KR20180100302A - 인테그린 결합 펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인테그린 결합 펩티드, 상기 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 치료제, 진단제, 조영제와 표적제로서 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

인테그린 결합 펩티드 및 그의 용도
본 발명은 생화학과 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 인테그린 결합 펩티드 분야 및 섬유증, 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 관한 것이다.
인테그린은 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 매개하는 일군의 당단백질 막관통 수용체이다. 인테그린은 2개의 서로 다른 사슬인 알파 및 베타 소단위체(subunit)를 가진 이종 이량체이다. 포유류에서는 18개의 α 소단위체와 8개의 β 소단위체가 기술되었다.
ITGA11은 인테그린 알파11(α11)로 1166개의 아미노산 길이(145 kDa)의 막-결합 수용체이다. ITGA11 수용체는 7개의 FG-GAP 반복체, 23개 아미노산의 막관통 영역과 24개 아미노산의 세포질 꼬리를 가진 커다란 세포외 도메인을 함유하고 있다. 세포질 꼬리는 다른 알파 사슬에 비해 매우 보존적이다. α11 수용체는 공수용체인 인테그린 베타 1(β1)과 관련이 있고 상기 이량체 수용체 α11β1은 I형 콜라겐에 결합되어 있다. 인테그린 β1은 다수의 인테그린 α 수용체와 협력하고(co-partner) 다수의 조직에 의해 발현된다. 그러나 ITGA11의 발현은 고도로 구조화된 간질 콜라겐 망상구조의 영역에서 간엽 비근육 세포에 한정되어 있는 것으로 밝혀졌다(Tiger CF, et al., Dev Biol 2001, 237(1): 116-129).
ITGA11은 간엽 비근육 세포에서 세포 부착, 이동과 콜라겐 재구성에 관여한다. 비근육 간엽 세포는 주로 간 섬유증, 신장 섬유증, 심장 섬유증, 죽상 동맥경화증 등과 같은 섬유성 질환에서 발견되는 근섬유 아세포를 포함하고 있다. 또한 비악성 종양 성분인 종양 간질은 크게 소위 암 관련 섬유아세포(CAF)라고 하는 근섬유 아세포로 구성되어 있다. CAF는 간질의 친종양 형성 작용(pro-tumorigenic action)을 담당하는 종양 간질에서 가장 중요한 세포 유형이다. 폐암(소세포 폐암과 비소세포 폐암)에서 ITGA11의 발현은 CAF에서 상향 조절되는 것으로 나타났다(Zhu CQ, et al., PNAS 2007, 104(28): 11754-11759, Navab R, et. PNAS 2011, 108(17): 7160-7165). ITGA11이 다른 유형의 암에 관여할 가능성은 있지만 아직 조사되지는 않았다. 또한 당뇨병성 심근병증과 신장 섬유증에 존재하는 근섬유 아세포에서는 ITGA11의 발현 수준이 높은 것으로 밝혀졌다(Talior-Volodarsky I, et al. Cardiovasc Res 2012, 96(2): 265-275, Svendsen OS et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009, 29(11): 1864-1870). 특발성 폐질환, 간 섬유증과 피부 섬유증과 같은 다른 섬유성 질환에서는 ITGA11의 발현 수준이 높을 것으로 예상된다.
인테그린 α5β1은 소단위체 ITGA5(인테그린 α5)와 인테그린 β1로 구성되어 있다. 여러 인테그린이 피브로넥틴에 결합하지만 α5β1은 상호작용을 위해 피브로넥틴의 9번째와 10번째 II형 반복체(FNIII-9와 FNIII-10) 모두를 필요로 하므로 피브로넥틴에 대한 선택성이 있다. α5β1 인테그린은 혈관계와 결합조직에서 주로 발현한다. 종양 혈관에서 발현이 크게 증대되지만 결장암, 유방암, 난소암, 폐암과 뇌종양을 포함한 다수 암 유형의 종양세포 자체에서도 크게 증대된다. 또한 섬유아세포, 조혈세포, 면역세포, 평활근세포와 상피세포를 포함한 다수의 세포 유형에서 다양한 정도로 발현된다. α5β1 인테그린의 높은 발현은 폐 섬유증과 같은 섬유성 조직에서도 관찰되었다.
조직에서 정상 섬유아세포는 불과 4-5%의 낮은 밀도(population)로 존재한다. 그러나 이들은 섬유증 동안에 증식하여 장기 질량의 80-90%까지 차지할 수 있다. 섬유성 조직의 근섬유 아세포는 조직을 손상시키고 비기능적으로 만드는 다량의 세포외 기질 단백질을 생성한다. 이들 과정은 근섬유 아세포를 저해시켜 저지할 수 있다. 암에서 종양 간질은 주로 간질 근섬유 아세포(또는 CAF)로 이루어져 있으며 유방암과 췌장암과 같은 몇몇 유형의 암에서는 세포외 기질이 종양의 80%까지 차지할 수 있다. CAF는 종양의 성장과 전이를 촉진하지만 또한 화학치료에 대한 암세포 내성을 제공한다. 따라서 CAF의 활성 저해는 이들의 친종양 활성을 차단하는 매우 흥미있는 방안일 수 있다. 또한 CAF는 안정적이고 크게 발현된 표적으로 영상 기법을 이용하여 이들을 검출하면 암에 대한 새로운 진단 시스템으로 이어질 수 있다. 따라서 근섬유 아세포 또는 CAF에 조영제 또는 치료제를 특이적으로 전달하는 것은 암과 섬유성 질환에 대한 신규 진단 및 치료 시스템을 개발하는데 매우 흥미로운 방안일 수 있다.
본 발명의 목적은 인테그린 결합 펩티드, 특히 ITGA5, ITGA11, α5β1 인테그린과 α11β1에 결합하는 펩티드를 제공하는 것이다. 이러한 펩티드는 예를 들면 종양과 섬유성 질환의 진단과 치료, 영상 유도 수술, 영상 유도 약물 전달, 조영제 또는 치료제의 표적 지향 전달과 같은 광범위한 용도를 가질 수 있다.
따라서 본 발명은 5 내지 25개의 아미노산을 갖고
- 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는
- 적어도 상기 서열의 7-9번 위치의 아미노산을 포함하는 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
- 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 5-12개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 가진 상기 서열의 변이체를 포함하거나, 또는
- 아미노산 서열 SFATWTPNFERN 또는 상기 서열의 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 아미노산 치환체를 가진 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 11(ITGA11) 결합 펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 6 내지 25개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN을 포함하거나
- 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 포함하는 6-16개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
- 상기 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 6-16개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미소산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 가진 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 5(ITGA5) 결합 펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 2개의 펩티드를 포함하는 다량체 펩티드, 바람직하게는 본 발명에 따른 2개의 펩티드를 포함하는 이량체 펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 바람직한 화합물은 바람직하게는 표지, 링커, N- 또는 C-말단 변형 또는 내부 변형과 같은 적어도 하나의 추가 부분을 포함한다. 상기 화합물은 바람직하게는 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 나노복합체, 폴리플렉스, 탄소나노튜브, 양자점, 마이크로캡슐, 리포솜, 미소구체, 하이드로겔, 폴리머, 마이셀, 덴드리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 항체 단편, 시클로덱스트린과 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 담체에 결합 또는 봉입된 상기 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드, 다량체 펩티드, 화합물 또는 핵산 분자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 치료제, 예방제 또는 진단제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 다량체 펩티드 또는 핵산 분자를 제공한다. 상기 작용제는 바람직하게는 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 조영제 또는 표적제로서 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 펩티드의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 인테그린 알파 5(ITGA5) 또는 인테그린 알파 11(ITGA11)을 발현하는, 바람직하게는 α5β1 또는 α11β1 인테그린을 발현하는 조직을 본 발명에 따른 펩티드 또는 다량체 펩티드와 접촉시켜 상기 조직을 영상화하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에 본 발명에 따른 펩티드, 다량체 펩티드, 핵산 분자 또는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 제조하기 위한 방법으로서:
- 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하고;
- 상기 핵산 분자로 숙주 세포를 형질 전환시키고;
- 상기 펩티드의 발현이 가능한 조건에서 상기 숙주 세포를 배양하고;
- 상기 세포로부터 상기 펩티드를 수확하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 ITGA11이 간 섬유증, 간경변 및 췌장암에서 발현되고 성상 세포에서 ITGA11 발현이 TGAβ1에 의한 활성화 후 증가하고 CCl-4 유도 간 섬유증에서 증가한다는 것을 발견하였다. 또한 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 SFATWTPNFERN을 가진 펩티드와 이의 변이체가 ITGA11에 높은 친화도로 결합한다는 것을 발견하였다. 또한 상기 서열의 적어도 5개의 연속해 있는 아미노산을 가진 펩티드 SGLTEWLRWFNS의 더 짧은 변이체가 결합능을 유지하거나 더 나아가 증가된 결합능을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 이러한 ATGA11 결합 펩티드는 인테그린의 α 소단위체(α11)에 결합하지만 다수의 인테그린에 존재하는 β1에는 결합하지 않는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 ATGA11 결합 펩티드는 α11β1 인테그린에 대한 특이성이 높다. ITGA11은 종양과 섬유성 질환에서 근섬유 아세포에 의해 크게 발현되기 때문에 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드를 사용한 ITGA11 표적화는 종양세포와 섬유성 조직세포를 표적화하는 최적의 방법이다.
본 발명의 ITGA11 결합 펩티드는 또한 항섬유화 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 펩티드 AXI-1(SGLTEWLRWFNS)은 TGFβ로 활성화한 후 콜라겐 발현 감소로 나타난 바와 같이 LX2 세포의 활성화를 저해하는 것으로 밝혀졌다(도 8A). 또한 상기 펩티드는 근섬유 아세포의 표지자인 ITGA5와 ITGA11의 유전자 발현 감소 및 간에서 콜라겐-I과 III의 단백질 발현 감소에 의해 CCl4-유도 간 섬유증 모델에서 입증된 바와 같이 섬유 발생을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 8B).
따라서 제1 측면에 있어서 본 발명은 5 내지 25개의 아미노산을 가지며 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는
- 적어도 상기 서열의 7-9번 위치의 아미노산을 포함하는 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
- 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 5-12개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 가진 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 11(ITGA11) 결합 펩티드를 제공한다.
상기 펩티드는 바람직하게는 서열 MSLRWFNSGSVRPATTILFP로 이루어져 있지 않다.
서열 SGLTEWLRWFNS의 변이체는 상기 서열의 5-12개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 바람직하게 상기 변이체는 상기 서열의 6-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 7-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 8-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 9-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 10, 11 또는 12개의 연속해 있는 아미노산과 같이 상기 서열의 10-12개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 특히 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 서열 SGLTEWLRWFNS의 7-12, 8-12, 9-12, 10-12, 11-12 또는 12개의 연속해 있는 아미노산과 같이 5-12개, 바람직하게는 6-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어져 있다.
서열 SGLTEWLRWFNS의 변이체는 적어도 상기 서열의 7-9번 위치에 있는 아미노산을 더 포함한다. 이에 따라 상기 변이체는 적어도 경우에 따라 본 명세서에 정의되어 있는 1 내지 3개의 치환체, 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 1 또는 2개의 아미노산 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 하나의 아미노산 치환체를 가진 아미노산 서열 LRW를 포함한다. 바람직하게 상기 변이체는 적어도 상기 서열의 6-9번 위치에 있는 아미노산을 포함하는바, 즉 상기 변이체는 경우에 따라 본 명세서에 정의되어 있는 1 내지 3개의 치환체, 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 1 또는 2개의 아미노산 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 하나의 아미노산 치환체를 가진 아미노산 서열 WLRW를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 변이체는 적어도 서열 WLRW를 포함한다.
서열 SGLTEWLRWFNS의 변이체는 상기 5 내지 12개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 더 갖는다. 상기 3개 이하의 치환체는 서열 SGLTEWLRWFNS의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된다. 바람직하게 본 명세서에 정의되어 있는 서열 SGLTEWLRWFNS의 변이체는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 1 또는 2개를 갖고, 보다 바람직하게는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖는다. 또한 바람직하게 본 발명에 따른 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체의 아미노산의 최대 25%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체의 아미노산의 최대 20%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체의 아미노산의 최대 15%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체의 아미노산의 최대 10%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다.
적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체는 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 보존적 아미노산 치환체, 알라닌에 의한 치환체 또는 대응 비천연 아미노산에 의한 치환체를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 변이체는 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖거나 아미노산 치환체를 갖지 않는다.
보다 바람직하게, 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 1 및/또는 12번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 2번 위치의 글리신이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 4번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 5번 위치의 글루탐산이 아스파르트산, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 6번 및/또는 9번 위치의 트립토판이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 7번 위치의 류신이 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 알라닌, 발린과 이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 8번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 11번 위치의 아스파라긴이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개를 포함한다:
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 1번 및/또는 12번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 2번 위치의 글리신이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴과 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 4번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 5번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 6번 및/또는 9번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 7번 위치의 류신이 알라닌, 발린, 이소류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 8번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 11번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 최대 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개를 포함한다:
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 1번 및/또는 12번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 2번 위치의 글리신이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴과 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 4번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 5번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 6번 및/또는 9번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 7번 위치의 류신이 알라닌, 발린, 이소류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 8번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 11번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체.
바람직한 구현예에 있어서, 서열 SGLTEWLRWFNS의 변이체에서 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환체, 바람직하게는 1 또는 2개의 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 치환체는 서열 SGLTEWLRWFNS의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11과 12번 위치에 아미노산 알라닌을 갖는다.
본 발명에 따른 서열 SGLTEWLRWFNS 펩티드의 변이체는 바람직하게는 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 아미노산이 본 명세서에 정의되어 있는 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체, 바람직하게는 2개 이하의 치환체, 바람직하게는 하나의 치환체를 가진 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS의 12개 모든 아미노산으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 본 명세서에 정의되어 있는 상기 서열의 변이체를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 서열 SGLTEWLRWFNS로 이루어지거나 본 명세서에 정의되어 있는 상기 서열의 변이체로 이루어져 있다.
서열 SGLTEWLRWFNS의 특히 바람직한 변이체는 표 1의 서열로부터 선택된 서열을 갖는다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 표 1의 서열로부터 선택된 서열로 이루어져 있다.
특히 바람직한 구현예에 있어서, 6-12개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 11(ITGA11) 결합 펩티드가 제공되는바, 상기 변이체는:
- 적어도 상기 서열의 6-9번 위치의 아미노산을 포함하는 상기 서열의 6-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고,
- 경우에 따라 상기 6-12개의 연속해 있는 아미노산 중
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 1번 또는 12번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 2번 위치의 글리신이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴과 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 4번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 5번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 6번 또는 9번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 7번 위치의 류신이 알라닌, 발린, 이소류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 8번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체, 및
- 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 11번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이하의 아미노산 치환체, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 아미노산 치환체를 갖는다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 5 내지 25개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 SFATWTPNFERN을 포함하거나 또는 상기 서열의 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 갖는 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 11(ITGA11) 결합 펩티드를 제공한다.
서열 SFATWTPNFERN의 변이체는 상기 서열의 5-12개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 바람직하게 상기 변이체는 상기 서열의 6-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 7-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 8-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 9-12개의 연속해 있는 아미노산, 보다 바람직하게는 상기 서열의 10, 11 또는 12개의 연속해 있는 아미노산과 같이 상기 서열의 10-12개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 특히 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 서열 SFATWTPNFERN의 5-12개, 바람직하게는 7-12개, 8-12개, 9-12개, 10-12개, 11-12개 또는 12개와 같이 6-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어져 있다. 일 구현예에 있어서, ITGA11 결합 펩티드는 서열 SFATWTPNFERN으로 이루어져 있다.
서열 SFATWTPNFERN의 변이체는 상기 5-12개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 더 갖는다. 바람직하게 본 명세서에 정의되어 있는 서열 SFATWTPNFERN의 변이체는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 1개 또는 2개를 갖거나, 보다 바람직하게는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖는다. 또한 바람직하게 본 발명에 따른 서열 SFATWPNFERN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 25%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 20%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 15%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 10%는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다.
상기 아미노산 치환체는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환체, 알라닌에 의한 치환체 또는 대응 비천연 아미노산에 의한 치환체이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 변이체는 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖거나 아미노산 치환체를 갖지 않는다.
보다 바람직하게, 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열의 1번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 2번 및/또는 9번 위치의 페닐알라닌이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 티로신과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 3번 위치의 알라닌이 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 4번 및/또는 6번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 위치의 트립토판이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 7번 위치의 프롤린이 알라닌, 시스테인, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴과 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 8번 및/또는 12번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 10번 위치의 글루탐산이 아스파르트산, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 11번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열의 1번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 2번 및/또는 9번 위치의 페닐알라닌이 티로신, 트립토판과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 3번 위치의 알라닌이 발린, 이소류신, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 4번 및/또는 6번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 8번 및/또는 12번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 10번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 11번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 SFATWTPNFERN의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열의 1번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 2번 및/또는 9번 위치의 페닐알라닌이 티로신, 트립토판과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 3번 위치의 알라닌이 발린, 이소류신, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 4번 및/또는 6번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 8번 및/또는 12번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 10번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 11번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체.
바람직한 구현예에 있어서, 서열 SFATWTPNFERN의 변이체에서 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환체, 바람직하게는 1 또는 2개의 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 치환체는 아미노산 알라닌에 의한 치환체이다.
본 발명에 따른 서열 SFATWTPNFERN 펩티드의 변이체는 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 3개 이하의 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 2개 이하의 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 하나의 치환체를 가진 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS의 12개 모든 아미노산으로 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 서열 SFATWTPNFERN을 포함하거나 본 명세서에 정의되어 있는 상기 서열의 변이체를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 ITGA11 결합 펩티드는 서열 SFATWTPNFERN로 이루어지거나 본 명세서에 정의되어 있는 상기 서열의 변이체로 이루어져 있다.
본 발명자들은 췌장암, 신장 섬유증, 피부 섬유아세포와 췌장 성상 세포에서 ITGA5의 발현이 TGFβ1에 의한 활성화 이후에 증대됨을 발견하였다. 또한 중첩 서열 TTVRYYRITYGE과 YYRITYGETGGN을 가진 펩티드와 이의 변이체가 ITGA5에 높은 친화도로 결합한다는 것을 발견하였다. 또한 이들 서열의 더 짧은 펩티드 변이체는 결합능을 유지하거나 더 나아가 증가된 결합능을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 이러한 ATGA5 결합 펩티드는 인테그린의 α 소단위체(α5)에 결합하지만 다수의 인테그린에 존재하는 β1에는 결합하지 않는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 ATGA5 결합 펩티드는 α5β1 인테그린에 대한 특이성이 높다.
본 발명의 ITGA5 결합 펩티드는 또한 항섬유화 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 펩티드 AV3(RYYRITY)은 TGFβ에 의한 활성화 이후 αSMA 발현을 저해하고(도 14A) α-SMA, Col-1a1과 비멘틴(vimentin)과 같은 섬유화 표지자를 발현시킴으로써(도 14B) 나타난 바와 같이 췌장 성상 세포 활성화를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 또한 IGTA5 결합 펩티드는 인간 섬유아세포의 이동을 저해하는 것으로 밝혀졌다(도 15).
또 다른 측면에 있어서, 따라서 본 발명은 6 내지 25개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN을 포함하거나
- 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 포함하는 6-16개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
- 상기 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 6-16개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미소산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 가진 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 5(ITGA5) 결합 펩티드를 제공한다.
서열 TTVRYYRITYGETGGN의 변이체는 상기 서열의 6-16개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 바람직하게 상기 변이체는 상기 서열의 7-16개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 변이체는 상기 서열의 8-16, 9-16, 10-16, 11-16 또는 12-16개의 연속해 있는 아미노산을 갖는다. 특히 바람직한 ITGA5 결합 펩티드는 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속해 있는 아미노산과 같이 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 6-16개, 바람직하게는 7-16개의 연속해 있는 아미노산을 가진 변이체로 이루어져 있다.
서열 TTVRYYRITYGETGGN의 변이체는 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 더 포함한다. 이에 따라 상기 변이체는 적어도 경우에 따라 본 명세서에 정의되어 있는 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 바람직하게는 하나 이하의 아미노산 치환체를 가진 아미노산 서열 YYRITY를 포함한다. 바람직하게 상기 변이체는 적어도 상기 서열의 4-10번 위치의 아미노산을 포함하는바, 즉 상기 변이체는 적어도 경우에 따라 본 명세서에 정의되어 있는 1 내지 3개의 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 1 또는 2개의 아미노산 치환체, 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의되어 있는 하나의 아미노산 치환체를 가진 아미노산 서열 RYYRITY를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 변이체는 적어도 서열 YYRITY, 바람직하게는 서열 RYYRITY를 포함한다.
서열 TTVRYYRITYGETGGN의 변이체는 상기 6-16개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 더 갖는다. 상기 3개 이하의 치환체는 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16번 위치의 아미노산으로부터 선택된다. 또한 바람직하게는 본 발명에 따른 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 25%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 20%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 15%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체의 아미노산의 최대 10%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된다. 바람직하게 본 명세서에 정의되어 있는 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 변이체는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 1개 또는 2개, 보다 바람직하게는 아미노산 치환체를 갖지 않거나 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖는다. 상기 1개 또는 2개의 치환체는 바람직하게는 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 5번 및 8번 위치의 1개 또는 2개 아미노산 모두의 치환체이다.
적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체는 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 보존적 아미노산 치환체, 알라닌에 의한 치환체 또는 대응 비천연 아미노산에 의한 치환체를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 변이체는 상기 아미노산 치환체 중 하나를 갖거나 아미노산 치환체를 갖지 않는다. 상기 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 하나 이하의 아미노산 치환체는 바람직하게는 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산의 치환체이다.
보다 바람직하게 적어도 하나의 아미노산 치환체를 갖는 서열 TTVRYYRITYGETGGN, 바람직하게는 서열 RYYRITY의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개, 보다 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열의 4번 및/또는 7번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘, 알라닌, 발린, 이소류신과 류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 및/또는 10번 위치의 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 TTVRYYRITYGETGGN, 바람직하게는 서열 RYYRITY의 상기 변이체는 바람직하게는 아래의 아미노산 치환체들 중 3개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개, 가장 바람직하게는 하나를 포함한다:
- 상기 서열의 4번 및/또는 7번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 및/또는 10번 티로신이 알라닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 치환체.
보다 바람직하게 적어도 하나의 아미노산 치환체를 가진 서열 TTVRYYRITYGETGGN, 바람직하게는 서열 RYYRITY의 상기 변이체는 아래의 아미노산 치환체들 중 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개를 포함한다:
- 상기 서열의 4번 및/또는 7번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체 및/또는
- 상기 서열의 5번 및/또는 10번 티로신이 알라닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된 치환체.
바람직한 구현예에 있어서, 서열 RYYRITY의 변이체에서 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환체, 바람직하게는 1개 또는 2개의 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 치환체는 서열 RYYRITY의 1, 2, 4, 5 또는 7번 위치에 아미노산 알라닌을 갖는다.
바람직한 구현예에 있어서, 6-16개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN 또는 상기 서열의 변이체를 포함하는 분리 또는 재조합 인테그린 알파 5(ITGA5) 결합 펩티드가 제공되는바, 상기 변이체는:
- 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 포함하는 상기 서열의 6-16개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고,
- 경우에 따라
- 상기 서열의 4번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 7번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 5번 위치의 티로신이 알라닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 10번 위치의 티로신이 알라닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 서열의 5-10번 위치의 상기 아미노산 중 아미노산의 3개 이하의 치환체, 바람직하게는 1개 또는 2개의 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 치환체를 갖는다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 6-16개의 아미노산을 갖고 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN 또는 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 5(ITGA5) 결합 펩티드가 제공되는바, 상기 변이체는:
- 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 포함하는 상기 서열의 6-16개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고,
- 경우에 따라
- 상기 서열의 5번 위치의 티로신이 알라닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체,
- 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환된 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 서열의 5-10번 위치의 상기 아미노산 중 아미노산의 1개 또는 2개의 치환체, 보다 바람직하게는 하나의 치환체를 갖는다.
서열 TTVRYYRITYGETGGN의 특히 바람직한 변이체는 표 2의 서열로부터 선택된 서열을 갖는다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 ITGA5 결합 펩티드는 표 2의 서열로부터 선택된 서열로 이루어져 있다. 상기 ITGA5 결합 펩티드는 예를 들면 RYYRITY, RYYRITYC, TTVRYYRITYGE와 YYRITYGETGGN으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어져 있다.
본 명세서에 정의되어 있는 아미노산 서열 또는 그의 변이체에서 아미노산들은 단일 문자 기호로 표시되어 있다. 이들 단일 문자 기호와 3문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있고 다음과 같은 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌, C(Cys)는 시스테인, D(Asp)는 아스파르트산, E(Glu)는 글루탐산, F(Phe)는 페닐알라닌, G(Gly)는 글리신, H(His)는 히스티딘, I(Ile)는 이소류신, K(Lys)는 라이신, L(Leu)은 류신, M(Glu)은 글루탐산, N(Asn)은 아스파라긴, P(Pro)는 프롤린, Q(Gln)는 글루타민, R(Arg)은 아르기닌, S(Ser)는 세린, T(Thr)는 트레오닌, V(Val)는 발린, W(Trp)는 트립토판, Y(Tyr)는 티로신이다.
본 명세서에서 사용되는 "보존적 아미노산 치환체"는 아미노산이 유사한 화학적 성질, 특히 전하 또는 소수성을 가진 측쇄가 있는 또 다른 아미노산에 의해 치환된 치환체이다. 보존적 아미노산 치환체는 전형적으로 펩티드의 ATGA5 또는 ATGA11 결합성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 다음 5개의 군들은 각각 서로에 대해 보존적인 치환체인 아미노산들을 나열한 것이다:
1) 세린, 트레오닌 아스파라긴, 글루타민;
2) 아스파르트산, 글루탐산;
3) 히스티딘, 아르기닌, 라이신;
4) 이소류신, 류신, 메티오닌, 알라닌, 발린 및
5) 페닐알라닌, 티로신, 트립토판.
본 명세서에서 사용되는 "대응 비천연 아미노산"은 기준 천연 아미노산의 유도체인 비천연 아미노산을 지칭한다. 예를 들면 천연 아미노산은 대응 β-아미노산에 의해 치환된다. β-아미노산은 천연 아미노산에서와 같이 α 탄소 대신 β 탄소에 결합되어 있는 아미노기를 갖고 있다. 예를 들면 α-알라닌이 β-알라닌 등에 의해 치환되어 있다. 천연 아미노산을 상기 천연 아미노산의 유도체인 비천연 아미노산으로 치환한 치환체의 다른 바람직한 예들은 다음과 같다. 알라닌에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환체는 예를 들면 베타-알라닌, t-부틸알라닌, 2-나프틸알라닌; L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노이소부티르산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아르기닌에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 호모아르기닌, 오르니틴, N5-카르바모일오르니틴과 3-아미노-프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아스파라긴에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 N-에틸아스파라긴이다. 아스파르트산에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 4-tert-부틸 수소 2-아지도숙시네이트이다. 시스테인에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 시스테인산과 호모시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 글루탐산에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 γ-카르복시-DL-글루탐산과 4-플루오로-DL-글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 글루타민에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 D-시트룰린과 티오-L-시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 글리신에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 N-메틸글리신, t-부틸글리신, N-메틸글리신과 D-알릴글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 히스티딘에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 3-(3-메틸-4-니트로벤질)-L-히스티딘 메틸 에스테르이다. 이소류신에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 이소데스모신, N-메틸이소류신과 알로-이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 류신에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 노르류신, 데스모신과 5,5,5-트리플루오로-류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 라이신에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 6-N-메틸라이신, 2-아미노헵탄산, N-아세틸 라이신, 히드록시라이신과 알로-히드록시라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 메티오닌에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 메티오닌 술폭시드이다. 페닐알라닌에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 p-아미노-L-페닐알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌과 4-플루오로페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 프롤린에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린과 1-아세틸-4-히드록시-L-프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 세린에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 호모세린, 이소세린과 3-페닐세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 트레오닌에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 D-티록신과 알로-트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 트립토판에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 5-히드록시-트립토판, 5-메톡시-트립토판과 5-플루오로-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 티로신에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신과 3-클로로-티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 발린에 대해 바람직한 비천연 아미노산 치환기는 노르발린, N-메틸발린과 3-플루오로-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 "펩티드"는 다수의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"와 "폴리펩티드"는 호환하여 사용된다. ITGA11에 결합하는 것으로 입증된 본 발명에 따른 최소 펩티드는 5개의 아미노산 길이를 갖는다. ITGA5에 결합하는 것으로 입증된 본 발명에 따른 최소 펩티드는 6개의 아미노산 길이를 갖는다. 그러나 상기 아미노산 서열 또는 이의 변이체는 더 큰 펩티드, 즉 하나 이상의 추가 아미노산에 의해 N-말단 및/또는 C-말단이 연장된 펩티드의 일부일 수 있다. 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 또는 그의 변이체는 바람직하게는 N- 및/또는 C-말단 연장기를 포함함으로써 N-말단 및/또는 C-말단이 변형될 수도 있다. 이와 달리 상기 아미노산 서열 또는 그의 변이체는 N- 및/또는 C-말단이 연장된다.
따라서 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 적어도 5개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산을 포함하고 25개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 6 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 보다 바람직하게 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 7 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 8 내지 25개의 아미노산으로 이루어져 있다. 실시예에서는 8개의 아미노산의 ITGA11 결합 펩티드가 더 작은 펩티드인 ITGA11에 더 강한 결합을 나타내었음을 보여주고 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 바람직하게는 9-25, 10-25, 11-25, 12-25개의 아미노산으로 이루어져 있다. ITGA5 결합 펩티드는 적어도 6개의 아미노산을 포함하고 25개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드는 바람직하게는 6 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 6 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 보다 바람직하게 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 7 내지 25개의 아미노산으로 이루어진다. 실시예에서는 7개의 아미노산(AV3)의 ITGA5 결합 펩티드가 수용체에 대한 친화성이 높다는 것을 보여주고 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드는 바람직하게는 9-25, 10-25, 11-25, 12-25개 아미노산의 길이를 갖는다. 그러나 더 작은 펩티드가 바람직하다. 따라서 본 발명에 따른 바람직한 펩티드는 길이가 5-20개 아미노산, 보다 바람직하게는 5-16개 아미노산, 보다 바람직하게는 5-15개 아미노산, 보다 바람직하게는 5-14개 아미노산, 보다 바람직하게는 5-13개 아미노산, 보다 바람직하게는 5-12개 아미노산이다. 예를 들면 본 발명에 따른 펩티드는 5-16개의 아미노산, 즉 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게 상기 펩티드는 6-20, 6-16 또는 6-15, 6-14, 6-13, 6-12개와 같이 적어도 6개의 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 펩티드는 6-20개의 아미노산, 6-16개의 아미노산 또는 6-12개의 아미노산을 갖는다. 또한 본 발명에 따른 특히 바람직한 펩티드는 7-20개의 아미노산, 7-16개의 아미노산 또는 7 내지 12개의 아미노산으로 이루어져 있다. 또한 본 발명에 따른 특히 바람직한 펩티드는 8-20개의 아미노산, 8-16개의 아미노산 또는 8 내지 12개의 아미노산으로 이루어져 있다. 또한 본 발명에 따른 특히 바람직한 펩티드는 10-20개의 아미노산, 10-16개의 아미노산 또는 10 내지 12개의 아미노산으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 N-말단, C-말단 변형 및/또는 내부 변형을 더 가질 수 있다. 따라서 N-말단 변형, C-말단 변형 및/또는 내부 변형을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드가 제공된다. 또한 N-말단 변형, C-말단 변형 또는 내부 변형을 가진 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물이 제공된다. 바람직한 N-말단 변형은 아세틸화이다. 바람직한 C-말단 변형은 아미드화이다. 바람직한 내부 변형은 예를 들면 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합의 형성의 결과로서 고리화 또는 이고리화이다. 따라서 N-말단, C-말단 변형 및/또는 내부 변형을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드가 제공된다.
또한 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체 및/또는 아미노산 서열 SFATWTPNFERN 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체 및/또는 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체를 포함하는 본 발명의 적어도 하나의 펩티드의 다량체, 예를 들면 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 또는 팔량체가 제공된다. 바람직한 다량체는 본 발명에 따른 2개의 펩티드의 이량체이다. 이러한 다량체, 바람직하게는 이량체는 본 발명에 따른 2개의 동일한 펩티드의 동종 이량체와 같은 본 발명에 따른 동일한 펩티드를 다수 포함하는 동종 다량체일 수 있다. 이와 달리, 이러한 다량체는 본 발명의 서로 다른 2개의 펩티드의 이종 이량체와 같이 본 발명에 따른 적어도 2개의 서로 다른 펩티드를 포함하는 이종 다량체일 수 있다. 예를 들면 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 서로 다른 2개의 ITGA11 결합 펩티드의 이량체가 제공된다. 또 다른 예로서, 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 서로 다른 2개의 ITGA5 결합 펩티드의 이량체가 제공된다. 또 다른 예로서, 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 하나의 ITGA11 결합 펩티드와 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN 또는 본 명세서에 정의되어 있는 이의 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 하나의 ITGA5 결합 펩티드의 이량체가 제공된다. 이량체는 예를 들면 펩티드 단량체에 존재하는 2개의 시스테인 잔기 간 이황화 결합 형성의 결과로서 생성된다. 따라서 본 발명에 따른 펩티드는 바람직하게는 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 이량체는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 각각 포함하는 본 발명에 따른 2개의 펩티드를 포함한다. 따라서 본 발명에 따른 특히 바람직한 펩티드는 RYYRITYC이다. 실시예에서 입증한 바와 같이(도 15 참조), 상기 펩티드는 섬유아세포의 이동을 저해하는데 특히 활성이다. 이론에 구속되기를 바라지 않지만 서로 다른 2개의 펩티드 분자 내 2개의 시스테인 잔기 간 이황화 결합 형성의 결과로서 상기 펩티드의 이량체가 생성되고 상기 펩티드의 이량체 형태는 보다 효과적이라고 판단된다. 따라서 본 발명에 따른 2개의 펩티드를 포함하는 이량체가 제공된다. 상기 펩티드는 바람직하게는 각각 시스테인 잔기를 포함한다. 상기 2개의 펩티드는 또한 바람직하게는 동일하다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 펩티드는 자체가 자연계에서 발생하지 않는 펩티드, 즉 본 발명의 펩티드는 비자연 발생적 펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는 "비자연 발생적"은 펩티드가 상기 형태로 자연계에서 발견되지 않는, 바람직하게는 펩티드의 아미노산 서열이 자연계에서 발견되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 이러한 구현예에 있어서, 바람직하게 본 발명의 펩티드는 적어도 본 명세서에 정의되어 있는 아미노산 서열에 적어도 하나의 아미노산 치환체를 포함한다.
본 발명의 펩티드는 방출 제어 및/또는 표적 지향 전달 담체에 혼입되는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용되는 용어 "방출 제어"는 시간에 의존하는 방식으로 본 발명의 펩티드가 방출되는 것을 의미한다. 일 구현예에 있어서, 방출 제어는 서방성을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적지향 전달"은 부위 지향 방식으로 본 발명의 펩티드가 방출되는 것을 말한다. 방출 제어 수송체를 사용하면 예를 들면 주사에 의한 본 발명의 펩티드의 빈번한 투여를 피할 수 있다는 장점이 있다. 표적지향 전달 수송체를 사용하면 본 발명의 펩티드가 염증 부위 또는 감염 부위와 같은 대상체의 신체 내 대상 부위에 효과적으로 전달 및/또는 상기 대상 부위에서 유지되는 장점이 있다. 바람직하게는 본 발명의 펩티드는 박테리아, 진균류, 바이러스와 기생충을 포함한 미생물에 의해 감염된 부위를 표적으로 한다. 방출제어 및/또는 표적지향 전달 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 방출 제어 및/또는 표적지향 전달 수송체의 비제한적인 예로는 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 나노복합체, 폴리플렉스, 탄소나노튜브, 양자점, 마이크로캡슐, 리포솜, 미소구체, 하이드로겔, 폴리머, 마이셀, 덴드리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 항체 단편, 시클로덱스트린과 덱스트란을 포함한다. 방출 제어는 예를 들면 이러한 담체의 표면 내부 또는 상부에 본 발명의 펩티드를 혼입함으로써 제공된다. 상기 담체는 본 발명의 펩티드를 포획하고 수성, 산성 또는 염기성 환경 또는 체액과 같은 적합한 환경에서 서서히 분해 또는 용해되는 입자를 형성함으로써 펩티드를 방출하는 물질이다. 표적지향 전달은 예를 들면 담체 표면에 표적지향기를 제공함으로써 달성된다. 표적지향기를 포함하는 이러한 담체의 예로는 항체-관능화 담체, 부위 특이적 리간드를 가진 담체와 표면 양전하 또는 표면 음전하를 가진 담체가 있다. 방출 제어 및/또는 표적지향 전달을 위해 바람직한 입자로는 경우에 따라 표적지향기가 제공되어 있는 나노입자, 즉 직경이 약 1 내지 500 nm, 바람직하게는 직경이 약 200 nm 이하의 범위에 있는 입자와 리포솜이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 이량체 펩티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 성분은 바람직하게는 적어도 하나의 추가 부분을 포함한다. 상기 화합물은 바람직하게는 표지, PEG 링커와 같은 링커, N-말단 변형, C-말단 변형 또는 내부 변형을 포함하거나 또는 상기 화합물은 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 나노복합체, 폴리플렉스, 탄소나노튜브, 양자점, 마이크로캡슐, 리포솜, 미소구체, 하이드로겔, 폴리머, 마이셀, 덴드리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 항체 단편, 시클로덱스트린과 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 담체에 결합 또는 봉입되는 상기 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함한다.
또한 본 발명에 따른 펩티드의 염이 제공된다. 이러한 염은 산부가염과 염기부가염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 펩티드의 "약제학적으로 허용되는 염"은 펩티드의 원하는 ITGA11 또는 ITGA5 결합 활성을 유지하고 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 염을 지칭한다. 펩티드 염을 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 예를 들면 생성물의 유리산 또는 유리 염기 형태를 염을 용해하지 않는 용매 또는 매질이나 추후 진공 또는 동결건조에 의해 제거되는 물과 같은 용매에서 적절한 산 또는 염기의 1 당량 이상과 반응시키거나 존재하고 있는 염의 양이온을 적합한 이온교환수지상의 또 다른 양이온에 대해 교환함으로써 펩티드를 약제학적으로 허용되는 산 또는 염기와 혼합하는 것을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 산과 염기의 예는 펩티드의 유리 아미노기와 암모늄염을 형성하는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 트리플루오로아세트산, 신남산, 황산, 염산, 브롬산, 질산, 과염소산, 인산과 티오시안산과 같은 유기산과 무기산 및 펩티드의 유리 카르복실산기와 카르복실레이트염을 형성하는 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민과 그 외 모노-, 디- 및 트리알킬 아민과 아릴아민과 같은 염기를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드는 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 통상적으로 사용되는 고상 합성법, 예를 들면 당업계에 잘 알려져 있는 알파-아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호를 포함하는 방법에 의해 펩티드를 합성할 수 있다. 이때 아미노산은 성장하는 아미노산의 사슬에 순차적으로 부가된다. 이러한 방법들은 예를 들면 Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156; 및 Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press, London (1989)에 기재되어 있다. 고상 합성법은 약 70개 이하의 아미노산 길이를 가진 펩티드와 같이 비교적 짧은 길이의 펩티드를 대규모 제조로 합성하기에 특히 적합하다. 이와 달리, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 본 명세서에서는 본 발명에 따른 핵산 분자라고도 한다. 본 명세서에서 사용되는 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA의 사슬을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 핵산 서열 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포에 이종 핵산 서열을 도입할 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지 또는 동물 바이러스와 같은 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주 세포에서 이종 핵산 서열에 의해 코딩되는 본 발명의 펩티드의 발현 또는 생산을 가능하게 한다. 본 발명에 따라 사용되는 벡터는 예를 들면 동물 바이러스로부터 유도되며, 그 예로는 우두 바이러스(변형 우두 바이러스 앙카라(MVA)와 같은 약독화된 유도체 포함), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 아데노바이러스 또는 레트로바이러스를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 선택된 숙주 세포에서 본 발명에 따른 펩티드의 전사 개시에 적합한 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 펩티드를 발현시키기에 적합한 프로모터의 예로는 베타-액틴 프로모터, 면역글로빈 프로모터, 5S RNA 프로모터 또는 포유류 숙주에 대한 시토메갈로바이러스(CMV), 라우스 육종 바이러스(RSV)와 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터와 같은 바이러스 유래 프로모터를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 벡터와 같은 핵산 분자에 의해 형질 전환된 세포 또는 형질 전환할 수 있는 세포이다. "형질 전환"은 수용 세포에 외래 핵산이 도입되는 것을 의미한다. 숙주 세포의 형질 전환으로 인해 상기 세포에 의한 재조합 단백질의 일시적인 발현이 나타날 수 있는데, 이는 재조합 단백질이 한정된 기간 동안만 발현되는 것을 의미한다. 이와 달리, 수용 세포의 형질 전환으로 인해 안정된 발현이 나타날 수 있는데, 이는 상기 세포의 게놈에 핵산이 도입되어 세포의 다음 세대로 전해지는 것을 의미한다. 또한 재조합 단백질의 유도성 발현이 달성될 수 있다. 유도성 발현계는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 가능하게 하는 분자의 존재 또는 부재를 필요로 한다. 유도성 발현계의 예는 Tet-On 및 Tet-Off 발현계, 예를 들면 엑디손 유도성 유전자 발현계와 같은 호르몬 유도성 유전자 발현계, 아라비노우스 유도성 유전자 발현계 및 유도성 메탈로티오네인 프로모터를 포함하는 pMT/BiP 벡터(Invitrogen)를 사용하는 초파리 유도성 발현계를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 가능하게 하는 분자의 존재 또는 부재를 필요로 한다. 본 발명에 따른 펩티드를 제조하기 위한 방법에서 사용되는 숙주 세포는 예를 들면 그램 양성 원핵생물, 그램 음성 원핵생물 또는 진핵생물이다. 바람직하게 상기 숙주 세포는 식물 세포, 효모 세포, 포유류 세포 또는 곤충 세포와 같은 진핵 세포, 가장 바람직하게는 곤충 세포 또는 포유류 세포이다. 적합한 숙주 세포의 예는 옥수수 세포, 벼 세포, 개구리밥 세포, 담배 세포(BY-2 또는 NT-1 세포와 같은)와 감자 세포를 포함한다. 효모 세포의 예는 사카로마이세스와 피치아이다. 곤충 세포의 예는 Tn5, SF-9와 SF-21 세포와 같은 스포돕테라 프루기페르다 세포와 드로소필라 슈나이더 2(S2) 세포와 같은 초파리 세포이다. 본 발명에 따른 펩티드를 발현하기에 적합한 포유류 세포의 예는 아프리카 푸른 원숭이 신장(Vero) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK-21와 같은) 세포, 인간 망막 세포(예를 들면 PerC6 세포), 인간 배아 신장 세포(HEK293 세포와 같은), Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포, 닭 배아 섬유아세포(CEF), 닭 배아 신장 세포(CEK 세포), 배반엽 유래 배아 간세포(예. EB14), 마우스 배아 섬유아세포(3T3 세포와 같은), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 이들 세포 유형의 유도체를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
이에 따라 본 발명은:
- 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하고;
- 상기 핵산 분자로 숙주 세포를 형질 전환시키고;
- 상기 펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건에서 상기 숙주 세포를 배양하고;
- 상기 세포로부터 상기 펩티드를 수확하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드를 정제 및/또는 단리하는 것을 더 포함한다. 수득한 본 발명에 따른 펩티드는 바람직하게는 경우에 따라 추가 정제, 단리 또는 처리 후, 예를 들면 겔 전기영동 또는 크로마토그래피법을 이용하여 정제한 후에 인간 치료에 사용된다.
일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드는 ITGA11 및/또는 α11β1 인테그린에 결합한다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드는 ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린에 결합한다. ITGA11, α11β1 인테그린, ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린에 대한 펩티드의 결합은 예를 들면 코팅된 수용체(ITGA11, α11β1 인테그린, ITGA5 또는 α5β1 인테그린) 또는 실시예에 기재되어 있는 펩티드 마이크로어레이를 사용하여 결정된다. 첫 번째 분석에서 관련 수용체를 예를 들면 ELISA 플레이트에 코팅하고 이어서 펩티드와 함께 배양한다. 두 번째 분석에서는 펩티드를 어레이 상에 고정하고 이어서 관련 수용체와 함께 배양한다.
본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드는 바람직하게는 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA11 저해 활성을 갖는다. 상기 저해 활성은 바람직하게는 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포(pericyte) 및/또는 기타 간엽 기원 세포들에 대한 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA11의 결합 저해, 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포들의 이동 저해, 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포들의 분화 저해 및/또는 세포외 기질 합성 및/또는 침착 저해를 포함한다.
본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드는 바람직하게는 α5β1 인테그린 및/또는 ITGA5 저해 활성을 갖는다. 상기 저해 활성은 바람직하게는 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포들, 바람직하게는 섬유아세포, 근섬유 아세포 및/또는 성상 세포에 대한 α5β1 인테그린 및/또는 ITGA5의 결합 저해, 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포들, 바람직하게는 섬유아세포, 근섬유 아세포 및/또는 성상 세포의 이동 저해, 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포들, 바람직하게는 섬유아세포, 근섬유 아세포 및/또는 성상 세포의 분화 저해 및/또는 세포외 기질 합성 및/또는 침착 저해를 포함한다. 성상 세포에는 간 성상 세포, 췌장 성상 세포와 유족 세포(podocyte)가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 저해 활성은 보다 바람직하게는 적어도 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈소판 및/또는 기타 간엽 기원 세포, 바람직하게는 섬유아세포, 근섬유 아세포 및/또는 성상 세포, 보다 바람직하게는 섬유아세포의 이동 저해를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 화합물은 치료와 비치료 분야 모두에서 유리하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 펩티드와 화합물은 치료제, 예방제, 진단제 또는 표적제로서 유용하다.
따라서 또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게 이량체 펩티드 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염 또는 본 발명에 따른 핵산 분자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드, 본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 이와 달리, 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 하나가 넘는 ITGA11 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드 및/또는 본 발명에 따른 하나가 넘는 ITGA5 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드 또는 그의 조합을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 이량체 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물과 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 ITGA11 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함하는 하나 이상의 화합물, 본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함하는 하나 이상의 화합물 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드를 제공한다. 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물이 제공된다. 상기 약제는 치료제 또는 예방제일 수 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 약제학적 조성물은 서로 다른 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 예로서 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드를 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 구강, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하(subcutaneous), 피하(subdermal), 경피, 척수강내 및 두개내 방법을 통해 투여하는 것을 포함한다, 경구 투여를 위해서 상기 활성 성분은 캡슐제, 정제와 산제와 같은 고체 투여형태 또는 엘릭시르, 시럽과 현탁액과 같은 액체 투여형태로 투여 될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 적합한 담체의 예는 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin, KLH), 혈청 알부민(예를 들면 BSA 또는 RSA)과 난백 알부민을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 적합한 담체는 용액, 예를 들면 염수이다. 정제, 캡슐제 등에 혼입될 수 있는 부형제의 예는 다음과 같다: 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 미세결정 셀룰로오스와 같은 부형제; 옥수수 전분, 호화전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아린산 마그네슘과 같은 활제; 수크로오스, 락토오스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 윈터그린(wintergreen) 또는 체리 오일과 같은 향미제이다. 투여 단위 형태가 캡슐일 때에는 상기 유형의 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 코팅으로서 또는 그렇지 않고 투여 단위의 물리적 형태를 변형시기 위해서 다양한 다른 물질들이 존재할 수 있다. 예를 들어 정제는 셀락, 당 또는 이들 2개로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 상기 활성 화합물, 감미제로서 수크로오스, 보존제로서 메틸 파라벤과 프로필 파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향미제를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 바람직하게는 인체용으로 적합하다.
주사용 멸균 조성물은 종래의 약제학적 실시에 따라 본 발명의 펩티드를 물 또는 참깨유, 코코넛유, 면실유 등과 같은 천연 식물유와 같은 주사용 매질 또는 에틸 올레에이트 등과 같은 합성 지방 매질에 용해 또는 현탁시켜 제형화할 수 있다. 완충제, 보존제, 산화방지제 등을 혼입할 수도 있다.
국소 투여용 조성물은 종래의 약제학적 실시에 따라 제형화할 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 "국소 투여"는 피부 또는 점막과 같은 신체 표면에 도포하여 미생물 또는 기생충 감염증에 기인하는 증상을 국소 치료하는 것을 의미한다. 국소 투여에 적합한 제형의 예는 크림, 겔, 연고, 로션, 포말, 현탁액, 분무액, 에어로졸, 분말 에어로졸을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 약제는 피부 도포형으로 이는 피부에 직접 도포되는 것을 의미한다. 국소 약제는 예를 들면 기도의 점막 상피 도포용 흡입제이거나 결막에 도포되는 점안액 또는 귀에 넣는 점이액과 같이 피부 이외의 조직의 표면에 도포될 수도 있다. 국소 투여용으로 제형화되는 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 유화제, 희석제, 보습제, 보존제, pH 조정제 및/또는 물과 같은 국소 도포용에 적합한 적어도 하나의 약제학적 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 이량체 펩티드는 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 및/또는 암의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. 바람직하게 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게 이량체 펩티드는 섬유증 및/또는 섬유증 관련 질환 또는 암의 치료, 보다 바람직하게는 섬유증 또는 섬유증 관련 질환의 치료에 사용된다. 본 발명자들은 신규한 ITGA5 및 ITGA11 결합 펩티드를 개발하였다. 이론에 구속되기를 바라지 않지만 이들 펩티드는 예를 들면 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포로 분화하여 이들의 분화를 저해한다. 조직 수복 중에 섬유아세포 및 성상 세포와 같은 세포는 좀더 증식 및 수축 표현형을 갖는 근섬유 아세포로 세포외 기질의 전환에 관여하는 정상적인 상대적 휴지 상태로부터 표현형을 변화시킨다. 정상적인 조직 수복 중에 반흔이 형성되고 근섬유 아세포는 세포 사멸을 겪게 된다. 병리학적 섬유증에서 근섬유 아세포는 조직 내에 남고 조직의 기질 합성과 수축 증가를 통해 섬유증을 일으킨다. 따라서 예를 들면 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포의 분화 저해는 섬유증의 발생 및/또는 진행을 저지하는데 기여한다. 이에 따라 본 발명의 펩티드를 항섬유화제와 항암제로서 사용할 수 있다.
따라서 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 방법으로서 상기 대상체에 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드 또는 바람직하게는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 또한 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 방법으로서 상기 대상체에 본 발명에 따른 핵산 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
또한 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 및/또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드가 제공된다. 또한 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 및/또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드를 포함하는 화합물이 제공된다.
또한 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 및/또는 암의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드의 용도가 제공된다. 또한 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 및/또는 암의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드를 포함하는 화합물의 용도가 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 인간 또는 동물이다. 대상체는 인간, 돼지, 흰담비, 바다표범, 토끼, 고양이, 개, 소와 말과 같은 포유류를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 대상체는 포유류이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 대상체는 인간이다.
상기 펩티드 또는 화합물을 함유하는 펩티드, 화합물 및 조성물은 예방 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 펩티드 또는 화합물을 함유하는 펩티드, 화합물 및 조성물은 치료적 처치를 위해 투여된다. 치료 용도에 있어서, 펩티드 또는 조성물은 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암을 이미 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 인간에게 상기 질병과 그 합병증을 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 상기 펩티드 또는 화합물은 전형적으로 본 발명에 따른 약제학적 조성물 중에 치료량, 즉 증상 또는 질환, 특히 섬유증, 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암을 치료하기에 충분한 양으로 존재한다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드의 전형적인 투여량은 펩티드의 크기에 따라 체중 kg 당 펩티드 0.01 내지 10 mg이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "섬유증"은 폐, 신장, 심장, 간, 피부와 관절을 포함하는 피부 또는 장기에 세포외 기질 성분이 침착되어 반흔 조직을 생성하는 것을 특징으로 하는 증상을 의미한다. 상기 용어는 반흔 조직의 형성 과정을 의미하기도 한다. 섬유증 또는 섬유증 관련 장애의 치료는 이미 섬유화 증상이 발생한 대상체의 치료를 의미한다. 섬유증 또는 섬유증 관련 장애의 예방은 섬유화 증상이 발생할 위험이 있는 대상체의 예후적 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "섬유증 관련 장애"는 섬유증의 결과로서 일어날 수 있거나 섬유증과 관련이 있는 장애 또는 증상으로 정의된다. 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애는 바람직하게는 신장 섬유증, 간 섬유증, 간 경화증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 담관 섬유증, 복막 섬유증; 심근 섬유증; 췌장 섬유증, 간 또는 신장 이식 후 재관류 손상, 간질성 폐질환(ILD), 낭포성 섬유증(CF), 죽상 동맥경화증, 전신 경화증, 골경화증, 척추 추간판 탈출증 및 기타 척수 손상, 섬유종증, 섬유 근육통, 관절염, 재발협착증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상을 의미한다. 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증과 경피증 폐 섬유증을 포함한다. 피부 섬유증은 경피증, 켈로이드(keloid), 비대성 반흔, 피부 섬유종, 창상, 만성 창상, 피부 반흔, 건선과 화상을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 섬유증 및/또는 섬유증 관련 장애는 간 섬유증, 피부 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 신장 섬유증과 죽상 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
염증은 섬유증의 초기 단계일 수 있다. 예를 들면 간염은 간 섬유증으로 나타나고 신장염은 신장 섬유증으로 나타난다. 본 명세서에서 사용되는 "염증성 질환"은 과도하거나 조절되지 않은 염증 반응과 관련된 임의의 질환을 지칭한다. 본 발명에 따라 치료되는 염증성 질환은 바람직하게는 조직 손상과 섬유증을 유발하는 염증성 질환이다. 바람직하게 본 발명에 따라 치료되는 염증성 질환은 류마티스성 관절염(RA), 건선성 관절염, 강직성 척추염과 청소년 특발성 관절염과 같은 관절염; 궤양성 대장염, 크론병, 소아 지방병, 장염, 괴사성 장염과 글루텐 과민성 장 질환과 같은 염증성 장 질환; 기관지 천식, 알레르기성 천식, 내인성 천식, 외인성 천식 및 먼지 천식을 포함한 천식, 특발성 간질 폐렴, 성인 호흡 곤란 증후군, 알레르기 비염, 만성 폐쇄성 기도 질환, 가역성 폐쇄 기도 질환, 과민성 폐질환, 기도 과민반응과 기관지염; 건선, 경피증, 습진, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 피부 근염, 피부염, 다형성 홍반 및 심마진과 같은 피부의 염증성 질환; 자가 면역 간염과 바이러스성 간염을 포함한 간염; 사구체 신염, 간질 신염과 신우 신염을 포함한 신염; 췌장염, 맥관염, 치은염, 치주염, 유육종증, 갑상선염, 이염, 결막염, 부비동염 및 병원성 미생물에 의한 유발되는 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 염증성 질환은 신염, 간염, 췌장염, 피부의 염증성 질환과 호흡계의 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "암"은 모든 유형의 악성 종양 또는 악성 신생물을 지칭한다. 본 발명에 따라 치료되는 암은 바람직하게는 폐암, 췌장암, 유방암, 간암, 뇌암, 피부암, 결장암, 소장암, 위암, 자궁암, 신장암, 신장세포암종, 전립선암, 담낭암, 두부경부암, 난소암, 자궁경부암, 아교 모세포종, 흑색종, 연골육종, 섬유육종, 결합조직성 소원형세포종양, 자궁내막, 식도, 눈 또는 위장 간질 종양, 지방육종, 비인두, 갑상선, 질과 외음부 종양 및 기타 결합조직성을 가진 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 결합조직성을 가진 종양이다. 본 명세서에서 사용되는 "결합조직성을 가진 종양"은 섬유 또는 결합 조직의 성장과 관련된 종양을 말한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 간암, 유방암, 전립선암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 암의 치료는 종양 크기의 감소, 종양 성장의 저해 및 전이 형성 저해를 포함한다.
본 발명의 펩티드는 예를 들면 대상 부위에 치료용 분자 또는 조영제를 전달하는 표적지향 전달제로서 적합하게 사용된다. 따라서 조영제 또는 표적제로서 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드의 용도가 제공된다. 또한 표적제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드가 제공된다. 또한 인테그린 알파 11(ITGA11)을 발현, 바람직하게는 α11β1 인테그린을 발현하는 조직을 본 발명에 따른 ITGA 결합 펩티드 또는 다량체, 바람직하게는 이량체 펩티드와 접촉시킴으로써 영상화하는 방법이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 예를 들면 조직 또는 세포 시료를 영상화하기 위한 시험관내 방법이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 생체내 조직 또는 세포를 영상화하기 위한 생체내 방법이다. ITGA11 결합 펩티드는 바람직하게는 섬유증 조직 또는 종양 조직과 같은 ITGA11 및/또는 α11β1 인테그린을 발현하는 조직에 치료제 또는 조영제를 전달하기 위해 사용된다. 또한 인테그린 알파 5(ITGA5)를 발현하는, 바람직하게는 α5β1을 발현하는 조직을 본 발명에 따른 ITGA5 결합 펩티드 또는 다량체, 바람직하게는 이량체 펩티드와 접촉시킴으로써 영상화하는 방법이 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 예를 들면 조직 또는 세포 시료를 영상화하기 위한 시험관내 방법이다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 생체내 조직 또는 세포를 영상화하기 위한 생체내 방법이다. ITGA5 결합 펩티드는 바람직하게는 섬유증 조직 또는 종양 조직(내 세포)과 같은 ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린을 발현하는 세포 또는 조직에 치료제 또는 조영제를 전달하기 위해 사용된다.
본 발명의 펩티드를 사용하여 대상 부위를 표적으로 할 수 있는 치료용 분자는 예를 들면 단백질 또는 펩티드, 사이토카인, 약물 함유 나노입자, 소분자 치료제 및/또는 화학치료제이다. 그러한 치료용 분자는 예를 들면 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드에 결합된다. 일 구현예에 있어서, 바람직하게 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드는 치료용 분자가 섬유증 조직 또는 ITGA11 및/또는 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린을 발현하는 섬유증 조직 내 세포를 표적으로 하기 위해 사용된다. 상기 치료제는 섬유증 또는 섬유증 관련 장애를 치료하기에 적합한 것으로 당업계에 공지된, 예를 들면 피르페니돈(5-메틸-1-페닐피리딘-2-온), 트라닐라스트(2-{[(2E)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로프-2-에노일]아미노}벤조산), 인터페론-β1a, 인터페론-γ, 콜히친, D-페니실라민, 릴렉신, 로바스타틴, 아세틸시스테인, 각질형성세포 성장 인자, 간세포 성장 인자, 캅토프릴, 빌리루빈과 이마티닙으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 작용제일 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드는 치료용 분자가 ITGA11 및/또는 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린을 발현하는 종양세포를 표적으로 하기 위해 사용된다. 상기 치료제는 덱사메타손, 프레드니솔론, 베타메타손, 트리암시놀론, 아비라테론, 리아로졸, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 포스페스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 클로로트리아니센, 메트록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 클로르마디논, 시프로테론 아세테이트, 다나졸, 알릴에스트레놀, 게스트리논, 메파르트리신, 랄록시펜, 오메록시펜, 레보멜록시펜, 타목시펜, 토레미펜, 풀베스트란트, 고나도트로핀, 성선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 메피티오스탄, 테스트로락톤, 아미노글루테티미드, 고세렐린, 부세렐린, 류프로렐린, 드롤록시펜, 에피티오스타놀, 에티닐레스트라디올, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 보로졸, 포르메스탄, 플루타미드, 피나스테리드, 두타스테리드, 에프리스테리드, 티오테파, 카르보쿠온, 임프로설판, 부술판, 니무스틴, 미토브로니톨, 멜팔란, 다카르바진, 라니무스틴, 에스트라무스틴, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 에토글루시드, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 알트레타민, 암바무스틴, 디브로스피디움, 포테무스틴, 프레드니무스틴, 푸미테파, 리보무스틴, 테모졸로미드, 트레오설판, 트로포스파미드, 지노스타틴 스티말라머, 아도젤레신, 시스테무스틴, 비젤레신, 메르캅토푸린, 6-메르캅토푸린 리보시드, 티오이노신, 메토트렉세이트, 에노시타빈, 시타라빈, 시타라빈, 안시타빈, 플루오로우라실, 독시플루리딘, 카르모푸르, 갈로시타빈, 엠미테푸르, 아미노프테린, 부토신, 폴리네이트 칼슘, 레보폴리네이트 칼슘, 클라드리빈, 에미테푸르, 플루다라빈, 겜시타빈, 펜토스타틴, 피리트렉심, 이독수리딘, 미토구아존, 티아조프린, 암바무스틴, 악티노마이신 D, 악티노마이신 C, 미토마이신 C, 크로모마이신 A3, 블레오마이신, 블레오마이신 설페이트, 다우노루비신, 독소루비신, 피라루비신, 에피루비신, 네오카르지노스타틴, 미트라마이신, 사르코마이신, 카르지노필린, 미토탄, 조루비신, 미톡산트론, 이다루비신, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 테니포시드, 판클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 피시바닐, 크레스틴, 시조피란, 렌티난, 우베니멕스, 인터페론, 인터류킨, 대식세포 콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니-자극 인자, 에리트로포이에틴과 림포톡신으로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 호르몬 치료제, 화학치료제, 면역치료제와 같이 당업계에 공지된 임의의 항암제일 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드에는 이미징 표지가 제공될 수 있다. 사용 가능한 이미징 표지의 예는 효소, 형광 화합물, 방사성 동위원소, 화학 발광 화합물과 생물 발광 화합물을 포함한다. 이러한 이미징 표지는 당업계에 잘 알려져 있는 것을 일반적으로 이용 가능하다. 표지의 비 제한적인 예는 비오틴, 플루오레세인, 단실(dansyl), 7-메톡시쿠마린 아세트산(Mca), 팔미트산이다. 이러한 표지는 예를 들면 당업계에 잘 알려져 있는 이용 가능한 방법을 이용하여 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부착된다. 따라서 본 발명에 따른 펩티드와 표지, 바람직하게는 이미징 표지를 포함하는 화합물이 제공된다. 바람직한 표지의 예로는 효소, 형광 표지, 방사성 동위원소, 화학 발광 표지와 생물 발광 표지가 있다. 특히 바람직한 표지는 형광 표지이다.
이미징 표지가 제공된 본 발명에 따른 펩티드는 시험관내 및 생체내에서 모두 사용할 수 있다. 예를 들어 연구 또는 진단 목적으로 시험관내 사용은 예를 들면 개체의 조직 시료에서 ITGA11 및/또는 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA5 및/또는 α5β1 인테그린을 표지하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드의 생체내 사용의 예는 영상 유도 수술 및 영상 유도 약물 전달이다. 영상 유도 수술은 수술 절차를 돕거나 안내하기 위해 대상 조직을 실시간으로 표지화하는 수술 절차를 말한다. 영상 유도 약물 전달에서 종양 국재화와 약물 전달은(비침습적인) 영상화를 통해 유도되고 모니터링된다.
따라서 진단제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물이 제공된다. 이러한 펩티드는 예를 들면 본 명세서에 기재되어 있는 이미징 표지에 결합된다. 상기 진단제는 바람직하게는 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암의 진단에 사용하기 위한 것이다. 본 발명은 또한 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암을 진단하기 위한 방법으로서, 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암에 걸린 것으로 의심되는 대상체의 시료를 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또한 조영제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 다량체, 바람직하게는 펩티드 또는 이러한 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 화합물이 제공된다. 이러한 펩티드는 예를 들면 본 명세서에 기재되어 있는 이미징 표지에 결합된다. 상기 조영제는 바람직하게는 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암의 진단에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에는 명료성 및 간결한 설명을 위해 본 발명의 동일 또는 개별 측면 또는 구현예의 일부로서 특징들이 기재될 수 있다. 당업자라면 본 발명의 범위가 동일 또는 개별 구현예의 일부로서 본 명세서에 기재되어 있는 특징 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 아래의 비제한적인 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 1: TGF-β1에 의해 활성화된 인간 간 성상 세포(A) 및 CCl4 유도된 간 섬유증 마우스 모델(B)에서 간 섬유증의 서로 다른 단계에서 단리한 간에서 α-SMA와 인테그린 α11의 유전자 발현 수준. *p<0.05, **p<0.01 vs. 정상.
도 2: A. 인간 간경변에서 ITGA11; B. 체장암에서 ITGA11; C. 인간 신장 섬유증에서 ITGA11. 패널 A와 B의 사진은 ITGA11(녹색)과 a-SMA(적색)의 면역형광 염색 및 이들의 합성사진(황색)을 보여준다. 패널 C는 ITGA11(적색)과 a-SMA(녹색)의 면역형광 염색 및 이들의 합성사진(주황색)을 보여준다. 이들 사진은 합성 사진에서 주황색으로 나타나 있는 섬유아세포 표지자인 a-SMA와 함께 국재화된 모든 병적 증상의 섬유화 영역에서 ITGA11이 강하게 발현됨을 보여 주고 있다.
도 3: α11β1 대 α4β1에 대한 파아지의 결합을 보여주는 파아지 ELISA 분석.
도 4: ITGA11에 대한 펩티드의 결합. A는 코팅된 α11β1 수용체에 대한 AXI-I-PEG-FITC의 결합을 보여준다. 농도가 증가함에 따라 AXI-I-FITC는 수용체에 결합하였고 과량의 미표지 AXI-I에 의해 결합이 블로킹되었다. 비어있는 웰 또는 무관한 수용체 α15β1에 대한 펩티드의 결합은 특이적인 결합을 일으키지 않았다. B와 C는 녹색 표시 LX2 간 성상 세포에 대한 AXI-I-FITC(B) 및 AXI-II-FITC(C) 펩티드의 결합을 보여준다.
도 5: 코팅된 α11β1 수용체(A)와 LX2 세포(B)에 대한 FITC 표지 ITGA11 결합 펩티드(AXI-I)의 결합 연구. 상기 수용체에 대한 결합은 미표지 펩티드의 10배 고농도를 첨가함으로써 경쟁적으로 블로킹되었다. 수용체 결합 데이터는 n=4개의 독립적인 실험(각각 2회)의 평균값이다. 평균+sem. LX2에서 ITGA11이 녹다운(knockdown)되어 펩티드 결합이 완전히 저해되었다.
도 6: AXI-I-PEG-FITC 결합 분석-1차 인간 췌장 성상 세포에서 유세포 계수법. 서로 다른 농도의 AXI-I-PEG-FITC를 4℃에서 1 시간 동안 현탁된 췌장 성상 세포와 함께 배양하고 세척하여 0.5% 포름 알데히드로 고정시키고 유세포 계수법으로 측정하였다. 그 결과, 이들 세포에 AXI-I-PEG-FITC가 농도 의존적으로 결합하여 대략 1μM의 해리 상수(kd) 값이 얻어졌다.
도 7: AXI-I 펩티드(SGLTEWLRWFNS)에 대한 알라닌 스캐닝 및 펩티드 사슬 길이 스캔.
도 8. 시험관내(A) 및 마우스의 CCl4 유도 간 섬유증 모델에서 생체내(B, C) LX2 세포의 활성화에 대한 AXI-I의 효과. A) AXI-I 치료는 TGFβ-활성화 LX2 세포에서 농도 증가에 따라 콜라겐-I의 발현을 저해한 반면에 스크램블된 펩티드(SAXI)는 비활성 상태로 있었다. B) 및 C) CCl4-유도 간 섬유증 모델에서 AXI-1(200 ㎍/kg/d) i.p. 주사 에 의해 처리하였더니 매질 대조군(C)에 비해 섬유 발생의 감소가 ITGA5 및 ITGA11(B)의 유전자 발현 감소로 나타났고(B), 근섬유 아세포의 표지자와 간에서 콜라겐-I과 III의 단백질 발현 감소가 나타났다. *p<0.05 평균+SEM.
도 9: 췌장암에서 ITGA5. A. 왼쪽 사진은 정상 인간 췌장에서 ITGA5의 면역 염색을 보여주고 오른쪽 사진은 췌장 종양에서 염색을 보여준다. 췌장 종양은 ITGA5의 강한 염색을 보이지만 정상 췌장은 염색을 보이지 않는다. B. a-SMA(근섬유 아세포에 대한 표지자)와 CD31 염색(내피 세포에 대한 표지자)과 함께 ITGA5의 국재화. 2중 염색 결과 ITGA5가 a-SMA와 완벽하게 일치하지만 CD31과는 약간 일치하는데, 이는 ITGA5가 근섬유 아세포에서 크게 발현됨을 의미한다.
도 10: 인간 피부 섬유아세포와 췌장 성상 세포에서 ITGA5 발현. A. 인간 피부 섬유아세포(BJhtert)는 TGF-β1로 8, 24, 48 시간 동안 활성화시킨 후 ITGA5의 발현 수준을 증가시켰다. B. TGFβ 또는 panc-1 종양세포 조절된 배지로 췌장 성상 세포를 활성화하였더니 24 시간 후 ITGA5 발현 수준을 유도하였다.
도 11: ITGA5에 대한 펩티드의 디자인. 'Protocol Multiwell Peptide Microarrays' of JPT Technologies, Berlin Germany, https://www.jpt.com/fileadmin/Multiwell-Peptide-Microarray_Protocol_Rev_1.0_V06.pdf 출처 사진.
도 12: 코팅한 α5β1 수용체 및 LX2 세포에 대한 펩티드의 결합. FITC-표지 nAV2: YYRITYGETGGN-K-PEG(6)-플루오레세인; nAV2: YYRITYGETGGN; AV3: RYYRITY. A. nAV2-FITC는 과량의 nAV2 펩티드에 의해 블로킹되고 과량의 AV3 펩티드로 훨씬 더 강하게 블로킹된 코팅 α5β1 수용체에 결합하였다. B. 녹색(FITC)으로 나타나 있는 LX2 세포(DAPI로 염색)에 대한 nAV2-FITC의 결합.
도 13: 필수 아미노산을 찾기 위한 펩티드 RYYRUTY의 알라닌 치환 분석. 굵고 밑줄 친 아미노산, 특히 Y3과 T6은 결합에 중요한 것으로 보인다.
도 14: A. AV3 펩티드의 항섬유화 효과. B. 시험관내 PSC 활성화에 대한 AV3-cys 펩티드 효과(농도 20 μM, 배율 20배). A. TGFβ에 의해 PSC를 활성화하였더니 이들 세포가 α-SMA 발현에 의해 나타낸 바와 같이 활성화되었다. AV3 펩티드로 처리한 결과, 20 μM에서 α-SMA 발현이 유의적으로 저해되었다. B. PSC를 TGFβ1와 함께 배양한 결과, 면역 염색에 의해 나타낸 바와 같이 α-SMA, Col-1a1과 비멘틴과 같은 섬유화 표지자의 발현이 증대되었다. AV3-cys 펩티드로 처리한 결과, 이들 생물 표지자의 발현이 분명하게 저해되었다. 이에 비해, 스크램블된 AV3-cys는 어떠한 저해 효과도 보이지 않았다.
도 15: 인간 섬유아세포의 이동에 대한 펩티드의 효과. 인간 피부 섬유아세포 BJhtert를 완전히 밀집되도록 성장시켜 찰상(창상)을 만들고 24 시간 후에 창상 봉합(섬유아세포의 이동)에 대한 펩티드의 효과를 측정하였다. A. AV3-cys는 섬유아세포의 이동을 유의적으로 저해하는 반면, 스크램블된 형태는 어떠한 효과도 나타내지 않음을 보여주고 있다. B. 섬유아세포의 이동에 대한 서로 다른 펩티드의 효과를 보여주고 있다. AV3.3만이 약 30%의 이동 감소를 보인 반면에 다른 형태는 거의 효과를 보이지 않았다.
도 16: 펩티드 AV3와 AXI-I의 특이성. α5β1 수용체와 α11β1 수용체 각각에 대한 형광 표지된 펩티드(AV3-PEG(6)-5FAM(A) 및 AXI-I-PEG(6)-FITC(B))의 결합 친화도를 조사하였다.
도 17: 인간 피부 섬유아세포의 활성화에 대한 AV3 펩티드의 농도 응답 효과.
도 18: AV3 펩티드를 이용한 종양 영상화. 800CW 염료로 표지한 AV3 펩티드의 분포를 보여주는 광학 사진(AV3-800CW). 인간 췌장 성상 세포와 함께 인간 췌장 종양세포(Panc-1)를 SCID 마우스의 옆구리에 주사하여 약 200mm3의 크기로 성장시켰다. 종양을 가지고 있는 마우스에서 AV3-800CW(1 nmol)를 단독으로(A) 또는 50배 과량의 미표지 AV3와 함께(B) 정맥내 주사하였다. 사진은 Pearl 촬상장치(LICOR)를 사용하여 포착하였다.
실시예
실시제 1
재료 및 방법
재료
New England Biolabs가 얻은 Peptide Phage Display Ph.D.12TM Library를 그대로 사용하였다. 대장균 ER2738 숙주 균주는 New England Biolabs로부터 구입하였다. 표적 단백질 rhIntegrin α11β1과 대조군 단백질 rhIntegrin α4/β1은 R&D systems로부터 구입하였다.
바이오패닝
ER2738 숙주 세포를 신선한 상태로 사용하기 위해 밤새 배양하였다. 코팅 완충액(0.1M NaHCO3) 중 표적 단백질 α11β1(50-100 ㎍/mL) 100 ㎕를 4℃의 96-웰 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음, 각 웰을 0.1 M NaHCO3(pH 8.6), 5 mg/mL BSA, 0.02% NaN3, 0.1 ㎍/mL 스트렙타비딘의 블로킹 완충액 300 μL로 37℃에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 다음, 블로킹된 웰을 0.1%-0.3% Tween-20을 함유한 PBST 중 2% 탈지유로 6회 세척하였다. 이후, 미리 분리한(pre-subtracted) 파아지를 웰로 옮기고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 웰을 PBST(0.1-0.3% Tween 20) 중 2% 우유로 10회 세척하였다. 결합 파아지를 산성 용출 완충액으로 용출시키고 1M Tris-HCl(pH 9.1)로 중화시켰다.
용출물의 적정
간단히, 용출물 1 ㎕를 100 ㎕의 LB 배지로 희석하고 연속 희석액을 준비했습니다. 먼저 희석액을 시험관에서 중간 대수증식기의(mid-log) 대장균 숙주 세포 200 μL와 혼합한 다음, 이 혼합물을 미리 가온시킨 3 mL의 Agarose Top(45℃)에 첨가하고, 신속히 볼텍싱하고, 미리 가온시킨 LB/IPTG/Xgal 플레이트에 부어 즉시 Agarose Top을 균일하게 도말하였다. 실온에서 약 5분간 냉각시킨 후, 플레이트를 뒤집은 다음 37℃에서 밤새 배양하였다. 마지막으로 플레이트를 검사하고 플레이트상의 블루 플라크(파아지 벡터를 보유한)의 수를 세었더니 플라크가 약 100개이었다. mL 당 pfu(플라그 형성 단위)는 각 숫자에 희석 인자를 곱하여 결정하였다.
용출물의 증폭
1차 또는 2차 스크리닝의 용출물 중 나머지는 20 mL의 ER2738 세포 배양물을 감염시키고 37℃에서 4.5 시간 동안 배양함으로써 증폭시켰다. 세포 상청액에 함유된 증폭 파아지는 1/6 부피의 PEG/NaCl을 첨가하여 침전시키고 4℃에서 밤새 배양하였다. 침전된 파아지를 LB/IPTG/X-gal 플레이트상에서 적정하고 다음 차수의 스크리닝을 위해 보존하였다.
파아지 ELISA 분석
각 클론에 대해 20 mL의 LB 배지에 ER2738을 접종하고 약간 혼탁해질 때까지 37℃에서 배양하였다. 파아지의 단일 플라크를 각 배양물에 접종한 다음 37℃에서 격렬하게 통기시키면서 4.5시간 동안 배양하였다. 배양물을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고 10,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액의 상층부 80%를 새로운 튜브로 옮기고 PEG/NaCl로 2회 침전시켰다. 다음, 얻어진 펠릿을 250 μL TBS에 현탁시켰다. 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅 완충액 중 1 ㎍/mL 표적 100 μL로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음, 플레이트를 세척 완충액(TBS 중 0.1% Tween)으로 1회 세척하였다. 모든 웰을 1-2 시간 동안 4℃에서 250 μL의 블로킹 완충액으로 블로킹하였다. 다음, 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 종이 수건 위에 두드려 과량의 완충액을 제거하였다. 이후, 웰 당 100 μL의 파아지 비리온(virion)을 첨가하였다. 경쟁적 파아지 ELISA에서 경쟁 항원을 세척 완충액 중에서 파아지와 혼합하고 웰에 첨가하여 교반하면서 1-2 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하였다. HRP-접합 항-M13 항체(GE healthcare, 블로킹 완충액 중 1:5000)를 각각의 웰에 첨가하고, 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 다음, 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 100 μL HRP 기질 용액(21 mL의 OPD 모액에 30% H2O2 36 μL를 새로 첨가한 50 mM 시트르산 나트륨 중 22 mg OPD(Sigma), pH 4.0)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10-60분 동안 배양하였다. 플레이트를 490 nm에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
시퀀싱을 위한 ssDNA 분리
단일 플라크는 2 mL ER2738 세포 배양물을 감염시키고 37℃에서 4.5 시간 동안 배양함으로써 증폭시켰다. 500 μL의 파아지 함유 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 200 μL PEG/NaCl을 첨가하여 혼합하였다. 튜브를 최고 속도로 10 분간 원심분리하고 상등액은 버렸다. 펠릿을 100 μL의 요오드화 완충액에 완전히 현탁시키고, 250 μL의 에탄올을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 다음, 튜브를 10분 동안 원심분리하고 상등액을 버렸다. 펠렛을 70% 에탄올에서 세척하고, 진공에 잠깐 건조시켰다. 펠렛을 30 μL TE 완충액에 현탁시키고 재현탁한 주형 5 μL를 DNA 시퀀싱용으로 사용하였다. 서열은 전문 소프트웨어(Vector NTI®, Version 10)로 해독하였다.
펩티드 및 펩티드-PEG-FITC의 합성
Chinapeptides, Shanghai, China에 의해 펩티드와 펩티드-PEG(6)-FITC를 >95%의 순도로 주문 합성하였다. 질량 분광분석법에 의해 펩티드 합성의 성공을 확인하였다.
ITGA11 수용체에 대한 펩티드의 결합
정제한 ITGA11 수용체(α11β1; 100 ㎍/ml - 모액; R&D systems)를 1xPBS로 5 ㎍/ml까지 희석하였다. 96-웰 ELISA White Maxisorb plate(Nunc)를 50 μL의 5 ㎍/ml ITGA11(또는 대조군으로서 α5β1) 수용체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음, 웰을 블로킹 완충액(5% BSA를 함유한 1xPBS) 200 μL로 3-4 시간 동안 블로킹하였다. 웰을 200 μL의 세척 완충액(0.5% BSA와 0.05% Tween20을 함유한 1xPBS)으로 3회 세척하였다. FITC를 접합한 펩티드를 세척 완충액에서 서로 다른 농도로 희석한 다음 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 또한 펩티드의 결합은 10배 더 많은 양의 미표지 펩티드와 함께 배양함으로써 블로킹하였다. 이어서, 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 다음, 1xPBS 100 μL를 첨가하고 플레이트를 형광 플레이트 리더로 485nm/520nm에서 판독하였다.
세포 결합 실험
인간 간 성상 세포(LX2, 15,000 세포/웰)를 permanentox Lab-Tek 8 웰 챔버 슬라이드(Nunc)에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양 후 세포를 0.5% BSA 함유 배지로 3회 세척한 다음, FITC-표지 펩티드(20 μM)를 첨가하고 간헐적으로 흔들어 주면서 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 다음, 세포를 0.5% BSA 함유 배지와 2xPBS로 3회 세척하였다. 그후, 세포를 4% 파라포름알데히드(1xPBS에서 제조)로 20 분 동안 고정시킨 후, 1xPBS로 3회 세척하였다. 다음, 세포를 DAPI(vector labs)가 있는 봉입제로 봉입하고 형광 현미경(Nikon E600)으로 영상화하였다. 팔로이딘 염색을 위해서 세포를 고정한 후 TRITC-접합 팔로이딘(0.1% 트리톤x100을 함유한 1xPBS에서 1:1000으로 준비)과 함께 10분 동안 배양하였다. 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고 DAPI-함유 봉입제로 봉입하였다.
CCl4-유도 간 섬유화 마우스 모델
모든 동물 실험은 위트레흐트 대학 윤리위원회의 승인을 받았다. Harlan(Zeist, 네덜란드)에서 얻은 C57/BL6 마우스(7-8 주령)를 충분한 사료와 물을 공급하면서 12/12 명암 주기에서 유지하였다. CCl4(올리브유에서 1.0 ml/kg 제조)를 4주(경증 섬유증)와 8주(진행성 섬유증) 동안 마우스에 복강내 투여하였다(주당 2 회). 마지막 투여한지 24시간 후에 동물을 희생시키고 각각의 간엽으로부터 단편을 잘라내고 에펜도르프 튜브에 수집하여 RNA 분리를 위해 액체 질소에서 급속 동결하였다. 정상 대조군 마우스에는 올리브유를 투여하였다.
간 섬유증에 대한 AXI-1 펩티드의 효과를 평가하기 위해서 0일에 1회 투여량의 CCl4(1 ml/kg)을 동물에 주입하였다. 이어서, 1일과 2일째에 펩티드(200 ㎍/kg/d, ip) 또는 매질(PBS)을 마우스에 주사하였다. 4일째, 마우스를 희생시키고 면역 조직 화학 분석과 유전자 발현 연구를 위해 간 시료를 처리하였다.
시험관내 유전자 발현 연구
간 성상 LX2 세포(80,000 세포/웰)를 12 웰 플레이트에 도말하고 37℃/5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음, 0.5% 혈청 함유 배지에서 세포를 밤새 기아 상태로 한 다음 24시간 동안 5 ng/ml TGFβ로 활성화시켰다. 이어서, 세포를 1xPBS로 세척하고 200 μL의 RNA 용해 완충액으로 용해시켰다. SV Total Isolation System(Promega)을 사용하여 총 RNA를 제작사 지침에 따라 분리하였다. UV 분광광도계(Nanodrop technologies)를 사용하여 RNA 농도를 정량화하였다. iScript cDNA 합성 키트(Biorad)를 사용하여 1 ㎍ RNA를 역전사시켰다. 2x SYBR green PCR master mix(Bioline)를 사용하여 20 ng cDNA로 실시간 PCR 반응을 제작사 지침에 따라 수행하고 Biorad CFX384 Real-Time PCR 검출 시스템에 의해 분석하였다. 마지막으로 임계 사이클(Ct)을 계산하고 상대적 유전자 발현을 하우스키핑 유전자로서 GAPDH(마우스의 경우)로 정규화하였다.
ITGA 11 인간 정방향: CAGCTCGCTGGAGAGATACG; 역방향: TTACAGGACGTGTTCGCCTC; GAPDH 인간 정방향: TCCAAAATCAAGTGGGGCGA; 역방향: TGATGACCCTTTGGCTCCC; a-sma 인간 정방향: GAACCCTGTGTCCTGCATCA; 역방향: TTGGAGTTCCACCTCGAAGC; ITGA11 마우스 정방향: TTGGGCTACTACAACCGCAG; 역방향: CTTGTTGGTGCCTTCCAAGC; GAPDH 마우스 정방향: ACAGTCCATGCCATCACTGC; 역방향: GATCCACGACGGACACATTG; α-sma 마우스 전달: ACTACTGCCGAGCGTGAGAT; Reverse: CCAATGAAAGATGGCTGGAA.
펩티드 마이크로 어레이에 대한 결합 연구
PEG 링커를 사용하여 펩티드의 N-말단을 유리 슬라이드에 접합시켜 펩티드 마이크로 어레이를 제조하였다. 인공물과 오류를 피하기 위해 각각의 펩티드를 서로 다른 위치에 3번 디스플레이하였다. 결합 연구를 위해서 펩티드 어레이를 TBST 중 3% BSA로 2시간 동안 블로킹하였다. 다음, 어레이 슬라이드를 TBST에서 5회 세척하고 이어서 37℃에서 1시간 동안 표적 수용체(α11β1, PBS에 용해된 10 ㎍/ml)와 함께 배양했다. 슬라이드를 TBST로 세척한 다음, ITGA11에 대한 1차 항체(1 ㎍/ml)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 슬라이드를 세척하고 형광 염료 표지된 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 슬라이드를 TBST와 물로 세척 한 다음, 건조시키고 마이크로어레이 스캐너로 스캐닝하여 펩티드의 결합을 검출하였다. 발광 반점을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 비특이적 결합을 결정하기 위해서 펩티드 어레이를 수용체 배양 단계없이 오직 1차 및 2차 항체와 함께 배양하였다. 다음, 비특이적 결합의 신호를 총 결합으로부터 차감하여 특이적 결합을 계산하였다.
인간 간경화 및 췌장암에서 ITGA의 발현
실시예 2에 기재한 바와 같이 면역조직화학염색을 수행하였다.
인간 췌장 성상 세포에 대한 AXI-PEG_FITC 결합
PSC는 트립신-EDTA 용액을 사용하여 트립신화하고 세포수를 4 × 104 세포/ml로 희석하였다. 수용체 회수가 가능하도록 세포를 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 다음, 2% FBS를 함유한 세포에 다양한 농도의 AXI-I-FITC를 첨가하고 4℃에서 60분간 배양했다. 이후, 세포를 4℃에서 1500 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 4℃에서 1시간 동안 0.5% 포름알데히드로 고정시키고 형광에 대한 유세포 계수법으로 측정하였다.
결과
간 성상 세포 및 간 섬유증에서 ITGA11 발현
본 발명자들은 간 섬유증에서 가장 중요한 세포 유형이고 세포외 기질 생성을 담당하는 간 성상 세포에서 ITGA11의 발현을 조사하였다. 본 발명자들은 TGFβ1로 성상 세포를 활성화하였더니 ITGA11 유전자 발현을 크게 증가시켰음을 발견하였다(도 1A). 이들 데이터는 성상 세포 활성화 표지자 α-SMA의 발현 수준 증가에 의해 확증되었다. 또한 본 발명자들은 마우스의 CCl4-유도 간 섬유증 모델에서 ITGA11의 발현을 조사하였다. 본 발명자들은 4주(경증 섬유증)와 8주(진행성 섬유증) 동안 CCl4 처리 후 섬유증이 진행함에 따라 ITGA11의 발현 수준이 크게 증대되었음을 발견했다(도 1B). 이 데이터는 ITGA11이 간 섬유증에 대해 중요한 생물표지자임을 의미한다. 방사성 동위원소 또는 조영제로 표지한 ITGA11에 대한 리간드의 도움으로 MRI, SPECT, PET, CT, 광음향 등과 같은 이미징 기술을 이용한 ITGA11의 검출은 간 섬유증 진단을 위해 또한 간 섬유증의 진행을 결정하기 위해 적용될 수 있다.
본 발명자들은 인간의 서로 다른 병적 증상에서 ITGA11의 발현을 측정하였다. 본 발명자들은 ITGA11이 간경변, 췌장 종양 간질과 신장 섬유증과 같은 검사한 모든 병적 증상의 섬유화 영역에서 강하게 발현된다는 것을 발견하였다(도 2). ITGA11 염색은 합성사진에서 주황색으로 나타나 있는 섬유아세포 표지자 a-SMA와 함께 잘 국재화되었다.
파아지-디스플레이 선택 펩티드:
α4β1 수용체로부터 분리된 후 α11β1 수용체에 결합된 파아지를 용출 및 증폭시켰다. 무작위로 40개의 클론을 골라 α11β1 및 α4β1 수용체에 대한 결합을 Phage ELISA 분석법을 이용하여 검사하였다(도 3). 클론 번호 11, 13, 14, 16, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31 및 38은 α4β1와 비코팅 웰에 비해 α11β1에 대한 높은 결합을 보였다. DNA 시퀀싱 데이터는 클론 번호 11, 13, 14, 16, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 28, 29, 30, 31 및 38이 결과적으로 단일 서열(5'-tctggtctgactgagtggttgaggtggtttaattcg-3') 또는 아미노산 서열(AXI-1: SGLTEWLRWFNS)로 나타난 반면에 클론 27은 결과적으로 DNA 서열(5 '-agattttgcgacgtggactccgaattttgagaggaat-3') 또는 아미노산 서열(AXI-II: SFATWTPNFERN)로 나타났다.
ITGA11에 대한 펩티드 결합
펩티드가 ITGA11 수용체에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하기 위해서 본 발명자들은 고정화된 인간 ITGA11(α11β1) 수용체에 FITC 표지된 AXI-1 펩티드를 결합시켰다. 본 발명자들은 10배가 넘는 미표지 펩티드에 의해 결합이 블로킹되었기 때문에 AXI-I-FITC가 ITGA11 수용체에 특이적으로 결합하였음을 발견하였다(도 4A). 또한 펩티드는 또 다른 인테그린 수용체(즉, α5β1)에 대해 비어있는 웰에 대한 결합과 유사하게 매우 낮은 결합을 보였다. β1 수용체는 α11β1과 α5β1 모두에서 보편적인 공수용체로서 펩티드가 α5β1에 결합하지 않지만 α11β1에 대해서는 결합이 높다는 것은 펩티드가 α11에 의해 바람직하게 결합된다는 것을 의미한다. 또한 본 발명자들은 마우스 α11β1 수용체에 대한 AXI-I의 결합을 조사하여 펩티드가 인간의 경우와 유사한 결합 친화력을 갖는다는 것을 발견한바, 이는 마우스와 인간 ITGA11 수용체 간 약 80%의 상동성에 기인한 것이다. 고정화된 수용체에 대한 결합을 확인한 후, 본 발명자들은 ITGA11-발현 간 성상 세포에 대한 펩티드의 결합을 조사하였다. 본 발명자들은 AXI-I와 AXI-II가 성상 세포에 결합하였지만 AXI-I의 결합이 AXI-II보다 명백하게 더 강하다는 것을 발견하였다(도 4B).
코팅된 α11β1 수용체에 대해 FITC로 표지한 ITGA11-결합 펩티드(AXI-1)의 결합 연구를 통해 펩티드가 수용체에 비어있는 웰에 비해 특이적으로 결합하였음을 알 수 있었다. 결합은 미표지 펩티드를 10배의 고농도로 첨가함으로써 경쟁적으로 블로킹되었는데, 이는 펩티드의 특이적 결합을 보여주는 것이다(도 5a). 또한 본 발명자들은 ITGA11 발현 LX2 세포에 대한 펩티드의 결합을 형광 현미경을 사용하여 확인하였다. 이들 세포에서 shRNA-ITGA11을 이용하여 ITGA11를 녹다운시킨 결과 형광 신호가 검출되지 않았기 때문에 펩티드 결합이 완전히 억제됨을 알 수 있었다(도 5B).
알라닌 스캐닝 및 펩티드 사슬 길이 스캔
펩티드 결합을 담당하는 아미노산 및 가장 효율적인 결합 펩티드를 찾기 위해서 알라닌 치환과 AXI-I 펩티드(SGLTEWLRWFNS)에 비해 짧은 펩티드를 사용하여 펩티드 마이크로 어레이를 개발하였다(도 7).
AXI-1 펩티드(SGLTEWLRWFNS)의 경우에 L3 또는 F10을 치환한 결과 α11β1 수용체에 결합하는 펩티드가 현저하게 감소한바, 이들 아미노산이 에피토프를 생성한다는 것을 암시한다. 펩티드 사슬을 짧게 했을 때 LTEWLRWF 펩티드가 수용체에 대해 가장 강한 결합을 유도하였음을 알 수 있었다. 대조군으로서, 펩티드 어레이를 α5β1에 노출시켜 LTEWLRWF 펩티드의 비특이적 결합을 확인하였다. 표 1은 ITGA11 결합 펩티드의 서열을 나타낸다.
ITGA11 결합 펩티드의 서열
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
S G L T E W L R W F N S
1 L T E W L R W F
2 G L T E W L R W F N S
3 G L T E W L R W F N
4 L T E W L R W F N S
5 S G L T E W L R W F N
6 S G L T E W A R W F N S
7 S G L T E W L R W F
8 S G L T E W L A W F N S
9 S G L T E W L R W F N S
10 S G L A E W L R W F N S
11 W L R W F N S
12 S A L T E W L R W F N S
13 S G L T E W L R W F A S
14 T E W L R W
15 S G L T E W L R W F N S
16 E W L R W F N S
17 S G L T A W L R W F N S
18 S G L T E W L R W F N A
19 S G L T E A L R W F N S
20 T E W L R W F N S
21 S G L T E W L R W
22 S G L T E W L R A F N S
23 A G L T E W L R W F N S
24 L R W F N S
인간 췌장 성상 세포에 대한 AXI-PEG_FITC 결합
서로 다른 농도의 AXI-I-PEG-FITC를 현탁된 PSC와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하고, 세척하고, 0.5% 포름알데히드로 고정시키고, 유세포 계수법으로 측정하였다. 그 결과는 PSC에 대한 AXI-I-PEG-FITC의 결합이 농도가 증가함에 따라 증가하고 20 mM 농도에서 정점에 도달함을 증명하고 있다(도 6). 전체 결합의 50%, 즉 해리상수(kd) 값은 1μM이었다. 펩티드가 PEG 사슬과 형광단에 의해 변형되었기 때문에 펩티드의 결합 친화도는 입체 장애로 인해 감소할 수 있다.
LX2 세포와 마우스의 CCl4-유도 간 섬유증 모델에 대한 시험관내 AXI-1 펩티드의 효과
본 발명자들은 LX2 세포에서 AXI-I 펩티드의 저해 효과를 조사하였다. TGFβ1에 의한 LX2 세포의 활성화는 콜라겐-I의 발현을 유도 하였다. 흥미로운 것은 AXI-1의 농도를 증가시키면서 처리하였더니 콜라겐-I의 발현이 저해되었다(도 8A). 이와 달리 스크램블된 펩티드는 콜라겐 염색에서 감소를 보이지 않았다.
또한 본 발명자들은 마우스의 CCl4-유도 간 섬유증 모델에서 AXI-1의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 200 ㎍/kg/d i.p.의 용량으로 AXI-I로 처리한 결과 매질 대조군에 비해 근섬유 아세포의 표지자인 ITGA5와 ITGA11의 유전자 발현 감소와 간에서 콜라겐-I 및 III 단백질 발현 감소가 의미하는 바와 같이 섬유 발생이 감소하였다(도 8B). 이들 데이터는 AXI-I이 서로 다른 투여량에서 최적화할 필요가 있는 항섬유성을 갖고 있음을 의미한다.
실시예 2
재료 및 방법
ITGA5 펩티드 선택
ITGA5에 대한 펩티드 모방체 결합을 선택하기 위해서 인간 피브로넥틴-III 도메인 9-10(Uniprot 번호 P02751)의 서열로부터 12개 아미노산 중첩 펩티드(8 중첩)를 점으로 세포막 상에 표시하였다(도 11). 펩티드는 안정한 링커를 사용하여 이들의 C-말단 부위에 부착시켰다. 안정성을 증진시키기 위해 또한 시스테인은 일반적으로 에피토프를 생성하지 않기 때문에 시스테인을 세린으로 바꿔주었다. 펩티드-표시 세포막을 1분 동안 메탄올에 담그고 TBS-완충 식염수(TBS)에서 헹구고 3번 세척하였다. 다음, 막을 실온에서 3시간 동안 0.05% tween-20 함유 TBS(TBST) 중 3% BSA로 블로킹하였다. 다음, 멤브레인을 TBST로 10분 동안 세척하고 실온에서 1 시간 및 이후 4℃에서 밤새 TBST 중 3% BSA에서 5 ㎍/ml α5β1 인간 재조합 단백질(R&D systems)과 함께 배양하였다. 이어서, 막을 TBST로 3회 세척하였다. 이후, 막에 결합된 수용체를 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 이를 위해 먼저 PVDF 멤브레인을 메탄올에 1분간 담근 다음, 5% 탈지유로 2시간 동안 블로킹하였다. 다음, 상기 멤브레인을 1차 항-알파5 인테그린 항체(Sigma-Aldrich)와 함께 5% 탈지유에서 밤새 배양하였다. 상기 멤브레인을 TBST로 3회 세척한 후 항토끼-HRP 2차 항체(Dako)와 함께 배양하고, 세척하고, 화학 발광 검출 키트로 현상하였다.
중첩 펩티드를 개발하기 위해 다음과 같은 피브로넥틴의 서열을 사용하였다.
인간 FNIII-9(Uniprot 번호 P02751)
GLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLT
NLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQST
마우스 FNIII-9(P11276)
AVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIELTNLLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYLVSVSSVYEQHESIPLRGRQKT
일부 인간 FNIII-10 서열.
TVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISI
코팅 수용체에 대한 펩티드 결합 연구
정제한 인간 재조합 α5β1 또는 α11β1 수용체(PBS 중 5 ㎍/ml)를 4℃에서 밤새 배양하여 96-웰 ELISA 플레이트(White Maxisorb -Nunc)에 코팅하였다. 다음, 실온에서 2시간 동안 블로킹 완충액(5% (w/v) BSA, 150 mM Nacl, 25 mM Tris)으로 웰을 블로킹하였다. 다음, 웰을 200 μL의 세척 완충액(150 mM Nacl, 25 mM Tris-base, 0.005% Tween20, 0.5% BSA)으로 3회 세척하였다. 이후, PEG(6)-FITC와 접합된 펩티드를 세척 완충액에서 서로 다른 농도로 희석시켰다. 경쟁적 연구를 위해서 웰을 10배 더 많은 양의 미표지 펩티드와 함께 공배양했다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 다음, 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하고 이어서 형광 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 플루오레세인 신호 Ex/Em 485 nm/520 nm에 대해 플레이트를 판독하였다.
펩티드 마이크로 어레이에 대한 결합 연구
PEG 링커를 사용하여 펩티드의 N-말단을 유리 슬라이드에 접합시켜 펩티드 마이크로 어레이를 제조하였다. 인공물과 오류를 피하기 위해 각각의 펩티드를 서로 다른 위치에 3번 디스플레이하였다. 결합 연구를 위해서 펩티드 어레이를 TBST 중 3% BSA로 2시간 동안 블로킹하였다. 다음, 어레이 슬라이드를 TBST에서 5회 세척하고 이어서 37℃에서 1시간 동안 표적 수용체(α5β1, PBS에 용해된 10 ㎍/ml)와 함께 배양했다. 슬라이드를 TBST로 세척한 다음, ITGA5에 대한 1차 항체(1 ㎍/ml)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 슬라이드를 세척하고 형광 염료 표지된 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 슬라이드를 TBST와 물로 세척한 다음, 건조시키고 마이크로 어레이 스캐너로 스캐닝하여 펩티드의 결합을 검출하였다. 발광 반점을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 비특이적 결합을 결정하기 위해서 펩티드 어레이를 수용체 배양 단계없이 오직 1차 및 2차 항체와 함께 배양하였다. 다음, 비특이적 결합의 신호를 총 결합으로부터 차감하여 특이적 결합을 계산하였다.
효과 연구
인간 1차 췌장 성상 세포(PSC)는 ScienCell(Carlsbad, CA)로부터 얻었고 상기 제조사가 제공한 페니실린/스트렙토마이신이 부가된 특정 배지에서 배양하였다. 세포는 9 계대 미만을 사용하였고 Poly-L-라이신-코팅 플레이트에 접종하였다.
PSC를 완전 배지에서 12 웰 플레이트(6 × 104 세포/웰, 유전자 발현용) 또는 24 웰 플레이트(염색용)에 접종하였다. 24시간 후, 무혈청 배지에서 세포를 기아 상태로 만든 다음 24시간 후 펩티드와 함께 또는 펩티드 없이 TGF-β1(5 ng/ml)을 첨가하였다.
배양한지 24시간 후, 세포를 용해 완충액으로 용해시키고 총 RNA를 GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep Kit를 사용하여 분리하였다. RNA 양은 NanoDrop® ND-1000 분광광도계(Wilmington, DE)로 측정하였다. 이어서, iScript™ cDNA Synthesis Kit(BioRad, Veenendaal, 네덜란드)로 cDNA를 합성하였다. 각각의 PCR 반응을 위해 10 ng cDNA를 사용하였다. 인간 αSMA 및 RPS18에 대한 실시간 qPCR 프라이머는 Sigma(네덜란드)로부터 구입하였다. 유전자 발현 수준은 하우스키핑 유전자 RPS18의 발현으로 정규화하였다.
면역 염색을 위해서 세포를 세척하고 아세톤-메탄올로 고정시키고 면역세포화학염색을 위해 처리하였다.
면역조직화학염색
인간 췌장 표본, 인간 간경화 및 신장 섬유증 표본은 Department of Pathology, Laboratory Pathology East Netherlands (LabPON, 엔스헤데, 네덜란드)로부터 얻었다. LabPON의 지역의료 윤리위원회으로부터 윤리 승인을 받았다. 시료를 마이크로톰(Leica Microsystems, 누스로흐, 독일)을 사용하여 2 μm 두께의 절편으로 절단하였다. 절편을 탈파라핀 처리한 다음 Dako 항원 회수 완충액에서 밤새 80℃에서 배양하여 항원을 노출시켰다. 내인성 과산화효소 활성은 메탄올에서 제조한 3% H2O2에 의해 블로킹하였다. 다음, 절편을 PBS로 세척하고, 1차 항체(항-ITGA11, 항-ITGA5 또는 항-SMA 또는 항-CD31)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다음, 절편을 실온에서 1시간 동안 양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합 2차 항체와 함께 배양하였다. 다음, 1시간 동안 Alexa488 또는 Alexa594-접합 3차 항체와 함께 배양한 후, 1xPBS로 3회 세척하였다. 핵은 DAIP 함유 봉입제(Sigma)에 의해 대조 염색하였다.
면역세포염색을 위해서 세포를 -20℃에서 30분 동안 아세톤-메탄올(1: 1)로 고정시킨 다음, 건조시키고 10분 동안 재수화하였다. 다음, 세포를 1차 항체와 함께 1시간 동안 배양한 다음, HRP-표지 2차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 이후, AEC(3-아미노-9-에틸카르바졸) 기질 키트(Life Technologies, 게이더스버그, MD)를 사용하여 20분 동안 과산화효소 활성을 전개시키고 핵은 헤마톡실린(Fluka Chemie, Buchs, 스위치)으로 대조 염색하였다. 세포를 Aquatex 봉입제(Merck, 다름스타트, 독일)로 봉입하였다. 염색을 영상화하고 광학 현미경(Nikon eclipse E600 microscope, Nikon, 도쿄, 일본)을 사용하여 사진을 촬영하였다.
결과
ITGA5 결합 펩티드의 선택
인테그린 α5인 ITGA5는 공지된 피브로넥틴(FN) 수용체이고 ITGA5에 대한 펩티드 리간드를 선택하기 위해서 인간 FN-III 도메인-9 및 10의 중첩 서열(8개 아미노산이 중첩된 12개 아미노산 길이)을 설계하고 세포막에 디스플레이하였다. 도킹 실험(Nagae et al, 2012 J. Cell Biol. 131- 140)으로 나타난 바와 같이 α5β1 수용체에 대한 결합을 담당하는 것으로 보고된 FN의 도메인 9와 10을 선택하여 펩티드를 디자인하였다. 인간 재조합 인테그린 α5β1 수용체에 대해 상호작용 연구를 수행하였고 결합 단백질을 다른 막으로 옮기고 항체를 이용하여 ITGA5를 검출하였다. 많은 서열들이 인간 및 마우스 도메인의 α5β1 수용체에 결합하는 것으로 보였고 다음과 같이 인간 FN-III 도메인 10의 2개의 서열에 의해 가장 강한 결합이 얻어졌다.
인간 FN-III 도메인 9로부터
서열 1. ITANSFTVHWIA - 약함
서열 2. VALNGREESPLL - 매우 약함
인간 FN-III 도메인 10으로부터
서열 3. TTVRYYRITYGE - 강함
서열 4. YYRITYGETGGN - 매우 강함
서열 5. GDSPASSKPISI - 보통
마우스 FN-III 도메인 9로부터
서열 6. SIELTNLLVRYS - 보통
서열 7. TNLLVRYSPVKN - 보통
YYRITYGETGGN 서열이 가장 강한 신호를 제공하였기 때문에 이 서열을 화학적으로 추가 합성한 다음, 코팅 α5β1 수용체에 대한 펩티드 결합 분석 중에 PEG(6)-플루오레세인을 그의 검출을 위해 펩티드의 N-말단측에 도입하였다. 그러나 놀랍게도 코팅 수용체에 대해 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. 세포막 상의 펩티드 어레이에서 펩티드는 C-말단을 통해 접합된 반면에 펩티드의 N-말단은 수용체와 자유로이 결합하였다. 그러나 합성 펩티드에서 PEG는 펩티드의 결합을 블로킹할 수 있는 N-말단에 접합되었다. 따라서 라이신기를 도입하여 PEG 결합을 가능하게 함으로써 PEG(6)-플루오레세인이 C-말단에 접합된 신규 펩티드(nAV2)를 합성하였다.
흥미로운 점은 nAV2가 코팅 수용체에 대해 양호한 결합을 보였다는 것이다(도 12A). 10배가 넘는 과량의 미표지 펩티드로 펩티드를 블로킹하여 nAV2-PEG(6) - 플루오레세인의 결합을 블로킹하였다. 또한 서열 3과 서열 4(위의 서열 참조)는 공통 아미노산으로서 "YYRITY"를 갖고 서열 4의 N-말단은 수용체에 대한 결합에 결정적이었기 때문에 새로운 짧은 펩티드(RYYRITY, AV3이라 함)를 설계하였다. nAV2-PEG-플루오레세인에 과량의 AV3를 첨가하여 수용체에 대한 그의 결합이 크게 블로킹되었는데, 이는 AV3가 수용체에 대해 더 높은 친화도를 가졌음을 알 수 있다. 따라서 추가 연구를 진행하기 위해 AV3를 선택하였다. 나아가 본 발명자들은 LX2 세포에 nAV2-FITC를 결합시켰고 이들 세포에 펩티드가 대조군 세포에 비해 분명하게 결합하였음을 발견하였다(도 12B).
알라닌 스캐닝 및 펩티드 사슬 길이 스캔
펩티드 결합을 담당하는 아미노산 및 가장 효율적인 결합 펩티드를 찾기 위해서 알라닌 치환과 더 짧은 펩티드를 사용하여 펩티드 마이크로 어레이를 개발하였다. 또한 서열 RYYRITYC(AV3-Cys)를 가진 펩티드를 개발하였다. AV3(RYYRITY)의 경우에 펩티드 마이크로 어레이를 항-α5와 이후 형광 염료 표지 2차 항체로 포획한 α5β1 수용체와 함께 배양하였다. 결합 결과를 통해 Y3의 치환은 결합 손실로 나타난 반면에 R1, R4와 Y7의 치환은 AV3 펩티드의 결합 감소로 나타난다는 것을 알 수 있다. T6의 치환은 배양 항체에 대한 펩티드의 비특이적 결합을 유도하였다(도 13). 표 2는 ITGA5 결합 펩티드의 서열을 나타낸다.
ITGA5 결합 펩티드의 서열
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
T T V R Y Y R I T Y G E T G G N
T T V R Y Y R I T Y G E
Y Y R I T Y G E T G G N
R Y Y R I T Y
A Y Y R I T Y
R A Y R I T Y
R Y Y A I T Y
R Y Y R A T Y
R Y Y R I T A
R Y Y R I T Y C
Y Y R I T Y G E T G G N K
R Y Y R I T Y G G G G L T E W L R W F
원발성 췌장 성상 세포(PSC)의 효과 연구
인간 피부 섬유아세포(BJhtert)를 TGFβ1로 활성화시켜 8, 24 및 48 시간에 ITGA5의 유전자 발현 수준이 유도되었다(도 10). 또한 TGFβ 또는 panc-1 종양세포 순화 배지로 췌장 성상 세포를 활성화시켜도 24시간 후 ITGA5 발현 수준을 유도 하였다.
피부 섬유아세포와 PSC에 대한 효과 연구
TGFβ에 의한 PSC의 활성화는 α-SMA 발현 증가에 의해 나타난 바와 같이 이들 세포의 활성화와 근섬유 아세포로의 분화로 이어졌다. 흥미로운 것은 AV3 펩티드로 처리하였더니 20 μM에서 α-SMA 발현을 유의적으로 저해한바, 이는 AV3 펩티드의 항섬유화 효과를 나타낸다(도 14A). 또한 TGFβ1와 함께 PSC를 배양하였더니 면역조직화학염색에 의해 나타낸 바와 같이 α-SMA, Col-1a1 및 비멘틴과 같은 섬유화 표지자의 발현을 증대시켰다. AV3-cys 펩티드 처리는 이들 생물 표지자의 발현을 명백하게 저해한바, AV3-cys 펩티드가 PSC의 활성화와 분화를 저해할 수 있음을 의미한다. 이에 비해, 스크램블된 AV3-cys는 어떠한 저해 효과도 나타내지 않았다(도 14B).
또한 본 발명자들은 인간 피부 섬유아세포의 이동에 대한 AV3와 그의 변이체의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 AV3-cys 펩티드가 섬유아세포의 이동을 유의 적으로 저해한 반면에 상기 펩티드의 스크램블된 형태는 어떠한 효과도 나타내지 않았음을 발견하였다(도 15A). 또한 섬유아세포의 이동에 대한 서로 다른 펩티드 형태의 효과를 시험하였다. 이동에 대해 AV3.3만이 약 30% 감소를 보인 반면에 다른 형태들은 거의 효과를 보이지 않았다(도 15B).
인간 췌장 표본의 면역조직화학염색
본 발명자들은 정상 췌장과 췌장 종양에서 ITGA5의 발현을 조사하였다. 본 발명자들은 정상 인간 췌장은 ITGA5의 염색을 전혀 보이지 않은 반면에 췌장 종양은 간질 영역에서 ITGA5의 강한 염색을 보였음을 발견하였다(도 9A). a-SMA(근섬유 아세포에 대한 표지자)와 CD31 염색(내피 세포에 대한 표지자)과 함께 ITGA5의 국재화 결과, ITGA5가 α-SMA와 완벽하게 일치하지만 CD31과는 약간 일치하는데, 이는 ITGA5가 근섬유 아세포와 종양 맥관 구조에서도 크게 발현됨을 의미한다(도 9B).
실시예 3
재료 및 방법
미소 규모의 열이동
형광 표지 펩티드(AV3-PEG(6)-5FAM 또는 AXI-I-PEG(6)-FITC)(1 μM)를 서로 다른 농도의 인간 재조합 수용체(즉, α5β1, α11β1 또는 αvβ3)와 함께 10분 동안 에펜도르프 튜브에서 배양하였다. 펩티드와 수용체의 혼합물을 NT.115™ 친수성 유리 모세관에 로딩하였다. 최선의 열이동 세팅을 찾기 위해서 낮은(20%), 중간(40%), 높은(80%) MST 출력에서 표적 수용체에 대한 펩티드의 결합을 조사하였고, 다른 모든 결합 실험은 동일한 MST 세팅을 사용하여 수행하였다. 마지막으로, 해리상수(Kd) 값은 3회 실험의 평균으로부터 계산되었다.
마우스에서 종양 이미징
모든 실험은 네덜란드법에 의거한 동물 윤리 규정에 따라 수행하였고 프로토콜은 지역 동물윤리위원회에 의해 승인되었다. 웅성 SCID 마우스(약 20 g)는 Charles River(독일)로부터 얻었다. 인간 췌장 성상 세포(PSC)와 함께 인간 췌장 종양세포(Panc-1)를 마우스의 옆구리에 주사하고 약 200 mm3의 크기로 종양을 성장시켰다. 800CW(AV3-800CW)(1 nmol)가 접합된 AV3 펩티드를 단독으로 또는 50배 과량의 미표지 AV3(블로킹제로서)와 함께 종양이 있는 마우스에 정맥내 주사하였다. 3시간째에 동물을 마취하여 Pearl optical 촬상장치(LICOR)로 스캐닝하여 펩티드의 분포를 조사하였다.
인간 피부 섬유아세포에 대한 AV3 펩티드의 효과
인간 피부 섬유아세포를 ScienCell(칼즈배드, CA)로부터 구입하여 2% FBS와 함께 페니실린과 스트렙토 마이신이 부가된 섬유아세포 배지(cat#2301, ScienCell)에서 배양하였다. 7 × 104 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 24시간 후에 배지를 무-FCS 배지로 교체한 다음, 인간 재조합 TGFβ(5 ng/ml)를 AV3 없이 또는 서로 다른 농도의 AV3(1, 5, 20 μM)와 스크램블된 AV3(sAV3; 5 및 20 μM) 펩티드와 함께 첨가하였다. 48시간 후, 세포를 용해 완충액으로 용해시키고 α-SMA과 β-액틴 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
결과
펩티드 AV3 및 AXI-I의 특이성
α5β1과 α11β1 수용체 각각에 대한 형광 표지된 펩티드(AV3-PEG(6)-5FAM과 AXI-I-PEG(6)-FITC)의 결합 친화도를 미소 규모의 열이동(MST)을 이용하여 조사하였다. MST에 의해 펩티드는 용액상에서 수용체와 상호작용할 수 있다. 이들 펩티드를 또한 인테그린 계열 αvβ3과 관련이 없는 수용체에 노출시켰고 MST 분석을 수행하였다.
AV3 펩티드는 α5β1에 대해 97.8 nM의 해리상수(Kd) 값을 갖는 반면에 αvβ3에 대한 Kd값은 36.1 μM임을 밝혀졌다(도 16A). 유사하게, α11β1에 대한 AXI-1 펩티드의 Kd값은 149 nM인(도 16B) 반면에 αvβ3에 대해서는 어떠한 결합도 보이지 않았다(그래프 미도시). 이들 데이터를 통해 AV3와 AXI-I이 각각의 인테그린 수용체에 대해 매우 특이적임을 알 수 있다.
인간 피부 섬유아세포에 대한 AV3 펩티드의 효과
AV3 없이 또는 서로 다른 농도의 AV3(1, 5, 20 μM)와 스크램블된 AV3(sAV3; 5 및 20 μM) 펩티드와 함께 인간 재조합 TGFβ(5 ng/ml)로 활성화한지 48시간 후에 섬유아세포의 활성화 및 분화에 대한 표지자인 α-SMA를 분석하였다.
AV3 펩티드는 섬유아세포 활성화를 농도 의존적으로 저해한는 반면에 sAV3는 어떠한 저해도 보이지 않았다(도 17). 이들 결과는 피부 반흔을 저해하는 AV3 펩티드의 치료 용도를 의미한다.
AV3 펩티드를 이용한 종양 영상화
인간 췌장 종양세포에서 800CW 염료(AV3-800CW)로 표지한 AV3 펩티드의 분포를 분석하였다. 인간 췌장 성상 세포(PSC)와 함께 인간 췌장 종양세포(Panc-1)를 SCID 마우스의 옆구리에 주사하여 약 200mm3의 크기로 성장시켰다. 종양을 가지고 있는 마우스에서 AV3-800CW(1 nmol)를 단독으로(도 18A) 또는 50배 과량의 미표지 AV3와 함께(도 18B) 정맥내 주사하였다.
사진은 AV3-800CW가 종양에 축적되는 반면에(도 18A의 화살표), 과량의 AV3로 블록킹하면 종양 내 축적이 특이적으로 블로킹됨을 보여준다.
<110> Universiteit Twente Jai Prakash <120> Integrin binding peptides and uses thereof <130> P108748PC00 <140> PCT/NL2016/050725 <141> 2016-10-21 <150> EP 15191256.5 <151> 2015-10-23 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 1 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 2 Ser Phe Ala Thr Trp Thr Pro Asn Phe Glu Arg Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 3 Thr Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disclaimed peptide <400> 4 Met Ser Leu Arg Trp Phe Asn Ser Gly Ser Val Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Pro 20 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 5 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 6 Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 7 Thr Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 8 Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 9 Thr Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 1 5 10 15 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 10 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin binding peptide <400> 11 Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Cys 1 5 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cagctcgctg gagagatacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttacaggacg tgttcgcctc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tccaaaatca agtggggcga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgatgaccct tttggctccc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaaccctgtg tcctgcatca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ttggagttcc acctcgaagc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttgggctact acaaccgcag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttgttggtg ccttccaagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acagtccatg ccatcactgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gatccacgac ggacacattg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 actactgccg agcgtgagat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccaatgaaag atggctggaa 20 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 24 Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe 1 5 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 25 Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 26 Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 27 Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 28 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 29 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Ala Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 30 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 31 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Ala Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 32 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 33 Ser Gly Leu Ala Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 34 Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 35 Ser Ala Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 36 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 37 Thr Glu Trp Leu Arg Trp 1 5 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 38 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 39 Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 40 Ser Gly Leu Thr Ala Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 41 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 42 Ser Gly Leu Thr Glu Ala Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 43 Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 44 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp 1 5 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 45 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Ala Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 46 Ala Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA11 binding peptide <400> 47 Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 48 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr 20 25 30 Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 35 40 45 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu 65 70 75 80 Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr 85 90 <210> 49 <211> 91 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp 1 5 10 15 Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Glu Leu Thr Asn 20 25 30 Leu Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu 35 40 45 Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Leu Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His 65 70 75 80 Glu Ser Ile Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr 85 90 <210> 50 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser 1 5 10 15 Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile 20 25 30 Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val 35 40 45 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 50 55 60 <210> 51 <211> 91 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp 1 5 10 15 Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Glu Leu Thr Asn 20 25 30 Leu Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu 35 40 45 Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Leu Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His 65 70 75 80 Glu Ser Ile Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr 85 90 <210> 52 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial Human FNIII-10 seq <400> 52 Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser 1 5 10 15 Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile 20 25 30 Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val 35 40 45 Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 50 55 60 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 53 Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 54 Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 55 Thr Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 56 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 57 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 58 Ser Ile Glu Leu Thr Asn Leu Leu Val Arg Tyr Ser 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 59 Thr Asn Leu Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn 1 5 10 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 60 Thr Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 1 5 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 61 Ala Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 62 Arg Ala Tyr Arg Ile Thr Tyr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 63 Arg Tyr Tyr Ala Ile Thr Tyr 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 64 Arg Tyr Tyr Arg Ala Thr Tyr 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 65 Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Ala 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 66 Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Cys 1 5 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 67 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Lys 1 5 10 <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA5 binding peptide <400> 68 Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Gly Leu Thr Glu Trp Leu 1 5 10 15 Arg Trp Phe <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 69 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 70 Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 71 Ser Gly Ala Thr Glu Trp Leu Arg Trp Phe Asn Ser 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 72 Ser Gly Ala Thr Glu Trp Leu Arg Trp Ala Asn Ser 1 5 10 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 73 Ser Gly Leu Thr Glu 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 74 Ser Gly Leu Thr Glu Trp Leu Arg 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> screened AXI-I variants <400> 75 Ser Gly Leu Thr Glu Trp 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RYYRITY variant with high unspecific binding <400> 76 Arg Tyr Tyr Arg Ile Ala Tyr 1 5

Claims (25)

  1. 5 내지 25개의 아미노산으로 이루어져 있고
    - 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS 또는
    - 적어도 상기 서열의 7-9번 위치의 아미노산을 포함하는 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
    - 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 5-12개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 갖되 아미노산의 최대 25%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된 상기 서열의 변이체를 포함하거나, 또는
    - 아미노산 서열 SFATWTPNFERN 또는 상기 서열의 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 아미노산 치환체를 갖되 아미노산의 최대 25%가 또 다른 아미노산에 의해 치환된 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 11(ITGA11) 결합 펩티드로서,
    단, 서열 MSLRWFNSGSVRPATTILFP로 이루어져 있지 않은 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ITGA11 결합 펩티드가 서열 SGLTEWLRWFNS의 5-12개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지거나, 또는 상기 ITGA11 결합 펩티드가 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체, 바람직하게는 하나의 치환체를 가진 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS로 이루어진 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열 SGLTEWLRWFNS의 상기 변이체가 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 하나 이하의 치환체를 가진 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITGA11 결합 펩티드가 표 1로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 1번 및/또는 12번 위치의 세린이 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 2번 위치의 글리신이 프롤린, 알라닌, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴과 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 4번 위치의 트레오닌이 세린, 아스파라긴, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 5번 위치의 글루탐산이 아스파르트산과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 6번 및/또는 9번 위치의 트립토판이 알라닌, 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 7번 위치의 류신이 알라닌, 발린, 이소류신과 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 8번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열 SGLTEWLRWFNS의 11번 위치의 아스파라긴이 트레오닌, 세린, 글루타민과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA11 저해 활성을 갖고, 바람직하게는 상기 저해 활성이 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포에 대한 α11β1 인테그린 및/또는 ITGA11의 결합 저해를 포함하는 펩티드.
  7. 6 내지 25개의 아미노산으로 이루어져 있고 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN을 포함하거나
    - 적어도 상기 서열의 5-10번 위치의 아미노산을 포함하는 6-16개의 연속해 있는 아미노산으로 이루어지고
    - 상기 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16번 위치의 아미노산으로부터 선택된 상기 6-16개의 연속해 있는 아미노산 중 아미노산이 또 다른 아미소산에 의해 치환된 3개 이하의 치환체를 가진 상기 서열의 변이체를 포함하는 단리된 또는 재조합 인테그린 알파 5(ITGA5) 결합 펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 서열 TTVRYYRITYGETGGN의 상기 변이체가 상기 서열의 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 위치의 아미노산으로부터 선택된 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 하나 이하의 치환체를 가진 펩티드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 ITGA5 결합 펩티드가 RYYRITY, RYYRITYC, TTVRYYRITYGE 및 YYRITYGETGGN으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    - 상기 서열의 4번 및/또는 7번 위치의 아르기닌이 라이신, 히스티딘과 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열의 5번 및/또는 10번 위치의 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환되고/또는
    - 상기 서열의 8번 위치의 이소류신이 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신과 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 또는 대응 비천연 아미노산에 의해 치환된 펩티드.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 α5β1 인테그린 및/또는 ITGA5 저해 활성을 갖고, 바람직하게는 상기 저해 활성이 섬유아세포, 성상 세포, 근섬유 아세포, 혈관 주위 세포 및/또는 기타 간엽 기원 세포에 대한 α5β1 인테그린 및/또는 ITGA5의 결합 저해를 포함하는 펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 2개의 펩티드를 포함하는 이량체 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이량체 펩티드의 2개의 펩티드 각각이 시스테인 잔기를 포함하는 이량체 펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드를 포함하는 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 추가 부분을 포함하는 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 부분이 표지, 링커, N-말단 변형, C-말단 변형 및/또는 내부 변형을 포함하는 화합물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 나노복합체, 폴리플렉스, 탄소나노튜브, 양자점, 마이크로캡슐, 리포솜, 미소구체, 하이드로겔, 폴리머, 마이셀, 덴드리머, 지질 복합체, 혈청 알부민, 항체, 항체 단편, 시클로덱스트린과 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 담체에 결합 또는 봉입된 상기 펩티드 또는 다량체 펩티드를 포함하는 화합물.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제19항에 따른 핵산 분자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 치료제, 예방제 또는 진단제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제18항에 따른 핵산 분자.
  21. 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제18항에 따른 핵산 분자.
  22. 섬유증 또는 섬유증 관련 장애, 염증성 질환 또는 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 제18항에 따른 핵산 분자 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  23. 조영제 또는 표적제로서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드의 용도.
  24. 인테그린 알파 5(ITGA5) 또는 인테그린 알파 11(ITGA11)을 발현하는 조직을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이량체 펩티드와 접촉시켜 상기 조직을 영상화하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조직이 α5β1 및/또는 α11β1 인테그린을 발현시키는 방법.
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