ES2923567T3 - Composiciones del dominio de fibronectina estabilizadas, métodos y usos - Google Patents
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Abstract
Un andamio de proteína basado en una secuencia de consenso de proteínas de fibronectina tipo III (FN3), como la décima repetición FN3 de fibronectina humana (tenascina humana), que incluye ácidos nucleicos aislados que codifican un andamio de proteína, vectores, células huésped y métodos para hacer y uso de los mismos. Las moléculas de andamiaje proteico de la presente invención exhiben una estabilidad térmica y química mejorada al tiempo que presentan seis dominios de bucle modificables que pueden diseñarse para formar un compañero de unión capaz de unirse a un objetivo para aplicaciones en composiciones, métodos y dispositivos diagnósticos y/o terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones del dominio de fibronectina estabilizadas, métodos y usos
ANTECEDENTES
Campo de la invención
La presente invención se refiere a armazones proteicos con nuevas propiedades, que incluyen la habilidad de unirse a objetivos celulares. Mas particularmente, la presente invención se dirige a armazones proteicos basado en una secuencia de consenso de una repetición de fibronectina tipo III (FN3).
Análisis del Campo
Los anticuerpos monoclonales son el tipo más ampliamente utilizado de proteínas terapéuticas cuando se desea una alta afinidad y especificidad para una molécula objetivo. Sin embargo, las proteínas que no son anticuerpos pero que pueden ser diseñadas para unirse con dichos objetivos son de gran interés en la industria biofarmaceutica. Estas proteínas de “armazones alternativos” pueden tener ventajas sobre los anticuerpos tradicionales debido a su pequeño tamaño, la falta de enlaces de disulfuro, alta estabilidad, y habilidad para ser expresados en huéspedes procariotas. Recientemente se han aplicado nuevos métodos de purificación; estos son fácilmente conjugables con drogas/toxinas, penetran eficientemente en los tejidos y son fácilmente formateados en uniones multiespecíficas (Skerra 200 J Mol Recognit 13(4): 167-87; Binz and Pluckthun 2005 Curr Opin Biotechnol 16(4): 459-69).
Uno de tales armazones alternativos es el pliegue de inmunoglobulina (Ig). Este pliegue se encuentra en las regiones variables de anticuerpos, así como miles de proteínas que no son anticuerpos. Se ha mostrado que una de tales proteínas Ig, la décima repetición de fibronectina tipo III (FN3) de la fibronectina humana, puede tolerar un gran número de mutaciones en giros expuesto en superficie mientras retiene el conjunto de la estructura pliegue-Ig. Así, se han construido bibliotecas de variantes de amino ácidos sobre los giros y uniones seleccionados con un gran número de diferentes objetivos (Koide et al. 1998 J Mol Biol 284(4): 1141-51; Karatan et al. 2004 Chem Biol 11(6): 835-44). Se ha hallado que tales dominios de FN3 diseñados se aglutinan con los objetivos de alta afinidad, mientras retienen importantes propiedades biofísicas (Parker et al. 2005 Protein Eng Des Sel 18(9): 435-44).
Las propiedades físicas deseables de las moléculas de potenciales armazones alternativos incluyen la alta estabilidad térmica y la reversibilidad del pliegue y despliegue térmico. Se han aplicado muchos métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de proteínas y encimas, incluyendo el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables muy similares, diseño de estabilización de puentes de disulfuro, mutaciones para incrementar la propensión a hélice-alfa, diseño de puentes de sal, alteración de la carga en superficie dela proteína, evolución dirigida, y composición de secuencias consensuadas (Lehmann and Wyss 2001 Curr Opin Biotechnol 12(4): 371-5). La estabilidad en altas temperaturas es una propiedad deseable de tales armazones ya que esto aumenta el rendimiento de las proteínas obtenidas, mejora la solubilidad de la molécula purificada, mejora la actividad de los armazones intracelulares, reduce la inmunogenicidad, y minimiza la necesidad de una cadena fría en la fabricación.
La WO 2010/051274 describe un armazón de proteínas basado en una secuencia de consenso de proteínas de fibronectina tipo III (FN3). La US2008/0176654 describe mutagénesis de recorrido y bibliotecas de polipéptidos de fibronectina Tipo III (FN3) combinatorias de variantes naturales, junto con su método de construcción y uso.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Aquí se describe un armazón de proteína basado en la repetición de la proteína fibronectina tipo III (FN3), codificada o acidos nucleicos complementarios, vectores, células huésped, composiciones, combinaciones, formulaciones, dispositivos, y métodos para fabricarlos y utilizarlos. En un caso preferente, el armazón de proteína está compuesto por una secuencia consensuada de múltiples dominios FN3 de Tenascin-C humano (en lo sucesivo “Tenascin”). En otro caso preferente, el armazón de proteína aquí descrito es una secuencia consensuada de 15 dominios FN3 (SEQ ID NO: 1-15) o una variante de la misma. En un aspecto particular de la invención, el armazón de proteína tiene residuos sustitutos que causan que el armazón de la proteína demuestre habilidad para aumentar la resistencia a la desnaturalización térmica y química. Los armazones de proteína de la invención pueden ser diseñados mediante métodos conocidos en la materia, incluyendo la inserción de residuos en región en giro designado en las cuales el armazón, forme un dominio de unión seleccionado de un compañero de unión. El compañero de unión debe ser una molécula soluble o una molécula celularmente anclada, por ejemplo, el dominio extracelular de una proteína receptora.
Las sustituciones específicas de la secuencia basada en consenso de SEQ ID NO:16 (Tencon) seleccionada para la estabilidad térmica y química inherente descritas en la presente mejoran la estabilidad térmica del armazón Tencon a más de 11°C y cambian el punto medio de la desnaturalización inducida GdmCL desde 3.4 M a más de 5 M. En un caso, las sustituciones específicas a SEQ ID NO: 16 (Tencon) son unitarias, como el N46V, E14P y E86I y todos los L17A y N46V y E86I. Polipéptidos basados en Tencon con estabilidad mejorada proporcionan armazones con facilidad de purificación mejorada, formulación, y aumento de la vida propia. Los compañeros de unión diseñados con estabilidad general mejorada pueden ser producidos introduciendo péptidos aleatorizados en los giros del armazón estabilizado.
Los armazones de proteína de la invención pueden ser utilizados como unidades monoméricas o vinculados para formar estructuras poliméricas con las mismas o diferentes especificaciones del compañero de unión. Las moléculas basadas en el armazón de proteína Tencon deben ser además modificadas para mejorar una o más propiedades in vivo relacionadas con la biodistribución, persistencia en el cuerpo, o eficacia terapéutica como la asociación con moléculas con alteración celular, en particular, la captación de células epiteliales, por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo, o moléculas diseñadas para aglutinar proteínas de suero como el dominio de unión abdominal. En otras realizaciones, los armazones de proteína de la invención deben ser ligados a una molécula de ácido nucleico que debe codificar el armazón de proteína.
Aquí se describe al menos un método para expresar al menos un polipéptido de armazón de proteína cuya secuencia está relacionada con una secuencia consensuada de múltiples dominios FN3, en una célula huésped, que comprende el cultivo de una célula huésped como se describe en la presente bajo la condición de que de ellas al menos un armazón de proteína sea expresado en cantidades detectables y/o recuperables.
Aquí se describe al menos una composición que comprende (a) un armazón de proteína basado en una secuencia consensuada de múltiples dominios FN3 y/o la codificación de ácido nucleico descrito en la presente; y (b) un adecuado y/o farmacéuticamente aceptado portador o diluyente.
En la presente se describe un método de generación de bibliotecas de armazones de proteína basados en una repetición de proteínas fibronectina tipo II (FN3), preferiblemente, una secuencia consensuada de múltiples dominios FN3 y, más preferentemente, una secuencia consensuada de múltiples dominios FN3 para Tenascin humano con estabilidad térmica y química mejorada. Las bibliotecas se pueden generar mediante alteración de la composición amino ácido de un giro simple o la alteración simultánea de múltiples giros o posiciones adicionales de la molécula de armazón. Los giros alterados pueden ser alargados o acortados convenientemente. Dichas bibliotecas pueden ser generadas para incluir todo el amino ácido posible en cada posición, o un subconjunto de amino ácidos diseñados. Los miembros de la biblioteca pueden ser utilizados para la detección por pantalla, como la representación in vitro (ADN, ARN, representación de ribosomas, etc.), hongos de levadura, bacteriana, y representación fágica.
Los armazones de proteína de la presente invención proporcionan propiedades biofísicas mejoradas, como la estabilidad bajo condiciones de elevada fuerza osmótica y solubilidad en altas concentraciones. Los dominios de las proteínas de armazón no están vinculados al disulfuro, haciendo posible la expresión y archivo en sistemas desprovistos de encimas requeridos para la formación de enlaces disúlfidos, incluyendo sistemas procarioticos, como el E. coli, y un sistema de transcripción/translación in vitro, como el sistema de lisado de reticulocitos de conejo.
También se divulga en la presente un método de generación de una molécula de armazón que aglutina para un objetivo particular mediante la criba de la biblioteca de armazones de la invención con el objetivo de detectar uniones. En otros aspectos relacionados, la que descrito son métodos de representación que deben ser empleados para generar o armazones de proteínas maduras con la actividad deseada, p. ej. Capaces de aglutinar para conseguir proteínas con una cierta afinidad. La afinidad de maduración puede ser realizada mediante iteración de mutagénesis y selección utilizando sistemas, como la representación fágica o la representación in vitro. La mutagénesis durante este proceso debe resultar de la muta génesis dirigida para residuos de armazón específicos, mutagénesis aleatoria debido a PCR propenso a errores, transposición de ADN, y/o combinaciones de estas técnicas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 Análisis SDS-PAGE de Tencon purificado realizado en un gel (Invitrogen) Bis-Tris NuPAGE 4-12% y tenido con azul Coomasie. N representa las condiciones naturales y R las condiciones reducidas.
Figura 2 muestra un análisis de dicroísmo circular de Tencon en PBS.
Figura 3 muestra un análisis de dicroísmo circular del tercer dominio FN3 desde la tenascina y Tencon en PBS donde se alcanzan temperaturas de fusión de 54°C y 78°C respectivamente.
Figura 4 muestra un diseño plásmido fagémico del pTencon-pIX. La expresión está dirigida por un promotor
Lac y la secreción a través de una secuencia de señal OmpA.
Figura 5 muestra el NYC-Tencon que se puede visualizar utilizando ELISA demostrando la unión del fago al recubrimiento anti-Myc, recubrimientos CNTO95 y no recubiertos.
Figura 6 es una figura describiendo la estructura en giro de tercer dominio FN3 del Tenascin humano. Figura 7 muestra la representación mediante ELISA resultado de las selecciones IgG donde se testaron clones individuales para aglutinar biotina IgG o Biotina HSA como control.
Figura 8A-B son gráficos que muestran la desnaturalización inducida de GdmCl para mutaciones simples (A) y mutaciones combinatorias (B) medidas mediante excitación fluorescente de 280nm y una emisión de 360nm.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Abreviaturas
ADCC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; CDC = citotoxicidad dependiente de complementos; DSC = calorimetría de escáner diferencial; AG = Energía Libre de Gibbs; IgG = Inmunoglobulina G; Tm = Temperatura de fusión;
Definiciones y explicación de la terminología
El término “anticuerpo” o “fracción de anticuerpo” se pretende que abarque anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de los mismos, incluyendo sin limitaciones, compuestos miméticos de anticuerpos o porciones que comprenden anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especifico o porción del mismo, incluyendo, sin limitaciones, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos de dominio simple, mini-cuerpos, y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión de antígenos que se unen al antígeno de interés. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpos capaces de unirse al antígeno objetivo o a porciones del mismo, incluyendo, pero no limitándose a, Fab (p. ej. Por digestión papaína), Fab’ (p. ej. Por digestión pepsina y reducción parcial) y F (ab’)2 (p. ej. Por digestión pepsina), facb (p. ej. Por digestión plasmina), pFc’ (p. ej. Por digestión pepsina o plasmina), Fd (p. ej. Por digestión pepsina, reducción parcial y re-agregación), Fv o scFv (p. ej. Por técnicas de biología molecular) fragmentos, están abarcados por el termino anticuerpos. El anticuerpo o fragmento puede ser derivado de cualquier mamífero, como, pero no limitado a, un humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, un camélido, una cabra, o cualquier combinación de los mismos e incluye aisladamente humanos, primates, roedores, mamíferos, quiméricos, humanizados y/o anticuerpos de CDR injertado, inmunoglobulinas, productos de disociación y otras porciones específicas y variantes de las mismas.
El término “epítopo” significa una proteína determinante capaz de unirse específicamente a un anticuerpo o dominio de unión diseñado como uno o más giros de una proteína de base de armazón. Los epitopos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas superficie químicamente activa como el amino ácido o cadenas de azúcar y generalmente tienen características específicas de estructura en tres dimensiones, así como características de carga específica. Los epitopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en la unión del primero, pero no del segundo donde se pierde en presencia de solventes desnaturalizante. Los epitopos conformacionales resultan del plegado conformacional de la molécula objetivo la cual se alcanza cuando amino ácidos de porciones diferentes de la secuencia lineal de la molécula objetivo están muy próximas en un espacio tridimensional. Tales epitopos conformacionales son generalmente distribuidos en el lado extracelular de la membrana de plasma.
Los términos “Fc”, “proteína que contiene Fc” o “molécula que contiene Fc” son empleados en la presente para referirse a una proteína mono-mérica, dimérica, heterodimérica que tenga al menos un dominio de inmunoglobulina CH2 y CH3. Los dominios CH2 y CH3 pueden formar al menos una parte de la región dimérica de la proteína/molécula (p. ej. Anticuerpos).
El término “estabilidad” es utilizado en la presente para referirse a la habilidad de mantener un estado de plegado bajo condiciones fisiológicas de manera que retenga al menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, unirse a una molécula objetivo como la citoquina o proteína de suero. La medición de la estabilidad de la proteína y la fiabilidad de la proteína pueden verse como el mismo o como diferente aspecto que la integridad de la proteína. Las proteínas son sensibles o “lábiles” por la desnaturalización causada por calor, por ultravioletas o radiación iónica, cambios en la osmolaridad ambiente y el PH si se trata de una solución liquida, fuerza de cizallamiento mecánico impuesta por filtraciones de pequeño tamaño de poro, radiación ultravioleta, radiación iónica, como la radiación gamma, deshidratación química o por calor, o cualquier otra acción o fuerza que puede causar la destrucción de la estructura de proteína. La estabilidad de la molécula puede determinarse por métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede ser determinada midiendo la temperatura de fusión térmica
(“TM”). El TM es la temperatura en ° Celsius (°C) a la cual la mitad de las moléculas se despliegan. Generalmente, cuanta más alta es la TM, más estable es la molécula. Además del calor, el ambiente químico también cambia la habilidad de la proteína para mantener una estructura en tres dimensiones particular.
Del mismo modo, la desnaturalización química se puede medir por diferentes métodos. La desnaturalización química es un agente conocido por interrumpir las interacciones de enlace no covalente de una proteína, incluyendo enlaces de hidrogeno, enlaces electroestáticos, fuerzas Van der Waals, interacciones hidrofóbicas o enlaces disúlfidos. Los desnaturalizantes químicos incluyen clorhidrato de guanidinio, tiocianato guaninio, urea, acetona, disolventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (bromuro de litio sulfato de amonio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (p. ej. Ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenceno, e hidruros, tales como borohidruro de sodio), detergente iónicos y no iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (p. ej. Fosfolípidos) y moléculas desnaturalizantes (Jain RK y Hamilton AD, Angew. Chem.
114(4), 2002). La cuantificación del extremo de desnaturalización puede depender de la perdida de propiedades funcionales como la habilidad de aglutinar una molécula objetivo, o de las propiedades fisicoquímicas como la tendencia a la agregación, exposición a residuos de solventes inaccesibles formados, o interrupción o formación de pliegues disúlfidos.
En términos de perdida de estabilidad, p. ej. Se conoce como “desnaturalización” de proteínas el proceso donde algunas o todas formaciones tridimensionales que imparten las propiedades funcionales de la proteína se han perdido con la consiguiente pérdida de actividad y/o solubilidad. Las fuerzas interrumpidas durante la desnaturalización incluyen pliegues intramoleculares, que incluyen, pero no se limitan a fuerzas electroestáticas, hidrofóbicas, Van der Waals, pliegues de hidrogeno, y disulfuro. La desnaturalización de la proteína puede ser causada por fuerzas aplicadas a la proteína o a una solución que comprenda la proteína como por ejemplo una fuerza mecánica (por ejemplo, compresión o cizallamiento), térmica, estrés osmótico, cambios de PH, campos eléctricos o magnéticos, radiación iónica, radiación ultravioleta y deshidratación, y por desnaturalizantes químicos.
Un tratamiento o una cantidad de tratamientos “terapéuticamente efectivo” como aquí se emplean, se refiere a una cantidad suficiente para causar una disminución o mejora detectable de la causa del desorden o sus síntomas. La “mejora” se refiere a la disminución del efecto de detrimento del desorden en el paciente que recibe la terapia. El sujeto de la invención, preferiblemente ha de ser humano, e cualquier caso, puede preverse que cualquier animal con necesidad de tratamiento para unas condiciones perjudiciales, desorden o enfermedad puede ser tratado con proteínas de base de armazón diseñadas con tal fin.
Descripción general
En la presente se describe, un recombinante aislado y/o un armazón de proteína sintético basado en la secuencia consensuada de fibronectina tipo III (FN3), proteína repetida, que incluye, sin limitaciones, un armazón derivado de mamífero, así como composiciones y moléculas de ácido nucleico codificado que comprende al menos, un armazón de proteína de un poli-nucleótido codificado basado en la secuencia consensuada FN3. También se describen en la presente, métodos de fabricación y uso, tales como ácidos nucleicos y armazones de proteína, incluyendo como tal una plataforma de descubrimiento, y para el diagnóstico y composición terapéutica, métodos y artilugios.
Los armazones de proteína de la presente invención ofrecen ventajas sobre las bioterapias basadas en largas inmunoglobulinas, debido a su pequeño, compacto tamaño. En particular, el tamaño y forma de una molécula biológica puede impactar en su habilidad para ser localmente administrada, oralmente, o cruzar la barrera de sangre-cerebro; habilidad para ser expresado en sistemas de bajo coste tales como el E. coli; habilidad para ser diseñado en moléculas bi- o multi-específicas que se aglutinan con objetivos múltiples o múltiples epitopos del mismo objetivo, adecuación para la conjugación p. ej. Con activos, polímeros, y probetas; habilidad para ser formulados en altas concentraciones; y la habilidad de dichas moléculas para penetrar de manera efectiva en tejidos enfermos y tumores.
Además, los armazones de proteína poseen muchas de las propiedades de los anticuerpos en relación con sus pliegues que imitan la región variable de un anticuerpo. Esta orientación permite que los giros FN3 sean expuestos a similares regiones determinadas de anticuerpos complementarios (CDRs). Estos deberían ser capaces de aglutinarse con objetivos celulares y los giros pueden ser alterados, p. ej. Afinidad madurada, para mejorar ciertas uniones o propiedades relacionadas.
Tres de los seis giros del armazón de proteína de la invención se corresponden topológicamente a los dominios de unión de un anticuerpo posicionado en los giros del dominio variable conocido por ser hiper-variable en origen (giros de dominio hiper-variable (HVL)), en posiciones como las definidas por Kabat como los residuos de las regiones complementariamente determinantes (CDRs), p. ej. Regiones de unión a antigenos, de un anticuerpo, mientras que los tres giros remanentes son expuestos superficialmente de un modo similar al anticuerpo CDRs. Estos giros abarcan o están posicionados en o alrededor de los residuos 13-16, 22-28, 51-54, 60-64, y 75-81 de
SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 3 más abajo y en la Figura 6. Preferiblemente, las regiones en giro en o alrededor de los residuos 22-28, 51-54 y 75-81 son alteradas para especificidad de aglutinamiento y afinidad. Uno o más de estas regiones en giro están aleatorizadas con otras regiones en giro y/o otras cadenas que mantienen su secuencia como porciones de la columna vertebral para tener lugar en la biblioteca y uniones potentes pueden ser seleccionados de la biblioteca teniendo gran afinidad con una proteína objetivo particular. Una o más de las regiones en giro pueden interactuar con la proteína objeto similar a la interacción de un anticuerpo CDR con la proteína.
Los armazones de la presente invención deben incorporar otras subunidades, p. ej. Vía interacciones covalentes. Todos o una porción de una región constante de anticuerpos puede ser agregada al armazón para impartir propiedades de anticuerpo, especialmente aquellas propiedades asociadas con la región Fc, p. ej. Actividad complementaria (ADCC), vida media, etc. Por ejemplo, la función de efector puede proporcionarse y/o controlada, p. ej. Mediante modificación de la unión a C1q y/o unión a FcyR y de este modo cambiando la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Las “funciones de efector” son responsables por activación o disminución de la actividad biológica (p. ej. En un sujeto). Los ejemplos de funciones de efector incluyen, pero no están limitados a: unión C1q: complemento dependiente de citotoxicidad (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediante células dependientes de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; bajo regulación de los receptores de superficie de célula (p. ej. Receptores de células B; BCR), etc. Tales efectos de efector pueden requerir que la región Fc se combine con un dominio de unión (p. ej. Giros de armazón de proteína) y pueden ser alcanzados empleando varios ensayos (p. ej. Ensayos de unión a Fc, ensayos ADCC, ensayos CDC, etc.).
Porciones adicionales pueden deben ser añadidos o asociados con los polipéptidos basados en armazón o variantes como el conjugado de toxina, albumina o conectores de albúmina, moléculas de glicol polietileno (PEG) deben ser añadidos a la molécula de armazón para alcanzar las propiedades deseadas. Estas porciones deben ser fusiones alineadas con la secuencia codificada de armazón y deben ser generadas por técnicas estándar, por ejemplo, mediante la expresión de la proteína de fusión desde un vector codificado de fusión recombinante construido utilizando secuencias de codificación nucleótido públicamente asequible. Alternativamente, deben emplearse métodos químicos para añadir las porciones a una proteína de base de armazón producida recombinadamente.
Los armazones de la presente invención pueden ser utilizados como mono específico de forma monomérica o como bi- o multi- específico (para diferentes proteínas objetivo o epítopos en la misma proteína objetivo) de forma multimérica. Los adjuntos entre cada unidad de armazón deben ser covalentes o no-covalentes. Por ejemplo, un armazón de biespecificidad dimérica tiene una subunidad con especificación para una primera proteína objetivo o epítopo y una segunda subunidad con especificidad para una segunda proteína objetivo o epítopo. Las subunidades de armazón pueden unirse en una gran variedad de formaciones que pueden aumentar la valencia y así la avidad de las uniones a antígenos.
Generación y Producción de la Proteína de Armazón
Al menos una proteína de armazón de la siguiente invención puede ser producida opcionalmente por una línea de células, una línea de células mixta, una célula inmortalizada o una población clonada de células inmortalizadas, como se conoce en la materia. Ver, p. ej. Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, nY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons, NY, NY, (1997-2001).
Los amino ácidos de una proteína de armazón pueden ser alterados, añadidos y/o eliminados para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, vida media, estabilidad, solubilidad o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la materia.
Las proteínas bioactivas basadas en armazón pueden ser diseñadas con retención de alta afinidad para los antígenos, así como otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, las proteínas de armazón pueden ser opcionalmente preparadas mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptualmente diseñados utilizando modelos en tres dimensiones de las secuencias parentales y diseñadas. Los modelos en tres dimensiones son asequibles y familiares para los expertos en la materia. Hay disponibles programas de ordenador que representan y expresan probables estructuras tridimensionales conformacionales de secuencias candidatas seleccionadas y pueden medir la posible inmunogenicidad (p. ej. Programa Immunofilter de Xencor, Inc., de Monrovia, CA). La inspección de estas representaciones permite el análisis del papel más adecuado para los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, p. ej. El análisis de los residuos que influyen en la habilidad de la proteína de armazón candidata para unirse con su antígeno. De este modo, los residuos pueden ser seleccionados y combinados desde las secuencias de origen y referencia de manera que las características deseadas, como la afinidad para los antígenos objetivos, es alcanzada. Alternativamente, o en adición a esto, pueden utilizarse los procedimientos anteriormente mencionados, o cualquier
otro método de diseño adecuado.
Representación
La representación de proteínas de base de armazón diseñadas o bibliotecas que comprenden proteínas de base de armazón con residuos variados o dominios como unión específica para proteínas similares o fragmentos puede ser convenientemente lograda utilizando nucleótidos (representa ionización de ARN o ADN) o bibliotecas de péptidos representados, por ejemplo, representación in vitro. Este método incluye la representación de grandes bibliotecas de péptidos para que miembros individuales tengan las estructuras o funciones deseadas. El péptido representado con o sin secuencias nucleótidos puede ser de entre 3 y 5000 nucleótidos, o más, o amino ácidos en longitud, frecuentemente desde la longitud de 5-100 amino ácidos, y muy a menudo desde la longitud de 8 a 25 amino ácidos. Además de los métodos directos químicos sintéticos para generar bibliotecas de peptidos, muchos métodos de recombinación de ADN han sido descritos. Uno de los tipos incluye la representación de la secuencia de péptidos en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia péptida particularmente representada.
Los armazones de proteína de la invención pueden aglutinar proteínas humanas o de cualquier otro mamífero con un amplio rango de afinidades (KD). en una realización preferente, al menos un armazón de proteína de la presente invención puede opcionalmente unirse con una proteína objetivo de gran afinidad, por ejemplo, con un Kd igual o inferior a 10-7M, como por ejemplo pero no limitado a, 0.1-9.9 (o cualquier otro rango de valor en el mismo) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 o cualquier rango o valor dentro de los mismos, como se determina mediante resonancia de plasmones superficiales o método Kinexa, practicado por expertos en la materia.
La afinidad o avidez de un armazón de proteína para un antígeno puede determinarse de manera experimental utilizando cualquier método apropiado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions”, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); y los metodos descritos en los mismos). La afinidad medida de una interacción particular de armazón de proteína-antígeno puede variar si se toman las medidas bajo diferentes condiciones (p. ej. Osmolaridad, pH), Así, las medidas de afinidad y otros parámetros de aglutinamiento con antígenos (p. ej. Kd , Kon, Koff) deben ser, preferentemente, realizadas con soluciones estandarizadas de armazones de proteína y antígenos, y una solución amortiguadora estándar, tal como la que e se describe aquí.
Se pueden llevar a cabo ensayos competitivos con el armazón de proteína de la presente invención para determinar proteínas, anticuerpos, y otros antagonistas capaces de unirse a una proteína objetivo con el armazón de proteína de la presente invención y/o compartir la región epitopa. Estos ensayos tal y como se conocía hasta ahora por los expertos en la materia evalúan la competición entre antagonistas o ligantes para un número limitado de puntos de unión en una proteína. La proteína y/o anticuerpo es inmovilizado, aislado, o capturado antes o después de la complexión y la muestra unida a la proteína objetivo es separado de la muestra no-enlazada, por ejemplo, mediante decantación (donde la proteína/anticuerpo ha sido pre-solubilizada) o mediante centrifugado (donde la proteína/anticuerpo ha sido precipitada tras la reacción competitiva). También, la unión competitiva debe ser determinado por si la funciones alterada por la unión o la falta de unión del armazón de proteína a la proteína objetivo, p. ej. Si la molécula de armazón de la proteína inhibe o potencia la actividad enzimática de, por ejemplo, un marcador. ELISA y otros ensayos funcionales deben ser empleados, tal y como se conoce en la materia.
Moléculas de Ácido Nucleico
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican armazones de proteína pueden presentarse en forma de ARN, tales como mARN, hnARN, tARN o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluyendo, pero limitado a, cADN y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido sintéticamente, o por combinaciones de la misma. El ADN puede ser de cadena triple, cadena doble o simple, o cualquier combinación de la misma. Cualquier porción de al menos una cadena del ADN o ARN puede ser la cadena codificadora, también conocida como cadena con sentido, o puede ser la cadena no-codificadora, también conocida como cadena sin sentido.
Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico comprendiendo un marco de lectura abierta (ORF), opcionalmente, con uno o más intrones, p. ej. Pero no limitado a, al menos una porción especifica de al menos un armazón de proteína; las moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificadora para un armazón de proteína o región en giro que aglutinan la proteína objetivo; y moléculas de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótido sustancialmente diferente de las anteriormente descritas pero las cuales, debido a la degeneración del código genético, aun codifican el armazón de proteína como se describe en la presente y/o como se conoce en la materia. Por supuesto, el código genético es conocido en la materia. De este modo, consiste en algo rutinario par aun experto en la materia generar, dichas variantes de ácido nucleico degenerado que codifica armazones de proteína específicos para la presente invención. Ver, p. ej. Ausubel et al., supra, y las variantes de ácido nucleico que se incluyen en la presente invención.
Tal y como se indica en la presente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención las cuales comprenden ácido nucleico que codifica un armazón de proteína pueden incluir, pero no están limitadas a, aquellos que codifican la secuencia de ácido nucleico de un fragmento de armazón de proteína, por si mismos; la secuencia codificadora para el armazón de proteína completo o una porción de la misma; la secuencia codificadora para un armazón de proteína, fragmento o porción, así como las secuencias adicionales, tales como la secuencia codificadora de al menos un señal líder o péptido de fusión, con o sin las citadas secuencias codificadoras adicionales, tales como al menos un intron, junto con secuencias no-codificadoras adicionales, incluyendo pero no limitadas a, secuencias no-codificadoras 3’ y 5’, tales como las transcritas, secuencias no-traducidas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento de mARn, incluyendo empalmes y señales de polianelidacion (por ejemplo, unión a ribosomas y estabilizadores de mARN); una secuencia codificadora adicional que codifica para adicionales amino ácidos, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. De este modo, la secuencia que codifica un armazón de proteína puede estar fusionada en una secuencia marcadora, como la secuencia codificadora de un péptido que facilita la purificación de los armazones de proteína fusionados que comprende un fragmento o porción del armazón de proteína.
Moléculas de Ácido Nucleico
La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican las composiciones de la invención como polinucleótido aislados o como porciones de vectores de expresión que incluyen vectores compatibles con procarioticos, eucarióticos o expresiones de fago filamentosos, secreciones y/o representación de la composición o mutaciones dirigidas de la misma.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden ser realizados empleando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación, y/o combinaciones de las mismas, como es bien sabido en la materia.
Los polinucleótidos útiles en la práctica de la presente invención codificaran a porción funcional del armazón de proteína descrito en la presente. Los polinucleótidos de la invención aceptan secuencias de ácido nucleico que pueden ser empleadas para hibridación selectiva de un polinucleótido que codifique un armazón de proteína de la presente invención. Se describen en la presente ácidos nucleicos aislados que se hibridizan bajo unas condiciones de hibridación selectivas en los polinucleótidos descritos en la misma. Así, los polinucleótidos de esta realización pueden ser utilizados para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden dichos polinucleótidos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para identificar, aislar, o ampliar clones parciales o de longitud completa de la biblioteca. En algunas realizaciones, los polinucleótido son genomas o secuencias aisladas de cADN, o complementarias de otro modo que, un cADN de un humano o ácido nucleico de mamífero de la biblioteca.
Los ácidos nucleótidos pueden comprender según conveniencia secuencias en adición al polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, una zona de multi-clonacion que comprenda una o más restricciones de endonucleasa puede ser insertada en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, secuencias traducibles pueden ser insertadas para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio adecuado para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, excluyendo la secuencia codificadora, es opcionalmente un vector, adaptador, o enlazador para la clonación y/o expresión del polinucleótido de la presente invención.
Secuencias adicionales pueden ser añadidas a tales clonaciones y/o secuencias de expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido dentro de la célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y enlazadores es bien conocido en el arte.
Tal y como se indica en la presente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden ácido nucleico que codifica un armazón de proteína incluyen, pero no están limitadas a, aquellos que codifican secuencias de amino ácidos de un fragmento de armazón de proteína, por si mismos; la secuencia codificadora para el armazón de proteína completo o una porción del mismo; la secuencia codificadora para un armazón de proteína, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, como la secuencia codificadora de al menos un líder de señal o péptido de fusión, con o sin las citadas secuencias codificadoras adicionales, tales como al menos un intron, junto con adicionales, secuencias no-codificadoras, incluyendo pero no limitadas a, secuencias no-codificadoras 3’ y 5’, tales como las transcritas, no-traducidas secuencias que juegan un papel en la transcripción, procesamiento del mARN, incluyendo empalmes y señales de poliadenilacion (por ejemplo, unión a ribosomas y estabilizadores de mARN); una secuencia codificadora adicional que codifica amino ácidos adicionales, tales como los que le proporcionan funcionalidades adicionales. De este modo, la secuencia que codifica un armazón de proteína puede estar fusionada en una secuencia marcadora, como la secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del armazón de proteína fusionado que comprende un fragmento o porción de armazón de proteína.
Para la expresión bacteriana que incluye un fago de bacteria infectada, la señal de secreción preferida es la señal de secreción pelB o ompA, pero otros dominios poli péptidos de señal de secreción pueden ser empleados tal y como se describe en U.S. Pat. No. 5.658.727. En la representación de fagos, una secuencia de ADN traducible más abajo codifica una proteína recubierta de fago filamentoso, por ejemplo, proteína pIII o pIX. Las fago-proteínas preferentes se obtienen de fago filamentos M13, fl, fd y fago filamentos equivalentes. Así, la secuencia de ADN traducible más abajo codifica una secuencia de residuos de amino ácidos que se corresponde y es preferentemente idéntica, al gen fago filamentoso II o al gen IX de recubrimiento polipéptido. Las secuencias de tales recubrimientos de proteína son conocidas y accesibles en bases de datos públicas como la NCBI.
Una biblioteca de cADN o genómica puede ser explorada utilizando una sonda basad en la secuencia de polinucleótido de la presente invención, tal como se describe aquí. Las sondas pueden ser utilizadas para hibridarse con secuencias de ADN o cADN genómico para aislar genes homólogos en los mismos o diferentes organismos. Aquellos expertos en la materia apreciaran que se pueden usar varios grados de rigurosidad de hibridación en el ensayo; y también puede ser rigurosa la hibridación o el medio de lavado. Según las condiciones de hibridación se vuelven las rigurosas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y el objetivo para que se dé la doble formación. El grado de rigurosidad puede ser controlado por uno o más entre la temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un solvente desnaturalizante, como la formamida. Por ejemplo, la rigurosidad de hibridación varía a conveniencia cambiando la polaridad de la solución reactora a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida dentro de un rango de 0% a 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) requerido para detectar la unión variara en función de la rigurosidad de la hibridación media y/o el lavado medio. El grado de complementariedad será de manera óptima del 100%, o 70-100%, o cualquier rango o valor entre los mismos. De cualquier modo, debe comprenderse que las pequeñas variaciones en las secuencias de sondas y cebadores pueden ser compensadas reduciendo la rigurosidad de la hibridación y/o el lavado medio.
En uno de los aspectos de la invención, los polinucleótidos son construidos utilizando técnicas para la incorporación de codones aleatorizados con objeto de dar color al polipéptido resultante en uno o más de los residuos específicos o para añadir residuos en posiciones específicas dentro de la secuencia. Pueden emplearse varias estrategias para crear bibliotecas de secuencias de poli péptidos alterados incluyendo métodos aleatorios, semi-racionales y racionales. Los métodos racionales y semi-racionales tienen la ventaja sobre las estrategias aleatorias, de que se posee más control sobre las consecuencias de los cambios introducidos en la secuencia codificadora. Además, si nos fijamos en las variaciones en ciertas regiones del gen, puede explorarse un universo de variantes de posibles aminos ácidos en las posiciones elegidas.
Una construcción construida sobre el común NNK o el esquema diversificado NNS introduce la posibilidad de 32 diferentes codones en cada posición de los 20 amino ácidos. Esta biblioteca teóricamente recoge 32n para cada número n de residuos. En términos prácticos, siendo así, la representación de fagones está limitada a bibliotecas de muestras de 109 a 1010 variantes lo que implica que solo 6-7 residuos pueden ser alcanzados para el abigarramiento si ha de lograrse por la biblioteca la cobertura de la secuencia completa. Así, los métodos semiracionales o “enfocados” para generar bibliotecas de variantes de armazones mediante identificación de las posiciones clave para ser abigarrados y poder elegir el régimen de diversificación adecuado puede ser aplicado. Un “juego de codones” se refiere al juego de diferentes secuencias de nucleótidos triples empleados para codificar las variaciones de amino ácidos deseadas. La forma estándar de designación de codones es la del código IUB, el cual es conocido en la materia y se describe en la presente. Un “juego de codones no-aleatorio” se refiere a un juego de codones que codifica los amino ácidos seleccionados. La síntesis de oligonucleótidos con “degeneración” de nucleótidos seleccionados en ciertas posiciones es bien conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, la aproximación TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. (1999), 296: 57-86); Garrard&Henner, Gene (1993), 128:103). Dichos juegos de nucleótidos que poseen ciertos juegos de codones pueden ser sintetizados utilizando nucleótidos comercialmente asequibles o reactivos de nucleosidos y aparatos.
Un juego de codones es un juego de diferentes secuencias de nucleótidos triples utilizados para codificar las variaciones de amino ácidos deseados. Los juegos e codones pueden ser representados empleando símbolos para designar nucleótidos particulares o mezclas equimolares de nucleótidos como se muestra más abajo de acuerdo con el código IUB.
Códigos IUB
G Guanine
A Adenine
T Thymine
C Cytosine
R (A or G)
Y (C or T)
M (A or C)
K (G or T)
S (C or G)
W (A or T)
H (A or C or T)
B (C or G or T)
V (A or C or G)
D (A or G or T)
N (A or C or G or T)
Por ejemplo, en el juego de codones DVK, D puede ser nucleótidos A o G o T; V puede ser A o G o C; y K puede ser G o T. este juego de codones puede presentar 18 codones diferentes y puede codificar amino ácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys.
Pueden crearse bibliotecas especializadas (p. ej. No-aleatorizadas) empleando codones NNK y centrándose en el abigarramiento de residuos seleccionados o, alternativamente, variantes con sustituciones noaleatorizadas pueden ser creadas utilizando, por ejemplo, codones DVK, los cuales codifican 11 amino ácidos (ACDEGKNRSYW) y un codón de parada. Alternativamente, se puede emplear la muta génesis de Kunkel para abigarrar los deseados residuos o regiones del polipéptido (Kunkel et al. Methods Enzymol. 154:367-382, 1987).
Técnicas de clonado estándar son empleadas para clonar las bibliotecas en un vector para su expresión. La biblioteca debe ser expresada utilizando un sistema conocido, por ejemplo, expresando la biblioteca como una fusión de proteínas. Las proteínas fusionadas pueden ser representadas en la superficie de cualquier fago adecuado. Son bien conocidos los métodos para representar polipéptido fusionados que comprenden fragmentos de anticuerpos en la superficie de un bacteriófago (Us 6.969.108 para Griffith; US.6.172.197 para McCAfferty; US 5.223.409 para Ladner; US 6.582.915 para Griffiths; US6472147 para Janda). Las bibliotecas para el nuevo aislante polipéptido pueden ser representadas en pIX (WO2009085462A1). Las bibliotecas también pueden ser traducidas in vitro, por ejemplo, utilizando una representación de ribosomas (Hanes y Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 94:4937, 1997), representación mARN (Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 94:12297, 1997), representación-CIS (Odegrip et al., Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 101:2806, 2004) u otros sistemas libres de células (US 5.643.768 para Kawasaki).
Bibliotecas con regiones diversificadas pueden ser generadas utilizando vectores que comprenden polinucleótido que codifican la secuencia Tencon (SEQ ID NO: 16) o una mutación predeterminadas de la misma. El constructo modelo debe tener un promotor y unas secuencias de señal para la cadena de polipéptido. Para crear bibliotecas de armazones, se emplean reacciones de muta génesis que utilizan oligonucleótidos que codifican las regiones en giro (A:B, B:C, C:D, D:E, E:F, y F:G) del armazón. Para asegurar la incorporación de todas las posiciones elegidas del esquema aleatorizado, puede incorporarse un codón de parada (como el TAA) en cada región deseada para destinarlo a ser diversificado. Solo podrán darse clones donde los codones de parada hayan sido reemplazados.
Polipéptidos de Armazón Modificado
Los armazones y fragmentos de proteína modificada de la invención pueden comprender uno o más restos que son covalentemente enlazados, directa o indirectamente, a otra proteína.
En el caso de la adición de residuos péptidos, o la creación de una proteína de fusión en línea, la adición de tales residuos debe realizarse a través de técnicas recombinantes desde una secuencia de polinucleótido como se describe en la presente. En el caso de un péptido anexo, adjunto o conjugado, proteína, químico orgánico, químico inorgánico o átomo, o cualquier combinación de los mismos, los restos adicionales que son enlazados a la proteína de la invención es generalmente vía otro que no sea el enlace péptido. Los armazones de proteína modificados de la invención pueden ser producidos mediante la reacción de una armazón de proteína o fragmento con un agente modificador. Por ejemplo, los restos orgánicos pueden ser enlazados al armazón de proteína es un modo no especifico empleando un agente modificador de amino reactivos, por ejemplo, éster NHS de PEG. Los armazones de proteína modificados y fragmentos que comprenden el resto orgánico que es enlazado con partes especificas del
armazón de proteína de la presente invención pueden ser preparados utilizando métodos adecuados, como la proteólisis reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al, Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1197); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), y lo métodos descritos en Hermanson, G.T., Bioconjugate Technicques, Academic Press: San Diego, CA (1996).
Cuando un polímero o una cadena es enlazada a la proteína de armazón, el polímero o cadena puede ser independientemente un grupo de polímero hidrófilos, un grupo de ácidos grasos o un grupo de ácidos éster grasos. Como se emplea en la presente, el término “ácido graso” engloba ácidos mono-carboxílicos y ácidos di-carboxílicos. Un “grupo hidrófilo polimérico”, como se emplea el termino en la presente, se refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es más soluble en agua que en octano. Así un armazón de proteína modificado por el enlace covalente de la polilisina es recogido en la invención. Polímeros hidrófilos adecuados para modificar los armazones de proteína de la invención pueden ser lineales o ramificados e incluir, por ejemplo, glicoles polialquenos (p. ej. PEG, glicol monometoxi-polietileno (mPEG), PPG y similares), carbohidratos (p. ej. Dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de hidrófilo amino ácidos (p. ej. Polilisina, poliarguinina, poliaspartato y similares), óxidos poli alcanos (p. ej. Polietileno oxido, polipropileno oxido y similares) y polivinilo pirolidona. Preferentemente, el polímero hidrófilo que modifica el armazón de proteína de la invención tiene un peso molecular de entre 800 y 150.000 Dalton como una entidad molecular separada. Por ejemplo, pueden utilizarse PEG5000 y PEG20000, donde el subíndice es el peso medio molecular del polímero en Dalton. El grupo hidrófilo polimérico puede ser sustituido por grupos de ácidos grasos o ácidos éster graso, con entre uno y seis alquiles. Los polímeros hidrófilos que son sustituidos por ácidos grasos o grupos éster de ácidos grasos pueden ser preparados mediante el uso de métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende un grupo de aminos puede ser acoplado a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y un carboxilato activado (p. ej. Activado con N, N-carbonilo diimidazol) en un ácido graso o éster de ácido graso puede set acoplado a un grupo hidroxilo en un polímero.
Los ácidos grasos y esteres de ácidos grasos adecuados para modificar armazones de proteína de la invención pueden ser saturados o pueden contener una o más unidades de saturación. Los ácidos grasos adecuados adecuados para modificar armazones de proteína de la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20,araquinato), ndocosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todos los cis-A5, 8, 11, 14-eicosatetraenoato (C20 , arachidonato) ácido octanedioico, ácido tetradecanedolico, ácido docosanedioico y similares. Los esteres de ácidos grasos adecuados incluyen mono ésteres de ácidos di carboxílicos que comprenden un grupo de bajos alquiles lineares o ramificados. El grupo de alquiles más bajo puede comprender desde uno hasta doce, preferiblemente, de uno a seis, átomos de carbono.
Las proteínas que contienen Fc pueden ser comparadas por funcionalidad con muchos ensayos in vitro conocidos. En particular, por afinidad con miembros de la familia FcyRI, FcyRII y FcyRIII del FcyR de interés. Estas medidas pueden llevarse a cabo utilizando formas de recombinante soluble de los receptores o formas asociadas a células de los receptores. Además, afinidad al FcRn, el receptor responsable para la circulación prolongada de vida media del IgGs, puede ser medida, por ejemplo, mediante BIAcore utilizando recombinante soluble FcRn. Ensayos funcionales basados es células, tales como el ensayo ADCC y los ensayos CDC, revelan las consecuencias funcionales de una variante particular de las estructuras. En una realización, el ensayo ADCC es configurado para tener células NK como células efectoras primarias, de este modo reflectando los efectos funcionales del receptor FcyRIIIA. Ensayos de fagocitosis deben ser utilizados para comparar las funciones de inmune efectores de diferentes variantes, como ensayos que miden la respuesta celular, tales como el su peróxido o la liberación de mediadores inflamatorios. Modelos en vivo también pueden emplearse, como, por ejemplo, en el caso de utilizar variantes de anticuerpos anti-CD3 para medir la activación de células T en ratones, una actividad dependiente de dominios Fc atrayendo ligantes específicos, como los receptores Fcy.
Selección de Células Huésped o Diseño de Células Huésped
Tal y como se describe en la presente, la célula huésped elegida para la expresión de la proteína de base de armazón es una gran contribuyente en la composición final, incluyendo, sin limitación, la variación en la composición de los restos oligosacáridos que decoran la proteína, si se desea, por ejemplo, en el dominio de inmunoglobulina CH2 cuando se presenta. Así, un aspecto de la descripción abarca la selección de la célula huésped adecuada para el uso y/o mejora de la célula producida expresando la deseada proteína terapéutica.
Además, la célula huésped debe ser de origen mamífero seleccionado o seleccionada entre COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, almidón, o células de insectos o plantas, o cualquier derivado, inmortalizado o célula transformada de las mismas.
Alternativamente, la célula huésped puede ser seleccionada de especies u organismos incapaces de polipéptidos glicosilados, p.ej. una célula u organismo procarioticos, como uno natural o diseñado: E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp.
Seleccionando Dominios de Unión
Los polipéptidos o proteínas de fusión o componentes o dominios de los mismos también se pueden obtener seleccionándolos de bibliotecas de dichos dominios o componentes, p. ej. Una biblioteca de fagos. Una biblioteca de fagos puede crearse insertando una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios o una biblioteca de polinucleótidos que contengan secuencias de interés, tales como dominios de anticuerpos de células-B de un animal o humano inmunizado (Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317). Las bibliotecas de fago anticuerpos contienen pares de regiones de cadenas variables pesadas (H) y ligeras (L) en un fago permitiendo la expresión de fragmentos de cadena simple Fv o fragmentos Fab (Hoogenboom et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8). La diversidad de unas bibliotecas fagémidas puede ser manipulada para incrementar y/o alterar las especificaciones de los polipéptidos de la biblioteca para producir y subsecuentemente identificar propiedades moleculares adicionales, deseadas, y los polinucleótidos que las codifican.
Otras bibliotecas de componentes de unión a objetivos que deben incluir además de regiones variables de anticuerpos son las representaciones de ribosomas, representación CIS, representación de almidón, representaciones bacterianas y representaciones en células mamíferas. La representación de ribosomas es un método de traducción el mARN en proteínas afines a la misma mientras mantiene la proteína adosada al ARN. El ácido nucleico que codifica la secuencia es recuperado por RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,9022). La representación CIS es una alternativa del método in vitro en el cual la biblioteca se construye como una fusión de proteínas con RepA. Durante la traducción in vitro, las uniones RepA in cis al ADN del que fue creado, proporcionando un enlace directo entre el genotipo y el fenotipo (Odegrip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:2806, 2004). La representación de almidón se basa en la construcción del receptor de adhesión de proteínas fusionadas de almidón alfa-aglutinina de membrana asociada, aga1 y aga2, una parte del tipo de sistema de apareamiento (Broder et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). La representación bacteriana se basa en la fusión del objetivo con proteínas bacterianas exportadas que asocian la membrana de la célula o pared de la célula (Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503). Similarmente, los sistemas de representación de mamíferos están basados en la creación de una proteína de fusión entre los polipéptidos que contiene secuencias aleatorizadas y una membrana de anclaje a la proteína oculta.
Usos de las Moléculas de Base de Armazón
La composición de las moléculas de base de armazón descritas en la presente y generadas mediante cualquiera de los métodos anteriormente descritos debe ser empleada para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de la enfermedad humana o patologías específicas de las células, tejidos, órganos, fluidos, o generalmente, un huésped. Una molécula de base de armazón diseñada para un propósito específico puede ser utilizada para tratar una inmune-deficiencia, una enfermedad metabólica, un desorden cardiovascular; una enfermedad maligna; un desorden o enfermedad neurológico; una infección, como la bacteriana, infección viral o parasitaria; o cualquier otra relacionada con las condiciones especificadas, incluyendo la inflamación, el dolor, la necrosis de tejidos o la fibrosis.
Tal método puede comprender la administración de una cantidad efectiva de la composición o composición farmacéutica que comprenda al menos una proteína de armazón para una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción de los síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad efectiva puede comprender una cantidad de entre 0.001 a 500 mg/hg para sencillas (p. ej. Bolos), administración múltiple o continua, o para lograr una concentración de suero 0.01-500 ug/ml de concentración de suero para sencillas, múltiples o continuas administraciones, o cualquier rango efectivo o valor de los mismos, como se ha realizado y determinado utilizando métodos conocidos, como se describe en la presente o en artes relevantes.
Composiciones que Comprenden Proteínas de base de Armazón
El proteínas de armazón de unión objetivo que son modificadas o no-modificadas, monovalentes, bi- o multivalentes, y mono-, bi- o multi-objetivos, pueden ser aisladas utilizando procesos de separación conocidos en la materia para la captura, inmovilización, partición, o sedimentación y purificado hasta el punto necesario para su aplicación comercial.
Para el uso terapéutico, las proteínas de base de armazón deben ser formuladas de un modo adecuado de administración incluyendo pero no limitándose a parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intra-bronquial, intra-abdominal, intra-capsular, intra-cartilaginosa, intra-cavitaria, intracelial, intra-cerebral, intracerebroventricular, intra-cólica, intra-cervical, intra-gástrica, intra-hepática, intra-miocárdico, intr.-ósea, intra-pélvica, intra-pericárdica, intra-peritoneal, intra-pleural, intra-prostática, intra-pulmonar, intra-rectal- intra-renal, intra-retiniana, intra-espinal, intra-sinovial, intra-torácica, intra-uterina, medios intra-vesicales, intra-lesionales, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intra-nasal o transdérmica. Al menos un armazón de proteína de la composición puede ser preparado para el uso den forma de pastillas o capsulas; polvos, gotas nasales o aerosoles; gel, ungüento, loción, suspensión o incorporado en un vendaje o “parche” terapéutico como se conoce en el arte. La invención proporciona para formulaciones estables de proteínas de base de armazón, lo que preferentemente es una solución salina
tamponada con fosfato o una solución acuosa de sal mixta, así como soluciones y formulaciones conservadas, así como formulaciones en conserva multi-uso adecuadas para el uso farmacéutico o veterinario, comprendiendo al menos una proteína de base de armazón en una formulación farmacológicamente aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación, inclusiva de otras proteínas humanas, p. ej. Albumina de suero humano, se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, Troy, D. B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, ver especialmente pp. 958 989.
La composición debe utilizarse con, o incorporar una formulación simple en la misma, otros activos conocidos beneficiosos para el tratamiento del desorden, condición, o enfermedad indicada o puede ser testado preparando combinaciones de proteínas de base de armazón con nuevas composiciones y activos.
Mientras la invención ha sido descrita en términos generales, las realizaciones de la invención serán descritas más a fondo en los siguientes ejemplos que no deben ser interpretadas como limitaciones a las reivindicaciones.
EJEMPLO 1. CONSTRUCCIÓN DE VARIANTES DE LA GLICOSALICIÓN Fc
Diseño Tencon
El tercer dominio FN3 para la Tenascina humana (SEQ ID NO: 3) puede ser utilizada como armazón alternativo capaz de ser diseñada para aglutinarse a moléculas objetivo específicas vía giros de superficie expuesta estructuralmente análogas a regiones determinantes de la complementariedad de anticuerpos (CDR). La temperatura de fusión de este dominio es de 54°C en PBS en su forma natural. Con objeto de producir una molécula de armazón con una estructura similar y mejorar las propiedades físicas, tal como la estabilidad térmica mejorada, se diseñó una secuencia consensuada basándose en el alineamiento de los dominios 15 FN3 de Tenascina humana (SEQ ID NO: 1-15).
El análisis del alineamiento de la secuencia múltiple en la Tabla 1 muestra que estos 15 dominios tienen identidades de secuencia respectivas que van del 13 al 80%, con una identidad de secuencia media entre pares del 29%. Una secuencia consensuada (SEq ID NO: 16) fue diseñada mediante la incorporación el amino ácido más conservada (frecuente) en cada posición desde la alineación mostrada en la Tabla 1. En los alineamientos de pares, la secuencia consensuada de la presente invención (SEQ ID NO: 16), denominada Tencon, es idéntica a los dominios FN3 de Tenascina al 34-59% de las posiciones con una secuencia media de identidad del 43%.
Expresión y purificación de la proteína
La secuencia de amino ácidos de Tencon (SEQ ID NO: 16) fue traducida otra vez, resultando en la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO: 17. Esta secuencia fue ensamblada por solapamiento del PCR, subclonados subclonado en un vector pET15 modificado, transformado en BL21Star(DE3) E. coli(Invitrogen) y cultivadas en placas de agar LB que contienen 75 pg/ml de carbenicilina. Se seleccionó una colonia simple y se cultivó durante la noche a 37°C en 50 ml de TB con un 2% de glucosa y 100 pg/ml de carbenicilina. Este cultivó se empleó para sembrar 500 ml de media auto inducida (Overnight Express Instant TB media, Novagen) en un matraz de 2.5 L Ulta Yield. El cultivo y la expresión se realizó utilizando un programa dual (3 horas a 37°C, 300 rpm, seguido de 16 horas a 30°C, 250 rpm) en una incubadora vibratoria ATR Multitron.
El cultivo fue recolectado y centrifugado a 7000 rpm durante 15 minutos en un rotor JL8.1 para sedimentar las células. Las células fueron re suspendidas en 30 ml de disolución tampón que contiene 20mM de fosfato de sodio, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerol, 20 mM imidazol, 0.37 mg/ml lisocima, inhibidor IX Complete Protease (EDTA-libre; Roche) y Benzonasa (Sigma-Aldrich, 0.25 pl/ml final) y lisada con Misonix XL2020 sonicator por 5 minutos en hielo en modo pulso (5 minutos encendido, 30 segundos apagado). El material insoluble fue retirado mediante centrifugado a 17.000 rpm durante 30 minutos en un rotor JA-17.
La proteína Tencon fue purificada del lisado soluble por proceso cromatográfico de dos etapas. Primero, la proteína fue capturada mediante cromatografía de inmovilización por afinidad metal, añadiendo perlas de 2 ml Ni-NTA agarosa (Qiangen) al lisado y colocándolo en una plataforma oscilante durante una hora a 4°C. Después la, resina se empaqueto en una columna Poly-Prep (bio-Rad) y se lavó con 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerol y 20 mM imidazol para retirar el material no ligado. Las proteínas se eluyeron de la resina con 20mM de fosfato de sodio, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerol y 500 mM imidazol. Las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE, ambos mediante tinte Coomassie y Western utilizando HRP-conjugado anti-His anticuerpos (Immunology Consultants Laboratory). Las fracciones deseadas fueron agrupadas y dializadas en PBS pH 7.4. como segundo paso del proceso de purificación la proteína se cargó en una columna de Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare) equilibrado en PBS. Las fracciones fueron analizadas mediante SDS-PAGE, y las fracciones contenedoras de Tencon fueron agrupadas y concentradas utilizando un concentrado Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).
La concentración de proteínas se determinó utilizando un plato lector BioTek para medir la absorbencia de la muestra a 280 nm. La preparación final se analizó por tinte Coomassie (Figura 1), tinte Western con anti-His anticuerpo, y mediante HPLC-SEC utilizando una columna G3000SW-XL (TOSOH Biosciencies) equilibrado en PBS. El análisis SDS-PAGE muestra que el Tencon migra entre 6 y 14 kDa, de acuerdo con la masa esperada de 10.7 kDa para la proteína monomérica. Se obtuvo un cultivo de almidón de >50 mg de proteína Tencon pura por litro.
Caracterización Biofísica
La estructura y estabilidad del Tencon fue caracterizada por espectroscopia de dicroísmo celular y colorimetría de escáner diferencial respectivamente. Las medidas de CD fueron realizadas en un espectrómetro AVIV a 20°C en PBS en una concentración de 0.2 mg/ml. El espectro de la Figura 8 muestra un mínimo de 218 nm, sugestivo de estructura de lámina beta para una proteína que pertenece a la familia del FN3. Los datos DSC se obtuvieron calentando soluciones de 0.5 mg/ml de la tercera del dominio FN3 de Tenascin o Tencon en PBS entre 35°C y 95°C a un ratio de 1°C/minuto en un calorímetro N-DSCII (Termodinámica Aplicada). Primero, la curva del tinte de tampón fue sustraído para producir los perfiles mostrados en la Figura 3. De estos datos, se calculó las temperaturas de fusión de 54°C y 78°C para la tercera del dominio FN3 y Tencon, respectivamente, utilizando el software CpCalc (Termodinámica Aplicada). El plegado y desplegado de ambos dominios es reversible a estas temperaturas.
Análisis de Inmunogenicidad
Un programa informático que modela las secuencias de amino ácidos para humanos fue empleado para comparar la inmunogenicidad prevista de secuencias de amino ácidos que representan el tercer dominio FN3 de Tenascin, Tencon, humano y diversos anticuerpos terapéuticos (mostrado en la Tabla 2). El Chrimetic mAbs y mAb humano (adalimumab) analizado con el programa fueron seguidos por aplicación del umbral de tolerancia (retira 9-mer péptidos con identidad 100% a una secuencia codificada gemline). El umbral de tolerancia no se aplicó al Tenascin o Tencon. El umbral de tolerancia asume amplia tolerancia de células T a las secuencias de gemline codificado mAb y se enfoca los análisis en nuevas secuencias primarias de CDRs y dominios flanqueados.
Estos análisis predicen un bajo riesgo inmunogénico para el Tenascin y Tencon y basados o similares a péptidos 9-mer, derivados de la secuencia analizada que aglutinará uno o más moléculas HLA. Las calificaciones son engordadas con respectos a la prevalencia de cada alelo HLA. Las calificaciones de los modelos para cada secuencia para proporcional un número sencillo que describe el PIR general de cada secuencia (suma de calificaciones). Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 2. El Tenascin tiene la puntuación más baja (11.9). Tencon, como Tenascin, puntuó uniones primarias y riesgo agrótopos inmunogénicos previstos bajos (puntuación=13.2). Las secuencias de Tenascin y Tencon puntuaron favorablemente comparado con anticuerpos terapéuticos.
Representación de Tencon en fago M 13 por fusión pIX
El gen codificador de la secuencia de amino ácidos de Tencon fue sub-clonada en el vector pPep9 de la expresión fagémida por PCD y restricción de la clonación de digestión, resultando el vector pTencon-pIX. Este sistema expresa en términos N el Myc-tagged Tencon como la fusión del término C en el término N de la proteína M13 (Figura 4). El promotor Lac permite para niveles más bajos de expresión sin IPTG y expresión aumentada tras la adición de IPTG. La señal de secuencia OmpA se anexó al término N del Tencon para promover eficientemente la translocación al periplasma. Un enlace corto TSG-GGGS (SEQ ID NO: 141) fue construido entre Tencon y pIX para prevenir interacciones estéricas entre estas proteínas.
Para confirmación de la representación en la superficie de la partícula de fago M13, se transformó el pTencon-IX en XL1-Blue E. coli y se utilizó una colonia sencilla para inocularlo a 5 ml de cultivo LB suplementado con ampicilina. Este cultivo se hizo crecer a 37°C hasta alcanzar la fase mid-log en cuyo punto en que se añadió un fago ayudante 610pfu de VCSM 13 y el cultivo incubado a 37°C durante 10 minutos sin agitación seguido de 50 minutos con agitación. El cultivo de fago ayudante rescatado fue diluido en 50 ml de media 2YT suplementado con ampicilina y kanamicina y se hizo crecer a 37°C con agitación hasta que el O.D.600 alcanzó los 0.7 en cuyo momento se añadió el IOTG a la concentración final de 1 mM y la temperatura se redujo a 30°C. después de 16 horas, el cultivo fue centrifugado a 4000X g durante 20 minutos y el flotante recogido y almacenado a 4°C para su análisis.
El aglutinamiento de las partículas fago a un anticuerpo anti-Myc (Invitrogen) fue utilizado para confirmar la representación de la construcción Myc-Tencon en la superficie del fago M13. Se cubrió un plato Maxisorp durante la noche con una concentración de 2.5 ug/ml con anti-Myc o un anti-av anticuerpo (control negativo) y bloqueado con SuperBlock T20 (Pierce). La dilución en serie de doble pliegue del flotante del cultivo fagémido descrito anteriormente fue realzado en PBS y añadido a los huecos del plato cubierto. Tras una hora, se lavó el plato con TBST y se añadió un anticuerpo anti-M13 HRP a cada hueco y lavado con TBST seguido de una hora de incubadora. El sustrato Roche BD ELISA POD fue añadido y detectada la luminiscencia en un plato de lectura (Tecan). La Figura 5 muestra que las partículas de fago Myc-Tencon aglutina el anti-myc, pero no los huecos
cubiertos con el anticuerpo anti-av o los huecos de control no cubiertos del plato de un modo dependiente de la concentración, confirmando la representación específica del Myc-Tencon en la partícula fago M13.
Un vector fagémido adicional puede ser construido para representar el Tencon y los miembros de la biblioteca (ver ejemplo 2) en el fago M13 como fusión para cubrir la proteína pIII. Para este sistema, el gen para el pIX es reemplazado por el gen codificador una versión truncada de pIII (Bass et al. 1990). Cambios adicionales como se compara en el sistema mostrado en la Figura 4 incluyen el reemplazo de la secuencia de señal OmpA con la secuencia de señal DsbA, como secreción utilizando esta secuencia se ha mostrado ser beneficial para la representación alternativa estable de las moléculas de armazón (Steiner et al. 2006).
EJEMPLO 2: Generación de Bibliotecas Tencon
Pueden elaborarse bibliotecas de variantes Tencon por diferentes métodos, dependiendo de la complejidad deseada y la ubicación relativa de las mutaciones en la molécula. Los métodos de sintetización del ADN son preferibles para crear mutaciones esparcidas alrededor del gen Tencon. También se puede utilizar la restricción de la clonación de encimas para recombinar los fragmentos de ADN que contienen mutaciones en diferentes regiones del gen. Saturando la mutagénesis en una pequeña región definida, como un giro simple de Tencon, se puede introducir empleando un oligo-nucleótido degenerado y una mutagénesis dirigida de oligonucleótido (Kunkel et al.
1987).
Se construyó la biblioteca Tencon, biblioteca FG7, diseñada para reemplazar el giro FG con 7 amino ácidos aleatorios utilizando mutagénesis dirigida de oligonucleótidos. Se sintetizó un oligonucleótido (TconFG7-For-5'pho) para tener una secuencia degenerada de 21 pares base (bp) de NNS en las posiciones codificadoras el giro FG y dos secuencias de nucleótidos oscilantes 20-27 bp de complementariedad con la secuencia codificadora de Tencon. En este diseño, los veinte amino ácidos capaces de ser representadas en el giro FG. La diversidad de nivel nucleótido calculada es de 1.3x109.
TconFG7-For5'pho: (SEQ ID NO: 18)
G AATAC ACCGTTT CT AT CT ACGGT GTTNNSNN SNN SNN SNN SNN SNNSCCGCT
GTCTGCGGAATTCAC
El formato para la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos, pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-Piii, se construyó por reemplazo de la secuencia codificadora del giro Tencon F:G con una secuencia de tallo de giro que contiene un lado de restricción Ascl. Este sistema permite la eliminación del ADN modelo de fondo tras la mutagénesis mediante digestión del ADN resultante con Ascl antes de la transformación. Para purificar un formato de ADN de cadena simple para la mutagénesis, se cogió una colonia sencilla de E. coli CJ236 que hospeda pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-pIII, en 5 ml de 2YT medio cultivadas con carbenicilina (50 ug/ml de concentración final) y Chloramphenicol 10 ug/ml). Después de 6 horas, se añadió el fago ayudante VCSM13 a la concentración final de 1010 pfu/ml e incubado sin agitación durante 10 minutos antes de ser transferido a 150 ml de 2YT con carbenicilina (10 ug/ml) y uridina (0.25 ug/ml) e incubado a 37°C con agitación a 200 rpm durante la noche. Las células fueron sedimentadas mediante centrifugado y los flotantes recogidos y el fago sedimentado con PEG NaCl. La cadena simple de ADN fue purificada del sedimento utilizando el kit QlAprep Spin M13 (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
Para hibridar el oligonucleótido degenerado con el formato, se combinaron 5 ug de ADN tipo fueron combinados con coligo TconFG7-For-5-pho a una ratio molar de 10:1 en Tris-HCl (50 mM, PH 7.5) y MgCl12 (10 mM) e incubado a 90°C durante 2 minutos, 60°C tres minutos y 20°C durante 5 minutos. Tras la reacción de hibridación, se añadieron ATP (10 mM), dNTPs (25 mM cada), DTT (100 mM), gigante T4 (7 unidades) y T7 ADN polimerasa (10 unidades) a la mezcla reactiva e incubado a 14°C durante 6 horas seguido de 20°C durante 12 horas. Se purificó el ADN resultante utilizando el kit de purificación PCR (Qiagen) y recuperado en 100 uL de agua. Se digestionó la biblioteca de ADN con 10 unidades de Ascl durante 4 horas y después se purificó de nuevo con el kit de purificación Qiagen PCR. La biblioteca final de ADN fue recuperada en 50 uL de agua. El producto de ADN de doble cadena resultante fue después transformado en E. coli MC1061 F'mediante electroporación.
Se recogieron los transformantes en 20 mL de medio SOC y se permitió la recuperación en una hora a 37°C. al final de la recuperación, la parte alícuota fue diluida en serie y emplatada en platos de Carbenicilina (100 ug/ml) que contienen un 1% de glucosa para alcanzar el número total de transformantes. El cultivo remanente de SOC fue después empleado para inocular un medio de un Litro de 2xYT con Carbinicilina y un 1% de glucosa hasta que el OD600 alcanza 0.6. Se inocularon 100 mL de este cultivo con 1010/mL de fago ayudante M13 e incubado a 37°C antes del centrifugado. El sedimento de célula resultante fue resuspendido en 500 mL de medio fresco 2xYT contenedor de Carbenicilin (100 ug/mL) y Kanamicin (35 ug/mL) y cultivado a 30°C durante la noche antes del centrifugado. Las partículas fago se precipitaron por adición de PEG/NaCl y almacenados a -80°C.
Una segunda biblioteca, BC6/FG7, fue designado para introducir diversidad en los giros B:C y F:G de
Tencon simultáneamente. Con tal objeto, dos oligonucleótidos, Tc-BC6-For-5'phos y POP149 fueron sintetizados. El oligo delantero fue fosforilatado y contenía 18 bases de codones NNS en cada posición codificando giros B:C, mientras que el oligo contrario fue biotinilatado en el 5'final y contenía 21 bases de codones NNS en cada posición codificando el giro F:G. Ambos oligonucleótidos son flanqueados por dos secuencias de nucleótidos 18 bp idénticos en cada región y seguido de que la región fuera mutagenizada (ver más abajo para detalles).
Tc-BC6-For-5'phos: (SEQ ID NO:19)
gactctctgcgtctgtcttg gNN SNN SNN SNNSNNSNN STT CG ACT CTTT CCT G AT CC AGT A
c c
POP 2149: (SEQ ID NO: 20)
GT G AATTCCGCAG AC AGCGGSNN SNN SNN SNN SNNSNNSNN AACACCGT AGATA
GAAACGGTG
Para construir la biblioteca, se realizaron dieciséis reacciones de 100 uL PCR utilizando t oligos Tc-CB6-For5'phos y POP2149 para amplificar el modelo ADN Tencon, introduciendo codones NNS en giros B:C y F:G simultáneamente en el proceso. El producto de PCR de doble cadena se mezcló con perlas de estreptavidina magnética (Dylan) en solución amortiguadora B&W (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1m M EDTA, 2M NaCl, 0.1% Tween-20) e incubó durante 20 minutos, y rebajó magnéticamente y lavó dos veces con solución amortiguadora B&W. La cadena frontal se eluyó de las perlas con 300 uL de 150 mM NaOH. Este “mega-cebador”, una mezcla de cebadores largos con más de 8x1016 en diversidad teórica, fue utilizado par hibridarse con un modelo de biblioteca de cadenas simples. La construcción de la biblioteca se llevó a cabo tal y como se ha descrito anteriormente para la biblioteca FG7.
EJEMPLO 3: Selección de uniones Ig
Con objeto de realizar la selección de los miembros de la biblioteca Tencon que aglutinen IgG, se biotinilató el recombinante IgG (subtipo humano IgG1) utilizando sulfo-NHS-LC-Biotin (pierce) dializándolo antes en PBS. Para las selecciones, se bloquearon 200 uL de bibliotecas FG7 representes de fago o BC6/FG7 con 200 uL de bloqueador químico antes de la adición de igG biotinilatado a concentraciones de 500 mM (ronda 1) o 100 mM (rondas 2 y 3). Se recuperaron los fago enlaces mediante perlas magnéticas de Neutravidina (Seradyne) en la ronda 1 o perlas magnéticas de estreptavidina (Promega) en las rondas 2 y 3. Los fagos no enlazados fueron lavados de las perlas empleando 5-10 lavados con 1 mL de Tris suero de solución amortiguadora con TBST seguido de 21 mL lavados con suero de solución amortiguadora (TBS). Los fago enlaces se eluyeron de las perlas mediante la adición de E. coli MC1061 F'de fase media-larga. Se emplataron las células infectadas en platos agar LB suplementados con carbenicilina y glucosa. Al día siguiente, se rasparon las células del plato y cultivaron con fase media-larga antes del recate con fago ayudantes VCSM13 y cultivados durante la noche. Las partículas fago se aislaron por precipitación PEG/NaCl y emplearon para las selecciones de las siguientes rondas.
Después de tres rondas de lavado para retirar el IgG, se sub-clonó el producto a vector pET27 modificado para incluir un área de clonación independiente a la ligasa por amplificación del gen Tencon por PCR. Este producto PCR fue hibridizado con el vector y transformado en células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). Se colocaron colonias individuales en cultivos de 1 mL en platos Wells de profundidad 96 (Corning) y cultivados hasta la saturación durante la noche a 37°C. Al día siguiente, 50 microL del cultivo de la noche fueron empleados para inocular un cultivo fresco de 1 mL. Los cultivos crecieron a 37°C durante 2 horas antes de añadir el IPTG a 1 mM y reduciendo la temperatura a 30°C. Se recolectaron las células mediante centrifugado de 16 horas tras la inducción y lisadas con 100 microL de BugBuster (Novagen). Se clarificaron los lisados mediante centrifugación y empleados para testar por aglutinación con IgG con ELISA:
Se recubrieron platos Maxisorp (Nunc) con 0.1 gg de anticuerpo anti-HIS (Qiagen) durante la noche, lavaron con TBST, y bloquearon con Starting Block T20 (Thermo Scientific). Se añadieron los lisados clarificados diluidos en 1:4 de Starting Block a los platos para aglutinarse durante una hora antes del lavado con TBST. Se añadió IgG biotinilatado o HSA biotinilatado a una concentración de 1 ug/ml y lavó von TBST tras una hora de incubación. Se llevó a cabo la detección de enlaces IgG o HSA por adición de Estraptevidina-HRP (Jackson Immunoresearch) y se detectó con sustrato luminiscente químico POD. Los resultados de ELISA se muestran en la Figura 7. Se secuenciaron constructos que enlazan IgG biotinilatado 10 pliegues más que HSA biotinilatado, tal y como se juzga por la señal ELISA. Después de terminar muchos experimentos de selección, se obtuvieron 60 secuencias únicas de uniones de la biblioteca FG7 y 10 secuencias únicas de la biblioteca BC6FG7; la Tabal 4 muestra secuencias representativas de uniones IgG en los cuales los giros B:C y/o F:G son mostrados de modo que son diferentes de aquellos del SEQ ID NO: 16. También se muestran en la Tabla 4 numerosas mutaciones en otras
regiones del armazón.
La proteína Tencon aquí designada, expresada y purificada tiene una estabilidad térmica mejorada 26°C con respecto a la tercera del dominio FN3 de Tenascin humano, que ha sido utilizada como alternativa a la molécula de armazón. Basándose en este incremento de estabilidad, esta molécula de armazón es probable que sea más sensible a la sustitución de amino ácidos y más fácil de fabricar. Las mutaciones que reducen la estabilidad de la proteína es probable que sean mejora toleradas en el contexto de un armazón más estable y así un armazón con estabilidad mejorada es probable que produzca uniones más funcionales y bien plegados de una biblioteca de variedades de armazón.
M P l f l D l O N l O O ) n n ^ in
Tabla 2
Tabla 3. Giros
Tabla 4. Unión de armazones a IgG
Continuación
Continuación
Continuación
Secuencias:
SEC ID NO. 1:
sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfirvf ailenkksipvsarvat
SEC ID NO. 2:
tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqey eislhivknntrgpglkrvtttrld
SEC ID NO. 3:
dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevsl isrrgdmssnpaketftt
SEC ID NO. 4
SEC IDE NO. 5:
dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvllta ekgrhkskpakskparvk
SEC IDE NO. 6:
qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatpytv siygviqgyrtpvlsaeastge
SEC IDE NO. 7:
etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaathyti tirgvtqdfsttplsvevlte
SEC ID NO. 8:
evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragtpytv tlhgevrghstrplavevvte
SEC ID NO. 9:
dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaatpyrv siygvirgyrtpvlsaeastakepe
SEC IDE NO. 10:
kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglppstdfiv ylsglapsirtktisatatte
SEC IDENO. 11:
alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyev mvsgftqghqtkplraeivte
SEC IDE NO. 12:
aepevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrdltglreateyei elygiskgrrsqtvsaiattam
SEC ID NO. 13:
gspkevifsditensatvswraptaqvesfrityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsii amkgfeesepvsgsfttal
SEC IDE NO. 14:
dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepateytlrifa ekgpqksstitakfttdl
SEC IDE NO. 15:
dsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllvyesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqa lngplrsnmiqtifttigl
SEC IDE NO. 16:
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVS IYGVKGGHRSNPLSAEFTT SEC ID NO. 17:
ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgtcttggaccgcgc cggacgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaagttggtgaagcgatcaacct gaccgttccgggttctgaacgttcttacgacctgaccggtctgaaaccgggtaccgaatacaccgtttct atctacggtgttaaaggtggtcaccgttctaacccgctgtctgcggaattcaccacc
Secuencia Tencon mostrando bucles fSEC IDN0:161
A-ft 3-c c-D
1 - LPAPKULWEEVTEDSLPLSWTAPDJUkFDSFLIQYQESEKVGEft- 44
D-E E-F F-G
4S-1NLPVPGEEHSYDLTGLKPGTEYWSIIfdVK&GHESMPLaAEFTT-89
EJEMPLO 4: Estabilizando las Mutaciones de Tencon
Las mutaciones se diseñaron para mejorar la estabilidad de doblado del armazón Tencon descrito anteriormente en la presente (SEQ ID NO: 16). Se realizaron mutaciones de diversos puntos para producir la sustitución de residuos individuales de SEQ ID NO: 16, tales como N46V (Tencon 17-SEQ ID NO:142), E14P (Tenco18-SEQ ID NO:143), E11N (Tencon 19-SEQ ID NO:144), E37P (Tencon20-SEQ ID NO:145) y G73Y (Tencon 21-SEQ ID NO:146) de los cuales se predijo que mejorarían la estabilidad mediante el programa PoPMuSiC v2.0 (Dehouck, Grosfils et al. 2009). El mutante E86I (Tencon22-SEQ ID NO:147) se había hallado anteriormente para estabilizar una proteína homologa, el tercer dominio FN3 de Tenascin humano (WO2009/086116a2). Finalmente, se descubrió que la mutación L17A estabiliza significativamente el Tencon durante los experimentos de escaneado de alanina en los cuales todos los residuos de los giros de Tencon fueron reemplazados por alanina independientemente (no se muestran datos). Siguiendo a la ronda inicial de ensayos de estabilidad (ver más abajo), se produjeron para aumentar aún más la estabilidad los mutantes combinables N46V/E86I (Tencon23-SEQ ID NO:148), E14P/N46V/E86I (Tencon24-SEQ ID NO:149) y L17A/N46V/E86I (Tencon 25-SEQ ID NO:150).
Expresión y purificación
Se realizaron las mutaciones en las secuencias codificadoras de Tencon utilizando el kit de muta génesis QuickChange (Stratagene). Los plásmidos resultantes se transformaron en BL21-GOLD (DE3) E. coli (Stratagene) para la expresión. Se recogió una colonia sencilla y se cultivó durante la noche a 37°C en 2 mL de medio TB que contiene 100 pg/ml de ampicilina. Este cultivo se empleó para sembrar 100 mL de medio de autoinducción (Overnight Express Instant TB media, Novageen) en un matraz de deflectores de 500 mL y cultivado a 37°C durante 16 horas.
Se recolectó el cultivo mediante centrifugado a 400xg por 20 minutos y se re suspendieron las células sedimentadas en 5 mL de BugBuster HT (Novagen) por gramo de sedimento de célula húmeda. Tras 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se clarificaron los lisados mediante centrifugado a 30.000xg por 20 minutos y cargados en 3 mL de columna de superflujo Ni-NTA (Novagen) por gravedad. Tras la carga, se lavó cada columna con 15 mL de una solución amortiguadora de 50 mM de fosfato de sodio pH 7.4, 500 mM NaCl y 10 mM de imidazol. Después se eluyó la proteína de enlace de la columna utilizando 10 mL de una solución amortiguadora de 50 mM de fosfato de sodio pH 7.4, 500 mM NaCl y 250 mM de imidazol. Se evaluó la pureza de la proteína mediante SDS-PAGE. Antes del análisis biofísico, se dializó cada mutante a fondo en PBS pH 7.4. Se obtuvieron 28-33 mg de proteína purificada por cada mutante de un cultivo de 100 mL.
Caracterización de la Estabilidad Térmica
Se midió la estabilidad térmica del Tencon original y cada mutación mediante calorímetro diferencial de escaneado capilar (DSC). Cada muestra se dializó extensivamente contra PBS pH 7.4 y diluyo en una concentración
de 2-3 mg/mL. Se midieron las temperaturas de fusión para dichas muestras utilizando un VP-DSC instrumento equipado con inyector automático (MicroCal, LLC). Se calentaron las muestras de 10°C a 95°C o 100°C en un ratio de 1 °C por minuto. Solo se realizó un escáner de solución amortiguadora entre cada muestra para calcular una línea base para la integración. Se adecuaron los datos para un modelo de despliegue de dos etapas seguido de la substracción de la única señal de la solución amortiguadora. Se determinó reversibilidad de la desnaturalización térmica por repetición del escaneado de cada muestra sin eliminarla de la célula. Se calculó la reversibilidad comparando el área bajo la curva del primer y segundo escaneados. Se presentan los resultados los experimentos DSC en la Tabla 5 así como los valores derivados de las curvas de fusión completa. Los mutantes simples Tencon17, Tencon18, Tencon 19 y Tencon 22 mejoran la estabilidad térmica comparada con la secuencia Tencon original. Solo el Tencon21 resultó significativamente desestabilizante. Las muestras de mutantes combinatorios Tencon23, Tencon24 y Tencon25 mejoran significativamente la estabilidad, indicando que las mutaciones diseñadas son aditivas con respecto a la mejora de la estabilidad térmica.
Desnaturalización por Hidrocloruro de Guanidina
Se empleó para mejorar la estabilidad, la habilidad del Tencon y cada mutante para mantenerse enlazados durante el tratamiento con concentraciones crecientes de Hidrocloruro de Guanidina (GdmCl), tal y como se había medido por fluorescencia de triptófano. El Tencon contiene sólo un residuo de triptófano. El residuo de triptófano es enterrado en el núcleo hidrofóbico y así la emisión fluorescente a 360 nm es una medida sensible del estado plegado de la proteína. Para producir una valoración de 17 puntos se pipetearon 200 uL de solución de 50 mM de sodio fosfato pH 7.0, 150 mM NaCl y concentraciones variables de GdmCl de 0.48 a 6.63 M en platos Well-96 (Greiner), negros, no uniones. Se añadieron 10 uL de una solución que contiene los mutantes de Tencon a cada plato Well para crear una nueva concentración final de proteína de 23 uM y mezcló y pipeteó suavemente hacia arriba y hacia abajo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 24 horas, se leyó la fluorescencia utilizando un plato lector Spectramaz M5 (Molecular Devices) con excitación de 280 n y emisión de 360 nm. Los datos generados de cada curva se muestran en la Figura 8. La señal de fluorescencia se convirtió en fracción de despliegue mediante la ecuación (Pace 1986 Methods Enzymol 131: 266-80):
fu , = (j ?f - y } / ( y f - yu~)
Donde yp es la señal fluorescente de la muestra plegada y yu de la muestra desplegada. Los puntos intermedios de la transición al despliegue e inclinación de la transición fueron determinados mediante la siguiente ecuación (Clarke, Hamill et al. 1997):
Donde F es la fluorescencia en la concentración desnaturalizante dada, aN y aD son los interceptores-y de los estados naturales y desnaturalizados, pN y pD son las inclinaciones de las líneas base de los estados naturales y desnaturalizados, [D] es la concentración de GdmCl, [D]50% la concentración de GdmCl en el punto en el que el 50% de la muestra es desnaturalizada, m la pendiente de la transición, R la constante de gas, y T la temperatura. La energía de pliegue liberada por cada muestra se estimó utilizando la ecuación (Pace 1986 supra; Clarke, Hamill et al. 1997 J Mol Biol 270(5): 771-8): AG = m[D]50%
A menudo resulta difícil medir con precisión la pendiente de la transición, m, para dichas curvas. Adicionalmente, se espera que las mutaciones descritas no alteren el mecanismo de plegado del Tencon. De este modo, se midió el valor m para cada mutante y se realizó la media de los valores (Pace 1986 supra) para producir una m=3544 cal/mol/M utilizada para todos los cálculos de energía liberada. Los resultados de estos cálculos se presentan en la Tabla 5. Los resultados para los experimentos del despliegue de GdmCl demuestran que los mismos mutantes que estabilizan el Tencon con respecto a la estabilidad térmica también estabilizan la proteína contras la desnaturalización inducida de GdmCl.
Cromatografía de Exclusión por Tamaños
La cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) fue empleada para valorar el estado de agregación del Tencon WT con cada mutante. Se inyectaron 5 uL de cada muestra en columna Superdex 755/150 (GE Healthcare) con un ratio de flujo 0.3 mL/min con una fase móvil PBS. Se monitorizó la elución de la columna por absorbancia 280nm. Con el objeto de valorar el estado de agregación, la columna fue previamente calibrada con estándares de peso molecular globular (Sigma). Todas las muestras examinadas, con excepción del Tencon 21, se eluyeron en un pico en un volumen de elución consistente en una muestra monomérica. Tencon 21 eluyó en dos picos, indicando la presencia de agregados.
Claims (7)
1. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 145 o 146.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de la reivindicación 1.
3. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Una célula huésped procariota o eucariótica que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 2, en donde opcionalmente dicha célula huésped es por lo menos una seleccionada de E. coli BL21Star(DE3), otra célula de E. coli, levadura, célula de insecto, COS-1 , COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, células de mieloma o linfoma, células inmortalizadas o transformadas de las mismas.
5. Una composición que comprende la proteína de la reivindicación 1 y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, que opcionalmente comprende además por lo menos un compuesto o polipéptido seleccionado de un indicador o marcador detectable, un antagonista del TNF, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco para el sistema cardiovascular (CV), un fármaco para el sistema nervioso central (SNC), un fármaco para el sistema nervioso autónomo (ANS), un fármaco para el tracto respiratorio, un fármaco para el tracto gastrointestinal (GI), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco de inmunomodulación, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un alimento activo funcional, una citoquina y un antagonista de citoquina.
6. Un dispositivo médico, que comprende la proteína de la reivindicación 1, en donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar dicho andamiaje de proteína por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intraretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico.
7. Un artículo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de envasado y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de la proteína de la reivindicación 1, opcionalmente en donde dicho recipiente es un componente de un dispositivo o sistema de administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.
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