CN102906112B - Trail r2-特异性多聚体支架 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合TRAIL受体2(TRAIL R2)(参与细胞凋亡的细胞膜受体)的基于腱糖蛋白‑3FnIII结构域的多聚体支架。本发明还提供了具有增强的对于靶的亲和力、增强的稳定性和减小的免疫原性的工程变体。此外，本发明还涉及作为预防剂、治疗剂或诊断剂的工程多价支架以及它们抗由表达TRAIL R2的细胞引起的疾病的用途，特别地涉及抗癌的治疗性用途。

Description

TRAIL R2-特异性多聚体支架
发明背景
参考序列表
本申请通过引用以标题为“2943.011PC02_sequence_listing.txt”的文本文件(于2011年4月12日创建的并且大小为211千字节)与本申请一起通过EFS-Web提交的序列表将其并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及抗体模拟物的领域，具体地涉及用于例如产生具有新型结合特征的产物的基于纤连蛋白III型(Fn3)结构域的多聚体支架。具体地，本发明涉及衍生自人胰糖蛋白C的第3FnIII结构域的TRAIL R2-特异性多聚体支架，以及它们用于TRAIL R2受体检测和TRAIL R2-介导的功能的调节例如癌症和其它障碍的治疗的用途。
背景领域
能够特异性结合期望的靶表位的生物分子具有作为治疗剂、研究和医学诊断工具的极大重要性。该类分子的公知实例为抗体。可选择特异性结合几乎任何结构表位和具有对于所述表位的亲和力的抗体。然而，经典抗体是难以在简单真核系统中表达的结构复杂的异源四聚体分子。因此，大多数抗体使用复杂且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生。
具有相对确定的三维结构的蛋白质(通常称为蛋白质支架)可用作用于设计工程产物的试剂。其中这类支架是有用的一个具体领域是抗体模拟物设计的领域。抗体模拟物，即小的非抗体蛋白质治疗剂，利用抗体和抗体片段的有利方面，例如对靶的高亲和力结合以及低免疫原性和毒性，同时避免一些缺点，例如抗体片段聚集的倾向以及不如全长IgG稳定。
这些缺点可通过使用通过除去抗体天然折叠的部分产生的抗体片段来解决。然而，当通常包埋在疏水环境例如可变结构域与恒定结构域之间的界面中的氨基酸残基变得暴露于溶液时，这通常引起聚集。基于支架的抗体模拟物的一个实例基于III型(FnIII)的纤连蛋白模块(在门(phyla)间和蛋白质种类间(例如在哺乳动物的血液和结构蛋白质中)被广泛发现的结构域)的结构。
TRAIL(肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体，在文献中也称为Apo2L和TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族并且已被鉴定为肿瘤细胞的程序化细胞死亡或细胞凋亡的激活物。TRAIL的膜结合和可溶性形式都能够通过与位于靶细胞上的TRAIL受体相互作用来触发细胞凋亡。在人中，已鉴定了5个受体具有对TRAIL的结合活性。在TRAIL对TRAIL R1或TRAIL R2结合后，触发了半胱天冬酶相关的细胞死亡。鉴于该细胞死亡活性，正在寻找基于TRAIL的治疗方法。已开发了几种基于TRAIL或TRAIL R1或R2人激动抗体的治疗性方法，然而，TRAIL具有极短的寿命，其结合诱饵受体，并且抗体的大尺寸可限制它们的肿瘤渗透。因此，存在对可结合TRAIL受体的新型分子、包含此类分子的药物组合物、用于筛选此类分子的方法以及用于在许多癌症的治疗性治疗中使用此类分子的方法的需要。
本文中的参考资料的引述或论述不应当被解释为这对于本发明是现有技术的承认。
发明概述
本发明提供了包含2个Tn3单体支架的TRAIL R2-特异性重组多聚体支架，其中(a)每一个Tn3单体支架包含命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，和6个命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的环区域，(b)Tn3单体支架以串联形式连接，以及(c)重组多聚体支架特异性结合TRAILR2。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个Tn3单体支架。在一些其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的所有Tn3单体支架以串联形式存在。
在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少一个Tn3单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于1、2、3、4、5、6或7个其它Tn3单体支架。在某些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架直接连接而无间插在Tn3单体支架之间的接头。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含肽接头。在一些实施方案中，肽接头是柔性肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含(GxS)y序列，其中x和y为整数，其中x=1、2、3或4，并且其中y=1、2、3、4、5、6或7。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架对TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较得到了增强。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架对TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较增强了对靶的作用。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2特异性支架对TRAIL R2的结合相对TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合的增强是结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。在其它实施方案中，对于TRAIL R2的结合亲和力和蛋白质稳定性相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述结合亲和力和蛋白质稳定性得到了增强。在一些实施方案中，对于TRAILR2的结合亲合力和蛋白质稳定性相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架的所述亲合力和蛋白质稳定性得到了增强。
在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架包含含有功能性部分的接头。在一些实施方案中，功能性部分为免疫球蛋白或其片段。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段选自：Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体、线性抗体、全长抗体、Fc区域及所述部分的两个或更多个的组合。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含IgG的Fc结构域和铰链区。在其它实施方案中，免疫球蛋白或其片段还包含CH1结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含Cκ结合域或Cλ结构域。
在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架的Tn3单体支架的至少一个融合于异源部分。在一些实施方案中，异源部分包含选自如下物质的组合物：蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒素剂、成像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSA FcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子以及所述部分的两种或更多种的组合。
在一些具体实施方案中，将TRAIL R2-特异性多聚体支架缀合于PEG。在其它实施方案中，超过2个Tn3单体支架通过接头连接并且至少一个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。
在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架中的Tn3单体支架以分枝形式连接。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的一些Tn3单体支架以线性串联方式连接并且一些Tn3单体支架以分枝形式连接。在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是相同的。在其它实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是不同的。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架结合至少另外的靶，其可以是T细胞抗原。在一些实施方案中，该T细胞抗原为CD40L。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架为受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的相同表位。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的不同表位。在一些实施方案中，不同TRAILR2表位为非重叠表位。在其它实施方案中，不同TRAIL R2表位为重叠表位。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架的β链与SEQ ID NO:1的β链具有至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架包含氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIX2L(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKX3TFTT
其中XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，其中X2代表氨基酸残基D或G，其中X3代表氨基酸E或G，并且其中环的长度n为2与26之间的整数。在一些实施方案中，AB环包含SEQ ID NO:35，CD环包含SEQ ID NO:37以及EF环包含SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，BC环包含选自SEQ IDNO:97、98或168的序列。在一些实施方案中，DE环包含选自SEQ ID NO:102、103和179的序列。在一些实施方案中，FG环包含选自SEQ ID NO:106、108、109、169和170。在一些实施方案中，BC环包含SEQ ID NO:97，DE环包含SEQ ID NO:179以及FG环包含SEQ ID NO:170。在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架包含SEQ ID NO:209或204。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架以1μM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。在另一个实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架以500nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。在另一个实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架以100nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
本发明还提供了编码任何上述多聚体支架的分离的核酸分子。在一些实施方案中，表达载体包含核酸。在其它实施方案中，宿主细胞包含载体。
本发明还提供了产生本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的方法，包括在其中由核酸分子编码的多聚体支架被表达的条件下培养宿主细胞。本发明还提供了在药学上可接受的赋形剂中包含本发明的重组TRAIL R2-特异性多聚体支架的组合物。本发明还提供了通过施用有效量的包含本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的组合物来预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。
本发明还提供了利用包含本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架的组合物诊断患者的疾病或对其成像的方法。还提供了诱导表达RAIL R2的细胞的细胞凋亡的方法，包括将细胞与本发明的TRAILR2-特异性多聚体支架接触。在一些实施方案中，预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症的方法还包括另外的疗法，其中所述疗法为免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法或小分子药物疗法。
在一些实施方案中，TRAIL R2-特异性多聚体支架特异性结合人TRAIL R2。在一些具体实施方案中，本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架结合TRAIL R2并且(a)激活TRAILR2受体，(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，(d)诱导细胞凋亡，(e)降低或抑制细胞活力，或(f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
在其它实施方案中，本发明的支架提供了改变表达TRAIL R2的细胞的活性的方法，包括将细胞与根据权利要求1-47中任一项所述的TRAIL R2特异性多聚体支架接触，其中多聚体支架结合TRAIL R2并且(a)激活TRAIL R2受体，(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，(d)诱导细胞凋亡，(e)降低或抑制细胞活力，或(f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
在一些实施方案中，将PEG在N端或C端上缀合于本发明的TRAIL R2-特异性多聚体支架。
附图简述
为了举例说明本发明，附图中描述了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描述的实施方案的精确安排和工具。
图1显示了多价Tn3支架的线性、抗体样和融合形式。多价Tn3支架包含通过黑色八边形块表示的间隔子联接的两个或更多个Tn3模块，其中所述间隔子可以是例如接头。
图2显示了按照图1中显示的3种不同分子形式产生的TRAILR2-特异性多价Tn3支架(命名为A2至A9)，效价(Tn3模块的数目)从2变化至8。
图3显示了相应于在大肠杆菌(E.coli)中表达的命名为A1至A5的线性串联构建体(效价从1变化至8)的粗制细菌培养基的非还原性SDS-PAGE分析(右边的凝胶)和亲和纯化的样品(左边的凝胶)。
图4显示了测量单价(A1)和多价(A2,A3)Tn3支架对TRAIL R2的结合的竞争ELISA。
图5显示了结合H2122细胞的TRAIL R2-特异性多价支架A9与不结合TRAIL R2的关联对照支架(B9)相比较的流式细胞术柱状图。
图6A显示了效价对多价支架对表达TRAIL R2的细胞系H2122的特异性杀伤的影响。
图6B显示了TRAIL R2-特异性多价支架对H2122肿瘤细胞杀伤的特异性。
图7A显示了分子形式对包含4个Tn3模块的TRAIL R2-特异性多价支架杀伤H2122细胞的影响。
图7B显示了分子形式对包含8个Tn3模块的TRAIL R2-特异性多价支架杀伤H2122细胞的影响。
图8A显示了线性融合的四价-(A3)和八价(A5)TRAIL R2-特异性Tn3支架对结直肠腺癌细胞系Colo205的特异性杀伤。
图8B显示了线性融合的四价-(A3)和八价(A5)TRAIL R2-特异性Tn3支架对表达TRAIL R2的白血病Jurkat细胞系的特异性杀伤。
图9A显示了鼠CD40L-特异性串联二价Tn3支架(M13构建体)的设计。
图9B显示了具有连接两个M13模块的接头的纯化的单价M13构建体(CD40L-特异性Tn3构建体)或串联二价支架的SDS-PAGE分析，所述接头包含1、3、5或7个Gly4Ser单元(称为GS)。将单价M13构建体在泳道2中电泳，构建体C1在泳道3和7中电泳，构建体C2在泳道4和8中电泳，构建体C3在泳道5和9中电泳，构建体C4在泳道6和10中电泳。将样品在非还原条件(泳道2-6)或还原条件(泳道7-10)下进行电泳。
图9C显示了MuCD40L-特异性单价(M13)或二价串联支架对MuCD40L与固定在生物传感器芯片上的鼠CD40受体的结合的抑制。显示了各种构建体的半最大抑制浓度(IC50)。
图9D显示了MuCD40L-特异性单价(M13)Tn3、二价串联支架或抗体MR1(抗-MuCD40L抗体)对B细胞上的MuCD40L-诱导的CD86表达的抑制作用。
图10显示了通过细菌培养基的SDS-PAGE分析的在大肠杆菌中重组表达的可溶性单价和TRAIL R2/CD40L-双特异性串联二价Tn3支架构建体的表达水平。单价支架A1和79分别示于泳道2和3中。通过长度递增的Gly4Ser氨基酸接头串联连接的包含A1和79的串联支架构建体(与构建体C5、C6、C7和C8关联)示于泳道4-7中。利用星号在染色的凝胶上标示表达的构建体。
图11A显示了使用捕获ELISA测定的双特异性Tn3支架对TRAIL R2的结合。
图11B显示了使用捕获ELISA测定的双特异性Tn3支架对人CD40L的结合。
图12显示了使用AlphaScreenTM测定法测定的双特异性串联Tn3支架C5、C6、C7和C8对TRAIL R2和CD40L的同时结合。
图13显示了在盐酸胍存在的情况下Tn3支架的稳定性。显示了每一个测试的支架的Cm(中点值)。
图14显示了通过差示扫描量热法(DSC)分析的3个不同的具有不同环序列但具有相同长度FG环(9个氨基酸)的Tn3支架与具有更长的FG环的亲代Tn3支架相比较的热稳定性。
图15显示了在盐酸胍存在的情况下，与亲代(WT)Tn3支架相比较具有9个氨基酸长度的FG环(P1C01、A6和71)的Tn3支架的稳定性的增加。
图16A显示了三特异性/三价Tn3支架的图示和表达。D1-1E11-79支架包含-结合结构域(D1)，紧接着TRAIL R2-Fc结合结构域(1E11)和对于人CD40L(79)是特异性的C-末端Tn3结构域。柔性(Gly4Ser)3接头将每一个结构域分隔。
图16B显示表达并且纯化的D1-1E11-79支架的SDS-PAGE(4-12%Bis-Tris)凝胶。该构建体的预期分子量为约34,081道尔顿。
图17A显示使用AlphaScreen结合分析证明的三特异性/三价Tn3支架D1-1E11-79对huCD40L和TRAIL R2-Fc的同时结合。AlphaScreen信号(ASS)显示为TrailR2-Fc浓度的函数。
图17B显示使用AlphaScreen结合分析证明的三特异性/三价Tn3支架D1-1E11-79对huCD40L和的同时结合。AlphaScreen信号(ASS)显示为浓度的函数。
图18显示使用ELISA证明的三特异性/三价Tn3支架D1-1E11-79对TRAIL R2-Fc和的同时结合。
图19显示亲代TRAIL R2结合克隆1C12与其亲和成熟的衍生物的序列比对。突出显示工程二硫键的位置，箭头指示一个构架突变的位置，在亲和成熟过程中产生的环的变化示于突出显示的块A、B、C和D中。
图20显示1C12克隆及其亲和成熟的衍生物的CellTiter-Glo细胞存活测定。
图21显示作为时间的函数的小鼠血清中G6串联的浓度。
图22A显示了相应于克隆F4的犬交叉反应的工程化增强的序列比对。所有这些克隆间的共同特征是处于DE环之前2个氨基酸的从D至G的突变。
图22B显示由F4或F4mod1单体产生的对人或犬TRAIL R2-Fc与F4mod1涂覆的板的结合的抑制的ELISA测量。
图23A显示了相应于克隆F4mod1的种系化(germlining)的序列比对，特别是F4、F4mod1和F4mod12与TN3种系的比较。
图23B显示了F4、F4mod1或F4mod12单体对人或犬TRAILR2-Fc与F4mod1涂覆的板的结合的抑制的ELISA测量。
图23C显示比较G6串联6与F4mod12串联6的Colo205细胞杀伤测定。
图23D显示比较G6串联8与F4mod12串联8的Colo205细胞杀伤测定。
图24显示比较G6串联8与F4mod12串联8在TRAIL抗性细胞系HT29中的活性HT29细胞杀伤测定。
图25显示相应于在Antitope EpiScreen免疫原性分析中测试的克隆的序列比对。突出显示相对于克隆F4mod12的差异。
图26A显示非-SEC-纯化的G6串联8的SEC描记线。
图26B显示SEC-纯化的G6串联8的SEC描记线。
图27显示了响应不同剂量的Tn3TRAIL R2激动剂G6串联6和G6串联8的Colo205结直肠癌异种移植物模型的肿瘤体积的改变。
图28显示响应不同剂量的Tn3TRAIL R2激动剂G6串联6和G6串联8的Colo205结直肠癌异种移植物模型的体重的改变。
发明详述
定义
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于特定组合物或方法步骤，这样其可变化。必须指出，如本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文明确地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数所指物。术语“一(a)”(或“一(an)”)以及术语“一个或多个”和“至少1个”在本文中可互换使用。
此外，本文中所用的“和/或”将被用作两个指定的特征或组分的每一个的单独或一起的特定公开内容。因此，在本文中在短语例如“A和/或B”中使用的术语“和/或”意指包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)。同样地，短语例如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意指包括下列实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)和C(单独的)。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关的领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，生物医学和分子生物学简明词典(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology),Juo,Pei-Show，第2版,2002,CRC Press；细胞和分子生物学词典(The Dictionary of Cell and MolecularBiology),第3版,1999,Academic Press；以及生物化学和分子生物学牛津词典(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology),修订版,2000,OxfordUniversity Press,为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。
单位、前置代号(prefixe)和符号以它们的国际单位制(Système Internationalde Unites)(SI)接受的形式来表示。数值范围包括界定范围的数字。除非另外指出，否则氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，通过参考本说明书其是作为整体而存在。因此，即将在下文中定义的术语通过参考说明书作为整体得到更全面的定义。
应理解，无论在本文中何处用词汇“包含”描述实施方案，也都提供了以“由……组成”和/或“基本上由.....组成”描述的其它类似实施方案。
在本文中利用它们的通常已知的三字母符号或利用由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母符号提及氨基酸。同样地利用它们通常接受的单字母代码提及核苷酸。
如本文中所用，术语“表位”是指能够结合本发明的支架的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特殊的三维结构特征以及特殊的电荷特征。构象和非构象表位区别在于对前者但非对后者的结合在变性溶剂存在的情况下丧失。
术语“纤连蛋白III型(FnIII)结构域”和“FnIII结构域”是指与人纤连蛋白III型结构域同源的多肽，所述人纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β折叠片之间的至少7个β链(所述β链自身彼此靠在一起以形成蛋白质的核心)，并且还包含将β链彼此连接的溶剂暴露环。在β折叠片夹层的每一个边缘上存在至少3个这样的环，其中所述边缘是与β链的方向垂直的蛋白质的边界。在某些实施方案中，FnIII结构域包含连接于命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的6个环区域的命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，其中环区域连接每一个β链。
术语“DNA”是指两个或更多个共价键合的天然存在的或经修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。
术语“融合蛋白”是指包括(i)联接于(ii)第二不同的蛋白质(即，“异源”蛋白质)的本发明的一个或多个支架的蛋白质。
术语“异源部分”在本文中用于表示组合物至本发明的支架的添加，其中所述组合物通常不是FnIII结构域的部分。示例性异源部分包括蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、成像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物以及可能提供非FnIII结构域本身非固有的活性的任何其它组合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒素剂、放射性核素、成像剂、生物素、二聚化结构域(例如亮氨酸拉链结构域)、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段(例如，抗体可变结构域、CH1结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、CH2或CH3结构域)、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子等。
如本文中所用，术语“接头”是指联接或连接两个或更多个支架的任何分子装配体。接头可以是其功能为用作支架的模块之间的“间隔子”的分子，或其还可以是具有其它功能的分子(即，“功能性部分”)。包括在“异源部分”的定义中的分子也可用作接头。
术语“连接的”和“融合的”可互换使用。这些术语是指通过无论什么方法(包括化学缀合或重组方法)将两个或更多个支架、异源部分或接头连接在一起。
术语“多聚体”、“多聚体支架”和“多价支架”是指包含至少2个缔合的FnIII支架的分子。形成多聚体支架的支架可通过允许每一个支架独立地起作用的接头连接。“多聚体的”和“多价的”在本文中可互换使用。多价支架可以是单特异性的或双特异性的。
术语“结构域”或“蛋白质结构域”是指可折叠成稳定的三维结构(通常与蛋白质的其余部分独立的)并且可被赋予特定功能的蛋白质的区域。该结构保持与原始蛋白质内的结构域的功能相关的特定功能，例如，酶促活性、针对另一种分子的识别基序的产生或为蛋白质存在于特定蛋白质环境中提供必需的结构组分。在蛋白质家族内和相关蛋白质超家族内，蛋白质结构域可以是进化上保守的区域。当描述多聚体支架的组分时，术语“结构域”、“单体支架”和“模块”可互换使用。“天然FnIII结构域”是指由活生物体编码的任何非重组FnIII结构域。
“蛋白质序列”或“氨基酸序列”意指以氨基末端至羧基末端的方向存在的多肽的氨基酸组成的线性表现，其中所述表现中的彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。
术语“核酸”是指任何两个或更多个共价键合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如本文中所用，该术语包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。
术语“多核苷酸”意欲包括单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。术语“分离的”核酸或多核苷酸意欲指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，对于本发明的目的而言，包含在载体中的编码例如本发明的支架的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分或大体上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以为调控元件或可包括调控元件例如启动子、核糖结合位点或转录终止子。
术语“药学上可接受的”是指可给动物(例如，哺乳动物)施用而无明显有害医学后果的化合物或蛋白质。
术语“生理上可接受的载体”是指对治疗的宿主不具有明显的有害影响并且保持与其一起施用的化合物的治疗性质的载体。一个示例性生理上可接受的载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体及其它制剂对于本领域技术人员来说是已知的并且描述于例如《雷明顿药学大全》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第18版)，编者A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company，Easton,Pa.(通过引用并入本文)。
“多肽”意指通过酰胺键(肽键)线性连接的两个或更多个氨基酸的任何序列，无论长度、翻译后修饰或功能。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。因此，肽、二肽、三肽或寡肽包括在“多肽”的定义内，并且可使用术语“多肽”替代这些术语的任何术语，或可与其互换使用。术语“多肽”还意欲指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护/封闭基团进行的衍生、蛋白质水解切割或利用非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式(包括通过化学合成)来产生。
作为本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。变体可天然存在或为非天然存在的。可使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。变异多肽可包含保守或非保守氨基酸置换、缺失或添加。作为“衍生物”还包括包含一个或多个天然存在的20种标准氨基酸的氨基酸衍生物的肽。
“随机化的”或“突变的”意指相对于模板序列包括一个或多个氨基酸改变，包括缺失、置换或添加。“随机化”或“突变”意指将这样的氨基酸改变引入序列的过程。随机化或突变可通过通常核酸编码序列的有意、盲目或自发序列变异来实现，以及可通过任何技术例如PCR、易错PCR或化学DNA合成来产生。术语“随机化”、“随机化的”、“突变”、“突变的”等在本文中可互换使用。
“关联”或“关联、非突变的蛋白质”意指除引入变异蛋白质的氨基酸外在序列上与变异蛋白质相同的蛋白质，其中所述变异蛋白质被随机化或突变。
“RNA”意指两个或更多个共价键合的、天然存在的或经修饰的核糖核苷酸的序列。本术语中包括的经修饰的RNA的一个实例为硫代磷酯酯RNA。
如本文中所用，术语“本发明的支架”或“本发明的支架”是指多聚体支架以及单体FnIII支架。术语“靶”是指被本发明的特定支架识别的化合物。常见的靶包括蛋白质、多糖、多核苷酸和小分子。术语“靶”和“抗原”在本文中可互换使用。如本文中所用，例如在术语“特异性结合”或“特异的结合”中的术语“特异性”是指本发明的支架籍以通过一个或多个抗原结合结构域结合一个或多个抗原并且该结合使得一个或多个抗原结合结构域与一个或多个抗原之间产生一定互补性的相对亲和力。根据该定义，当本发明的支架对表位的结合比其对随机、无关表位的结合更容易时，所述支架被认为“特异性结合”该表位。
如本文中所用，术语“亲和力”是指本发明的某些支架对单个表位的结合的强度。
如本文中所用，术语“亲合力”是指本发明的支架群体与某些表位之间的复合物的总体稳定性，即多个支架与抗原的结合的功能性组合的强度。亲合力与单个抗原结合结构域与特定表位的亲和力以及本发明的支架的效价相关。
术语“对靶的作用”是指本发明的多聚体支架对一个或多个靶的结合以及因这样的结合而引起的生物效应。在这方面，多聚体支架中的多抗原结合单元可与多个靶和/或表位相互作用并且，例如使两个靶在物理上更靠近，通过与不同靶相互作用触发代谢级联等。关于TRAIL R2，“对靶的作用”是指例如通过增强、刺激或激活TRAIL R2的一个或多个生物学活性所获得的作用。
如本文中所用，术语“效价”是指潜在抗原结合模块的数目，例如，本发明的支架中的FnIII模块的数目。当本发明的支架包含超过一个抗原结合模块时，每一个结合模块可特异性结合例如相同靶或不同靶中的相同表位或不同表位。
如本文中所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二巯基形成二硫键或桥的巯基。
术语“Tn3模块”和“Tn3支架”，如本文中所用，是指这样的FnIII支架，其中A β链包含SEQ ID NO:42，Bβ链包含SEQ ID NO:43，Cβ链SEQ ID NO:45或131，Dβ链包含SEQ ID NO:46，Eβ链包含SEQ ID NO:47，Fβ链包含SEQ ID NO:49以及β链G包含SEQ ID NO:52，其中至少1个环为“野生型Tn3支架”中的环的非天然存在的变体。在某些实施方案中，除Cβ链(例如，SEQ ID NO:45或131中的半胱氨酸)和Fβ链(SEQ ID NO:49)中的半胱氨酸残基不被置换外，Tn3模块的一个或多个β链包含至少1个氨基酸置换。
如本文中所用，术语“野生型Tn3支架”是指包含SEQ ID NO:1的FnIII支架，即从人生腱蛋白C的第3个FnIII衍生的工程FnIII支架。
术语“免疫球蛋白”和“抗体”包括各种广泛种类的在生物化学上可区分的多肽。本领域技术人员将理解重链被分类为γ、μ、α、δ或ε。该链的性质是将抗体的“种类”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。这些种类的每一个种类的经修饰的形式对于本领域技术人员来说是可容易辨别的。如本文中所用，术语“抗体”包括但不限于完整抗体、经修饰的抗体、抗体VL或VL结构域、CHl结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、Fc结构域(参见上文)、CH2或CH3结构域。
如本文中所用，术语“经修饰的抗体”包括被改变以使它们为非天然存在的抗体的合成形式，例如包含至少2个重链部分但不包含两个完整的重链的抗体(例如，缺失结构域的抗体或微小抗体(minibody))；经改变结合两个或更多个抗原或结合单个抗原的不同表位的抗体的多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)。此外，术语“经修饰的抗体”包括抗体的多价形式(例如，三价、四价等，结合3个或更多个拷贝的相同抗原的抗体)。(参见，例如，Antibody Engineering,Kontermann&Dubel编著,2010Springer Protocols,Springer)。
术语“体内半衰期”以其通常的含义使用，即50%的多肽的生物活性仍然存在于身体/靶器官时的时间，或多肽的活性为其初始值的50%时的时间。作为测定功能性体内半衰期的另一选择，可测定“血清半衰期”，即50%的多肽分子在被清除之前在血浆或血流中循环时的时间。血清半衰期的测定通常比测定功能性体内半衰期简单，并且血清半衰期的量度通常是功能性体内半衰期的量度的良好指征。针对血清半衰期的可选择的术语包括血浆半衰期、循环半衰期、循环半衰期(circulatory half-life)、血清清除、血浆清除和清除半衰期。待保留的功能性通常选自促凝血、蛋白质水解、辅因子结合、受体结合活性或其它类型的与特定蛋白质相关的生物活性。
关于功能性体内半衰期或血浆半衰期的术语“增加的”用于表示多肽的相关半衰期相对于参照分子(例如未修饰的多肽)的半衰期在统计学上得到显著增加，如在可比较的条件下测定的。
如本文中所用，术语“表达”是指基因籍以产生生物化学分子例如本发明的支架或其片段的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于基因至一种或多种mRNA的转录，以及这样的mRNA至一种或多种多肽的翻译。如果最终的期望产物为生物化学分子，则表达包括生物化学分子和任何前体的产生。
“表达产物”可以是核酸，例如通过基因的转录产生的信使RNA，或多肽。本文中描述的表达产物还包括具有转录后修饰例如磷酸化的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质的添加、与其它蛋白质亚基的缔合、蛋白水解切割等)的多肽。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明用作用于将期望的表达产物引入宿主细胞并且在其中表达的媒介物的载体。如本领域技术人员已知的，此类载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和腺病毒。一般地，与本发明相容的载体可包括选择标记、适当的限制位点以赋予促进期望的核酸的克隆和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
术语“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术构建的并且编码至少1个表达产物的载体的宿主细胞。在用于从重组宿主分离表达产物的方法的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，除非另外明确地指出，否则是指表达产物的来源，即表达产物从“细胞”的回收意指从离心沉淀的完整细胞回收，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
如本文中所用，术语“治疗”或“医治”是指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)受试者不期望的生理变化或病况，例如炎性疾病或病况的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病的稳定的(即，未恶化的)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的好转或缓和以及缓解(无论部分还是完全)，无论可检测的还是不可检测的。
术语“医治”也指与当不接受医治时预期的存活时间相比较延长的存活时间。需要医治的人包括已患有病况或障碍的人以及易于患病况或障碍的人或其中将进行病况或障碍预防的人。
术语“受试者”、“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”是指期望对其进行诊断、预后或治疗的任何个体、患者或动物，特别地哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、家畜和动物园动物、运动动物或宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等。
如本文中所用，术语“TRAIL受体”是指结合TRAIL并且当结合TRAIL时，激活肿瘤细胞的程序化细胞死亡(细胞凋亡)的蛋白质。TRAIL受体的非限定性实例包括TRAIL-R2受体。
术语“TRAIL R2”或“TRAIL R2受体”在本文中可互换使用，是指全长TRAIL受体序列和Sheridan等人,Science,277:818-821(1997)；Pan等人,Science,277:815-818(1997),美国专利No.6,072,047和6,342,369；PCT公布No.WO98/51793、WO98/41629、WO98/35986、WO99/02653、WO99/09165、WO98/46643和WO99/11791PCT公布；Screaton等人,Curr.Biol.,7:693-696(1997)；Walczak等人,EMBO J.,16:5386-5387(1997)；Wu等人,NatureGenetics,17:141-143(1997)中描述的受体的可溶性细胞外结构域形式。代表性全长TRAIL受体序列可在GenBank登录号AAC51778.1和O14763.2下获得。
术语“TRAIL受体激动剂”或“激动剂”以最广义使用，包括体外、原位或体内部分或完全地增强、刺激或激活TRAIL R2及其生物活性变体的一个或多个生物学活性的任何分子。这样的生物活性的实例包括细胞凋亡以及文献中进一步报导的生物活性。激动剂可以以直接或间接方式起作用。例如，作为引起受体激活或信号转导的其与TRAILR2结合的结果，TRAIL受体激动剂可用于体内、体外或原位部分或完全地增强、刺激或激活一个或多个TRAIL R2受体或一个或多个TRAIL R2受体和其它靶的一种或多种生物学活性。
“TRAIL”或“TRAIL多肽”是指结合一个或多个TRAIL受体包括TRAIL R2的配体以及其生物活性片段。代表性TRAIL序列可在GenBank登录号AAH32722.1和P50591.1下获得。片段包括但不限于具有TRAIL多肽序列的约5至约50个氨基酸残基，或约5至约25个，或约10至20个残基，或约12至约20个氨基酸残基的粗略。任选地，TRAIL肽由不超过25个氨基酸残基(例如，25、23、21、19、17、15个或更少的氨基酸残基)组成。
术语“细胞凋亡”和“细胞凋亡活性”以广义使用并且是指哺乳动物的细胞死亡的有序或受控形式，其通常伴随特征性细胞变化之一，包括细胞质的凝缩、质膜微绒毛的丧失、细胞核的分裂、染色体DNA的降解或线粒体功能的丧失。该活性可使用本领域公知的方法例如通过细胞活力测定、FACS分析或DNA电泳、对膜联蛋白V的结合、DNA的片段、细胞皱缩、内质网扩张、细胞片段化和/或膜囊(细胞凋亡小体)的形成来测定和测量。
引言
TRAIL-R2蛋白由TNF–受体超家族基因的成员编码，并且包含细胞内死亡结构域。在一些情况下，其也被称为TNFRSFl0B、CD262、DR5、KILLER、KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB或ZTNFR9。该受体可被肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNFSF 10/TRAIL/APO-2L)激活，并且转导细胞凋亡信号。此外，TRAIL-R2诱导的细胞凋亡牵涉半胱天冬酶和细胞内适体分子FADD/MORT1(Walczak等人EMBOJ,(1997),16,5386-97)。
虽然几种类型的正常细胞表达TRAIL R2，但通过该受体的细胞凋亡信号转导似乎主要限制于肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在它们通过癌基因例如Myc或Ras的转化的背景中变得对死亡受体介导的细胞凋亡更加易感(Wang等人,Cancer Cell 5:501-12(2004)；Nesterov等人,Cancer Res.64:3922-7(2004))。TRAIL-R2频繁地由人癌症细胞系以及原发性肿瘤表达。
本发明提供了能够结合TRAIL R2的重组非天然存在的蛋白质支架的家族。具体地，本文中描述的蛋白质可用于显示与抗体可变区的互补决定区(“CDR”)类似的确定的环。可将这些环经历随机化或限制进化以产生能够结合许多靶化合物的多样性。蛋白质可被组装成能够结合TRAIL R2和不同靶的多特异性支架。
在具体实施方案中，本发明提供了用于预防、缓解、检测、诊断或监控疾病(例如但不限于癌症)的TRAIL-R2特异性结合剂。在其它具体实施方案中，本发明的TRAIL-R2特异性结合支架对于治疗其中癌细胞表达TRAIL-R2的癌症是有用的。在一些实施方案中，癌症可包括但不限于肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。本发明还提供了使用支架消耗细胞群体的方法。在一个实施方案中，本发明的方法在消耗下列细胞类型中是有用的：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。
本发明的支架为包含衍生自人腱糖蛋白C的第3FnIII结构域的单体支架的多聚体支架，其中，至少一个非天然存在的分子内二硫键已被工程化。组成彼此独立地正确折叠的本发明的多聚体支架的Tn3支架保留它们的结合特异性和亲和力，并且每一个单体支架保持其功能性质。当组成本发明的多聚体支架的Tn3支架被装配在高效价多聚体支架(例如六价或八价支架)中时，彼此独立地正确折叠的单体支架保留它们的结合特异性和亲和力，并且每一个单体支架保留其功能性质。
即使当构建体的拓扑学是非线性时，例如当以复杂分枝结构(例如，Fc融合构建体或抗体样构建体)装配单体Tn3或多聚体Tn3支架时，多聚体Tn3支架，包括高效价支架(例如，六价或八价)，仍然正确折叠。
天然FnIII结构域例如人纤连蛋白(10FnIII)的第10FnIII结构域和绝大部分天然存在的FnIII结构域不包含二硫键或游离半胱氨酸。当通过引入多个半胱氨酸对多结构域蛋白质进行工程改造时，蛋白质表达的缺乏、所得蛋白质的沉淀或非功能性蛋白质的产生是普遍事件。这类有害作用归因于导致不正确的蛋白质折叠的分子内结构域内和/或结构域间二硫键的不正确形成，和/或分子间二硫键的不正确形成。当半胱氨酸和/或蛋白质结构域的数目增加时，这些作用通常增强。
例如，包含8个野生型Tn3支架(SEQ ID NO:1)的线性多聚体支架可沿着单个多肽氨基酸序列包含16个半胱氨酸。在另一个示例性实施方案中，包含4个Tn3模块(其中两个Tn3模块连接于IgG重链并且两个Tn3连接于IgG轻链)的抗体样构建体可包含分布在4个不同的多肽链间的8个半胱氨酸。本发明的多聚体支架，例如包含4、6或8个线性Tn3模块，包含这样的数目的半胱氨酸和这样的结构复杂性的多聚体支架，正确折叠并且当与它们各自的单体相比较时显示增强的稳定性和靶结合性质。
当以高效价多聚体形式装配包含一个或多个工程二硫键的Tn3支架时，每一个个体单体支架正确折叠，从而保留其结合特异性和亲和力，以及其功能性质。此外，单体支架能够形成稳定的、功能性的和正确折叠的多聚体支架。
本发明的多聚体支架的有利方面是它们结合多个表位的能力，例如(i)结合单个靶中的多个表位，(ii)结合多个靶中的单个表位，(iii)结合位于一个靶的不同亚单元上的多个表位或(iv)结合多个靶上的多个表位，从而增强亲合力。
此外，归因于多聚体支架的柔性和通过接头改变多个Tn3单体之间的距离的可能性，多聚体Tn3支架能够在表面上(在相同细胞/表面上或在不同细胞/表面上)结合多个靶分子。
作为它们同时结合超过一个靶的能力的结果，可将本发明的多聚体支架用于调节多个途径、交叉连接细胞表面上的受体、结合分离的细胞上的细胞表面受体和/或将靶分子或细胞结合至基质。
根据FnIII结构域的先前序列分析，可在BC和FG环中看到大的变异，这表明这些环对于稳定性不是至关重要的(参见，例如，PCT公布No:WO 2009/058379)。本发明提供了具有增强的稳定性的Tn3支架，其在氨基酸序列上可变化但包含具有比人糖腱生蛋白C的第3FnIII的相应FG环的长度短的长度的FG环。已观察到缩短FG环导致具有增强的稳定性的突变型Tn3支架。因此，本发明的另一个方面提供了具有增强的蛋白质稳定性的野生型Tn3支架的变体(SEQ ID NO:1)。
在某些实施方案中，本发明的Tn3单体支架包含具有9个氨基酸和与包含人腱糖蛋白C的天然第三FnIII结构域的支架(该支架具有10个氨基酸的FG环长度)相比较增强的稳定性的FG环。此外，本发明提供了具有指定的FG环长度的各种Tn3支架的文件，所述文库用于分离具有增强的稳定性的Tn3支架。
此外，本发明提供了可结合TRAIL R2和一个或多个另外的靶的多特异性支架，其中支架对特定靶的亲和力通过突变进行了调节的亲和力成熟支架以及其在动物物种间的免疫原性和/或交叉反应通过突变进行了调节的支架。同样地，本发明还提供了产生本发明的支架的方法以及工程化具有期望的物理化学、药理学或免疫学性质的支架的方法。此外，本发明还提供了此类支架和方法用于治疗性、预防性和诊断性应用的用途。
FnIII结构基序
本发明的Tn3支架基于III型纤连蛋白模块(FnIII)(广泛地发现于活病毒的所有三个结构域间和众多蛋白质种类中的结构域)的结构。
在具体实施方案中，本发明的支架衍生自人生腱蛋白C的第三FnIII结构域(SEQID NO:4)。在一个具体实施方案中，本发明的支架包含Tn3模块。该结构域的总体三维折叠与最小的功能性抗体片段重链的可变区(VH)的总体三维折叠密切相关，骆驼和美洲骆驼(例如，骆马(llamas))的单结构域抗体中的所述片段包含完整的抗原识别单元。
本发明的Tn3单体支架和来自腱糖蛋白C的天然FnIII结构域的特征在于相同的三维结构，即在一侧上有3个β链(A、B和E)和在另一侧上有4个β链(C、D、F和G)通过6个环区域连接的β-夹层结构。根据连接至每一个环的N和C端的β链命名这些环区域。因此，AB环位于β链A与B之间，BC环位于β链B与C之间，CD环位于β链C与D之间，DE环位于β链D与E之间，EF环位于β链E与F之间，FG环位于β链F与G之间。FnIII结构域具有耐受随机化的溶剂暴露环，这有利于产生能够以高亲和力结合特定靶的蛋白质支架的多样性库(diverse pool)。
在本发明的一个方面，Tn3结构域用作支架，将所述支架经历被设计来随机化一个或多个环的定向进化，所述环与抗体可变区的互补决定区(CDR)类似。这样的定向进化法导致对于目标靶例如TRAILR2具有高亲和力的抗体样分子的产生。此外，在一些实施方案中，本文中描述的支架可用于显示确定的暴露环(例如，先前被随机化的并且基于靶结合选择的环)以指导结合这类引入的环的分子的进化。可进行该类型的选择以鉴定任何单个CDR-样环的识别分子或者，可选择地用于识别组合入非线性表位结合部分的两个或所有三个CDR样环的识别分子。
在一些实施方案中，本发明的支架是基于：PCT公布No.WO2009/058379中描述的人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的结构基序的分子。一组3个环(命名为BC、DE和FG)(所述环可赋予特异性靶结合)分别分布在B与C链之间、D与E链之间以及F与Gβ链之间。人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的环BC、DE和FG环分别为9、6和10个氨基酸长。这些环的长度落在在抗体重链中发现的关联抗体-识别环的狭窄范围内，即，在长度上分别为7-10、4-8和4-28个氨基酸。类似地，第二组环AB、CD和EF环(在长度上分别为7、7和8个氨基酸)分布在A与Bβ链之间、C与Dβ链之间以及E与Fβ链之间。
在随机化和选择对靶的高亲和力结合后，Tn3结构域中的环可使得与靶的接触等同于抗体中的关联CDR环的接触。因此，在一些实施方案中，随机化AB、CD和EF环，然后选择其对一个或多个靶例如TRAIL R2的高结合亲和力结合。在一些实施方案中，可与BC、DE和FG环的随机化平行地进行该随机化和选择过程，然而在其它实施方案中，连续地进行该随机化和选择过程。
本发明的单体支架
本发明提供了重组非天然存在的FnIII支架，其包含连接于多个环区域的多个β链结构域，其中所述环区域的一个或多个通过从野生型Tn3(SEQ ID NO:1)的关联环缺失、置换或添加至少1个氨基酸而变化。
为了具有新型结合特征的改进的Tn3分子，可将野生型Tn3经历氨基酸添加、缺失或置换。应当理解，当将改进的支架的序列与Tn3的序列相比较时，使用相同的β链和环的定义。可使用人腱糖蛋白C的第3FnIII结构域、野生型Tn3支架或先前的改进的Tn3支架产生改进的Tn3支架。在一些实施方案中，本发明的单体支架包含氨基酸序列：
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT，其中XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，并且其中n=2-26。
在一个实施方案中，XAB由SEQ ID NO:35组成。在一个实施方案中，XBC由SEQ IDNO:36组成。在一个实施方案中，XCD由SEQ IDNO:37组成。在一个实施方案中，XDE由SEQ IDNO:38组成。在一个实施方案中，XEF由SEQ ID NO:39组成。在一个实施方案中，XFG由SEQ IDNO:40组成。
在一个实施方案中，XAB包含SEQ ID NO:35。在一个实施方案中，XBC包含SEQ IDNO:36。在一个实施方案中，XCD包含SEQ ID NO:37。在一个实施方案中，XDE包含SEQ ID NO:38。在一个实施方案中，XEF包含SEQ ID NO:39。在一个实施方案中，XFG包含SEQ ID NO:40。
在某些实施方案中，XAB由SEQ ID NO:35组成，XCD由SEQ IDNO:37，且XEF由SEQ IDNO:39组成。在一个实施方案中，XBC由SEQ ID NO:36组成，XDE由SEQ ID NO:38组成，且XFG由SEQ ID NO:40组成。
在某些实施方案中，XAB包含SEQ ID NO:35，XCD包含SEQ ID NO:37，且XEF包含SEQID NO:39。在一个实施方案中，XBC包含SEQ ID NO:36，XDE包含SEQ ID NO:38，且XFG包含SEQID NO:40。
在一些实施方案中，本发明的单体支架包含Tn3模块。在其它实施方案中，本发明的支架包含Tn3模块(SEQ ID NO:1)，其中人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的β链C(SEQ IDNO；4)被包含N末端半胱氨酸的变体β链C(SEQ ID NO:45或SEQ ID NO：131)替代并且其中人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的β链F(SEQ ID NO:48)被包含C末端半胱氨酸的变体β链F(SEQ ID NO:49)替代。在一些实施方案中，本发明的支架包含Tn3模块，其中除C和F β链(分别地SEQ ID NO:45或131和SEQ ID NO:49)中的半胱氨酸残基不可被置换外，一个或多个β链包含至少1个氨基酸置换。
可对连接本发明的支架的多个β链的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，本发明的支架具有至少1个对其长度和/或序列多样性进行随机化的环。在一个实施方案中，可对支架的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，使本发明的支架的至少1个环保持恒定同时对至少1个另外的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，使环AB、CD和EF的至少1个、至少2个或全部3个保持恒定，同时对环BC、DE和FG的至少1个、至少2个或全部3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环AB、CD和EF的至少1个、至少2个或全部3个进行随机化，同时对环BC、DE和FG的至少1个、至少2个或全部3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环AB、CD、EF、BC、DE和FG的至少1个、至少2个、至少3个、至少4、至少5个或全部6个的长度或序列多样性进行随机化。
在一些实施方案中，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。在一些实施方案中，使环内的一个或多个残基保持预定的有限数目的不同氨基酸，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。因此，本发明的支架可包含一个或多个具有简并共有序列和/或一个或多个不变体氨基酸残基的环。在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的AB环：K-X-X-X-X-X-a，其中X代表天冬酰氨、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中(a)代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的AB环：K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X代表天冬酰氨、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中(a)代表丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环：S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表脯氨酸或丙氨酸并且其中(b)代表丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环：S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X代表任意氨基酸，并且其中(c)代表脯氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的BC环：A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(d)代表脯氨酸、谷氨酸或赖氨酸，其中(e)代表天冬酰胺或甘氨酸，并且其中(f)代表丝氨酸或甘氨酸。
在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的CD环：Xn，其中X代表任意氨基酸，并且其中n=6、7、8、9或10。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的CD环：Xn，其中X代表天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且其中n=7、8或9。
在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的DE环：X-X-X-X-X-X，其中X代表任意氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的EF环：X-b-L-X-P-X-c-X，其中X代表天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(b)代表天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，并且其中(c)代表异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
在一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环：X-a-X-X-G-X-X-X-b，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环：X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)，其中X代表任意氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环：X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或甘氨酸。在具体的实施方案中，本发明的支架包含具有下列共有序列的经随机化的FG环：X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X代表任意氨基酸，并且其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。
在某些实施方案中，本发明的支架包含被认为比人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域的关联FG环短至少1个氨基酸残基并且在一个或多个位置上被进一步随机化的FG环。
在具体的实施方案中，环BC、DE和FD的至少1个被随机化，其中Aβ链包含SEQ IDNO:41或42，Bβ链包含SEQ ID NO:43，Cβ链包含SEQ ID NO:44，Dβ链包含SEQ ID NO:46，Eβ链包含SEQ ID NO:47，Fβ链包含SEQ ID NO:48、49、50或51且Gβ链包含SEQ ID NO:52或53，AB环包含SEQ ID NO:35，CD环包含SEQ ID NO:37，且EF环包含SEQ ID NO:39。
在其它具体的实施方案中，环AB、CD和EF的至少1个被随机化，其中Aβ链包含SEQID NO:41或42，Bβ链包含SEQ ID NO:43，Cβ链包含SEQ ID NO:44或45，Dβ链包含SEQ ID NO:46，Eβ链包含SEQ ID NO:47，Fβ链包含SEQ ID NO:48、49、50或51，以及Gβ链包含SEQ ID NO:52或53，BC环包含SEQ ID NO:36，DE环包含SEQ ID NO:38以及FG环包含SEQ ID NO:40。
增强的支架稳定性
非天然存在的二硫键
本发明的Tn3支架的稳定性可通过许多不同的方法来增强。在一些实施方案中，本发明的支架通过延伸N和/或末端区域来稳定。N和/或C末端区域可被延伸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个氨基酸。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架可通过引入增加血清半衰期的改变来稳定，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，本发明的Tn3支架包含至少1个氨基酸残基的添加、缺失或置换来稳定支架的疏水核。
本发明的Tn3支架可通过工程化非天然二硫键来进行有效地稳定。这样的工程支架可有效地表达为多聚体支架的部分。二硫键的正确形成和工程支架的正确折叠通过支架的生物活性的保持得到证明。包含非天然二硫键的工程支架可同时结合至少2个靶(参见，例如，实施例8)或三个靶(参见，例如，实施例12)的事实提供了支架的三维结构未被工程二硫键显著改变并且靶结合环的相对位置得到保持的证据。在一些实施方案中，本发明的支架包含非天然存在的二硫键，如PCT公布No.WO 2009/058379中所描述的。可利用生物信息学方法来鉴定适用于工程二硫键的候选位置。
在一个实施方案中，本发明的Tn3单体支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个非天然存在的分子内二硫键。在具体的实施方案中，本发明提供了获得与包含2、3、4或更多个工程分子内二硫键的人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域相比较具有增强的稳定性的Tn3支架的方法。
在一个实施方案中，本发明的Tn3单体支架包含至少一种非天然存在的分子内二硫键，其中所述至少一种非天然存在的二硫键稳定单体支架。
在另一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少1个非天然存在的二硫键，其中所述键位于相同多聚体支架的两个不同的单体支架之间。在另一个实施方案中，本发明的支架包含至少1个非天然存在的二硫键，其中所述键位于两个不同的多聚体支架之间。即，二硫键为分子间二硫键。例如，二硫键可连接不同的支架(例如，两个分离的Tn3单体、分离的Tn3单体支架和多聚体支架或两个多聚体支架)、Tn3支架和接头、Tn3支架和Fn结构域，或Tn3支架和抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的支架包含至少1个非天然存在的连接支架与分离的异源部分、支架与融合或缀合于相同支架的异源部分或支架与融合或缀合于不同支架的异源部分的分子间二硫键。
在一些实施方案中，本发明的支架包含形成至少2个、至少3个、至少4或更多个支架的多聚体支架的二硫键。
在另一个实施方案中，本发明的支架可包含N和/或C末端区域的延伸。在一个实施方案中，本发明的支架包含改变以延长血清半衰期，如本文中所描述的。在另一个实施方案中，本发明的支架包含至少1个氨基酸残基的添加、缺失或置换以稳定支架的疏水核心。
在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少一个天然存在的分子内二硫键，其中Aβ链结构域包含SEQ ID NO:42，Bβ链包含SEQ ID NO:43，Cβ链包含SEQ ID NO:45，Dβ链包含SEQ ID NO:46，Eβ链包含SEQ ID NO:47，Fβ链包含SEQ ID NO:49且Gβ链包含SEQ ID NO:52。
在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少1个非天然存在的分子内二硫键，其中Aβ链结构域由SEQ ID NO:42组成，Bβ链由SEQ ID NO:43组成，Cβ链由SEQ ID NO:45组成，Dβ链由SEQ ID NO:46组成，Eβ链由SEQ ID NO:47组成，Fβ链由SEQ ID NO:49组成，且Gβ链由SEQ ID NO:52组成。
在具体的实施方案中，本发明的支架包含至少1个非天然存在的分子内二硫键，其中Aβ链结构域基本上由SEQ ID NO:42组成，Bβ链基本上由SEQ ID NO:43组成，Cβ链基本上由SEQ ID NO:45组成，Dβ链基本上由SEQ ID NO:46组成，Eβ链基本上由SEQ ID NO:47组成，Fβ链基本上由SEQ ID NO:49组成，且Gβ链基本上由SEQ IDNO:52组成。
增强的支架稳定性：FG环长度
本发明人已发现FG环的长度在Tn3支架的稳定性中起着重要作用。具体地，包含非天然存在的变体FG环(其比FOI的FG环中发现的长度短至少1个氨基酸)Tn3支架经显示具有增强的稳定性。在某些实施方案中，本发明的支架包含比人腱糖蛋白C的第三FnIII结构域的FG环短至少1个氨基酸残基的非天然存在的变体FG环。
在具体的实施方案中，通过FG环中缺失至少1个氨基酸来增强Tn3支架的稳定性。在另一个实施方案中，可通过在FG环中缺失至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个或至少10个氨基酸来增强Tn3支架的稳定性。特别地预期已稳定的Tn3支架可包含至少1个非天然存在的二硫键。
在某些实施方案中，Tn3支架变体还包含已对其长度和/或序列进行随机化的至少1个环，(即AB、BC、CD、DE、EF和/或FG)。特别地预期Tn3支架变体可包含至少1个非天然存在的二硫键。
在某些实施方案中，Tn3支架变体包含比野生型Tn3支架的FG环短至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个氨基酸残基的FG环，其中Tn3支架变体还包含至少1个氨基酸置换。
稳定性测量
分离的或作为多聚体支架的部分的已稳定的本发明的FnIII支架的稳定性的增强可容易地利用本领域已知的技术来测量，例如热(Tm)和离液序列高的变性(chaotropicdenaturation)(例如利用尿素或胍盐的处理)、蛋白酶处理(例如利用嗜热菌蛋白酶的处理)或另一种本领域接受的测定蛋白质稳定性的方法。用于测量蛋白质稳定性的技术的综述可见于例如John Wiley和Sons.2007的"Current Protocols in Molecular Biology"和"Current Protocols in Protein Science"中。
多聚体支架
本发明的一个方面提供了包含至少2个以串联形式连接的本发明的Tn3单体支架的多聚体支架。可以以多个形式装配此类多聚体支架。在一些实施方案中，以线性形式装配单体支架，然而在其它实施方案中，以分枝形式装配支架(参见，例如，图1)。在特定方面，本发明提供了多聚体支架，其中至少2个Tn3支架通过肽接头串联连接。在一些实施方案中，本发明的多聚体支架中的Tn3支架结合TRAILR2，然而第二Tn3支架结合不同的靶，从而显示多个功能，和/或结合相同的靶，从而增加靶结合的效价和/或亲合力、靶的其它作用。在一些实施方案中，当多个支架结合相同靶时，实现了靶结合的效价和/或亲合力的增加。在一些实施方案中，效价的增加增强了对靶的特异性作用，例如增加靶蛋白质的二聚化。
在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个串联连接的本发明的Tn3单体支架，其中每一个Tn3支架结合至少1个靶，并且其中每一个Tn3支架包含连接于多个环区域的多个β链，其中至少1个环为野生型Tn3结构域中的关联环的非天然存在的变体。
多聚体串联支架
在一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含2、3、4、5、6、8个或更多个本发明的Tn3单体支架。在一些实施方案中，一些Tn3单体支架以串联形式连接。在另一个实施方案中，一些Tn3单体支架以串联形式连接并且一些Tn3单体支架不以串联形式连接。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个或更多个串联连接的本发明的支架(参见，例如，图1和图2)。
在一个实施方案中，多聚体支架通过Tn3单体支架之间的共价结合，例如直接连接Tn3支架或通过包含接头例如肽接头来产生。在具体的实例中，通过构建编码单体Tn3支架的融合基因或可选择地通过将半胱氨酸残基的密码子工程化到单体Tn3支架中(且能够在表达产物之间形成二硫键)来产生共价结合的支架。
在一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个彼此直接连接而无任何另外的间插氨基酸的Tn3支架。在另一个实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过接头例如肽接头串联连接的Tn3支架。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过肽接头串联连接的Tn3支架，其中肽接头包含1至约1000或1至约500或1至约250或1至约100或1至约50或1至约25个氨基酸。在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过肽接头串联连接的Tn3支架，其中肽接头包含1至约20或1至约15或1至约10或1至约5个氨基酸。
在具体的实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个通过接头例如肽接头串联连接的Tn3支架，其中接头为功能性部分。基于多聚体支架的期望的功能和/或特征选择功能性部分。例如，用于纯化的功能性部分(例如，组氨酸标记物)可用作接头。用作接头的功能性部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒素剂、放射性核素、成像剂、生物素、二聚化结构域、人血清白蛋白(HSA)或其FcRn结合部分、抗体的结构域或片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、IgG分子、酶、配体、受体、结合肽、非-Tn3支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子等。可用作功能性接头的具体肽接头和功能性部分公开于下文中。
在一些实施方案中，多聚体Tn3支架包含至少2个通过一个或多个接头连接的Tn3支架，其中间插在每一个Tn3支架之间的接头可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施方案中，接头可包含多个接头，其可以是相同的接头或不同的接头。在一些实施方案中，当串联多个接头时，一些或所有接头可以是功能性部分。
多聚体支架的结合化学计量学
在一些实施方案中，多聚体Tn3支架包含对于TRAIL R2是特异性的支架。在其它实施方案中，本发明的多聚体支架包含对于不同表位是特异性的支架，所述表位可以是TRAILR2上或不同靶上的不同表位。
在具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合相同TRAIL R2分子上的两个或更多个不同表位(例如，非-重叠表位)。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合TRAIL R2上的两个或更多个表位。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架结合TRAILR2上的两个或更多个不同的表位以及另外地，结合一个或多个不同靶分子上的至少1个表位。在另一个具体的实施方案中，多聚体Tn3支架可结合TRAIL R2二聚体上的相同表位。在另一个实施方案中，多聚体Tn3支架可结合至少两个TRAIL R2分子上的相同表位。在某些实施方案中，多聚体Tn3支架可结合相邻细胞表面上的两个或更多个拷贝的TRAIL R2分子上的相同表位。在一些实施方案中，多聚体Tn3支架可以以相同或不同的结合亲和力和/或亲合力结合TRAIL R2上或不同靶中的相同表位或不同表位。
在另一个实施方案中，多聚体Tn3支架中的单体支架可按照设计来获得或增强(例如，协同地)期望的对靶的作用(例如靶二聚化)的特定结合模式结合一个或多个拷贝的TRAIL R2上的表位。例如，线性多聚体支架中的Tn3支架可按照一定的模式结合单个TRAILR2或或多个TRAIL R2，例如6个模块的线性多价支架中的Tn3支架可按照AAABBB模式、AABBAA模式、ABABAB模式、AAAABB模式等结合两个TRAIL R2靶A和B；按照AABBCC模式、ABCABC模式和ABCCBA模式等结合3个靶；按照ABCDDA模式、ABCADA模式等结合4个靶；等。此外，当多聚体本发明的支架包含多个工程(例如，二硫硫键工程、环工程、或二硫键工程和环工程两者)和非工程支架，可按照特定模式排列这样的单体支架以获得或增强特定生物效应。可组合地装配单体Tn3支架的此类组合，随后使用本领域已知的方法进行评价。
在一些实施方案中，以分枝结构形式存在的多聚体Tn3支架，例如以Fc融合或抗体样形式存在的多聚体支架，还可结合单个TRAILR2或按照特定模式结合多个TRAIL R2。例如，在某些实施方案中，融合于抗体样形式的Tn3多聚体支架的IgG重链的线性形式的Tn3支架可结合第一靶，然而融合于抗体样形式的Tn3支架中的IgG轻链的多价Tn3线性支架可结合第二靶。在另一个实施方案中，融合于抗体样形式的Tn3支架的IgG重链的线性形式的Tn3支架可以以特定的亲和力结合靶，然而融合于抗体样形式的支架的IgG轻链的线性形式的支架可以以不同的亲和力结合相同靶。在一些实施方案中，融合于抗体的“Y”的左臂的链的Tn3支架可结合第一靶，然而融合于抗体的“Y”的右臂的链的Tn3支架可结合第二靶。
融合
本发明提供了包含至少2个Tn3单体支架的多聚体Tn3支架，然而可将至少一个Tn3单体支架融合于异源部分。在本说明书中，不将异源部分用作间隔子来连接支架，但可给多聚体Tn3支架提供额外的功能性。例如，在一些实施方案中，可将结合TRAIL R2的多聚体Tn3支架融合于细胞毒素剂以有利于特定靶细胞的杀伤。在一些实施方案中，异源部分可用作接头。
本发明包括缀合于或融合于一个或多个异源部分的多聚体Tn3支架的用途，所述异源部分包括但不限于肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂(mimeticagent)、合成药物、无机分子和有机分子。本发明包括重组地融合于或化学地缀合于异源蛋白质或多肽或其片段的多聚体Tn3支架的用途。缀合包括共价和非共价缀合。在一些实施方案中，可将多聚体Tn3支架融合于或化学缀合于至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少500或至少1000个氨基酸的多肽以产生融合蛋白。
多聚体Tn3支架至一个或多个异源部分的融合或缀合可以是直接的，即无间插在Tn3支架与异源部分之间的接头，或通过本文中描述的接头序列进行的。在一些实施方案中，通过将Tn3支架融合或缀合于对于靶细胞的特定细胞表面受体例如TRAIL R2是特异性的抗体，支架可用于在体外或体内将异源多肽靶向特定细胞类型。融合于或缀合于异源多肽的多聚体Tn3支架还可用于体外免疫测定和使用本领域已知的方法的纯化法。参见，例如，国际公布No.WO 93/21232；欧洲专利No.EP 439,095；Naramura等人Immunol.Lett.39:91-99,1994；美国专利No.5,474,981；Gillies等人，PNAS 89:1428-1432,1992；和Fell等人，J.Immunol.146:2446-2452,1991，将所述文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可通过将多聚体Tn3支架与免疫球蛋白或其结构域(包括但不限于IgG的恒定区(Fc))融合或缀合(例如，通过N或C端)来使支架与人免疫反应结合。类似地，支架与补体蛋白例如例如CIq之间的融合可用于靶向细胞。多聚体Tn3支架与毒素之间的融合可用于特异性破坏携带本文中描述的特定抗原的细胞。
各种出版物描述了用于获得其半衰期可通过将FcRn-结合多肽引入分子来进行改变的生理活性分子的方法(参见，例如，WO 97/43316；美国专利No.5,869,046；美国专利No.5,747,035；WO 96/32478和WO 91/14438)，通过将分子与其FcRn-结合亲和力可得到保留但对于其它Fc受体的亲和力已被大大减小的抗体融合(参见，例如，WO99/43713)，或通过将分子与抗体的FcRn结合结构域融合(参见，例如，WO 00/09560；美国专利No.4,703,039)。增加生理活性分子的半衰期的具体技术和方法还可见于美国专利No.7,083,784。具体地，预期可将多聚体Tn3支架融合于来自IgG的Fc区域，其中Fc区域包含氨基酸残基突变M252Y/S254T/T256E或H433K/N434F/Y436H，其中按照氨基酸Kabat编号方案命名位置。在一些实施方案中，可通过将多价Tn3支架与本质上无特定结构的重组多肽(例如，XTENTM多肽)基因融合或通过与聚乙二醇(PEG)缀合来增加多聚体Tn3支架的半衰期。
在一些实施方案中，可将多聚体Tn3支架与增加或延长体内或血清半衰期的分子融合。在一些实施方案中，可将支架与白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、其新生儿Fc受体(FcRn)结合片段、PEG、多糖、抗体、补体、血红蛋白、结合肽、脂蛋白及其它因子融合或缀合以增加其在血流中的半衰期和/或其组织穿透力。可利用标准技术，例如通过从使用公共可获得的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白来产生这些融合的任何融合。
此外，可将本发明的支架融合于标记序列例如帮助纯化的肽。在一些实施方案中，标记氨基酸序列为多组氨酸肽(His-标记物)，例如八组氨酸-标记物(His-8-标记物)或六组氨酸-标记物(His-6-tag)例如pQE表达载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif，91311)中提供的标记物，除其它载体外，所述载体中的许多载体是商购可得的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中所描述的，例如，多组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。用于纯化的其它肽标记物包括但不限于血凝素("HA")标记物(其相应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(参见，例如，Wilson等人，Cell 37:767,1984))、FLAG标记物、Strep-标记物、myc-标记物、V5标记物、GFP-标记物、AU1-标记物、AU5-标记物、ECS-标记物、GST-标记物或OLLAS标记物。
可通过基因改组、基因改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)产生包含本发明的支架的另外的融合蛋白。
可将DNA改组用于改变Tn3支架对靶的作用(例如，产生具有更高亲和力和更低解离速率的支架，或具有增强二聚化TRAIL R2的能力的支架)。可通过在重组之前利用易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变Tn3支架。可将编码结合特定靶的支架的多核苷酸的一个或多个部分与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等组合。
抗体-样多聚体支架
在一些实施方案中，本发明的多聚体支架包含至少2个Tn3支架，其中将至少一个Tn3支架融合于抗体(例如，IgG)的结构域或片段，包括但不限于完整抗体、抗体可变结构域、CHl结构域、Cκ结构域、Cλ结构域、Fc结构域、CH2或CH3结构域。
在一些实施方案中，可将Tn3支架融合于抗体的结构域或片段。抗体的结构域或片段还可通过类似于下文中描述的Fc结构域提供二聚化或多聚化结构域(其有利于本发明的多聚体支架的形成)来增强多聚体支架的亲合力和/或亲和力。此外，抗体的结合域或片段可进一步增强支架对靶的作用，例如更高效地二聚化或多聚化靶。
在一些实施方案中，仅将一个包含2个Tn3结构域的多聚体Tn3串联支架缀合于或融合于抗体的结构域片段。例如，可将单个多聚体串联支架融合于抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链或轻链)的多肽的N端。在一些实施方案中，通过将一个或多个Tn3支架融合或缀合于抗体的结构域或片段(例如，抗体的重链和/或轻链)的多肽的N端和/或C端来产生多聚体Tn3支架。在一些实施方案中，一些或所有融合于抗体的结构域或片段的Tn3支架是相同的。在一些其它实施方案中，一些或所有融合于抗体的结构域或片段的Tn3支架是不同的。
在一些实施方案中，用于产生抗体样多价Tn3支架的串联Tn3支架可包含相同数目的Tn3模块。在其它实施方案中，用于产生抗体样多价Tn3支架的串联Tn3支架可包含不同数目的Tn3模块。例如，可以例如通过将线性形式的四价Tn3支架融合于单个位置，或通过将一个Tn3单体支架融合于一个位置并且将三聚体线性形式的Tn3支架融合于另一个位置，或通过将两个二聚体Tn3线性形式的支架融合于两个不同的位置，或通过融合4个Tn3单体支架(每一个支架融合于单个位置)来形成四价Tn3支架。
在具体的实施方案中，本发明的多聚体Tn3支架包含4个融合于抗体的结构域或片段的多价体线性Tn3支架，其中每一个多聚体线性Tn3支架包含2个通过接头串联连接的Tn3单体支架(图1)。在其它实施方案中，本发明的多聚体Tn3支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个融合于抗体的结构域或片段的本发明的单体或多聚体Tn3支架。
在一个具体的实施方案中，可通过将一个Tn3支架融合于抗体的结构域或片段的轻链和重链的每一个的N端来产生四价Tn3支架(参见，例如，图2中的A9构建体)。
可通过将Tn3支架的任何组合融合于抗体或经修饰的抗体的结构域或片段来产生抗体样形式的多价Tn3支架。经修饰的抗体的实例包括缺失结构域的抗体、微小抗体(参见，例如，美国专利No.5,837,821)、四价微小抗体、四价抗体(参见，例如，Coloma&Morrison,Nature Biotechnol.15:159-163,1997；国际公布No.WO 95/09917)、热稳定的抗体、人源化抗体等。
用于产生根据图1的抗体样多价Tn3支架的本发明的线性支架的每一个Tn3支架可包含相同的接头和接头分布或不同的接头或不同的接头分布。
Fc-融合多聚体支架
在一些实施方案中，本发明的多聚体Tn3支架包含多个连接于Fc结构域的单体或多聚体Tn3支架。多聚体本发明的Tn3支架与包含Fc结构域的抗体片段的融合通过提供有助于多聚体FnIII支架的二聚体形成的二聚化结构域进一步增强了多聚体Tn3支架的亲合力和/或活性。
在一些实施方案中，仅将一个多聚体Tn3支架融合于Fc结构域。在具体的实施方案中，本发明的多聚体Tn3支架包含2个融合于Fc结构域的多聚体Tn3支架，其中每一个多聚体Tn3支架包含2个或更多个通过一个或多个接头连接的Tn3支架(图1)。在一个具体的实施方案中，融合于Fc结构域的多聚体Tn3支架为线性形式的支架。
在一个具体的实施方案中，将2个串联包含2个Tn3结构域的线性形式的Tn3支架融合于Fc结构域以产生效价为4的多聚体Tn3支架(参见，例如，图2中的A7构建体)。在另一个具体的实施方案中，将两个线性形式的支架(其每一个包含4个Tn3单体支架)融合于Fc结构域以产生效价为8的多聚体Tn3支架(参见，例如，图2中的A8构建体)。I
在一些实施方案中，融合于Fc结构域的Tn3支架包含相同数目的Tn3模块。在一些实施方案中，融合于Fc结构域的Tn3支架包含不同数目的Tn3模块。在一些实施方案中，融合于Fc结构域的Tn3支架包含相同的接头。在其它实施方案中，融合于Fc结构域的Tn3支架包含不同的接头。
在一些实施方案中，可通过使用有利于异二聚体形成的Fc结构域突变来二聚化本发明的不同多聚体Tn3支架。已知Fc区域的变体(例如，氨基酸置换和/或添加和/或缺失)增强或消除了抗体的效应子功能并且可改变抗体的药代动力学性质(例如，半衰期)。因此，在某些实施方案中，本发明的多特异性Tn3支架包含Fc结构域，所述结构域包含其中已在Fc区域产生一个或多个改变以改变多聚体Tn3支架的功能和/或药代动力学性质的改变的Fc区域。
还已知可改变Fc区域的糖基化以增强或减弱效应子功能和/或抗炎活性。因此，在一个实施方案中，本发明的多聚体FnIII支架的Fc区域包含改变的氨基酸残基的糖基化以改变多聚体支架的细胞毒性和/或抗炎性质。
多聚体支架的拓扑学
本领域技术人员应理解，图1和图2以及整个说明书中的上述多聚体支架仅为示例性实例。图1和图2中显示的构建体拓扑学或形式举例说明在一些实施方案中，将本发明的支架融合于抗体的Fc结构域的组成多肽的N端。可将本发明的支架以任何适当的空间排列融合于Fc结构域、抗体轻链和抗体重链的C端。例如，在一些实施方案中，可通过将FnIII单体支架融合于抗体的每一个重链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的C端结构域，通过将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个重链的C端，或通过将FnIII单体支架融合于抗体的每一个重链的N端和将FnIII单体支架融合于抗体的每一个轻链的N端来产生四价支架。可将单体和/或多聚体FnIII支架融合于包含可变区和恒定区的全长重链和/或轻链。或者，可将FnIII单体和/或多聚体支架融合于仅包含恒定区的截断的重链和/或轻链(例如，如在图2中显示的A9构建体中)。
多聚体Tn3支架可使用图1中显示的形式作为构件块(building block)来产生。例如，抗体样和Fc融合形式为包含更简单的线性形式的Tn3模块的组合。因此，在一些实施方案中，更复杂的多聚体Tn3支架形式可通过组合如图1中显示的构件块来产生。
图1和2还举例说明了在一些实施方案中，多聚体Tn3支架可以是线性或分枝的并且显示不同水平的分枝。例如，Fc形式提供了一级分枝形式的实例，然而抗体样形式提供了二级分枝形式的实例。更高级分枝结构可通过用Fc融合形式构件块或抗体样构件块替代抗体样形式或Fc融合形式中的线性形式构件块，然后将它们连接于Fc或抗体的组成多肽的C端或N端来获得。
图1和2以及表1举例说明了这样的事实：在一些实施方案中，多聚体Tn3支架中的接头在结构和功能上可以是多样的并且可提供多个联接点。例如，除通过(Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly4Ser)1Ala接头连接的第4和第5Tn3模块外，A4和A5构建体中的所有Tn3模块通过(Gly4-Ser)3Ala接头连接。例如，在A7构建体中，第一和第二Tn3结构域以及第三和第四Tn3结构域通过(Gly4Ser)3Ala接头连接，然而第二和第三Tn3结构域通过作为功能性部分接头的Fc结构域连接。
图1中显示的Fc融合物举例说明了在一些实施方案中，可将单体或多聚体Tn3支架融合于功能性部分接头的多肽的N端。在一些实施方案中，可容易地将本发明的单体或多聚体Tn3支架融合于Fc融合形式的构建体中的Fc结构域的C端。
类似地，抗体样形式的构建体中的抗体或经修饰的抗体也是功能性部分接头。在该情况下，图1的抗体样实例中显示的抗体提供了6个可能的联接点，而非2个联接点(如在(Gly4Ser)3Ala或(Gly4Ser)2GlyThrGlySerAlaMetAlaSer(Gly4Ser)1Ala接头中)或4个可能的联接点(如在Fc结构域的情况下)。图1中显示的抗体样形式举例说明了在一些实施方案中，功能性部分接头中仅N末端联接点被Tn3支架占据。在抗体样形式的构建体中，可容易地将一些或所有本发明的Tn3支架融合于抗体或经修饰的抗体结构域的重链和轻链的C端。可应用其它融合化学计量学，即可将1、2、3、4、5、6、7、8或更多个本发明的Tn3支架融合于抗体或经修饰的抗体。
图1和2还举例说明了在一些实施方案中，可通过组合其它多聚体Tn3支架产生多聚体Tn3支架。例如，图2的Fc形式A6、A7和A8支架可以是同二聚体Tn3支架，其中多聚体Tn3支架通过两个多肽链形成，每一个多肽链包含融合于Fc结构域的线性形式的Tn3支架，所述多肽转而通过分子间二硫键连接。图1和2的抗体样支架举例说明了异四聚体Tn3支架，其中相应于两种不同类型的支架(2个通过将Tn3单体支架融合于IgG轻链恒定区形成的Tn3支架，和2个通过将Tn3单体支架融合于IgG的CH1-铰链区-Fc区形成的2个Tn3支架)的多肽通过分子间二硫键连接。
本发明的支架的产生
本文中描述的Tn3支架可用于用于进化新型或改进的靶结合蛋白的任何技术。在一个具体的实例中，将靶固定在固体载体例如柱树脂或微量滴定板孔上，随后将靶与基于候选支架的结合蛋白的文库接触。这样的文库可由通过随机化CDR样环的序列和/或长度从Tn3支架构建的克隆组成。
在这方面，噬菌体展示是一种公知技术，其允许筛选大型寡肽文库以鉴定能够特异性结合靶的所述文库的成员。噬菌体展示是籍以将变体多肽以与外壳蛋白的融合蛋白的形式展示在噬菌体颗粒的表面上的技术(Scott,J.K.和Smith,G.P.(1990)Science 249:386)。可将生物信息学方法用于确定天然存在的FnIII结构域的环长度和多样性参数选择。通过使用该分析，可将环长度和序列多样性的参数选择用于开发“限制随机化(″restricted randomization)”法。在该限制随机化中，将相对环长度和序列参数选择并入文库策略的开发中。将环长度和序列多样性分析整合入文库开发导致限制随机化(即，随机化的环内的某些位置受到限制，其中氨基酸可位于该装置)。
本发明还提供了包含多种多样的非天然存在的Tn3支架群体的重组文库。在一个实施方案中，文库包含含有连接于多个环区域的多个β链结构域的非天然存在的Tn3支架，其中一个或多个所述环相异在于至少1个氨基酸的缺失、置换或添加。在具体的实施方案中，文库包含衍生自野生型Tn3支架的Tn3支架。
如上所述，可对连接支架的多个β链的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一个实施方案中，本发明的文库包含具有至少1个已对其长度和/或序列多样性进行随机化的环的Tn3支架。在一个实施方案中，对Tn3支架的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环的长度和/或序列多样性进行标准化。在一个实施方案中，使至少1个环保持恒定，然而对至少1个另外的环的长度和/或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，使环AB、CD和EF的至少1个、至少2个或所有3个保持恒定，同时对环BC、DE和FG的至少1个、至少2个或所有3个的长度或序列多样性进行随机化。在另一个实施方案中，对环AB、CD和EF的至少1个、至少2个或至少所有3个进行随机化，同时对环BC、DE和FG的至少1个、至少2个或所有3个的长度和/或序列多样性进行随机化。
我们发现比FOI的FG环中发现的氨基酸长度短至少1个氨基酸的FG环经显示增强的稳定性。因此，本发明提供了包含Tn3支架的文库，其中除使FG环的长度保持比人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的关联FG环(包含10个氨基酸残基)短至少1个氨基酸外，对至少1个环的长度和/或序列多样性进行随机化。在一些实施方案中，本发明的文库包含Tn3支架，其中每一个支架包含连接于6个环区域的命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，其中环区域连接每一个β链并且被命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG；并且其中至少一个环为野生型Tn3支架环的非天然存在的变体，并且其中FG环比野生型Tn3支架中的关联环短至少一个氨基酸。
在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链包含SEQ ID NO:42，Bβ链包含SEQ ID NO:43，Cβ链包含SEQ ID NO:45，Dβ链包含SEQ ID NO:46，Eβ链包含SEQID NO:47，Fβ链包含SEQ ID NO:49，且Gβ链包含SEQ ID NO:52。
在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链由SEQ ID NO:42组成，Bβ链由SEQ ID NO:43组成，Cβ链由SEQ ID NO:45组成，Dβ链由SEQ ID NO:46组成，Eβ链由SEQ IDNO:47组成，Fβ链由SEQ ID NO:49组成，且Gβ链由SEQ ID NO:52组成。
在具体的实施方案中，本发明的文库包含FnIII支架，其中Aβ链基本上由SEQ IDNO:42组成，Bβ链基本上由SEQ ID NO:43组成，Cβ链基本上由SEQ ID NO:45组成，Dβ链基本上由SEQ ID NO:46组成，Eβ链基本上由SEQ ID NO:47组成，Fβ链基本上由SEQ ID NO:49组成，且Gβ链基本上由SEQ ID NO:52组成。
如上所述，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。任选地或可选择地，使环内的一个或多个残基保持恒定，同时对其它残基的长度和/或序列多样性进行随机化。因此，本发明的文库包含可含有一个或多个具有简并共有序列和/或一个或多个不变体氨基酸残基的环的Tn3支架。
在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Tn3支架：S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表脯氨酸或丙氨酸并且其中(b)代表丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Tn3支架：S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X代表任意氨基酸并且其中(c)代表脯氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的BC环的Tn3支架：A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X代表任意氨基酸，其中(d)代表脯氨酸、谷氨酸或赖氨酸，其中(e)代表天冬酰胺或甘氨酸，并且其中(f)代表丝氨酸或甘氨酸。
在一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有具有下列共有序列的被随化的DE环的Tn3支架：X-X-X-X-X-X，其中X代表任意氨基酸。
在一个实施方案中,本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的FG环的Tn3支架：X-a-X-X-G-X-X-X-b，其中X代表任意氨基酸，其中(a)代表天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸，并且其中(b)代表丝氨酸或丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明的文库包含拥有具有下列共有序列的经随机化的FG环的FnIII支架：X-X-X-X-X-X-X-X-X(X9)，其中X代表任意氨基酸。
在具体实施方案中，本发明的文库包含支架，其中支架包含氨基酸序列：IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT，其中XAB、XBC、XCD、XDE、XEF和XFG分别代表存在于AB、BC、CD、DE、EF和FG环中的氨基酸残基，其中X1代表氨基酸残基A或T，并且其中n=2-26以及m=1-9。
本发明还提供了用于通过筛选本发明的文库鉴定结合靶例如TRAIL R2并且与野生型Tn3支架相比较具有增强的稳定性或增强的对靶例如TRAIL R2的作用的重组Tn3支架的方法。
在某些实施方案中，用于鉴定与野生型Tn3支架相比较具有增强的蛋白质稳定性并且特异性结合靶的重组Tn3支架的方法，包括：
(a)在适合于形成支架：靶配体复合物的条件下将靶配体与本发明的文库接触；
(b)从复合物获得结合靶配体的支架；
(c)确定步骤(b)中获得的支架的稳定性是否大于野生型Tn3支架的稳定性。
可使用相同的方法鉴定具有增强的对于靶的结合亲和力、亲合力等的重组Tn3支架。在一个实施方案中，在步骤(a)中，将本发明的支架文库与固定的靶一起温育。在一个实施方案中，在步骤(b)中，洗涤支架：靶配体复合物以除去非特异性结合剂，在极严格的条件下洗脱最紧密的结合剂，将其经历PCR以恢复序列信息。特别地预期步骤(b)中获得的结合剂和/或序列信息可用于使用本文中公开的或本领域技术人员已知的方法产生新文库，可将所述新文库在进行或不进行序列的进一步诱变的情况下用于重复选择过程。在一些实施方案中，可进行许多轮选择直至获得具有足够的对于抗原的亲和力的结合剂。
本发明的其它实施方案为编码包含本发明的支架和上述支架的文库的分离的核酸分子的集合。
可将本发明的支架经历亲和力成熟。在本领域接受的方法中，将特定结合蛋白经历选择增强的对于特定靶的亲和力的方案(参见Wu等人，Proc Natl Acad Sci USA.95(11):6037-42)。所得的本发明的支架可显示至少与亲和力成熟之前的支架一样高的结合特征。
本发明还提供了鉴定能够结合靶以形成支架：靶复合物的蛋白质支架的氨基酸序列。在一个实施方案中，方法包括：a)将本发明的文库与固定的或可分离的靶接触；b)将支架：靶复合物与游离支架分离；c)引起(b)的分离的支架复制以导致新的多肽展示文库，其与(a)中的多肽展示文库区别在于具有减少的多样性和被富集在能够结合靶的展示的支架中；d)任选地用(c)的新文库重复步骤(a)和(b)；和e)测定编码来自(d)的种类的展示支架的区域的核酸序列，从而推导能够结合靶的肽序列。
在另一个实施方案中，还可在从文库筛选鉴定后进一步对本发明的支架进行随机化。在一个实施方案中，本发明的方法包括使用本文中描述的方法进一步对从文库鉴定的支架的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环进行随机化。在另一个实施方案中，将进一步随机化的支架经历随后的鉴定能够结合靶的支架的方法。该方法包括(a)将所述进一步随机化的支架与固定的或可分离的靶接触，(b)将进一步随机化的支架：靶复合物与游离支架分离，(c)引起(b)的分离的支架复制，任选地重复步骤(a)-(c)，和(d)测定编码所述进一步随机化的支架的区域的核酸序列，从而推导能够结合靶的肽序列。
在其它实施方案中，进一步随机化的支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个先前在第一文库中被随机化的随机化的支架。在可选择的其它实施方案中，进一步随机化的支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个先前在第一文库中未被随机化的随机化的环。
本发明还提供了用于获得至少2个结合至少1个或多个靶的Tn3支架的方法。该方法允许筛选协同作用以引发特定反应的试剂。当需要需要超过一个支架的协同作用的激动活性(例如，但不限于属于TNF受体家族的受体的激动)时，可以有利地使用这样的筛选。该方法允许筛选协同试剂而无需对文库重新格式化以形成多聚体复合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括在允许支架：靶配体复合物形成的条件下将靶配体与本发明的文库接触，使所述支架与交联剂(定义为将至少两个相同的或不同的支架拉近在一起的试剂)衔接，其中支架的交联引发可检测的反应，以及从所述复合物获得结合靶的所述支架。在其它实施方案中，交联剂为支架特异性抗体或其片段、其片段的附加表位特异性抗体、二聚化结构域例如例如Fc区域、卷曲螺旋基序(coiled coil motif)(例如，但不限于亮氨酸拉链)、化学交联剂或本领域已知的另一种二聚化结构域。
本发明还提供了利用本发明的支架检测化合物的方法。基于通过文库筛选获得的支架的结合特异性，在测定中使用这样的支架有可能在样品中检测到靶，例如以用于诊断方法。在一个实施方案中，检测化合物的方法包括在允许化合物：支架复合物形成的条件下将样品中的所述化合物与本发明的支架接触，然后检测所述支架，从而检测样品中的所述化合物。在其它实施方案中，标记(即，放射性标记、荧光、酶联或比色标记(colorimetriclabel))支架以帮助检测化合物。
本发明还提供了利用本发明的支架捕获化合物的方法。基于通过文库筛选获得的支架的结合特异性，在测定中使用这样的支架有可能捕获样品中的特定靶，例如用于纯化方法。在一个实施方案中，捕获样品中的化合物的方法包括在允许化合物：支架复合物形成的条件下将样品中的所述化合物与本发明的支架接触，然后从样品取出所述复合物，从而捕获所述样品中的所述化合物。在其它实施方案中，将支架固化以帮助取出化合物：支架复合物。
在一些实施方案中，从本发明的文库分离的支架包含至少1个、至少2个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个随机化的环。在一些实施方案中，可将分离的支架环序列从供体支架交换至接受者支架中的任何环(例如，可将来自供体支架的FG环序列转移至接受者支架中的任何环)。在具体的实施方案中，可将分离的环序列转移至接受支架的关联环(例如，可将来自供体支架的FG环序列转移至FG环位置中的接受者支架)。在一些实施方案中，可将分离的环序列与各种接受者支架随机地“混合和匹配”。
在其它实施方案中，分离的支架序列可通过环序列来鉴定。例如，将文库用于淘选特定的靶，然后分离特定结合剂的集合。可将随机化的环序列表征为独立于支架背景的特定序列(即，结合靶X的支架，其中所述支架包含SEQ ID NO:X的FG环序列)。在可选择的实施方案中，当支架显示两个结合靶X的环序列时，可将环序列表征为在支架序列不存在的情况下结合靶X。换句话说，预期从文库分离的结合特定靶的支架可表达为结合独立于支架主链的靶的可变环序列。该方法与抗体的可变区中的CDR的概念类似。
亲和力成熟
TRAIL R2Tn3支架的开发可包括一个或多个体外或体内亲和力成熟步骤。可使用导致Tn3结构域或Tn3结构域环的氨基酸变化的任何亲和力成熟法，所述氨基酸变化可增强Tn3支架对期望的抗原的结合。
这些氨基酸变化可以例如通过随机诱变、“模糊”诱变(“walk though”mutagenesis)和精确诱变(“look through”mutagenesis)。这样的诱变可以例如使用易错PCR、酵母或细菌的“增变”株、在基于FnIII的结合分子的全部或部分的从头开始合成过程中随机或确定的核酸变化的整合来实现。用于进行亲和力成熟和/或诱变的方法描述于例如美国专利No.7,195,880、6,951,725、7,078,197、7,022,479、5,922,545、5,830,721、5,605,793,5,830,650、6,194,550、6,699,658、7,063,943、5,866,344和PCT公布No.WO06023144中。
这样的亲和力成熟法可能还需要增强抗原结合筛选测定的严格性以选择具有增强的对抗原的Tn3支架。用于增强蛋白质间相互作用测定的严格性的本领域公认的方法可用于此处。在一个实施方案中，改变一个或多个测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)以减小Tn3支架对于期望的抗原的亲和力。在另一个实施方案中，缩短Tn3支架结合期望的抗原所允许的时间长度。
在另一个实施方案中，可将竞争结合步骤添加至蛋白质间相互作用测定。例如，可首先允许Tn3支架结合期望的固定的抗原。随后添加用于竞争与固定的抗原结合的特定浓度的非固定的抗原，以便具有最低的对于抗原的亲和力的Tn3支架从固定的抗原洗脱，从而导致具有增强的结合亲和力的Tn3支架的选择。测定条件的严格性可通过增加被添加至测定的非固定抗原的浓度来进一步增强。
筛选方法可能还需要多轮的选择以富集一种或多种具有增强的抗原结合的Tn3支架。在一个实施方案中，在第一轮选择上，可向Tn3支架中引入其它氨基酸突变。在另一个实施方案中，在每一轮选择中，可增强对期望的抗原结合的严格性以选择具有增强的对于抗原的亲和力的Tn3支架。
在一些实施方案中，通过对Tn3的BC、DE和FG环的部分的饱和诱变来进行亲和力成熟。在一些实施方案中，使用Kunkel诱变进行饱和诱变。在其它实施方案中，通过使用PCR进行饱和诱变。
在一些实施方案中，应用至少1轮、至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮或超过5轮亲和力成熟。在一些实施方案中，将饱和诱变仅用于一个环，然而在一些其它实施方案中，在一轮亲和力成熟过程中仅诱变一个环或环的部分。在一些实施方案中，在相同轮的亲和力成熟过程中突变超过一个环或一个或多个环的部分。
在其它实施方案中，在相同轮的亲和力突变过程中同时突变BC、DE和FG环。
在装配成结合相同靶的不同表位的多聚体支架的Tn3支架情况下或在双特异性Tn3支架的情况下，可独立地筛选每一种结合特异性。因此，在一些实施方案中，使用Tn3支架的第一文库进行鉴定结合第一靶例如TRAIL R2的单个Tn3结合分子的第一筛选，其中改变一个或多个环中的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，可进行鉴定结合不同靶或结合相同靶的不同表位的单个Tn3分子的另外的筛选。
在一些实施方案中，使用噬菌体展示文库随机化环。在一些实施方案中，可使用本文中公认的方法测定Tn3支架对期望的靶的结合。同样地，还可使用本领域公认的方法测定筛选中鉴定的Tn3支架的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的单体亲和力成熟的支架显示与亲和力成熟之前相同的Tn3支架相比较对于TRAIL R2的亲和力增强至至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少60倍、至少80倍或至少100倍或更多倍，如通过表面等离体共振技术或通过本领域已知的其它测定法测量的。在一些实施方案中，本发明的单体亲和力成熟的支架具有低于5μM、低于1μM、低于500μM、低于250μM、低于100μM或低于50μM的解离常数(Kd)，如通过表面等离子体共振技术或通过本领域已知的其它测定法测量的。
这些亲和力成熟法可用于开发具有期望的增强的结合性质例如增强的亲和力或其它期望特征，例如有利的药代动力学性质、高效力、低免疫原性、增强的或减弱的与来自其它生物体的TRAIL R2受体的交叉反应性等的Tn3支架。
串联重复的产生
串联构建体的连接可使用本领域已知的限制性内切酶(包括但不限于II型和IIS型限制性内切酶)通过在限制位点上连接寡核苷酸来产生。
本发明的多聚体Tn3支架可在C端和/或N端和/或结构域之间包含接头，如本文中所描述的。此外，可将包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个环的本发明的支架或多肽支架融合或缀合于二聚化结构域，包括但不限于选自如下部分的抗体部分：
(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；
(ii)Fab'片段，其为在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；
(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；
(iv)具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C端上具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；
(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；
(vi)dAb片段，其由VH结构域组成；
(vii)分离的CDR区域；
(viii)F(ab′)2片段，包括通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；
(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)；
(x)具有两个抗原结合位点的“双链抗体”，其包含连接于相同多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；
(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；
(xii)全长抗体；和
(xiii)包含CH2-CH3的Fc区域，其还可包含铰链区和/或CH1区的全部或部分。在下面的实例中例示了各种效价、亲和力和空间定向方案。
支架的产生
本发明的支架的重组表达需要构建包含编码支架的多核苷酸的表达载体。在已获得编码支架的多核苷酸后，可使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生用于产生支架的载体。因此，本文中描述了用于通过表达包含支架编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可将对于本领域技术人员来说是公知的方法用于构建包含支架多肽编码序列和适当的转录及翻译控制信号的表达载体。此类方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含有效地连接于启动子的编码本发明的支架的核苷酸序列的可复制载体。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，随后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的支架。因此，本发明包括包含有效地连接于异源启动子的编码本发明的支架的多核苷酸的宿主细胞。适当的宿主细胞包括但不限于微生物例如细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。
可将多种宿主-表达载体系统用于表达本发明的支架。此类宿主-表达系统代表籍以产生目标编码序列并随后纯化所述序列的载体(vehicle)，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的支架的细胞。这类宿主-表达系统包括但不限于利用包含支架编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细胞(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NSO和3T3细胞)。
用于产生本发明的支架的方法公开于例如公布No:WO2009/058379中。在已通过重组表达产生本发明的支架后，可利用本领域内已知的用于纯化蛋白质的任何方法来纯化其。
可按比例扩大研究实验室的本发明的支架的生产以在分析规模反应器或生产规模反应器中产生支架，如美国专利申请公布No.US2010/0298541A1中所描述的。
分泌型支架的可扩展的生产
可细胞内产生或可以以分泌的形式产生本发明的Tn3支架。在一些实施方案中，分泌型支架正确地折叠并且具有完全的功能。可通过可扩展法(scalable process)生产本发明的Tn3支架。在一些实施方案中，可在研究实验室中，通过可按比例扩大以在分析规模生物反应器(例如，但不限于5L、10L、15L、30L或50L的生物反应器)中生产本发明的Tn3支架的本发明的可扩展法生产Tn3支架。在其它实施方案中，可在研究实验中，通过可按比例扩大至在生产规模的生物反应器(例如，但不限于75L、100L、150L、300L或500L)中生产本发明的支架的本发明的可扩展法生产支架。在一些实施方案中，本发明的可扩展法导致与在研究实验室中进行的生产方法相比较几无或无生产效率的下降。
接头
多聚体支架中的Tn3支架通过蛋白质和/或非蛋白质接头连接，其中每一个接头融合于至少2个本发明的Tn3支架。适当的接头可由蛋白质接头、非蛋白接头及其组合组成。接头的组合可以是同聚体或异聚体。在一些实施方案中，本发明的多聚体Tn3支架包含多个其中所有接头都是相同的单体Tn3支架。在其它实施方案中，多聚体Tn3支架包含多个其中至少1个接头在功能上或结构上与其余接头不同的单体Tn3支架。在一些实施方案中，接头本身可通过直接或间接参与对靶的结合为多聚体FnIII支架的活性作出贡献。
在一些实施方案中，蛋白质接头为多肽。接头多肽应当具有这样长度，所述长度足以以使它们采取彼此相对正确的构象(以便它们保留期望的活性)的方式连接2个或更多个本发明的单体支架或2个或更多个本发明的多聚体支架。
在一个实施方案中，多肽接头包含1至约1000个氨基酸残基、1至约50个氨基酸残基、1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、1-15个氨基酸残基、1-10个氨基酸残基、1-5个氨基酸残基、1-3个氨基酸残基。本发明还提供了编码多肽接头序列的核酸例如DNA、RNA或两者的组合。被选择包含在多肽接头中的氨基酸残基应当显示不显著干扰本发明的多聚体Tn3支架的活性或功能的性质。因此，多肽接头应当在总体上不显示与本发明的多聚体支架的活性或功能不一致，或干扰内部折叠，或与一个或多个Tn3单体结构域中的氨基酸残基形成键或其它相互作用(这严重地阻碍了本发明的多聚体支架对TRAILR2的结合)的电荷。
天然存在的以及人工肽接头用于将多肽连接入新型连接的融合多肽的用途在文献中是公知的。因此，融合2个或更多个本发明的支架的接头是天然接头、人工接头或其组合。在一些实施方案中，存在于多聚体本发明的支架中的所有肽接头的氨基酸序列是相同的。在其它实施方案中，存在于本发明的多聚体支架中的至少两个肽接头的氨基酸序列是不同的。
在一些实施方案中，多肽接头具有构象柔性。在具体实施方案中，多肽接头序列包含(G-G-G-G-S)x氨基酸序列，其中x为正整数。在一些实施方案中，多肽接头为固有地非结构化的天然或人工多肽(参见，例如，Schellenberger等人，Nature Biotechnol.27:1186-1190,2009；也参见，Sickmeier等人，NucleicAcids Res.35:D786-93,2007)。
可以以引入包含用于非多肽部分的联接基团的氨基酸残基的方式修饰肽接头。此类氨基酸残基的实例可以是半胱氨酸残基(随后可将非肽部分联接于其)或氨基酸序列可包含体内N-糖基化位点(从而将糖部分(体内)联接于肽接头)。
在一些实施方案中，存在于多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列是相同的。或者，存在于多肽多聚体中的所有肽接头的氨基酸序列可以不同。
支架的标记或缀合
本发明的支架可以以非缀合形式使用或可缀合于多个异源部分的至少一个以有利于靶检测或用于成像或治疗。当进行纯化时，可在纯化之前或之后标记或缀合本发明的支架。
许多异源部分不存在本发明的支架可与其连接的适当的官能团。因此，在一些实施方案中，通过接头将效应分子联接于支架，其中接头包含用于缀合的反应基团。在一些实施方案中，缀合于本发明的支架的异源部分可用作接头。在其它实施方案中，部分可通过可被切割或不可切割的接头缀合于支架。在一个实施方案中，可切割的连接分子为可氧化还原切割的连接分子，以便连接分子在具有更低的氧化还原电位的环境(例如细胞质或具有更高浓度的具有游离巯基的分子的其它区域)中可被切割。可因氧化还原电位的变化而被切割的连接分子的实例包括包含二硫化物的那些连接分子。
在一些实施方案中，对本发明的支架进行工程化以提供用于缀合的反应基团。在这样的支架中，N端和/或C端还可用于提供用于缀合的反应基团。在其它实施方案中，可将N端缀合于一个部分(例如，但不限于PEG)同时将C端缀合于另一个部分(例如，但不限于生物素)，或反之亦然。
术语“聚乙二醇”或“PEG”意指聚乙二醇化合物或其衍生物(具有或不具有偶联剂、偶联或活化部分(例如，具有巯基、三氟甲磺酸盐、三氟乙基磺酸单甲氧基(Tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分))。术语“PEG”意欲表示分子量为500至150,000Da的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OH基已被甲氧基替代(称为mPEG)。
可用聚乙醇(PEG)衍生本发明的支架。PEG为具有两个末端羟基的环氧乙烷重复单元的线性、水溶性聚合物。按照它们的分子量(通常在约500道尔顿至约40,000道尔顿的范围内)将PEG分类。在具体的实施方案中，使用的PEG具有从5,000道尔顿变化至约20,000道尔顿的分子量。偶联于本发明的支架的PEG可为分枝的或未分枝的。参见，例如，Monfardini,C.等人1995Bioconjugate Chem 6:62-69。PEG可从Nektar Inc.,SigmaChemical Co.和其它公司商购获得。这样的PEG包括但不限于单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸盐(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸单甲氧基(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
简而言之，利用惰性基团例如甲氧基或乙氧基在一个末端给所使用的亲水聚合物例如PEG加帽。此后，通过与适当的活化剂例如氰基尿素卤化物(例如，氰尿酰氯、氰尿酸溴或氰尿酸氟)、羰基二咪唑、酸酐试剂(例如，二卤代丁二酸酐，例如二溴丁二酸酐)、酰叠氮、对-重氮基二苄醚、3-(对-重氮基苯氧基)-2-羟丙醚)等反应来在另一端活化聚合物。随后将活化的聚合物与本文中描述的多肽反应以产生利用聚合物衍生的多肽。或者，可活化发明的支架中的官能团以与聚合物反应或可使用已知的缀合法在协调的偶联反应中连接两个基团。将容易地理解，可使用许多本领域技术人员已知的和使用的其它反应方案，利用PEG来衍生本发明的多肽。可将PEG在支架的末端上或支架内的一个或多个官能团上偶联至本发明的支架。在某些实施方案中，将PEG偶联在N端或C端。
在其它实施方案中，可将本发明的支架、其类似物或衍生物缀合于诊断剂或可检测剂。这样的支架可用于监控或预后疾病的发展或进展作为临床测试法的部分，例如测定特定疗法的功效。
本发明还包括缀合于治疗性部分的支架的用途。可将支架缀合于治疗性部分例如细胞毒素，例如细胞抑制剂(cytostatic agent)或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如α-发射体。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害的任何试剂。
测定支架
可通过许多本领域已知的体外测定法来测定支架对抗原的结合亲和力和其它结合性质，所述测定法包括例如，平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、或动力学(例如，分析)以及其它方法例如间接结合测定、竞争性结合测定、凝胶电泳和层析(例如，凝胶过滤)。这些和其它方法可利用待检查的一个或多个组分上的标记和/或应用多种检测法，包括但不限于生色(chromogenic)、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可见于Paul,W.E.编著，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)。
在一些实施方案中，本发明的支架以特定动力学特异性结合靶。在一些实施方案中，本发明的支架可具有低于1×10-2M、1×10-3M、1×10-4M、1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M或低于1×10-15M的解离常数或Kd(koff/kon)。在具体实施方案中，本发明的支架具有500μM、100μM、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM或更少的Kd，如通过BIAcore测定或通过本领域已知的其它测定法测定的。在可选择的实施方案中，本发明的支架的亲和力以缔合常数(Ka)进行描述，所述缔合常数计算为至少1×102M-1、1×103M-1、1×104M-1、1×105M-1、1×106M-1、1×107M-1、1×108M-1、1×109M-1、1×1010M-11×1011M-11×1012M-1、1×1013M-1、1×1014M-1、1×1015M-1或至少5X l015M-1的比率kon/koff。在某些实施方案中，与本发明的支架与靶表位解离所处的比率可以比Kd或Ka的值更相关。在一些实施方案中，本发明的支架具有小于10-3s-1、小于5x10-3s-1、小于10-4s-1、小于5x10-4s-1、小于10-5s-1、小于5x10-5s-1、小于10-6s-1、小于5x10-6s-1、小于10- 7s-1、小于5x10-7s-1、小于10-8s-1、小于5x10-8s-1、小于10-9s-1、小于5x10-9s-1或小于10-10s-1的koff。在某些其它实施方案中，本发明的支架与靶表位缔合所处的比率可以比Kd或Ka的值更相关。在该情况下，本发明的支架以至少105M-1s-1、至少5x105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5x106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5x 107M-1s-1或至少108M-1s-1或至少109M-1s-1的kon率结合靶。
还可将本发明的支架联接于固体载体，这对于靶的免疫测定或纯化是特别有用的。此类固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
TRAIL R2-特异性Tn3支架
TRAIL R2蛋白由TNF-受体超家族基因的成员编码，并且包含细胞内死亡结构域。在一些情况下，其也可称为TNFRSFlOB；CD262、DR5、KILLER、KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB或ZTNFR9。该受体可被肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNFSF 10/TRAIL/APO-2L)激活，并且转导细胞凋亡信号。此外，TRAIL R2诱导的细胞凋亡涉及半胱天冬酶和细胞内适体分子FADD/MORT1(Walczak等人.EMBOJ,(1997),16,5386-97)。
本发明提供了特异性结合TRAIL R2的Tn3支架。在具体的实施方案中，本发明的支架特异性结合人TRAIL R2。在其它具体实施方案中，本发明的Tn3支架结合来自小鼠、鸡、恒河猴、食蟹猴、大鼠或兔子的TRAIL R2同源物。在一些实施方案中，本发明的Tn3支架结合TRAIL R2的暴露表位。这样的实施方案包括在细胞和/或经转染以异位表达受体的细胞上内源表达的TRAIL R2。
在其它实施方案中，本发明的Tn3支架识别在单体TRAIL R2上展示的表位。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架识别在TRAIL R2的同二聚体形式上显示的表位。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架结合单体TRAIL R2并且促进2个或更多个TRAIL R2分子的二聚化或寡聚化(例如，但不限于多聚体支架)。在其它实施方案中，本发明的支架减弱或抑制TRAIL R2与TRAIL配体的相互作用。在其它实施方案中，本发明的支架模拟TRAIL配体与TRAIL R2的相互作用。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架通过TRAIL-R2激活细胞信号转导。
本发明还提供了使用本文中描述的Tn3支架调节TRAIL R2活性的方法。在一些实施方案中，本发明的方法包括将表达TRAIL R2的细胞与TRAIL R2特异性支架接触，以及阻断与TRAIL配体的相互作用。在其它实施方案中，本发明的方法包括将表达TRAIL R2的细胞与TRAIL R2-特异性Tn3支架接触，以及模拟TRAIL配体与TRAILR2的相互作用。
在其它实施方案中，本发明的方法包括通过与TRAIL R2-特异性Tn3支架接触来激活TRAIL R2。在其它实施方案中，本发明的方法包括通过将在细胞上表达的TRAIL R2的单体与TRAIL R2特异性支架并且促进二聚化或寡聚化来接触二聚化或寡聚化TRAIL R2。在其它实施方案中，TRAIL R2的二聚化可通过使用例如但不限于多聚体Tn3支架来实现，所述多聚体Tn3支架模拟TRAIL R2二聚体、稳定TRAIL R2二聚体形成、使TRAIL R2单体去稳定或仅识别细胞上展示的TRAIL R2二聚体。
在其它实施方案中，TRAIL R2的二聚化或寡聚化可通过使用偶联有支架二聚化或寡聚化试剂的单体Tn3支架来实现。这样的支架二聚化或寡聚化试剂可包括例如但不限于抗支架抗体，具有偶联有探针表位标记物的抗体的表位标记物的支架的使用，或本文中描述的和本领域已知的各种蛋白质二聚化或寡聚化基序的整合。在其它实施方案中，TRAILR2二聚体或寡聚体可通过施用单体支架，然后施用支架二聚化或寡聚化试剂来诱导。
在一些实施方案中，本发明的方法包括施用降低细胞活力(如通过本领域已知的常规测定法测量)的TRAIL R2特异性支架。在其它实施方案中，细胞活力的降低是细胞凋亡的激活，如通过本领域已知的测定法测量的。在其它实施方案中，细胞活力的降低是细胞分裂的抑制，如通过本领域接受的方法测量的。在一些实施方案中，细胞活力与在处理不存在的情况下的细胞活力相比较降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架以与TRAIL R2的配体(称为TRAIL)相似的活性激活TRAIL R2。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架能够充分激活TRAIL R2以导致一个或多个细胞内信号转导途径的激活，包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、半胱天冬酶10或FDAA的激活。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架在至少一个癌症细胞类型中激活细胞凋亡。在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2-结合Tn3支架在至少一个细胞类型中显示与TRAIL相比较增强的细胞凋亡的激活。
在其它实施方案中，本发明的TRAIL R2结合Tn3支架可结合与TRAIL(配体)所结合的表位相同的TRAIL R2上的表位或竞争对所述表位的结合。在这样的实施方案中，TRAILR2结合支架能够阻断或抑制TRAIL R2与TRAIL的相互作用至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多，这可使用可溶性TRAIL配体(例如TRAIL配体的114-281片段)、结晶学研究或其它已知的体内或体外研究来在体外竞争性测定中进行测定。
在疗法中使用Tn3TRAIL R2-特异性支架的方法
已知TRAIL R2介导细胞凋亡信号转导。虽然几种类型的正常细胞表达TRAIL R2，但通过该受体的细胞凋亡信号似乎主要限制于肿瘤细胞，所述肿瘤细胞在它们通过癌基因例如Myc或Ras的转化的背景中变得对死亡受体介导的细胞凋亡更易感(Wang等人,CancerCell 5:501-12(2004)；Nesterov等人,Cancer Res.64:3922-7(2004))。TRAIL R2通常由人癌细胞系以及原发性肿瘤表达。
在一些实施方案中，给需要治疗的受试者(例如，癌症患者)施用本发明的TRAILR2特异性支架。在这样的实施方案中，给有此需要的受试者施用包含TRAIL R2特异性支架的无菌、无热源组合物。可使用本领域公知的多种体外和体内测定法例如但不限于细胞凋亡活性、使用膜联蛋白V结合的半胱天冬酶激活以及肿瘤负荷或体积的减小来测量治疗效率。
在其它实施方案中，本发明的TRAILR2特异性支架对于诊断和检测癌症或其它TRAIL R2相关疾病是有用的。在这样的实施方案中，将本发明的TRAIL R2特异性支架连接于检测剂例如但不限于放射性同位素、荧光或化学发光标记物。这样的连接的结合剂在检测或诊断受试者或采自所述受试者的样品的癌症或TRAIL R2相关疾病的方法中是有用的。此外，TRAIL R2特异性支架在诊断和治疗其它TRAILR2相关病理病况例如哺乳动物(包括人)的免疫相关疾病中是有用的。
特异性TRAIL R2结合序列
在一些实施方案中，本发明的TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个结合TRAIL R2的环序列。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3支架包含选自：1C12(SEQ ID NO:132)、G3(SEQ ID NO:133)、1E11(SEQ ID NO:134)、C4(SEQ ID NO:135)、C11(SEQ ID NO:136)、F4(SEQ ID NO:137)和G6(SEQ ID NO:138)的TRAIL R2结合单体支架克隆的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个环序列。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含至少1个选自表4中所列的环序列的环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少1个选自表4中所列的BC环序列的BC环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少1个选自表4中所列的DE环序列的DE环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含至少1个选自表4中所述列的FG环序列的FG环序列。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含选自表4中所列的BC环序列的BC环序列；和选自表4中所列的DE环序列的DE环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性单体支架包含选自表4中所列的BC环序列的BC环序列；以及选自表4中所列的FG环序列的FG环序列。在其它实施方案中，TRAIL R2特异性支架包含选自表4中所列的DE环序列的DE环序列；以及FG环序列选自表4中所列的FG环序列。在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3单体支架包含相应于来自1、2或3个不同Tn3克隆的环序列。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为线性多聚体，例如二聚体例如SEQ ID NO:139的1E11串联2支架、四聚体例如SEQ ID NO:140的1E11串联4支架或SEQ IDNO:143的G6串联4支架、六聚体例如SEQ ID NO:141的1E11串联6支架、SEQID NO:144的G6串联6支架或SEQ ID NO:167的F4mod12串联6、或八聚体例如SEQ ID NO:142的1E11串联8支架、SEQ ID NO:145的G6串联8支架或SEQ ID NO:166的F4mod12串联8支架。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为Fc融合物，例如，SEQ IDNO:149的1C12Fc融合物、SEQ ID NO:150的G3Fc融合物、SEQ ID NO:151的1E11Fc融合物、SEQ ID NO:152的C4Fc融合物或SEQ ID NO:153的G6Fc融合物。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架为抗体样融合物，例如由SEQID NO:154的1C12IgG1重链恒定区支架与SEQID NO:155的1C12κ轻链支架的缔合产生的支架，由SEQ ID NO:156的G3IgG1重链支架与SEQ ID NO:157的G3κ轻链支架的缔合产生的支架，由SEQ ID NO:158的1E11IgG1重链支架与SEQ ID NO:159的1E11κ轻链支架的缔合产生支架，由SEQ ID NO:160的C4IgG1重链支架与SEQ ID NO:161的C4κ轻链支架的缔合产生支架，或由SEQ ID NO:162的G6IgG1重链支架与SEQ ID NO:163的G6κ轻链支架的缔合产生支架。
在一些实施方案中，TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架以线性形式组合Fc融合形式，例如SEQ ID NO:164的1E11串联2Fc融合物或SEQ ID NO:165的1E11串联4Fc融合物。
在某些实施方案中，当TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架序列在序列的C端包含接头和/或组氨酸标记物时，可除去该C末端接头和/或组氨酸标记物，从而相应的氨基酸序列包含C末端接头和His标记物序列的缺失。
在一些实施方案中，将TRAIL R2特异性Tn3多聚体支架缀合于PEG。在具体实施方案中，将F4mod12串联6(SEQ ID NO:167)或F4mod12串联8(SEQ ID NO:166)支架缀合于PEG。在其它实施方案中，将PEG在缀合于多聚体支架分子的N端或C端。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如但不限于与药学上可接受的载体一起配制的包含一种本发明的支架或多聚体支架或其组合的药物组合物。此类组合物可包含一种本发明的支架或例如但不限于两种或更多种不同的本发明的支架的组合。例如，本发明的药物组合物可包含结合靶抗原上不同表位的支架或具有互补活性的支架的组合。在具体的实施方案中，药物组合物包含多聚体本发明的支架。
还可在联合治疗(例如与其它试剂组合的)中施用本发明的药物组合物。例如，联合治疗可包括与至少一种其它疗法(其中所述疗法可以为放射疗法、化学疗法、辐照疗法或药物疗法)组合的本发明的支架。本发明的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。
药物给药和施用
为了制备包含本发明的Tn3支架的药物或无菌组合物，将支架与药学上可接受的载体或赋形剂混合。选择治疗剂的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状的水平、实体的免疫原性和靶细胞在生物学基质中的可及性。在某些实施方案中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化至与副作用的可接受水平一致。针对具体的患者、组合物以及施用模式，可改变本发明的药物组合物的活性成分的实际水平以获得有效地实现期望的治疗反应而无对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多个药代动学因素，包括使用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、待使用的具体化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与使用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物或材料、等治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往医疗史等医学领域公知的因素。
本发明的组合物还可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，通过一个或多个施用途径来进行施用。在某些实施方案中，可配制本发明的Tn3支架以确保正确的体内分布。
使用支架的方法
本发明的Tn3支架具有体外和体内诊断及治疗效用。例如，可将此类分子给例如体外或离体培养的细胞或受试者的细胞例如，体内施用以治疗、预防或诊断多种障碍。
同样地，作为亚单元交联的结果，许多细胞表面受体激活或灭活。本发明的Tn3支架可用于通过交联细胞表面受体来刺激或抑制靶细胞的反应。在另一个实施方案中，本发明的支架可用于阻断多个细胞表面受体例如TRAIL R2与抗原的相互作用。在另一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于增强多个细胞表面受体与抗原的相互作用。在另一个实施方案中，可能使用包含共有对相同抗原的特异性或结合两个不同抗原的结合结构域的本发明的Tn3支架交联细胞表面受体的同二聚体或异二聚体。在另一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于将配体或配体类似物递送至特定的细胞表面受体。
本发明还提供了不容易用常规抗体实现的靶向表位的方法。例如，在一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于首先靶向邻近抗原并且当结合时，另一个结合结构域可衔接隐蔽抗原。
本发明还提供了使用本发明的Tn3支架将不同细胞类型相合的方法。在一个实施方案中，本发明的支架可利用一个结合结构域结合靶细胞并且通过另一个结合结构域招募另一个细胞。在另一个实施方案中，所述第一细胞可以是癌细胞并且所述第二细胞为免疫效应细胞例如NK细胞。在另一个实施方案中，本发明的Tn3支架可用于增强两种不同细胞，例如可能增强免疫反应的抗原递呈细胞和T细胞之间的相互作用。
本发明还提供了使用Tn3支架缓解、治疗或预防癌症或其症状的方法。在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明Tn3支架消耗抗TRAIL细胞群体的方法。在这方面，本发明的Tn3支架可用于治疗一些类型的抗治疗性癌症(therapy resistant cances)。
本发明还提供了使用Tn3支架消耗细胞群体的方法。在一个实施方案中，本发明的方法用于消耗下列细胞类型：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞和肿瘤细胞。本发明还提供了使用支架灭活、抑制或消耗细胞因子的方法。本发明还提供了使用Tn3支架蛋白作为诊断试剂的方法。在这方面，在一些实施方案中，本发明的Tn3支架对TRAIL R2受体的结合可诊断性用于检测表达TRAIL R2的细胞。在其它实施方案中，本发明的Tn3支架区分抗TRAIL但对TRAIL模拟物敏感的细胞群体与抗TRAIL并且也抗TRAIL模拟物的细胞群体的能力(参见例如，实施例19)可用于诊断目的。本发明的Tn3支架可用于其中需要同时高效地捕获不同抗原的试剂盒或试剂。还预期由细胞凋亡的异常引起的癌症也可利用本发明的方法和组合物来治疗。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于预防、管理、处理或缓解癌症的方法。TRAIL R2特异性多聚体Tn3支架可用于治疗癌症例如肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌和多发性骨髓瘤。利用TRAIL R2特异性多聚体Tn3进行的癌症的治疗还可包括另外的疗法，例如免疫疗法、生物疗法、化学疗法、放射疗法或小分子药物疗法。
治疗癌症的方法可包括给有此需要的受试者施用(与手术组合地、单独地或与标准或实验性化学疗法、激素疗法、生物疗法/免疫疗法和/或放射疗法的施用进一步组合地)一剂预防或治疗有效量的一种或多种本发明的Tn3支架。根据这些实施方案，可以将或可以不将用于预防、管理、治疗或缓解癌症、自身免疫、炎性或感染性疾病或其一种或多种症状的本发明的Tn3支架缀合或融合于部分(例如，治疗剂或药物)。
等同物
本领域技术人员可识别或能够仅使用常规实验确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物意欲包括在下列权利要求中。
本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请都是通过引用并入本说明书，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请特定且个别地通过引用并入本文。本申请要求保护2010年4月13日提交的美国临时专利申请No.:61/323,708的优先权的利益，将其整个内容通过引用并入本文。此外，为了所有目的，将2008年10月10日提交的并且公布为国际公布No.WO 2009/058379A2的PCT申请PCT/US2008/012398号通过引用整体并入本文。
表1.装配代表性的本发明的支架的分子组分的序列和SEQ ID
NO：
实施例
现参考下列实施例描述本发明。这些实施例仅为举例说明性的并且本发明决不应当解释为限定于这些实施例而应当解释为包括任何和所有作为本文中提供的教导的结果而变得显然的变型。
实施例1
各种多价Tn3形式的设计
已设计了Tn3支架的多价形式。多价形式包含一个或多个融合于它们自身、融合于可寡聚化的其它蛋白质基序或融合于它们自身以及可寡聚化的其它蛋白质基序的Tn3模块，所述多价形式示于图1中。在每一种情况下，所得的分子实体包含至少2个Tn3模块。将Tn3模块彼此连接或连接于其它蛋白质基序的多肽接头可以有结构的或非结构化的以及具有或不具有功能。提供了多价Tn3支架蛋白的3个示例性种类：(i)包含通过多肽接头彼此融合的Tn3模块的线性(L)多价蛋白质；(ii)包含一个或多个融合于抗体或抗体片段的轻链和重链的线性融合的Tn3模块的抗体样(Ig)多价蛋白质和(iii)包含一个或多个融合于抗体Fc区域的线性融合的Tn3模块的含Fc多价蛋白质(图1)。
实施例2
多价TRAIL R2-特异性的含Tn3蛋白的表达和纯化
制备了一系列具有对于人TRAIL R2的结合特异性的八价含Tn3-模块支架蛋白(也称为“Tn3蛋白”或“Tn3支架”)。从实施例1中描述的3个多价形式的每一个制备实例，并且所有此类蛋白质呈现2个或更多个TRAIL R2-结合Tn3模块A1(克隆1E11、G6或1C12)。对于几个TRAIL R2-特异性多价Tn3蛋白，还产生不结合TRAIL R2的相应的对照Tn3蛋白(克隆D1，对于抗体是特异性的Tn3结构域)，这些蛋白质的差异仅在于组分Tn3模块的序列和结合特异性。Tn3克隆D1为其中1E11克隆的BC、DE和FG环分别被具有相应于SEQ IDNO:99、38和107的序列的可选择的环替代的Tn3蛋白(参见表4)。表达的多价Tn3蛋白构建体的序列标识号示于表2中，并且所有可能的构建体示意性地示于表3和图2中。克隆的环序列提供于表4中。
表2.表达的含Tn3蛋白的名称、形式、效价和特异性
L=线性Tn3融合物，Fc=Fc-Tn3融合物，Ig=抗体样Tn3融合物
表3.Tn3支架构建体的图示
表4：这些研究中使用的Tn3克隆的环序列
包含具有序列CELAYGI(SEQ ID NO:131)的Cβ链的克隆，所有其它克隆包含具有序列CELTYGI(SEQ IDNO:45)的Cβ链
表达构建体的制备:使用的酶来自New England Biolabs(Ipswich,MA)，DNA纯化试剂盒来自Qiagen(Germantown,MD)，DNA引物来自IDT(Coralville,IA)。如下制备编码2个或更多个线性融合的Tn3模块的表达构建体。利用引物“Tn3gly4ser1模块正向”(SEQ IDNO:112)和“Tn3gly4ser2模块反向”(SEQ ID NO:113)(表5)通过PCR扩增编码TRAIL R2-特异性Tn3模块(例如，1E11，SEQ ID NO:134；G6，SEQ ID NO:138；等)的DNA。
在净化PCR产物后，将扩增的DNA分成两半，一半用BpmI降解，另一半用AcuI降解。使用PCR净化试剂盒纯化降解的样品，然后用T4DNA连接酶连接以产生编码两个Tn3模块的DNA产物(A2)。通过琼脂糖凝胶电泳纯化该材料，再次将其分成两份。利用NcoI和KpnI的降解，然后至NcoI/KpnI降解的pSec-oppA(L25M)中的连接(描述于WO 2009/058379A2，实施例18中)产生蛋白A2的细菌表达构建体。未降解的产物至pCR 2.1-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的连接提供了用于产生高级融合物的遗传材料。为了产生编码4个Tn3模块的DNA片段(A3)，利用引物“模块amp正向”(SEQ ID NO:114)和“模块amp反向”(SEQ ID NO:115)(表5)PCR扩增TOPO克隆的A2DNA，然后进行纯化，分成两份以利用AcuI或BpmI进行降解。用于制备A3表达构建体的方法的其余部分与用于制备A2构建体的方法相同，其中从A2构件块装配编码A3的DNA。再次地，装配的A3DNA至pCR 2.1-TOPO的同时克隆提供了用于产生高级融合物的遗传材料。
为了制备A4和A5细菌表达构建体，在A3表达构建体内的多-Tn3编码序列的3’末端上引入适体模块。为了达到这一点，首先用KpnI和EcoRI降解A3表达载体，然后用含有寡核苷酸“pSec中的插入物BamHI正向”(SEQ ID NO:116)和“pSec中的插入物BamHI反向”(SEQID NO:117)(表5)的双链体盒(duplex cassette)替代切离的片段。利用引物“模块插入BamHI正向”(SEQ ID NO:118)和“模拟amp反向”(SEQ ID NO:115)(表5)从相应的pCR2.1TOPO构建体PCR扩增A2和A3序列。利用BamHI/KpnI双降解扩增产物，随后将其克隆入类似降解的A3表达构建体。
如WO 2009/058379A2的实施例16中所述，通过293F细胞的瞬时转染表达蛋白质A6-A9。简而言之，通过从细菌表达构建体PCR扩增Tn3模块(或多个Tn3模块)，将所述模块克隆入用于表达Fc融合物或抗体蛋白质的编码Fc区域、κ轻链恒定区和/或CH1-铰链-CH2-CH3重链恒定区的房子载体(house vector)来产生表达载体。对于蛋白质A9，Tn3模块替代人IgG1重链和κ轻链的抗体可变区。添加相容性NheI和KasI位点以产生串联构件体的Fc融合物的引物示于表5中。
表5.用于多价Tn3蛋白的构建的引物序列
蛋白质的表达和纯化:将单价或线性Tn3蛋白于BL21(DE3)大肠杆菌(EMD/Novagen,Gibbstown,NJ)中表达，使用Ni NTA Superflow树脂(Qiagen)从培养基纯化His-标记的蛋白质。令人惊讶地，尽管分子量存在巨大差异，但所有这些构建体在大肠杆菌中以中等水平至高水平表达，并且高效地分泌至培养基中(表6和图3)。
为了表达Fc融合蛋白和抗体样蛋白(A6-A9)，用适当的表达构建体瞬时转染293F细胞。在第6天和第10天收获上清液，通过蛋白A亲和层析纯化蛋白质。
在NuPage Novex 4-12%bis tris凝胶上于不含还原剂的MES缓冲液中通过SDS-PAGE分析所有纯化的蛋白质，使用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen,Carlsbad,CA)显现蛋白质。还使用大小排阻层析分析纯化的蛋白质，并且必要时，在Superdex 7510/300GL或Superdex20010/300GL柱(GE Healthcare,Piscataway，NJ)上取出聚集的材料，达到低于10%的总蛋白质的终水平。如由制造商所指示的，使用具有Mustang E膜(PallCorporation,Port Washington,NY)的Acrodisc单元(Acrodisc unit)以从细菌表达的蛋白质制剂除去内毒素。
表6.纯化代表性多价Tn3蛋白形式后的产率
蛋白质(克隆) 产率(mg/L)
A1(1E11) 400
A2(1E11) 300
A3(1E11) 135
A4(1E11) 90
A5(1E11) 40
实施例3
TRAIL R2对单价和多价Tn3蛋白的结合亲和力
为了测量Tn3的效价对针对一系列TRAIL R2-特异性Tn3蛋白的结合亲和力的影响，进行竞争性ELISA实验。在4°C下，以抗体样形式用A9(1C12)(SEQ ID NO:154+SEQ IDNO:145)(TRAIL R2特异性支架)以2μg/ml(于PBS中)涂覆96孔NUNC MaxiSorp板(ThermoFisher,Rochester,NY)，过夜。用PBS 0.1%Tween 20+10mg/ml BSA封闭板。将A1(1E11单体)和线性形式A2(1E11二价)或A3(1E11四价)多聚体支架的稀释物与0.75nM生物素化的TRAILR2-Fc一起在涂覆的板上于室温下在PBS 0.1%Tween 20+1mg/ml BSA中温育2小时，然后洗涤。用链霉抗生物素蛋白HRP、TMB检测结合的生物素化的TRAIL R2Fc，然后用酸中和。在450nm读取吸光度。数据示于图4中。结合亲和力(IC50)示于表7中，并且计算为使生物素化的TRAILR2-Fc的最大结合减小50%所需的竞争性蛋白质的浓度。
A2和A3的IC50值为单体的至多1/30，处于该测定的检测限上(即，大致等于生物素化的TRAIL R2-Fc的浓度)。生物素化的TRAIL R2-Fc对固定的TRAIL R2-特异性Tn3的结合被TRAIL R2结合构建体替代。
相对于单体A1蛋白，二价或四价A2和A3蛋白以30-40倍的亲和力结合TRAIL R2-Fc，这是多价Tn3模块保持其结合活性和通过亲合力作用贡献更高亲和力的指征。鉴于A2和A3的IC50值大致等于用于测定的生物素化的TRAIL R2-Fc的浓度(0.75nM)，单价与二价或四价Tn3蛋白之间的亲和力的真实差异可能大于30-40倍。
表7.TRAIL R2-Fc对固定的TRAIL R2结合A9(1C12)Tn3蛋白的
结合的抑制的IC50值
克隆 效价 IC50(nM)
A1(1E11) 1 16
A2(1E11) 2 0.5
A3(1E11) 4 0.4
实施例4
用于细胞结合的确认的流式细胞术
使用流式细胞术来确认多价TRAIL R2-特异性Tn3蛋白对在H2122细胞的细胞表面上表达的内源TRAIL R2的结合的特异性。使用Accutase(Innovative Cell Technologies,San Diego,CA)从组织培养瓶分离贴壁H2122细胞(非小细胞肺癌腺癌细胞系)。用完全培养基(补充有10%PBS的RPMI 1640培养基)漂洗细胞，然后以2x106个细胞/mL将其重悬浮于PBS/2%FBS中。以40nM的浓度在PBS/2%FBS中制备Tn3蛋白A9(1E11)(SEQ ID NO:158+SEQ IDNO:159)(四价抗体样形式的多聚体支架)或形式匹配的对照Tn3蛋白B9(克隆D1)。
将细胞以75μl/孔涂覆在96孔U形底板上，以25μl/孔添加蛋白质样品(至10nM的终浓度)。将板在4°C下温育约1小时，随后用PBS/2%FBS洗涤3次。添加(100μl/孔)缀合有抗-人IgG Alexa Fluor488的第二抗体，将板在4℃下温育约30分钟，然后如上所述进行洗涤。将细胞重悬浮于100μl的PBS/2%FBS中，使用BD LSR II细胞计数器(BD Biosciences,SanJose,CA)进行流式细胞术分析。当与TRAIL R2特异性Tn3蛋白一起温育时荧光标记的H2122细胞相对于对照的偏移(增加)确认了TRAIL R2特异性Tn3蛋白能够结合细胞TRAIL R2(图5)。
实施例5
效价和形式对由TRAIL R2-特异性Tn3蛋白产生的H2122细胞
的凋亡的影响
可通过交联细胞表面TRAIL R2来诱导癌细胞系的凋亡细胞死亡。可在测量活细胞的数目的细胞测定中测定该作用。为此目的，将肺癌细胞系H2122细胞以10,000个细胞/孔的密度于75μl完全培养基(补充有10%FBS的RPMI 1640培养基)涂覆在96孔板中。在于37°C下温育过夜后，用25μl含有TRAIL R2-特异性(克隆1E11)或阴性对照(克隆D1)Tn3蛋白的系列稀释物的条件化培养基补充培养基。以一式二份孔进行所有处理。将商购可得的TRAIL配体(Chemicon/Millipore,Billerica,MA)用作TRAIL受体诱导的细胞死亡的阳性对照。72小时后，按照制造商的说明书使用来自Promega(Madison,WI)的CellTiter-Glo试剂盒以测定ATP水平，该ATP水平是培养的活细胞的数目的量度。在Envision板读出器(PerkinElmer,Waltham,MA)上测量测定荧光。通过将处理的细胞的荧光值除以未处理的活细胞的平均荧光来测定细胞活力的抑制率。产生抑制对化合物浓度的剂量反应曲线，将细胞杀伤效力(EC50)测定为抑制50%的细胞活力所需的蛋白质的浓度。
为了测试效价对多价TRAIL R2-特异性Tn3蛋白的促凋亡活性的影响，用单价Tn3蛋白A1(克隆1E11)和一系列线性融合的Tn3蛋白A2-A5(每一个克隆1E11)处理H2122细胞，所述Tn3蛋白包含2、4、6或8个Tn3模块。虽然单价和二价Tn3蛋白未显示或显示可忽略不计的杀伤活性，但包含4、6和8个Tn3模块的蛋白有力地抑制H2122细胞活力，效力作为效价的函数逐渐增加(图6A；表8)。蛋白A3(四价)具有对TRAIL、天然TRAIL R2配体具有相似的效力，然而蛋白A4(六价)和A5(八价)的效力比其高1-2log(10-100倍)。从该测定很清楚地看到对于给定的分子形式，细胞杀伤对于更高的效价提高达到其中测定不能再辨别的点。
表8.多价构建体对H2122的杀伤的EC50值
克隆 EC50(nM) 最大抑制%
A3(1E11) 0.013 91
A4(1E11) 0.0009 97
A5(1E11) 0.0006 97
人TRAIL 0.027 98
为了证明细胞活力的抑制率取决于TRAIL R2结合，在可溶性TRAIL R2-Fc蛋白存在的情况下将100pM蛋白A5(克隆G6)(即，167xEC50)与H2122细胞一起温育。可溶性TRAILR2-Fc对细胞杀伤的剂量依赖性抑制是细胞杀伤取决于蛋白A5对细胞表面TRAIL R2的结合的指征(表6B)。对于包含克隆1E11环的蛋白A5观察到相似的结果(数据未显示)。
除了结合模块的数目，多价Tn3蛋白的活性还可能受用于呈递单个结合单元的分子形式影响。为了测试分子形式对活性的影响，用不同的呈递相同数目的Tn3结合模块的TRAIL R2-特异性Tn3蛋白处理H2122细胞。在细胞活力测定中测试四价蛋白A3、A7和A9(每一个克隆来自1E11)诱导H2122细胞的杀伤的能力，同样地对一对八价Tn3蛋白A5和A8(每一个克隆来自1E11)进行所述测试。无活性的单价和二价蛋白质用作阴性对照，TRAIL用作阳性对照(图7；表9和表10)。在图7A，对于针对4的效价测试的3个构建体，很明显A3(线性形式)和A7(Fc-融合形式)在其细胞杀伤活性上相似并且在杀伤H2122细胞上比A9(抗体样融合形式)更有效力。这清楚地显示Tn3模块的空间定向可对生物活性具有相当大的影响，其中A3抑制H2122细胞活力的效力为A9蛋白的约150倍(表9)。表7B显示八价TRAIL R2-结合Tn3蛋白的两种形式A5(线性)和A8(Fc-融合)在抑制H2122细胞的活力上具有相似的功效。这些构建体的EC50数据示于表9中。微调亲和力、效价和空间定向的能力在精确地设计期望的治疗结果方面提供了极大的灵活性。
表9.四价的多价构建体对H2122的杀伤的EC50值
克隆 EC50(nM) 最大抑制%
A9(1E11) 1.98 80
A7(1E11) 0.02 88
A3(1E11) 0.013 91
人TRAIL 0.027 98
表10.八价的多价构建体对H2122的杀伤的EC50值
克隆 EC50(nM) 最大抑制%
A5(1E11) 0.0006 97
A8(1E11) 0.0002 98
人TRAIL 0.027 98
实施例6
细胞系Colo205和Jurkat的剂量依赖性细胞杀伤
为了证明多价TRAIL R2-特异性Tn3蛋白可杀伤除H2122外的癌细胞，还测试了其它表达TRAIL R2的细胞系。测试了结直肠腺癌细胞系Colo205(图8A)和Jurkat T细胞白血病细胞系(图8B)的被蛋白A3(四价，线性形式)(SEQ ID NO:143)和A5(八价，线性形式)(SEQIDNO:145)(每一个克隆G6)杀伤的能力。用A3、A5、阳性对照TRAIL或不结合TRAIL R2的阴性对照蛋白B5(SEQ ID NO:148)温育每一个细胞系，如对于H2122所描述的进行细胞活力测定。在这些细胞系的每一个系中，A5显示极强的对细胞活力的抑制。较低效价的A3蛋白也诱导细胞杀伤，虽然效力比A5低。因此，更高效价的构建体显示更高的活性。如所预期的，TRAIL也可抑制细胞活力，但不结合TRAIL R2的八价阴性对照蛋白B5不抑制细胞活力。
表11.线性串联构建体对Colo205的杀伤的EC50值
克隆 EC50(nM) 最大抑制%
A3(G6) 0.04 97
A5(G6) 0.0005 100
人TRAIL 0.08 100
表12.线性串联构建体对Jurkat细胞杀伤的EC50值
克隆 EC50(nM) 最大抑制%
A3(G6) 0.05 83
A5(G6) 0.0001 100
人TRAIL 0.009 99
利用如实施例5中的CellTiter-Glo测定分析细胞。
实施例7
小鼠CD40L-特异性二价串联支架的设计、表达和活性
通过融合一对相同的Tn3模块来制备二价鼠CD40L-特异性Tn3蛋白(表13)。M13为特异性结合鼠CD40L的Tn3蛋白。M13序列相应于Tn3的序列，其中用具有相应于SEQ ID NO:100、104和110序列的可选择的环分别替代BC、DE和FG环的序列(参见表4)。使用包含1个(构建体C1(M13))、3个(构建体C2(M13))，5个(构建体C3(M13))或7个(构建体C4(M13))拷贝的Gly4Ser(GS)单元的接头，从而导致接头长度为13至43个氨基酸(参见图9A和表3)。
表13.表达的含Tn3的蛋白质的名称、效价和特异性
名称(克隆) Tn3模块的数目 接头长度 特异性
M13(M13) 1 N/A 鼠CD40L
C1(M13) 2 13 鼠CD40L
C2(M13) 2 23 鼠CD40L
C3(M13) 2 33 鼠CD40L
C4(M13) 2 43 鼠CD40L
简而言之，如下产生表达构建体：利用对于Tn3基因上游的pSec载体是特异性的引物和引物“1-3GS接头反向”(SEQ ID NO:123)(关于使用的Tn3特异性引物的序列参见表14)，通过PCR扩增实施例1中描述的pSec-oppA(L25M)载体中克隆的鼠CD40L结合剂pSec-M13来产生片段A。通过分别用引物“1GS接头”(SEQ ID NO:121)或“3GS接头”(SEQ ID NO:122)与对于Tn3基因下游的pSec载体是特异性的引物通过PCR扩增相同模板来产生片段B1GS和B3GS。在凝胶纯化片段后，将片段A和B1GS或片段A和B3GS混合，利用两个pSec载体特异性引物在PCR反应中利用重叠PCR产生串联构建体。用NcoI和KpnI降解产物，将其克隆回实施例1中描述的pSec-oppA(L25M)载体，从而产生2个构建体：C1(M13)和C2(M13)。为了产生5和7个GS接头构建体，利用PstI和XmaI降解通过利用引物“GS L Amp正向”(SEQ ID NO:126)和“GS L Amp反向”(SEQ IDNO:127)分别PCR扩增寡核苷酸“5GS接头”(SEQ ID NO:124)和“7GS接头”(SEQ ID NO:125)产生的接头插入物，将其克隆入通过用PstI和XmaI切割pSecM13-1GS-M13产生的载体片段，从而产生构建体C3(M13)和C4(M13)。
表14.用于构建串联二价MuCD40L特异性构建体的引物序列
重组表达包含相同Tn3支架的单价和二价串联构建体，如实施例2中所述从大肠杆菌纯化所述构建体。图9B描述了在还原和非还原条件下纯化的蛋白质制品(proteinpreps)的SDS-PAGE分析。
为了测试二价串联M13-M13构建体的结合效率和将它们与单价M13支架相比较，测试鼠CD40L对固定在生物传感器芯片上的鼠CD40受体的竞争性抑制。
简而言之，以约3000个反应单元的密度将以与IgG1的Fc区域的嵌合融合蛋白形式存在的鼠CD40受体的片段固定在GLC芯片(Bio-Rad)上。对于竞争性结合测定，用固定浓度的含有0.1%(v/v)Tween-20和0.5mg/mL BSA的PBS中的大肠杆菌产生的重组鼠CD40L(0.5μg/ml)温育具有不同接头长度的单价M13或M13串联二价构建体的3倍系列稀释物。随后将这些样品以30μL/分钟的流速注射在GLC芯片上方，进行300秒，将结合的CD40L的水平在固定的时间点上记录在传感图中，将其与在任何竞争剂不存在的情况下的结合的蛋白质的相应水平相比较。在每一个结合测量后，通过注射10mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)将残留CD40L从芯片表面解吸。通过从芯片的位点间(interspot)扣除传感图来校正非特异性结合途径。使用GraphPad Prism计算相应于替代50%的鼠CD40L所需的Tn3构建体的浓度的IC50值。
如图9C中所示，M13单体的半最大抑制浓度(IC50)为71nM，然而二价串联构建体C1(M13)的IC50为29nM。对于含有更长接头(分别地构建体C2(M13)、C3(M13)和C4(M13))的二价构建体获得5或6nM的相似IC50值。由于测定中使用的CD40L的浓度的原因，这位于可在该测定中观察到的IC50的下限。二价构建体全都具有与单价构建体相比较更低的IC50值，这表示与单个M13Tn3模块相比较二价串联构建体的增强的结合活性。这些二价构建体的接头长度对测定效力显示一定的作用，最短的接头长度构建体具有中等效力，然而具有23或更多个氨基酸的接头的那些构建体在该测定中是相当的。
为了测试二价串联Tn3构建体在基于细胞的活性中的活性和将它们与单价M13支架相比较，测试B细胞上的鼠CD40L-诱导的CD86表达的抑制。作为对照，平行测试商购可得的抗-鼠CD40L特异性抗体(MR1)。
测定利用从健康志愿者的血液制备的PBMC。简而言之，将新抽取的血液收集在具有肝素的BDCPTTM细胞制备管中。离心后，收集包含PBMC的细胞层，用PBS洗涤2次，然后用RPMI 1640培养基洗涤1次。将细胞以5×106个细胞/ml的浓度重悬浮于完全RPMI1640培养基(补充有10%的热灭活胎牛血清，1%P/S)中。
洗涤表达鼠CD40L的Th2细胞系D10.G4.1，将其以1×106个细胞/ml的浓度重悬浮在完全RPMI 160培养基中。
将M13、M13-M13串联二价构建体C1-C4或MR1抗体(BioLegend Cat.No:106508)系列稀释(1:3)在完全RPMI 1640培养基中。将50μl的每一个稀释度的样品添加至96孔U形底组织培养板的孔中。随后每一个孔接收50μl D10.G4.1细胞(5x104)，混合后，将板在37℃下温育1小时。随后将100μl的重悬浮的PBMC(5x105个细胞)添加至每一个孔，在37℃下温育20-24小时。
收集PBMC，用FACS缓冲液(PBS pH 7.4,1%BSA,0.1%叠氮化钠)中的APC-抗-人CD86(BD bioscience,Cat#555660)和FITC-抗-人CD19(BD bioscience,Cat#555412)在4℃下于黑暗中将其温育30分钟。在于FACS缓冲液中洗涤2次后，随后利用FACS LSRII(BectonDickinson)分析样品。评估CD19门控的B细胞上表达的CD86。使用GraphPad Prism软件分析作为测试蛋白质的函数的CD86表达。
如图9D中显示的，二价M13-M13串联构建体全都以可与MR1抗体(100pM)的IC50相比较的100至200pM的IC50抑制CD86表达，效力比M13单价支架本身高约3log(约为1000倍)。与生物化学测定相反，在该基于细胞的测定中未观察到接头长度的作用，具有长度在13至43个氨基酸的范围内变化的接头的二价构建体全都显示相对于单价蛋白质的同等的增强效力的能力。
实施例8
双-特异性串联支架的表达
为了产生具有对于TRAIL R2和人CD40L(HuCD40L)的特异性的双特异性Tn3构建体，将2个Tn3模块(一个具有对于TRAIL R2(克隆1E11)的特异性并且一个具有对于人CD40L(克隆79)的特异性)融合在一起，用具有可变长度的接头分隔2个模块(表3和表15)。克隆79蛋白的序列(SEQ ID NO:184)相应于Tn3模块的序列，其中BC、DE和EF环已分别被相应于SEQID NO:101、105和111的可选择的环替代。除最初将携带Tn3变体A1和79的质粒用作PCR模板外，如实施例7中所述，产生包含具有1和3个Gly4Ser(GS)重复(分别地构建体C6和C8)的接头的串联双特异性支架的表达构建体。除使用“0GS接头反向”替代“1-3GS接头反向”用于C5外，以与C6和C8相似的方式使用表16中所列的另外的引物产生构建体C5(包含来源于连接人生腱蛋白C的第二与第三FnIII结构域的天然序列的短接头，其被认为是第3FnIII结构域的A β链的部分，虽然其不是支架结合所必需的)和构建体C7。
表15.表达的含Tn3的蛋白质的名称、效价和特异性
名称 Tn3模块的数目 接头长度 特异性
A1(1E11) 1 N/A TRAILR2
79(79) 1 N/A HuCD40L
C5(1E11&79) 2 8 TRAIL R2+HuCD40L
C6(1E11&79) 2 13 TRAIL R2+HuCD40L
C7(1E11&79) 2 18 TRAIL R2+HuCD40L
C8(1E11&79) 2 23 TRAIL R2+HuCD40L
表16.双特异性串联构建体的构健中使用的其它引物序列
如实施例2中所述，在大肠杆菌培养基中重组表达单价以及串联双特异性Tn3支架。使用SDS-PAGE分析可溶性构建体的表达水平。图10显示测试的构建体的可接受的表达水平。
实施例9
双特异性串联支架的特异性结合
为了测量双特异性Tn3构建体对CD40L和TRAIL R2的结合，使用捕获ELISA测定。简而言之，如下将8X His-标记的蛋白质构建体：A1、79、C5、C6、C7或C8(关于详细内容，参见表15)从大肠杆菌培养基捕获至抗-His抗体涂覆的孔上。用2μg/ml的Qiagen抗-His抗体涂覆96孔MaxiSorb板，过夜。用含有0.1%v/v Tween-20和4%w/v脱脂奶粉(PBST 4%牛奶)的PBS封闭涂覆的板，进行1.5小时。用PBST洗涤涂覆的板，添加包含可溶性的表达的蛋白质的稀释的细菌培养基(稀释30倍)，将板在室温下温育2小时。在用PBST洗涤后，用不同浓度的生物素化的TRAIL R2(图11A)或复合物(通过用生物素化的抗-His抗体(图11B)预温育大肠杆菌产生的His-标记的HuCD40L产生的)温育含有捕获的构建体的孔1.5小时。在用PBST洗涤后，使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(RPN1231V；GE Healthcare；1000x工作稀释度)检测结合的TRAIL R2或HuCD40L/抗-His抗体复合物，进行20分钟，随后用PBST洗涤，然后通过添加TMB底物(Pierce)进行比色检测。在450nm处读取吸光度。
双特异性串联TRAIL R2-HuCD40L-特异性支架对TRAIL R2的结合，和双特异性串联TRAIL R2-HuCD40L-特异性支架对HuCD40L的结合分别描述于图11A和图11B中。双特异性串联支架(命名为C5至C8，包含融合于HuCD40L特异性Tn3结合域的TRAIL R2特异性Tn3结构域)结合TRAIL R2和HuCD40L；然而，单体/单特异性Tn3构建体A1和79根据它们已知的特异性结合TRAIL R2或HuCD40L，但不同时结合两个靶。
使用AlphaScreenTM测定法测定串联TRAIL R2-HuCD40L-特异性构建体对TRAIL R2和HuCD40L的同时结合。将包含蛋白A1、79、C5、C6、C7和C8的大肠杆菌培养基的稀释物与PBS+0.01%Tween+0.1%BSA中的10nM TRAIL R2-Fc融合蛋白、50nM生物素化的HuCD40L(于大肠杆菌中产生的)、链霉抗生物素蛋白AlphaScreen供体珠粒(0.02mg/ml)和蛋白AAlphaScreen受体珠粒(0.02mg/ml)一起温育。将样品在黑暗处温育1小时，然后在PerkinElmer Envision读数器中进行读数。用680nm的激光激发供体珠粒群体，引起单态氧的释放。单态氧具有有限的寿命，从而允许其在落回低能级状态前通过扩散行进达到200nm。单态氧激发受体珠粒，从而引起520至620nm(通过Envision读数器测量的)之间的光发射。仅当供体和受体珠粒靠近时，才产生信号。因此，当通过同时与两个靶相互作用的分子将两种珠粒类型拉到一起时，观察到信号的增强。在对靶的结合不存在时，不应当检测到信号。
如图12中显示的，串联双特异性构建体同时结合TRAIL R2和HuCD40L，从而产生强AlphaScreen信号；然而，单价Tn3支架A1和79不产生信号，这表明它们不能通过同时结合两个靶将供体与受体珠粒拉近在一起。
实施例10
具有9个氨基酸长度的FG环的Tn3支架的增强的稳定性
为了测量FG环的长度对Tn3稳定性的影响，通过内在色氨酸荧光评估通过pH 7.0的盐酸胍(GuHCl)产生的HuCD40L-特异性Tn3支架的展开。此类Tn3单体支架包含9、10或11个氨基酸的FG环长度。在50mM磷酸钠pH 7.0中制备包含不同浓度的盐酸胍的0.05mg/mLTn3支架的样品。在Horiba Fluoromax-4荧光分光光度计上于280nm的激发波长处获得荧光发射光谱。对于每一种蛋白质，将360nm处的相对荧光发射强度作为GuHCl浓度的函数作图。每一种支架包含独特的BC、DE和FG环序列。超过50%的克隆A3(SEQ ID NO:185；注意，本实施例中的A3单体支架与表3中提供的命名为A3的构建体不同)、71(SEQ ID NO:186)、79(SEQID NO:184)、127(SEQ ID NO:187)、252(SEQ ID NO:188)和230(SEQ ID NO:189)在pH 7.0下在3.0M GuHCl中展开，所述GuHCl浓度为实现50%的亲代Tn3展开所需的GuHCl浓度(Cm)。克隆A3、79、127、252和230的Cm值分别为2.2M、2.7M、2.4M、2.7M、2.4M。这些克隆的FG环长度分别为11、11、11、10和11个氨基酸，然而亲代Tn3的FG环长度为10个氨基酸。令人惊讶地，克隆71(唯一的具有9个氨基酸的FG环长度的变体)显示4.2M的Cm，稳定性明显高于亲代Tn3支架或其它5个测试的变体。结果示于图13中。
为了确定Tn3克隆71的增强的稳定性是其序列所固有的还是缩短的FG环长度造成的，利用差示扫描量热法(DSC)分析该克隆和两个另外的具有9个氨基酸的FG环长度(但不同的BC、DE和FG环序列)的单体Tn3支架蛋白(A6(SEQ ID NO:190；注意，本实施例中的A6单体支架与表3中提供的命名为A6的构建体不同)和P1C01(SEQID NO:191))，并且将其与包含长度为10个氨基酸的FG环的亲代Tn3支架相比较。分析PBS pH 7.2中的1mg/mL的Tn3蛋白样品。在所有情况下，与具有10个残基的FG环的亲代(WT)Tn3相比较，具有9个残基FG环的克隆的热展开的中点更高。热展开是可逆的或部分可逆的(克隆A6)，如当冷却和重新加热相同样品时通过重合的热谱图(thermograms)证明的。如图14中显示的，亲代Tn3的熔化温度(Tm)为72.1℃，对于P1C01，Tm为75.2，对于A6，Tm为77.5℃，对于71，Tm为74.4℃。
这些发现通过在盐酸胍稳定性实验中测试相同的Tn3蛋白变体来确证。如上所述，通过内在色氨酸荧光来评估盐酸胍(GuHCl)在pH7.0下对亲代(WT)Tn3、P1C01、A6和71的展开。如图15中显示的，与图14中的DSC数据一致，与亲代(WT)Tn3支架相比较，Tn3克隆A6、71和P1C01全都在显著更高的GuHCl浓度上具有展开的中点，这表明具有长度为9个氨基酸的FG环(即比亲代Tn3支架中的短)的Tn3蛋白的稳定性得到增强。
实施例11
FG环长度的稳定性分析
如上所述，初步分析显示具有9个残基的FG环长度的Tn3分子明显比具有更长的FG环的分子稳定。在这些研究中，我们对一组随机Tn3进行稳定性分析以评估FG环长度对热稳定性的影响。
将Tn3文库亚克隆入pSEC表达载体。该文库编码具有不同序列以及变化但确定的长度的BC、DE和FG环的Tn3。作为这些研究的焦点的FG环可以为9、10或11个残基长。BC环可具有9、11或12个残基长。该文库中的DE环具有6个残基的固定长度。将亚克隆文库用于转化DH5α感受态细胞，从所述细胞纯化质粒，将其用于转化BL21(DE3)细胞。对BL21克隆进行测序以鉴定96个编码全长Tn3的克隆。使用标准Magic Media表达(接种后于37℃振荡24小时)以500μl的规模将最终的96个克隆生长在96深孔板上，在SDS-PAGE上进行分析。将29个具有中等至高表达水平的随机克隆按比扩大到50mL规模的表达，使用标准固定的金属亲和层析进行纯化。利用质谱法确认所有蛋白质的本体。
利用DSC分析随机克隆的稳定性。简而言之，在VP-CapillaryDSC(MicroCal)上进行测量。通过充分透析将蛋白质交换至PBS(pH7.2)中，将其调整至0.25-0.5mg/ml的浓度以用于DSC分析。以90℃/小时的扫描速度从20至95℃扫描样品，不重复扫描。结果示于表17中。
表17.具有FG9的Tn3对FG10/11的Tm值的比较
FG9 Tm(℃) FG10/11 Tm(℃)
A1 64.8 E12(FG10) 65.0
A3 71.8 F5(FG10) 60.0
B2 70.0 G1(FG11) 64.3
B4 69.4 G4(FG11) 67.6
C5 66.6 G8(FG11) 64.2
C7 66.0 H6(FG11) 70.3
C8 64.1 H7(FG11) 71.7
C11 59.5 H8(FG10) 61.9
D1 73.7 H9(FG10) 59.5
D8 72.1 H10(FG11) 67.6
D10 65.6 H11(FG11) 63.7
D11 65.6 H12(FG11) 65.6
D12 66.4
E1 75.0
E3 66.0
E9 75.3
E11 61.9
n=17 n=12
平均值 67.9 平均值 65.1
在本研究中，比较具有环长度FG9或FG10和11的Tn3的热稳定性。趋势显示具有长度为9的FG环的Tn3结构域比具有环长度FG10或11的所述结构域更耐热。作为对照，野生型Tn3结构域(具有10个残基的FG环)当与上述样品平行地运行时具有72℃的Tm。对于每一个环长度看到的Tm值的范围表明其它因素也在确定Tn3结构域的热稳定性中起作用。
实施例12
三特异性Tn3的产生和表征
在这些实验中，产生和表征对3种不同靶具有结合特异性的Tn3分子。分别将D1(对于抗体是特异性的Tn3结构域)连接于1E11(对于TRAIL受体2是特异性的Tn3结构域)和79(对于CD40L是特异性的Tn3结构域)(图16A)。将构建体在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中表达，使用标准方法(参见图16B)进行纯化。
为了确认三特异性构建体能够同时结合成对的所有3个靶，进行AlphaScreen和ELISA实验。对于AlphaScreen实验，将三特异性Tn3、3个总靶分子中的2个的亚组(一个被生物素化并且另一个包含抗体Fc部分)、蛋白A供体珠粒和链霉抗生物素蛋白受体珠粒组合在384孔白色Optiplate中，如上文中所描述的。只有当链霉抗生物素蛋白供体珠粒与蛋白A受体珠粒彼此十分靠近(彼此相距200nm)(在该测定中这可通过利用三特异性分子桥连来实现)时才可观察到AlphaScreen信号。如下利用AlphaScreen来确认D1-1E11-79同时结合huCD40L和TRAIL R2-Fc(图17A)，以及同时结合huCD40L和Synagis(图17B)的能力：在384孔白色Optiplate中，将下列组分：20mM纯化的D1-1E11-79、50mM生物素化的huCD40L、(0、1、2.5、5、10或42nM)TrailR2-Fc(图18A)或(0、1、2.5、5、10或42nM)Synagis(图18B)、各自5μl的AlphaScreen蛋白A受体珠粒和链霉抗生物素蛋白供体珠粒的1/50稀释物中组合在30μl的总体积中。在于黑暗中温育1小时后，在AlphaScreen模式中的Envision板读出器上读取板。
因为和TRAIL R2-Fc都包含Fc结构域，因此AlphaScreen测定不能用于证明此类分子对三特异性构建体的同时结合。代替该测定，进行ELISA实验。用TRAIL R2-Fc(100μl，1μg/ml)涂覆MaxiSorp板，用4%牛奶进行封闭，随后添加不同浓度的三特异性构建体。添加生物素化的Synagis(第二靶配体)，通过加入HRP-链霉抗生物素蛋白来进行检测(图18)。也显示D1-1E11-79能够同时结合TRAIL R2-Fc和如由图18中ELISA的结果所显示的。因此我们可得出该构建体可同时结合其的全部3对靶。
实施例13
lead分离
开发激动剂Tn3的第一步是分离Tn3单体，所述Tn3单体可结合TRAIL R2并且当连接入多价形式时可以以衔接细胞凋亡途径的方式结合两个或更多个TRAIL R2细胞外结构域。由于并非所有结合剂都可用作激动剂，因此我们决定首先分离一小组结合剂，随后在第二体外细胞杀伤测定中筛选激动(agonism)。我们首先淘选在重组TRAILR2-Fc上的BC、DE和FG环中具有变异的Tn3的大型噬菌体展示文库以分离初始小组的结合剂。选择作为该文库的基础的Tn3支架不是来自生腱蛋白C的天然第3FnIII结构域而是具有工程二硫键以增强稳定性的变型。构建包含BC、DE和FG环中的随机化的内部(inhouse)Tn3/基因3融合噬菌体展示文库。通过噬菌体ELISA发现多个结合剂，在所述噬菌体ELISA中，将TRAIL R2直接涂覆在板上，利用缀合有抗-M13-过氧化物酶的抗体(GE Healthcare Biosciences,Piscataway，NJ)检测到于PBS+0.1%Tween 20(PBST)1%牛奶中1:3稀释的噬菌体的结合。大部分结合剂在环之一中具有不期望的游离半胱氨酸并且不被选择用于进一步研究。将一个亚组的不存在未配对的半胱氨酸的克隆克隆入表达载体，从而产生Fc融合构建体或抗体样构建体(图1)，在肿瘤细胞系H2122中测试细胞杀伤(数据未显示)。虽然无论其融合的Tn3如何Fc融合形式都不能杀伤细胞，但抗体样形式不引发对超过一种结合剂的反应。
实施例14
亲和力成熟
克隆1C12(SEQ ID NO:132)(参见图19)在初始筛选测定中显示最佳的细胞杀伤，因此被选择用于进行亲和力成熟。通过使用Kunkel缕屡诱变或利用包含随机化的寡核苷酸的PCR饱和诱变环的部分，然后装配其，将其连接入噬菌体展示载体来进行亲和力成熟。第1轮和第3轮分别由BC和FG环的部分饱和诱变组成，第2轮单组合所有3个环的部分的饱和诱变，淘洗，基因改组，随后淘选改组的突变体以获得最高亲和力输出克隆。在通过直接从噬菌体PCR或通过使用Qiagen试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)制备单链RNA然后进行PCR来进行淘选后，回收亲和力成熟的克隆的库。用NcoI和KpnI(New England Biolabs,Ipswich,MA)降解PCR产物，然后将其克隆入我们的内部表达载体pSEC。将克隆在MagicMedia(Invitrogen,Carlsbad,CA)中表达，在凝脉上电泳以确认表达在克隆之间差异不大。通过竞争性ELISA鉴定改进的克隆，在所述竞争性ELISA中，用四价抗体样1C12(SEQ ID NO:154和155)涂覆盖板，使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(GE Healthcare Biosciences,Piscataway，NJ)测量在Tn3的稀释物存在于MagicMedia中的情况下0.75nM TRAIL R2生物素的结合的抑制。添加TMB(KPL,Gaithersburg,MD)，用酸中和。在450nm处读取吸光度。
在ProteOn XPR36蛋白质相互作用阵列系统(Bio-Rad,Hercules,CA)上，在25°C下利用GLC传感器芯片进行亲和力测量。将具有0.005%Tween 20的ProteOn磷酸缓冲盐溶液，pH 7.4(PBS/Tween)用作电泳缓冲液。将TRAIL R2固定在芯片上，以在36μM至700nM的范围内变化的起始浓度在PBS/Tween/0.5mg/ml BSA，pH 7.4中制备Tn3结合剂(1C12(SEQ IDNO:132)、1E11(SEQ ID NO:134)、G3(SEQ ID NO:133)、C4(SEQ ID NO:135)和G6(SEQ IDNO:138))的2倍12点系列稀释物。将每一个浓度的样品以30μl/分钟的流速注射入6个分析物通道，进行300秒。通过使用ProteOn软件中的平衡分析设置测定Kd。来自每一轮的最佳克隆的序列示于图19中。3轮亲和力成熟后亲和力的总增强几乎为为两个数量级，最佳克隆具有在40-50nM范围内的亲和力(表18)。
表18:如通过表面等离子体共振(SPR)测量的来自lead克隆1C12
的亲和力成熟的单体最佳克隆的平衡结合常数
轮 克隆 Kd(nM) 增强的倍数
lead分离 1C12 4130±281
亲和力成熟1 G3 422±45 10
亲和力成熟2 1E11 103±9 40
亲和力成熟3 C4 50±2 83
亲和力成熟3 G6 43±2 96
实施例15
Tn3亲和力对抗体样形式的效力的影响
为了评估单个TN3亚单位的亲和力对效力的影响，将表18中的所有克隆重新格式化成图1中描述的抗体样构建体。为了表达抗体样蛋白质，用适当的表达构建体瞬时转染293F细胞。在第6和第10天收获上清液，通过蛋白A亲和层析纯化蛋白质。在NuPage Novex4-12%bis tris凝胶上于不含还原剂的MES缓冲液中通过SDS-PAGE分析所有纯化的蛋白质，使用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen,Carlsbad,CA)显示所述蛋白质。
还使用大小排阻层析来分析纯化的蛋白质，必要时，在Superdex7510/300GL或Superdex 20010/300GL柱(GE Healthcare,Piscataway，NJ)上除去聚集的材料，达到低于10%的总蛋白质的终水平。如由制造商所指示的，使用具有Mustang E膜(PallCorporation,Port Washington,NY)的Acrodisc单元从细菌表达的蛋白质制剂除去内毒素。
随后使用CellTiter-Glo细胞活力测定测试H2122细胞对激动抗体样构建体的敏感性。在该测定中，发光与96孔板的给定的孔内的ATP水平成正比，所述ATP水平依次与具有代谢活性的活细胞的量成正比。对于H2122细胞系，将细胞以10,000个细胞/孔的密度于75μl的完全培养基(补充有10%FBS的RPMI 1640培养基)中涂覆在96孔板中。在于37°C下过夜培养后，用25μl含有TRAIL R2-特异性或阴性对照蛋白质的系列稀释物的额外培养基补充培养基。以一式二份孔进行所有处理。将商购可得的TRAIL配体(Chemicon/Millipore,Billerica,MA)用作TRAIL受体诱导的细胞死亡的正对照。
72小时后，按照制造商的说明书使用CellTiter-Glo试剂盒。在Envision板读取器(PerkinElmer,Waltham,MA)上测量测定荧光。通过将处理的细胞的荧光值除以未处理的活细胞的平均荧光来测定细胞活力的抑制率。
两个变量决定效力：构建体抑制细胞活力达50%时的浓度(EC50)和细胞活力的最大抑制。图20显示作为总的趋势，Tn3单体的更大亲和力导致更低的抗体样构建体EC50，因为G6具有比1E11低的EC50，并且1E11具有比1C12低的EC50。
实施例16
线性Tn3的药代动力学
为了测定作为每串联Tn3模块的数目的函数的线性Tn3串联的半衰期，将G6单体(SEQ ID NO:138)、G6串联4(SEQ ID NO:143)、G6串联6(SEQ ID NO:192)和G6串联8(SEQ IDNO:145)注射入小鼠，然后利用ELISA监测Tn3的血清浓度。施用途径为腹膜内(IP)注射。实验设计示于表19中。将小鼠在每一时间点上放血150μL。通过ELISA测定血清中的Tn3，在所述ELISA中，用在PBST 1%牛奶中稀释的血清温育内部产生的TRAIL R2涂覆的板。为了使信号在测定的动态范围内，进行初始ELISA以确定针对给定的时间点的正确稀释范围。利用PBST 1%牛奶中的兔子的多克隆抗-Tn3血清的1/1000稀释物(Covance,Princeton,NJ)，然后利用驴抗-兔HRP的-Tn3的PBST 1%牛奶中的1/1000稀释物(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)来检测结合的Tn3。对于每一个构建体，产生标准曲线。使用内部统计程序进行统计分析。
术语“最大血清浓度”(“Cmax”)是指在给患者施用测试材料后观察到的血浆中串联Tn3的最大浓度。
术语"Tmax"是指达到最大血浆浓度Cmax的时间。
术语“曲线下面积”(“AUC”)是在血浆对时间的串联Tn3的浓度的图表中的曲线下面积。AUC可以是在时间间隔过程中瞬时血浆浓度(Cp)的积分的量度并且具有质量*时间/体积的单位。然而，通常给予时间间隔0至无限的AUC。因此，如本文中所用"AUCinf"是指来自无限时期上的AUC。
术语“生物学半衰期”(“T1/2”)被定义为串联Tn3的血浆浓度达到其原始值的一半所需的时间。
术语“CLF”是指计算为剂量/AUCinf的表观总体内清除率。
Tn3生物学半衰期(T1/2)随着每线性分子串联Tn3的数目增加而增加。添加7个Tn3以从单体产生串联8使半衰期增加了几乎50%。效价的增加不影响Tmax。然而，效价从1至8的增加导致Cmax和AUCinf分别增加至约10倍和7倍。此外，当效价从1增加至8时，观察到清除率(CL/F)减少至约7。
表19：抗-TRAIL R2线性串联的药代动力学测定的实验设计。
表20：串联Tn3的药代动力学性质
实施例17
犬交叉反应性的工程化增强
为了在食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))进行临床前毒性测试，期望开发与食蟹猴TRAIL R2(犬TRAIL R2)交叉反应的抗-TRAILR2-Tn3。我们的初始亲和力成熟的lead克隆具有较弱的与犬TRAILR2的交叉反应，虽然与人TRAIL R2的同源性为88%。通过产生基于克隆F4(SEQ ID NO:137)的文库增强了交叉反应性，所述克隆为在由亲和力成熟产生的克隆间具有最佳犬交叉反应性的克隆。
通过饱和诱变产生两个文库：一个在单独的FGT环中具有多样性，一个在BC和FG环中具有多样性。还使用低错误率诱变PCR(low error rate mutagenic PCR)来使得可以在环外部产生可对增强的犬TRAIL R2结合有益的突变。对内部产生的犬TRAIL R2进行4轮噬菌体淘选，将输出物克隆入pSEC表达载体。为了在ELISA形式中筛选初始命中，将Tn3分泌入MagicMedia(Invitrogen,Carlsbad,CA)，使用抗-his标记抗体(R和D Systems,Minneapolis,MN)从上清液将其捕获。
利用抗-人-Fc-HRP检测溶液中人或犬TRAIL R2-Fc对捕获的Tn3的结合。选择具有对犬TRAIL R2-Fc的显著结合并且未表现出丧失对人TRAIL R2-Fc的结合的克隆以进行随后的筛选ELISA，在所述ELISA中，将人或犬TRAIL R2-Fc涂覆在板上，滴定Tn3上清液，随后用抗-his标记HRP进行检测。因为克隆间的表达水平的变化水平较低，还因为溶液中具有二价TRAILR2-Fc的亲合力不能掩盖Tn3亲和力的差异，因此该ELISA允许进行亲和力区分。已发现一个突变(处于DE环之前两个氨基酸的从D至G的突变)存在于所有工程犬交叉反应性克隆中(图22A)。将该D至G的突变工程引入原始F4以产生称为F4mod1(SEQ ID NO:193)的克隆，并且在不牺牲对人TRAILR2的结合的情况下对于犬的交叉反应性得到极大增强(图22B)。在该ELISA中，测量纯化的F4对0.75nM的人或犬TRAIL R2-Fc对F4mod1包被的板的结合的抑制。
期望犬交叉反应增强的克隆对犬TRAIL-R2-Fc的结合在其对人TRAIL R2-Fc的结合的10倍内。同样地，期望犬交叉反应增强的克隆对犬TRAIL-R2-Fc的结合在F4对人TRAILR2-Fc的结合的10倍内。F4mod1对犬TRAIL R2的结合的IC50与F4mod1对人TRAIL R2的结合的IC50相差小于3倍。此外，F4mod1对人TRAIL R2的结合的IC50为F4对人TRAIL R2的结合的IC50的6倍。因此，F4mod1满足期望的交叉反应性需要。
实施例18
增强的犬交叉反应性克隆的种系工程
对克隆F4mod1进一步改造以从种系消除非必需突变，以减少可能的免疫原性风险。产生一小组12个不同的修饰以确定是否存在给定的突变对与人和犬TRAIL R2的结合的影响。图23A显示终克隆F4mod12(SEQ ID NO:194)(其包含了不影响结合的所有测试的种系突变)与其它构建体即Tn3种系、原始F4亲代和克隆F4mod1(最初的工程化的具有增强的犬交叉反应性的克隆)的比较。
F4mod12的氨基酸序列始于天然Tn3序列SQ，终于L，具有从A至T的构架2突变的回复，并且具有从TA至NQ的DE环的最终两个氨基酸的回复。图23B显示F4、F4mod1和F4mod12在它们对人TRAIL R2的结合中全都在彼此的6倍之内。还显示F4mod1和F4mod12在它们对犬TRAIL R2的结合中在彼此的2倍之内。
将F4mod12重新格式化成串联6(SEQ ID NO:167)和串联8(SEQID NO:166)构建体，并且对其进行测试以确认相对于G6串联6(SEQID NO:144)和串联8(SEQ ID NO:145)效力没有损失。图23C和图23D显示在Colo205细胞系中与G6串联相比较，种系统工程化的具有增强的犬交叉反应性F4mod12串联的效力没有损失。
实施例19
G6串联8在抗TRAIL细胞系中的活性
多个细胞系抗由TRAIL产生的杀伤。因此，我们评估G6串联8构建体相对于TRAIL的增强的效力在TRAIL敏感性细胞系中是否可转化成G6串联8在TRAIL抗性细胞系中的效力。利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega,Madison,WI)测定几个癌细胞系的对Apo2L/TRAIL的敏感性。简而言之，将细胞涂覆在96孔板中，使其附着过夜，随后用不同浓度的重组人Apo2L/TRAIL和TRAIL模拟G6串联8在含有10%FBS的培养基中进行处理。在48-72小时的时期后，按照制造商的方案测定细胞活力。图24显示对于抗TRAIL细胞系HT29，G6串联8显示强力细胞杀伤活性，然而TRAIL没有。表21显示G6串联8在许多但非所有测试的抗TRAIL细胞系中具有细胞杀伤活性。增强的效力可归因于相对于TRAIL的串联的更高效价，虽然结合模块的空间定向也可能具有作用。
表21：G6串联8和TRAIL在抗TRAIL细胞系中的活性
实施例20
TRAIL R2结合单体的免疫原性研究
免疫原性是任何治疗性蛋白质的潜在问题，即使其为人来源的。免疫原性反应可通过可导致炎症的中和抗体限制功效。免疫反应发生中的最重要因素之一是可刺激CD4+T细胞增殖的表位的存在。在EpiScreen测试(Antitope,Cambridge,UK)中，用测试蛋白质温育已消耗了外周血单核细胞(PBMC)的CD8+T细胞，然后监测CD4+T细胞增殖和IL-2分泌(参见，Baker&Jones,Curr.Opin.DrgDiscovery Dev.10:219-227,2007；Jaber&Baker,J.Pharma.Biomed.Anal.43:1256-1261,2007；Jones等人，J.Thrombosis andHaemostasis3:991-1000,2005；Jones等人，J.Interferon Cytokine Res.24:560-72,2004)。从代表在世界人口中表达的HLA-DR同种异型的供体库分离PBMC。
表达图25中显示的Tn3单体(具有GGGGHHHHHHHH接头-His标记物)，纯化，然后通过SEC确认其为单体，将其过滤以除去内毒性，如上文中所描述的。所有测试的非-野生型都来自增强犬交叉反应性的工程轮(图22A)。然而，这些克隆具有至种系的突变，已显示所述突变在F4mod1背景中不影响结合。在ELISA中测试这些克隆以确认种系化突变不影响结合。在T细胞增殖测定和IL-2分泌测定中，大于2的刺激指数(SI)先前已被确定为对于给定的供体的阳性反应。阳性反应群体的平均SI或SI的平均值表示反应的强度。两个测定都包括了已知诱导强反应的对照蛋白质钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
表22显示所有测试蛋白质的平均SI，其显著低于KLH的平均SI，并且不比为2的阳性平均SI的截断值高多少。此外，对测试蛋白质的反应的频率也极低(除了具有超过90%的反应的对照外，对于所有测试的蛋白质为10%或更低)。由Antitope进行的先前研究已显示低于10%的EpiScreen反应表示低临床免疫原性风险。因此，我们观察到的所有测试的Tn3具有10%或更低的反应频率表示临床免疫原性的低风险。
表22：Antitope EpiScreen免疫原性测定的结合。将测试的Tn3
分为1(最大免疫原性)至4(最低免疫原性)组。
实施例21
未纯化的和纯化的G6串联8Tn3的聚集状态
在本领域已知包含多个半胱氨酸的蛋白质，例如由包含内部二硫键的串联重复组成的蛋白质通常未显示正确的二硫键配对。二硫键的无规性可减少或消除至培养基中的表达。如果蛋白质不表达进入培养基，其可能为具有分子间以及错配的分子内二硫键对的不正确折叠的蛋白质，从而导致聚集。我们的SEC数据显示细胞表达培养基中的大部分串联蛋白质处于单体正确折叠的状态。在Ni-NTA纯化Hi-标记的G6串联8蛋白后，大约15%的蛋白质聚集。通过用2mM DTT还原，观察到的聚集减少至4%(图26A)，这表明大部分聚集是二硫键介导的。如上所述，通过SEC纯化除去大部分聚集(图26B)。
实施例22
TRAIL模拟物G6TN6和G6TN8在Colo205结直肠癌异种移植
物模型中的肿瘤生长抑制的测定
在Colo205(人结直肠癌异种移植物模型)中评估TRAIL Tn3模拟物G6串联6(G6TN6)(SEQ ID NO:144)和G6串联8(G6TN8)(SEQ ID NO:145)的抗肿瘤活性。将Colo205细胞以半贴壁单层(semiadhesive monolayer)培养物形式于37℃、5%CO2下维持在含有10%胎牛血清(FB S)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中。将通过胰蛋白酶消化收获的细胞在Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中重悬浮至3×107个细胞/mL的终浓度。在右肋中对各无胸腺雌性裸小鼠皮下(SC)注射3×106个Colo205细胞。当肿瘤达到约177mm3的平均尺寸时开始研究。研究设计概述于表23中。用20mM Tris-HCl 300mM精氨酸-HCl pH 7从原液稀释TRAIL，将其以表23中指定的剂量进行静脉内(IV)施用，每天根据体重(10mL/kg)施用总共5个剂量。G6串联6(G6TN6)和G6串联8(G6TN8)各自用PBS从原液进行稀释，将其以表23中指定的剂量进行静脉内(IV)施用，每天根据体重(10mL/kg)施用总共5个剂量。记录肿瘤体积和体重测量。使用电子测径器进行肿瘤测量，使用公式肿瘤体积=[长度(mm)×宽度(mm)2]/2计算肿瘤体积(mm3)。肿瘤生长抑制率(TGI)计算为TGI%=(1-T/C)×100，其中T=在最后一个剂量后来自处理组的终肿瘤体积，C=最后一个剂量后来自对照组的终肿瘤体积。
在给药期(DP)中(图27)，3mg/kg和30mg/kg的G6TN6分别导致92%(p<0.0001)和93%(p<0.0001)的显著TGI(表24)。类似地，在对终浓度进行等摩尔的调整后，2.25mg/kg和25.5mg/kg的G6TN8分别导致93%(p<0.0001)和94%(p<0.0001)的显著TGI(表24)。30mg/kg的TRAIL导致60%的TGI，(表24)。
至再生长期(RP)的第34天(图27),虽然3mg/kg G6TN6未导致任何CR(CR；组中在两次连续测量中未检测到可触摸的肿瘤的小鼠的百分比)，但2.25mg/kg G6TN8导致90%CR。在30mg/kg G6TN6的更高剂量上，获得50%CR。在另一方面，25.5mg/kg G6TN8导致100%CR(表25)。来自两个剂量的结果显示G6TN8导致与G6TN6相比较更大的功效。然而，G6TN6和G6TN8在某些剂量上显示功效。更重要地，两种构建体都显著胜过不导致任何PR或CR的TRAIL。
如图28中所示，在研究的给药和再生期中在所有剂量上对于G6TN6和G6TN8都未观察到体重减轻。
表23.关于Trail和TRAIL模拟物(G6TN6和G6TN8)在Colo205
肿瘤异种移植物模型中的研究设计
表24.在研究的给药期中TRAIL和TRAIL模拟物(G6TN6和G6TN8)对TGI的影响
处理组 TGI% P值(与未处理的对照比较)
TRAIL 30mg/kg 60 P<0.001
G6TN630mg/kg 93 P<0.0001
G6TN63mg/kg 92 P<0.0001
G6TN825.5mg/kg 94 P<0.0001
G6TN82.25mg/kg 93 P<0.0001
表25.直至研究的第34天在再生长期过程中TRAIL和TRAIL
模拟物(G6TN6和G6TN8)对TGI的影响
治疗组 PRa(%) CRb(%)
Trail - -
G6TN630mg/kg 50 50
G6TN63mg/kg 100 -
G6TN825.5mg/kg - 100
G6TN82.25mg/kg 10 90
a部分消退的百分比(PR；组中在两次连续测量中肿瘤体积小于分期时的体积的50%的小鼠的百分比)
b完全消退的百分比(CR；组中在两次连续测量中未检测到可触摸的肿瘤的小鼠的百分比)
上文中显示的实施例举例说明了本发明的各个方面和本发明的方法的实施。这些实施例无意提供本发明的许多不同实施方案的穷尽描述。因此，虽然为了理解清楚上述发明已通过举例说明和实施例对本发明进行了稍许详细的描述，但本领域技术人员可容易地认识到，可在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行许多改变和变动。
本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请通过引用并入本文，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请明确且个别地通过引用并入本文。
上述实施例举例说明了本发明的不同方面和本发明的方法的实施。实施例无意提供本发明的许多不同实施方案的穷尽描述。因此，虽然为了理解清楚上述发明已通过举例说明和实施例对上述发明进行了稍许详细的描述，但本领域技术人员可容易地认识到，可在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行许多改变和变动。
本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请通过引用并入本文，其引用程度就如同将每一个别公开案、专利或专利申请明确且个别地通过引用并入本文。

Claims (37)

1.一种包含以线性串联形式连接的六个TRAIL R2特异性Tn3单体支架的TRAIL R2-特异性重组多聚体支架，其中
(a)每一个Tn3单体支架包含命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，连接命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的6个环区域，其中：
(i)AB环是SEQ ID：35的序列，BC环是SEQ ID NO：97序列，CD环是SEQ ID NO：37的序列，DE环是SEQ ID NO：179的序列，EF环是SEQ ID NO：39的序列，FG环是SEQ ID NO：170的序列，
(ii)AB环是SEQ ID：35的序列，BC环是SEQ ID NO：97序列，CD环是SEQ ID NO：37的序列，DE环是SEQ ID NO：102的序列，EF环是SEQ ID NO：39的序列，FG环是SEQ ID NO：106的序列，
(iii)AB环是SEQ ID：35的序列，BC环是SEQ ID NO：97序列，CD环是SEQ ID NO：37的序列，DE环是SEQ ID NO：102的序列，EF环是SEQ ID NO：39的序列，FG环是SEQ ID NO：108的序列，或
(iv)AB环是SEQ ID：35的序列，BC环是SEQ ID NO：97序列，CD环是SEQ ID NO：37的序列，DE环是SEQ ID NO：102的序列，EF环是SEQ ID NO：39的序列，FG环是SEQ ID NO：170的序列，且β链A、B、C、D、E、F和G的序列分别为IEV、ALITW、CELAYGI、TTIDL、YSI、YEVSLIC和KETFTT；
(b)所述Tn3单体支架以线性串联形式连接；
(c)所述重组多聚体支架特异性结合TRAIL R2；且
(d)所述Tn3单体支架具有至少一个二硫键来连接所述7个β链其中两个。
2.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架包含7或8个TRAIL R2特异性Tn3单体支架。
3.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架直接连接而无间插在所述Tn3单体支架之间的接头。
4.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架通过接头连接。
5.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中所述接头包括肽接头。
6.根据权利要求5所述的多聚体支架，其中所述肽接头为柔性肽接头。
7.根据权利要求5所述的多聚体支架，其中所述肽接头包含(GxS)y序列，其中x和y为整数，其中x＝1、2、3或4，并且其中y＝1、2、3、4、5、6或7。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中，所述多聚体支架对于TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架对于TRAIL R2的结合相比较得到了增强。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架对于TRAIL R2的结合与TRAIL R2特异性Tn3单体支架对于TRAIL R2的结合相比较增强了对所述靶的作用。
10.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对TRAIL R2的结合相对于TRAIL R2特异性Tn3单体支架对于TRAIL R2的结合的增强为结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。
11.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对于TRAIL R2的结合亲和力和蛋白质稳定性与TRAIL R2特异性Tn3单体支架对于TRAIL R2的结合亲和力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。
12.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对于TRAIL R2的结合亲合力和蛋白质稳定性与TRAIL R2特异性Tn3单体支架对于TRAIL R2的结合亲合力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中将Tn3单体支架的至少一个缀合于PEG。
14.根据权利要求13所述的多聚体支架，其中将所述PEG在N端或C端缀合于所述支架。
15.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中超过两个所述Tn3单体支架通过接头连接，并且其中至少1个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述TRAIL R2为人TRAIL R2。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架结合TRAIL R2并且：
(a)激活所述TRAIL R2受体，
(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，
(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，
(d)诱导细胞凋亡，
(e)降低或抑制细胞活力，或
(f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架是相同的。
19.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架是不同的。
20.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架为TRAIL R2激动剂。
21.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的相同表位。
22.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架结合TRAIL R2上的不同表位。
23.根据权利要求22所述的多聚体支架，其中所述不同TRAILR2表位为非重叠表位。
24.根据权利要求22所述的多聚体支架，其中所述不同TRAILR2表位为重叠表位。
25.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述支架以1μM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
26.根据权利要求25所述的多聚体支架，其中所述支架以500nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
27.根据权利要求25所述的多聚体支架，其中所述支架以100nM或更小的亲和力(Kd)结合TRAIL R2受体。
28.一种编码根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架的分离的核酸分子。
29.一种包含根据权利要求28所述的核酸的表达载体。
30.一种包含根据权利要求29所述的载体的宿主细胞。
31.一种产生重组多聚体支架的方法，包括在其中由所述核酸分子编码的多聚体支架被表达的条件下培养根据权利要求30所述的宿主细胞。
32.一种组合物，其在药学上可接受的赋形剂中包含根据权利要求1-27中任一项所述的重组多聚体支架。
33.权利要求32所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗、缓解或管理有此需要的患者的癌症。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述癌症是结直肠癌。
35.权利要求32所述的组合物在制备医药产品中的用途，所述产品用于对患者的疾病进行诊断或成像。
36.一种诱导表达TRAIL R2的细胞的细胞凋亡的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1-27中任一项所述的重组多聚体支架接触。
37.一种改变表达TRAIL R2的细胞的活性的方法，包括将所述细胞与根据权利要求1-27中任一项所述的TRAIL R2特异性多聚体支架接触，其中所述多聚体支架结合TRAIL R2并且：
(a)激活所述TRAIL R2受体，
(b)模拟TRAIL对TRAIL R2受体的结合，
(c)促进TRAIL R2受体二聚化或寡聚化，
(d)诱导细胞凋亡，
(e)降低或抑制细胞活力，或
(f)活性(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的组合。
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