CN116568341A - 基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途 - Google Patents

基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116568341A
CN116568341A CN202180029558.0A CN202180029558A CN116568341A CN 116568341 A CN116568341 A CN 116568341A CN 202180029558 A CN202180029558 A CN 202180029558A CN 116568341 A CN116568341 A CN 116568341A
Authority
CN
China
Prior art keywords
combination
antibody
seq
agent
chelator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180029558.0A
Other languages
English (en)
Inventor
P·E·莫林
D·J·唐纳利
W·S·海耶斯
R·A·史密斯
S·J·博纳科西
D·K·梁
W·韦伯
A·克拉克哈特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of CN116568341A publication Critical patent/CN116568341A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1054—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/106—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from kidney or bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1066—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from skin

Abstract

本文提供了用于在检测、治疗和监测受试者的癌症中使用的放射成像剂和放射治疗剂。

Description

基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月28日提交的标题为“基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途(Radiolabeled Fibronectin Based Scaffolds and Antibodiesand Theranostic Uses Thereof)”的美国临时号62/983412的优先权，将其全部内容通过引用特此并入本文。
背景技术
治疗诊断剂使用人体中的特定生物途径，以获取诊断图像，以及向患者递送治疗剂量的辐射。特定的诊断测试显示出在疾病部位(例如肿瘤)处的特定分子靶标，允许治疗剂与疾病部位处的靶标特异性地结合，而不是更广泛地靶向其他组织，从而避免不利影响。与先前的“one-medicine-fits-all”方法相比，这种组合方法提供了更具靶向性、更有效的药物疗法。
因此，仍然需要用于在非侵入性体内成像和治疗方法中使用的合适的放射性标记的药剂，以评估靶标表达和分布，以及获得可靠的诊断、预后和治疗信息。
发明内容
本文提供了用于在对受试者的癌症进行成像中使用的放射成像剂和用于治疗受试者的癌症的放射治疗剂的治疗诊断组合。本文提供的放射成像剂和放射治疗剂的组合可用于检测受试者的癌细胞、肿瘤大小和位置、癌细胞转移和癌细胞迁移的方法中，与放射疗法方法组合以治疗癌症，以及监测向受试者施用的放射治疗剂的功效。
在一个方面，本文提供了一种用于在诊断、监测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含与由所述癌症表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和放射性核素；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含所述FBS多肽和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的FBS多肽与所述靶标结合。
在一些实施方案中，所述放射成像剂的放射性核素和/或所述放射性核素通过螯合剂(例如，双功能螯合剂(BFC))与所述FBS多肽连接，所述螯合剂包含与靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。在一些实施方案中，所述螯合剂经由接头(例如，肽接头)与所述FBS多肽共价附接。
在一些实施方案中，所述FBS多肽包含人10Fn3结构域。在某些实施方案中，所述10Fn3结构域与人PD-L1结合(即，是抗PD-L1艾得奈可汀(Adnectin))。在特定实施方案中，所述抗PD-L1艾得奈可汀的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；(d)分别地，SEQID NO:51、52和53；(e)分别地，SEQ ID NO:66、67和68；(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。在一个实施方案中，所述抗PD-L1艾得奈可汀包含SEQID NO:96或SEQ ID NO:80。
在另一个方面，本文提供了一种放射治疗剂，所述放射治疗剂包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素。在一些实施方案中，所述放射治疗剂是包含抗体12A4的三个VH CDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的三个CDR的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的CDR和VL的CDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射治疗剂是包含抗体12A4的VH和VL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述放射治疗剂包含12A4或其抗原结合片段。
在一个相关方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本文提供了一种用于在检测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的PD-L1抗体或其抗原结合片段具有相同的抗原结合特异性。
在一些实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂的放射性核素通过螯合剂(例如，双功能螯合剂(BFC))与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段连接，所述螯合剂包含与靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。在一些实施方案中，所述螯合剂经由接头(例如，肽接头)与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段共价附接。
在一些实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂是包含抗体12A4的三个VHCDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的三个CDR的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的CDR和VL的CDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂是包含抗体12A4的VH和VL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述放射成像剂和/或放射治疗剂是12A4。
在另一个方面，本文提供了使用本文提供的放射成像剂和放射治疗剂的组合用于诊断、监测和治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与由癌细胞表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和适于放射成像的放射性核素；(b)获得所述受试者的全部或一部分的放射图像，以确定所述靶标在所述受试者中的存在；(c)施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽和适于放射疗法的放射性核素，其中所述放射成像剂和放射治疗剂与相同的靶标结合。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与由癌细胞表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和适于放射成像的放射性核素；(b)获得所述受试者的全部或一部分的放射图像，以确定所述靶标在所述受试者中的存在；(c)施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽和适于放射疗法的放射性核素，其中所述放射成像剂和放射治疗剂与相同的靶标结合。
在一些实施方案中，还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂以监测所述受试者中的靶标水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的靶标水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
在一些实施方案中，所述癌症是表达PD-L1的癌症，并且所述放射成像剂和放射治疗剂是抗PD-L1艾得奈可汀。在一些实施方案中，所述放射成像剂和治疗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，所述放射成像剂是抗PD-L1艾得奈可汀，并且所述放射治疗剂是抗PD-L1抗体或其片段。
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的放射成像剂和/或放射治疗剂。本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含本文提供的放射成像剂和放射治疗剂以及使用说明书。
附图说明
图1描绘了PD-L1转导的U698M细胞的表征(左)。通过PD-L1染色分析的转导的U698M(底部)和未转导的U698M(顶部)的PD-L1表达的代表性流式细胞术评价(右)。未转导的和转导的U698M细胞两者的每细胞PD-L1分子的定量。
图2描绘了在携带PD-L1阳性U-698-M(白色箭头)和U-698-M野生型(透明箭头)异种移植物的NSG小鼠中在1h p.i.(上图)和2h p.i.(下图)时68Ga-艾得奈可汀的静态μPET扫描的最大密度投影(MIP)(0％-9％ ID/g)。小鼠#481：共注射68Ga-艾得奈可汀+用9mg/kg未标记的艾得奈可汀阻断。
图3A-图3C描绘了轴向切片：在1h p.i.时在携带U698M-PDL1+(白色箭头)和U698M野生型(透明箭头)肿瘤的NSG小鼠中68Ga-艾得奈可汀的CT(图3A)、PET(图3B)、PET/CT(图3C)。数据表示为0-9％ ID/g。
图4描绘了在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型异种移植物的小鼠中在1hp.i.和2h p.i.时68Ga-艾得奈可汀的静态PET扫描的ROI定量。为一只小鼠共注射68Ga-艾得奈可汀+9mg/kg未标记的艾得奈可汀(阻断)。
图5A描绘了动态PET扫描的最大密度投影(MIP)。在90min的采集时间内在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型异种移植物的小鼠中68Ga-艾得奈可汀的不同时间-帧数的累加图像(0-9％ ID/g)。图5B.源自动态μPET/CT数据的血池(心脏)、肾脏、肌肉、肝脏以及PD-L1阳性和阴性肿瘤的时间-活度曲线(以％ID/g计)。
图6描绘了在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型异种移植物的小鼠中68Ga-艾得奈可汀的生物分布数据(以％ID/g计)(1h和2h p.i.)。
图7描绘了来自两只小鼠的代表性离体FACS分析，评估野生型(交叉影线)和PD-L1转导的(阴影)肿瘤上的GFP(顶部)和PD-L1(底部)表达。
图8描绘了在U-698-M肿瘤内PD-L1阳性细胞的离体分析。野生型和PD-L1转导的肿瘤的相应的免疫组织化学HE染色和PD-L1染色。
图9A和图9B描绘了在1h、24h、72h和7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M野生型(WT)肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1艾得奈可汀的SPECT/CT成像(注射剂量：37MBq；100μg艾得奈可汀，n＝1)，并且图9C描绘了在1h、24h、48h和72h p.i.时的情况(注射剂量：33MBq；69μg艾得奈可汀，n＝1)。
图10A描绘了在72h p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M WT肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1艾得奈可汀的SPECT/CT成像和离体生物分布(注射剂量：33MBq；69μg艾得奈可汀，n＝1)，并且图10B描绘了在7d p.i.时的情况(注射剂量：37MBq；100μg艾得奈可汀，n＝1)。
图11A描绘了在5h、24h、48h、72h和7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M WT肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb的SPECT/CT成像(注射剂量：25MBq；100μg mAb，n＝1)，并且图11B描绘了在5h、24h、48h和72h p.i.以及96h p.i.时的情况(注射剂量：34MBq；102μgmAb，n＝1)。
图12A描绘了在96h p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M WT肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb的SPECT/CT成像和离体生物分布(注射剂量：34MBq；102μg mAb，n＝1)，并且图12B描绘了在7d p.i.时的情况(注射剂量：25MBq；102μg mAb，n＝1)。
图13描绘了在5h p.i.(n＝1)、24h p.i.(n＝1)和72h p.i.(n＝1)时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb的生物分布。注射剂量：1.5MBq，大约13μg mAb。
图14描绘了68Ga-艾得奈可汀长达4h的体外稳定性，如通过放射-TLC和放射-HPLC所确定的。
图15A-图15B描绘了随起始活度量、前体和反应时间变化的NOTA-艾得奈可汀相比于DOTA-艾得奈可汀的68Ga标记的放射化学产率(RCY)。
图16描绘了68Ga标记的DOTA-艾得奈可汀和NOTA-艾得奈可汀的比较动态μPET扫描的最大密度投影(MIP)。在90min的采集时间内在携带PD-L1阳性U-698-M(白色箭头)和U-698-M野生型(透明箭头)异种移植物的小鼠中68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的不同时间-帧数的累加图像(0-9％ ID/g)。(B＝膀胱，K＝肾脏)。
图17描绘了在携带PD-L1阳性U-698-M(白色箭头)和U-698-M野生型(透明箭头)异种移植物的NSG小鼠中在1h p.i.时68Ga-DOTA-艾得奈可汀(上图)和68Ga-NOTA-艾得奈可汀(下图)的静态μPET扫描(5-6MBq，大约10μg)的最大密度投影(MIP)(0％-9％ ID/g)。阻断：共注射68Ga-DOTA/NOTA-艾得奈可汀+用9mg/kg未标记的艾得奈可汀阻断。
图18描绘了在1h p.i.时在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的NSG小鼠中68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的生物分布(5-6MBq，大约10μg)。数据表示为％ID/g(平均值±SD)。
图19描绘了在7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M WT肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1艾得奈可汀的SPECT/CT成像和离体放射自显影、HE染色和IHC染色(注射剂量：37MBq；100μg艾得奈可汀)。
图20描绘了在竞争性放射性配体结合测定中确定的177Lu-mAb对PD-L1的结合亲和力和特异性。(左)在浓度渐增的冷配体(DOTA-mAb)的存在下177Lu-mAb的细胞结合活性。(右)在冷配体(0.1nM)的存在下在PD-L1阳性和野生型U-689-M细胞上177Lu-mAb的细胞结合活性。
具体实施方式
I.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与熟练技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所述的方法和组合物类似或等效的任何方法和组合物，但本文描述了优选的方法和组合物。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。除非另外说明，否则“或”或“和”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
如本文所用，“约”意指在数字的±10％内。例如，“约100”将指代在90与110之间的任何数字。
如本文所用，术语“治疗诊断剂”是指放射性标记的诊断剂和放射治疗剂的组合。通常，单独施用放射性标记的药剂，例如，放射性标记的诊断剂含有和与疾病(例如，癌症)相关的靶标结合的多肽，用于通过成像(如正电子发射断层扫描(PET)成像)评估疾病病症(例如，癌症)的位置、范围和靶标密度，然后用和与患病细胞相关的相同靶标结合的放射治疗剂进行放射免疫疗法(RIT)。
如本文所用，如通常指代“生物靶标”的“靶标”是指细胞、组织(例如，癌症或肿瘤)、病原微生物(例如，细菌、病毒、真菌、植物、朊病毒、原生动物或其部分)、蛋白质(例如，PD-L1)或其他分子。
术语“靶向配体”、“靶向剂”或“靶向分子”可互换地用于指代与另一种分子结合的分子，如肽、蛋白质、糖蛋白等、FBS多肽(例如，艾得奈可汀，例如PD-L1艾得奈可汀)、抗体或抗原结合蛋白(例如，抗体的抗原结合片段)。在某些实施方案中，靶向剂结合至放射性标记，以便将放射性标记“靶向”途径至靶向剂所结合的其他分子。
如本文所用的“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何序列，而不管长度、翻译后修饰或功能如何。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用。多肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，如通过引用并入本文的美国专利号中6,559,126中描述的天然氨基酸和非天然氨基酸。也可以以多种标准化学方式中的任一种修饰多肽(例如，可以用保护基团修饰氨基酸；可以将羧基末端氨基酸变为末端酰胺基团；可以用例如增强亲脂性的基团修饰氨基末端残基；或者可以化学糖基化或以其他方式修饰多肽以增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可以包括将另一种结构(如环状化合物或其他分子)附接至多肽，并且还可以包括含有一个或多个构型改变(即，R或S；或者L或D)的氨基酸的多肽。
如本文所用，“多肽链”是指如下多肽，其中其每个结构域通过一个或多个肽键(与非共价相互作用或二硫键相反)与其他一个或多个结构域连接。
“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定出并且与其天然环境的组分分离和/或从其天然环境的组分中回收的多肽。其天然环境的污染物组分是会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，多肽将被纯化(1)至如通过Lowry方法所确定的按重量计大于95％、最优选按重量计大于99％的多肽；(2)至通过使用旋杯式测序仪足以至少获得N末端或内部氨基酸序列的残基的程度；或(3)至在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染通过SDS-PAGE测得的同质性。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
本文的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在用以实现最大序列同一性百分比而比对序列和引入空位(如果需要)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTARTM)软件。本领域技术人员可以容易地确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A与(to、with或against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以可替代地用短语表示为与(to、with或against)给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中作为相同匹配得分的氨基酸残基数，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。
“抗原结合蛋白”是指结合抗原的蛋白质，并且包括FBS多肽(例如，艾得奈可汀)、抗体和抗体的抗原结合片段(或部分)。
如本文所用，术语“FBS结合位点”、“艾得奈可汀结合位点”和“抗体结合位点”分别是指蛋白质(例如，PD-L1)的与特定FBS多肽(例如，多肽的10Fn3结构域)、艾得奈可汀或抗体相互作用或结合的位点或部分。结合位点可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的结合位点通常在暴露于变性溶剂时保留，然而通过三级折叠形成的结合位点通常在用变性溶剂处理时丢失。
如本文在FBS多肽(例如，艾得奈可汀)或抗原结合蛋白(例如，本文提供的抗体)的上下文中所用，术语“交叉反应性”分别是指FBS多肽或抗原结合蛋白与具有相同或非常类似的结合位点的多于一种不同的蛋白质结合。
“抗原结合特异性”是指抗体的为其提供与抗原的特定区域特异性地结合的能力部分，并且可以是例如抗体的可变区或其CDR。在某一CDR(例如，VL CDR1)对于抗原结合不重要的情况下，这种CDR不被包括在定义“抗原结合特异性”中。即使一个或多个CDR中的特定氨基酸被取代、缺失或添加，两种或更多种抗体也可以具有相同的抗原结合特异性。可以通过晶体学确定两种抗体是否具有相同的抗原结合特异性，其中如果两种抗体与靶蛋白具有相同的相互作用，则它们的抗原结合特异性是相同的，如通过晶体结构所确定的。
如本文所用的术语“抗体”(缩写为“Ab”)是指包含至少重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3以及至少轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够与抗原结合。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。所述术语还涵盖具有全长重链和/或轻链的分子。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(如小鼠、人、食蟹猴、等)的抗体。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含至少一条重链，其包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分；以及至少一条轻链，其包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，抗体包含两条重链，其中每条重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分；以及两条轻链，其中每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，认为单链Fv(scFv)或包含例如含有所有六个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单条多肽链的任何其他抗体具有重链和轻链。在一些此类实施方案中，重链是抗体的包含三个重链CDR的区域，并且轻链是抗体的包含三个轻链CDR的区域。
如本文所用的术语“重链可变区”是指包含重链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。在一些实施方案中，重链CDR1对应于Kabat残基26至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；并且重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见例如，Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987和1991，NIH，马里兰州贝塞斯达)；以及图1。在一些实施方案中，重链CDR1对应于Kabat残基31至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；并且重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见同上。
如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的区域。非限制性的示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性的示例性重链恒定区还包括ε和μ。每个重恒定区对应于一种抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为子类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；并且IgM抗体包括但不限于IgM1和IgM2。
在一些实施方案中，重链恒定区包含赋予抗体所需特征的一个或多个突变(或取代)、添加或缺失。非限制性的示例性突变是IgG4铰链区(在恒定结构域CH1与CH2之间)中的S241P突变，其将IgG4基序CPSCP变为CPPCP，它类似于IgG1中的相应基序。在一些实施方案中，该突变产生更稳定的IgG4抗体。参见例如，Angal等人,Mol.Immunol.30:105-108(1993)；Bloom等人,Prot.Sci.6:407-415(1997)；Schuurman等人,Mol.Immunol.38:1-8(2001)。
如本文所用的术语“重链”(缩写为HC)是指包含至少重链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
如本文所用的术语“轻链可变区”是指包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。在一些实施方案中，轻链CDR1对应于Kabat残基24至34；轻链CDR2对应于Kabat残基50至56；并且轻链CDR3对应于Kabat残基89至97。参见例如，Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，NIH，马里兰州贝塞斯达)。
如本文所用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性的示例性轻链恒定区包括λ和κ。
如本文所用的术语“轻链”(缩写为LC)是指包含至少轻链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
如本文所用的“嵌合抗体”是指包含至少一个来自第一物种(如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区和至少一个来自第二物种(如人、食蟹猴等)的恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个大鼠可变区和至少一个小鼠恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区都来自第一物种，并且嵌合抗体的所有恒定区都来自第二物种。
如本文所用的“人源化抗体”是指如下抗体，其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸已经被来自人可变区的相应氨基酸替代。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体是Fab、scFv、(Fab’)2等。
如本文所用的“CDR移植抗体”是指如下人源化抗体，其中第一(非人)物种的互补决定区(CDR)已经被移植到第二(人)物种的框架区(FR)上。
如本文所用的“人抗体”是指在人中产生的抗体、在包含人免疫球蛋白基因的非人动物(如)中产生的抗体以及使用体外方法(如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体库是基于人免疫球蛋白序列。
如本文可互换地使用的术语“特异性地结合”、“特异性结合”、“选择性结合”和“选择性地结合”是指FBS多肽(例如，艾得奈可汀)或抗原结合蛋白对靶标(例如，PD-L1)展现出亲和力，但是不与不同的多肽显著地结合(例如，小于约10％结合)，如通过本领域可用的技术所测量的，所述技术如但不限于Scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。在例如本文所述的FBS多肽或抗体的结合结构域对靶标(例如，PD-L1)具有特异性的情况下，所述术语也适用。
如本文所用的术语“优先结合”是指如下情况，其中本文所述的FBS多肽(例如，艾得奈可汀)或抗原结合蛋白与靶标(例如，PD-L1)的结合比它与不同的多肽的结合大至少约20％，如通过本领域可用的技术所测量的，所述技术如但不限于Scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。
如本文所用，术语“KD”旨在指代特定靶标(例如，PD-L1)相互作用的解离平衡常数或者FBS多肽(例如，艾得奈可汀)或抗原结合蛋白对蛋白质(例如，PD-L1)的亲和力，如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。如本文所用，“所需KD”是指艾得奈可汀的足以用于预期目的的KD。例如，所需KD可以指代艾得奈可汀的在体外测定(例如，基于细胞的萤光素酶测定)中引发功能效应所需的KD。
如本文所用的术语“ka”旨在指代FBS多肽或抗原结合蛋白与靶标结合成复合物的缔合速率常数。
如本文所用，术语“kd”旨在指代FBS多肽或抗原结合蛋白从与靶标的复合物中解离的解离速率常数。
如本文所用，术语“IC50”是指FBS多肽(例如，艾得奈可汀)或抗体的在体外或体内测定中将反应抑制至为最大抑制反应的50％(即，最大抑制反应与未处理反应之间的一半)的水平的浓度。
术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩略词，并且涵盖化合物的包括(通过举例的方式)受试者的吸收、分布、代谢和消除的特性。如本文所用的“PK调节蛋白”或“PK部分”是指当与生物活性分子融合或与生物活性分子一起施用时影响生物活性分子的药代动力学特性的任何蛋白质、肽或部分。PK调节蛋白或PK部分的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合物(如在美国公开号2005/0287153和2007/0003549、PCT公开号WO 2009/083804和WO2009/133208中所披露的)、人血清白蛋白及其变体、转铁蛋白及其变体、Fc或Fc片段及其变体以及糖(例如，唾液酸)。
蛋白质或化合物的“血清半衰期”是指例如由于序列或化合物通过天然机制的降解和/或序列或化合物通过天然机制的清除或螯合(sequestration)而导致的多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间。可以以本身已知的任何方式(如通过药代动力学分析)确定半衰期。合适的技术将是本领域技术人员所清楚的，并且可以例如通常涉及如下步骤：向受试者适当地施用合适剂量的本文所述的氨基酸序列或化合物；以规则的间隔从受试者收集血液样品或其他样品；确定本文所述的氨基酸序列或化合物在所述血液样品中的水平或浓度；以及从由此获得的数据(的曲线图)计算与给药时的初始水平相比，直到本文所述的氨基酸序列或化合物的水平或浓度已经降低50％的时间。例如，参考标准手册，如Kenneth,A.等人,Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook forPharmacists和Peters等人,Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(1996)。还参考Gibaldi,M.等人,Pharmacokinetics,第2修订版,Marcel Dekker(1982)。
可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β、HL_λz和曲线下面积(AUC)等参数表示半衰期。
在一个例子中，如本文所用的术语“放射化学品”是指包含共价附接的或配位附接的(配体)放射性同位素的有机、无机或有机金属化合物，特别是包括放射性成像探针和旨在向患者施用的放射治疗剂(其在本领域中也称为放射性药物、放射性示踪剂或放射性配体)。
术语“放射性同位素”或“放射性元素”是指展现出放射性衰变(例如，发射正电子、β粒子、γ辐射等)的同位素和包含放射性同位素的放射性标记剂。同位素或元素在本领域中也称为放射性同位素或放射性核素。
如本文所用，术语“连接”是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即，重组融合)。可以使用多种本领域公认的技术(如化学缀合和重组蛋白生产)实现此类连接。
术语“诊断”或“检测”可以可互换地使用。诊断通常是指定义组织的特定组织学状态，而检测则识别并定位含有特定可检测靶标的组织、病变或生物体。
术语“可检测的”是指在背景信号上检测信号的能力。术语“可检测量”是指所施用的可检测化合物的足以使得能够检测化合物与癌细胞的结合的量。如本文在成像剂和诊断剂的上下文中使用的术语“可检测信号”是源自非侵入性成像技术的信号，所述成像技术如但不限于正电子发射断层扫描(PET)。可检测信号是可检测的，并且可与可能从受试者产生的其他背景信号区分开。换言之，在可检测信号与背景之间存在可测量且统计上显著的差异(例如，统计上显著的差异对于区分可检测信号和背景的差异是足够的，如在可检测信号与背景之间的差异为约0.1％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％或更多)。标准品和/或校准曲线可以用于确定可检测信号和/或背景的相对强度。
包含本文所述的成像剂的组合物的“可检测有效量”或“成像有效量”定义为足以使用可用于临床使用的设备产生可接受图像的量。本文提供的可检测有效量的成像剂可以在多于一次的注射中施用。可检测有效量可以根据诸如个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的独特反应等因素而变化。成像组合物的可检测有效量也可以根据所使用的仪器和方法而变化。此类因素的优化完全在本领域的技术水平之内。
如本文所用的“PD-L1阳性”可以与“至少约5％的PD-L1表达”可互换地使用。因此，PD-L1阳性肿瘤可以具有至少约5％、至少约10％或至少约20％的表达PD-L1的肿瘤细胞。在某些实施方案中，“PD-L1阳性”意指存在至少100个在细胞表面上表达PD-L1的细胞。可以通过本领域已知的任何方法测量PD-L1表达。在一些实施方案中，PD-L1阳性肿瘤表达可检测水平的PD-L1，如通过本文提供的放射成像方法所测量的。在其他实施方案中，通过自动IHC测量PD-L1表达。
受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓与疾病相关的症状、并发症、病症或生化指标的进展、发展、严重程度或复发。
术语“治疗有效量”至少是指药剂的赋予受试者治疗益处所必需的最小剂量，但是小于毒性剂量。
如本文所用，“有效量”至少是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下有效实现所需结果的量。
如本文所用，“足量”是指足以实现所需结果的量。
如本文所用，如在本文提供的成像剂和治疗剂的上下文中使用的“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含成像剂或治疗剂的组合物物理引入受试者中。本文所述的成像剂的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的成像剂可以经由非肠胃外途径(如局部、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。
如本文所用，术语“共施用”等意在涵盖向单一患者施用所选药剂，并且旨在包括通过相同或不同的施用途径或者在相同或不同的时间施用药剂的方案。
术语“患者”和“受试者”和“个体”在本文中可互换地用于指代人，例如根据本文提供的方法接受包含成像剂和治疗剂的组合物的人。对于体外应用，如体外诊断和研究应用，上述受试者的体液和细胞样品将适于使用，如血液、尿液或组织样品。
术语“样品”可以指代组织样品、细胞样品、流体样品等。样品可以取自受试者。组织样品可以包括毛发(包括根)、颊拭子、血液、唾液、精液、肌肉或来自任何内部器官。流体可以是但不限于尿液、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身体组织可以包括但不限于皮肤、肌肉、子宫内膜、子宫和宫颈组织。
术语“同位素纯的”意指元素、化合物或组合物相对于其他同位素含有更大比例的一种同位素。在某些实施方案中，元素、化合物或组合物是大于约40％、50％或60％同位素纯的。
如本文所用，当标记的分子与未标记的分子部分或完全分离，使得与起始混合物相比，标记的分子的级分被富集时，标记的分子是“纯化的”。“纯化的”标记的分子可以包含几乎任何比率的标记的和未标记的分子的混合物，所述比率包括但不限于约5:95；10:90；15:85；20:80；25:75；30:70；40:60；50:50；60:40；70:30；75:25；80:20；85:15；90:10；95:5；97:3；98:2；99:1或100:0。
术语“生物正交化学”是指可以在生命系统内部发生而不干扰天然生化过程的任何化学反应。所述术语包括如下化学反应，其是在水中或在水的存在下在生理pH下在体外发生的化学反应。为了被认为是生物正交的，反应是具选择性的，并且避免与起始化合物中发现的其他官能团发生副反应。另外，反应配偶体之间产生的共价键应当是强的并且对生物反应具有化学惰性，并且不应当影响所需分子的生物活性。
术语“点击化学”是指一组可靠且具选择性的用于快速合成新化合物和组合文库的生物正交反应。点击反应的特性包括模块化、范围宽、高产、立体特异性和简单的产物分离(通过非色谱方法与惰性副产物分开)，以产生在生理条件下稳定的化合物。在放射化学和放射药物学中，点击化学是一组标记反应的通用术语，这些标记反应利用具选择性且模块化的构建单元，并且使得在不存在催化剂的情况下能够与放射性标记生物相关的化合物进行化学选择性连接。“点击反应”可以用铜进行，或者它可以是无铜点击反应。
术语“辅基”或“双功能标记剂”是指含有能够与肽或蛋白质连接的放射性核素的小有机分子。
如本文关于放射性药物化学使用的术语“螯合剂”和“螯合剂配体”是指为了用放射性核素标记多肽(通过为螯合剂负载放射性核素)的目的而与多肽连接的分子，并且包括双功能螯合剂(BFC)，其含有可以与靶向分子(例如，肽、蛋白质、核苷酸、纳米颗粒)共价偶联(缀合)的反应性官能团。BFC利用如下官能团，如羧酸或活化酯(例如，N-羟基-琥珀酰亚胺NHS-酯、四氟苯基TFP-酯)(用于酰胺偶联)、异硫氰酸酯(用于硫脲偶联)和马来酰亚胺(用于硫醇偶联)。
“癌症”是指一组广泛的不同疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。
“免疫反应”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)和通过这些细胞中的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物身体中侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。
“免疫调节剂”是指调节免疫反应的物质、药剂、信号传导途径或其组分。“调节(regulating)”、“改变(modifying)”或“调节(modulating)”免疫反应是指免疫系统的细胞或这种细胞的活性的任何改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低或免疫系统内可能发生的任何其他变化来显示。已经鉴定了抑制性和刺激性两种免疫调节剂，其中的一些在癌症微环境中可能具有增强的功能。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫反应的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。
如本文所用，“正电子发射断层扫描”或“PET”是指产生示踪剂在体内的位置的三维图像的非侵入性核医学技术。所述方法检测由发射正电子的放射性核素(示踪剂)间接发射的成对伽马射线，所述放射性核素通过生物活性分子引入体内。PET成像工具在临床前和临床上都具有广泛的用途，并且有助于药物开发。示例性应用包括靶标的体内饱和的直接可视化；监测正常组织中的摄取以预测毒性或患者之间的变化；定量患病组织；肿瘤转移；以及监测药物随时间的功效或随时间的耐药性。
在以下小节中进一步详细描述了本文所述的各个方面。
II.基于纤连蛋白的支架(FBS)
在一个方面，在本文所述的放射性标记的成像化合物和放射性标记的治疗化合物中使用的靶向分子是FBS蛋白。
如本文所用，“基于纤连蛋白的支架”或者“FBS”蛋白或部分是指基于纤连蛋白III型(“Fn3”)重复的蛋白质或部分。Fn3是具有免疫球蛋白(Ig)折叠结构(即，Ig样β-三明治结构，由七条β链和六个环组成)的小(约10kDa)结构域。纤连蛋白具有18个Fn3重复，并且虽然重复之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上都具有较高的相似性。Fn3结构域也存在于除纤连蛋白以外的许多蛋白质中，所述蛋白质如粘附分子、细胞表面分子(例如，细胞因子受体)和碳水化合物结合结构域。关于综述，参见Bork等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(19):8990-8994(1992)；Bork等人,J.Mol.Biol.,242(4):309-320(1994)；Campbell等人,Structure,2(5):333-337(1994)；Harpez等人,J.Mol.Biol.,238(4):528-539(1994)。术语“FBS”蛋白或部分旨在包括基于来自这些其他蛋白质(即，非纤连蛋白分子)的Fn3结构域的支架。
Fn3结构域是小的、单体的、可溶的并且稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。Fn3结构域从N末端到C末端依次包含β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。七条反平行的β链排列为两个β片层，其形成一个稳定的核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD和EF位于一个面(“南极”)，并且环BC、DE和FG位于相对的面(“北极”)。在人纤连蛋白中存在至少15个不同的Fn3模块，并且虽然模块之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上都具有较高的相似性。
Fn3分子中的环在结构上类似于抗体的互补决定区(CDR)，并且当发生改变时，可以参与Fn3分子与靶标(例如，靶蛋白)的结合。Fn3分子的其他区域(如β或β样链和N末端或C末端区)当发生改变时也可以参与与靶标的结合。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任何一个或全部可以参与与靶标的结合。任何β或β样链都可以参与与靶标的结合。Fn3结构域也可以通过一个或多个环和一条或多条β或β样链与靶标结合。结合也可能需要N末端或C末端区。用于在蛋白质中使用的FBS结构域可以包含所有环、所有β或β样链或它们的仅一部分，其中某些环和/或β样链和/或N末端或C末端区被修饰(或改变)，条件是FBS结构域优选地与靶标特异性地结合。例如，FBS结构域可以包含1、2、3、4、5或6个环，1、2、3、4、5、6、7或8条β链，以及任选的N末端和/或C末端区，其中相对于野生型FBS结构域，一个或多个环、一条或多条β链、N末端区和/或C末端区被修饰。
基于人10Fn3结构域的FBS蛋白的例子是艾得奈可汀(Adnexus，Bristol-MyersSquibb的全资子公司)。艾得奈可汀是如下10Fn3分子，其中10Fn3结构域的CDR样环区、β链、N末端和/或C末端区已经被修饰以开发出能够与目标化合物结合的蛋白质。例如，美国专利号7,115,396描述了10Fn3结构域蛋白，其中BC、DE和FG环的改变产生高亲和力的TNFα结合物。美国专利号7,858,739描述了Fn3结构域蛋白，其中BC、DE和FG环的改变产生高亲和力的VEGFR2结合物。
如本文所用的10Fn3结构域的“区域”是指人10Fn3结构域的环(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β链(A、B、C、D、E、F和G)、N末端(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-7)或C末端(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基93-94)。
“支架区”是指人10Fn3结构域的任何非环区。支架区包括A、B、C、D、E、F和Gβ链以及N末端区(对应于SEQ ID NO:1的残基1-7的氨基酸)和C末端区(对应于SEQ ID NO:1的残基93-94的氨基酸，并且任选地包含构成人纤连蛋白中Fn3结构域的第10个与第11个重复之间的天然接头的7个氨基酸)。
在某些实施方案中，FBS部分是基于Fn3重复，而不是纤连蛋白(例如，人纤连蛋白)的III型结构域的第10个重复。例如，FBS部分可以类似于任何其他纤连蛋白III型重复，例如第1个、第2个、第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个、第11个、第12个、第13个、第14个、第15个、第16个、第17个和第18个Fn3重复。在又其他实施方案中，FBS部分可以来自除纤连蛋白以外的分子。示例性FBS部分可以源自腱生蛋白，腱生蛋白是一种由15个Fn3结构域(如在纤连蛋白中发现的彼此具有类似的序列相似性)构成的蛋白质。例如在Jacobs等人,Protein Engineering,Design&Selection,25:107(2012)中描述了这些重复。基于纤连蛋白分子中的重复和腱生蛋白分子中的重复的同源性，已经产生了基于这些同源性的人工分子。包含基于纤连蛋白分子中结构域的同源性的共有氨基酸序列的蛋白质称为Fibcon和FibconB(WO 2010/093627和Jacobs等人(2012)同上)，并且包含基于腱生蛋白分子中结构域的同源性的共有氨基酸序列的蛋白质称为Tencon(WO 2010/051274、WO 2010/051310和WO 2011/137319，将其通过引用明确并入本文)。Fibcon、FibconB或Tencon部分或其靶结合变体(无论是自身还是与异源部分连接)可以如本文所述的融合。来自其他蛋白质(例如，细胞表面激素和细胞因子受体、伴侣蛋白和碳水化合物结合结构域)的Fn3结构域可以如本文所述的缀合。
可以使用本领域公认的方法产生和测试对任何所需靶分子具有特异性的FBS蛋白。用于测试FBS蛋白的结合特性的方法也是众所周知的。例如，一种快速制备和测试具有特定结合特性的Fn3结构域的方式是Bristol-Myers Squibb研发公司Adnexus的核酸-蛋白质融合技术。本公开文本利用称为“PROfusion”的体外表达和标记技术，其利用核酸-蛋白质融合物(RNA-蛋白质融合物和DNA-蛋白质融合物)来鉴定对与蛋白质结合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术是一种将蛋白质与其编码遗传信息共价地联系起来的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，参见Szostak等人,美国专利号6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018和6,818,418；Roberts等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997；94:12297-12302；以及Kurz等人,Molecules,2000；5:1259-64，将其全部通过引用并入本文。
如本文所述，适用于在本文提供的方法中使用的FBS多肽包含如下Fn3结构域，其中一个或多个溶剂可及环已经被随机化或突变。在某些实施方案中，Fn3结构域是源自人纤连蛋白III型结构域的野生型第十个模块的Fn3结构域(10Fn3)：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:1)(94个氨基酸；AB、CD和EF环加下划线；核心10Fn3结构域以氨基酸9(“E”)开始且以氨基酸94(“T”)结束，并且对应于86个氨基酸的多肽)。核心野生型人10Fn3结构域如SEQ ID NO:2所示。
变体和野生型两种10Fn3蛋白的特征在于相同的结构，即指定为A至G的七个β链结构域序列以及连接七个β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环和FG环)。最靠近N末端和C末端定位的β链可以在溶液中采用β样构象。在SEQ ID NO:1中，AB环对应于残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，并且FG环对应于残基75-87。
因此，在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的FBS多肽是与SEQ ID NO:1所示的人10Fn3结构域或如SEQ ID NO:2所示的其核心序列至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％相同的10Fn3多肽。许多变异性通常将发生在一个或多个环或者一条或多条β链或者N末端或C末端区中。10Fn3多肽的每条β或β样链基本上由与SEQ IDNO:1或2的相应β或β样链的序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列组成，条件是这种变化不会破坏多肽在生理条件下的稳定性。
在某些实施方案中，选自BC、DE和FG的一个或多个环的长度可以相对于相应的人纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在一些实施方案中，环的长度可以减少1-11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，10Fn3的环的长度可以在长度和序列上改变，以在抗原结合中获得最大可能的柔性和亲和力。
在某些实施方案中，FBS多肽包含含有非环区的氨基酸序列的Fn3结构域，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2的非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，其中选自BC、DE和FG的至少一个环被改变。在一些实施方案中，被改变的BC环具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，多达1、2、3或4个氨基酸缺失，多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入，或其组合。
在一些实施方案中，整合素结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ IDNO:1的氨基酸78-80)的一个或多个残基可以被取代以便破坏整合素结合。在一些实施方案中，本文提供的多肽的FG环不含RGD整合素结合位点。在一个实施方案中，RGD序列被极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(在N末端到C末端方向上)替代。在一些实施方案中，RGD序列被SGE替代。在一个实施方案中，RGD序列被RGE替代。
在某些实施方案中，FBS多肽包含通常通过以下序列定义的10Fn3结构域：EVVAA(Z)aLLISW(Z)xYRITY(Z)bFTV(Z)yATISGL(Z)cYTITVYA(Z)zISINYRT(SEQ ID NO:3)
其中AB环由(Z)a表示，CD环由(Z)b表示，EF环由(Z)c表示，BC环由(Z)x表示，DE环由(Z)y表示，并且FG环由(Z)z表示。Z表示任何氨基酸，并且Z后面的下标表示氨基酸数量的整数。特别地，a可以是从1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2个氨基酸；并且b、c、x、y和z可以各自独立地是从2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7个氨基酸。相对于SEQ ID NO:1或2所示的相应氨基酸，在所有7个支架区中，β链的序列可以具有从0至10、从0至8、从0至6、从0至5、从0至4、从0至3、从0至2或从0至1个取代、缺失或添加。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或2所示的相应氨基酸，在所有7个支架区中，β链的序列可以具有从0至10、从0至8、从0至6、从0至5、从0至4、从0至3、从0至2或从0至1个保守取代。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，并且任何取代、保守取代、缺失或添加发生在除核心氨基酸残基以外的残基处。
A.N末端和/或C末端区中的修饰
在某些实施方案中，本文提供的多肽的N末端和/或C末端区的氨基酸序列可以通过相对于野生型人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1或2)的相应区域的氨基酸序列的缺失、取代或插入来修饰。10Fn3结构域通常以SEQ ID NO:1的氨基酸编号1开始。然而，本发明也涵盖具有氨基酸缺失的结构域。另外的序列也可以添加到具有SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的10Fn3结构域的N末端或C末端。例如，在一些实施方案中，N末端延伸由选自以下的氨基酸序列组成：M、MG和G。在某些实施方案中，MG序列可以置于由SEQ ID NO:1定义的10Fn3的N末端。M通常将被切割掉，从而在N末端留下G。另外，M、G或MG也可以置于表3中所示的任何N末端延伸的N末端。
在示例性实施方案中，长度为从1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸的替代N末端区可以添加到SEQ ID NO:1或2或者表3中列出的任何艾得奈可汀的N末端区。示例性替代N末端区包括(由单字母氨基酸密码表示)M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:574)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:575)。其他合适的替代N末端区(其可以例如与艾得奈可汀核心序列的N末端连接)包括例如XnSDVPRDL(SEQ ID NO:576)、XnDVPRDL(SEQ ID NO:577)、XnVPRDL(SEQ ID NO:578)、XnPRDL(SEQ ID NO:579)、XnRDL(SEQ ID NO:580)、XnDL(SEQ IDNO:581)或XnL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，并且当n＝2时，X是Met-Gly。当将Met-Gly序列添加到10Fn3结构域的N末端时，M通常将被切割掉，从而在N末端留下G。在一些实施方案中，替代N末端区包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO:582)。
在示例性实施方案中，长度为从1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸的替代C末端区可以添加到SEQ ID NO:1或2或者表3中列出的任何FBS多肽的C末端区。替代C末端区序列的具体例子包括例如包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的多肽：EIEK(SEQ ID NO:584)、EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIEKPSQ(SEQID NO:587)、EIEKP(SEQ ID NO:588)、EIEKPS(SEQ ID NO:589)或EIEKPC(SEQ ID NO:590)。在一些实施方案中，替代C末端区包含EIDK(SEQ ID NO:591)，并且在特定实施方案中，替代C末端区是EIDKPCQ(SEQ ID NO:592)或EIDKPSQ(SEQ ID NO:593)。另外的合适的替代C末端区如SEQ ID NO:594-618所示。
在某些实施方案中，FBS多肽与包含E和D残基的C末端延伸序列连接，并且长度可以在8与50、10与30、10与20、5与10以及2与4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾序列包括基于ED的接头，其中序列包含ED的串联重复。在示例性实施方案中，尾序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾序列还可以包括另外的氨基酸残基，例如像：EI、EID、ES、EC、EGS和EGC。此类序列部分地是基于已知的艾得奈可汀尾序列，如EIDKPSQ(SEQ ID NO:593)，其中残基D和K已经被去除。在示例性实施方案中，基于ED的尾在ED重复之前包含E、I或E1残基。
在某些实施方案中，N末端或C末端延伸序列与具有已知接头序列(例如，表3中的SEQ ID NO:629-678)的FBS多肽连接。在一些实施方案中，序列可以置于10Fn3结构域的C末端以促进药代动力学部分的附接。例如，含半胱氨酸的接头如GSGC(SEQ ID NO:638)可以添加到C末端以促进在半胱氨酸残基上进行定点PEG化。
在某些实施方案中，可以与C末端氨基酸RT(即，氨基酸94)连接的替代C末端部分包含氨基酸PmXn，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。在某些实施方案中，替代C末端部分包含氨基酸PC。在某些实施方案中，替代C末端部分包含氨基酸PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ ID NO:605)、PIEK(SEQ ID NO:606)、PIDKP(SEQID NO:607)、PIEKP(SEQ ID NO:608)、PIDKPS(SEQ ID NO:609)、PIEKPS(SEQ ID NO:610)、PIDKPC(SEQ ID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:613)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:614)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:615)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)、PHHHHHH(SEQ IDNO:617)和PCHHHHHH(SEQ ID NO:618)。在实施例和表4中提供了在其C末端具有PC的示例性抗PD-L1艾得奈可汀。
在某些实施方案中，本文所述的FBS多肽具有6X his尾(SEQ ID NO:619)。
在某些实施方案中，FBS多肽包含具有替代N末端区序列和替代C末端区序列两者的10Fn3结构域以及任选的6X his尾。
B.融合物，包括药代动力学部分
在某些实施方案中，例如包含FBS蛋白(或一般地，任何抗原结合蛋白)的成像剂与以小增量调节(例如，增加)其血液PK的部分连接，以增强放射性标记的成像剂和/或治疗剂的成像对比度或增加其亲合力。在一些实施方案中，相对于未修饰的FBS蛋白，多肽在哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人)中的清除率大于两倍、大于三倍、大于四倍或大于五倍，或者增加了大于两倍、大于三倍、大于四倍或大于五倍。减慢蛋白质从血液中的清除的部分(在本文中称为“PK部分”)包括聚氧化烯部分(例如，聚乙二醇)、糖(例如，唾液酸)和耐受性良好的蛋白质部分(例如，Fc及其片段和变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。FBS蛋白也可以与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合，如美国公开号2007/0048282中所述，或者可以与一种或多种血清白蛋白结合FBS蛋白融合，如本文所述。
可以在本发明中使用的其他PK部分包括通过引用并入本文的Kontermann等人(Current Opinion in Biotechnology 2011；22:868-76)中描述的PK部分。此类PK部分包括但不限于人血清白蛋白融合物、人血清白蛋白缀合物、人血清白蛋白结合物(例如，Adnectin PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(即，基于脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸三种氨基酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉(HES))、糖基化物、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。
在一些实施方案中，本发明提供了与作为聚合糖的PK部分融合的放射性标记的FBS蛋白。在一些实施方案中，PK部分是聚乙二醇部分。PEG是一种众所周知的水溶性聚合物，其可商购获得或者可以根据本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138-161页)。
术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或PEG末端的修饰，并且可以由下式表示：X—O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n是2或更大(例如，20至2300)，并且X是H或末端修饰(例如，C1-4烷基)。PEG可以含有其他化学基团，所述化学基团是结合反应所必需的，是由分子的化学合成产生的，或者充当分子部分的最佳距离的间隔子。另外，这种PEG可以由连接在一起的一条或多条PEG侧链组成。具有多于一条PEG链的PEG称为多臂或支链PEG。支链PEG描述于例如欧洲公开申请号473084A和美国专利号5,932,462中。
一个或多个PEG分子可以附接在蛋白质上的不同位置，并且这种附接可以通过与胺、硫醇或其他合适的反应基团的反应来实现。胺部分可以是例如在多肽的N末端发现的伯胺或存在于氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)中的胺基。在一些实施方案中，PEG部分附接在多肽上的选自以下的位置：a)N末端；b)N末端与最N末端β链或β样链之间；c)位于与靶结合位点相对的多肽表面上的环；d)C末端与最C末端β链或β样链之间；以及e)C末端。
PEG化可以通过定点PEG化来实现，其中将合适的反应基团引入蛋白质中以产生PEG化优先发生的位点。在一些实施方案中，蛋白质被修饰以在所需位置引入半胱氨酸残基，从而允许在半胱氨酸上进行定点PEG化。可以将突变引入蛋白质编码序列中以产生半胱氨酸残基。例如，这可以通过将一个或多个氨基酸残基突变为半胱氨酸来实现。用于突变为半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其他亲水性残基。优选地，待突变为半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。用于基于一级序列或蛋白质预测残基的表面可及性的算法是本领域众所周知的。可替代地，可以通过比较结合多肽的氨基酸序列来预测表面残基，因为已经解决了设计和开发结合多肽所基于的框架的晶体结构(参见Himanen等人,Nature 2001；414:933-8)，因此鉴定了表面暴露的残基。半胱氨酸残基的PEG化可以使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-邻二硫吡啶来进行。
通常用适合与多肽上的所需位点偶联的合适的活化基团活化PEG。PEG方法是本领域众所周知的，并且进一步描述于Zalipsky,S.等人,"Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides"Polyethylene GlycolChemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992)以及Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16:157-182中。
PEG的分子量可能变化很大，并且可以是支链的或直链的。通常，PEG的重均分子量为从约100道尔顿至约150,000道尔顿。PEG的示例性重均分子量包括约1,000道尔顿、约2,000道尔顿、约5,000道尔顿、约10,000,道尔顿、约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。在某些实施方案中，PEG的分子量为约5,000道尔顿。也可以使用具有前述任一种总分子量的支链形式的PEG。在一些实施方案中，PEG具有两个分支。在其他实施方案中，PEG具有四个分支。在一个实施方案中，PEG是双PEG(NOF Corporation，DE-200MA)。
与抗体类似，如果需要的话，FBS多肽的选择性PEG化可以用于微调(以增量增加)FBS多肽的半衰期。
本领域已知的常规分离和纯化技术可以用于纯化PEG化的FBS蛋白，所述技术如尺寸排阻(例如，凝胶过滤)和离子交换色谱。也可以使用SDS-PAGE分离产物。可以分离的产物包括单PEG化的、二PEG化的、三PEG化的、多PEG化的和未PEG化的FBS多肽以及PEG游离的FBS多肽。可以通过合并洗脱峰周围较宽的级分来控制单PEG缀合物的百分比，以增加组合物中单PEG的百分比。约90％的单PEG缀合物代表产率和活度的良好平衡。
在某些实施方案中，例如，当在PET成像中使用时，FBS多肽合意地具有短的半衰期。在某些实施方案中，FBS多肽在血液或血清中的半衰期为30分钟至3小时、30分钟至120分钟、60分钟至120分钟或80分钟至100分钟。在某些实施方案中，FBS多肽的半衰期类似于它所附接的放射性标记的半衰期。
C.靶标
结合本文所述的放射性标记的FBS多肽成像剂和治疗剂的示例性体内靶分子是与希望杀死某些细胞的各种疾病或病症相关的分子，所述疾病或病症如恶性疾病、心血管疾病、感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病或神经系统疾病。本文提供了包含如下FBS多肽或抗原结合蛋白的放射性标记的成像剂和放射治疗剂，所述FBS多肽或抗原结合蛋白与靶分子(如人细胞表面上的靶蛋白)特异性地结合。在某些实施方案中，FBS多肽包含人10Fn3结构域。在某些实施方案中，FBS多肽或抗原结合蛋白与细胞表面分子(例如，肿瘤细胞上的细胞表面分子)结合。
为了治疗癌症，位于肿瘤细胞上并且优选地通常不存在于健康细胞上的任何抗原都可以用作本文所述的放射成像剂和放射治疗剂的靶标。一种这样的抗原是PD-L1。其他抗原包括任何肿瘤抗原，如针对其制备抗体药物缀合物的肿瘤抗原。示例性靶标包括：MUC1、MUC16、EGFR、EphB2、EphA、Eph-A4和PMSA、AXL激酶抗原66、CD20、CD22、CD30、CD33、PTK7、CD123、5T4、Her2和CD56。
可以通过使用本领域技术人员已知的标准程序鉴定与特定靶标结合的FBS多肽。一种快速制备和测试具有特定结合特性的Fn3结构域的方式是Bristol-Myers Squibb研发公司Adnexus的核酸-蛋白质融合技术。本公开文本利用称为“PROfusion”的体外表达和标记技术，其利用核酸-蛋白质融合物(RNA-蛋白质融合物和DNA-蛋白质融合物)来鉴定对与蛋白质结合重要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术是一种将蛋白质与其编码遗传信息共价地联系起来的技术。关于RNA-蛋白质融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，参见Szostak等人,美国专利号6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018和6,818,418；Roberts等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997；94:12297-12302；以及Kurz等人,Molecules,2000；5:1259-64，将其全部通过引用并入本文。
示例性FBS蛋白或部分包括但不限于与间皮素、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、TL1A、CD8、肌生成抑制蛋白、LPA1受体、TNF-α、VEGFR2、PCSK9、IL-23、EGFR或IGF1R结合的FBS蛋白或部分，以及描述于例如WO 2010/093627、WO 2011/130324、WO 2009/083804、WO 2009/133208、WO 02/04523、WO 2012/016245、WO 2009/023184、WO 2010/051310、WO 2011/020033、WO2011/051333、WO 2011/051466、WO 2011/092233、WO 2011/100700、WO 2011/130324、WO2011/130328、WO 2011/137319、WO 2010/051274、WO 2009/086116、WO 09/058379、WO2013/067029和WO 2012/016245(将其全部通过引用明确并入本文)中的FBS蛋白或部分；这些公开案中描述的任何FBS蛋白或部分都可以如本文所述的使用。
D.PD-L1 FBS多肽
在某些实施方案中，在本文提供的方法中使用的FBS多肽与PD-L1结合。PD-L1过表达与多种癌症(特别是乳腺癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、血液癌症和黑色素瘤、膀胱癌、三阴性乳腺癌)的预后较差相关。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含人10Fn3结构域。在一些实施方案中，人10Fn3结构域可以包含如SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环中的至少一个被改变。如上所述，对应于SEQ ID NO:1的残基23-31、51-56和75-87的氨基酸残基分别定义了BC、DE和FG环。然而，应当理解的是，并非环区内的每个残基都需要被修饰以便获得对所需靶标(例如，PD-L1)具有强亲和力的10Fn3结合物。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:21、22和23所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:21、22和23的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:36、37和38所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:51、52和53所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:51、52和53的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:66、67和68所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:66、67和68的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:6、7和8所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:81、82和83所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:81、82和83的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环具有分别与SEQ ID NO:97、98和99所示的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含SEQ ID NO:3所示的序列，其中分别如由(Z)x、(Z)y和(Z)z表示的BC、DE和FG环包括具有以下的氨基酸序列的BC、DE和FG环：分别地，SEQ ID NO:113、114和115；分别地，SEQ ID NO:124、125和126；分别地，SEQ ID NO:135、136和137；分别地，SEQ ID NO:146、147和148；分别地，SEQ ID NO:157、158和159；分别地，SEQ ID NO:168、169和170；分别地，SEQ ID NO:179、180和181；分别地，SEQ ID NO:190、191和192；分别地，SEQ ID NO:201、202和203；分别地，SEQ ID NO:212、213和214；分别地，SEQID NO:223、224和225；分别地，SEQ ID NO:234、235和236；分别地，SEQ ID NO:245、246和247；分别地，SEQ ID NO:256、257和258；分别地，SEQ ID NO:267、268和269；分别地，SEQ IDNO:278、279和280；分别地，SEQ ID NO:289、290和291；分别地，SEQ ID NO:300、301和302；分别地，SEQ ID NO:311、312和313；分别地，SEQ ID NO:322、323和324；分别地，SEQ ID NO:333、334和335；分别地，SEQ ID NO:344、345和346；分别地，SEQ ID NO:355、356和357；分别地，SEQ ID NO:366、367和368；分别地，SEQ ID NO:377、378和379；分别地，SEQ ID NO:388、389和390；分别地，SEQ ID NO:399、400和401；分别地，SEQ ID NO:410、411和412；分别地，SEQ ID NO:421、422和423；分别地，SEQ ID NO:432、433和434；分别地，SEQ ID NO:443、444和445；分别地，SEQ ID NO:454、455和456；分别地，SEQ ID NO:465、466和467；分别地，SEQID NO:476、477和478；分别地，SEQ ID NO:487、488和489；分别地，SEQ ID NO:498、499和500；分别地，SEQ ID NO:509、510和511；分别地，SEQ ID NO:520、521和522；分别地，SEQ IDNO:531、530和531；分别地，SEQ ID NO:542、543和544；分别地，SEQ ID NO:553、554和555；或者分别地，SEQ ID NO:564、565和566。相对于SEQ ID NO:3的支架氨基酸残基，此类抗PD-L1 FBS多肽的支架区可以包含从0至20、从0至15、从0至10、从0至8、从0至6、从0至5、从0至4、从0至3、从0至2或从0至1个取代、保守取代、缺失或添加。可以进行此类支架修饰，只要抗PD-L1 FBS多肽能够以所需KD结合PD-L1即可。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽的BC环包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:6、21、36、51、66、81和97。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽的DE环包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:7、22、37、52、67、82和98。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽的FG环包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:8、23、38、53、68、83和99。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别与以下中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的BC、DE和FG环氨基酸序列：SEQ IDNO:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；以及8、23、38、53、68、83和99。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含与以下中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552和563。
在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 FBS多肽包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含与以下中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、6975、84-91、100-107、116-122、127-133、138-144、150-155、160-166、171-177、182-188、193-199、204-210、215-221、227-232、237-243、248-254、259-265、271-276、291-287、292-298、303-309、314-320、325-331、337-342、347-353、358-364、369-375、380-386、391-397、402-408、413-419、424-430、435-441、446-452、457-463、468-474、479-485、490-496、501-507、512-518、523-529、534-540、545-551和556-562。在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1 FBS多肽包含与以下中的任一个的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9-15、24-30、39-45、54-60、6975、84-91和100-107。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:6、7和8所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:21、22和23所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:36、37和38所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:51、52和53所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:66、67和68所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:81、82和83所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含分别如SEQ ID NO:97、98和99所示的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，将本文所述的BC、DE和/或FG环氨基酸序列(例如，分别为SEQID NO:6、21、36、51、66、81和97；7、22、37、52、67、82和98；以及8、23、38、53、68、83和99)移植到非10Fn3结构域蛋白支架中。例如，一个或多个环氨基酸序列被交换为或插入抗体重链或轻链或其片段的一个或多个CDR环中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸环序列被交换或插入其中的蛋白质结构域包括但不限于共有Fn3结构域(Centocor，美国)、锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners AG，瑞士苏黎世)、结构域抗体(Domantis,Ltd，马萨诸塞州剑桥)、单结构域骆驼纳米抗体(Ablynx，比利时)、脂质运载蛋白(例如，抗运载蛋白(anticalin)；Pieris Proteolab AG，德国弗赖辛)、Avimer(Amgen，加利福尼亚州)、亲和体(affibody)(Affibody AG，瑞典)、泛素(例如，affilin；Scil Proteins GmbH，德国哈勒)、蛋白质表位模拟物(Polyphor Ltd，瑞士阿尔施维尔)、螺旋束支架(例如，alphabody，Complix，比利时)、Fyn SH3结构域(Covagen AG，瑞士)或atrimer(Anaphor,Inc.，加利福尼亚州)。
在一些实施方案中，FBS多肽以10nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，如例如通过SPR(Biacore)所确定的，并且展现出以下特性中的一种或多种：
1.将人PD-L1与人PD-1之间的相互作用抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如使用人PD-1Fc蛋白和人PD-L1阳性细胞(如L2987细胞)例如通过流式细胞术所确定的；
2.将人CD80(B7-1)与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定或通过SPR(Biacore)所确定的；
3.将抗PD-L1抗体12A4(描述于例如美国专利号7,943,743中)与人PD-L1的结合抑制至少50％、70％、80％、90％或更多，如例如在ELISA测定或通过SPR(Biacore)所确定的；以及
4.在混合淋巴细胞反应(MLR)中抑制细胞增殖。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且展现出特性1-4中的每一种。在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且展现出特性1-4中的每一种。
本文提供了FBS多肽，所述FBS多肽包含与本文所述的抗PD-L1 FBS多肽或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以10nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含与本文所述的抗PD-L1 FBS多肽或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且展现出特性1-4中的每一种。在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽包含与本文所述的抗PD-L1 FBS多肽或其部分(例如，BC、DE和FG环)至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，以0.1nM或更小的KD与人PD-L1结合，并且展现出特性1-4中的每一种。
在某些实施方案中，抗PD-L1 FBS多肽与本文所述的特定抗PD-L1 FBS多肽竞争(例如，交叉竞争)与PD-L1结合。可以基于它们在标准PD-L1结合测定中竞争性地抑制本文所述的FBS多肽与PD-L1的结合的能力来鉴定此类具竞争性的FBS多肽。例如，可以使用标准ELISA测定，其中将重组PD-L1蛋白固定在板上，荧光标记FBS多肽之一，并且评价未标记的FBS多肽竞争掉标记的FBS多肽的结合的能力。
在某些实施方案中，可以进行竞争性ELISA形式，以确定两种抗PD-L1 FBS多肽是否结合PD-L1上的重叠FBS多肽结合位点。在一种形式中，将FBS多肽#1包被在板上，然后封闭并洗涤所述板。向此板中添加单独的PD-L1或与饱和浓度的FBS多肽#2一起预孵育的PD-L1。在合适的孵育期之后，将板洗涤并用多克隆抗PD-L1抗体(如生物素化的抗PD-L1多克隆抗体)探测，然后用链霉亲和素-HRP缀合物和标准四甲基联苯胺显影程序进行检测。如果在进行或不进行与FBS多肽#2一起预孵育的情况下的OD信号相同，则两种FBS多肽彼此独立地结合，并且它们的FBS多肽结合位点不重叠。然而，如果接受PD-L1/FBS多肽#2混合物的孔的OD信号低于接受单独的PD-L1的孔的OD信号，则证实FBS多肽#2的结合阻断FBS多肽#1与PD-L1的结合。
可替代地，通过表面等离子体共振(SPR，例如BIAcore)进行类似的实验。将FBS多肽#1固定在SPR芯片表面上，然后注射单独的PD-L1或与饱和浓度的FBS多肽#2一起预孵育的PD-L1。如果PD-L1/FBS多肽#2混合物的结合信号与单独PD-L1的结合信号相同或更高，则两种FBS多肽彼此独立地结合，并且它们的FBS多肽结合位点不重叠。然而，如果PD-L1/FBS多肽#2混合物的结合信号低于单独的PD-L1的结合信号，则证实FBS多肽#2的结合阻断FBS多肽#1与PD-L1的结合。这些实验的特点是使用饱和浓度的FBS多肽#2。如果PD-L1没有被FBS多肽#2饱和，则上述结论不成立。类似的实验可以用于确定任何两种PD-L1结合蛋白是否与重叠的FBS多肽结合位点结合。
上文例示的两种测定也可以以相反的顺序进行，其中固定FBS多肽#2，并且将PD-L1-FBS多肽#1添加到板中。可替代地，可以用单克隆抗体和/或可溶性受体-Fc融合蛋白替代FBS多肽#1和/或#2。
在某些实施方案中，可以使用HTRF夹心测定来确定竞争。
在某些实施方案中，具竞争性的FBS多肽是与本文所述的特定抗PD-L1 FBS多肽结合PD-L1上的相同FBS多肽结合位点的FBS多肽。诸如蛋白酶作图、突变分析、HDX-MS、X射线晶体学和二维核磁共振等标准作图技术可以用于确定FBS多肽是否与参考FBS多肽结合相同的FBS多肽结合位点或表位(参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。表位由用于定位它的方法来定义。例如，在某些实施方案中，PD-L1 FBS多肽或抗体与本文所述的PD-L1 FBS多肽之一结合相同的表位，如通过HDX-MS所确定的或如通过X射线晶体学所确定的。
具竞争性的候选抗PD-L1 FBS多肽可以将本文所述的抗PD-L1 FBS多肽与PD-L1的结合抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％，和/或它们的结合被抗PD-L1FBS多肽抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。可以使用上述方法之一确定竞争％。“竞争％”是在一种特定测定的背景下定义的。
E.纤连蛋白支架的产生
重组蛋白表达-载体和多核苷酸
本公开文本还包括编码本文所述的任何蛋白质的核酸序列。如本领域技术人员所理解的，由于第三碱基简并，几乎每个氨基酸都可以由编码核苷酸序列中的多于一种三重密码子表示。另外，微小的碱基对变化可能导致所编码的氨基酸序列中的保守取代，但是预期不会实质性地改变基因产物的生物活性。因此，可以在序列上稍微修饰编码本文所述的蛋白质的核酸序列，但是仍编码其各自的基因产物。编码本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀及其融合物的某些示例性核酸包括具有SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111所示的序列的核酸。
还考虑了核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:16-19、31-34、46-49、61-64、76-79、92-95和108-111至少50％(如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同，并且编码与PD-L1结合的蛋白质。在一些实施方案中，引入核苷酸取代以便不改变所得翻译的氨基酸序列。
可以化学合成编码本文所述的各种蛋白质或多肽中的任一种的核酸。可以选择密码子使用，以便改善细胞中的表达。这种密码子使用将取决于所选的细胞类型。已经为大肠杆菌(E.coli)和其他细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见例如：Mayfield等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(2003年1月21日)；Sinclair等人,Protein Expr.Purif.,26(I):96-105(2002年10月)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(2001年10月)；Makrides等人,Microbiol.Rev.,60(3):512-538(1996年9月)；以及Sharp等人,Yeast,7(7):657-678(1991年10月)。
核酸操作的一般技术描述于例如通过引用并入本文的Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Ausubel,F.等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenPublishing and Wiley-Interscience,New York(1987)和定期更新中。通常，将编码多肽的DNA与源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。此类调节元件包括转录启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。另外掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)以及有利于转化体识别的选择基因。
本文所述的蛋白质不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽优选地是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特定切割位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选地是由宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。用于在哺乳动物系统中产生多肽的示例性N末端前导序列是：METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:583)，其在表达后被宿主细胞去除。
对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如以下的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定的肠毒素II前导序列。
为了酵母分泌，天然信号序列可以被例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列或美国专利号5,631,144中描述的信号序列取代。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒gD信号。可以将此类前体区的DNA以符合阅读框的方式连接至编码蛋白质的DNA。
表达载体和克隆载体两者都含有使得载体能够在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米的质粒起点适用于酵母，并且多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于克隆哺乳动物细胞中的载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常只能使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。
表达载体和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基因编码如下蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型的缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物(例如，编码杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因)。
表达载体和克隆载体通常含有由宿主生物体识别并且与编码本文所述的蛋白质(例如，基于纤连蛋白的支架蛋白)的核酸可操作地连接的启动子。适于与原核宿主一起的启动子包括phoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(如tan启动子)。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于在细菌系统中使用的启动子还将含有与编码本文所述的蛋白质的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。真核细胞的启动子序列是已知的。事实上，所有真核基因都具有富AT区，它位于转录起始的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3’端添加poly A尾的信号。所有这些序列都被适当地插入真核表达载体中。
用于与酵母宿主一起使用的合适的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，所述其他糖酵解酶如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
在哺乳动物宿主细胞中自载体转录可以受到例如从病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、最优选猿猴病毒40(SV40))基因组获得的启动子、异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热休克启动子的控制，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
通常通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核细胞对编码本文所述的蛋白质的DNA的转录。现在已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常，将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧(late side)(bp 100-270)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧上的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强元件，还参见Yaniv,Nature,297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，在编码肽的序列的5’或3’的位置，但是优选地位于启动子的5’的位点。
在真核宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还将含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区和偶尔的3’非翻译区获得。这些区域含有在编码本文所述的蛋白质的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化的片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026和其中披露的表达载体。
重组DNA还可以包括可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆载体和表达载体可见于CloningVectors:A Laboratory Manual(Elsevier,New York(1985))，将其相关公开内容通过引用特此并入。
使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，这对于本领域技术人员而言将是清楚的。在本领域中已知多种用于将核酸引入宿主细胞中的方法，包括但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(其中载体是感染原)。
合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)。酵母(优选地来自酵母属(Saccharomyces)物种，如酿酒酵母(S.cerevisiae))也可以用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow等人(Bio/Technology,6:47(1988))综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备纯化的多肽。对于许多应用，本文所述的许多小尺寸的多肽将使得在大肠杆菌中表达成为优选的表达方法。然后从培养基或细胞提取物中纯化蛋白质。
F.蛋白质产生
本文还描述了细胞系，所述细胞系表达抗PD-L1艾得奈可汀或其融合多肽。可以使用本领域已知的标准技术(如本文所述的技术)来完成抗PD-L1艾得奈可汀的细胞系的产生和分离。
用本文所述的表达载体或克隆载体转化宿主细胞以产生蛋白质，并且在为了诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因而适当改良的常规营养培养基中进行培养。
也可以通过在例如原核细胞(例如，大肠杆菌)中产生艾得奈可汀而以去糖基化的形式获得本发明的艾得奈可汀。值得注意的是，当在体外测试时，本文所述的去糖基化形式的艾得奈可汀展现出与糖基化的艾得奈可汀相同的亲和力、效力和作用机制。
可以在多种培养基中培养用于产生本发明的蛋白质的宿主细胞。可商购获得的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((Minimal Essential Medium，MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基((Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，Ham等人,Meth.Enzymol.,58:44(1979)，Barites等人,Anal.Biochem.,102:255(1980)，美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502或美国专利号RE 30,985中描述的许多培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基都可以根据需要补充有激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包括本领域技术人员已知的任何其他必要的补充物。培养条件(如温度、pH等)是选择进行表达的宿主细胞先前所使用的条件，并且对于普通熟练技术人员而言将是清楚的。
也可以使用无细胞翻译系统产生本文所述的蛋白质。为此类目的，必须修饰编码多肽的核酸，以允许体外转录以产生mRNA，以及允许在被利用的特定无细胞系统(真核生物的，如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统；或原核生物的，如细菌无细胞翻译系统)中无细胞地翻译mRNA。
还可以通过化学合成(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,ThePierce Chemical Co.,Rockford,Ill.(1984)中描述的方法)产生本文所述的蛋白质。也可以通过化学合成产生对蛋白质的修饰。
可以通过蛋白质化学领域通常已知的蛋白质分离/纯化方法来纯化本发明的蛋白质。非限制性例子包括萃取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些的任何组合。在纯化之后，可以将多肽交换到不同的缓冲液中和/或通过本领域已知的多种方法中的任一种进行浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。
纯化的多肽是优选地至少85％纯的，或优选地至少95％纯的，最优选地至少98％纯的。无论纯度的确切数值如何，多肽对于用作药物产品都是足够纯的。
(i)高通量蛋白质生产(HTPP)
将克隆到HIS6标签上游的PET9d载体中的所选结合物转化到大肠杆菌BL21DE3plysS细胞中并接种在24孔形式的5ml含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中并且在37℃下生长过夜。制备新鲜的5ml LB培养基(50μg/mL卡那霉素)以用于通过从过夜培养物中抽吸200μl并将其分配到适当的孔中来进行诱导表达。使培养物在37℃下生长直到A6000.6-0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃下表达6小时，并且通过在4℃下以2750g离心10分钟进行收获。
将细胞沉淀(呈24孔形式)通过重悬在450μl裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5MNaCl、1x CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNA酶、2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中裂解，并且在室温下振荡1-3小时。使裂解物澄清化并通过转移到装有96孔的1.2ml捕获板的96孔Whatman GF/DUnifilter中重新堆放成96孔形式并且正压过滤。将澄清化的裂解物转移到已经用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑，pH 8.0)平衡的96孔镍或钴螯合板中，并且孵育5min。正压去除未结合的材料。用洗涤缓冲液#1(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)以0.3ml/孔将树脂洗涤两次。正压去除每次洗涤液。在洗脱之前，将每个孔用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤，孵育5min，并且正压丢弃此次洗涤液。通过将另外100μl洗脱缓冲液施加到每个孔中来洗脱蛋白质。在室温下孵育30分钟之后，将一个或多个板以200g离心5分钟，并且将洗脱的蛋白质收集在含有在洗脱之前添加到洗脱捕获板底部的5μl 0.5M MgCl2的96孔捕获板中。以野生型10Fn3结构域作为蛋白质标准品使用总蛋白测定对洗脱的蛋白质进行定量。
(ii)基于纤连蛋白的不溶性支架蛋白结合物的中规模表达和纯化
为了表达不溶性克隆，将一个或多个克隆、然后是HIS6标签克隆到pET9d(EMDBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥)载体中，并且在大肠杆菌HMS174细胞中进行表达。使用20ml接种物培养物(由单个铺板菌落产生)来接种1L含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃下生长直到A600 0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃下生长4小时，并且通过在4℃下以>10,000g离心30分钟进行收获。将细胞沉淀在-80℃下冷冻。使用均质器(IKA works)，将细胞沉淀在冰上重悬在25ml裂解缓冲液(20mM NaH2P04、0.5M NaCl、lx Complete蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA(Roche)、I mM PMSF，pH 7.4)中。使用型号M-l 10S(Microfluidics)通过高压均质化(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离不溶性级分。用20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)洗涤从裂解物的离心中回收的不溶性沉淀。将沉淀通过超声处理重新溶解在20mM磷酸钠/500M NaCl(pH 7.4)中的6.0M盐酸胍中，然后在37度下孵育1-2小时。将重新溶解的沉淀过滤至0.45μm，并且加载到用20mM磷酸钠/500M NaCl/6.0M胍(pH 7.4)缓冲液平衡的Histrap柱上。在加载之后，用相同的缓冲液将柱洗涤另外的25CV。用20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0MHCl胍(pH 7.4)中的50mM咪唑洗脱结合的蛋白质。通过用50mM乙酸钠/150mM NaCl(pH 4.5)透析使纯化的蛋白质重新折叠。
(iii)基于纤连蛋白的可溶性支架蛋白结合物的中规模表达和纯化
为了表达可溶性克隆，将一个或多个克隆、然后是HIS6标签克隆到pET9d(EMDBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥)载体中，并且在大肠杆菌HMS174细胞中进行表达。使用20ml接种物培养物(由单个铺板菌落产生)来接种1L含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃下生长直到A6000.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃下生长4小时，并且通过在4℃下以>10,000g离心30分钟进行收获。将细胞沉淀在-80℃下冷冻。使用均质器(IKA works)，将细胞沉淀在冰上重悬在25ml裂解缓冲液(20mM NaH2P04、0.5M NaCl、lx Complete蛋白酶抑制剂混合物-无EDTA(Roche)、I mM PMSF，pH 7.4)中。使用型号M-1 10S(Microfluidics)通过高压均质化(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离可溶性级分。经由0.45μm过滤器澄清上清液。将澄清过的裂解物加载到用20mM磷酸钠/500M NaCl(pH 7.4)预平衡的Histrap柱(GE)上。然后用25个柱体积的相同缓冲液，然后用20个柱体积的20mM磷酸钠/500MNaCl/25mM咪唑(pH7.4)，然后用35个柱体积的20mM磷酸钠/500M NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱。用15个柱体积的20mM磷酸钠/500M NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，将级分基于A2so处的吸光度合并并用lX PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)透析。通过以0.22μm过滤去除任何沉淀物。
G.生物化学/生物学表征
可以依据平衡常数(例如，解离常数KD)以及依据动力学常数(例如，缔合速率常数kon和解离速率常数koff)评估本文所述的蛋白质靶向分子与靶分子的结合。蛋白质靶向分子通常将以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM的KD与靶分子结合，但是可以容忍更高的KD值，其中koff足够低或者kon足够高。
用于确定蛋白质靶向分子的结合亲和力的示例性测定包括但不限于溶液相方法，如动力学排除测定(KinExA)(Blake等人,JBC 1996；271:27677-85；Drake等人,AnalBiochem 2004；328:35-43)、采用Biacore系统(瑞典乌普萨拉)的表面等离子体共振(SPR)(Welford等人,Opt.Quant.Elect 1991；23:1；Morton和Myszka,Methods in Enzymology1998；295:268)以及均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Newton等人,J Biomol Screen 2008；13:674-82；Patel等人,Assay Drug Dev Technol 2008；6:55-68)。
在某些实施方案中，可以采用Biacore系统实时监测生物分子相互作用，所述Biacore系统使用SPR来检测由于直到300nm远的表面的折射率变化而导致的玻璃支持物上的薄金膜表面处光的共振角的变化。Biacore分析生成缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和常数。通过使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore,Inc.)评估缔合和解离速率常数来获得结合亲和力。将生物传感器芯片激活，以用于靶标的共价偶联。然后将靶标稀释并注射到芯片上，以获得以固定的材料的响应单位表示的信号。由于以共振单位(RU)表示的信号与固定的材料的质量成比例，因此这代表了基质上固定的靶标密度的范围。在全局分析中同时拟合缔合和解离数据，以解出1:1双分子相互作用的净速率表达，从而产生kon、koff和Rmax(饱和时的最大响应)的最佳拟合值。根据SPR测量值作为koff/kon计算结合的平衡解离常数KD。
在一些实施方案中，本文所述的蛋白质靶向分子在SPR亲和力测定中展现出500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、15nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或者1nM或更小的KD。
应当理解的是，上文所述的测定是示例性的，并且本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，基于荧光的转移(FRET)、酶联免疫吸附测定和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定))都可以用于评估本文所述的蛋白质靶向分子的结合亲和力。
H.结合亲和力的体外测定
可以使用各种体外测定来鉴定结合并拮抗PD-L1的抗PD-L1艾得奈可汀。在某些实施方案中，测定是允许同时筛选多种候选艾得奈可汀的高通量测定。
用于确定抗PD-L1艾得奈可汀的结合亲和力的示例性测定包括但不限于溶液相方法，如动力学排除测定(KinExA)(Blake等人,JBC 1996；271:27677-85；Drake等人,AnalBiochem 2004；328:35-43)、采用Biacore系统(瑞典乌普萨拉)的表面等离子体共振(SPR)(Welford等人,Opt.Quant.Elect 1991；23:1；Morton和Myszka,Methods in Enzymology1998；295:268)以及均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Newton等人,J Biomol Screen 2008；13:674-82；Patel等人,Assay Drug Dev Technol 2008；6:55-68)。
在某些实施方案中，可以采用Biacore系统实时监测生物分子相互作用，所述Biacore系统使用SPR来检测由于直到300nm远的表面的折射率变化而导致的玻璃支持物上的薄金膜表面处光的共振角的变化。Biacore分析生成缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和常数。通过使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore,Inc.)评估缔合和解离速率常数来获得结合亲和力。将生物传感器芯片激活，以用于靶标的共价偶联。然后将靶标稀释并注射到芯片上，以获得以固定的材料的响应单位表示的信号。由于以共振单位(RU)表示的信号与固定的材料的质量成比例，因此这代表了基质上固定的靶标密度的范围。在全局分析中同时拟合缔合和解离数据，以解出1:1双分子相互作用的净速率表达，从而产生kon、koff和Rmax(饱和时的最大响应)的最佳拟合值。根据SPR测量值作为koff/kon计算结合的平衡解离常数KD。
在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀在实施例2中描述的SPR亲和力测定中所展现出的与人PD-L1的结合的KD为500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小、150nM或更小、100nM或更小、90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小、15nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或者1nM或更小。
应当理解的是，上文所述的测定是示例性的，并且本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，基于荧光的转移(FRET)、酶联免疫吸附测定和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定))都可以用于评估本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀的结合亲和力。
III.PD-L1抗体
在另一个方面，本文提供了用于在治疗和/或诊断方法中使用的放射性标记的抗PD-L1抗体及其抗原结合片段。本文还提供了使用抗PD-L1抗体及其抗原结合片段的治疗诊断剂。
“PD-L1抗体”是指与人PD-L1特异性地结合的抗体。用于如本文所述使用的PD-L1抗体包括在文献中描述的PD-L1抗体，如在US 7,943,743和WO 2013/173223中描述的PD-L1抗体。可以如本文所述使用的其他PD-L1抗体包括：阿特珠单抗(Roche；也称为MPDL3280A，RG7446；参见US 8,217,149；还参见Herbst等人(2013)J ClinOncol 31(增刊):3000)、度伐鲁单抗(durvalumab)(AstraZeneca；也称为IMFINZITM，MEDI-4736；参见WO 2011/066389)、阿维鲁单抗(avelumab)(Pfizer；也称为/>MSB-0010718C；参见WO 2013/079174)、STI-1014(Sorrento；参见WO 2013/181634)、CX-072(Cytomx；参见WO 2016/149201)、KN035(3D Med/Alphamab；参见Zhang等人,CellDiscov.7:3(2017年3月))、LY3300054(Eli Lilly Co.；参见例如，WO 2017/034916)、BGB-A333(BeiGene；参见Desai等人,JCO 36(15增刊):TPS3113(2018))和CK-301(CheckpointTherapeutics；参见Gorelik等人,AACR:Abstract 4606(2016年4月))。
在一些实施方案中，放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的三个VH CDR。在一些实施方案中，放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的三个CDR的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的CDR和VL的CDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是包含抗体12A4的VH和VL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，放射治疗剂是12A4。
在一些实施方案中，本文提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含如本文公开的放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是包含抗体12A4的VH的CDR和VL的CDR的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是包含抗体12A4的VH和VL的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是12A4。在一些实施方案中，用177Lu标记放射性标记的抗体12A4或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供了治疗诊断方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含用有效用于成像目的的放射性核素(如68Ga)标记的抗PD-L1抗体；以及放射治疗剂，所述放射治疗剂包含用有效用于此类治疗目的的放射性核素标记的抗PD-L1抗体，其中放射成像剂的PD-L1抗体和放射治疗剂的PD-L1抗体具有相同的抗原结合特异性。在权利要求中列出了具体实施方案。
在一个实施方案中，在放射成像剂和放射治疗剂中使用的PD-L1抗体是在实施例中使用的抗体12A4或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含用68Ga标记的抗体12A4或其抗原结合片段；以及放射治疗剂，所述放射治疗剂包含用177Lu标记的抗体12A4或其抗原结合片段。
抗体12A4是包含以下氨基酸序列的IgG4/S228P抗体：
用于用放射性核素标记蛋白质(如抗体，包括抗体片段)的各种方法是本领域已知的。在实施例中描述了示例性方法。其他方法包括以下。例如，可以使用NODAGA作为螯合剂用放射性核素(例如，68Ga和177Lu)标记蛋白质(例如，抗体)，如例如Wangler等人(2011)J.Nuclear Med.52(4)；586中所述。可以使用NOTA作为螯合剂用放射性核素(例如，68Ga和177Lu)标记蛋白质(例如，抗体)，如例如Bing等人(2015)Sci.Rep.5:8626中所述。还可以使用DOTA(如例如Rasaneh等人(2009)36:363中所述)或使用DTPA(如例如Dho等人ScientificReports 8(2018),Article number:8960中所述)用177Lu标记抗体。也可以在不使用螯合剂的情况下用放射性核素(例如，68Ga和177Lu)直接标记蛋白质(例如，抗体)，如例如Migliari等人(2017)Med Clin Arch 1:DOI:10.15761/MCA.1000116中所述。
在一些实施方案中，放射治疗剂是使用NODAGA作为螯合剂产生的[177Lu]-抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是使用NOTA作为螯合剂产生的[177Lu]-抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，放射治疗剂是使用DOTA作为螯合剂产生的[177Lu]-抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
IV.放射性标记
A.放射成像剂
可以用于标记本文提供的成像剂(例如，FBS多肽和抗原结合蛋白)的放射性核素包括适用于在放射成像技术(如PET或SPECT)中使用的任何放射性核素。例如，用于标记本文提供的放射成像剂的放射性核素通常具有足够长的半衰期，以允许放射性示踪剂分子的合成和分析、注射到患者体内、体内定位、从非靶组织清除以及产生清晰图像。
在一些实施方案中，放射性核素是β+发射体或γ-发射体。用于本文提供的成像剂的合适的放射性核素包括但不限于68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。在一些实施方案中，放射性核素选自68Ga、18F和64Cu。在一个实施方案中，放射性核素是68Ga。在一些实施方案中，使用177Lu作为用于成像的放射性核素，但是图像可能不如使用68Ga的图像清晰。
B.放射治疗剂
可以用于标记本文提供的放射治疗剂(例如，FBS多肽和抗原结合蛋白)的放射性核素包括适用于在放射疗法中使用的任何放射性核素，例如是细胞毒性的。在癌症的背景下，放射治疗性治疗可以减少癌细胞的数量，减少转移瘤的数量，减小肿瘤体积，增长预期寿命，诱导癌细胞的化疗或放射敏感性，抑制癌细胞附近的血管生成，抑制癌细胞增殖，抑制肿瘤生长，预防或减少转移，延长受试者的寿命，减少癌症相关的疼痛，和/或减少治疗后癌症的复发或再次发生。在特定实施方案中，治疗性治疗减少、延迟或预防进一步的转移发生。
合适的细胞毒性放射性核素包括但不限于β-发射体、α-发射体金属、俄歇发射体和发射辐射类型组合的放射性核素。在一些实施方案中，放射性核素选自90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。在某些实施方案中，放射治疗性FBS多肽(例如，抗PD-L1艾得奈可汀)或抗体包含177Lu。
C.螯合剂
在某些实施方案中，放射性药剂在一个或多个氨基酸残基处与靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)缀合。在某些实施方案中，一种或多种(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或更多数量)放射性核素可以存在于标记的多肽(例如，FBS多肽或抗原结合蛋白)中。
在一些实施方案中，放射性核素通过螯合剂与靶向剂附接(例如，参见美国专利8,808,665)。在一些实施方案中，螯合剂是双功能螯合(BFC)剂。已经广泛地综述了螯合剂和放射性核素的合适组合(例如，Price等人,Chem.Soc.Rev.43:260-290,2014)。本领域公认的用于用放射性核素标记多肽的方法包括例如在US 2014/0271467；Gill等人,NatureProtocols 2011；6:1718-25；Berndt等人Nuclear Medicine and Biology 2007；34:5-15；Inkster等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 2013；23:3920-6中描述的方法，将其内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，螯合剂是NOTA或其衍生物；衍生自三氮杂大环和四氮杂大环的甲基异羟肟酸(NOTHA 2和DOTHA 2)；1,4,7-三氮杂环壬烷-1-戊二酸-4,7-二乙酸(NODAGA)或其衍生物；二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或其衍生物；1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸(DOTA)及其衍生物；1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸(D03A)及其衍生物；3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)或其衍生物；1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)及其衍生物；1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及其衍生物；1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸(DOTMA)及其衍生物；1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸(D03MA)及其衍生物；N,N′,N″,N′″-四膦酸基甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)及其衍生物；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基甲基膦酸)(DOTMP)及其衍生物；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基苯基膦酸)(DOTPP)及其衍生物；或者N,N′-乙烯二-L-半胱氨酸或其衍生物。
在某些实施方案中，放射性核素经由双功能螯合(BFC)部分与靶向剂附接。可以在本文公开的放射性标记的组合物中使用的双功能螯合剂是可商购获得的(例如，SigmaAldrich；Click Chemistry Tools)，或者可以根据众所周知的化学反应合成。
在某些实施方案中，BFC是包含与靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团的环辛炔。环辛炔上的反应基团包括酯、酸、羟基、氨基氧基、马来酰亚胺、α-卤代酮和α-卤代乙酰胺。
在某些实施方案中，BFC选自基于环辛炔的试剂，包括但不限于DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、NODAGA、NOTA、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar和衍生物、NODASA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA和衍生物(DATA)、DBCO、DIBO、DFO、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、H5decapa、H6phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA和TRITA基螯合剂及其密切类似物和衍生物。
在某些实施方案中，螯合剂是DOTA。在一些实施方案中，螯合剂是NODOGA。在其他实施方案中，螯合剂是NOTA。
在某些实施方案中，环辛炔包含亲水性聚乙二醇(PEG)y间隔臂，其中y是从1至8的整数。在某些实施方案中，y是从2至6的整数。在某些实施方案中，y是4或5。
在一些实施方案中，螯合剂是含BFC的马来酰亚胺。在一些实施方案中，BFC是马来酰亚胺-DOTA、马来酰亚胺-NODGA或马来酰亚胺-NOTA，其可以经由靠近多肽的C末端的半胱氨酸残基与靶向部分(例如，FBS多肽或抗体)共价附接。
在某些实施方案中，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VHCDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是64Cu。
在某些实施方案中，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VH CDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是68Ga。
在某些实施方案中，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VHCDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是177Lu。
在某些实施方案中，螯合剂是DOTA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是DOTA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VH CDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是64Cu。
在某些实施方案中，螯合剂是DOTA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VH CDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是68Ga。
在某些实施方案中，螯合剂是DOTA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是DOTA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VHCDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是177Lu。
在某些实施方案中，螯合剂是NOTA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是64Cu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VH CDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是64Cu。
在某些实施方案中，螯合剂是NOTA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是68Ga。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VH CDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是68Ga。
在某些实施方案中，螯合剂是NOTA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂(例如，成像剂或治疗剂)包含FBS多肽或抗PD-L1多肽(例如，本文所述的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体)。在某些实施方案中，靶向剂是包含SEQ ID NO:80、88、96或104所示的氨基酸序列的抗PD-L1艾得奈可汀，螯合剂是NODAGA，并且放射性核素是177Lu。在某些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体，其包含(i)分别包含SEQ ID No:681、682和683的VHCDR1、CDR2和CDR3以及分别包含SEQ ID No:684、685和686的VL CDR1、CDR2和CDR3(即，12A4的CDR)或者(ii)包含SEQ ID NO:679的VH和包含SEQ ID NO:680的VL(即，12A4的VH和VL)；螯合剂是NODAGA；并且放射性核素是177Lu。
在某些实施方案中，放射成像剂是68Ga-NODAGA-FBS。在某些实施方案中，放射成像剂是68Ga-NODAGA-抗PD-L1艾得奈可汀。在某些实施方案中，放射成像剂是68Ga-DOTA-FBS。在其他实施方案中，放射成像剂是68Ga-DOTA-抗PD-L1艾得奈可汀。在其他实施方案中，放射成像剂是68Ga-NOTA-FBS。在仍其他实施方案中，放射成像剂是68Ga-NOTA-抗PD-L1艾得奈可汀。在一些实施方案中，靶向剂是抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体包含12A4的VH和VL。
在某些实施方案中，放射治疗剂是177Lu-DOTA-FBS。在某些实施方案中，放射治疗剂是177Lu-DOTA-抗PD-L1艾得奈可汀。在某些实施方案中，放射治疗剂是177Lu-NOTA-FBS。在某些实施方案中，放射治疗剂是177Lu-NOTA-抗PD-L1艾得奈可汀。
在特定实施方案中，本文提供的治疗诊断组合包含含有68Ga-DOTA-FBS的放射成像剂和含有177Lu-DOTA-FBS的放射治疗剂。在一个实施方案中，治疗诊断组合包含68Ga-DOTA-抗PD-L1艾得奈可汀和含有的177Lu-DOTA-抗PD-L1艾得奈可汀的放射治疗剂。
D.接头
在一些实施方案中，本文所述的放射成像剂和/或放射治疗剂的靶向FBS多肽可以与螯合剂直接连接。在替代实施方案中，FBS多肽经由连接分子与螯合剂连接。例如，为了提供“接头”的目的，还可以在FBS多肽的任一末端添加另外的残基，通过所述接头FBS多肽经由缀合部分(例如，螯合剂)与螯合剂共价连接。
肽接头通常是至少一个残基，并且可以是40个或更多的残基，更通常是1至10个残基。在一些实施方案中，肽接头含有甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。在一些实施方案中，接头可以是柔性肽接头。柔性肽接头的长度可以是约20个或更少的氨基酸。例如，肽接头可以含有约12个或更少的(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)氨基酸残基。在一些情况下，肽接头包含以下氨基酸中的两种或更多种：甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
示例性接头包括第IIA节中提供的N末端和C末端尾。在一些实施方案中，FBS多肽在C末端包含肽接头。在一些实施方案中，FBS多肽包括包含半胱氨酸残基或赖氨酸残基的肽接头。
在一些实施方案中，FBS多肽包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的肽接头：EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIEKPC(SEQ ID NO:590)、GSGC(SEQ ID NO:638)、PC、PIDKPC(SEQ ID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPCQ(SEQ IDNO:615)或PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)。
在特定实施方案中，FBS多肽包含C末端接头，所述C末端接头包含EIDKPCQ(SEQ IDNO:592)或PC、基本上由其组成或由其组成。
可替代地，连接分子可以包含非氨基酸部分。此类部分包括包含彼此连接的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物。非肽聚合物的例子包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共-聚(乙二醇/丙二醇)、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚膦腈、多糖、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸和肝素。通常，此类接头将具有从约1kDa至50kDa的分子量范围，这取决于特定的接头。例如，典型的PEG的分子量为约1至5kDa，并且聚乙二醇的分子量为约5kDa至50kDa、更优选约10kDa至40kDa。
V.配制品
进一步提供了组合物(例如，药物组合物)，所述组合物含有与药学上可接受的载体单独或一起配制的一种本文所述的靶向剂(例如，放射成像剂和/或放射治疗剂)或者本文所述的靶向剂(例如，放射成像剂和/或放射治疗剂)的组合。此类组合物可以包括一种本文所述的靶向剂或者(例如，两种或更多种不同的)本文所述的靶向剂的组合。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将18F标记的靶向剂包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。
本文所述的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理作用的盐(参见例如，Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及源自无毒有机酸(如脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的盐。碱加成盐包括源自碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)以及源自无毒有机胺(如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。
本文所述的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可以用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两种方式来确保防止微生物的存在。还可能令人希望的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本文所述的药物组合物中的用途。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
在制造和储存条件下，药物组合物通常必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，将优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过如下方式制备无菌可注射溶液：将18F标记的靶向剂以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后微过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所列举的成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的靶向剂的量将根据被治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的靶向剂的量通常将是组合物的产生可检测效果的量。通常，从百分比来说，此量的范围将从约0.01％至约99％的活性成分，优选从约0.1％至约70％、最优选从约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合。
VI.使用方法
A.组合检测和治疗方法
本文提供了检测和治疗受试者中的靶阳性细胞(例如，癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用本文提供的放射成像剂(例如，抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体或其片段)，以及检测成像剂，检测到的放射成像剂定义靶阳性细胞在受试者中的位置，然后施用对表达靶标的细胞具有细胞毒性的放射治疗剂。
本文提供的检测和治疗靶阳性细胞的方法允许定位疾病的部位和程度以及靶标表达的生物分布。放射成像剂还有助于确定待施用的最佳治疗剂量或活度，例如基于在肿瘤部位中测得的预期杀肿瘤剂量，以及用于监测对治疗的反应。
在某些实施方案中，本文提供的放射性标记的成像剂可以用于对表达所需靶标的细胞或组织(例如，表达PD-L1的肿瘤)进行成像。例如，以足以将放射性标记的成像剂摄取到目标组织(例如，表达PD-L1的肿瘤)中的量向受试者施用放射性标记的成像剂。然后使用成像系统(如PET)对受试者进行成像，持续适合被使用的特定放射性核素的时间量。然后通过成像系统检测表达放射性标记的成像剂结合的靶标的细胞或组织，例如表达PD-L1的肿瘤。
采用成像剂的PET成像可以用于定性地或定量地检测表达靶标(例如，PD-L1)的细胞。在某些实施方案中，使用放射成像剂作为生物标记，并且阳性信号在受试者中的存在或不存在指示例如受试者将对本文提供的相应放射治疗剂有反应。
在某些实施方案中，可以随时间或治疗的变化对疾病(例如，肿瘤)的进展或消退进行成像。例如，可以在接受用本文提供的放射治疗剂进行治疗的受试者中监测肿瘤的大小，并且可以基于对放射性标记的成像剂的检测来实时监测肿瘤的消退程度。还可以在治疗和/或疾病之前和/或期间可视化并监测放射成像剂在一个或多个肿瘤或健康细胞内的分布。
有效导致将本文提供的放射成像剂(例如，FBS多肽、抗PD-L1艾得奈可汀、抗PDL抗体或其片段)摄取到目标细胞或组织(例如，肿瘤)中的量可以取决于多种因素，包括例如宿主的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；所采用的特定探针的排泄率；治疗持续时间；与所采用的特定组合物组合使用或巧合使用的其他药物的存在；以及其他因素。
在某些实施方案中，用放射成像剂对表达靶标(例如，PD-L1)的组织进行放射成像是在施用放射治疗剂之前进行的。在某些实施方案中，在向受试者施用放射治疗剂之后施用放射成像剂，例如以监测放射疗法的功效。
在某些实施方案中，放射成像剂提供至少50％、75％或更高的对比度。
在某些实施方案中，使用本文所述的放射成像剂来通过如下方式检测受试者中的靶阳性细胞：向受试者施用本文公开的本文提供的放射成像剂(例如，抗PD-L1放射成像剂)，以及检测放射成像剂，检测到的放射成像剂定义靶阳性细胞在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层扫描检测成像剂。
通常，为了PET成像目的，令人希望的是作为单次静脉内输注向接受者提供在从约0.1mg至200mg范围内的剂量的放射成像剂，但是也可以根据情况施用更低或较更的剂量。对于典型的成人来说，可能令人希望的是为接受者提供在从约0.1mg至10mg/平方米体表面积的蛋白质或肽的范围内的剂量，但是也可以根据情况施用更低或较更的剂量。为了成像目的可以向人类受试者施用的蛋白质或肽的剂量的例子是10μg至1000μg、100μg至1000μg、100μg至500μg、200μg至500μg和300μg至400μg，但是可以使用更高或更低的剂量。例如，可以例如作为团注以范围从10μg至1000μg、100μg至1000μg、100μg至500μg、200μg至500μg和300μg至400μg的量向人施用68Ga标记的抗PD-L1艾得奈可汀(例如，[68Ga]-DOTA-A02)成像剂。
在某些实施方案中，施用以在0.005μg/kg体重至50μg/kg体重/天之间(例如，在0.02μg/kg体重至10μg/kg体重之间(例如，每天)、在0.1μg/kg体重至10μg/kg体重之间(例如，每天)、在1μg/kg体重至10μg/kg体重之间(例如，每天)、在2μg/kg体重至6μg/kg体重之间(例如，每天)或在4μg/kg体重至5μg/kg体重之间(例如，每天))的放射成像剂(例如，68Ga-抗PD-L1艾得奈可汀)的量进行。
调整剂量方案以提供最佳的可检测量，以获得摄取放射成像剂的组织或细胞的清晰图像。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和剂量的均匀。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待施用放射性标记的靶向剂的受试者的单一剂量的物理上离散的单位。本文所述的剂量单位形式的规格取决于并且直接依赖于(a)放射性标记的成像剂的靶向部分的独特特征；(b)待靶向的组织或细胞；(c)所使用的成像技术固有的限制。
在某些实施方案中，可以配制本文所述的放射性标记的成像剂以确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。药剂可以通过将它们配制在例如脂质体中而穿过BBB。关于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂质体可以包含选择性地转移到特定细胞或器官中从而增强靶向药物递送的一种或多种部分(参见例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)。
可以使用两种类型的PET程序。一种类型涉及获得示踪剂摄取的单个时间点估计值或提供区域示踪剂浓度的空间图的静态成像。对于静态成像，仅测量平均值(例如，标准化摄取值，SUV)。第二种类型称为动态示踪剂成像，它可以通过描绘示踪剂摄取的时间和空间模式两者来提供有关体内生物学的多得多的信息。参见例如，Muzi等人Magn ResonImaging.2012 30(9):1203–1215。
为了定量示踪剂摄取，临床医生可以在PET扫描上目视识别肿瘤病变，并且确定这些病变周围的感兴趣区域(ROI)。这些ROI中放射成像剂的摄取可以针对体重和注射剂量进行校正，并且定量为标准化摄取值(SUV最大值和SUV平均值)。
通过图像重构来获得断层图像。为了确定放射性示踪剂的分布，可以在重构的图像上绘制ROI，包括但不限于肺、肝脏、心脏、肾脏、皮肤或其他器官和组织(例如，癌症组织)。使用在这些区域中随时间的放射性示踪剂摄取来生成在不存在任何干预的情况下或在未标记的靶向剂的存在下在所检查的各种给药模式下获得的时间活度曲线(TAC)。数据可以表示为每单位体积每单位时间的放射性(μci/cc/mCi注射剂量)。
PET可以伴随低剂量或诊断性CT扫描，以用于解剖参考目的。
可替代地，在治疗之前的第一次扫描可以指示受试者在大多数肿瘤中不表达靶标(例如，PD-L1)，并且用如本文公开的放射治疗剂进行治疗将不成功。
在某些实施方案中，本文提供了如下方法，所述方法包括将在放射成像剂之后的第一时间点进行的PET扫描与在第二时间点和/或稍后的时间点(例如，在用本文提供的放射治疗剂进行治疗之后)进行的PET扫描进行比较。这种比较可以告知患者疾病的演变、患者对治疗的反应、患者的潜在不良反应或其他。
在某些实施方案中，怀疑受试者患有表达PD-L1的癌症，并且所述方法包括(a)以约3-10mCi(100-333MBq)的剂量向受试者施用PD-L1成像剂，例如68Ga标记的PD-L1艾得奈可汀成像剂；以及(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，其中在至少1、2、3、4或5个时间点进行步骤(a)和(b)，并且如果受试者在一个肿瘤中或在几个肿瘤中的PD-L1水平等于或高于治疗所需的水平，则向受试者施用如本文提供的抗PD-L1放射治疗剂。
本文提供了治疗患有PD-L1癌症的受试者的方法，所述方法包括(a)向受试者施用抗PD-L1放射成像剂；以及(b)在步骤(a)之后约1-120分钟(如30-120、30-60或60-120分钟)对受试者进行PET扫描，以确定一个肿瘤中或几个肿瘤中的PD-L1水平；以及(c)向受试者施用如本文提供的放射治疗剂。
本文还提供了监测放射疗法针对受试者的表达PD-L1的肿瘤的进展的方法，所述方法包括
(a)在第一时间点向有需要的受试者施用本文所述的抗PD-L1放射成像剂，并且获得受试者的至少一部分的图像以确定肿瘤的大小；
(b)向受试者施用本文所述的放射治疗剂(例如，放射性标记的抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段)；
(c)在一个或多个后续时间点向受试者施用放射成像剂，并且在每个时间点获得受试者的至少一部分的图像；
其中在每个时间点肿瘤的尺寸和位置指示疾病的进展。
本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括
(a)向有需要的受试者施用本文提供的放射成像剂，并且获得受试者的至少一部分的图像以确定PD-L1在一个或多个肿瘤中的存在；以及，如果在一种或多种肿瘤中检测到PD-L1，则，
(b)向受试者施用本文提供的放射治疗剂。
本文提供了监测抗肿瘤疗法针对受试者的表达PD-L1的肿瘤的进展的方法，所述方法包括
(a)在第一时间点向有需要的受试者施用包含抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的放射成像剂，并且获得受试者的至少一部分的图像以确定肿瘤的大小；
(b)向受试者施用包含抗PD-L1艾得奈可汀或抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的放射治疗剂；
(c)在一个或多个后续时间点向受试者施用放射成像剂，并且在每个时间点获得受试者的至少一部分的图像；其中在每个时间点肿瘤的尺寸和位置指示受试者对放射治疗剂的反应。
B.放射治疗方法
本文还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，将放射性标记的抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)与未放射性标记的抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)组合施用。
可以使用本文提供的放射性标记的PD-L1艾得奈可汀和/或抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)检测和/或治疗的癌症的非限制性例子是呈PD-L1阳性的癌症，并且基于WO2013/173223中披露的抗PD-L1免疫疗法的非常广泛的适用性的适应证，包括骨癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、去势抵抗性前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、胃肠道和乳腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的癌症)、转移性癌症和所述癌症的任何组合。PD-L1艾得奈可汀也适用于治疗转移性癌症。
可以使用本文所述的放射性标记的抗PD-L1艾得奈可汀和/或抗PD-L1抗体(及其抗原结合片段)治疗的示例性癌症包括MEL(例如，转移性恶性黑色素瘤)、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、卵巢癌(OV)、胃癌(GC)、乳腺癌(BC)、胰腺癌(PC)和食道癌。另外，本文所述的放射性标记的PD-L1艾得奈可汀和抗PD-L1抗体(及其抗原结合片段)也适用于在治疗难治性或复发性恶性肿瘤中使用。
C.组合疗法
在一些实施方案中，本公开文本涉及施用本文提供的放射治疗剂与另外的癌症治疗以用于治疗各种癌症的方法，所述另外的癌症治疗包括化疗方案、手术、激素剥夺和血管生成抑制剂。在一些实施方案中，将放射治疗剂与免疫原性剂和/或另一种免疫治疗性Ab(例如，抗CTLA-4、抗PD-Ll和/或抗LAG-3Ab)组合，所述免疫原性剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞(如携带肿瘤相关抗原的树突细胞)、用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞的制剂(He等人,2004)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原的肽(如gplOO、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶的肽)或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
VII.试剂盒和制品
本文所述的放射成像剂和/或放射治疗剂可以在试剂盒中提供，例如预定量的放射成像剂和放射治疗剂的包装组合(例如，在单独的容器中)与用于在本文所述的方法中使用的说明书。
例如，提供了制品，所述制品含有可用于检测和/或治疗本文所述的障碍或病症或者用于在本文所述的检测和/或治疗方法中使用的材料。制品包含一个或多个容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。
在一些实施方案中，制品包含用于产生如本文提供的放射治疗剂(例如，抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)或抗PD-L1艾得奈可汀)的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含放射性标记的抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)或放射性标记的抗PD-L1艾得奈可汀。在一些实施方案中，制品进一步包含未放射性标记的抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)或抗PD-L1艾得奈可汀。
在其他实施方案中，试剂盒包含用于在检测和治疗中使用的两种或更多种组分。在一些实施方案中，试剂盒可以容纳本文所述的用于体内成像的组合物，并且可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)，并且第二容器可以容纳本文所述的用于放射疗法的组合物。制品可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液)的容器。在一些实施方案中，制品还可以包含用于与放射治疗剂组合使用的未放射性标记的组合物。它可以进一步包括从商业和用户角度来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在某些实施方案中，试剂盒包含形成68Ga标记的抗PD-L1艾得奈可汀体内成像剂(如[68Ga]-DOTA-PD-L1艾得奈可汀)所必需的一种或多种试剂，如本文进一步描述的；以及形成177Lu标记的抗PD-L1艾得奈可汀放射治疗剂所必需的一种或多种试剂。试剂盒可以包含放射成像剂和放射治疗剂，但是不包含它们的放射性核素，或者至少不包含放射成像剂的放射性核素。
试剂盒可以进一步包含小瓶、溶液以及任选的制造放射性标记的成像剂和放射性标记的治疗剂所必需的另外的试剂，并且可以含有例如按照实施例中描述的方法完成药剂的合成的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂(例如，药学上可接受的载体)。在一些实施方案中，试剂盒包括待用于根据本文公开的方法产生标记的探针的反应前体。试剂盒的组分可以根据如本文所述的待监测的特定生物状况进行定制。试剂盒可以进一步包括本领域已知的用于向宿主细胞或宿主生物体施用上文所列组分的各种组合的适当的缓冲液和试剂。可以以溶液或以冻干形式提供成像剂和载体。当试剂盒的成像剂和载体呈冻干形式时，试剂盒可以任选地含有无菌且生理上可接受的重构介质，如水、盐水、缓冲盐水等。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。它可以进一步包括从商业和用户角度来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
通过引用并入
将本文所述的所有文献和参考文献(包括专利文献(例如，PCT/US15/62485和PCT/US15/62502)和网站)都在本文中通过引用单独且明确地并入本文件中，其程度如同将它们完整或部分地写入本文件一样。也将WO 2016086021、WO 2017/210302、WO 2016086036和WO/2017/210335的内容(特别是关于成像剂的章节)通过引用明确并入本文。
各种实施方案
下文提供了本发明的非限制性实施方案。
1.一种用于在诊断、监测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含与由所述癌症表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和放射性核素；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含所述FBS多肽和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的FBS多肽与所述靶标结合。
2.根据实施方案1所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的FBS多肽是相同的。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的组合，其中所述成像剂包含作为β+发射体或γ-发射体的放射性核素。
4.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
5.根据实施方案4所述的组合，其中所述成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、64Cu、86Y、44Sc或18F。
6.根据实施方案1所述的组合，其中所述成像剂包含68Ga。
7.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含作为β-发射体、α-发射体、俄歇发射体或其组合的放射性核素。
8.根据实施方案7所述的组合，其中所述放射治疗剂包含选自以下的放射性核素：90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
9.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含177Lu。
10.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过螯合剂与所述FBS多肽连接。
11.根据实施方案10所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂与所述放射治疗剂的螯合剂相同。
12.根据实施方案10或实施方案11所述的组合，其中所述螯合剂是环辛炔衍生物。
13.根据实施方案10-12中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是双功能螯合剂(BFC)。
14.根据实施方案10-13中任一项所述的组合，其中所述螯合剂包含与所靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。
15.根据实施方案14所述的组合，其中所述螯合剂经由在所述多肽的C末端附近的半胱氨酸残基与所述FBS多肽共价连接。
16.根据实施方案10-15中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
17.根据实施方案10-15中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
18.根据实施方案10-15中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
19.根据实施方案10-18中任一项所述的组合，其中所述螯合剂通过接头与所述FBS多肽共价附接。
20.根据实施方案19所述的组合，其中所述接头与所述FBS多肽的C末端附接。
21.根据实施方案19或实施方案20所述的组合，所述接头是选自以下的肽接头：EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:592)、EIEKPC(SEQID NO:590)、GSGC(SEQ ID NO:638)、PC、PIDKPC(SEQ ID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:615)或PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)。
22.根据实施方案21所述的组合，其中所述肽接头是PC。
23.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至68Ga的FBS多肽。
24.根据实施方案1-22中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODAGA结合至68Ga的FBS多肽。
25.根据实施方案1-22中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至68Ga的FBS多肽。
26.根据实施方案1-22中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至64Cu的FBS多肽。
27.根据实施方案1-22中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODOGA结合至64Cu的FBS多肽。
28.根据实施方案1-22中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至64Cu的FBS多肽。
29.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的FBS多肽。
30.根据实施方案1-28中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过NODAGA或NOTA与177Lu复合的FBS多肽。
31.根据前述实施方案中任一项所述的组合，其中所述FBS多肽包含与所述靶分子结合的人10Fn3结构域。
32.根据实施方案31所述的组合，其中所述10Fn3结构域与人PD-L1结合。
33.根据实施方案31所述的组合，其中与人PD-L1结合的所述10Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)所述10Fn3具有至少一个选自氨基酸序列相对于人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环的序列发生改变的环BC、DE和FG的环，并且(c)所述多肽与人PD-L1特异性地结合。
34.根据实施方案34所述的组合，其中所述10Fn3结构域以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM的KD与人PD-L1结合。
35.根据实施方案32-34中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；(d)分别地，SEQ ID NO:51、52和53；(e)分别地，SEQID NO:66、67和68；(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。
36.根据实施方案32-35中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQID NO:5、20、35、50、65、80或96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
37.根据实施方案36所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80、88、96或104至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
38.根据实施方案36所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80或88至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
39.根据实施方案32-37中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含SEQ IDNO:96或104。
40.根据前述实施方案中任一项所述的用于诊断、监测和治疗表达PD-L1的癌症的组合，其中所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含FBS多肽，所述FBS多肽包含含有SEQ ID NO:80、88、96或104(A02或E01艾得奈可汀)的人10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的C末端共价结合至包含氨基酸序列PC的接头；并且所述放射性核素是通过螯合剂与所述接头的半胱氨酸残基复合的68Ga；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽，所述FBS多肽包含含有SEQ ID NO:80、88、96或104(A02或E01艾得奈可汀)的人10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的C末端共价结合至包含氨基酸序列PC的接头；并且所述放射性核素是通过螯合剂与所述接头的半胱氨酸残基复合的177Lu。
41.根据实施方案40所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂包含相同的人10Fn3结构域。
42.根据实施方案40或实施方案41所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射成像剂的螯合剂是相同的。
43.根据实施方案42所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA。
44.根据实施方案42所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA。
45.根据实施方案42所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA。
46.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-45中任一项所述的放射成像剂。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-45中任一项所述的放射治疗剂。
48.一种用于在放射成像和放射疗法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含(a)基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽，其与靶标和适于放射成像的放射性核素的螯合剂结合；以及(b)FBS多肽，其与靶标和适于放射疗法的放射性核素的螯合剂结合，其中所述FBS多肽在(a)和(b)中是相同的，并且其中所述试剂盒含有使所述FBS多肽与所述放射性核素螯合的说明书。
49.根据实施方案48所述的试剂盒，其中用于放射成像的所述放射性核素选自68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
50.根据实施方案49所述的试剂盒，其中用于放射成像的所述放射性核素选自68Ga、64Cu、86Y、44Sc或18F。
50,根据实施方案49所述的试剂盒，其中用于放射成像的所述放射性核素是68Ga。
51.根据实施方案48-50中任一项所述的试剂盒，其中用于放射疗法的所述放射性核素选自90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
52.根据实施方案48-51中任一项所述的试剂盒，其中用于放射疗法的所述放射性核素是177Lu。
53.根据实施方案48-52中任一项所述的试剂盒，其中用于放射成像的所述放射性核素是68Ga，并且用于放射疗法的所述放射性核素是177Lu。
54.根据实施方案48-53中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是环辛炔衍生物。
55.根据实施方案48-53中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
56.根据实施方案48-53中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
57.根据实施方案48-53中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
58.根据实施方案48-57中任一项所述的试剂盒，其中(a)和(b)的所述螯合剂是相同的。
59.根据实施方案48-58中任一项所述的试剂盒，其中所述FBS多肽包含人10Fn3结构域。
60.根据实施方案59所述的试剂盒，所述试剂盒包含实施方案中任一项所述的组合与人PD-L1结合的人10Fn3结构域。
61.根据实施方案59所述的试剂盒，其中其中与人PD-L1结合的所述10Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)所述10Fn3具有至少一个选自氨基酸序列相对于人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环的序列发生改变的环BC、DE和FG的环，并且(c)所述多肽与人PD-L1特异性地结合。
62.根据实施方案61所述的试剂盒，其中所述10Fn3结构域的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；(d)分别地，SEQ ID NO:51、52和53；(e)分别地，SEQ ID NO:66、67和68；(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。
63.根据实施方案62所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:104至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
64.根据实施方案62所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:88至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
65.根据实施方案32-37中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含SEQ IDNO:88。
66.根据实施方案48-65中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种放射性核素。
67.根据实施方案66所述的试剂盒，其中所述一种或多种放射性核素是68Ga和177Lu。
68.一种诊断和治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与由癌细胞表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和适于放射成像的放射性核素；(b)获得所述受试者的全部或一部分的放射图像，以确定所述靶标在所述受试者中的存在；(c)施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽和适于放射疗法的放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂与相同的靶标结合。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂分别如实施方案1-47中任一项所定义。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂以监测所述受试者中的靶标水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的靶标水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
71.一种治疗患有表达PD-L1的癌症的受试者的方法，所述方法包括a.确定PD-L1在患有癌症的受试者中的存在，其包括向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与螯合剂和68Ga连接的FBS多肽，所述FBS多肽包含与人PD-L1结合的人10Fn3结构域，以及如果发现PD-L1存在于所述受试者的一个或多个肿瘤中，则b.向所述受试者施用与螯合剂和177Lu连接的FBS多肽，所述FBS多肽包含与人PD-L1结合的人10Fn3结构域。
72.一种用于在检测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1抗体和放射性核素；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的PD-L1抗体具有相同的抗原结合特异性。
73.根据实施方案72所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
74.根据实施方案73所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga。
75.根据实施方案72-74中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂的放射性核素是90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
76.根据实施方案75所述的组合，其中所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
77.根据实施方案72-76中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
78.根据实施方案72-77中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和/或所述放射治疗剂的放射性核素与所述PD-L1抗体直接连接。
79.根据实施方案72-78中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和所述放射治疗剂的放射性核素与所述PD-L1抗体直接连接。
80.根据实施方案72-77中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和/或所述放射治疗剂的放射性核素通过螯合剂与所述PD-L1抗体连接。
81.根据实施方案72-77中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和所述放射治疗剂的放射性核素通过螯合剂与所述PD-L1抗体连接。
82.根据实施方案80或81所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA、DOTA、NOTA或DTPA。
83.根据实施方案80-82中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂的螯合剂与所述放射治疗剂的螯合剂相同。
84.根据实施方案83所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA。
85.根据实施方案83所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA。
86.根据实施方案83所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA。
87.根据实施方案83所述的组合，其中所述螯合剂是DTPA。
88.根据实施方案83-87中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
89.根据实施方案83-87中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
90.根据实施方案83-87中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
91.根据实施方案83-87中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DTPA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
92.根据实施方案72-91中任一项所述的组合，其中所述抗体以10-7M、10-8M、10-9M或更小的KD与人PD-L1结合。
93.根据实施方案72-92中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和/或所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
94.根据实施方案93所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
95.根据实施方案72-94中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和/或所述放射治疗剂的抗体是抗原结合片段。
96.根据实施方案95所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体是抗体的抗原结合片段，并且所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
97.根据实施方案96所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体是抗体的抗原结合片段。
98.根据实施方案72-97中任一项所述的组合，其中所述抗原结合片段包含所述抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)。
99.根据实施方案72-98中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含至少95％相同的氨基酸序列。
100.根据实施方案99所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含至少97％相同的氨基酸序列。
101.根据实施方案100所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含至少98％相同的氨基酸序列。
102.根据实施方案101中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含99％相同的氨基酸序列。
103.根据实施方案72-102中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含相同的VH CDR1、CDR2和CDR3。
104.根据实施方案103所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含相同的VH CDR1、CDR2和CDR3以及相同的VL CDR1、CDR2和CDR3。
105.根据实施方案104所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含相同的VH和VL。
106.根据实施方案105中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或抗原结合片段是相同的，除了其中一种抗体的重链能够包含C末端半胱氨酸。
107.根据实施方案106所述的组合，其中所述抗原结合片段不包含CH2或CH3区。
108.根据实施方案72-107中任一项所述的组合，其中所述抗体包含抗体12A4的VHCDR和VL CDR。
109.根据实施方案72-108中任一项所述的组合，其中所述抗体包含抗体12A4的VH和VL。
110.根据实施方案72-94、99-106和108-109中任一项所述的组合，其中所述抗体包含抗体12A4的重链和轻链。
111.根据实施方案72所述的组合，其中(a)所述放射成像剂的放射性核素是68Ga；(b)所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu；并且其中所述放射成像剂的PD-L1抗体和所述放射治疗剂的PD-L1抗体包含抗体12A4的VH CDR1、CDR2、CDR3以及VL CDR2、CDR2和CDR3。
112.根据实施方案111所述的组合，其中所述放射成像剂的PD-L1抗体和所述放射治疗剂的PD-L1抗体包含12A4的VH和VL。
113.根据实施方案112所述的组合，其中所述放射成像剂的PD-L1抗体和所述放射治疗剂的PD-L1抗体包含12A4的重链和轻链。
114.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案72-113中任一项所述的组合和使用说明书。
115.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者(a)在第一时间施用放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1抗体和放射性核素；以及(b)在第二时间施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的PD-L1抗体具有相同的抗原结合特异性。
116.根据实施方案115所述的方法，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂分别是实施方案72-113中任一项所定义的放射成像剂和放射治疗剂。
117.根据实施方案115或116所述的方法，其中所述第一时间和所述第二时间是不同的时间。
118.根据实施方案115或116所述的方法，其中至少一次，所述第一时间与所述第二时间相同。
119.根据实施方案115-118中任一项所述的方法，其中所述第一时间是在所述第二时间之前。
120.根据实施方案115-119中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序：(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；(ii)在所述受试者中检测所述放射成像剂；以及(iii)向所述受试者施用所述放射治疗剂。
121.根据实施方案115-119中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序，(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；(ii)确定所述放射成像剂在所述受试者中的存在；以及(iii)如果在所述受试者中检测到所述放射成像剂，则向所述受试者施用所述放射治疗剂。
122.根据实施方案115-121中任一项所述的方法，其中还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂例如以监测所述受试者中的PD-L1水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的PD-L1水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
123.一种用于在检测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1艾得奈可汀和放射性核素；以及(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素。
124.根据实施方案123所述的组合，其中所述放射成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
125.根据实施方案123所述的组合，其中所述放射成像剂包含68Ga。
126.根据实施方案123-125中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过选自NODAGA、DOTA或NOTA的螯合剂与所述抗PD-L1艾得奈可汀连接。
127.根据实施方案123-126中任一项所述的组合，其中所述抗PD-L1艾得奈可汀包含SEQ ID NO:80、88、96或104。
128.根据实施方案123-127中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含选自以下的放射性核素：90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
129.根据实施方案123-128中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含177Lu。
130.根据实施方案123-129中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过选自NODAGA、DOTA、NOTA或DPTA的螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段连接。
131.根据实施方案123-130中任一项所述的组合，其中所述螯合剂与所述抗体中的随机赖氨酸残基、例如2-5个赖氨酸残基连接。
132.根据实施方案123-131中任一项所述的组合，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的VH的三个CDR。
133.根据实施方案123-132中任一项所述的组合，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的VH CDR和VL CDR。
134.根据实施方案123-133中任一项所述的组合，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的VH和VL。
135.根据实施方案123-134中任一项所述的组合，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的重链和轻链。
136.一种检测和治疗患有表达PD-L1的癌症的受试者的方法，所述方法包括a.确定PD-L1在患有癌症的受试者中的存在，其包括施用根据实施方案124-127中任一项所述的放射成像剂，以及如果发现PD-L1存在于所述受试者的一个或多个肿瘤中，则b.向所述受试者施用根据实施方案128-135中任一项所述的放射治疗剂。
现在通过参考以下实施例来描述本发明，所述实施例仅是说明性的，并不旨在限制本发明。虽然已经参考本发明的具体实施方案对本发明进行了详细描述，但对于本领域技术人员而言将清楚的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。
实施例
实施例1：螯合剂与抗hPD-L1艾得奈可汀的连接
此实施例描述了抗PD-L1艾得奈可汀与螯合剂NODAGA和DOTA的连接。由于使用马来酰亚胺化学将艾得奈可汀与NODAGA(CheMatech)连接，因此对两种艾得奈可汀进行了修饰，以在C末端包括含有脯氨酸、然后是半胱氨酸的肽接头。修饰的E01和A02艾得奈可汀的氨基酸序列分别提供在SEQ ID NO:104和88中。如先前所述(WO 2017/210302)，使用半胱氨酸将艾得奈可汀与螯合剂连接。
将10倍摩尔过量的马来酰亚胺-NODAGA(CheMatech)或DOTA溶解在PBS(pH 7.4)中，并且在1mM TCEP的存在下添加到纯化的艾得奈可汀中。在缀合混合物中，最终的DMSO浓度不超过5％。在质谱分析之前，将缀合混合物在室温下放置一小时。在MS确认缀合之后，使用在PBS(pH 7.2)中平衡的HiLoad 26/60Superdex 75柱通过尺寸排阻色谱纯化样品。
实施例2：68Ga标记的抗hPDL-1艾得奈可汀作为用于对PD-L1表达进行成像的PET药 剂的临床前评价
概述：
目的：肿瘤细胞通过表达共抑制蛋白(如PD-L1)来利用检查点途径逃避抗肿瘤免疫反应。正如最近在第一批患者中证明的那样，18F-BMS-986192(18F-艾得奈可汀)提供了用于对肿瘤中的PD-L1表达进行体内成像和定量的有希望的手段。PD-L1配体在肿瘤中的高摄取表明PD-L1也可以用作治疗诊断靶标。作为放射性标记的PD-L1配体的治疗诊断应用的第一步，我们评价了68Ga标记的BMS-986192类似物的生物分布和肿瘤摄取。
方法：在pH 5.5的NaOAc缓冲液中进行艾得奈可汀的68Ga标记(50℃，15min)。在37℃下在人血清中测定体外稳定性持续4小时。使用表达PD-L1的转导的淋巴瘤细胞系U-698M和野生型U-698M细胞(作为阴性对照)进行PD-L1结合测定。使用表达PD-L1的转导的淋巴瘤细胞系U-698M和野生型U-698M细胞(作为阴性对照)进行PD-L1竞争性结合测定。使用携带PD-L1阳性和阴性U-698M的NSG小鼠进行68Ga-艾得奈可汀的生物分布和小动物PET研究。
结果：在15min内，以定量RCY(>97％)和高RCP获得了68Ga-艾得奈可汀。68Ga标记的艾得奈可汀在人血清中的体外稳定性在4h时(≥95％)，并且通过尺寸排阻色谱显示了单体洗脱曲线。证实了68Ga-艾得奈可汀与表达人PD-L1的癌细胞的高且特异性的结合，这与通过流式细胞术和IHC染色测定的相应PD-L1表达水平密切相关。在体内，在PD-L1+肿瘤(在1hp.i.时为9.0％±2.1％ ID/g)和肾脏(在1h p.i.时为56.9％±9.2％ ID/g)中的68Ga-艾得奈可汀摄取较高，而在其他组织中的摄取可忽略不计。PD-L1阴性肿瘤仅表现出放射性的背景摄取(0.6％±0.1.％)。共注射过量的未标记的艾得奈可汀将PD-L1的肿瘤摄取降低超过80％。
结论：68Ga-艾得奈可汀使得能够容易地进行放射合成，并且显示出优异的体外和体内PD-L1靶向特征。在早期成像时间点高肿瘤摄取以及低背景积累证明了68Ga-艾得奈可汀用于对肿瘤中的PD-L1表达进行成像的可行性，并且对于PD-L1配体的治疗诊断应用是令人鼓舞的。
下文描述了这些实验的细节。
材料和方法
除非另外说明，否则所有试剂都获自Sigma Aldrich(德国慕尼黑)。马来酰亚胺基-单酰胺-DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-马来酰亚胺基-乙基乙酰胺)购自Macrocyclics(美国普莱诺)。68Ga获自68Ge/68Ga发生器(Galliapharm，Eckert&Ziegler AG，德国柏林)。在配备有NaI(TI)闪烁检测器(2“x 2“)和SPD M20A二极管阵列UV/Vis检测器的Shimadzu HPLC系统上使用bioZen SEC-2(300x 4.6mm)柱(Phenomenex LTD，德国阿沙芬堡)进行68Ga标记的艾得奈可汀的分析型放射尺寸排阻色谱(放射-SEC)。以0.35ml/min的恒定流速用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱示踪剂。使用Varian二氧化硅浸渍的ITLC色谱纸(Varian Inc.，美国加利福尼亚州)和0.1M水性柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)(作为流动相)进行放射-TLC。在B-FC-3600TLC扫描仪(Bioscan，美国华盛顿)上分析TLC条带。
68Ga标记
在PBS缓冲液(pH 7.4)中配制蛋白质BMS-936559((也称为MDX 1105和12A4(US 7,943,743))；“mAb”)和具有C末端PC尾的A02(“艾得奈可汀”)(SEQ ID NO:88)，其中艾得奈可汀的浓度为0.9mg/mL并且mAb的浓度为2.6mg/mL。
用0.05M水性HCl(4ml)洗脱具有TiO2基质的68Ge/68Ga发生器(Eckert&ZieglerRadiopharma，德国)。向含有最高活度(170–240MBq)的1ml68Ga洗脱液的级分中添加100μl1M NaOAc(pH 5.5)和222μl艾得奈可汀(200μg，在PBS中)，得到pH 5.5的1.32ml标记溶液。将溶液短暂混合并且在50℃下孵育15min。通过凝胶过滤在PD-10柱(GE Healthcare，英国白金汉郡)上纯化68Ga标记的艾得奈可汀。
使用Varian二氧化硅浸渍的ITLC色谱纸(Varian Inc.，美国加利福尼亚州)和0.1M水性柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)的1:1(v/v)混合物(作为流动相)通过放射-TLC分析放射化学产率和放射化学纯度，其中68Ga标记的蛋白质停留在原点(RF＝0)，并且用溶剂前沿洗脱游离68GaIII(RF＝0.8–1)。在B-FC-3600TLC扫描仪(Bioscan，美国华盛顿)上分析TLC条带。
68Ga-艾得奈可汀在人血清中的体外稳定性
根据如上所述的优化方案进行DOTA-艾得奈可汀的68Ga标记。在分析之前，通过凝胶过滤在PD-10柱(GE Healthcare，英国白金汉郡)上纯化68Ga标记的Ad。通过如下方式进行体外稳定性研究：向800μl新鲜制备的人血清(SeronormTM Human，IGZ Instruments AG，苏黎世)中添加200μl68Ga-艾得奈可汀(18MBq，在0.9％ NaCl中)，然后在37℃下孵育长达4小时。为了研究68Ga-艾得奈可汀在人血清中的稳定性，在0、1、2、3和4小时进行了放射-HPLC和放射-TLC。
如上所述进行放射-TLC。在配备有NaI(TI)闪烁检测器(2“x2“)和SPD M20A二极管阵列UV/Vis检测器的Shimadzu HPLC系统上使用bioZen SEC-2(300x4.6mm)柱(PhenomenexLTD，德国阿沙芬堡)进行68Ga标记的蛋白质的分析型放射尺寸排阻色谱(放射-SEC)。以0.35μl/min的恒定流速用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱蛋白质。
细胞系的培养
B细胞淋巴瘤细胞U-698-M购自ATTC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。将培养物维持在补充有10％ FBS和青霉素/链霉菌(100IU/ml)的任一RPMI培养基中(U-698-M)。使细胞在37℃下在5％ CO2的湿润气氛中生长。
细胞系的转染
使用RD114细胞(Ward等人(2003)Mol Ther.8:804)作为产生逆转录病毒上清液的病毒包装细胞系。在转染之前二十四(24)小时，将0.3x 106个RD114细胞/孔接种在处理的组织培养6孔板中的3ml/孔cDMEM培养基中。第二天，为每种构建体制备由200μl无血清DMEM(Invitrogen，美国卡尔斯巴德)中的9μl TransIT-293转染试剂(Mirus，美国麦迪逊)组成的转染混合物，并且将其在室温下孵育20min。将三(3)μg含有PD-L1和GFP的基因的逆转录病毒载体添加到转染混合物中，小心混合并且在室温下孵育30min。然后伴随温和淘选将转染混合物滴加到细胞中，然后进行在37℃下持续48h的孵育步骤。在37℃下两天之后，使用含逆转录病毒的上清液转导细胞系。
细胞系的转导
将组织培养24孔板用400μl/孔RetroNectin(Takara，日本)溶液包被，并且在4℃下孵育过夜。第二天，用500μl/孔的在PBS中的2％ BSA溶液替换RetroNectin溶液，然后是在37℃下持续30min的孵育期。然后用2ml PBS洗涤孔，然后在1ml培养基中接种1x106个人B细胞淋巴瘤U-698-M细胞(DSZM，德国布伦瑞克)连同硫酸鱼精蛋白(cEND＝4μg/ml；MPBiomedicals，法国伊尔基希)和HEPES(cEND＝5mM；Invitrogen，美国卡尔斯巴德)。收获1ml/孔的转染的RD114细胞的逆转录病毒上清液，然后将其通过0.45μm过滤器过滤，然后将其添加到含有细胞悬浮液的24孔板的相应孔中。将板在不间歇的情况下在820g和37℃下离心90min，并且在37℃下孵育24h。在24h之后，收获转导的细胞，并且将其接种在具有新的培养基的RetroNectin包被的新24孔板中。再一次，如前所述，添加过滤的病毒上清液连同硫酸鱼精蛋白和HEPES。进行与上文相同的离心步骤，之后将一式三份重复在37℃下孵育24h。在24h之后，收获转导的细胞，将其用RPMI培养基洗涤并且重悬在相应的培养基(3ml)中。
竞争性结合测定
在竞争性结合实验中，使用PD-L1表达升高的稳定的转导的U698M-PDL1细胞测定艾得奈可汀对人PD-L1的亲和力。使用未转染的U-689-M细胞作为阴性对照证实特异性结合。在实验当天，将细胞通过离心从其正常培养基中分离，用PBS洗涤并且在补充有5％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI(Seromed，德国柏林)中调节至2x106个细胞/ml的浓度。将400.000个细胞(200μl细胞悬浮液)转移到小瓶中，并且在37℃下平衡至少15min。然后，添加50μl/小瓶的溶液，其含有浓度渐增(10-10–10-6M)的68Ga标记的蛋白质(25μL)和未标记的蛋白质(25μL，竞争物)的混合物(每种浓度一式三份重复)。
在37℃下孵育1h之后，通过以600x g(1,200rpm，Biofuge 15)离心5min终止孵育，取出每个小瓶的上清液，并且将细胞用250μl PBS彻底洗涤2次。在以600x g(1,200rpm，Biofuge 15)离心5min之后，将洗涤培养基与先前取出的上清液合并，代表游离放射性配体的量。在2470Wizard2γ计数器(PerkinElmer，美国马萨诸塞州)中测量细胞结合活性(细胞沉淀)的量以及游离放射性配体的量。将平均细胞结合活性的比例针对未标记的配体的浓度作图。每个数据点是至少三次测定的平均值。根据以下方程通过非线性回归分析测定半最大抑制浓度(IC50)值：
由于68Ga标记的和未标记的配体的高度结构相似性，假定对PD-L1的亲和力几乎相同，导致同源竞争性结合。
U-698-M肿瘤模型
使用PBS中的胰蛋白酶/EDTA(0.05％和0.02％)将转导的U-698-M PDL-1阳性细胞系和U-698-M野生型细胞系从培养瓶表面分离，离心并重悬在PBS中，并且将大约1x107个细胞/200μL的U-698-M PDL-1+细胞皮下接种在6至8周龄NSG小鼠(雄性，Charles River WIGAGmbH，德国苏尔茨费尔德)的右肩，并且将U-698-M野生型细胞皮下接种在所述小鼠的左肩。使肿瘤生长2至4周，至直径达到0.6-1cm。
小动物PET成像
经由尾静脉为小鼠静脉内脉注射大约5-7MBq(约10-13μg)的68Ga标记的艾得奈可汀。使用Siemens Inveon小动物PET/CT扫描仪进行体内成像研究。在1h和2h p.i.时记录静态图像，其中采集时间为20min。对于阻断研究，共注射未标记的艾得奈可汀(9mg/kg)与68Ga-艾得奈可汀。在异氟醚麻醉下，在卧床注射之后进行动态成像持续1.5h。使用三维有序子集最大期望值(OSEM3D)算法在进行扫描仪和衰减校正的情况下进行图像重构。使用Inveon Workplace软件(Siemens)进行数据分析。
FACS分析
在LSRII(BD Bioscience)上进行流式细胞术分析，并且使用FlowJo 7.6.5软件分析结果。离心步骤在500g和4℃下进行5min。每次染色，用FACS缓冲液洗涤0.5-1Mio必须表征的细胞。将细胞与50μl人血清在4℃下一起孵育10min，以防止抗体的非特异性结合。在采用FACS缓冲液的进一步洗涤步骤之后，添加2μl PE标记的小鼠抗人CD274(克隆MIH1)(BDBioscience，美国富兰克林湖)和1.5μl 7AAD，然后将混合物在黑暗中在4℃下孵育30min。在抗体染色之后，再次用FACS缓冲液洗涤混合物，以去除过量的抗体，之后将细胞吸收进200μl FACS缓冲液中。将细胞在黑暗中在4℃下储存直到测量。
对于离体流式细胞术分析，使用40μm细胞过滤器将肿瘤和器官单一化。在用FACS缓冲液洗涤之后，将红细胞在室温下使用ACK裂解缓冲液裂解5min，并且用于流式细胞术分析。
组织学和免疫组织化学
将肿瘤组织在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定至少48h，在标准条件下脱水(Leica ASP300S，德国韦茨拉尔)并且包埋在石蜡中。收集用旋转切片机(HM355S，ThermoFisher Scientific，美国沃尔瑟姆)制备的2μm厚的连续切片，并且进行组织学和免疫组织化学分析。根据标准方案用伊红和Mayer的Haemalaun对脱蜡切片进行苏木精-伊红(H.-E.)染色。
采用针对PD-L1抗体(克隆28-8，ab205921)的一抗使用Bond RXm系统(Leica，德国韦茨拉尔，所有试剂都来自Leica)进行肿瘤组织的免疫组织化学。简而言之，将载玻片使用脱蜡溶液脱蜡，并且用表位修复溶液2(Epitope retrieval solution 2)(EDTA缓冲液pH9)预处理。将一抗稀释(1:500)并且应用15min。将抗体结合用不含哨岗(post)一级试剂的聚合物精制检测试剂盒检测，并且用DAB可视化为深棕色沉淀物。用苏木精进行复染。然后将载玻片通过浓度渐增(70％、96％、100％)的酒精洗涤和二甲苯手动脱水，并且使用封固剂(Histolab，瑞典哥德堡，00801)盖片。在每次运行中都包括阳性对照。
用自动载玻片扫描仪(Leica Biosystems，德国韦茨拉尔，AT-2)扫描染色的载玻片，并且使用Aperio Imagescope软件(版本12.3，Leica Biosystems，德国韦茨拉尔)拍摄代表性图像。
生物分布
在异氟醚麻醉下，将约5-7MBq的68Ga标记的艾得奈可汀(约10μg)注射到携带U-698-M-PD-L1+和U-698-M野生型肿瘤的NSG小鼠的尾静脉中。在1h p.i.(n＝4)和2h p.i.(n＝4)时处死动物，解剖目标器官，并且使用γ计数器对称重的组织样品中的活度进行定量。
结果和讨论
68Ga标记
按照关于缓冲液、pH、温度和蛋白质量的优化标记程序进行PD-L1结合DOTA-艾得奈可汀的68Ga标记(170-240MBq、1M NaOAc(pH 5.5)、200μg艾得奈可汀，50℃；参见第一个报告)。在15min之后获得了定量RCY>78％的高标记效率。在纯化之后，实现了4.7–7.3GBq/μmol的比活度(SA)和RCP>98％。由于示踪剂制备的简便性，68Ga-艾得奈可汀的合成应当与日常临床工作完全兼容，并且应当非常适合临床常规中的自动放射合成。
68Ga-艾得奈可汀在人血清中的体外稳定性
通过放射-TLC和放射-HPLC测定68Ga标记的艾得奈可汀在37℃下在人血清中的体外稳定性长达4h(图1)。68Ga-艾得奈可汀的放射色谱图显示了具有较高分子量的放射性杂质(8.97min)的单体洗脱曲线，所述放射性杂质在人血清中在37℃下孵育4h之后略微增加直到5％。放射-TLC分析显示了68Ga-艾得奈可汀在4h内发生中度转移金属化(5％)。因此，在合成后长达4h内，证实了68Ga标记的艾得奈可汀在人血清中的合理体外稳定性(≥95％的完整示踪剂)，这确保了在68Ga标记的示踪剂的预定成像时间内完整示踪剂在循环中的延长的可用性(图14)。
细胞系的转导
将B细胞淋巴瘤细胞系U698M用与GFP连接的PD-L1逆转病毒转导，并且通过基于PD-L1的分选产生稳定的细胞系。未转导的U698M细胞仅显示了每个细胞大约4.000个分子的低PD-L1表达。PD-L1的表达可以通过稳定转导显著增加，对于U-698-M，每个细胞显示了约155.000个PD-L1分子。因此，稳定的转导的U-698-M细胞适于在体外和体内进一步评价PD-L1结合放射性配体。(图1)
小动物PET成像
在1h p.i.和2h p.i.时在携带PD-L1阳性和PD-L1野生型肿瘤的NSG小鼠中用68Ga-艾得奈可汀进行比较静态μPET扫描。在小鼠中注射大约5-7MBq(10-13μg；0.9–1.2nmol)的相应示踪剂(图2)。
68Ga-艾得奈可汀显示出快速的血液清除，具有低的非特异性全身摄取；以及主要的肾脏清除，从肾脏排泄到肝胆排泄略有转移，通过肝脏中的示踪剂摄取略有增强所示。68Ga-艾得奈可汀在1h和2h p.i.之后在PDL-1阳性肿瘤中显示出可比的高肿瘤摄取。
如图3所示，PD-L1阳性U-698-M和PD-L1 U-698-M野生型肿瘤中68Ga-艾得奈可汀积累的直接比较证实了68Ga-艾得奈可汀的PD-L1特异性结合。另外，采用未标记的艾得奈可汀(9mg/kg)进行的阻断实验证明，68Ga-艾得奈可汀摄取是特异性的，并且是PD-L1介导的(图2和图3)。
68Ga-艾得奈可汀的静态μPET图像的ROI定量显示了具有主要肾脏清除的有利的药代动力学(图4)。然而，肾脏和肝脏摄取在2h p.i.内略有增加，68Ga-艾得奈可汀的肿瘤摄取保持同样的高，导致在1h p.i.时肿瘤与背景比率更高。因此，在1h p.i.之后的高对比度PET成像似乎更可取。如在PET图像中所见，68Ga-艾得奈可汀是PD-L1特异性且可阻断的。有趣的是，采用过量的未标记的艾得奈可汀进行的阻断实验揭示，示踪剂的肾脏积累显著减少(图4)。
动态μPET/CT成像-时间-活度曲线
通过在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型异种移植物的小鼠中经1.5h的时间进行动态μPET/CT扫描来研究68Ga-艾得奈可汀的药代动力学(图5)。为了获得可比较的结果，将活度和蛋白质的注射量调整到与68Ga-艾得奈可汀的静态PET成像类似的值。
在40-90min p.i.时68Ga-艾得奈可汀的动态μPET/CT扫描的累加图像与对于在1h和2h p.i.时静态μPET成像获得的累加图像是可比的(图2)。68Ga-艾得奈可汀显示出从血池和非靶组织(例如，肝脏)的快速清除，具有低的非特异性全身摄取；以及主要的肾脏清除，通过随时间在肾脏中不断增加的积累来证明，从肾脏排泄到肝胆排泄略有转移，通过肝脏中的摄取仅略有增强所示。PD-L1阳性肿瘤中的68Ga-艾得奈可汀摄取在4min p.i.内很快，并且在60min p.i.内显示出渐增的PD-L1+肿瘤摄取，具有1.5h内的高保留。
在U-698-M野生型异种移植物中未观察到积累，证实了68Ga-艾得奈可汀的PD-L1特异性结合。另外，采用过量的未标记的艾得奈可汀(9mg/kg)进行的阻断实验证明，68Ga-艾得奈可汀摄取是特异性的，并且是PD-L1介导的。
生物分布
在1h p.i.和2h p.i.时在携带PD-L1阳性和PD-L1野生型肿瘤的NSG小鼠中用68Ga-艾得奈可汀进行比较静态μPET扫描。为了获得可比较的结果，68Ga-艾得奈可汀的注射量和活度(大约5-6MBq，10μg)与用于动态PET成像的相等。
在1h和2h p.i.时68Ga-艾得奈可汀的静态PET/CT图像(图5)与在40-90min p.i.时通过动态μPET/CT扫描获得的那些累加图像是可比的。在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的小鼠中68Ga-艾得奈可汀的生物分布数据(1h和2h p.i.)示于图6中并且总结在表1中。数据完全反映了动态μPET/CT成像的结果。
表1：在1h和2h p.i.时在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的NSG小鼠中68Ga-艾得奈可汀的生物分布。数据表示为％ID/g(平均值±SD)。右图：在1h和2h p.i.时68Ga-艾得奈可汀的肿瘤与器官比率。
68Ga-艾得奈可汀的静态μPET图像的ROI定量显示了在2h p.i.时肾脏清除是主要的，肝脏和非靶向组织中的摄取仅略有增加。在1h p.i.时，68Ga-艾得奈可汀的肿瘤摄取保持同样的高，导致在1h p.i.时肿瘤与背景比率更高。在PD-L1阳性肿瘤异种移植物中68Ga-艾得奈可汀的显著摄取是高度特异性的，因为在PD-L1阴性肿瘤中未观察到积累。由于在2hp.i.时肾脏摄取更高并且肿瘤摄取与1h p.i.时类似的高，较早的成像时间点(1h p.i.)似乎更值得推荐，这是由于肿瘤与器官比率更高。有趣的是，采用过量的未标记的艾得奈可汀进行的阻断实验揭示，示踪剂的肾脏积累显著减少。
FACS分析
来自2只小鼠的解剖肿瘤的离体流式细胞术(FACS)分析证实了如下成像结果，其显示出与U-698-M野生型肿瘤组织相比，PD-L1转导的肿瘤中的68Ga-艾得奈可汀摄取更高。在两只小鼠中，转导的肿瘤中的PD-L1表达水平都高度增加至未转导的情况，证实了稳定的PD-L1肿瘤细胞系在体内的产生和PD-L1介导的68Ga-艾得奈可汀的摄取(图7)。
离体组织学和免疫组织化学
为了进一步证实FACS分析的结果，我们对野生型和PD-L1+肿瘤进行了离体免疫组织化学分析。在所有U-698-M PD-L+肿瘤中都发现了强PD-L1表达(图8，下图)，而在所有U-698-M野生型肿瘤中都没有发现PD-L1表达(图8，上图)。这些结果证实了体内成像结果以及离体流式细胞术分析。
结论
以定量RCY和高RCP(>97％)获得了68Ga-艾得奈可汀。证实了68Ga-艾得奈可汀与表达人PD-L1的癌细胞的高且特异性的结合，这与通过流式细胞术和IHC染色测定的相应PD-L1表达水平密切相关。在体内，在PD-L1+肿瘤(在1h p.i.时为9.0％±2.1％ ID/g)和肾脏(在1h p.i.时为56.9％±9.2％ ID/g)中的68Ga-艾得奈可汀摄取较高，而在其他组织中的摄取可忽略不计。PD-L1阴性肿瘤仅表现出放射性的背景摄取(0.6％±0.1％ ID/g)。共注射过量的未标记的艾得奈可汀将PD-L1的肿瘤摄取降低超过80％。
68Ga-艾得奈可汀使得能够进行简单、快速且高效的放射合成，并且显示出优异的体外和体内PD-L1靶向特征。在早期成像时间点高肿瘤摄取以及低背景积累证明了68Ga-艾得奈可汀用于对肿瘤中的PD-L1表达进行成像的可行性，并且对于PD-L1配体的治疗诊断应用是令人鼓舞的。
实施例3：68Ga标记的NOTA-艾得奈可汀相比于DOTA-艾得奈可汀的临床前比较评价
在本研究中使用的所有材料和方法都如实施例1-2中所述。
如本文先前所述，按照关于缓冲液、pH、温度和蛋白质量的优化标记程序进行PD-L1结合DOTA缀合的或NOTA缀合的艾得奈可汀的68Ga标记(130-250MBq、1MNaOAc(pH 5.5)、100或200μg DOTA/NOTA-艾得奈可汀，50℃)。
随放射性量、前体和反应时间的变化评估放射化学产率(RCY)(图9)。使用大约130MBq68GaCl3和200μg相应前体(DOTA-艾得奈可汀与NOTA-艾得奈可汀)进行的68Ga标记显示了与在5和15min反应时间时DOTA-艾得奈可汀的68Ga标记相比，即使在5min之后，NOTA-艾得奈可汀的RCY也显著更高(≥95％)(图9A)。降低2倍的NOTA-艾得奈可汀量(100μg)显示出与200μg前体可比的高且定量的RCY≥95％。
因此，虽然DOTA-艾得奈可汀和NOTA-艾得奈可汀两者都适用于在本文提供的方法中使用，但NOTA-艾得奈可汀允许使用比DOTA-艾得奈可汀所需的低得多的前体浓度进行标记。这允许以高得多的比活度制备68Ga-NOTA-艾得奈可汀。与DOTA官能化的艾得奈可汀相比，使用较高的起始活度(大约250MBq的68GaCl3)即使在标记5min之后对于NOTA-艾得奈可汀也获得了更高的RCY。如图15所示，与DOTA(稳定性常数，KML＝21.3)相比，NOTA是68Ga的更有效的螯合剂(KML＝31.1)。另外，NOTA的68Ga标记与热敏蛋白相容，这是由于其短的放射性标记时间和在室温下进行放射性标记的能力。
动态μPET/CT成像
通过在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型异种移植物的小鼠中经1.5h的时间进行动态μPET/CT扫描来研究68Ga-NOTA-艾得奈可汀的药代动力学。68Ga-DOTA-艾得奈可汀相比于68Ga-NOTA-艾得奈可汀的动态μPET扫描的比较示于图10中。对于68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的两次PET扫描，注射活度和冷质量的量是相同的。两种示踪剂在PD-L1+肿瘤异种移植物中都展现出PD-L1依赖性结合，而在PD-L1阴性肿瘤中没有摄取。在90min p.i.之后，68Ga-NOTA-艾得奈可汀在PD-L1+肿瘤中显示出更快的积累和更高的摄取。
两种示踪剂在正常器官和组织内的分布良好，血液和正常组织摄取较低并且清除迅速。在肾脏中观察到两种示踪剂的最高积累。除了两种示踪剂的主要肾脏排泄外，对于68Ga-DOTA-艾得奈可汀，观察到肝脏中的摄取略有增强。(图16)
静态μPET/CT成像
在1h p.i.和2h p.i.时在携带PD-L1阳性和PD-L1野生型肿瘤的NSG小鼠中用68Ga-NOTA-艾得奈可汀进行比较静态μPET扫描。为了获得可比较的结果，68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的注射量和活度(大约5-6MBq，10μg)与用于动态PET成像(图16)的相等。对于两种示踪剂，在1h时68Ga-NOTA-艾得奈可汀和68Ga-DOTA-艾得奈可汀的静态PET/CT图像(图17)与在40-90min p.i.时通过动态μPET/CT扫描获得的那些累加图像是可比的。
两种放射性示踪剂都使得能够对PD-L1+肿瘤进行特异性可视化，并且在U-698-M野生型异种移植物中未观察到积累，证实了68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的PD-L1特异性结合。另外，采用过量的未标记的艾得奈可汀(9mg/kg)进行的阻断实验证明，对于两种示踪剂，68Ga标记的艾得奈可汀摄取都是特异性的，并且是PD-L1介导的(图11)。正如从动态PET成像预期的那样，两种放射性配体都显示出高肾脏摄取和显著的膀胱活度，表明了68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的快速肾脏清除。68Ga-NOTA-艾得奈可汀仅显示了肾脏排泄，而对于68Ga-DOTA-艾得奈可汀，观察到从肾脏排泄到肝胆排泄略有转移，通过肝脏中的示踪剂摄取略有增强所示。
生物分布
在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的小鼠中68Ga-DOTA-艾得奈可汀和68Ga-NOTA-艾得奈可汀的生物分布数据(1h p.i.)总结在图18中。数据完全反映了μPET/CT成像的结果。两种示踪剂展现出可比的器官分布，在非靶组织中的积累较低。在1h p.i.时，68Ga-NOTA-艾得奈可汀的肾脏摄取(103％±21％ ID/g)是68Ga-DOTA-艾得奈可汀(57％±9％ ID/g)的2倍。另外，与68Ga-DOTA-艾得奈可汀相比，观察到在PD-L1+肿瘤中68Ga-NOTA-艾得奈可汀的摄取略有增强(>2％ ID/g)。两种示踪剂的肿瘤摄取都是特异性的，并且是PD-L1介导的。如在PET图像中所见，68Ga-DOTA-艾得奈可汀显示出2％ ID/g的低肝脏摄取，而对于68Ga-NOTA-艾得奈可汀，未观察到摄取。
结论
68Ga标记的DOTA-艾得奈可汀相比于NOTA-艾得奈可汀的放射性标记效率的比较揭示了在较短的合成时间内，NOTA缀合的化合物具有更高的RCY。另外，由于定量68Ga标记所需的NOTA-艾得奈可汀的量更低，68Ga-NOTA-艾得奈可汀可以实现更高的比活度。因此，由于温和的标记条件以及定量放射化学产率和高放射化学纯度，用于临床常规应用的68Ga-NOTA-艾得奈可汀的制剂特别适用于在试剂盒样制剂中使用。
在临床前比较研究中，两种示踪剂显示出在PD-L1阳性肿瘤中选择性且特异性积累的可比的体内PD-L1靶向特征。因此，蛋白质内螯合剂单元的交换似乎对艾得奈可汀的人PD-L1结合亲和力没有影响。
另外，两种示踪剂显示了具有快速的肾脏排泄和非靶组织中的低摄取的可比且有利的药代动力学。关于排泄器官(如肾脏和肝脏)中的摄取，观察到两种配体略有差异。68Ga-NOTA-艾得奈可汀仅经由尿途径排泄，导致与68Ga-DOTA-艾得奈可汀相比，肾脏摄取要高2倍，而DOTA缀合的蛋白质显示出较低的肾脏积累和摄取增加的肝脏，这是由于从肾脏排泄到肝胆排泄略有转移。由于NOTA是一种六齿N3O3大环螯合剂，因此预期NOTA-艾得奈可汀的68Ga标记会产生中性化合物，而68Ga-DOTA复合物带负电荷，这可能会影响两种放射性示踪剂的药代动力学行为。68Ga-NOTA-艾得奈可汀的较低肝脏摄取也可能为以较高对比度对肿瘤进行成像提供优势。
实施例4：177Lu标记的抗hPDL-1艾得奈可汀和177Lu标记的抗hPDL-1mAb的临床前评 价
越来越多地研究免疫检查点配体PD-L1的分子成像作为指导患者选择和监测PD-1:PD-L1靶向免疫疗法的策略。另外，PD-L1靶向成像可以扩展到治疗诊断方法，为诊断和治疗两者都提供用于特定分子靶向的通用分子平台。该项目的主要目标是(1)研究BMS开发的两种类型的PD-L1配体是否适于对肿瘤上的PD-L1表达进行成像(68Ga/177Lu)以及基于放射性核素的治疗(177Lu)；以及(2)获得关于PD-L1靶向放射性核素疗法的有效性和毒性的初步数据。
材料和方法
177Lu标记
177LuCl3购自IDB Holland(荷兰巴勒纳绍)或ITG(/>德国加兴)。使用剂量校准器(Capintec INC.，美国新泽西州)测量用于蛋白质的177Lu标记的初始放射性。
在PBS缓冲液(pH 7.4)中配制蛋白质BMS-936559(每个抗体分子用2-5个DOTA标记，如实施例2中所述；“mAb”)和具有PC尾的A02艾得奈可汀(SEQ ID NO:88)(“艾得奈可汀”)，其中Ad的浓度为0.9mg/mL并且mAb的浓度为2.6mg/mL。
使用Varian二氧化硅浸渍的ITLC色谱纸(Varian Inc.，美国加利福尼亚州)和0.1M水性柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)(作为流动相)进行放射-TLC，其中177Lu标记的蛋白质停留在原点(RF＝0)，并且用溶剂前沿洗脱游离177LuIII(RF＝0.8–1)。在B-FC-3600TLC扫描仪(Bioscan，美国华盛顿)上分析TLC条带。
对于177Lu标记，将100μL 1M NaOAc(pH 5.5)添加到0.04M HCl中的60μL177LuCl3(大约100-130MBq)中。向此溶液中添加在PBS(pH 7.4)中的79μL mAb(200μg)或222μL艾得奈可汀(200μg)并且通过振荡混合，得到最终pH为5.5的反应溶液。通过将封闭的eppendorf小瓶放入加热的Eppendorf混合器中加热至42℃。在1–2h之后，通过放射-TLC测定放射性掺入。通过凝胶过滤在PD-10柱(GE Healthcare，英国白金汉郡)上纯化标记的蛋白质。
细胞培养和动物模型
如实施例1-2中所述，维持PD-L1阳性U-698M和U-698-M野生型细胞。为雄性NSG小鼠(6至8周，Charles River WIGA GmbH，德国苏尔茨费尔德)皮下接种1x107个细胞/200μLU-698-M PDL-1阳性细胞系(右肋腹)和U-698-M野生型细胞系(左肋腹)。使肿瘤生长2至3周，至直径达到0.6-1cm。
小动物SPECT成像
经由尾静脉为小鼠静脉内脉注射大约34-37MBq(约70-100μg)的177Lu标记的艾得奈可汀或25-34MBq(约100-102μg)的177Lu-mAb。使用Mediso Inveon nanoScan SPECT/CT扫描仪进行体内成像研究，所述扫描仪配备有NSP-106多针孔小鼠准直仪并且20％的能量窗口集中于177Lu的56keV、113keV和208keV能量峰。在1h、5h、24h、48h、72h、96h和7d p.i.时记录静态图像，其中采集时间为40min。在每次全身SPECT之前进行CT成像。使用VivoQuantTM和InterViewTMFUSION软件进行图像重构和数据分析。
离体放射自显影、组织学和免疫组织化学
处死动物，并且解剖PD-L1阳性和野生型U-698-M肿瘤。将肿瘤组织在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定至少48h，在标准条件下脱水(Leica ASP300S，德国韦茨拉尔)并且包埋在石蜡中。收集用旋转切片机(HM355S，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆)制备的2μm厚的连续切片，并且进行组织学和免疫组织化学分析。根据标准方案用伊红和Mayer的Haemalaun对脱蜡切片进行苏木精-伊红(H.-E.)染色。
采用针对PD-L1抗体(克隆28-8，ab205921)的一抗使用Bond RXm系统(Leica，德国韦茨拉尔，所有试剂都来自Leica)进行肿瘤组织的免疫组织化学。简而言之，将载玻片使用脱蜡溶液脱蜡，并且用表位修复溶液2(EDTA缓冲液pH 9)预处理。将一抗稀释(1:500)并且应用15min。将抗体结合用不含哨岗一级试剂的聚合物精制检测试剂盒检测，并且用DAB可视化为深棕色沉淀物。用苏木精进行复染。然后将载玻片通过浓度渐增(70％、96％、100％)的酒精洗涤和二甲苯手动脱水，并且使用封固剂(Histolab，瑞典哥德堡，00801)盖片。在每次运行中都包括阳性对照。用自动载玻片扫描仪(Leica Biosystems，德国韦茨拉尔，AT-2)扫描染色的载玻片，并且使用Aperio Imagescope软件(版本12.3，LeicaBiosystems，德国韦茨拉尔)拍摄代表性图像。
177Lu标记的艾得奈可汀和177Lu标记的mAb的生物分布
在异氟醚麻醉下，将约1MBq的177Lu标记的艾得奈可汀(约2.5μg)或0.5–1.5MBq177Lu-mAb(13–15μg)注射到携带U-698-M-PD-L1+和U-698-M野生型肿瘤的小鼠的尾静脉中。在1h(艾得奈可汀)、5h(mAb)、24h、72h、5d和7d p.i.时处死动物，解剖目标器官。使用γ计数器(1480Wizard，Wallac，Perkin Elmer)对称重的组织样品中的活度进行定量，并且将其与放射性标准品进行比较。对计数数据进行衰减校正，并且摄取表示为每克组织的注射活度(剂量)(％ID/g)。
177Lu标记的艾得奈可汀和177Lu标记的mAb的辐射剂量计算
使用177Lu标记的蛋白质在不同时间点的生物分布数据，我们进行了吸收剂量到人的外推。首先，对于177Lu标记的艾得奈可汀和mAb两种配体，计算小鼠肿瘤和正常器官的器官-活度曲线。基于放射性药物在小鼠中的器官与全身时间活度浓度比率等于在人中的比率的原理，将从生物分布数据([％IA/器官x小时]小鼠)获得的器官-时间活度浓度(＝曲线下面积(AUC))转化为人全器官注射剂量百分比([％IA/器官x小时]人)。在以下表达式中实施这种到人的外推：
其中OW人是人器官重量，OW小鼠是小鼠器官重量，TBW小鼠是小鼠平均总体重(TBWM＝25g)，并且TBWH是成年男性的平均总体重(TBWH＝73.7kg)。使用从生物分布数据获得的每个时间点小鼠血液的％IA/g值计算出的小鼠血液的AUC值来估计人心脏内容物中的活度浓度。使用以下表达式计算人全心脏内容物注射剂量百分比([％IA/心脏内容物x小时]人)的AUC值：
其中假定OW人为200mL的舒张期心脏体积。
对于177Lu-艾得奈可汀，假定在7天内肾脏清除为100％。对于177Lu-mAb，使用在每个时间点整个小鼠的AUC计算结果的总和在7d p.i.之后计算出注射活度经由肠道的排泄为40％。假定在最后一个研究的时间点之后放射性的清除仅通过物理衰减发生。根据积分时间-活度曲线，使用OLINDA对一组所选器官进行剂量计算。通过假定发射的β粒子在肿瘤组织中完全吸收来计算肿瘤剂量。
177Lu标记的mAb的疗法研究
为80只雄性NSG注射表达PD-L1的U-698-M细胞(n＝40)或野生型U-698-M细胞(n＝40)。在植入后第4天，将小鼠随机分为4组，每组10只小鼠注射了PD-L1阳性U-698-M细胞并且10只小鼠注射了野生型U-698-M细胞。为各组注射盐水、未标记的mAb或2个活度剂量的177Lu-mAb(相同量的冷mAb)。不同组的治疗方案总结在表2中。
表2.177Lu-mAb在PD-L1阳性U-698-M或U-698-M野生型NSG小鼠(n＝80)中的治疗方案。
每天监测小鼠的一般健康状况。每2天测量一次肿瘤生长以评估肿瘤反应。使用以下公式计算肿瘤体积：
针对副作用评估了体重和血液计数。当肿瘤大小大于>1cm，发生肿瘤溃疡或体重下降超过10％时，处死小鼠，并且收集器官进行HE(和IHC)染色。监测肿瘤生长持续至少40天。比较了177Lu-mAb、未标记的mAb处理的动物与注射了盐水的动物之间的肿瘤生长曲线。另外，比较了每组的PD-L1阳性和野生型异种移植物的肿瘤生长曲线。此外，我们将通过卡普兰-迈耶曲线和对数秩检验分析不同治疗之间的生存率差异。在实验完成时，对肾脏和肝脏进行采样，并且通过HE染色评价其毒性迹象。
结果
177Lu标记
在42℃下在1h–2h之后的标记产率分别为177Lu-艾得奈可汀76％±17％(n＝6)和177Lu-mAb 72％±21％(n＝7)。在纯化之后，两种示踪剂的通过放射-TLC测定的RCP都>95％。
177Lu-艾得奈可汀的小动物SPECT成像
在2种不同的携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的小鼠中177Lu-艾得奈可汀的1h、24h、48h、72h和7d p.i.的代表性SPECT/CT图像显示于图9中。
正如对于68Ga-艾得奈可汀已经见到的那样，177Lu标记的艾得奈可汀在早期成像时间点(1h p.i.)显示出快速的血液清除，具有低的非特异性全身摄取；以及主要的肾脏清除。另外，肝脏中的示踪剂摄取略有增强表明了从肾脏排泄到肝胆排泄略有转移。
两只小鼠的SPECT图像(图9)即使在1h p.i.时也在PD-L1阳性肿瘤中显示了高特异性摄取。另外，在PD-L1阴性U-698-M野生型细胞中未观察到摄取，证实了177Lu-艾得奈可汀对PD-L1的特异性。在用SPECT成像的两只小鼠中177Lu-艾得奈可汀的比较揭示了示踪剂的药代动力学的差异(图9，A/B相比于C)。图9A示出了在1h p.i.时肾脏和肝脏中的摄取更高，并且肾脏清除显著更快。此外，在72h和7d p.i.时在关节/骨中观察到放射性摄取。渐增的骨摄取可以通过177Lu-艾得奈可汀随时间的体内降解来解释，因此增加了游离177Lu或177Lu复合物的摄取。请注意，所有SPECT图像都按比例缩放至每只小鼠100％kBq/mL。因此，从肾脏清除会在肝脏中导致较高的活度信号。然而，可以假定177Lu-艾得奈可汀的肝脏摄取在通过SPECT成像考虑的时期内几乎保持恒定(7d p.i.，图9A)。
177Lu-艾得奈可汀的第二次SPECT扫描(图9C)显示出类似的器官分布，然而排泄器官(肾脏、肝脏；1h p.i.)中的摄取较低并且清除动力学显著延迟。在72h p.i.延迟的肾脏排泄可能是导致小鼠代谢降低的原因(与来自第一次SPECT扫描的小鼠1相比)。对于两只小鼠中177Lu-艾得奈可汀的药代动力学差异的另一种可能的解释是注射不同的艾得奈可汀量。为两只小鼠注射了可比的放射性量的177Lu-艾得奈可汀(大约35MBq)。然而，由于两种合成的比活度的差异，为小鼠1(图9A/B)注射约100μg艾得奈可汀，而向小鼠2施用更低量的69μg艾得奈可汀(图9C)。较低示踪剂量的注射可能会影响示踪剂的药代动力学。众所周知，SA的降低(例如，通过故意增加未标记的前体的浓度，其可以与示踪剂竞争与相应的靶标结合)可以显著影响放射性药物的特异性结合，从而影响总体药代动力学。对于小鼠1，低的SA和较高的艾得奈可汀量导致177Lu-艾得奈可汀的更快的肾脏清除动力学和更低的肿瘤摄取(图9A/B)，而使用较低的肽量和较高的SA，实现了较高的肾脏和肿瘤摄取以及72h p.i.内的高保留(图9C)。
为了定量177Lu-艾得奈可汀的组织摄取，在72h p.i.(图10C)和7d p.i.(图10A/B)时在SPECT/CT成像之后处死小鼠，解剖目标器官，并且使用γ计数器对称重的组织样品中的活度进行定量。
在72h p.i.之后，在非靶组织中几乎没有观察到177Lu-艾得奈可汀的摄取，除了在排泄器官(如肾脏和肝脏)中的低脾脏摄取和积累。在PD-L1阴性肿瘤组织中未观察到示踪剂摄取，证明PD-L1阳性肿瘤中的肿瘤摄取(3.83％ ID/g)是高度特异性的。相比之下，177Lu-艾得奈可汀的离体生物分布(小鼠2，7d p.i.)仍然显示了在PD-L1阳性和PD-L1阴性肿瘤组织中的摄取的差异，然而在7d p.i.之后，PD-L1阳性肿瘤中的177Lu-艾得奈可汀摄取显著降低至0.3％ ID/g。另外，在7d.p.i.内观察到示踪剂的几乎完全的肾脏清除，而在脾脏(9.3％ ID/g)和肝脏(6.0％ ID/g)中的摄取仍然是明显的。如在小鼠1的SPECT图像中所见，177Lu-艾得奈可汀的肝脏摄取高于小鼠2(图9C)，这可能是由于两种合成的177Lu-艾得奈可汀的比活度的差异。
离体放射自显影、HE染色和免疫组织化学
在SPECT成像之后，处死动物，并且解剖PD-L1阳性和野生型U-698-M肿瘤并准备进行放射自显影分析和HE、IHC染色(图19)。
177Lu-艾得奈可汀的生物分布
在1h、24h、72h、5d和7d p.i.时在携带PD-L1阳性U-698-M和U-698-M野生型肿瘤的小鼠中177Lu-艾得奈可汀的生物分布数据总结在表3中。生物分布数据与对于177Lu-艾得奈可汀的SPECT成像获得的结果非常相关。示踪剂在1h p.i.时展现出较低的血液活度水平，伴随低整体背景积累。177Lu-艾得奈可汀在肾脏中显示出高初始摄取，并且在肝脏和脾脏中的摄取略有增加。然而，虽然从肾脏迅速清除了活度，但肝脏活度水平保持持续的高直到7dp.i.，表明了示踪剂保留在肝脏中，而不是示踪剂缓慢而连续地从肝胆排泄。
表3.在1h、24h、72h、5d和7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中177Lu-艾得奈可汀的生物分布。注射剂量：1MBq；约2.5μg艾得奈可汀/小鼠。数据表示为％ID/g(平均值±SD)。
177Lu-艾得奈可汀在PD-L1阳性肿瘤异种移植物中在1h p.i.之后显示出高PD-L1特异性摄取以及延长的保留直到24h p.i.，而示踪剂从背景有效地清除，除了肝脏和脾脏，这导致肿瘤与背景比率增加。在24h p.i.之后，PD-L1阳性肿瘤积累在7d p.i.内从8.8％ID/g显著下降到0.5％ ID/g。由于在早期成像时间点的高PD-L1表达肿瘤摄取以及低背景积累，以及然而在5d p.i.内从PD-L1阳性肿瘤组织中快速洗脱，177Lu-艾得奈可汀对于对肿瘤中的PD-L1表达进行成像比对于PD-L1配体的治疗应用似乎更可行。
177Lu-艾得奈可汀的剂量测定
表4.在应用177Lu-艾得奈可汀之后不同器官中的吸收剂量[mGy/Mbq]。从在1h、24h、72h、5d和7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中的小鼠生物分布数据外推。(参见表3)
计算出的PD-L1阳性U-698-M肿瘤和野生型U-698-M肿瘤的177Lu-艾得奈可汀的平均比吸收β剂量测定了0.26Gy/MBq和0.017Gy/MBq的值。
177Lu-mAb的小动物SPECT成像
为了验证177Lu-mAb对PD-L1的体内特异性，在携带PDL1阳性U-689-M和U-698-M野生型肿瘤的2只NSG小鼠中进行成像SPECT/CT(图11)。177Lu-mAb的SPECT图像在两只小鼠中都显示了对于单克隆mAb已知的在早期成像时间点(5h p.i.)具有高血池活度和非靶组织中的积累的典型的分布概况。在72h p.i.之后，观察到背景活度的显著清除。然而，肝脏活度水平保持持续的高直到7d p.i.。在24h p.i.之后，观察到177Lu-mAb在PD-L1阳性肿瘤中的高积累，而在对照肿瘤中没有摄取，证明了177Lu-mAb与PD-L1的特异性结合(图11)。有趣的是，对于小鼠1(图11A)，观察到在一周内肿瘤体积的减小，这可能是由于通过用于SPECT成像的177Lu-mAb的量递送的治疗剂吸收剂量。
SPECT小鼠的生物分布显示出96h p.i.低血池活度，导致低的非特异性全身摄取，以及与U-698-M野生型肿瘤(在96h p.i.时为1.9％ ID/g；在7d p.i.时为1.1％ ID/g)相比，177Lu-mAb在PD-L1阳性异种移植物(在96h p.i.时为12.5％ ID/g；在7d p.i.时为41％ID/g)中的摄取明显升高，证明了成功的PD-L1靶向(图12)。
与96h p.i.相比，在7d p.i.时的生物分布数据显示出示踪剂的增加的血池清除，并且观察到低背景积累(图12B)，除了177Lu-mAb的肝脏和脾脏摄取，这是由于177Lu-mAb的肝胆排泄。177Lu-mAb与人PD-L1特异性地结合，而不与鼠PD-L1结合。因此，免疫缺陷NSG小鼠中177Lu-mAb的高脾脏摄取可通过抗体的Fc部分与在非靶器官(如脾脏)中表达Fc受体的鼠细胞之间的相互作用来解释(Sharma等人,Cancer Res.78(7):1820-1832,2018)。另外，已经报道了在高度免疫缺陷小鼠(如NSG)的脾脏内基于抗体的药剂的螯合(Lyon等人,Nat.Biotechnol.32:1059-1062,2014)。
177Lu-mAb在PDL-1阳性肿瘤组织中显示出显著高且PD-L1特异性的摄取(41.5％ID/g)直到7d p.i.。在7d p.i.内在PD-L1阳性异种移植物中177Lu-mAb的显著更高的摄取(41.5％ ID/g)表明了示踪剂随时间连续递送至靶向组织(图12)。另外，在7d p.i.内观察到PD-L1阳性肿瘤的皱缩，表明由于施用177Lu-mAb而产生了治疗效果。
177Lu-mAb的生物分布
在5h、24h和72h p.i.时在3只小鼠中177Lu-mAb的初步生物分布示于图13中。观察到在5h p.i.时的高血池和背景活度以及在72h p.i.内从非靶组织连续清除。在已知降解全尺寸抗体的器官(如肝脏和脾脏)中，在24h p.i.时注意到峰值摄取，而在72h p.i.之后显著降低。在72h p.i.内在所有器官中都观察到177Lu-mAb的清除，而骨摄取随时间增加。此效应可能是由抗体Fc结构域与NSG小鼠骨髓内表达Fc-γ受体的先天免疫效应细胞(如未成熟的巨噬细胞和树突细胞)的相互作用引起的(Jonnalagadda等人,Mol.Ther.2015；23:757-768；Guilliams等人,Nat Rev Immunol.2014；14:94-108)。177Lu-mAb在表达PD-L1的肿瘤中显示出随时间的PD-L1介导的摄取，这被证实是特异性的，这是由于PD-L1阴性U-698-M野生型肿瘤中的摄取可忽略不计。
为了完成177Lu-mAb的生物分布数据(每个时间点3只小鼠)，在5h(n＝2)、24h(n＝2)、72h(n＝2)、5d(n＝3)和7d p.i.(n＝3)时处死另外12只小鼠。数据总结在表5中。
表5.在5h p.i.(n＝2)、24h p.i.(n＝2)、72h p.i.(n＝2)、5d p.i.(n＝3)和7dp.i.(n＝3)时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb的生物分布。注射剂量：0.5-0.6MBq；15μg mAb/小鼠。数据表示为％ID/g(平均值±SD)。
令人惊讶的是，在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb的生物分布仅显示了U698M-PDL1+和U698M野生型肿瘤异种移植物中的177Lu-mAb摄取略有差异，表明了两种肿瘤类型中的高非特异性结合。由于肿瘤组织的增强的渗透性和保留(EPR)效应，预期野生型U-698-M异种移植物中会有177Lu-mAb的中度/低摄取，这有利于较大分子的非特异性肿瘤积累。另外，临床前在PD-L1阴性肿瘤组织中观察到靶向PD-L1的放射性标记的不同抗体的低的非特异性摄取。然而，PD-L1阳性组织中177Lu-mAb的低特异性摄取可能通过在小鼠中注射的放射性标记的抗体的量(0.5-0.6MBq 177Lu-mAb，15μg mAb)太低来解释。连同mAb的低177Lu标记效率(约10％ RCY)，这些结果表明在小鼠中可能仅注射了少量含有非完整mAb级分的完整177Lu-mAb。
在5h、24h、72h、5d和7d p.i.时在携带PD-L1阳性和U-698-M野生型肿瘤的NSG小鼠中重复177Lu-mAb的生物分布(n＝12)。数据总结在表6中。在PBS缓冲液中配制DOTA缀合的抗hPD-L1 mAb(2.0mg/mL，pH 7.4)，并且测试其是完整的。另外，由于脾脏是PD-L1抗体的重要汇集部位(sink)的事实，并且为了增加肿瘤环境中可用177Lu-mAb的量，对于先前的生物分布，在小鼠中注射了更高量的177Lu-mAb，其中在PD-L1阳性和野生型异种移植物中观察到几乎类似的摄取(6-7MBq，约30μg mAb/小鼠(新批次)相比于0.5-0.6MBq，15μg mAb/小鼠(先前的生物分布)；参见表5)。
正如在3只小鼠的初步生物分布中所见，观察到177Lu-mAb的可比器官分布(图9)。观察到在5h p.i.时的高血池和背景活度以及在24h p.i.内从非靶组织连续清除，除了肝脏和脾脏，其中的摄取在7d p.i.内几乎保持恒定，这是由于缓慢的肝胆排泄和此器官中全尺寸抗体的降解。另外，随时间的高脾脏摄取和骨中放射性的渐增积累增加可能可通过抗体的Fc部分与在NSG小鼠[1、3、4]的非靶器官(如脾脏)中表达Fc受体的鼠细胞和骨髓内的先天免疫效应细胞(如未成熟的巨噬细胞和树突细胞)之间的相互作用来解释。与几乎没有显示出在U-698-M-PDL1+和U-698-M野生型肿瘤异种移植物中177Lu-mAb摄取的差异的先前的生物分布(表5)相比，用新批次的177Lu-mAb获得的生物分布数据显示出随时间的表达PD-L1的肿瘤中PD-L1介导的摄取，这被证实是特异性的，这是由于在PD-L1阴性U-698-M野生型肿瘤中的摄取可忽略不计且降低2-3倍。分别地，在72h p.i.时注意到177Lu-mAb在PD-L1阳性异种移植物中的峰值肿瘤摄取(13.1±7.2ID/g)，而在7d p.i.内降低至2.9±1.2ID/g。另外，野生型U-698-M肿瘤显著大于PD-L1阳性异种移植物，这可能会影响肿瘤组织的增强的渗透性，导致在PD-L1阴性肿瘤中更高的非特异性抗体摄取。
表6.|在5h p.i.(n＝3)、24h p.i.(n＝3)、72h p.i.(n＝3)、5d p.i.(n＝3)和7dp.i.(n＝3)时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中177Lu-抗PD-L1 mAb(新批次)的第二次生物分布。注射剂量：6-7MBq；大约30μg mAb/小鼠。数据表示为％ID/g(平均值±SD)。
/>
177Lu-mAb的剂量测定。
表7.在应用177Lu-mAb之后不同器官中的吸收剂量[mGy/Mbq]。从在5h、24h、72h、5d和7d p.i.时在携带U698M-PDL1+和U698M肿瘤的NSG小鼠中的小鼠生物分布数据(表6)外推。
计算出的PD-L1阳性U-698-M肿瘤和野生型U-698-M肿瘤的177Lu-mAb的平均比吸收β剂量分别测定了1.26Gy/MBq和0.054Gy/MBq的值。
采用177Lu-mAb的疗法研究
由于与177Lu-艾得奈可汀相比，177Lu-mAb的更高的肿瘤与器官辐射剂量比率以及在PD-L1阳性组织中更高的保留在7d p.i.内，评价了177Lu-mAb用于放射免疫疗法的潜力，以评估PD-L1靶向放射性核素疗法的有效性和毒性。
在开始使用177Lu-mAb的疗法研究之前，在竞争性结合测定中使用转导的PD-L1阳性U-698-M细胞再次研究177Lu-mAb对人PD-L1的结合和特异性，以确保使用完整的177Lu-mAb在小鼠中进行治疗研究(图20)。177Lu-mAb对人PD-L1显示出高亲和力，其中IC50值为5.5nM(图20，左图)。使用未转染的U-689-M细胞作为阴性对照证实了特异性结合，证明了177Lu-mAb以PD-L1表达依赖性方式与肿瘤细胞的体外结合(图20，右图)。
平行地，对转导的PD-L1阳性和野生型U-689-M细胞进行另外的FACS分析，以确保在小鼠中接种两种细胞系以使用177Lu-mAb进行治疗研究之前，转导的细胞系的稳定的PD-L1表达。通过FACS分析测定的转导的和野生型U-698-M细胞上PD-L1表达的定量显示了野生型U-698-M细胞的低PD-L1表达。
相比之下，对于稳定的转导的U-698-M细胞，观察到高PD-L1表达。因此，两种细胞系都适于建立PD-L1阳性和PD-L1阴性异种移植物，以用于177Lu-mAb放射免疫疗法的体内评价。
结论
以定量RCY和高RCP(>95％)获得了177Lu-艾得奈可汀和177Lu-mAb。177Lu-艾得奈可汀的SPECT成像和生物分布研究显示了在早期时间点PD-L1+肿瘤(在1h p.i.时为7.5％±4.7％ ID/g)和肾脏(在1h p.i.时为129.2％±6.7％ ID/g)中的高摄取，而在PD-L1阴性肿瘤(在1h p.i.时为0.3％±0.1％ Id/g)和其他组织中的摄取可忽略不计。177Lu-艾得奈可汀随时间从肾脏有效地清除，然而在24h p.i.之后，PD-L1阳性肿瘤中的示踪剂摄取在7dp.i.内显著降低至0.5％ ID/g。177Lu-mAb的SPECT成像显示出关于mAb已知的在早期成像时间点具有高血池和背景活度的典型的分布概况。在72h p.i.之后，观察到177Lu-mAb的显著的背景清除以及在PD-L1阳性肿瘤中高且持续的摄取。通过在PD-L1阴性肿瘤组织中的摄取可忽略进一步证实了177Lu-mAb与PD-L1的特异性结合。177Lu-mAb的初步生物分布数据与用SPECT成像获得的那些结果(n＝3)是可比的。
177Lu-艾得奈可汀和177Lu-mAb显示出优异的体内PD-L1靶向特征。177Lu-艾得奈可汀在早期成像时间点显示了高且特异性的肿瘤摄取以及低背景积累。如在SPECT和生物分布研究中所见，177Lu-艾得奈可汀在7d p.i.内在PD-L1阳性肿瘤组织中显示出快速清除以及仅低保留，导致低肿瘤与器官辐射剂量比以及高肾脏剂量。然而，由于在7d p.i.内177Lu-艾得奈可汀从PD-L1阳性肿瘤组织快速清除，艾得奈可汀对于PD-L1靶向成像似乎更可行，例如使用68Ga标记的艾得奈可汀。
相比之下，177Lu-mAb在7d p.i.内显示出延长的高PD-L1特异性肿瘤摄取以及背景活度的持续清除。177Lu-mAb SPECT成像显示了在早期成像时间点具有高血池和背景活度的靶标特异性分布概况。在24至72h p.i.之后，在7d p.i.内观察到177Lu-mAb的显著的背景清除以及在PD-L1阳性肿瘤中高且持续的摄取。177Lu-mAb的剂量测定计算显示了可接受的高肿瘤与器官辐射剂量，表明了PD-L1阳性异种移植物的PD-L1靶向放射免疫疗法治疗的有效性，表明了PD-L1靶向放射性核素疗法的潜力很大。另外，177Lu-mAb SPECT成像可以潜在地用于执行治疗计划或确定对免疫疗法的反应。
表8：序列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
等效方案
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在被以下权利要求所涵盖。

Claims (221)

1.一种用于在检测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含
(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含与PD-L1结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和放射性核素；以及
(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述FBS多肽包含与PD-L1结合的10Fn3结构域。
3.根据权利要求2所述的组合，其中与人PD-L1结合的所述10Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)所述10Fn3具有至少一个选自氨基酸序列相对于人10Fn3结构域(SEQ IDNO:1)的相应环的序列发生改变的环BC、DE和FG的环，并且(c)所述多肽与人PD-L1特异性地结合。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的组合，其中所述10Fn3结构域以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM的KD与人PD-L1结合。
5.根据权利要求3或权利要求4中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：
(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；
(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；
(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；
(d)分别地，SEQ ID NO:51、52和53；
(e)分别地，SEQ ID NO:66、67和68；
(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或者
(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:5、20、35、50、65、80或96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80、88、96或104至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80或88至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
9.根据权利要求7中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:96或104。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID No:681、682和683所示的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID No:684、685和686所示的VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:679的VH和含有SEQ ID NO:680的VL。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合，其中抗PD-L1是12A4。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含作为β+发射体或γ-发射体的放射性核素。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
16.根据权利要求15所述的组合，其中所述放射成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、64Cu、86Y、44Sc或18F。
17.根据权利要求16所述的组合，其中所述成像剂包含68Ga。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过螯合剂与所述FBS多肽连接。
19.根据权利要求18所述的组合，其中所述螯合剂包含与所述FBS多肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的组合，其中所述螯合剂通过接头与所述FBS多肽共价附接。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的组合，其中所述接头与所述FBS多肽的C末端附接。
22.根据权利要求21所述的组合，所述接头是选自以下的肽接头：EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:592)、EIEKPC(SEQ ID NO:590)、GSGC(SEQ ID NO:638)、PC、PIDKPC(SEQ ID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPCQ(SEQ IDNO:615)或PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)。
23.根据权利要求22所述的组合，其中所述肽接头是PC。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的组合，其中所述螯合剂经由在所述多肽的C末端附近的半胱氨酸残基与所述FBS多肽共价连接。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是环辛炔衍生物。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是双功能螯合剂(BFC)。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
28.根据权利要求18-26中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
29.根据权利要求18-26中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
30.根据权利要求18-26中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过选自NODAGA、DOTA或NOTA的螯合剂与所述FBS多肽连接。
31.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至68Ga的FBS多肽。
32.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODAGA结合至68Ga的FBS多肽。
33.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至68Ga的FBS多肽。
34.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至64Cu的FBS多肽。
35.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODOGA结合至64Cu的FBS多肽。
36.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至64Cu的FBS多肽。
37.根据权利要求1-26中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含作为β-发射体、α-发射体、俄歇发射体或其组合的放射性核素。
38.根据权利要求37所述的组合，其中所述放射治疗剂包含选自以下的放射性核素：90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
39.根据权利要求38所述的组合，其中所述放射治疗剂包含177Lu。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段连接。
41.根据权利要求40所述的组合，其中所述螯合剂包含与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。
42.根据权利要求40或41中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是环辛炔衍生物。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是双功能螯合剂(BFC)。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的组合，其中所述螯合剂选自NODAGA、DOTA、NOTA、DPTA或其衍生物。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
46.根据权利要求40-44中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
47.根据权利要求40-44中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的组合，其中所述螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的一个或多个赖氨酸残基连接。
49.根据权利要求48所述的组合，其中所述螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的2-5个赖氨酸连接。
50.根据权利要求40-48中任一项所述的组合，其中所述螯合剂经由半胱氨酸残基与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段共价连接。
51.根据权利要求1-44中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
52.根据权利要求1-44中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过NODAGA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
53.根据权利要求1-44中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过NOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
54.根据权利要求18-53中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂与所述放射治疗剂的螯合剂相同。
55.根据权利要求1所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至68Ga的FBS多肽，并且所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
56.根据权利要求1所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至68Ga的FBS多肽，并且所述放射治疗剂包含通过NOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
57.根据权利要求1所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至68Ga的FBS多肽，并且所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:104，并且所述放射治疗剂包含12A4。
59.一种制品，所述制品包含根据权利要求1-58中任一项所述的组合。
60.一种检测和治疗患有表达PD-L1的癌症的受试者的方法，所述方法包括
a.确定PD-L1在患有癌症的受试者中的存在，其包括施用根据权利要求2-9和14-36中任一项所述的放射成像剂，以及如果发现PD-L1存在于所述受试者的一个或多个肿瘤中，则
b.向所述受试者施用根据权利要求10-13和37-58中任一项所述的放射治疗剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述放射成像剂包含含有SEQ ID NO:96或SEQID NO:104的10Fn3结构域。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述放射治疗剂包含12A4或其抗原结合片段。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述放射成像剂通过DOTA结合至68Ga，并且所述放射治疗剂通过DOTA结合至177Lu。
64.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述放射成像剂通过NOTA结合至68Ga，并且所述放射治疗剂通过NOTA结合至177Lu。
65.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述放射成像通过NOTA结合至68Ga，并且所述放射治疗剂通过DOTA结合至177Lu。
66.根据权利要求60-65中任一项所述的方法，其中所述放射成像剂包含SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:104，并且所述放射治疗剂包含12A4。
67.根据权利要求60-66中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序，
(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；
(ii)在所述受试者中检测所述放射成像剂；以及
(iii)向所述受试者施用所述放射治疗剂。
68.根据权利要求60-66中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序，
(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；
(ii)确定所述放射成像剂在所述受试者中的存在；以及
(iii)如果在所述受试者中检测到所述放射成像剂，则向所述受试者施用所述放射治疗剂。
69.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其中还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂例如以监测所述受试者中的PD-L1水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的PD-L1水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
70.一种放射治疗剂，所述放射治疗剂包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素。
71.根据权利要求70所述的放射治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID No:681、682和683所示的VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的放射治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含分别如SEQ ID No:684、685和686所示的VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
73.根据权利要求70所述的放射治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:679的VH和含有SEQ ID NO:680的VL。
74.根据权利要求70所述的放射治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体是12A4。
75.根据权利要求70-74中任一项所述的放射治疗剂，其中所述放射性核素选自90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
76.根据权利要求70-75中任一项所述的放射治疗剂，其中所述放射性核素是177Lu。
77.根据权利要求70-76中任一项所述的放射治疗剂，其中所述放射性核素通过螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段连接。
78.根据权利要求77所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂包含与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂是环辛炔衍生物。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂是双功能螯合剂(BFC)。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂选自NODAGA、DOTA、NOTA、DPTA或其衍生物。
82.根据权利要求77-81中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
83.根据权利要求77-81中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
84.根据权利要求77-81中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
85.根据权利要求77-84中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的一个或多个赖氨酸残基连接。
86.根据权利要求85所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段中的2-5个赖氨酸连接。
87.根据权利要求77-84中任一项所述的放射治疗剂，其中所述螯合剂经由半胱氨酸残基与所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段共价连接。
88.根据权利要求70-81中任一项所述的放射治疗剂，所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
89.根据权利要求70-81中任一项所述的放射治疗剂，其中所述放射治疗剂包含通过NODAGA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
90.根据权利要求70-81中任一项所述的放射治疗剂，其中所述放射治疗剂包含通过NOTA结合至177Lu的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
91.根据权利要求70-90中任一项所述的放射治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体是12A4。
92.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求70-91中任一项所述的放射治疗剂。
93.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求70-91中任一项的放射性标记的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求92所述的药物组合物。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述癌症是转移性恶性黑色素瘤(MEL)、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、卵巢癌(OV)、胃癌(GC)、乳腺癌(BC)、胰腺癌(PC)或食道癌。
95.一种制品，所述制品包含根据权利要求70-91中任一项所述的放射治疗剂和一个或多个容器。
96.一种用于在检测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含
(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素；以及
(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体或其抗原结合片段和放射性核素，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的PD-L1抗体具有相同的抗原结合特异性。
97.根据权利要求96所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
98.根据权利要求97所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga。
99.根据权利要求97所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是177Lu。
100.根据权利要求96-99中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂的放射性核素是90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
101.根据权利要求100所述的组合，其中所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
102.根据权利要求96-101中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
103.根据权利要求96-102中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和/或所述放射治疗剂的放射性核素与所述PD-L1抗体或其抗原结合片段直接连接。
104.根据权利要求96-103中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和所述放射治疗剂的放射性核素与所述PD-L1抗体或其抗原结合片段直接连接。
105.根据权利要求96-102中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和/或所述放射治疗剂的放射性核素通过螯合剂与所述PD-L1抗体或其抗原结合片段连接。
106.根据权利要求96-102中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的放射性核素和所述放射治疗剂的放射性核素通过螯合剂与所述PD-L1抗体或其抗原结合片段连接。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂是NODAGA、DOTA、NOTA或DTPA。
108.根据权利要求105-107中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂的螯合剂是NODAGA、DOTA、NOTA或DTPA。
109.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂的螯合剂与所述放射治疗剂的螯合剂相同。
110.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂和/或所述放射治疗剂的螯合剂是NODAGA。
111.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂和/或所述放射治疗剂的螯合剂是DOTA。
112.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂和/或所述放射治疗剂的螯合剂是NOTA。
113.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂和/或所述放射治疗剂的螯合剂是DTPA。
114.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
115.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
116.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
117.根据权利要求105-108中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DTPA，并且所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
118.根据权利要求97-117中任一项所述的组合，其中所述抗体或其抗原结合片段以10-7M、10-8M、10-9M或更小的KD与人PD-L1结合。
119.根据权利要求97-117中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和/或所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
120.根据权利要求119所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
121.根据权利要求97-118中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和/或所述放射治疗剂的抗体是抗原结合片段。
122.根据权利要求121所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体是抗体的抗原结合片段，并且所述放射治疗剂的抗体是全长抗体，其包含全长重链、具有或不具有C末端赖氨酸，和全长轻链。
123.根据权利要求122所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体是抗体的抗原结合片段。
124.根据权利要求97-123中任一项所述的组合，其中所述抗体或抗原结合片段包含所述抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)。
125.根据权利要求97-124中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含至少95％相同的氨基酸序列。
126.根据权利要求125所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含至少97％相同的氨基酸序列。
127.根据权利要求126所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体和所述放射治疗剂的抗体包含至少98％相同的氨基酸序列。
128.根据权利要求127中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含99％相同的氨基酸序列。
129.根据权利要求97-128中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含相同的VH CDR1、CDR2和CDR3。
130.根据权利要求129所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含相同的VH CDR1、CDR2和CDR3以及相同的VLCDR1、CDR2和CDR3。
131.根据权利要求120所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或其抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或其抗原结合片段包含相同的VH和VL。
132.根据权利要求131中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂的抗体或抗原结合片段和所述放射治疗剂的抗体或抗原结合片段是相同的，除了其中一种抗体的重链能够包含C末端半胱氨酸。
133.根据权利要求132所述的组合，其中所述抗原结合片段不包含CH2或CH3区。
134.根据权利要求97-133中任一项所述的组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含抗体12A4的VH CDR和VL CDR。
135.根据权利要求97-134中任一项所述的组合，其中所述抗体包含抗体12A4的VH和VL。
136.根据权利要求97-135中任一项所述的组合，其中所述抗体包含抗体12A4的重链和轻链。
137.根据权利要求97所述的组合，其中
(a)所述放射成像剂的放射性核素是68Ga；
(b)所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu；并且
其中所述放射成像剂的PD-L1抗体或抗原结合片段和所述放射治疗剂的PD-L1抗体或抗原结合片段包含抗体12A4的VH CDR1、CDR2、CDR3以及VL CDR2、CDR2和CDR3。
138.根据权利要求137所述的组合，其中所述放射成像剂的PD-L1抗体或抗原结合片段和所述放射治疗剂的PD-L1抗体或抗原结合片段包含12A4的VH和VL。
139.根据权利要求137所述的组合，其中所述放射成像剂的PD-L1抗体和所述放射治疗剂的PD-L1抗体包含12A4的重链和轻链。
140.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求97-139中任一项所述的组合和使用说明书。
141.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者
(a)在第一时间施用放射成像剂，所述放射成像剂包含PD-L1抗体或抗原结合片段、放射性核素；以及
(b)在第二时间施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含PD-L1抗体或抗原结合片段和放射性核素，
其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的PD-L1抗体具有相同的抗原结合特异性。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂分别是权利要求97-139中任一项所定义的放射成像剂和放射治疗剂。
143.根据权利要求141或权利要求142所述的方法，其中所述第一时间和所述第二时间是不同的时间。
144.根据权利要求141或权利要求142所述的方法，其中至少一次，所述第一时间与所述第二时间相同。
145.根据权利要求141-143中任一项所述的方法，其中所述第一时间是在所述第二时间之前。
146.根据权利要求141-145中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序，
(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；
(ii)在所述受试者中检测所述放射成像剂；以及
(iii)向所述受试者施用所述放射治疗剂。
147.根据权利要求141-145中任一项所述的方法，其中按照(i)至(iii)的顺序，
(i)向所述受试者施用所述放射成像剂；
(ii)确定所述放射成像剂在所述受试者中的存在；以及
(iii)如果在所述受试者中检测到所述放射成像剂，则向所述受试者施用所述放射治疗剂。
148.根据权利要求141-147中任一项所述的方法，其中还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂例如以监测所述受试者中的PD-L1水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的PD-L1水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
149.一种用于在诊断、监测和治疗受试者的癌症中使用的组合，所述组合包含
(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含与由所述癌症表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和放射性核素；以及
(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含所述FBS多肽和放射性核素，
其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的FBS多肽与所述靶标结合。
150.根据权利要求149所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂的FBS多肽是相同的。
151.根据权利要求149或权利要求150所述的组合，其中所述成像剂包含作为β+发射体或γ-发射体的放射性核素。
152.根据权利要求149-151中任一项所述的组合，其中所述成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
153.根据权利要求152所述的组合，其中所述成像剂包含选自以下的放射性核素：68Ga、64Cu、86Y、44Sc或18F。
154.根据权利要求149所述的组合，其中所述成像剂包含68Ga。
155.根据权利要求149-154中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含作为β-发射体、α-发射体、俄歇发射体或其组合的放射性核素。
156.根据权利要求155所述的组合，其中所述放射治疗剂包含选自以下的放射性核素：90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
157.根据权利要求149-156中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含177Lu。
158.根据权利要求149-157中任一项所述的组合，其中所述放射性核素通过螯合剂与所述放射成像剂和/或所述放射治疗剂的FBS多肽连接。
159.根据权利要求158所述的组合，其中所述放射成像剂的螯合剂与所述放射治疗剂的螯合剂相同。
160.根据权利要求158或权利要求159所述的组合，其中所述螯合剂是环辛炔衍生物。
161.根据权利要求158-160中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是双功能螯合剂(BFC)。
162.根据权利要求158-161中任一项所述的组合，其中所述螯合剂包含与所靶向蛋白或肽上的胺、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。
163.根据权利要求158-162中任一项所述的组合，其中所述螯合剂经由在所述多肽的C末端附近的半胱氨酸残基与所述FBS多肽共价连接。
164.根据权利要求158-163中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
165.根据权利要求158-163中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
166.根据权利要求158-163中任一项所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
167.根据权利要求158-163中任一项所述的组合，其中所述螯合剂通过接头与所述FBS多肽共价附接。
168.根据权利要求167所述的组合，其中所述接头与所述FBS多肽的C末端附接。
169.根据权利要求167或权利要求168所述的组合，所述接头是选自以下的肽接头：EGSGC(SEQ ID NO:585)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:586)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:592)、EIEKPC(SEQID NO:590)、GSGC(SEQ ID NO:638)、PC、PIDKPC(SEQ ID NO:611)、PIEKPC(SEQ ID NO:612)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:615)或PIEKPCQ(SEQ ID NO:616)。
170.根据权利要求169所述的组合，其中所述肽接头是PC。
171.根据权利要求149-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至68Ga的FBS多肽。
172.根据权利要求149-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODAGA结合至68Ga的FBS多肽。
173.根据权利要求149-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至68Ga的FBS多肽。
174.根据权利要求149-153和155-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过DOTA结合至64Cu的FBS多肽。
175.根据权利要求149-153和155-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NODOGA结合至64Cu的FBS多肽。
176.根据权利要求149-153和155-163中任一项所述的组合，其中所述放射成像剂包含通过NOTA结合至64Cu的FBS多肽。
177.根据权利要求149-176中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过DOTA结合至177Lu的FBS多肽。
178.根据权利要求149-176中任一项所述的组合，其中所述放射治疗剂包含通过NODAGA或NOTA与177Lu复合的FBS多肽。
179.根据权利要求149-178中任一项所述的组合，其中所述FBS多肽包含与所述靶分子结合的人10Fn3结构域。
180.根据权利要求179所述的组合，其中所述10Fn3结构域与人PD-L1结合。
181.根据权利要求180所述的组合，其中与人PD-L1结合的所述10Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)所述10Fn3具有至少一个选自氨基酸序列相对于人10Fn3结构域(SEQID NO:1)的相应环的序列发生改变的环BC、DE和FG的环，并且(c)所述多肽与人PD-L1特异性地结合。
182.根据权利要求180或权利要求181所述的组合，其中所述10Fn3结构域以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM的KD与人PD-L1结合。
183.根据权利要求180-182中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：
(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；
(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；
(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；
(d)分别地，SEQ ID NO:51、52和53；
(e)分别地，SEQ ID NO:66、67和68；
(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或者
(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。
184.根据权利要求180-183中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ IDNO:5、20、35、50、65、80或96至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
185.根据权利要求184所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80、88、96或104至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
186.根据权利要求180-183所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:80或88至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
187.根据权利要求180-183中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含SEQ IDNO:96或104。
188.根据权利要求180-187中任一项所述的用于诊断、监测和治疗表达PD-L1的癌症的组合，其中所述组合包含
(a)放射成像剂，所述放射成像剂包含FBS多肽，所述FBS多肽包含含有SEQ ID NO:80、88、96或104的人10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的C末端共价结合至包含氨基酸序列PC的接头；并且所述放射性核素是通过螯合剂与所述接头的半胱氨酸残基复合的68Ga；以及
(b)放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽，所述FBS多肽包含含有SEQ ID NO:80、88、96或104的人10Fn3结构域，其中所述10Fn3结构域的C末端共价结合至包含氨基酸序列PC的接头；并且所述放射性核素是通过螯合剂与所述接头的半胱氨酸残基复合的177Lu。
189.根据权利要求188所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂包含相同的人10Fn3结构域。
190.根据权利要求188或权利要求189所述的组合，其中所述放射成像剂和所述放射成像剂的螯合剂是相同的。
191.根据权利要求190所述的组合，其中所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
192.根据权利要求190所述的组合，其中所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
193.根据权利要求190所述的组合，其中所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
194.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求149-193中任一项所述的放射成像剂。
195.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求149-193中任一项所述的放射治疗剂。
196.一种用于在放射成像和放射疗法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含
(a)基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽，其与靶标和适于放射成像的放射性核素的螯合剂结合；以及
(b)FBS多肽，其与靶标和适于放射疗法的放射性核素的螯合剂结合，
其中所述FBS多肽在(a)和(b)中是相同的，并且其中所述试剂盒含有使所述FBS多肽与所述放射性核素螯合的说明书。
197.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述放射成像剂的放射性核素选自68Ga、18F、64Cu、123I、131I、125I、11C、75Br、124I、13N、32P、35C、99mTc、153Gd、111In、67Ga、201Tl、90Y、188Rh、153Sm、89Sr和211At。
198.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述放射成像剂的放射性核素选自68Ga、64Cu、86Y、44Sc或18F。
199.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga。
200.根据权利要求196-199中任一项所述的试剂盒，其中所述放射治疗剂的放射性核素选自90Y、67Cu、213Bi、212Bi、186Re、67Cu、90Y、213Bi、177Lu、67G、225Ac和227Th。
201.根据权利要求196-200中任一项所述的试剂盒，其中所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
202.根据权利要求196-201中任一项所述的试剂盒，其中所述放射成像剂的放射性核素是68Ga，并且所述放射治疗剂的放射性核素是177Lu。
203.根据权利要求196-202中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是环辛炔衍生物。
204.根据权利要求196-202中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是NODAGA或其衍生物。
205.根据权利要求196-202中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是DOTA或其衍生物。
206.根据权利要求196-202中任一项所述的试剂盒，其中(a)和/或(b)的所述螯合剂是NOTA或其衍生物。
207.根据权利要求196-205中任一项所述的试剂盒，其中(a)和(b)的所述螯合剂是相同的。
208.根据权利要求196-206中任一项所述的试剂盒，其中所述FBS多肽包含人10Fn3结构域。
209.根据权利要求207所述的试剂盒，其中所述FBS多肽包含与人PD-L1结合的人10Fn3结构域。
210.根据权利要求208所述的试剂盒，其中其中与人PD-L1结合的所述10Fn3结构域包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，(b)所述10Fn3具有至少一个选自氨基酸序列相对于人10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)的相应环的序列发生改变的环BC、DE和FG的环，并且(c)所述多肽与人PD-L1特异性地结合。
211.根据权利要求209所述的试剂盒，其中所述10Fn3结构域的BC、DE和FG环包含以下的氨基酸序列：
(a)分别地，SEQ ID NO:6、7和8；
(b)分别地，SEQ ID NO:21、22和23；
(c)分别地，SEQ ID NO:36、37和38；
(d)分别地，SEQ ID NO:51、52和53；
(e)分别地，SEQ ID NO:66、67和68；
(f)分别地，SEQ ID NO:81、82和83；或者
(g)分别地，SEQ ID NO:97、98和99。
212.根据权利要求210所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:104至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
213.根据权利要求210所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:88至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
214.根据权利要求208-210中任一项所述的组合，其中所述10Fn3结构域包含SEQ IDNO:88。
215.根据权利要求196-213中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种放射性核素。
216.根据权利要求214所述的试剂盒，其中所述一种或多种放射性核素是68Ga和177Lu。
217.一种诊断和治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与由癌细胞表达的靶标结合的基于纤连蛋白的支架(FBS)多肽和适于放射成像的放射性核素；
(b)获得所述受试者的全部或一部分的放射图像，以确定所述靶标在所述受试者中的存在；
(c)施用放射治疗剂，所述放射治疗剂包含FBS多肽和适于放射疗法的放射性核素，
其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂与相同的靶标结合。
218.根据权利要求216所述的方法，其中所述放射成像剂和所述放射治疗剂分别如权利要求149-193中任一项所定义。
219.根据权利要求216或权利要求217所述的方法，其中还在所述放射治疗剂之后施用所述放射成像剂以监测所述受试者中的靶标水平，并且基于用所述放射成像剂鉴定的靶标水平来确定所述放射治疗剂的进一步施用。
220.一种治疗患有表达PD-L1的癌症的受试者的方法，所述方法包括
a.确定PD-L1在患有癌症的受试者中的存在，其包括向所述受试者施用放射成像剂，所述放射成像剂包含与螯合剂和68Ga连接的FBS多肽，所述FBS多肽包含与人PD-L1结合的人10Fn3结构域，以及如果发现PD-L1存在于所述受试者的一个或多个肿瘤中，则
b.向所述受试者施用与螯合剂和177Lu连接的FBS多肽，所述FBS多肽包含与人PD-L1结合的人10Fn3结构域。
221.根据权利要求219所述的方法，其中所述放射成像剂如权利要求180-193中任一项所定义，并且所述放射治疗剂如权利要求180-193中任一项所定义。
CN202180029558.0A 2020-02-28 2021-02-26 基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途 Pending CN116568341A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062983412P 2020-02-28 2020-02-28
US62/983,412 2020-02-28
PCT/US2021/019972 WO2021174045A1 (en) 2020-02-28 2021-02-26 Radiolabeled fibronectin based scaffolds and antibodies and theranostic uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116568341A true CN116568341A (zh) 2023-08-08

Family

ID=75396847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180029558.0A Pending CN116568341A (zh) 2020-02-28 2021-02-26 基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4110407A1 (zh)
JP (1) JP2023515633A (zh)
CN (1) CN116568341A (zh)
WO (1) WO2021174045A1 (zh)

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
DE69835143T2 (de) 1997-01-21 2007-06-06 The General Hospital Corp., Boston Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20050019826A1 (en) 2000-03-31 2005-01-27 Roselyne Tournaire Peptides blocking vascular endothelial growth factor(vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said pepetides and methods of use thereof
EP1301538B1 (en) 2000-07-11 2015-12-09 Research Corporation Technologies, Inc Artificial antibody polypeptides
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
CN102816241B (zh) 2004-02-09 2015-07-22 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
JP5252635B2 (ja) 2005-07-01 2013-07-31 メダレックス インコーポレーティッド プログラム死リガンド１（ｐｄ−ｌ１）に対するヒトモノクローナル抗体
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
EP2222846B1 (en) 2007-08-10 2017-05-03 Protelix, Inc. Universal fibronectin type iii binding-domain libraries
AU2008319298B2 (en) 2007-10-31 2014-07-31 Medimmune, Llc Protein scaffolds
WO2009086116A2 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Alternative scaffold protein fusions phage display via fusion to plx of m13 phage
CA2710835A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Novartis Ag Improved fibronectin-based binding molecules and their use
US9296810B2 (en) 2008-05-02 2016-03-29 Novartis Ag Fibronectin-based binding molecules and uses thereof
CN102307896B (zh) 2008-10-31 2016-10-12 森托科尔奥索生物科技公司 基于iii型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
LT4209510T (lt) 2008-12-09 2024-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-l1 antikūnai ir jų panaudojimas t ląstelių funkcijos pagerinimui
CN102596992B (zh) 2009-02-12 2015-09-09 詹森生物科技公司 基于ⅲ型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
US20120270797A1 (en) 2009-08-13 2012-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Engineered proteins including mutant fibronectin domains
EP3434769B1 (en) 2009-10-30 2020-11-25 Novartis AG Universal fibronectin type iii bottom-side binding domain libraries
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
PT2504364T (pt) 2009-11-24 2017-11-14 Medimmune Ltd Agentes de ligação direcionados contra b7-h1
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
WO2011100700A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 University Of Rochester Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies
CN102906112B (zh) 2010-04-13 2016-12-07 米迪缪尼有限公司 Trail r2-特异性多聚体支架
RS55163B1 (sr) 2010-04-30 2017-01-31 Janssen Biotech Inc Kompozicije stabiliziranih fibronektin domena, metode izgradnje i upotrebe
MX345300B (es) 2010-07-30 2017-01-24 Novartis Ag * Moléculas andamio de fibronectina y bibliotecas de las mismas.
WO2013067029A2 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity
AU2012344260B2 (en) 2011-11-28 2017-09-07 Merck Patent Gmbh Anti-PD-L1 antibodies and uses thereof
CA2873402C (en) 2012-05-15 2023-10-24 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
CN115093480A (zh) 2012-05-31 2022-09-23 索伦托药业有限公司 与pd-l1结合的抗原结合蛋白
US9433689B2 (en) 2013-03-12 2016-09-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio Probes and methods of imaging non-Hodgkins lymphoma
EA034516B1 (ru) 2014-11-25 2020-02-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы и композиции для мечения радиоактивным изотопомf биологических препаратов
KR102632418B1 (ko) 2014-11-25 2024-01-31 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 영상화를 위한 신규 pd-l1 결합 폴리펩티드
IL292449B2 (en) 2015-03-13 2024-02-01 Cytomx Therapeutics Inc Nucleic acids encoding antibodies against PDL1 and methods for their preparation
US20180071413A1 (en) * 2015-04-07 2018-03-15 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Non-invasive imaging of tumor pd-l1 expression
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
WO2017210335A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics
WO2017210302A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Pet imaging with pd-l1 binding polypeptides
WO2019227490A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and methods for imaging

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021174045A1 (en) 2021-09-02
EP4110407A1 (en) 2023-01-04
JP2023515633A (ja) 2023-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11173219B2 (en) PD-L1 binding polypeptides for imaging
US20220184239A1 (en) Methods and compositions for 18f-radiolabeling of biologics
US20220347324A1 (en) Pet imaging with pd-l1 binding polypeptides
US11524992B2 (en) Glypican-3-binding fibronectin based scaffold molecules
CN116568341A (zh) 基于纤连蛋白的放射性标记的支架和抗体及其治疗诊断用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination