本発明1018]
第二の軽鎖が、λ可変領域をさらに含む、本発明1017の二重特異性抗体。
[本発明1019]
第二の軽鎖が、κ可変領域をさらに含む、本発明1017の二重特異性抗体。
[本発明1020]
第一の軽鎖が、κ定常領域およびκ可変領域を含み、かつ第二の軽鎖が、λ定常領域およびλ可変領域を含む、本発明1014の二重特異性抗体。
[本発明1021]
前記本発明のいずれかの抗体を含む、薬学的組成物。
[本発明1022]
それを必要とする対象に、本発明1021の薬学的組成物を投与する段階を含む、症状または疾患を緩和する方法。
[本発明1023]
疾患ががんである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
それを必要とする対象に、本発明1021の薬学的組成物を投与する段階を含む、T細胞を再ターゲティング（retargeting）する方法。

組み換えヒトCD3ε、カニクイザルCD3ε、およびヒトPD-1組み換えタンパク質に対して、ELISAを用いて、そして対照および候補抗CD3ε抗体によって得られた、結合シグナルを示すグラフ。NI-0701は、陰性対照として使用された抗ヒトCCL5 mAbである。 Jurkat T細胞の染色について、FACSを用いて、そして対照および候補抗CD3ε抗体によって得られた、結合シグナルを示すグラフ。NI-0701は、陰性対照として使用された。健康なヒトドナーから単離されたCD4+ T細胞集団の染色について、FACSを用いて、そして対照および候補抗CD3ε抗体によって得られた、結合シグナルを示すグラフ。健康なヒトドナーから単離されたCD8+ T細胞集団の染色について、FACSを用いて、そして対照および候補抗CD3ε抗体によって得られた、結合シグナルを示すグラフ。健康なヒトドナーから単離されたCD20+ B細胞集団の染色について、FACSを用いて、そして対照および候補抗CD3ε抗体によって得られた、結合シグナルを示すグラフ。

詳細な説明
本発明は、ヒトCD3イプシロン（CD3ε）に結合し、かつカニクイザルCD3εに交差反応性である、抗体のパネルの作製に関連する。これらの抗体はすべて、共通のVH鎖を有し、かつしたがって、κλボディ技術（WO2014087248）を用いる二重特異性抗体の作製に適合性である。カニクイザルCD3εに対する交差反応性は、本明細書に記載される抗CD3ε抗体を組み込んだ、T細胞再指向化二重特異性抗体の前臨床開発を容易にするために、重要な特徴である。さらに、これらの抗CD3ε抗体は、異なる結合親和性を示す。二重特異性抗体のCD3アームの親和性は、二重特異性抗体の機能的活性を顕著に改変することができ、かつしたがって、異なる親和性を有する抗CD3ε抗体の入手は望ましいことである。本明細書に記載される抗体は、最終的な二重特異性κλ構築物において、互いに容易に交換されることができる、なぜなら、それらすべては同じ重鎖を共有しているからである。二重特異性を達成するための変異またはリンカーのいずれかを含む、遺伝子操作された分子に基づく、他のT細胞再ターゲティング二重特異性抗体とは対照的に、本明細書において記載されるκλボディは、本来のヒトIgG構造を保持する。この特徴は、開発の観点から見て際立った利点をもたらす、なぜなら、これらのT細胞再ターゲティング物質も、ヒトモノクローナル抗体の薬物様特性を有するからである。好ましい物理化学的特性と組み合わせられた、それらの未改変のヒト配列および天然の構造は、患者に投与された際に、免疫原性の潜在性を最小限にすると予想される。

本開示は、CD3εに結合するモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、まとめて、本明細書において抗CD3εモノクローナル抗体、または抗CD3ε mAbと呼ばれる。好ましくは、モノクローナル抗体は、少なくともヒトCD3εに対して特異的である。いくつかの態様において、ヒトCD3εを認識するモノクローナル抗体はまた、少なくとも1種類の他の非ヒトCD3εタンパク質、非限定的な例として、非ヒト霊長類CD3ε、たとえばカニクイザルCD3ε、および／または齧歯類CD3εなどに対して、交差反応性である。

本開示はまた、CD3εに対して特異的な第一の結合部位を少なくとも含む、一価抗体および／または二重特異性抗体を提供する。好ましくは、一価抗体および／または二重特異性抗体は、少なくともヒトCD3εに対して特異的である。例示的な態様の、ヒトCD3εを認識する一価抗体および／または二重特異性抗体はまた、少なくとも1種類の他の非ヒトCD3εタンパク質、非限定的な例として、非ヒト霊長類CD3ε、たとえばカニクイザルCD3ε、および／または齧歯類CD3εなどに対して、交差反応性である。本開示はまた、本明細書において開示される抗CD3ε一価抗体および／または抗CD3ε二重特異性抗体と同じエピトープに結合する抗体を、提供する。

いくつかの態様において、二重特異性抗体は、CD3εに結合する第一のアーム、およびCD3εではない第二の標的に結合する第二のアームを含む。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、CD3εに結合する第一のアーム、および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第二のアームを含み、該TAAは、非限定的な例として、EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1、および／または5T4を含む。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、CD3εに結合する第一のアーム、および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第二のアームを含み、ここで第一のアームは、CD3εに低い親和性で結合し、かつ第二のアームはTAAに高い親和性で結合する。いくつかの態様において、TAAは、がん細胞の細胞表面上に発現される抗原である。いくつかの態様において、がん細胞は、肺がん細胞、気管支がん細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、白血病がん細胞、リンパ腫がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、泌尿器がんおよび／もしくは膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、口腔がん細胞、咽頭がん細胞、子宮がん細胞、ならびに／またはメラノーマがん細胞から選択される。いくつかの態様において、適したTAAは、非限定的な例として、EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1、および／または5T4を含む。

いくつかの態様において、二重特異性抗体は、PCT公報WO 2012/023053号に記載されるκλボディフォーマットなどの、完全ヒト型二重特異性IgGフォーマットであり、該公報の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本開示の例示的な抗CD3εモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、例えば、1B6抗体、1A10抗体、1D8抗体、1F8抗体、1A11抗体、および1A4抗体、またはそれらの抗原結合断片を含む。

少なくとも1つの結合部位がCD3εに対して特異的である、本開示の例示的な抗CD3ε二重特異性抗体は、例えば、1B6抗体、1A10抗体、1D8抗体、1F8抗体、1A11抗体、および1A4抗体、またはそれらの抗原結合断片を含む。

いくつかの態様において、本開示の例示的な抗CD3εモノクローナル抗体およびそれらの抗原結合断片は、表2に示される重鎖相補性決定領域（CDR）、および表3に示されるCDR配列から選択される軽鎖CDRを含み、ここで表2および表3に示されるCDRは、IMGT命名法に従って定義付けられる。（実施例を参照されたい）

抗CD3ε抗体
例示的な抗CD3ε抗体は、本明細書において1B6、1A10、1D8、1F8、1A11、もしくは1A4と呼ばれる抗体、またはそれらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体を含む。これらの抗体、またはそれらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、それぞれ、本明細書において「huCD3ε」抗体と呼ばれる。本開示のhuCD3ε抗体は、完全ヒト型モノクローナル抗体を含むとともに、ヒト化モノクローナル抗体およびキメラ抗体、またはそれらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体をも含む。これらの抗体は、ヒトCD3εに対する特異性を示し、かつ、これらは、CD3εの少なくとも1つの生物学的機能または活性を、調節する、たとえばブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはそうでなければ妨げることが、示されている。

CD3εの生物学的機能または活性は、非限定的な例として、T細胞受容体シグナル伝達を含む。本明細書に記載される抗体との結合の非存在下での、CD3εの機能活性のレベルと比較して、該抗体の存在下での、CD3εの機能活性のレベルが、少なくとも95%、例えば96%、97%、98%、99%、または100%低下する場合に、該抗体は、CD3εの少なくとも1つの機能活性を、完全に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはそうでなければ妨げる、とみなされる。本明細書に記載される抗体との結合の非存在下での、CD3εの機能活性のレベルと比較して、該抗体の存在下での、CD3εの機能活性のレベルが、95%未満、例えば10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、または90%低下する場合に、該抗体は、CD3εの少なくとも1つの機能的活性を、部分的に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはそうでなければ妨げる、とみなされる。

本明細書に記載される、huCD3εモノクローナル抗体、またはそれらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体のそれぞれは、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域を含む。

本明細書に記載される、huCD3εモノクローナル抗体、またはそれらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体のそれぞれは、GFTFNTYA（SEQ ID NO:3）のCDRH1アミノ酸配列、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO:4）のCDRH2アミノ酸配列、および

のCDRH3アミノ酸配列を有する重鎖可変領域（VH）を含む。

いくつかの態様において、重鎖可変フレームワーク配列は、hIGHV3-73に由来する。

例示的なヒト化重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を含む。IMGT命名法によって定義付けられるCDRには、下線が引かれている。
huSP34_VH

本明細書に記載される、1B6 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYANRWV（SEQ ID NO:13）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1A10 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYKGYWV（SEQ ID NO:14）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1D8 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYDGTWV（SEQ ID NO: 15）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1F8 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYDGKWV（SEQ ID NO:16）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1A11 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYDGWWV（SEQ ID NO:17）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1A4 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYKQRWV（SEQ ID NO:18）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

本明細書に記載される、1H4 huCD3εモノクローナル抗体、またはその任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、TGAVTTSNY（SEQ ID NO:11）のCDRL1アミノ酸配列、GTN（SEQ ID NO:12）のCDRL2アミノ酸配列、およびALWYNQHWV（SEQ ID NO:19）のCDRL3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（VL）を含む。

いくつかの態様において、抗CD3ε抗体配列またはその抗原結合断片は、CD3ε以外の標的に結合する第二の抗体配列またはその抗原結合断片とともに使用されて、本明細書において「抗CD3ε二重特異性抗体」と呼ばれる二重特異性抗体が作製される。

本明細書においては例として下記の抗体配列が提供されるが、当技術分野において認識される様々な技術の任意のものを用いて、二重特異性抗体を作製するためにこれらの配列を使用できることが、理解されるべきである。二重特異性フォーマットの例は、限定されるものではないが、共通の重鎖、κ型軽鎖、およびλ型軽鎖を含む完全ヒト型二重特異性抗体（PCT公報WO 2012/023053号）、Fabアーム交換に基づく二重特異性IgG（Gramer et al., 2013 MAbs. 5(6)）；CrossMabフォーマット（Klein C et al., 2012 MAbs 4(6)）；SEED技術（Davis JH et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23(4):195-202）、エレクトロスタティック・ステアリング（electrostatic steering）（Gunasekaran K et al., J Biol Chem. 2010 285(25):19637-46.）もしくはノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）（Ridgway JB et al., Protein Eng. 1996 9(7):617-21.）、またはホモ二量体形成を妨げる変異の他のセット（Von Kreudenstein TS et al., 2013 MAbs. 5(5):646-54.）のような、強制ヘテロ二量体化アプローチに基づく複数のフォーマット；タンデムscFv（BiTEなど）のような、断片に基づく二重特異性フォーマット（Wolf E et al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44.）；二重特異性四価抗体（Portner LM et al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75.）；二重親和性再ターゲティング分子（Moore PA et al., 2011 Blood. 117(17):4542-51）、ダイアボディ（Kontermann RE et al., Nat Biotechnol. 1997 15(7):629-31）を含む。

定義
別様に定義されている場合を除き、本開示に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本文がそれ以外であることを必要としている場合を除き、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる名称、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる。組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換に関して、標準的な技術が用いられる（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように行われる。前述の技術および技法は一般的に、当技術分野において周知の通常の方法に従っておよび本明細書を通して引用および考察される様々な一般的なおよびより特異的な参考文献に記述されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる名称、ならびにそれらの実験技法および技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる技法および技術である。化学合成、化学分析、薬剤調製、調合、ならびに患者への送達および処置に関して、標準的な技術が用いられる。

本開示に従って用いられるように、以下の用語は、それ以外であることを示している場合を除き、以下の意味を有すると理解される。

本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫活性部分、すなわち抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。「と特異的に結合する」、または「と免疫反応する」、または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原性決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応しないか、またはかなり低い親和性（K_d＞10^-6）で結合することを意味する。抗体としては、それらの任意の断片、バリアント、多量体型、もしくは二重特異性抗体が挙げられ、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb（ドメイン抗体）、一本鎖、F_ab、F_ab'、およびF_(ab')2断片、scFv、ならびにF_ab発現ライブラリが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

抗体の基本構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、各々の対が1つの「軽」鎖（約25 kDa）と1つの「重」鎖（約50～70 kDa）とを有する、ポリペプチド鎖の2つの同一の対で構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100個から110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのクラスのいずれかに関連する。あるクラスは、IgG₁、IgG₂、およびその他などのサブクラスも同様に有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖でありうる。

本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」（MAb）、または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、独自の軽鎖遺伝子産物と独自の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の1つの分子種のみを含む抗体分子集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の全ての分子において同一である。MAbは、抗原に対する独自の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。

「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖（「H」）と軽鎖（「L」）のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖と軽鎖のV領域内の3つの高度に多様な伸長部が、「フレームワーク領域」または「FR」として知られるより保存された隣接伸長部のあいだに挿入される。このように、「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域のあいだに、超可変領域に隣接して天然に見いだされるアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域は、三次元空間で互いに関連して配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の割付は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)）の定義に従う。

本明細書において用いられる「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFv、またはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面官能基からなり、通常、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端またはC末端ペプチドに対して作製されうる。抗体は、解離定数が≦1μM、例えば≦100 nM、好ましくは≦10 nM、および最も好ましくは≦1 nMである場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。

本明細書において用いられる「免疫学的に結合する」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、それに対して免疫グロブリン分子が特異的である抗原とのあいだに起こるタイプの非共有的相互作用を意味する。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（K_d）に関して表記することができ、K_dが小さいほど、親和性が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量することができる。そのような1つの方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離速度を測定する段階を伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。このように、濃度ならびに実際の結合速度および解離速度を計算することによって、「オン速度定数」（K_on）および「オフ速度定数」（K_off）の両方を決定することができる（Nature 361 : 186-87 (1993)を参照されたい）。K_off/K_onの比率は、親和性に関連しない全てのパラメータの削除を可能にして、解離定数K_dに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照されたい）。本開示の抗体は、放射リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定した場合に、平衡結合定数（K_d）が≦1μM、例えば≦100 nM、好ましくは≦10 nM、およびより好ましくは≦1 nMであれば、標的に特異的に結合すると言われる。

本明細書において用いられる「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、cDNA、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはそのいくつかの組み合わせを意味し、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見いだされるポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合していない、（2）天然において結合していないポリヌクレオチドに機能的に結合している、または（3）より大きい配列の一部として天然において存在しない。本開示に従うポリヌクレオチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。

「単離されたタンパク質」という用語は、cDNA、組み換え型RNA、もしくは合成起源のタンパク質、またはそのいくつかの組み合わせを意味し、その起源または由来源のために、「単離されたタンパク質」は、（1）天然において見いだされるタンパク質に会合していない、（2）同じ起源の他のタンパク質を含まない、例えば海洋タンパク質を含まない、（3）異なる種からの細胞によって発現される、または（4）天然において存在しない。

「ポリペプチド」という用語は、本明細書においてポリペプチド配列の本来のタンパク質、断片、またはアナログを意味するために、一般的な用語として用いられる。ゆえに、本来のタンパク質断片およびアナログは、ポリペプチドに属する種である。本開示に従うポリペプチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子を含むとともに、重鎖免疫グロブリン分子にカッパ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子を組み合わせた、およびその逆によって形成される抗体分子、ならびにその断片およびアナログを含む。

本明細書において物体に適用される場合に用いられる「天然に存在する」という用語は、物体を天然において見いだすことができるという事実を意味する。例えば、天然の起源から単離することができる生物（ウイルスを含む）に存在して、研究室において人為的にまたはそれ以外の方法で意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

本明細書において用いられる「機能的に連結した」という用語は、そのように記述された成分の位置がその意図される様式でそれらを機能させる関係にあることを意味する。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合性の条件下で達成されるようにライゲーションされる。

本明細書において用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを行うために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、原核細胞中の宿主生物に応じて異なり、そのような制御配列は一般的に、真核細胞においてプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み、一般的に、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終止配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングにとって必須である全ての成分を含むことを意図し、同様にその存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列、および融合パートナー配列を含むことができる。本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドのポリマーホウ素、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は、DNAの一本鎖および二本鎖型を含む。

本明細書において用いられる、20種類の通常アミノ酸およびその略語は、慣例的用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照されたい。20種類の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α-、α-二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非通常アミノ酸も同様に、本開示のポリペプチドにとって適した成分でありうる。非通常アミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において用いられるポリペプチドの表記において、標準的な用法および慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。

ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、プログラムGAPまたはBESTFITなどによって、デフォルトのギャップの重みを用いて最適に整列させた場合に、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99％の配列同一性を共有することを意味する。

好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の相互交換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、ならびにイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。

本明細書において考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における軽微な変化は、アミノ酸配列の変化が、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、および最も好ましくは99％を維持する限り、本開示に包含されると企図される。特に、保存的アミノ酸交換が企図される。保存的交換は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる交換である。遺伝子コードアミノ酸は一般的に、ファミリーに分けられる：（1）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（2）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（3）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、および（4）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。他のアミノ酸ファミリーには、（i）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；ならびに（iv）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、トレオニンをセリンに単発的に交換しても、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸に類似の交換を行っても、特に交換がフレームワーク部位内でのアミノ酸を伴わない場合、得られた分子の結合または特性に対して主要な効果を有しないことは妥当に予想される。アミノ酸の変化によって、機能的ペプチドが得られるか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書において詳細に記述される。抗体または免疫グロブリン分子の断片またはアナログは、当業者によって容易に調製することができる。断片またはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公共または固有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピューター化比較法を用いて、公知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定する。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は公知である。Bowie et al. Science 253: 164 (1991)。このように、前述の例は、当業者が、本開示に従って構造および機能的ドメインを定義するために用いられうる配列モチーフおよび構造コンフォメーションを認識できることを証明する。

好ましいアミノ酸置換は、（1）タンパク質分解に対する感受性を低減させる、（2）酸化に対する感受性を低減させる、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（4）結合親和性を変化させる、および（4）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与または改変する置換である。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含むことができる。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列（好ましくは分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）に行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、交換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを切断するまたは親配列を特徴付けする他のタイプの二次構造を崩壊させる傾向があってはらなない）。当技術分野において認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354: 105 (1991)において記述される。

本明細書において用いられる、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、印をつけたアビジン（例えば、光学または熱量測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができる、ビオチニル部分のポリペプチドに、放射標識アミノ酸または連結部分を組み入れることによって検出可能なマーカーを組み入れることを意味する。ある状況において、標識またはマーカーはまた、治療的でありうる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、用いられうる。ポリペプチドの標識の例には、以下が挙げられるがこれらに限定されるわけではない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、p-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光物質、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの態様において、標識は、可能性がある立体妨害を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。本明細書において用いられる「薬剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与した場合に、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を意味する。

本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))によって例証されるように、当技術分野における慣例的用法に従って用いられる。

本明細書において用いられる「実質的に純粋な」とは、目的種が、存在する優勢な種であり（すなわち、モルに基づいて、組成物中の他の任意の個々の種より豊富に存在する）、好ましくは実質的に精製された分画は、目的種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約50％（モルに基づいて）を含む組成物である。

一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全ての高分子種が約80％を超えて、より好ましくは約85％、90％、95％、および99％を超えて含むであろう。最も好ましくは、目的種は、組成物が本質的に1つの高分子種からなる、本質的に均一になるまで精製される（通常の検出法によって組成物中に汚染種を検出することができない）。

患者という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。

抗体
当技術分野において公知の様々な技法を、例えば、CD3ε、腫瘍関連抗原、もしくは他の標的などの所定の標的に対する、またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはオルソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するために用いてもよい（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）。

抗体は、免疫血清の主にIgG分画を提供するプロテインAまたはプロテインGを用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製される。次に、または代わりに、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープを、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製するためにカラム上に固定してもよい。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson（The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28）によって考察される。

一部の態様において、本開示の抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば本明細書において提供される実施例に記載される技法を用いることによって生成される。抗体はまた、例えばその表面上の所定の標的の高レベルを発現する細胞トランスフェクタントの組み合わせによってBALB/cマウスを免疫感作することによっても作製される。次に、骨髄腫/B細胞融合体から生じるハイブリドーマを、選択された標的に対する反応性に関してスクリーニングする。

モノクローナル抗体は、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記述される方法などのハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に、免疫物質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発するために、免疫物質によって免疫感作する。または、リンパ球をインビトロで免疫感作することができる。

免疫物質は典型的に、タンパク質抗原、その断片、またはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球が用いられ、または非ヒト哺乳動物起源が望ましい場合には脾細胞もしくはリンパ節細胞が用いられる。リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適した融合物質を用いて不死化細胞株に融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、詳しくは齧歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。融合していない不死化細胞の生育または生存を阻害する1つまたは複数の物質を好ましくは含む適した培養培地において、ハイブリドーマ細胞を培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠如する場合、ハイブリドーマの培養培地は典型的に、HGPRT欠損細胞の生育を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「HAT培地」）であろう。

好ましい不死化細胞株は、効率よく融合して、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、HAT培地などの培地に対して感受性である細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、例としてSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得ることができるマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も同様にモノクローナル抗体を産生するために記述されている（Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)を参照されたい）。

ハイブリドーマ細胞を培養した培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（RIA）もしくは酵素免疫測定法（ELISA）などのインビトロ結合アッセイによって決定する。そのような技術およびアッセイは当技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析によって決定することができる。その上、モノクローナル抗体の治療応用では、標的抗原に対して高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。

所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈技法によってサブクローニングして、標準的な方法によって生育させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照されたい）。この目的のための適した培養培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI 1640培地を含む。または、ハイブリドーマ細胞を、インビボで哺乳動物の腹水として生育させることができる。

サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製技法によって培養培地または腹水から単離または精製することができる。

モノクローナル抗体はまた、米国特許第4,816,567号に記述される方法などの組み換えDNA法によっても作製することができる。本開示のモノクローナル抗体をコードするDNAは、通常の技法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離およびシークエンシングすることができる。本開示のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい起源として役立つ。単離した後、DNAを発現ベクターの中に入れることができ、次に発現ベクターをサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはそれ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え型宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。DNAはまた、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照されたい）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、改変することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本開示の抗体の定常ドメインの代わりに置換することができ、または本開示の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、キメラ二価抗体を作製することができる。

本開示のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対してヒトが免疫応答を生じることがなく、ヒトに投与するために適している。抗体のヒト化型は、ヒト免疫グロブリンの配列で主に構成され、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖または断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂、または抗体の他の抗原結合小配列など）である。ヒト化は、例えばWinterと共同研究者（Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)）の方法に従うことによって、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって行われる。（同様に、米国特許第5,225,539号も参照されたい）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に交換する。ヒト化抗体はまた、例えばレシピエント抗体またはインポートされたCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見いだされない残基を含む。一般的に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、およびフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する、少なくとも1つ、典型的に2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Fc）を含む（Jones et al., 1986; Riechmann et al, 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)）。

完全ヒト型抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書において「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」と呼ばれる。モノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al, 1983 Immunol Today 4: 72を参照されたい）、およびモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい）を用いることによって調製することができる。モノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cote, et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照されたい）、またはエプスタイン-バーウイルスによってインビトロでヒトB細胞を形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい）利用および産生されうる。

加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含むさらなる技術を用いて産生することもできる。（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照されたい）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン座が部分的または完全に不活化されているマウスにヒト免疫グロブリン座を導入することによって作製されうる。チャレンジすると、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む全ての局面においてヒトにおいて認められるものと類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、およびMarks et al, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)において記述される。

加えて、ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性の抗体ではなく完全ヒト型抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて産生されうる（PCT公報WO 94/02602を参照されたい）。非ヒト宿主における重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性の遺伝子を、無能力化して、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な座を宿主ゲノムに挿入する。ヒト遺伝子を、例えば、必須のヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み入れる。次に、完全ではない修飾の相補物を含む中間のトランスジェニック動物を交雑することによって、所望の修飾の全てを提供する動物が子孫として得られる。そのような非ヒト動物の例は、PCT公報WO 96/33735およびWO 96/34096において開示されるXenomouse（商標）と呼ばれるマウスである。この動物は、完全ヒト型免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体を、動物から、関心対象の免疫原による免疫感作後に、例えばポリクローナル抗体調製物として、直接得ることができ、またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの動物に由来する不死化B細胞から得ることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収して発現させて、抗体を直接得ることができ、またはさらに改変して、例えば一本鎖Fv（scFv）分子などの抗体のアナログを得ることができる。

マウスがその例である、内因性の免疫グロブリン重鎖の発現を欠如する非ヒト宿主を産生する方法の例は、米国特許第5,939,598号に開示される。これは、座の再配列を防止するためにおよび再配列した免疫グロブリン重鎖座の転写物の形成を防止するために、胚幹細胞における少なくとも1つの内因性の重鎖座からJセグメント遺伝子を欠失させる段階であって、欠失が選択可能マーカーをコードする遺伝子を含むターゲティングベクターによって行われる段階、ならびにその体細胞および生殖細胞が選択可能マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚幹細胞から産生する段階を含む方法によって得ることができる。

ヒト抗体などの関心対象の抗体を産生する1つの方法は、米国特許第5,916,771号に開示される。この方法は、ある培養哺乳動物宿主細胞に、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する段階、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する段階、およびこれら2種類の細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成する段階を含む。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。

この技法をさらに改善するために、免疫原における臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で特異的に結合する抗体を選択する相関法が、PCT公報WO 99/53049に開示される。

抗体は、上記の一本鎖抗体をコードするDNAセグメントを含むベクターによって発現されうる。

これらは、ベクター、リポソーム、裸のDNA、アジュバント補助DNA、遺伝子銃、カテーテル等を含みうる。ベクターは、WO 93/64701に記述されるコンジュゲートなどの、ターゲティング部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）と核酸結合部分（例えば、ポリリジン）とを有する化学コンジュゲート、ウイルスベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に対して特異的な抗体）と核酸結合部分（例えば、プロタミン）とを含む融合タンパク質であるPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記述されるタンパク質などの融合タンパク質、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体、非染色体、または合成ベクターでありうる。

好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、オルトポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、I型単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Geller, A. I. et al, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990)を参照されたい）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al, Science, 259:988 (1993); Davidson, et al, Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al, J. Virol. 69:2004 (1995)を参照されたい）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M. G. et al, Nat. Genet. 8: 148 (1994)を参照されたい）を含む。

ポックスウイルスベクターは、細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターによって、核酸のごく短期間の発現が起こる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターは、神経細胞に核酸を導入するために好ましい。アデノウイルスベクターでは、核酸の発現は、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月間）より短期間（約2ヶ月間）であるが、アデノ随伴ウイルスでの発現は、HSVベクターより短期間である。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存するであろう。導入は、標準的な技術によって、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入、または形質転換によって行われうる。遺伝子移入様式の例には、例えば裸のDNA、CaPO₄沈殿、DEAEデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。

ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために用いることができる。例えば、定位注射を用いてベクター（例えば、アデノウイルス、HSV）を所望の位置に向けることができる。加えて、SynchroMed Infusionシステムなどのミニポンプ注入システムを用いて脳室内（icv）注入によって、粒子を送達することができる。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法はまた、脳の広い領域に大きい分子を送達するために有効であることが証明されており、標的細胞にベクターを送達するために有用でありうる（Bobo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2076-2080 (1994); Morrison et al, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照されたい）。用いることができる他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口または他の公知の投与経路を含む。

二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本件の例において、結合特異性の1つは、CD3εまたはその任意の断片などの標的に対するものである。第二の結合標的は、任意の他の抗原であり、都合よくは、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットである。

二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知である。従来、二重特異性抗体の組み換えによる産生は、2つの重鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（Milstein and Cuello, Nature, 305 :537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に組み合わさるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、そのうちの1つのみが正しい二重特異性構造を有する10個の異なる抗体分子の可能性がある混合物を生じる。正しい分子の精製は通常、アフィニティクロマトグラフィー段階によって行われる。類似の技法は、1993年5月13日に公表されたWO 93/08829、およびTraunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。

本開示の二重特異性および／または一価抗体は、これによってその内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる2011年8月16日に出願された同時係属中の出願、PCT公報WO 2012/023053号において開示されるものを含む、本技術分野において認識される様々な技術のうち任意のものを用いて作製することができる。PCT公報WO 2012/023053号に記載される方法によって、構造においてはヒト免疫グロブリンと同一の二重特異性抗体が作製される。このタイプの分子はユニークな重鎖ポリペプチドの2つのコピー、定常κドメインに融合された第一の軽鎖可変領域、および定常λドメインに融合された第二の軽鎖可変領域からなる。各々の結合部位は重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を表す。軽鎖可変領域はλファミリーまたはκファミリーのものであってよく、好ましくはλ定常ドメインおよびκ定常ドメインにそれぞれ融合される。これは、非天然型の接合ポリペプチドの生成を避けるために好ましい。しかし、第一の特異性のためにκ軽鎖可変ドメインを定常λドメインに融合し、第二の特異性のためにλ軽鎖可変ドメインを定常κドメインに融合することによって本開示の二重特異性抗体を得ることも可能である。PCT公報WO 2012/023053号に記載される二重特異性抗体は、IgGκλ抗体または「κλボディ」と呼ばれ、新規の完全ヒト型二重特異性IgGフォーマットである。このκλボディフォーマットにより、標準のモノクローナル抗体と識別不能な特徴を有する標準のIgG分子から識別不能な二重特異性抗体の親和性精製が可能になるため、本フォーマットは以前のフォーマットと比べて好都合である。

この方法において必須の段階は、同じ重鎖可変ドメインを共有し異なる抗原特異性を有する2つの抗体Fv領域（各々が可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとからなる）を同定することである。モノクローナル抗体およびその断片の作製については数多の方法が記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるAntibodies:A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。完全ヒト型抗体は、CDR1およびCDR2を含む軽鎖および重鎖の両方の配列がヒト遺伝子から生じるような抗体分子である。CDR3領域はヒト由来のものであってもよく、または、合成法によって設計されてもよい。本明細書においてそのような抗体は「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を作製するEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 を参照のこと）を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030を参照のこと）、またはインビトロにおいてエプスタイン・バーウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 を参照のこと）、利用することができ、作製することができる。

モノクローナル抗体は、例えば、標的抗原、またはその免疫原性断片、誘導体、もしくは変異体を用いて動物個体を免疫感作することによって作製される。あるいは、標的抗原をコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクトした細胞を用いることによって、トランスフェクトされた細胞の表面で標的抗原が発現され結合されるようにして、動物個体を免疫感作する。当技術分野においては異種（xenogenic）非ヒト動物を作製するための様々な技術が周知である。例えば、これによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,075,181号および第6,150,584号を参照のこと。

あるいは、抗体は、抗体配列もしくは抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリを、標的抗原との結合についてスクリーニングすることによって得られる。このライブラリは、例えばバクテリオファージにおいて、構築されたファージ粒子の表面上において発現されるバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質またはペプチド融合体、およびファージ粒子内に含有されるコードDNA配列として（即ち「ファージディスプレイライブラリ」として）調製される。

次いで、ミエローマ/B細胞融合の結果生じたハイブリドーマを、標的抗原に対する反応性についてスクリーニングする。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)によって記載されるようなハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法においては、免疫感作剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発するために、典型的には、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫感作剤を用いて免疫感作する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫感作することができる。

厳密には不可能ではないが、同じ重鎖可変ドメインを有するが異なる抗原に対して指向する異なる抗体が偶然に同定される可能性は非常に低い。実際、ほとんどの場合において、重鎖は抗原結合表面に大きく寄与しているとともに、配列が最も変わりやすい。特に、重鎖上のCDR3は、配列、長さ、および構造の最も多様なCDRである。したがって、異なる抗原に対して特異的な2つの抗体はほぼ常に、異なる重鎖可変ドメインを有する。

同時係属中の出願、PCT公報WO 2012/023053号において開示される方法は、この制限を克服するものであり、全てのライブラリメンバーについて重鎖可変ドメインが同じであり、それゆえに多様性が軽鎖可変ドメインに限定されるような抗体ライブラリを使用することによって、同じ重鎖可変ドメインを有する抗体の単離を大いに促進する。そのようなライブラリは、例えば、これによってその各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の出願、PCT公報WO 2010/135558号およびPCT公報WO 2011/084255号に記載されている。しかし、重鎖可変ドメインと共に軽鎖可変ドメインが発現されるため、双方のドメインが抗原との結合に寄与し得る。過程をさらに容易にするため、異なる抗原に対する抗体のインビトロにおける選択のために、同じ重鎖可変ドメインおよび多様なλ可変軽鎖またはκ可変軽鎖のいずれかを含有する抗体ライブラリを並行して使用することができる。このアプローチでは、本開示の完全免疫グロブリンフォーマットにおいて二重特異性抗体を作製するための構成要素として使用できる、共通の重鎖を有するが、一方がλ軽鎖可変ドメインを有し、他方がκ軽鎖可変ドメインを有する2つの抗体の同定が可能になる。本開示の二重特異性抗体は、異なるアイソタイプのものであってよく、異なるFcレセプターへの結合特性を変えるために、ならびにこのような方法で抗体のエフェクター機能および薬物動態学的特性を改変するために、それらのFc部分は改変されてよい。Fc部分を改変するための数多の方法が記載されており、本開示の抗体に適用可能である（例えば、Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685-91；米国特許第6,528,624号；2009年1月9日に出願されたPCT/US2009/0191199を参照のこと）。本開示の方法は、Fc部分を欠くF(ab’)₂ フォーマットでの二重特異性抗体および抗体混合物を作製するために使用することもできる。

共通の重鎖および2つの異なる軽鎖を単一の細胞において共発現させて、本開示の二重特異性抗体を構築する。全てのポリペプチドが同じレベルで発現され、免疫グロブリン分子を形成するのに十分に同等に構築された場合、単一特異性（同じ軽鎖）および二重特異性（2つの異なる軽鎖）の比率は50％となるはずである。しかし、異なる軽鎖が異なるレベルで発現される、および／または同じ効率では構築されない可能性がある。したがって、その固有の発現特性または異なる性質を補って共通の重鎖と構築させるために、異なるポリペプチドの相対的発現を調節する手段が用いられる。この調節は、プロモーターの強度によって、異なる効率を特徴とする配列内リボソーム進入部位（IRES）の使用、または、転写もしくは翻訳レベルにおいて作用できる、およびmRNA安定性に対して作用する他のタイプの調節エレメントの使用によって成すことができる。異なる強度の異なるプロモーターは、CMV（最初期サイトメガロウイルス・ウイルスプロモーター）；EF1-1α（ヒト伸長因子1α-サブユニットプロモーター）；Ubc（ヒトユビキチンCプロモーター）；SV40（サルウイルス40プロモーター）を含み得る。哺乳動物起源およびウイルス起源の異なるIRESについても記述されている（例えば、Hellen CU and Sarnow P. Genes Dev 2001 15:1593-612を参照のこと）。これらのIRESはその長さおよびリボソーム動員効率において大きく異なる。さらに、IRESの複数のコピーを導入することによって活性をさらに調整することが可能である（Stephen et al.2000 Proc Natl Acad Sci USA 97:1536-1541）。発現の調節は細胞の複数の連続的なトランスフェクションを行ってどれか1つの軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増加させ、それによりそれらの相対的な発現を改変することによって成すこともできる。本明細書において提供される例から、異なる鎖の相対的発現の調節が二重特異性抗体の構築および全収量を最大化するために重要であることが示される。

重鎖と2種類の軽鎖の共発現から、細胞培養上清中に3種類の異なる抗体の混合物が生じる：2種類の単一特異性二価抗体および1種類の二重特異性二価抗体である。後者は、混合物から精製して関心対象の分子を得なければならない。本明細書に記載される方法では、CaptureSelect Fab Kappa and CaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリクス（BAC BV, Holland）のようなκまたはλ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティクロマトグラフィー媒体を使用することによって、この精製工程が大いに促進される。この多段階アフィニティクロマトグラフィー精製アプローチは効率的であり、本開示の抗体に一般に適用可能である。これは抗体混合物を発現するクアドローマまたは他の細胞株に由来する各々の二重特異性抗体について開発しなければならない、および最適化しなければならない特異的精製法とは著しく対照的である。実際に、混合物中の異なる抗体の生化学的特徴が類似している場合、イオン交換クロマトグラフィーのような標準のクロマトグラフィー技術を用いたそれらの分離は難しいか、または全く不可能であり得る。

他の好適な精製法には、これによってその内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2012年10月19日に出願され、PCT公報WO 2013/088259号として公開された同時係属中の出願PCT/IB2012/003028において開示されるものが含まれる。

二重特異性抗体製造の他の態様において、所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。融合は好ましくは、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのあいだで行う。融合体の少なくとも1つに存在する軽鎖結合にとって必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（CHI）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましければ免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、異なる発現ベクターに挿入して、適した宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細に関しては、例えば、Suresh et al, Methods in Enzymology, 121 :210 (1986)を参照されたい。

WO 96/27011に記述される別のアプローチに従って、抗体分子対のあいだの界面を、組み換え型細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大限にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの1つまたは複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に交換する。大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に交換することによって、大きい側鎖と同一または類似のサイズの代償的「腔」が、第二の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物に対してヘテロ二量体の収率を増加させる機序を提供する。

抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術は、文献において記述されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を用いて調製することができる。産生された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための物質として用いることができる。

組み換え型細胞培養から二重特異性抗体断片を直接作製および単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている。Kostelny et al, J. Immunol. 148(5): 1547- 1553 (1992)。FosおよびJunタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって異なる2つの抗体のFab'部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体を産生するためにも利用することができる。Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)によって記述される「ディアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代わりの機序を提供している。断片は、同じ鎖の2つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（V_L）に接続された重鎖可変ドメイン（V_H）を含む。したがって、1つの断片のV_HおよびV_Lドメインを、別の断片の相補的V_LおよびV_Hドメインと対を形成させて、それによって2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv（sFv）二量体を用いることによって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も同様に報告されている。Gruber et al, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。

2価を超える抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。

例示的な二重特異性抗体は、異なる2つのエピトープに結合することができ、その少なくとも1つは、本開示のタンパク質抗原を起源とする。または、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームを、T細胞受容体分子（例えば、CD2、CD3、CD28、またはB7）、またはFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）などのIgGのFc受容体（FcγR）などの白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体を用いて、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性物質を向けることもできる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害剤、またはEOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETAなどの放射性核種キレート剤に結合するアームとを有する。別の関心対象の二重特異性抗体は、本明細書に記載されるタンパク質抗原に結合して、組織因子（TF）にさらに結合する。

ヘテロコンジュゲート抗体も同様に、本開示の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を望ましくない細胞に向けるために（米国特許第4,676,980号を参照されたい）およびHIV感染症を処置するために（WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089を参照されたい）提唱されている。抗体は、架橋剤を含む化学を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製することができると企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的のための適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダート、ならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示される試薬が挙げられる。

がんの処置において、ならびに／または異常なCD3εの発現および／または活性に関連する他の疾患および障害の処置において、例えば抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本開示の抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、サイレンシング変異はFc領域中に導入されることができ、それにより、Fc受容体の結合を妨害し、そして抗体依存性細胞傷害（ADCC）を低減させる。Fc領域におけるサイレンシング変異は、当技術分野において記述されている：例えば、LALA変異およびN297A変異（Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691）；ならびにD265A変異（Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181 : 6664- 69; Strohl, W., 前記）。サイレントFc IgG1抗体の例は、IgG1 Fcアミノ酸配列においてL234AおよびL235A変異を含む、いわゆるLALA変異体を含む。サイレントIgG1抗体の別の例は、D265A変異を含む。別のサイレントIgG1抗体は、N297A変異を含み、これは無グリコシル化／非グリコシル化抗体をもたらす。抗体のFc領域におけるグリコシル化は、Fc受容体との結合を調節し得、かつ脱グリコシル化は、結合を低減させ得る。作製された抗体はしたがって、低減した内在化能力、ならびに／または低下した補体媒介性の細胞の殺傷およびADCCを有し得る。

本明細書において開示される抗体はまた、イムノリポソームとして調合することができる。抗体を含むリポソームは、Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980);ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号において記述される方法などの当技術分野において公知の方法によって調製される。血液循環時間が改良されたリポソームは、米国特許第5,013,556号において開示される。

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって作製されうる。所望の直径を有するリポソームを生じるために、既定の孔サイズのフィルターの中にリポソームを押し出す。本開示の抗体のFab'断片を、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記述されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートさせることができる。

抗CD3ε抗体の使用
本開示に従う治療実体の投与は、移動、送達、認容性の改善、およびその他を提供するために製剤に組み入れられる、適した担体、賦形剤、および他の作用物質と共に投与されると認識されるであろう。多数の適当な製剤を、全ての製薬化学者に公知である処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にその中のBlaug, Seymourによる第87章において見いだすことができる。これらの製剤には、例えば、粉剤、パスタ剤、軟膏、ゼリー、ロウ、油、脂質、脂質（陽イオンまたは陰イオン性）含有小胞（Lipofectin（商標）など）、DNAコンジュゲート、無水吸収パスタ剤、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。前述の混合物はいずれも、製剤中の活性成分が、製剤によって不活化されず、製剤が投与経路と生理学的に適合性で認容性である限り、本開示に従う処置および治療において適切であり得る。同様に、製薬化学者にとって周知である製剤、賦形剤、および担体に関連する追加の情報に関して、Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、ならびにその中での引用を参照されたい。

本開示の抗体を含む本開示の治療製剤は、非限定的な例として、白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、神経膠腫、肺および気管支がん、大腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎臓および腎盂腎がん、口腔がんおよび咽頭がん、子宮体がん、ならびに／またはメラノーマのようながんに関連する症状を治療または緩和するために使用される。本開示はまた、がんに関連する症状を治療または緩和する方法をも提供する。治療計画は、例えばがんを患っている（または発症リスクのある）ヒト患者のような対象を、標準法を用いて同定することによって実施される。

処置の有効性は、特定の免疫関連障害を診断または処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。免疫関連障害の1つまたは複数の症状が軽減されれば、抗体が臨床上の恩典を付与することを示している。

所望の特異性を有する抗体をスクリーニングする方法は、酵素免疫測定法（ELISA）および当技術分野において公知の他の免疫学媒介技術を含むがこれらに限定されるわけではない。

CD3ε、腫瘍関連抗原またはその他の抗原（またはその断片）などの標的に対する抗体が、例えば適切な生理的試料中のこれらの標的のレベルを測定するために用いるために、診断法において用いるために、タンパク質のイメージングにおいて用いるために、およびその他のために、これらの標的の局在および／または定量に関連する当技術分野において公知の方法において用いられうる。所定の態様において、これらの標的のいずれかに対して特異的な抗体、または抗体由来抗原結合ドメインを含むその誘導体、断片、アナログ、もしくはホモログが、薬理活性化合物（本明細書において以降「治療物質」と呼ぶ）として利用される。

本開示の抗体は、免疫アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術を用いて特定の標的を単離するために用いられうる。本開示の抗体（またはその断片）を診断的に用いて、臨床試験技法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターする、例えば所定の処置治療計画の有効性を決定することができる。抗体を検出可能な物質に連結させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子群、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射活性材料が挙げられる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適した補欠分子群の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適した蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリンが挙げらる；発光材料の例には、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；ならびに適した放射活性材料には¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、または³Hが挙げられる。

ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、および完全ヒト型抗体を含む本開示の抗体は、治療物質として用いられうる。そのような物質は一般的に、対象における所定の標的の異常な発現または活性化に関連する疾患または病態を処置または予防するために用いられるであろう。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有する調製物を対象に投与すると、一般的に、標的とのその結合により効果を有するであろう。抗体を投与することにより、標的のシグナル伝達機能が排除、阻害、または妨害されうる。抗体を投与することにより、それが本来結合する内因性のリガンドと標的との結合が排除、または阻害、または妨害されうる。

本開示の抗体の治療的有効量は一般的に、治療目的を達成するために必要な量に関する。先に述べたように、これは、ある例において、標的の機能を妨害する、抗体とその標的抗原との結合相互作用でありうる。投与するために必要な量は、さらにその特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存して、同様に、投与された抗体が、それが投与される対象の他の自由容量（free volume other subject）から枯渇する速度に依存するであろう。本開示の抗体または抗体断片の治療的に有効な投与の一般的範囲は、非制限的な例として、約0.1 mg/kg体重から約50 mg/kg体重でありうる。一般的な投与回数は、例えば1日2回から1週間に1回の範囲でありうる。

本開示の抗体またはその断片は、薬学的組成物の形状で様々な疾患および障害の治療のために投与されうる。そのような組成物の調製に関係する原理および検討、ならびに成分の選択における指針は、例えばRemington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkにおいて提供される。

抗体断片を用いる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列の結合能を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学合成することができ、および／または組み換えDNA技術によって産生することができる（例えば、Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい）。製剤はまた、処置される特定の適応にとって必要な1つより多くの活性化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない補足的活性を有する化合物を含有することができる。またはもしくは加えて、組成物は、例えば細胞傷害物質、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤などのその機能を増強する作用物質を含むことができる。そのような分子は、ふさわしくは、意図される目的にとって有効である量で併用して存在する。

活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合化によって調製されたマイクロカプセル、例えばコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに捕捉することができる。

インビボ投与のために用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通して濾過することによって容易に達成される。

徐放性製剤を調製することができる。徐放性調製物の適した例には、マトリクスが、成型された製品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形状である、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）などの分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間のあいだ分子の放出を可能にするが、あるハイドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。

本開示の抗体は、試料中の所与の標的（またはそのタンパク質断片）の存在を検出するための作用物質として用いることができる。いくつかの態様において、抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル抗体であるか、またはより好ましくはモノクローナル抗体である。無傷の抗体またはその断片（例えば、F_ab、scFv、またはF_(ab)2）が用いられる。プローブまたは抗体に関して「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含すると意図される。間接的標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンによって検出することができるようにビオチンによるDNAプローブの末端標識が挙げられる。「生物試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および液体を含むと意図される。それゆえ、血液、および血清、血漿、またはリンパを含む血液の分画または成分は「生物試料」という用語の用法内に含まれる。すなわち、本開示の検出法を用いて、インビトロならびにインビボで生物試料中の対象mRNA、タンパク質、またはゲノムDNAを検出することができる。例えば、分析対象mRNAを検出するためのインビトロ技術には、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。分析対象タンパク質を検出するためのインビトロ技術には、酵素免疫測定法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。分析対象ゲノムDNAを検出するためのインビトロ技術にはサザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための技法は、例えば"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985において記述される。さらに、分析対象タンパク質を検出するためのインビボ技術は、標識した抗分析対象タンパク質抗体を対象に導入する段階を含む。例えば、対象におけるその存在および位置を標準的な撮像技術によって検出することができる放射活性マーカーによって、抗体を標識することができる。

薬学的組成物
本開示の抗体（本明細書において「活性化合物」と呼ばれる）、ならびにその誘導体、断片、アナログ、および相同体は、投与にとって適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびにその他を含むと意図される。適した担体は、参照により本明細書に組み入れられる、当技術分野において標準的な参考テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciences最新版に記述される。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および5％ヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も同様に用いられうる。薬学的活性物質のためにそのような媒体および作用物質を用いることは、当技術分野において周知である。いかなる通常の媒体または作用物質も、活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に、組成物に組み入れることができる。

本開示の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように調合される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、表面）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入することができる。

注射での使用にとって適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌的でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびその他）、およびその適した混合物を含む溶媒または分散媒体でありうる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル、およびその他によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、活性化合物の必要量を、適切な溶媒において、先に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に組み入れて、必要に応じてその後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基本分散培地と、先に列挙した必要な他の成分とを含む滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、予め濾過滅菌したその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分とを含む粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらを、ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の剤形で用いることができる。経口組成物はまた、液体担体中の化合物が、口に適用される、すすいで吐き出される、または飲み込まれる、マウスウォッシュとして用いるための液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤および／または補助材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤およびその他は、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含むことができる：血漿セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；蔗糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。

吸入投与の場合、化合物は、適した促進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの剤形で送達される。

全身投与も、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁にとって適切な浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野において公知であり、例えば経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、一般的に当技術分野において公知である軟膏、軟膏剤（salve）、ゲル、またはクリームに調合される。

化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤と共に）または浣腸の剤形で調製することができる。

1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよび微小封入送達システムを含む、徐放性製剤などの、化合物が体から急速に消失しないよう保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性で生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.からの購入によっても得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記述されるように当業者に公知の方法に従って調製することができる。

投与の容易さおよび用量の均一性のために、単位投与剤形で経口または非経口組成物を調合することが特に有利である。本明細書において用いられる単位投与剤形は、各単位が、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性化合物を含む、処置される対象にとって単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。本開示の単位投与剤形の仕様は、活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにそのような活性化合物を作る技術分野における固有の制限によって左右され、それらに直接依存する。

薬学的組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

本開示を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記述される本開示の範囲を制限しない。

実施例1. 抗CD3 MAB SP34のタンパク質配列の決定
市販のマウスモノクローナル抗体であるSP34（Pessano et al. 1985, EMBO J; 4-2）は、ヒトCD3εおよびカニクイザルCD3εの両方に、特異的に結合する。SP34の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列は、質量分析によって新たに決定された。タンパク質試料は、5 mMの最終濃度となるトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）の添加、および室温での20分間のインキュベーションによる還元の前に、8M 尿素、50 mM 重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）緩衝液中で可溶化された。続いて、10 mMの最終濃度となるようにヨードアセトアミドが添加され、そして試料は室温でさらに20分間、暗所でインキュベートされた。アルキル化後、PNGase F酵素緩衝液（New England Biolabs）の添加によって、抗体試料は1:10に希釈された。試料を脱グリコシル化するため、25μgの抗体に対して0.5μlのPNGaseが添加された。試料は、37℃で1時間、さらにインキュベートされた。アルキル化され、そして脱グリコシル化された抗体試料は、2種類の抗体サブユニット（LC、HC）を分離するため、試料ローディング緩衝液中で可溶化された。5μgの試料のアリコートは、SDS-PAGEゲルにロードされた。ゲルの泳動（150 V、最大400 mA、75分）の後、ゲルは、クマシーブリリアントブルー（CBB G250）を用いたゲル染色の前に、50% エタノール、10% 酢酸中で30分間インキュベートされた。酵素による切断を行うために、それぞれ100 mM ABC中、または50 mM ABC、60% ACN中での3回の膨潤／収縮によって、SDS-PAGEゲルからのゲルスライスが下準備された。各工程は、30分間、室温で実施された。最後の収縮工程後、ゲルスライスは、開けたエッペンドルフカップ中で、15分間乾燥させた。タンパク質分解は、3倍の量（おおよそのゲルの量に関して）の酵素溶液を、1:50の酵素／タンパク質の比で添加することによって、開始させた。表1は、タンパク質分解に使用された酵素溶液を列挙する。各タンパク質分解は、一晩実施された。結果として生じたペプチドは、質量分析の前に、0.5%（最終）のギ酸を用いて酸性化された。

（表１）タンパク質分解酵素と、それらに適した緩衝溶液およびインキュベーション温度の一覧

Agilent 1100 nanoLCシステムは、Orbitrap XL質量分析計（ThermoFisher, Bremen, Germany）に連結された。タンパク質分解からの試料は、酸性化の後で、nanoLC-ESIMS/MSにアプライされた。ペプチドを、濃縮カラム（Zorbax SB C18, 0.3 mm x 5 mm, Agilent）において、1% アセトニトリル／0.5% ギ酸溶液を用いて5分間捕捉および脱塩した後、ペプチドは、Zorbax 300 SB C18、75μm x 150 mmカラム（Agilent, Waldbronn）において、5%から40%へとアセトニトリルの勾配をつけて、アセトニトリル／0.1% ギ酸を用いて分離された。全体的なMSスペクトルは、nanoLC-ESI-MSMS分析のための、製造者による機器設定にしたがって、FTモードで自動的に取得され、ペプチドの断片化（CIDおよびHCD）ならびに検出もまた、FTモードで実行された。

反復された配列アセンブリ（データは示さない）により、モノクローナル抗体の、可変軽鎖についての1つの配列候補、および可変重鎖についての1つの配列候補が、明らかにされた。

決定されたアミノ酸配列および核酸配列は、以下に列挙される。

実施例2：マウスSP34のヒト化バリアントの選択
相補性決定領域（CDR）移植の、十分に記述されている方法（Jones P et al, 1980, Nature）を用い、そしてhIGHV3-73フレームワークをアクセプター（IMGT命名法）として用いる、抗体のヒト化のため、実施例1において決定されたVHのアミノ酸配列は、鋳型として使用された。hIGHV3-73フレームワークのアミノ酸配列および核酸配列は、以下に示される。IMGT命名法によって定義付けられるCDR配列には、下線が引かれている。
hIGHV3-73フレームワーク

hIGHV3-73フレームワーク

SP34のヒト化VHのCDRのアミノ酸配列および核酸配列は、表2に示される。

（表２）ヒト化SP34のCDR配列

ヒト化SP34可変重鎖のアミノ酸配列および核酸配列は、以下に示される。IMGT命名法によって定義付けられるCDR配列には、下線が引かれている。
huSP34VH

huSP34VH

SP34のマウス配列およびヒト化配列のアラインメントは、以下に示される（mSP34VH（SEQ ID NO: 1）およびhSP34VH（SEQ ID NO: 6））。IMGT命名法によって定義付けられるCDRには、下線が引かれている。mSP34VHに対してアラインされないhSP34VHアミノ酸は、斜体にされている。mSP34VHに対してアラインされるhSP34VHアミノ酸配列は、「.」として示される。

同様に、mSP34の軽鎖CDR1およびCDR2は、ヒトhIGLV7-46フレームワークへと移植された。hIGLV7-46フレームワークのアミノ酸配列および核酸配列は、以下に示される。IMGT命名法によって定義付けられるCDR配列には、下線が引かれている。
hIGLV7-46フレームワーク

hIGLV7-46フレームワーク

DNA合成の間に、mSP34のCDR3領域は、アクセプターフレームワークを作製するため、IIs型制限酵素を含む、非コードのスタッファーDNA断片によって置き換えられて、CDR3領域をコードする、変化させた配列の挿入、およびEP2432878に記載される方法にしたがった、ファージディスプレイ抗体ライブラリの効果的な作製が、可能になった。ヒト化VHおよびアクセプターVLは、最初に、scFvとして、pNDSファージミドベクター中へクローニングされた（Ravn et al., 2009, NAR）。mSP34の元々のCDRL3を部分的に無作為化した、3種類のDNA断片は、縮重NNSコドン戦略を用いて合成された。各断片（Fgt a、Fgt b、Fgt c）は、以下に示すように、CDRの連続した3つのコドンを変化させた。

X = NNSコドン

（表３）実施例2において単離された、選択されたヒト化CD3ε scFvバインダーのCDR配列

ヒト化SP34可変軽鎖のアミノ酸配列および核酸配列は、以下に示される。IMGT命名法によって定義付けられるCDR配列には、下線が引かれている。
L3sp34-G1-1-R2-P1_B6可変軽鎖

L3sp34-G1-2-R2-P1_A10可変軽鎖

L3sp34-G1-1-R2-P1_D8可変軽鎖

L3sp34-G1-2-R2-P1_F8可変軽鎖

L3sp34-G1-1-R2-P1_A11可変軽鎖

L3sp34-G1-2-R2-P1_A4可変軽鎖

L3sp34-G1-2.4-R2-P1_H4可変軽鎖

実施例3：マウスSP34のヒト化バリアントの特徴付け
選択されたscFv候補は、さらなる特徴付けのために、ヒトIgG1フォーマットへと再フォーマットされた。

精製されたIgGは、ヒトおよびカニクイザル組み換えCD3εタンパク質、ならびに関連性のないタンパク質への結合について試験された。対照として、SP34とともに、特許出願WO2011121110に記載される配列を用いて作製されたI2C抗CD3ε抗体が、使用された。用量反応実験は、これらの抗体のすべてが、カニクイザルのおよびヒトのCD3εタンパク質の両方への、同等の特異的な結合を示したことを示した、図1。

結合はまた、T細胞株、および健康な血液ドナーに由来する天然の細胞集団を含む、異なる細胞集団において、FACSによって評価された。最初に、対照および抗CD3ε候補は、異なる濃度で、ヒトT細胞株のJurkatにおいて試験された。図3に示される結果は、様々な候補が、用量依存的な様式でJurkatに結合することを示す。同じ実験が、CD3ε欠損T細胞株に対して実施され、そして結合は観察されなかった。天然の細胞集団への結合は、健康なドナーからPBMCを単離し、そしてCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞への、ならびにB細胞への結合を評価することによって、実施された。蛍光染色における用量依存的な増加は、CD4+集団およびCD8+集団の両方で観察され（図4および図5）、一方で、10μg/mlという最大濃度において、B細胞では染色は観察されなかった。異なる濃度において得られた蛍光強度は、候補間で違いがあり、結合親和性の違いを示唆する。飽和でない抗体濃度での、様々な候補についての平均蛍光値は、表4に列挙される。

（表４）0.1μg/mlの抗体濃度を用いて測定された平均蛍光強度

これらの値は、IgG 1D8、1F8、および1A4は最も高い結合能力を有しており、一方でIgG 1B6および1A11は中間の結合能力を有し、かつIgG 1A10は最も低い結合能力を示すことを、示唆する。異なっている、見かけの親和性を示す抗CD3ε抗体のパネルを入手することは、興味深い、なぜならそれは、T細胞再指向化二重特異性抗体を構築する際に、機能的意義を有し得るからである。

他の態様
本発明は、その詳細な説明と関連付けて説明されたが、前述の説明は例証を意図するものであり、かつ、添付の請求の範囲によって定義付けられる本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他の局面、利点、および改変は、以下の請求の範囲内にある。

Claims

（a）GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRH3）を含む、可変重鎖領域；ならびに
（b）TGAVTTSNY（SEQ ID NO: 11）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRL1）、GTN（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRL2）、ならびに

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む、可変軽鎖領域
を含み、
CD3εに結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
可変重鎖領域が、hIGHV3-73フレームワーク領域を含む、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
可変軽鎖領域が、hIGLV7-46フレームワーク領域を含む、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
CD3εが、ヒトCD3εまたはカニクイザルCD3εである、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
モノクローナル抗体、一本鎖抗体（scAb）、Fab断片、F(ab’)₂断片、一本鎖可変断片（scFv）、scFv-Fc断片、多量体型抗体、または二重特異性抗体である、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
カニクイザル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト型抗体、またはその抗原結合断片である、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
IgGアイソタイプである、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
IgG1アイソタイプである、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（a）CD3εに結合する、第一のアームであって、
（i）GFTFNTYA（SEQ ID NO: 3）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRH1）、IRSKYNNYAT（SEQ ID NO: 4）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRH2）、および

のアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRH3）を含む、可変重鎖領域；ならびに
（ii）TGAVTTSNY（SEQ ID NO: 11）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域1（CDRL1）、GTN（SEQ ID NO: 12）のアミノ酸配列を含む相補性決定領域2（CDRL2）、ならびに

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域3（CDRL3）を含む、可変軽鎖領域
を含む、第一のアーム；ならびに
（b）CD3εに結合しない、第二のアーム
を含む、二重特異性抗体。
SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、およびSEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、または41のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む、請求項10に記載の二重特異性抗体。
第二のアームが腫瘍関連抗原（TAA）に結合する、請求項10に記載の二重特異性抗体。
腫瘍関連抗原（TAA）が、EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1、または5T4である、請求項10に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体が、単一の重鎖ポリペプチドの2つのコピーならびに第一の軽鎖および第二の軽鎖を含み、第一の軽鎖と第二の軽鎖とが異なる、請求項10に記載の二重特異性抗体。
第一の軽鎖の少なくとも一部分がκ型であり、かつ第二の軽鎖の少なくとも一部分がλ型である、請求項14に記載の二重特異性抗体。
第一の軽鎖が、少なくともκ定常領域を含む、請求項15に記載の二重特異性抗体。
第二の軽鎖が、少なくともλ定常領域を含む、請求項16に記載の二重特異性抗体。
第二の軽鎖が、λ可変領域をさらに含む、請求項17に記載の二重特異性抗体。
第二の軽鎖が、κ可変領域をさらに含む、請求項17に記載の二重特異性抗体。
第一の軽鎖が、κ定常領域およびκ可変領域を含み、かつ第二の軽鎖が、λ定常領域およびλ可変領域を含む、請求項14に記載の二重特異性抗体。
請求項1～20のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
疾患を治療する、予防する、および/またはその進行を遅らせるための、請求項21に記載の薬学的組成物。
疾患ががんである、請求項22に記載の薬学的組成物。
T細胞の再ターゲティング（retargeting）のための、請求項21に記載の薬学的組成物。
がんが、白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、神経膠腫、肺がん、気管支がん、大腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎臓がん、腎盂腎がん、口腔がん、咽頭がん、子宮体がん、またはメラノーマである、請求項23に記載の薬学的組成物。