JP7104703B2 - Cd8a結合フィブロネクチンiii型ドメイン - Google Patents
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Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出をした配列表を含み、そして、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。2017年12月5日に作成した前出のASCIIコピーは、JBI5112WOPCT_SL.txtの名称を付しており、その大きさは、266,978バイトである。
本発明は、分化クラスター8a(CD8a)に対して特異的に結合するフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインに関する。かようなFN3ドメインは、例えば、医用画像、診断、及び、薬物療法に使用し得る。かような分子の製造方法、及び、それらを含む診断薬も提供する。
本明細書、及び、特許請求の範囲を通して、説明の態様に関する様々な用語を使用している。そのような用語には、特に断りの無い限りは、当該技術分野における通常の意味を付与する。具体的に定義をしたその他の用語は、本明細書で提供した定義と符合するように解釈する。
本発明は、ヒトCD8A結合FN3ドメイン、及び、検出可能な標識にコンジュゲートしたCD8A結合FN3ドメインを提供する。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードするポリヌクレオチド、または、その相補的核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに、それらを作製、及び、使用する方法を提供する。
本発明は、CD8Aに対して特異的に結合し、任意に、検出可能な標識にコンジュゲートするフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを提供する。これらの分子は、前臨床用途、それに、CD8Aをバイオマーカーとして使用するがん診断において広範に使用し得る。本発明は、本発明のFN3ドメインをコードするポリヌクレオチド、または、その相補的核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに、それらを作製、及び、使用する方法を提供する。
Tencon(配列番号1)は、ヒトテネイシンC由来の15個のFN3ドメインのコンセンサス配列からデザインした、天然に存在しないフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012;米国特許出願公開第2010/0216708号)。Tenconの結晶構造は、FN3ドメインの特徴である7本のベータ鎖をつなぐ6回表面露出ループを示し、各ベータ鎖は、A、B、C、D、E、F、及び、Gと呼ばれており、各ループは、AB、BC、CD、DE、EF、及び、FGループと呼ばれている(Bork and Doolittle,Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992,1992;米国特許第6,673,901号)。これらのループ、または、各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化し得るものであり、これらを用いて、CD8Aに結合する新規の分子を選択し得る。表1は、Tencon(配列番号1)の各ループ、及び、ベータ鎖の位置、及び、配列を示す。
& Sauer,Biochemistry 35,109-116,1996;米国特許第5,856,456号)。
本発明では、本発明のCD8A特異的FN3ドメインは、検出可能な標識を含み得る。ある実施形態では、当該検出可能な標識は、FN3ドメインにコンジュゲートしているキレート剤と複合体を形成し得る。別の実施形態では、当該検出可能な標識は、FN3ドメインにコンジュゲートしているリンカーにコンジュゲートしているキレート剤と複合体を形成し得る。さらに別の実施形態では、当該検出可能な標識は、FN3ドメインにコンジュゲートしているリンカーに結合し得る。さらに別の実施形態では、検出可能な標識は、第2の分子によって特異的に結合する当該標識の能力によって、本発明のペプチドに間接的に結合し得る。このタイプの間接的に付着した標識の例として、第2の分子であるストレプトアビジンによって特異的に結合することができるビオチン標識がある。単一、二重、または、多重標識が、有利であり得る。本明細書で使用する「検出可能な標識」とは、本発明のFN3ドメインに結合したときに、FN3ドメインを検出可能にするあらゆるタイプの標識である。検出可能な標識はまた、細胞に対して毒性、または、細胞傷害性とし得る。一般的に、検出可能な標識として、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、発蛍光団、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、放射性核種、シンチラント、金属原子などの質量標識(質量変化を介した検出用)、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、抗体またはその断片、Grb2、ポリヒスチジン、Ni2+、フラッグタグ、mycタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステル、及び、比色基質がある。特定の実施形態では、当該検出可能な標識は、放射性核種である。当業者であれば、本発明の実施において使用し得る、上記していないその他の有用な標識を、容易に認識する。
本発明のヒトCD8Aに特異的に結合するFN3ドメインは、例えば、共有結合性相互作用を介してその他のサブユニットを組み込み得る。本発明のある態様では、本発明のFN3ドメインは、半減期延長部分をさらに含む。代表的な半減期延長部分として、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質、及び/または、ドメイン、トランスフェリン、ならびに、それらの断片及び類似体、及び、Fc領域がある。
本発明は、本発明のヒトCD8Aに特異的に結合するFN3ドメインをコードする核酸を、単離したポリヌクレオチドとして、または、発現ベクターの一部として、または、直鎖DNA配列の一部として提供するものであり、インビトロでの転写/翻訳のために使用する直鎖DNA配列、当該組成物の真核生物、原核生物、または、フィラメントファージ発現、分泌、及び/または、出現と適合するベクター、または、それらの標的化突然変異源を含む。特定のポリヌクレオチドの例を、本明細書に開示しているが、遺伝コードの縮重、または、特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のFN3ドメインをコードする他のポリヌクレオチドも、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書では、生物学的試料でのCD8Aを検出するためのキットを提供する。これらのキットは、本明細書に記載のCD8A特異的FN3ドメインの1つ以上、及び、キットの使用説明書を含む。
本発明のヒトCD8Aに対して特異的に結合するFN3ドメインは、バイオマーカーとしてCD8Aを使用して、細胞、組織、器官、体液、または、一般的には、宿主において、ヒトの疾患または特定の病変を診断するために使用し得る。本発明の方法は、あらゆる分類に属する動物患者に使用し得る。そのような動物の例として、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び、家畜などの哺乳動物を含む。
本発明は、以下の実施形態も提供するが、これらに限定されない。
a)前記FN3ドメインが、配列番号1のTencon配列に基づくものであり、
b)前記FN3ドメインが、配列番号4のTencon27配列に基づくものであり、及び/または
c)前記FN3ドメインを、配列番号2、3、5、6、7、または、8の配列を含むライブラリーから単離する、実施形態2に記載の単離したFN3ドメイン。
Tencon(配列番号1)は、ヒトテネイシンC由来の15個のFN3ドメインのコンセンサス配列からデザインした、免疫グロブリン様足場であるフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012;米国特許第8,278,419号)。Tenconの結晶構造は、7個のベータ-鎖を連結する6個の表面露出ループを示す。これらのループ、または、各ループで選択した残基をランダム化することで、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインのライブラリーを構築することができ、このライブラリーを用いて、特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(配列番号1):
cisディスプレイシステムで使用するために、Tencon(配列番号1)のFGループだけをランダム化するようにデザインしたライブラリー、TCL1を構築した(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012)。このシステムでは、Tacプロモーター、Tenconライブラリーコード配列、RepAコード配列、cis要素、及び、ori要素の配列を組み込んだ一本鎖DNAを作製する。インビトロ転写/翻訳系で発現させると、それをコードしたDNAに対してcisで結合したTencon-RepA融合タンパク質の複合体を産生する。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、後述するようにして、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅する。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7は、あらゆるアミノ酸であり、及び、
X8、X9、X10、X11、及び、X12は、あらゆるアミノ酸であり、または、削除されている。
TenconのBC及びFGループの両方をランダム化し、かつ、それぞれの位置のアミノ酸の分布を厳密に制御したTCL2ライブラリーを構築した。表2は、TCL2ライブラリーの所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。デザインしたアミノ酸分布には、2つの目的がある。まず、このライブラリーを、Tencon結晶構造の解析、及び/または、ホモロジーモデリングに基づいて、Tenconのフォールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予想された残基に偏らせた。例えば、29番目の位置は、Tenconが折り畳まれる際に疎水性コアに埋もれるので、疎水性アミノ酸のサブセットだけになるように固定した。第2の層のデザインとしては、高親和性の結合分子を効率よく生成するため、抗体の重鎖HCDR3に選択的に認められる残基の分布に近くなるようにアミノ酸分布を偏らせた(Birtalan et al.,J Mol Biol 377:1518-28,2008;Olson et al.,Protein Sci 16:476-84,2007)。この目標のため、表1の「デザインした分布」は、以下の分布、すなわち、6%アラニン、6%アルギニン、3.9%アスパラギン、7.5%アスパラギン酸、2.5%グルタミン酸、1.5%グルタミン、15%グリシン、2.3%ヒスチジン、2.5%イソロイシン、5%ロイシン、1.5%リジン、2.5%フェニルアラニン、4%プロリン、10%セリン、4.5%トレオニン、4%トリプトファン、17.3%チロシン、及び、4%バリンのことを指す。この分布には、メチオニン、システイン、及び、終止コドンは含まれない。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
配列中、
X1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X2は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X3は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X4は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X5は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X6は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X7は、Phe、Ile、Leu、Val、または、Tyrである、
X8は、Asp、Glu、または、Thrである、
X9は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X10は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X11は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X12は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X13は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、
X14は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである、及び
X15は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15、及び、X16は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、または、Yであり、及び
X7、X8、X9、X17、X18、及び、X19は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yであり、または、削除されている。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12SNPLSAIFTT;
X1、X2、X3、X4、X5、X6、及び、X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、または、Yであり、及び
X8、X9、X10、X11、及び、X12は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yであり、または、削除されている。
FGループ内のコドンをランダム化した以外は、5’Tacプロモーターと、それに続く、Tenconの完全な遺伝子配列からなる合成DNA分子のセットを作製した(配列番号26~31)。FGループのランダム化については、システイン及びメチオニンを除くすべてのアミノ酸を同比率でコードした。多様化した部分の長さは、これらの部分が、FGループ内の7、8、9、10、11、または、12個のアミノ酸をコードするようなものとした。それぞれの長さの変異体のサブライブラリーを、2ugのスケールで個別に合成し、次いで、オリゴSloning-FOR(配列番号9)、及び、Sloning-Rev(配列番号10)を使用するPCRで増幅した。
このTCL7ライブラリーは、ランダム化したTenconBC及びFGループを有するライブラリーを提供する。このライブラリーでは、6~9個のアミノ酸の長さのBCループを、7~12個のアミノ酸の長さのランダム化したFGループとコンビナトリアルに混合した。合成Tencon断片BC6、BC7、BC8、及び、BC9(配列番号13~16)を、BCループが、6、7、8、または、9個のランダム化したアミノ酸で置換されるように、残基VXまでの、かつ、残基VXを含むタンパク質のN末端部分をコードしたTencon遺伝子を含むように製造した。これらの断片は、L17A、N46V、及び、E83I突然変異(CEN5243)の発見よりも前に合成されたものであるが、これらの突然変異は、後述する分子生物学的ステップで導入した。この断片を、ランダム化したFGループをコードする断片と結合するため、以下のステップを行った。
特定のライブラリーデザインにおいてランダム化する残基の選択は、形成される相互作用表面の全体の形状を定める。BC、DE、及び、FGループをランダム化したライブラリーからマルトース結合タンパク質(MBP)に結合するように選択した足場タンパク質を含むFN3ドメインのX線結晶解析は、MBPの活性部位に嵌まり込み、大きく湾曲した界面を有していることを示した(Koide et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104:6632-6637,2007)。これに対して、MBPに結合するように選択したアンキリン繰り返し足場タンパク質は、より平坦な相互作用表面を有しており、また、活性部位から離間したMBPの外表面に結合することが認められた(Binz et al.,Nat Biotechnol 22:575-582,2004)。これらの結果は、足場分子の結合表面の形状(湾曲と平坦)が、どの標的タンパク質が、または、それらの標的タンパク質上の特定のエピトープが、足場によって効果的に結合されるかを決定し得る、ことを示唆している。タンパク質結合用のFN3ドメインを含んだタンパク質足場の遺伝子操作に関して報告をした研究は、標的に結合するための隣接したループを遺伝子操作し、これにより、湾曲した結合表面をもたらすことに頼っている。この手法は、こうした足場によってアクセス可能な標的及びエピトープの数を制限し得る。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、及び、X13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、または、Mである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、及び、X13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、または、Wである。
アミノ酸分布を制御するため、Colibraライブラリー技術(Isogenica)を使用して、TCL21ライブラリーを作製した。アミノ酸分布を制御するため、Slonomics技術(Morphosys)を使用して、TCL19、TCL23、及び、TCL24遺伝子断片を作製した。最初の合成の後に、PCRを用いて各ライブラリーを増幅した後、ループライブラリーに関して先述したCISディスプレイシステム(Odegrip et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:2806-2810,2004)を使用する選択に用いるために、RepAの遺伝子とライゲートした。
2つのヒトCD8アルファ(Swiss Prot P01732)構築物を、HEK細胞から発現及び精製して、CISディスプレイパニング用の組換えタンパク質を産生した(表3)。
Cisディスプレイを用いて、TCL18、TCL19、TCL21、TCL23、及び、TCL24ライブラリーからCD8アルファ結合ドメインを選択した。ビオチン化CD8W7及びCD8W13をパニングに使用した。インビトロ転写及び翻訳(ITT)を行うため、3μgのライブラリーDNAを、0.1mMの完全アミノ酸、1X S30プレミクス成分、及び、15μLのS30エクストラクト(Promega)を用いて、50μLの全体積で、30℃で、インキュベートした。1時間後、375μLのブロッキング溶液(0.1% Casein(Thermo Fisher,Rockford,IL)、100mg/mlのHerring Sperm DNA(Promega,Madison,WI)、1mg/mLのヘパリン(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))を加え、そして、反応物を、氷上で、15分間、インキュベートした。選択のために、ビオチン化抗原を、400nM(ラウンド1)、200nM(ラウンド2及び3)、及び、100nM(ラウンド4及び5)の濃度で添加した。ニュートラアビジン磁気ビーズ(Thermo Fisher,Rockford,IL)(ラウンド1、3、5)、または、ストレプトアビジン磁気ビーズ(Promega,Madison,WI)(ラウンド2及び4)を用いて、結合ライブラリーメンバーを回収し、そして、これらのビーズを、500μLのPBSTで5~14回、続いて、500μLのPBSで2回洗浄することで、未結合のライブラリーメンバーを除去した。改善した親和性を有する足場分子を同定するために、さらなる選択ラウンドを実施した。すなわち、ラウンド5からのアウトプットを、上記したようにして調製し、そして、以下の変更を伴うさらなる反復ラウンドに供した。ビオチン化標的濃度を、25nM(ラウンド6及び7)、または、2.5nM(ラウンド8及び9)にまで減少させ、そして、過剰の非ビオチン化標的タンパク質の存在下で、さらに1時間洗浄を行った。これらの変更の目的は、潜在的に速いオン速度と遅いオフ速度を持つバインダーとを同時に選択して、実質的に低いKDをもたらすことにある。
ニュートラアビジンコートプレートを、Starting Block T20(Pierce)で、1時間、ブロックした後に、ビオチン化CD8W7もしくはCD8W13(パニングと同じ抗原)、または、ネガティブコントロール(ヒトFc)で、1時間、コートした。これらのプレートを、TBSTですすぎ、そして、希釈した溶解物を、1時間、プレートに塗布した。さらにすすぎを行った後に、ウェルを、HRPコンジュゲート抗FN3ドメイン抗体(PAB25)で、1時間、処理し、次いで、POD(Roche)でアッセイした。バックグラウンドよりも少なくとも10倍強いシグナルを有するFN3ドメイン分子を、さらなる分析のために選択した。
生化学的結合ELISAによって同定したユニークヒットから単離したクローンを、96ウェルブロックプレートでの増殖のために単一ヒットプレートに合わせ、クローンを、振盪しながら、37℃で、一晩、1mLの培養物(選択のためにカナマイシンを補充したLB培地)で増殖させた。96ブロックプレートでのタンパク質発現のために、カナマイシンを補充した1mLのTB培地に、50uLの一晩培養物を接種し、そして、OD600=0.6~1まで、300rpmで連続的に振盪しながら、37℃で、増殖させた。目標のODに達したら、IPTGを1mMまで添加してタンパク質発現を誘導し、プレートを、一晩増殖のために、30℃(300rpm)に移した。一晩培養物を遠心分離して細胞を回収し、細菌ペレットを、用時まで、-80℃で保存した。ペレットを、BugBuster(登録商標)HT溶解緩衝液(Novagen EMD Biosciences)で溶解し、そして、His MultiTrap(商標)HPプレート(GE Healthcare)での浄化溶解液を、His-タグしたセンチリンで精製し、次いで、20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、及び、250mMイミダゾールを含む緩衝液、pH 7.4で溶出した。精製した試料を、PD MultiTrap(商標)G-25プレート(GE Healthcare)を用いた分析のために、PBS pH7.4に交換した。
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、抗CD8アルファFN3ドメイン分子の凝集状態を測定した。各精製FN3ドメインのアリコート(10μL)を、Superdex 75 5/150カラム(GE Healthcare)に、流速0.3mL/分で、PBS pH7.4を移動相として注入した。カラムからの溶出液を、280nmの吸光度でモニターした。各実験でのコントロールとして、野生型Tenconを充てた。Agilent ChemStationソフトウェアを使用して、溶出プロファイルを分析した。同じ実験でのテネイシンコンセンサタンパク質の溶出プロファイルと同様の溶出プロファイルを示したタンパク質だけを、さらなる特徴決定のために考慮した。パニング、ELISAスクリーニング、及び、サイズ排除クロマトグラフィー分析の後に、バックグラウンドの10倍を超える強さで組換えヒトCD8アルファに結合し、そして、SECによる凝集体が認められない、合計で190個の独特な抗ヒトCD8アルファFN3ドメインを単離した(表4、配列番号40~228、及び、70)。
ヒト及びカニクイザル初代CD8 T細胞に対する190個のELISAヒットの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。このFN3ドメイン分子を、PBSで2μM及び0.2μMに希釈し、96ウェルフォーマットで、ヒトまたはカニクイザルCD8+ T細胞と共にインキュベートした。4℃で、1時間後、これらの細胞をPBSで1回洗浄した後、抗FN3ドメイン抗体(PAB25)溶液に再懸濁した。このインキュベートの後、これらの細胞を、PBSで2回洗浄し、そして、PEコンジュゲート二次抗体、及び、生存色素を添加した。最後に、細胞を洗浄し、BD Canto Instrumentを用いたフローサイトメトリー分析のために、PBSに再懸濁した。細胞を生細胞上でゲートし、結合したセンチリンの蛍光強度中央値(PEチャネル)を、Cytobankソフトウェアを使用して計算した。結果を、表4にまとめている。
精製した抗CD8A FN3ドメインを、さらなる特徴決定をすべく、最も遅いオフ速度を有するクローンを選択するために、Proteon表面プラズモン共鳴装置を使用して、オフ速度分析に供した。測定したオフ速度は、表4に示したように、2.64E-5から1.07E-2秒-1の範囲であった。
酸化(メチオニンまたはトリプトファン)、脱アミド化(NS)、異性化(DG)及び、クリッピング(DP)の翻訳後修飾の危険性を排除するために、幾つかの突然変異を、抗CD8A候補の上位候補にデザインした。プロリンは、ベータ鎖を不安定化させる可能性があるので、ベータ鎖に認められるプロリン残基もまた突然変異させた(Chiba T.,et al.J Biol Chem.2003;278:47016-24)。FN3ドメインライブラリーデザイン位置に由来する残基のみを、突然変異について考慮した。親分子の類似の化学的性質(例えば、トリプトファンからチロシン)を模倣するか、または、その位置でその他のCD8A FN3ドメインに認められるアミノ酸で、PTMリスクのあるアミノ酸を置換するために、変異体配列を選択した。遺伝子操作した配列の全リストを、表5に示す。各変異体と組換えCD8アルファとの間の解離速度を、表面プラズモン共鳴で測定して、相対的結合強度を推定した。
19個の抗CD8A候補を、組換えヒトCD8アルファに対する結合の完全な動態分析のために選択した。これらの候補を、1)ヒトT細胞に対する強力な相対的結合、2)カニクイザルT細胞に対する強力な相対的結合、3)2uMと比較して、0.2uMでの細胞結合の最小減少、4)SECを介した凝集体がないこと、5)オフ速度が、2.07E-3秒-1未満であること、6)配列ファミリーに関する配列多様性、及び、7)潜在的に変化する可能性の課題(酸化、アミド分解、クリッピング、及び、疎水性)を有する配列の相対的傾向の基準を用いて、上記した陽性ヒット(表4)から選択した。
抗CD8A FN3ドメインを、マレイミド含有キレート剤またはPET標識のコンジュゲーションのために、単一のシステイン残基を含むように修飾した。残基E54からシステインへの突然変異を有するクローンP282DR9P1359_F5、P282DR9P1359_F7、P282DR9P1359_G7、P282ER9P1360_C8、P283AR9P1362_D6、及び、P282DR9P1359_C5をコードする合成プラスミドDNAを、DNA2.0で合成した(表7)。E54は、この残基で変異したその他のFN3ドメインの結合親和性、安定性、及び、発現レベルの維持を実証した以前の研究に基づいて、変異の位置として選択した(Goldberg S.et al.Protein Engineering Design and Selection 2016 印刷版発行前の電子版)。
19個の選択した抗CD8A FN3ドメインについて、全用量応答結合曲線を作成した。各々の候補を、PBSで、20μMに希釈し、続いて、1:3希釈系列で、11点または18点の用量反応曲線を作成した。ヒトまたはカニクイザルのCD8+ T細胞を、希釈したFN3ドメインと共に、4℃で、1時間、インキュベートした。細胞を、PBSで、1回洗浄し、そして、抗センチリン抗体(PAB25)と共に、4℃で、1時間、インキュベートした。これらの細胞を、PBSで、2回洗浄し、続いて、PE二次抗体、抗CD3-PacB、抗CD4-APC、及び、生存色素とインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、BD Canto Instrumentを用いたフローサイトメトリー分析のために、PBSで再懸濁した。CD8 T細胞を、生存CD3+CD4-細胞と定義した。結合したセンチリンの蛍光強度の中央値(PEチャネル)、及び、Cytobankソフトウェアを使用して陽性染色を示す細胞の%を計算した。結果を、Prismを用いてグラフ化し、そして、EC50値を、4パラメーター用量反応可変勾配方程式を用いて計算した。
デノボ活性化
抗CD8A FN3ドメインが、T細胞を活性化するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーアッセイを実施して、T細胞活性化マーカーの変化をモニターした。6つの抗CD8A FN3ドメインを、T細胞活性化について評価した。当該FN3ドメインを、1μMまたは10nMのいずれかで、培地に含まれるヒトpan-T細胞と、二重に、4日間、インキュベートすることで、デノボでの活性化を評価した。2名の別個のドナーについて試験を行った。プレート結合抗CD3を、0.1ug/mL、及び、0.01ug/mLの2つの用量で、ポジティブコントロールとして使用した。PBSを、ネガティブコントロールとして使用した。次いで、細胞を生存色素で染色し、そして、次の抗体のパネル、すなわち、CD4-FITC、CD3-PerCP-Cy5.5、CD69-PacB、CD45RA-BV605、CD25-BV650、CD127-PE、及び、CD137-PE-Cy7で染色した。CD8+細胞を、生存CD3+CD4-細胞と定義し、そして、各々のT細胞活性化マーカーについてプロファイルした。蛍光強度の中央値を、FlowJoソフトウェアを用いて計算し、そして、複製値を平均化した。結果を、表10A(ドナー022)、及び、10B(ドナー146)にまとめている。365、366、367、368、及び、370では、1μMの最高用量レベルで試験した2名のドナーの1名のみに、T細胞活性化マーカーの小さな変化が認められた。これらの変化は、10nMの投与量では、双方のドナーでは認められておらず、このことは、これらの分子が、関連する濃度で、T細胞をデノボで活性化しないことを示唆している。369の分子は、双方のドナーにおいて、最高用量レベルで、CD137発現を有意に活性化しているものと考えられる。
抗CD8A FN3ドメインが、pan-活性化T細胞におけるT細胞活性化のマーカーに影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、当該抗CD8A FN3ドメインもまた、低用量のプレート結合CD3と組み合わせて評価した。このアッセイでは、最適以下の濃度(0.01μg/mL)のプレート結合抗CD3を使用して、1μMまたは10nMの抗CD8Aの存在下で、T細胞を活性化した。4日後に、これらの細胞を、上記したのと同じパネル及びゲート戦略を用いて評価した。2名の独立したドナーについて試験をした。蛍光強度の中央値を、FlowJoソフトウェアを用いて計算し、そして、複製値を平均化した。結果を、表11A(ドナー022)、及び、11B(ドナー146)にまとめている。
活性化マーカーで観察された変化のいずれかが、サイトカイン産生の変化をもたらすかどうかを決定するために、2つの抗CD8A FN3ドメインを用いて、抗原依存性T細胞活性化アッセイをも実施した。1セットのアッセイについて、CMV反応性、または、M1反応性のヒトPBMCのいずれかを解凍し、そして、6ウェルプレートで、37℃で、一晩静置した。翌日、PBMCをピペッティングにより回収し、計数し、そして、10μg/mLペプチドの存在下または非存在下で、IFNg Mabtech ELISpotプレートにプレーティングした。1μMの抗CD8A FN3-DFOコンジュゲートをウェルに添加し、そして、それらのプレートを、37℃で、約24時間、静置してインキュベートした。これらの細胞を除去し、そして、当該プレートを、PBSで5回洗浄した。供給を受けた検出抗体を添加し、そして、プレートを、2時間、インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そして、キット基質を各ウェルに加えた。プレートを水に潜らせて反応を停止させる前に、プレートを、約5分間、展開した。プレートを、暗所で、一晩、逆さまにして乾燥させた。プレートを、AID EliSpot Readerで読み取り、そして、スポットカウントを、AID EliSpotソフトウェアを使用して生成した。結果を、Prismでグラフ化した。結果は、図1にまとめてある。このアッセイでは、培地単独またはペプチドの非存在下での非CD8A結合TenConコントロールと比較して、365-DFOは、IFNgスポットの個数を増加させない(図1A、1C)。ペプチド及びCD3を、ポジティブコントロールとして含む。ペプチドの存在下では、ペプチド単独または非CD8A結合テンコンを有するペプチドと比較して、当該365-DFOは、IFNgスポットの数を変化させない(図1B、1D)。培地を、ネガティブコントロールとして含み、そして、CD3を、ポジティブコントロールとして含む。これらの結果は、センチリンが、T細胞活性化に影響を及ぼさないことを示唆している。
CD8S365をヨウ素-124で放射標識して、[124I]-IPEM CD8S 365を製造する現在の方法(スキーム1)は、文献(Bioconjugate Chem.1991,2,435-440;ChemistryOpen 2015,4,174-182)の手順に依拠した。
2つの抗CD8A FN3分子(CD8S365、及び、CD8S368)を、非ヒト霊長類(NHP)におけるPET画像化のために選択した。当該抗CD8A分子を、Zr-89(Zevacor,Somerset,NJ)、または、I-124(CPDC,Hamilton,Canada、及び、Zevacor,Somerset,NJ)のいずれかで放射標識した。約1~2mCiの放射標識抗CD8A分子(複数可)を、イソフルランを含む酸素で麻酔をしながら、メスのNHP(カニクイザル)の伏在静脈に注射した。各々の動物を、ベッドを動かして動物の全身を(頭から下腹部まで)収容して、大口径microPET Focus 220 PETスキャナー(Siemens,Knoxville,TN)でスキャンした。各スキャンは、約1時間続き、そして、これらの画像は、注射の15分後、2時間後、及び、24時間後に得た。PET画像は、2D最大尤度予測最大化(ML-EM)アルゴリズムを使用して、ボクセルサイズ1.898×1.898×0.796mm、寸法128×128×475の3D画像に再構成した。注射とは反対側の脚の伏在静脈から複数の時点で血液試料を採取し、そして、血中放射能をウェルカウンターで計数した。
抗CD8A分子の特異性を試験するために、同カニクイザルを、キメラCD8枯渇抗体(CM-T807マウスV/ヒトFc抗CD8抗体)で処理して、画像化する前にCD8+ T細胞を減少させた。画像化する3日前に、10mg/kgのCD8枯渇抗体を、動物の皮下に投与した。枯渇の前後に、各動物から採取した血液試料に含まれるCD8 T細胞のパーセンテージを測定することで、CD8枯渇を確認した(図12)。
抗CD8A FN3ドメイン分子、及び、PETを用いて検出可能な細胞の最小数を決定するために、異なる数のCD8過剰発現細胞を用いて、マウスで試験を実施した。4~5週齢のメスのNOD-scid IL2rγnull(NSG)マウス(JAX Laboratory)を使用し、そして、7~10日間、順応させた。これらのマウスを、12時間の明暗周期(06:30の時間に点灯)の下、温度19~22℃で、IVCケージに収容した。マウスには、標準的なオートクレーブ処理をした実験用固形飼料と水を自由に与えた。マウスに耳タグを付け、そして、試験開始の5~7日前に尾に入れ墨を入れて、各動物を識別した。
配列番号1=当初のTencon配列
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LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)7-12PLSAEFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7は、あらゆるアミノ酸であり、及び、X8、X9、X10、X11、及び、X12は、あらゆるアミノ酸であるか、または、削除されている。
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
配列中、
X1は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X2は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X3、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Val、
X4は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X5は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X6は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X7は、Phe、Ile、Leu、Val、または、Tyrであり、
X8は、Asp、Glu、または、Thrであり、
X9は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X10は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X11は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X12は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X13は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、
X14は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valであり、及び
X15は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、または、Valである。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、X13、X14、X15、及び、X16は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、または、Yであり、及び
X7、X8、X9、X17、X18、及び、X19は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yであり、または、削除されている。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12SNPLSAIFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、及び、X7は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、または、Yであり、及び
X8、X9、X10、X11、及び、X12は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Yであり、または、削除されている。
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX8VX9IX10GVKGGX11X12SX13PLSAIFTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、及び、X13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、または、Mである。
TCL24ライブラリー(配列番号8)
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSERSYDLTGLKPGTEYX10VX11IX12GVKGGX13X14SX15PLX16AX17FTT;
配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X10、X11、X12、及び、X13は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、または、Wである。
GTGACACGGCGGTTAGAAC
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
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CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
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CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
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Claims (18)
- 配列番号40~269のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインが、検出可能な標識、細胞傷害剤、半減期延長分子、キレート剤、ポリエチレングリコール、または、核酸から選択される、第2の分子にコンジュゲートしている、請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度の高い試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、ハプテンである、請求項2に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインが、配列番号1の位置54に対応する残基に、システイン置換を有する、請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインが、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイで測定されるように、インビトロで、CD8+ T細胞を活性化しない、請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインが、表面プラズモン共鳴で測定されるように、0.02~6.6nMの間の親和性(KD)で、ヒトCD8Aタンパク質に結合する、請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインのN末端にメチオニンをさらに含む、請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 前記半減期延長部分が、CD8結合分子、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール(PEG)、CD8、CD8変異体、または、免疫グロブリンのFc領域の少なくとも一部である、請求項2に記載の単離したCD8A結合FN3ドメイン。
- 請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメインをコードする単離したポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターを含む単離した宿主細胞。
- ヒトCD8Aタンパク質に対して特異的に結合する単離したCD8A結合FN3ドメインを製造する方法であって、前記単離したCD8A結合FN3ドメインを発現する条件下で請求項11に記載の単離した宿主細胞を培養し、及び、前記単離したCD8A結合FN3ドメインを精製する、ことを含む前記方法。
- 請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメインを含む診断キット。
- 請求項1に記載の単離したCD8A結合FN3ドメインを含む診断薬または捕捉剤。
- 前記単離したCD8A結合FN3ドメインが、配列番号1の残基位置54に対応する、システイン置換を有する、請求項14に記載の診断薬または捕捉剤。
- 前記置換システインが、Zr-89、または、I-124にコンジュゲートしている、請求項15に記載の診断薬。
- 生物学的試料に含まれるCD8発現細胞を検出する方法であって、前記生物学的試料を請求項15に記載の診断薬で処理し、及び、そのような診断薬のCD8A結合FN3ドメインへの前記生物学的試料の結合を評価する、ことを含む前記方法。
- 前記置換システインが、Zr-89、または、I-124にコンジュゲートしている、請求項17に記載の方法。
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