TW202334179A - 胜肽 - Google Patents

Abstract

本發明係關於胜肽及包含該胜肽之組成物。本發明之胜肽包含以下胺基酸序列：F-Nal1-V-V-N-V-Y-D-D-PeG-V-Nal1-Y-H-V-C-G(SEQ ID NO：2)；或者在上述胺基酸序列的選自由第2個、第4個、第7個、第8個、第9個、第10個、第12個、第13個、第14個、第15個及第17個胺基酸殘基所構成之群組之1-11個胺基酸殘基中，具有取代、附加、缺失或插入之胺基酸序列。

Description

胜肽

本發明係關於胜肽、包含該胜肽之組成物及該胜肽的利用。

TGF-β(轉形增殖因子：transforming growth factor β)為隸屬於TGF-β家族之細胞介素，具有許多機能。在TGF-β家族中，包含TGF-β的3種異型體(TGF-β1、β2及β3)或其他許多種訊息傳遞蛋白質。已知TGF-β具有影響細胞的增殖或分化的控制、膠原蛋白、纖維黏連蛋白等細胞外基質蛋白質的產生及沉積的促進等許多機能。已知經由TGF-β之訊息傳遞路徑參與例如癌細胞的增殖、轉移，或血管新生、免疫應答控制等(日本專利特表2021-100972)。因此，針對將作用於TGF-β的機能之物質，特定而言，阻礙或減弱TGF-β訊息傳遞之化合物，例如TGF-β拮抗劑應用於醫藥品，正謀求研究開發。此外，TGF-β訊息路徑對細胞的增殖/生存/分化具有重大影響，因而亦檢討將其用作供予培養基之添加劑。

作為具有TGF-β拮抗活性之物質，已知例如抗體(WO01/066140、WO2012/030394)或低分子(WO2015/ 103355)等，正研究使用該等之腎機能不全、心肌梗塞的治療藥等。此外，近年來，著眼於TGF-β所持有之腫瘤免疫抑制作用，亦研究免疫檢查點阻礙劑與TGF-β中和抗體之併用。

然而，針對具有TGF-β結合活性、TGF-β拮抗活性之胜肽，則尚未被報導。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 日本專利特表2021-100972 [專利文獻2] WO01/066140 [專利文獻3] WO2012/030394 [專利文獻4] WO2015/103355 [非專利文獻]

[非專利文獻1] Massague, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2012; 13(10). [非專利文獻2] Zhang et al., Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9(4).

[發明所欲解決之課題]

本發明者等人以創造出具有TGF-β結合活性，較佳為TGF-β拮抗活性之胜肽為目的而努力地致力研究之結果，想出本發明。本發明係提供胜肽、包含該胜肽之組成物及該胜肽的利用。 [解決課題之手段]

非限定地，本申請案包含以下發明。 [1] 一種胜肽，其包含以下胺基酸序列： F-Nal1-V-V-N-V-Y-D-D-PeG-V-Nal1-Y-H-V-C-G(SEQ ID NO：2)； 或者， 在上述胺基酸序列的選自由第2個、第4個、第7個、第8個、第9個、第10個、第12個、第13個、第14個、第15個及第17個胺基酸殘基所構成之群組之1-11個胺基酸殘基中，具有取代、附加、缺失或插入之胺基酸序列。 [2] 一種胜肽，其包含以下胺基酸序列： F-X1-V-X2-N-V-X3-X4-X5-X6-V-X7-X8-X9-X10-C (SEQ ID NO：1)， 其中， X1為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X2為任意的胺基酸； X3為任意的胺基酸； X4為任意的胺基酸； X5為任意的胺基酸； X6為在側鏈具有可經取代之烷基之胺基酸，或具有可經取代之烷基之二級胺基酸； X7為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X8為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X9為任意的胺基酸； X10為任意的胺基酸。 [3] 如[2]所記載之胜肽，其中，X1為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。 [4] 如[2]所記載之胜肽，其中，X1為Nal1、W6N、W7N或W。 [5] 如[2]-[4]中任一項所記載之胜肽，其中，X2為V、K、KCOpipzaa、KCOmeglumine或Q。 [6] 如[2]-[4]中任一項所記載之胜肽，其中，X2為V、K、KCOpipzaa或KCOmeglumine。 [7] 如[2]-[6]中任一項所記載之胜肽，其中，X3為Y、4Py、A、E、F4G、Q、K、F3G或3Py。 [8] 如[2]-[6]中任一項所記載之胜肽，其中，X3為Y或4Py。 [9] 如[2]-[8]中任一項所記載之胜肽，其中，X4為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。 [10] 如[2]-[8]中任一項所記載之胜肽，其中，X4為D、A、Q、K或E。 [11] 如[2]-[10]中任一項所記載之胜肽，其中，X5為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。 [12] 如[2]-[10]中任一項所記載之胜肽，其中，X5為D、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、A、Q或K。 [13] 如[2]-[12]中任一項所記載之胜肽，其中，X6為PeG、K或MeG。 [14] 如[2]-[13]中任一項所記載之胜肽，其中，X7為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。 [15] 如[2]-[13]中任一項所記載之胜肽，其中，X7為Nal1、W6N或W。 [16] 如[2]-[15]中任一項所記載之胜肽，其中，X8為Y、4Py、3Py或E。 [17] 如[2]-[15]中任一項所記載之胜肽，其中，X8為Y或4Py。 [18] 如[2]-[17]中任一項所記載之胜肽，其中，X9為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。 [19] 如[2]-[17]中任一項所記載之胜肽，其中，X9為H、A、Q或E。 [20] 如[2]-[19]中任一項所記載之胜肽，其中，X10為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。 [21] 如[2]-[19]中任一項所記載之胜肽，其中，X10為V、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、Q、K或A。 [22] 如[1]-[21]中任一項所記載之胜肽，其包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成： SEQ ID NO：2-33，或者 SEQ ID NO：2、4-13、15-33中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。 [23] 如[1]-[22]中任一項所記載之胜肽，其中，前述胜肽為環狀胜肽。 [24] 如[23]所記載之環狀胜肽，其具有經氯乙醯化之胺基酸與前述胜肽中所包含之半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。 [25] 如[1]-[24]中任一項所記載之胜肽，其進一步包含附加的胺基酸殘基。 [26] 如[1]-[21]、[23]-[25]中任一項所記載之胜肽，其中，在其C末端包含連結子。 [27] 如[1]-[26]中任一項所記載之胜肽，其具有TGF-β結合活性。 [28] 如[1]-[27]中任一項所記載之胜肽，其具有TGF-β拮抗活性。 [29] 一種醫療用、診斷用組成物，其包含如[1]-[28]中任一項所記載之胜肽。 [30] 一種研究用組成物，其包含如[1]-[28]中任一項所記載之胜肽，惟，排除使用作為供予用於培養類器官之培養基之添加劑之組成物。 [發明效果]

本發明之胜肽具有TGF-β結合活性，並且較佳為TGF-β拮抗活性。有用於作為癌症或肝疾患等的醫藥用組成物、診斷用組成物及研究用組成物等。

1.略語

在本說明書中，在沒有特別明確記載之前提下，以下略語係以下述意義使用。

(略語(一般)) Å：埃(單位)； ClAc：氯乙醯； DCM：二氯甲烷； DMSO：二甲基亞碸； DMF：二甲基甲醯胺； DIEA或DIPEA：N,N-二異丙基乙基胺； DIPCI：N,N’-二異丙基碳二亞胺； DODT：6-二氧雜-1,8-辛烷-二硫醇； Fmoc：9-茀基甲基氧基羰基； NHS：N-羥基琥珀酸醯亞胺； g：公克(單位)； HATU：O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽； HOSu：N-羥基琥珀醯亞胺； HPLC：高效液相層析； LC-MS或LC/MS：液相層析質量分析計； mL：毫升(單位)； M：體積莫耳濃度(單位)； μL：微升(單位)； mM：毫體積莫耳濃度(單位)； μM：微體積莫耳濃度(單位)； mg：毫克(單位)； MeCN：乙腈； mm：毫米(單位)； μm：微米(單位) nM：奈體積莫耳濃度(單位)； OSu：琥珀醯亞胺； PEG：聚乙二醇； rpm：每分鐘轉數(單位)； tBu：第三丁基； Mpe：甲基戊-3-基； Boc：第三丁氧基羰基； TFA：三氟醋酸； TIS：三異丙基矽烷； Trt或Tr：三苯甲基； TIPS：三異丙基矽烷基。

(略語(非天然胺基酸)) Nal1：1-萘基-L-丙胺酸(CAS No. 55516-54-6)； W6N：6-氮雜-L-色胺酸(CAS No. 149704-63-2)； W7N：L-7-氮雜色胺酸(CAS No. 49758-35-2)； KCOpipzaa：N6-(4-(羧基甲基)哌嗪-1-羰基)-L-離胺酸(CAS No. N/A)； KCOmeglumine：N6-(甲基((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)胺甲醯基)-L-離胺酸； 4Py：4-吡啶基-L-丙胺酸(CAS No. 37535-49-2)； PeG：苯乙基甘胺酸(CAS No. 7738-38-7)； F4G：對胍基-L-苯基丙胺酸(CAS No. 59574-11-7)； F3G：3-[(胺基亞胺基甲基)胺基]-L-苯基丙胺酸(CAS No. 1019057-42-1)； 3Py：3-(3-吡啶基)-L-丙胺酸(CAS No. 64090-98-8)； MeG：甲基甘胺酸(CAS No. 107-97-1)； PEG10c：1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十三烷-33-酸； MePEG8c：2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-酸； OCOmPEG10000：甲氧基聚乙二醇碳酸酯(平均分子量10,000)。 2.胜肽(A)

本發明係關於胜肽。

在一態樣中，本發明之胜肽為一種胜肽，其包含以下胺基酸序列： F-Nal1-V-V-N-V-Y-D-D-PeG-V-Nal1-Y-H-V-C-G(SEQ ID NO：2)； 或者， 在上述胺基酸序列的選自由第2個、第4個、第7個、第8個、第9個、第10個、第12個、第13個、第14個、第15個及第17個胺基酸殘基所構成之群組之1-11個胺基酸殘基中，具有取代、附加、缺失或插入之胺基酸序列。

SEQ ID NO：2為在本案說明書之實施例中，已確認具有TGF-β結合活性及TGF-β拮抗活性之胜肽。

在SEQ ID NO：2的胺基酸序列的選自由第2個、第4個、第7個、第8個、第9個、第10個、第12個、第13個、第14個、第15個及第17個胺基酸殘基所構成之群組之1-11個胺基酸殘基中，亦可具有取代、附加、缺失或插入。經胺基酸的取代、缺失、附加及/或插入之胺基酸的數量只要是1個以上且10個以下即可，其下限為1個。其上限為10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個，最小為1個。較佳為胺基酸的「取代」。該種胺基酸的取代較適合為保守性胺基酸取代。

所謂「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」，係意味與機能上等價或類似的胺基酸之取代。胜肽中之保守性胺基酸取代會對該胜肽的胺基酸序列帶來靜態變化。例如，具有同樣的極性之一個或二個以上胺基酸機能上等價地產生作用，對該種胜肽的胺基酸序列帶來靜態變化。一般而言，某一群組內之取代可被認為是針對結構及機能而言呈保守性。然而，如熟習該項技術者所顯而易見，特定的胺基酸殘基所扮演之角色可在包含該胺基酸之分子在三級結構中之含義上予以決定。例如，半胱胺酸殘基可採用相較於還原型的(硫醇)形式而言極性較低的氧化型的(二硫化物)形式。精胺酸側鏈的較長的脂肪族部分可構成結構及機能上重要的特徵。此外，包含芳香環之側鏈(色胺酸、酪胺酸、苯基丙胺酸)可有助於離子−芳香族相互作用或陽離子−pi相互作用。在該種情況，將具有此等側鏈之胺基酸與隸屬於酸性或非極性群組之胺基酸進行取代，在結構及機能上亦可呈保守性。脯胺酸、甘胺酸、半胱胺酸(二硫化物形式)等殘基有對主鏈的立體結構給予直接的效果之可能性，往往無法在不發生結構變形之情形下進行取代。

保守性胺基酸取代係如以下所示，包含基於側鏈的類似性之特異性取代(例如萊寧格，生化學，修訂第2版，1975年刊行，73至75頁：L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition, pp73-75，Worth Publisher, New York (1975)所記載之取代)及典型性取代。

此外，保守性胺基酸取代較佳為例如成為在如以下般將天然的胺基酸基於其共通的側鏈的性質進行區分而得之群組中，隸屬於與某一胺基酸所隸屬之群組相同的群組之胺基酸之取代。

疏水性(亦稱為非極性)胺基酸：顯示出疏水性(非極性)之胺基酸，包含丙胺酸(亦記為「Ala」或僅「A」)、甘胺酸(亦記為「Gly」或僅「G」)、纈胺酸(亦記為「Val」或僅「V」)、白胺酸(亦記為「Leu」或僅「L」)、異白胺酸(亦記為「Ile」或僅「I」)、脯胺酸(亦記為「Pro」或僅「P」)、苯基丙胺酸(亦記為「Phe」或僅「F」)、色胺酸(亦記為Trp」或僅「W」)、酪胺酸(亦記為「Tyr」或僅「Y」)、甲硫胺酸(亦記為「Met」或僅「M」)。

另外，疏水性胺基酸亦可進一步區分成以下群組。

脂肪族胺基酸：在側鏈具有脂肪酸或氫之胺基酸，包含Ala、Gly、Val、Ile、Leu。

脂肪族/分枝鏈胺基酸：在側鏈具有分枝型脂肪酸之胺基酸，包含Val、Ile、Leu。

芳香族胺基酸：在側鏈具有芳香環之胺基酸，包含Trp、Tyr、Phe。

親水性(亦稱為極性)胺基酸：顯示出親水性(極性)之胺基酸，包含絲胺酸(亦記為「Ser」或僅「S」)、蘇胺酸(亦記為「Thr」或僅「T」)、半胱胺酸(亦記為「Cys」或僅「C」)、天冬醯胺酸(亦記為「Asn」或僅「N」)、麩醯胺酸(亦記為「Gln」或僅「Q」)、天冬胺酸(亦記為「Asp」或僅「D」)、麩胺酸(亦記為「Glu」或僅「E」)、離胺酸(亦記為離胺酸。亦記為「Lys」或僅「K」)、精胺酸(亦記為「Arg」或僅「R」)、組胺酸(亦記為「His」或僅「H」)。

另外，親水性胺基酸亦可進一步區分成以下群組。

酸性胺基酸：側鏈顯示出酸性之胺基酸，包含Asp、Glu， 鹼性胺基酸：側鏈顯示出鹼性之胺基酸，包含Lys、Arg、His。

中性胺基酸：側鏈顯示出中性之胺基酸，包含Ser、Thr、Asn、Gln、Cys。

此外，針對Gly及Pro，亦可區分成「對主鏈的方向造成影響之胺基酸」，在側鏈包含硫分子之胺基酸，Cys及Met，亦可區分成「含硫胺基酸」。

此外，作為在側鏈具有芳香族之群組，包含Trp、Tyr、Phe。

在本說明書中，「胺基酸」不僅包含天然的胺基酸，亦包含非天然的胺基酸。在非天然的胺基酸中，包含例如上述所記載之天然的胺基酸經N-烷基化而得之N-烷基胺基酸、形成胜肽鍵之氮經分枝或未分枝之低級(例如C1-C5，較佳為C1-C3，更佳為C1)烷基修飾而得者。在N-烷基胺基酸中，較佳為N-乙基胺基酸、N-丁基胺基酸或N-甲基胺基酸，更佳為N-甲基胺基酸。此外，在非天然的胺基酸中，包含D型胺基酸(亦記為D-胺基酸)、β-胺基酸、γ-胺基酸、胺基酸變異體、胺基酸衍生物等經化學修飾之胺基酸、正白胺酸或鳥胺酸等在生物體內不會成為蛋白質的構成材料之胺基酸等。再者，包含在天然的胺基酸的側鏈進一步附加官能基或取代成另一官能基而得之胺基酸(例如在側鏈的伸芳基、伸烷基等部分具有取代或附加之胺基酸；側鏈的伸芳基、伸烷基或烷基的C數增加而得之胺基酸；在側鏈的芳香環具有取代之胺基酸；或具有側鏈中之羧酸官能基胺基酸經磺酸基取代而得之結構之胺基酸衍生物等經雜環化或縮合環化之胺基酸等)。

另外，藉由在天然的胺基酸的側鏈附加或取代官能基等結構等，便可賦予與天然的胺基酸不同的性質。即，在將天然的胺基酸基於其共通的側鏈的性質進行區分而得之前述群組中，可包含具有同樣的側鏈的性質之非天然胺基酸。依此，針對顯示出與某一胺基酸同樣的側鏈的性質之非天然胺基酸，亦可作為保守性胺基酸取代的對象包含在內。

非限定地，在非天然的胺基酸中，包含N-甲基胺基酸、4Py、Nal1、W6N、W7N、KCOpipzaa、KCOmeglumine、PeG等。 例如，Nal1、PeG可區分成疏水性胺基酸，4Py、W7N、W6N可區分成親水性胺基酸，再者，4Py、W7N、W6N亦可區分成鹼性胺基酸，4Py、Nal1、PeG、W6N、W7N亦可區分成芳香族胺基酸。另外，針對N-甲基胺基酸，亦可分類為N-烷基胺基酸，亦可依照未經N-甲基化之原本的胺基酸的側鏈的性質加以分類。

D-胺基酸亦可分類為D-胺基酸，亦可依照其側鏈的性質加以分類，針對N-甲基胺基酸，亦可分類為N-烷基胺基酸，亦可依照未經N-甲基化之原本的胺基酸的側鏈的性質加以分類。

非限定地，在一態樣中，前述胜肽為環狀胜肽。針對「環狀胜肽」，係在「3.胜肽(B)」中加以詳述。在本說明書中，「非限定地」、「在一態樣中」可同義地使用。

在一態樣中，前述胜肽係除了SEQ ID NO：2以外，亦可包含附加的胺基酸殘基。針對「附加的胺基酸殘基」，係在「3.胜肽(B)」中加以詳述。

在一態樣中，前述胜肽較佳亦可在C末端包含連結子。針對「連結子」，係在「3.胜肽(B)」中加以詳述。SEQ ID NO：2的C末端(第17個胺基酸殘基)的「G」為連結子。在一態樣中，前述胜肽亦可具有G以外之連結子，例如PEG連結子。或者，除了C末端的G以外，亦可進一步具有另一連結子。例如，亦包含富含甘胺酸之胜肽等態樣。

前述胜肽較佳係具有TGF-β結合活性，更佳為TGF-β1結合活性。前述胜肽較佳係具有TGF-β拮抗活性。針對「具有TGF-β1結合活性」、「具有TGF-β拮抗活性」，係在「3.胜肽(B)」中加以詳述。

本說明書中之「胜肽」在沒有特別提及之前提下，包含胜肽(A)及胜肽(B)兩者。 3.胜肽(B)

本發明係關於胜肽。

本發明之胜肽包含以下胺基酸序列： F-X1-V-X2-N-V-X3-X4-X5-X6-V-X7-X8-X9-X10-C(SEQ ID NO：1) 其中， X1為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X2為任意的胺基酸； X3為任意的胺基酸； X4為任意的胺基酸； X5為任意的胺基酸； X6為在側鏈具有可經取代之烷基之胺基酸，或具有可經取代之烷基之二級胺基酸； X7為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X8為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X9為任意的胺基酸； X10為任意的胺基酸。

所謂「在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸」，係在側鏈具有芳香環之胺基酸，例如具有苯基或吲哚環作為芳香環，其一部分的C等可取代成N等其他分子。芳香族環亦可為雜環。此外，亦可為例如酪胺酸的側鏈的羥基取代成其他官能基之胺基酸。在一態樣中，「在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸」較佳為在側鏈具有縮合環之胺基酸。例如，可為具有吲哚環或萘結構之胺基酸，再者，其一部分的C等可取代成N等其他分子。取代基並無特別限定，可在烷基、環烷基、羥基、鹵素等中任意地選擇。「在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸」包含例如酪胺酸、色胺酸、組胺酸、苯基丙胺酸等。非天然型胺基酸亦可為例如Nal1、W6N、W7N或W。

所謂「在側鏈具有可經取代之烷基之胺基酸」，係在側鏈具有烷基之胺基酸，例如離胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、白胺酸等，此等胺基酸的側鏈可經取代亦可未經取代之胺基酸。烷基可為鏈狀，亦可為環狀。所謂「具有可經取代之烷基之二級胺基酸」，係二級胺基酸，包含具有環狀或鏈狀結構之任意的天然或非天然的胺基酸。

在一態樣中，在「在側鏈具有可經取代之烷基之胺基酸」、「具有可經取代之烷基之二級胺基酸」的側鏈經取代之情況，取代基並無特別限定。在側鏈的烷基的末端亦可具有官能基。作為鍵結至末端之官能基，例如，非限定地，可列舉胺基或苄基等。

X1-X10的上述選項可以任意的組合進行選擇。

在一態樣中，X1為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。在一態樣中，X1為Nal1、W6N、W7N或W。

在一態樣中，X2為V、K、KCOpipzaa、KCOmeglumine或Q。在一態樣中，X2為V、K、KCOpipzaa或KCOmeglumine。在一態樣中，X2不為E。

在一態樣中，X3為Y、4Py、A、E、F4G、Q、K、F3G或3Py。在一態樣中，X3為Y或4Py。

在一態樣中，X4為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。「具有芳香族環之胺基酸」係例如為酪胺酸、色胺酸、組胺酸、苯基丙胺酸等。「含硫胺基酸」係例如為甲硫胺酸、半胱胺酸等。在一態樣中，X4為D、A、Q、K或E。在一態樣中，X4為D。

在一態樣中，X5為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。在一態樣中，X5為D、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、A、Q或K。在一態樣中，X5為D、E、KCOpipzaa或KCOmeglumine。

在一態樣中，X6為PeG、K或MeG。在一態樣中，X6為Peg。在一態樣中，X6不為A、N、Q、S(D體)、P(D體)。

在一態樣中，X7為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。在一態樣中，X7為Nal1、W6N或W。在一態樣中，X7為Nal1。在一態樣中，X7不為A、Q、K、E。

在一態樣中，X8為Y、4Py、3Py或E。在一態樣中，X8為Y或4Py。在一態樣中，X8不為A、Q、K、F3G、F4G。

在一態樣中，X9為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。「具有芳香族環之胺基酸」係例如為酪胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸等。「含硫胺基酸」係例如為甲硫胺酸、半胱胺酸等。在一態樣中，X9為H、A、Q或E。在一態樣中，X9為H。

在一態樣中，X10為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。「具有芳香族環之胺基酸」係例如為酪胺酸、色胺酸、組胺酸、苯基丙胺酸等。「含硫胺基酸」係例如為甲硫胺酸、半胱胺酸等。在一態樣中，X10為V、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、Q、K或A。在一態樣中，X10為V、E、KCOpipzaa或KCOmeglumine。

X1-X10的上述一態樣的選項可以任意的組合進行選擇。

在一態樣中，前述胜肽為環狀胜肽。「環狀胜肽」係指胜肽中之2個胺基酸進行鍵結，其全部或一部分成為環狀者。該2個胺基酸彼此的鍵結型式並無特別限定。藉由其中一胺基酸的羧基與另一胺基酸的胺基之間之醯胺鍵、其中一胺基酸的羧基與另一胺基酸的硫醇基之間之硫酯鍵、其中一胺基酸的硫醇基與另一胺基酸的硫醇基之間之二硫鍵、內醯胺環形成或大環化反應而形成環狀結構者，或具有套索肽(lasso peptide)狀結構者等亦含括在環狀胜肽中。惟，在該2個胺基酸彼此藉由醯胺鍵進行鍵結之情況，該醯胺鍵並不限於藉由其中一胺基酸的羧基與另一胺基酸的胺基進行鍵結所形成者，只要是就合成反應的結果而言藉由醯胺鍵進行鍵結即可。針對其他鍵結型式亦相同。較佳為後述經由氯乙醯化胺基酸與半胱胺酸殘基之鍵結所得之環狀化。

前述環狀胜肽只要其一部分形成環狀結構即可，亦可具有直鏈部。

胜肽一般而言會有在生物體內代謝安定性較差，此外，由於尺寸較大，因而難以穿透細胞膜之問題。對於該種課題，已採用使胜肽進行環狀化之方法。若將胜肽進行環狀化，則蛋白酶耐性提升，代謝安定性提升，此外，在構形變化上，限制亦加大，故暗示剛直性增大，膜穿透性或與標的蛋白質之親和性提升。

在一態樣中，前述胜肽具有經氯乙醯化之胺基酸與前述胜肽中所包含之半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。在一態樣中，前述胜肽具有N末端胺基酸(第1個胺基酸殘基)與前述胜肽中所包含之半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。在一態樣中，前述胜肽具有N末端胺基酸(第1個胺基酸殘基)與前述胜肽中所包含之第16個半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。在一態樣中，前述胜肽具有經氯乙醯化之N末端胺基酸(第1個胺基酸殘基)與前述胜肽中所包含之第16個半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。「氯乙醯化」亦可為經由其他鹵素之「鹵素乙醯化」。此外，「乙醯化」亦可為經由乙醯基以外之醯基之「醯化」。

在本說明書中，為了胜肽的環狀化，有時會改變胺基酸的一部分。該種經一部分的改變之胺基酸亦含括在內。例如，如上述，有時會對位於N末端之胺基酸附加氯乙醯基，與胜肽中之半胱胺酸殘基進行鍵結，加以環狀化，此種經附加氯乙醯基之各種(天然/非天然)胺基酸亦含括在本案之胺基酸中。

在一態樣中，前述胜肽包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成： SEQ ID NO：2-33，或者 SEQ ID NO：2、4-13、15-33中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。

在一態樣中，前述胜肽為環狀胜肽，其包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成： SEQ ID NO：2-33，或者 SEQ ID NO：2、4-13、15-33中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。

在一態樣中，前述胜肽包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成：SEQ ID NO：34-69，或者SEQ ID NO：34-69中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。

在一態樣中，前述胜肽為環狀胜肽，其包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成：SEQ ID NO：34-69，或者SEQ ID NO：34-69中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。

前述胜肽係除了SEQ ID NO：2-33，或者SEQ ID NO：2、4-13、15-33中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列中之任一者以外，亦可包含附加的胺基酸殘基。前述胜肽係除了SEQ ID NO：34-69，或者SEQ ID NO：34-69中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列中之任1種胺基酸序列中之任一者以外，亦可包含附加的胺基酸殘基。

附加的胺基酸殘基可包含在構成環狀結構之胜肽中，亦可從該環狀胜肽進一步以連結子狀附加胺基酸殘基。胜肽、胜肽部位的醯胺鍵的數量(胺基酸的數量/長度)並無特別限定。總胺基酸殘基(係指構成環狀結構之胜肽中所包含之胺基酸殘基數，在從該環狀胜肽進一步以連結子狀附加胺基酸殘基之情況，該等胺基酸不包含在內)較佳為22個殘基以內。較佳係胺基酸為6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上，較佳係胺基酸為20個以下、19個以下、18個以下。更佳係胺基酸為15個以上且18個以下，最佳係胺基酸為16個或17個。

此外，亦可從環狀胜肽進一步附加連結子。作為連結子，可列舉例如前述胺基酸連結子(胜肽連結子)、化學連結子、脂肪酸連結子、核酸連結子、醣鏈連結子等，此外，亦可為例如化學連結子與胜肽連結子等之複合體。作為化學連結子，係例如為PEG (Polyethyleneglycol)連結子。可為例如由1～24個乙二醇單元所構成之PEG連結子。此外，連結子亦可為包含衍生自脂肪酸之二價化學部分之脂肪酸連結子。胺基酸(胜肽)連結子為包含至少1個胺基酸之連結子，例如，可使用如美國專利第7,271,149號所記載之具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(式中，n為1、2、3、4、5或6)之胜肽等富含甘胺酸之胜肽，或美國專利第5,525,491號所記載之富含絲胺酸之胜肽連結子。非限定地，胜肽的物性(例如溶解度)有時會因附加連結子而發生變化。

針對連結子的附加位置，附加至任何處皆可。例如，可鍵結至位於C末端側之Cys，亦可鍵結至環狀胜肽中所包含之胺基酸。較佳係鍵結至位於C末端側之Cys，或鍵結至環狀胜肽中所包含之胺基酸的側鏈。在一態樣中，連結子係包含在C末端中。

連結子的附加可為單獨的，或者，亦可附加複數個同種或不同的連結子。例如，可為Gly-Lys作為胺基酸連結子進行鍵結，再者，PEG連結子鍵結至Lys的側鏈末端之形式。

再者，前述胜肽亦可經由連結子等形成多聚體。在此情況，前述胜肽可為由具有相同的序列之胜肽所構成之均聚物，亦可為由具有另一序列之胜肽所構成之異聚物。

SEQ ID NO：2、4-13、15-33的C末端的甘胺酸(G)為連結子。針對SEQ ID NO：2的胜肽，與上述同樣地，在一態樣中，前述胜肽亦可具有G以外之連結子。或者，除了C末端的G以外，亦可進一步具有另一連結子。

在一態樣中，較佳係前述胜肽具有TGF-β結合活性，更佳係具有TGF-β1結合活性或TGF-β2結合活性。

在一態樣中，較佳係前述胜肽具有TGF-β1結合活性及TGF-β2結合活性。

在一態樣中，較佳係前述胜肽具有TGF-β拮抗活性，更佳係具有TGF-β1拮抗活性或TGF-β2拮抗活性。再者，在一態樣中，較佳係具有TGF-β拮抗活性之胜肽具有TGF-β1結合活性。另外，所謂「具有TGF-β1結合活性」，並不限於僅對TGF-β1之結合活性，亦可對TGF-β2具有結合性。

在一態樣中，較佳係前述胜肽具有TGF-β1拮抗活性及TGF-β2拮抗活性。此外，較佳係具有TGF-β1拮抗活性及TGF-β2拮抗活性之胜肽具有TGF-β1結合活性及TGF-β2結合活性。

TGF-β(轉形增殖因子：transforming growth factor β)為隸屬於TGF-β家族之細胞介素，在哺乳動物中存在3種異型體(TGF-β1、-β2、-β3)。再者，在結構上類似的TGF-β超家族中，包含活化素、BMP(骨形成誘導因子)等。

成為本發明之態樣之「TGF-β」為TGF-β1及/或TGF-β2，較佳為TGF-β1。在本說明書中，所謂「TGF-β」，在沒有特別明確記載之情況，係指TGF-β1。

TGF-β係鍵結至由I型及II型受體次單元所構成之絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體，經由Smad的磷酸化傳遞訊息而在生物體中引起各式各樣的反應。已知具有例如影響細胞的增殖或分化的控制、膠原蛋白、纖維黏連蛋白等細胞外基質蛋白質的產生及沉積的促進等許多機能(Massague, 2012; Zhang et al., 2017)。

非限定地，TGF-β包含哺乳動物，例如人類及黑猩猩等靈長類、大鼠、小鼠及兔等實驗動物、豬、牛、馬、綿羊及山羊等家畜動物以及犬及貓等玩賞動物的TGF-β，較佳為人類的TGF-β，更佳為人類TGF-β1(NCBI GENE ID：7040)、人類TGF-β2(NCBI GENE ID：7042)。

所謂「TGF-β1結合活性」，係意味特異性結合至TGF-β1之活性，或特異性結合至TGF-β1及TGF-β2兩者之活性。

非限定地，本發明之胜肽對TGF-β1之結合狀態可以親和性常數Ka、解離常數Kd(亦記為KD)、結合速度常數kon及解離速度常數koff等為指標來表示。

親和性常數Ka及解離常數Kd為表示處於平衡狀態之2個分子間之結合親和性，即結合的強度之指標，解離常數Kd為親和性常數Ka的倒數。又，解離常數Kd的值越小，係意味結合越強。另一方面，處於平衡狀態之2個分子間之結合/解離反應的速度係以由化學動力學解析所求出之結合速度常數kon及解離速度常數koff來表示，Kd=koff/kon。從而，即便在顯示出同等的解離常數Kd之情況，亦有緩慢地締合但緩慢地解離之情形(kon及koff的值均較小)，及迅速地締合且迅速地解離之情形(kon及koff的值均較大)，各結合保持狀態完全不同。

表示前述胜肽對TGF-β之結合狀態之此等親和性常數Ka、解離常數Kd(亦記為KD)、結合速度常數kon及解離速度常數koff等可由熟習該項技術者使用周知的任意分子間相互作用測定法予以決定。

前述胜肽對TGF-β之結合狀態可藉由公知的方法予以測定。例如，可藉由表面電漿共振光譜解析(SPR)予以測定。非限定地，表面電漿共振光譜解析可使用例如屬於生物感測器(生物體分子間相互解析裝置)之BIACORE系統(BIACORE公司)施行。

作為前述胜肽的TGF-β結合活性的指標之一，有Kd解離常數。解離常數Kd越低，結合活性(親和性)越高。根據表面電漿共振光譜解析，非限定地，關於前述胜肽與例如人類TGF-β之結合之解離常數Kd為50nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下、10nM以下、8nM以下、6nM以下、5nM以下。前述胜肽與人類TGF-β之結合的解離常數Kd的下限並無特別限定。非限定地，前述胜肽解離常數Kd為0.01nM以上、0.05nM以上、0.1nM以上、0.2nM以上、0.3nM以上、0.4nM以上、0.5nM以上。非限定地，前述胜肽的解離常數Kd為0.01-50nM，較佳為0.05-30nM，更佳為0.2-15nM，特佳為0.3-10nM，最佳為0.4-6nM。

前述胜肽對TGF-β之結合亦能夠藉由例如ELISA(酵素結合免疫吸附法)予以調查。ELISA亦可藉由例如使用TGF-β1珠粒及在C末端附加HA標籤序列而得之胜肽調查結合活性而施行。

非限定地，前述胜肽與TGF-β之結合較佳為非共價結合。

在一態樣中，前述胜肽具有實施例1-6的化學式所示之環狀結構。

「TGF-β拮抗活性」係指阻礙或減弱TGF-β鍵結至TGFβ受體並進行作用之活性。在本發明中，特定而言，較佳為藉由鍵結至TGF-β而發揮拮抗作用者。

「TGF-β拮抗活性」亦可藉由例如使用SBE報導子-HEK293細胞系(BP Bioscience)之SBE報導子檢驗予以評估。非限定地，可將TGF-β所誘導出之訊息的最大值設為0%阻礙，將無刺激設為100%阻礙而算出胜肽的阻礙活性。非限定地，在使用適切的濃度，例如最適濃度的胜肽之情況，阻礙活性係阻礙5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上。 4.胜肽的製造

本發明之胜肽可藉由例如如以下之用於製造胜肽之任意公知的方法予以製造。 液相法、固相法、將液相法與固相法進行組合而得之混成法等化學合成法； 基因重組法等

固相法係例如使具有羥基之樹脂的羥基與α-胺基經保護基所保護之第一胺基酸(通常為目標胜肽的C末端胺基酸)的羧基進行酯化反應。作為酯化觸媒，可使用1-均三甲苯磺醯基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)等公知的脫水縮合劑。

其次，使第一胺基酸的α-胺基的保護基進行脫水，同時加入主鏈的羧基以外之所有的官能基經保護之第二胺基酸，使該羧基進行活化，而使第一及第二胺基酸進行鍵結。再者，將第二胺基酸的α-胺基進行脫保護，加入主鏈的羧基以外之所有的官能基經保護之第三胺基酸，使該羧基進行活化，而使第二及第三胺基酸進行鍵結。重複進行此操作，合成目標長度的胜肽之後，將所有的官能基進行脫保護。

作為固相合成的樹脂，可列舉例如Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin(Merck公司)、HMPA-PEGA resin(Merck公司)等。此等樹脂可經溶劑(二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等)洗淨之後再使用。

作為α-胺基的保護基，可列舉例如苄基氧基羰(Cbz或Z)基、第三丁氧基羰(Boc)基、茀基甲氧基羰(Fmoc)基、苄基、烯丙基、烯丙基氧基羰(Alloc)基等。Cbz基可藉由氫氟酸、氫化等進行脫保護，Boc基可藉由三氟醋酸(TFA)進行脫保護，Fmoc基可藉由經由哌啶或吡咯啶之處理進行脫保護。

α-羧基的保護可使用例如甲酯、乙酯、烯丙酯、苄酯、第三丁酯、環己酯等。

羧基的活化可使用縮合劑施行。作為縮合劑，可列舉例如二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC或WSC)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)參(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-[雙(二甲基胺基)甲基]-1H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸鹽(HBTU)等。

胜肽鏈從樹脂之切斷可藉由以TFA、氫氟酸(HF)等酸進行處理而施行。

經由基因重組法(轉譯合成系統)之胜肽的製造可使用編碼出前述胜肽之核酸施行。編碼出前述胜肽之核酸可為DNA，亦可為RNA。

編碼出前述胜肽之核酸可藉由公知的方法或以其為準之方法予以調製。例如，可藉由自動合成裝置予以合成。為了將所獲得之DNA插入載體中，亦可加入限制酵素識別部位。或者，亦可組入編碼出用於將所得胜肽鏈以酵素等切出之胺基酸序列之鹼基序列。

如上述，在使前述胜肽與膜穿透性胜肽等進行融合之情況，前述核酸亦包含編碼出膜穿透性胜肽之核酸。

為了抑制源自宿主之蛋白酶所引發之分解，亦可使用使目標胜肽以與其他胜肽之嵌合胜肽之形式進行表現之嵌合蛋白質表現法。在此情況，作為前述核酸，係使用編碼出目標胜肽及與其進行結合之胜肽之核酸。

繼而，使用編碼出該胜肽之核酸調製表現載體。核酸可依原樣，或以限制酵素進行消化，或附加連結子等，插入至表現載體的啟動子的下游。作為載體，可列舉例如源自大腸菌之質體(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等)、源自枯草菌之質體(pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等)、源自酵母之質體(pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等)、噬菌體(e噬菌體、M13噬菌體等)、病毒(反轉錄病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、花椰菜鑲嵌病毒、菸草鑲嵌病毒、桿狀病毒等)、黏質體等。

啟動子可因應宿主的種類而適宜選擇。在宿主為動物細胞之情況，可使用例如源自SV40(simian virus 40)之啟動子、源自CMV(cytomegalovirus)之啟動子。在宿主為大腸菌之情況，可使用trp啟動子、T7啟動子、lac啟動子等。

在表現載體中，亦可組入例如編碼出DNA複製起始點(ori)、選擇標記(抗生物質抵抗性、營養要求性等)、增強子、剪接訊息、聚A附加訊息、標籤(FLAG、HA、GST、GFP等)之核酸等。

其次，以前述表現載體將適當的宿主細胞進行轉形。宿主可依與載體之關係而適宜選擇。作為宿主，係使用例如大腸菌、枯草菌、芽孢桿菌屬菌、酵母、昆蟲或昆蟲細胞、動物細胞等。作為動物細胞，可使用例如HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、HeLa細胞、Vero細胞。轉形可因應宿主的種類，依照脂轉染法、磷酸鈣法、電穿孔法、顯微注射法、顆粒槍法等公知的方法施行。藉由將轉形體依照常法進行培養，目標胜肽便進行表現。

胜肽從轉形體的培養物中之精製係將培養細胞進行回收，懸浮於適當的緩衝液中之後再藉由超音波處理、凍結融解等方法破壞細胞，藉由離心分離或過濾獲得粗萃取液。在胜肽被分泌至培養液中之情況，係將上清液進行回收。

從粗萃取液或培養上清液之精製亦可藉由公知的方法或以其為準之方法(例如鹽析、透析法、超過濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGE法、離子交換層析、親和層析、逆相高效液相層析等)施行。

所獲得之胜肽亦可藉由公知的方法或以其為準之方法從游離體轉換成鹽，或從鹽轉換成游離體。

在一態樣中，轉譯合成系統亦可設為無細胞轉譯系統。根據無細胞轉譯系統，一般而言，可在未進行精製之情形下以純度較高的形式獲得表現產物。無細胞轉譯系統包含例如核糖體蛋白質、胺基醯基tRNA合成酵素(ARS)、核糖體RNA、胺基酸、rRNA、GTP、ATP、轉譯起始因子(IF)、伸長因子(EF)、終結因子(RF)及核糖體再生因子(RRF)以及轉譯所需之其他因子。為了提高表現效率，亦可加入大腸菌萃取液或小麥胚芽萃取液。除此以外，亦可加入兔紅血球萃取液或昆蟲細胞萃取液。

在包含此等之系統中，藉由使用透析連續地供給能量，便可非限定地生產數100μg至數mg/mL的蛋白質。為了一併施行從基因DNA之轉錄，亦可設為包含RNA聚合酶之系統。作為市售的無細胞轉譯系統，就源自大腸菌之系統而言，可使用Roche Diagnostics公司的RTS-100(註冊商標)、GeneFrontier公司的PURESYSTEM或NEW ENGLAND Biolabs公司的PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit等，就使用小麥胚芽萃取液之系統而言，可使用ZoeGene公司或CellFree Sciences公司之物等。

在細胞轉譯系統中，亦可使用將所期望的胺基酸或羥基酸與tRNA進行連結(醯化)而得之人工的胺基醯基tRNA來代替由天然的胺基醯基tRNA合成酵素所合成之胺基醯基tRNA。該種胺基醯基tRNA可使用人工的核酶予以合成。

作為該種核酶，可列舉彈性酶(flexizyme) (H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003)、Chemistry & Biology, Vol.10, 655-662；及WO2007/066627等)。彈性酶亦以原型彈性酶(Fx)及由此加以改變而得之二硝基苄基彈性酶(dFx)、增強型彈性酶(eFx)、胺基彈性酶(aFx)等稱呼為人所知。

藉由使用由彈性酶所生成之連結有所期望的胺基酸或羥基酸之tRNA，便可將所期望的密碼子與所期望的胺基酸或羥基酸賦予關聯並進行轉譯。作為所期望的胺基酸，亦可使用特殊胺基酸。例如，上述之環狀化所需之非天然胺基酸亦可藉由此方法導入結合胜肽中。

前述胜肽的化學合成可使用例如包含階段性固相合成、歷經構象上可支援之再接合之胜肽片段的半合成、化學接合之各式各樣該技術領域中泛用之方法予以合成。前述胜肽的合成係例如為如K. J. Jensen, P. T. Shelton, S. L. Pedersen, Peptide Synthesis and Applications, 2nd Edition, Springer, 2013等所記載之使用多種固相技術之化學合成。作為較佳的策略，係基於能夠暫時保護α-胺基及經由鹼選擇性去除之Fmoc基，與暫時保護側鏈官能基且在脫Fmoc條件下安定的保護基之組合。該種一般的胜肽側鏈的選擇在前述Peptide Synthesis and Applications，第2版或G. B. Fields, R. L. Noble, Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 1990, 161-214等中已為人所知，作為較佳的胜肽側鏈保護基，係例如有針對於絲胺酸或蘇胺酸的羥基之苄基或第三丁基及三苯甲(Trt)基、針對於酪胺酸的羥基之2-溴苄基氧基羰基或第三丁基、針對於離胺酸側鏈的胺基之Boc基、甲基四唑硫醇(Mtt)基、Alloc基及ivDde基、針對於組胺酸的咪唑基之Trt基或Boc基、針對於精胺酸的胍基之2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯(Pbf)基、針對於以麩胺酸或天冬胺酸為首之羧基之第三丁基、烯丙基及3-甲基戊(Mpe)基、針對於麩醯胺酸或天冬醯胺酸的羧醯胺基之Trt基，此外，針對於半胱胺酸的硫醇基之Trt基及單甲氧基三苯甲(Mmt)基。

前述胜肽可於前述之固相樹脂上在階段性方法中予以合成。所使用之C末端胺基酸及使用於合成之所有的胺基酸或胜肽必須在合成過程中選擇性地去除α-胺基保護基。較佳係使用前述固相樹脂，藉由適切的試劑將N末端經Fmoc等適切地保護之胜肽的C末端羧基或經Fmoc保護之胺基酸的C末端羧基形成活化酯之後，藉由附加至固相樹脂上之胺基而開始。接續之胜肽鏈的伸長能夠依照目標胜肽的胺基酸序列，藉由依次重複進行N末端保護基(Fmoc基)的去除，接著保護胺基酸衍生物的縮合而達成。另外，此等操作可使目標胜肽在最終階段游離。例如，作為使其游離之條件，可使其在Teixeira, W. E. Benckhuijsen, P. E. de Koning, A. R. P. M. Valentijn, J. W. Drijfhout, Protein Pept. Lett., 2002, 9, 379-385等中所列舉之在TFA中包含水/氫矽烷/硫醇作為捕捉劑之TFA溶液中進行游離。作為典型例，可列舉TFA/Water/TIS/DODT(體積比92.5：2.5：2.5：2.5)。

本說明書所記載之胜肽的合成可藉由使用單或多通道胜肽合成機，例如CEM公司的Liberty Blue合成機或Biotage公司的Syro I合成機或者該等之後續機等予以實施。

羧基的活化可使用縮合劑施行。作為縮合劑，可列舉例如二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC或WSC)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)參(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-[雙(二甲基胺基)甲基]-1H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸鹽(HBTU)等。

針對胜肽的環化，可依照公知的方法施行。非限定地，例如，藉由設計成在胜肽中包含2個以上半胱胺酸殘基，便可在進行轉譯後，藉由二硫鍵形成環狀結構。此外，依照Goto等人之方法(Y. Goto, et al. ACS Chem. Biol. 3 120-129 (2008))，通過遺傳密碼的重編程技術，藉由預先合成在N末端具有氯乙醯基之胜肽，並在胜肽中配置包含硫分子之半胱胺酸殘基，亦可進行環狀化。藉此，在轉譯後巰基自發性地對氯乙醯基進行親核攻擊，胜肽便藉由硫醚鍵進行環狀化。亦可通過遺傳密碼的重編程技術，將進行鍵結而形成環狀之其他胺基酸的組合配置於胜肽內而進行環狀化(本案之環化方法，ClAc-Cys)。或者，亦可藉由在胜肽中配置L-2-胺基己二酸殘基，並在與N末端的主鏈胺基之間進行鍵結而進行環狀化。依此，只要是公知的環狀化方法，即可無特別限制地使用。 5.複合體

在一態樣中，本發明係關於複合體。此複合體為包含上述任一種胜肽、與前述胜肽進行鍵結之連結子及鍵結至此連結子之物質之複合體。由於前述胜肽可結合至TGF-β，故前述複合體能夠將前述物質搬運至TGF-β。

有時將物質(特定而言，藥劑等)鍵結至胜肽之態樣稱為PDC(peptide drug conjugate)。

物質只要是希望送達至TGF-β之物質，則熟習該項技術者所希望之任何物質皆可。作為前述物質之例，並不受限，可列舉以下者： 化合物：包含低分子化合物、中分子化合物，可列舉例如公知的低分子藥劑。 胜肽：可為結合至體內之標的並顯示出某種效果之胜肽，例如，可為有別於本發明之胜肽之環狀胜肽。 RI：經放射性同位素標定之低分子、中分子化合物或抗體等，只要是可經放射性同位素標定之化合物，則任何者皆可。可列舉例如PET檢查用化合物。 蛋白質：只要是抗體、酵素等在體內顯示出有用的機能之蛋白質，則任何者皆可。可列舉例如用於酵素補充療法之酵素。 核酸：只要是DNA、RNA等包含鹼基序列者，則任何者皆可。可列舉例如核酸醫藥品。 用於藥物遞送系統(DDS)之分子：可為脂質體或微胞等使用於DDS之公知的分子。在該DDS分子中，亦可在內部進一步包含藥劑等化合物。

上述所列舉之物質可為經複數鍵結之複合體。進行複數鍵結之物質可為同種，亦可為不同種。

有時將物質(特定而言，藥劑等)鍵結至胜肽之態樣稱為PDC(peptide drug conjugate)。在本說明書中，在述及「胜肽」之情況，在沒有特別限定之前提下，亦可包含鍵結有物質之複合體的態樣。 6.組成物等

本發明復關於組成物，其包含本發明之胜肽。在本項中，「胜肽」亦可包含「5.複合體」之複合體。

非限定地，前述組成物為醫療用組成物、診斷用組成物或研究用組成物。 (醫藥組成物)

前述醫藥組成物可包含前述胜肽本身，亦可包含前述胜肽的藥學上可容許的鹽，或其溶媒合物。在本說明書中，「胜肽」在沒有特別明確記載之前提下，可包含其藥學上可容許的鹽，或其溶媒合物。前述醫藥組成物較佳係包含有效量的前述胜肽作為有效成分。

成為前述「醫藥組成物」的對象之疾患包含上述之胜肽本身產生效果之疾患，及修飾胜肽之藥劑產生效果之疾患兩者。作為成為前述醫藥組成物的對象之疾患，並無限定，可列舉例如TGF-β訊息傳遞路徑相關之疾病，例如有腫瘤、癌症、細胞的異常纖維化等與細胞增殖相關之疾病。此外，亦有用於作為包含絲球體硬化等在內之腎機能不全，或肝硬變、心肌梗塞等的治療用醫藥組成物的有效成分。或者，亦可以修飾胜肽之藥劑產生效果之疾患作為對象。

在本說明書中，醫藥組成物的投予形態並無特別限定，可為經口投予，亦可為非經口投予。作為非經口投予，可列舉例如肌肉內注射、靜脈內注射、皮下注射等注射投予、經皮投予、經黏膜投予(經鼻、經口腔、經眼、經肺、經陰道、經直腸)投予等。

有鑑於多肽易於代謝及排泄之性質，前述醫藥組成物可施行各種修飾。例如，可對多肽附加聚乙二醇(PEG)或醣鏈而增長血中滯留時間，使抗原性降低。此外，亦可將聚乳酸/二醇(PLGA)等生物體內分解性高分子化合物、多孔性羥基磷灰石、脂質體、表面修飾脂質體、以不飽和脂肪酸調製而得之乳液、奈米粒子、奈米球等用作緩釋化基劑，使多肽內包於其中。在進行經皮投予之情況，亦可將較弱的電流流至皮膚表面而使其穿透角質層(離子電滲法)。

前述醫藥組成物可依原樣使用有效成分，亦可加入藥學上可容許的擔體、賦形劑、添加劑等並加以製劑化。作為劑型，可列舉例如液劑(例如注射劑)、分散劑、懸浮劑、錠劑、丸劑、粉末劑、栓劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、口含錠劑、吸入劑、軟膏劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、泥罨劑等。製劑化可適宜使用例如賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、溶解劑、溶解輔助劑、著色劑、矯味矯臭劑、安定化劑、乳化劑、吸收促進劑、界面活性劑、pH調整劑、防腐劑、抗氧化劑等，藉由常法施行。

作為用於製劑化之成分之例，可列舉精製水、食鹽水、磷酸緩衝液、右旋糖、甘油、乙醇等藥學上可容許的有機溶劑、動植物油、乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、山梨糖醇、結晶纖維素、羥基丙基纖維素、澱粉、玉米澱粉、矽酸酐、矽酸鋁鎂、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧基甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、二丙三醇、丙三醇、丙二醇、凡士林、石蠟、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、肉豆蔻酸異丙酯、高級醇、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白等，但並不限定於此等。

有鑑於胜肽一般難以經黏膜吸收，前述醫藥組成物可包含改善難吸收性藥物的吸收之吸收促進劑。作為該種吸收促進劑，可使用聚氧乙烯月桂基醚類、月桂基硫酸鈉、皂苷等界面活性劑；甘膽酸、去氧膽酸、牛膽酸等膽汁酸鹽；EDTA、水楊酸類等螯合劑；羊油酸、羊蠟酸、月桂酸、油酸、亞麻油酸、混合微胞等脂肪酸類；烯胺衍生物、N-醯基膠原蛋白胜肽、N-醯基胺基酸、環糊精類、幾丁聚糖類、一氧化氮供體等。

在前述醫藥組成物為丸劑或錠劑之情況，亦可以糖衣、胃溶性、腸溶性物質進行被覆。

在前述醫藥組成物為注射劑之情況，亦可包含注射用蒸餾水、生理食鹽水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇類等。再者，亦可加入潤濕劑、乳化劑、分散劑、安定化劑、溶解劑、溶解輔助劑、防腐劑等。

此外，前述醫藥組成物不僅以人類作為對象，亦可以非人類哺乳動物或鳥類作為對象。非人類哺乳動物之例包含人類以外之靈長類(猴、黑猩猩、大猩猩等)、家畜動物(豬、牛、馬、綿羊等)，或者犬、貓、大鼠、小鼠、豚鼠、兔等。

特定而言，投予至人類之情況之投予量係依症狀、患者的年齡、性別、體重、感受性差異、投予方法、投予間隔、有效成分的種類、製劑的種類而有所不同，非限定地，例如，可1次或分成數次投予30μg～100g、100μg～500mg、100μg～100mg。在注射投予之情況，亦可依患者的體重，1次或分成數次投予1μg/kg～3000μg/kg、3μg/kg～1000μg/kg。

本發明係關於藉由投予本發明之胜肽而預防或治療疾患之方法。

本發明係關於本發明之胜肽的使用，其係用於預防或治療疾患。

本發明係關於本發明之胜肽的使用，其係用於製造用於預防或治療疾患之醫藥組成物。

本發明係關於本發明之胜肽，其係使用於預防或治療疾患之方法。 (診斷用組成物及研究用組成物)

本發明復關於診斷用組成物，其包含本發明之胜肽。

前述胜肽較佳係具有TGF-β結合活性，更佳為TGF-β1結合活性。所謂「具有TGF-β1結合活性」，係如「3.胜肽(B)」中所詳述。由於本發明之胜肽結合至TGF-β，故亦可使用作為檢測TGF-β之診斷藥。作為診斷藥，可為TGF-β量的檢測藥，在用作檢測藥之情況，本發明之胜肽亦可在能夠檢測之情形下加以標識。在被標識物質所標識之情況，藉由前述胜肽與TGF-β形成複合體，便能夠經由該標識物質施行TGF-β的檢測或定量。

標識物質的種類並無特別限定。非限定地，包含例如螢光素異硫氰酸鹽、羅丹明(Rhodamine)、丹磺醯氯、藻紅蛋白、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、近紅外螢光材料等螢光物質、化學發光色素、放射性物質(例如125I、131I、35S、3H等放射性同位素，或放射性同位素金屬離子的螯合錯合物，例如DOTA或去鐵胺(Desferrioxamine)的螯合錯合物)，以及生物素及GFP(綠色螢光蛋白質)等螢光蛋白質、發光蛋白質，以及過氧化酶、鹼性磷酸酶等酵素。較佳的標識物質之例為螢光素及FITC等螢光素衍生物、羅丹明及四甲基羅丹明等羅丹明衍生物以及德克薩斯紅(Texas Red)等螢光色素。

可以診斷用組成物進行診斷之疾患並無特別限定。可列舉例如TGF-β訊息傳遞路徑相關之疾病，例如有腫瘤、癌症、細胞的異常纖維化等與細胞增殖相關之疾病。此外，亦有用於作為包含絲球體硬化等在內之腎機能不全，或肝硬變、心肌梗塞等的診斷用組成物。

本發明係關於藉由使用本發明之胜肽而診斷疾患之方法。「診斷之方法」包含活體內(in vivo)或活體外(in vitro)之診斷方法。較佳為活體外(in vitro)之診斷方法。本發明復關於藉由使用本發明之胜肽而檢測疾患之方法。疾患的檢測亦可例如在研究機構(包含大學等教育機構)、企業等，由醫師以外之檢查技師、研究者等施行。在一態樣中，檢測疾患之方法不包含醫療行為。

本發明係關於本發明之胜肽的使用，其係用於診斷或檢測疾患。

本發明係關於本發明之胜肽的使用，其係用於製造用於診斷或檢測疾患之組成物。

本發明係關於本發明之胜肽，其係使用於診斷或檢測疾患之方法。

本發明復關於研究用組成物，其包含本發明之胜肽。惟，本發明之研究用組成物係排除使用作為供予用於培養類器官之培養基之添加劑之組成物。「研究用組成物」包含在研究機構(包含大學等教育機構)、企業、醫院等，由研究者、技師、學生、醫師等所使用者。

前述研究用組成物可使用於例如TGF-β的精製或檢測、疾患的檢測。

在一態樣中，由於本發明之胜肽具有TGF-β拮抗活性，故亦可使用作為供予用於培養細胞或臟器之培養基之添加劑。此外，亦可使用作為供予用於保護移植用臟器之保護溶液之添加劑。非限定地，可為用於培養肝臟或腦幹等臟器或其片段之培養基，亦可為用於培養幹細胞等具有全能性之細胞之培養基。再者，亦能夠使用於例如用於再生醫療中之細胞療法之細胞培養等。本發明之「研究用組成物」包含使用於此種培養培養基之組成物。

惟，本發明之研究用組成物係排除使用作為供予用於培養類器官之培養基之添加劑之組成物。「類器官」為源自於人類幹細胞，因其自行凝集能力、自行再生能力及分化能力而受到三維培養，並藉由自行組織化所形成之活體外培養物。「類器官」亦被認為是「臟器的小型版」。

由於前述胜肽具有對TGF-β，特定而言TGF-β1之結合活性(親和性)，特定而言較高的結合活性，故能夠例如從人類血清等中選擇性地分離出TGF-β。從而，前述胜肽可使用於TGF-β的精製方法。TGF-β的精製方法包含例如使前述胜肽或經固定化之前述胜肽與TGF-β進行結合，以及使已結合之TGF-β游離並回收TGF-β。再者，前述胜肽可使用於TGF-β的檢測方法。TGF-β的檢測方法包含例如使樣品中之TGF-β結合至前述胜肽或經固定化之前述胜肽，並檢測已結合之TGF-β。在此處，就檢測而言，係設為包含定性或定量中之任一種分析。

在本說明書中，用於將胜肽進行固定化之擔體並無特別限定，可列舉例如玻璃製、金屬性、樹脂製等微量滴定盤、基板、珠粒、硝基纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜等。

本發明包含TGF-β的精製或檢測方法，其係使用本發明之胜肽。

本發明復包含本發明之胜肽的使用，其係用於精製或檢測TGF-β。

本發明係關於診斷用或檢測用套組，其包含本發明之胜肽。前述診斷用或檢測用套組包含上述檢測所需之試劑及器具(非限定地，包含本發明之胜肽、抗體、固相擔體、緩衝液、酵素反應停止液、微量盤讀取器等中之任一者或全部)。

本發明係關於診斷用或檢測用測試器，其包含本發明之胜肽。 [實施例]

以下，基於實施例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於此等實施例。熟習該項技術者可基於本說明書的記載而輕易地對本發明加以修飾/變更，該等包含在本發明之技術範圍中。 (化學合成)

以下實施例中之化學合成中所使用之所有的原料、建構組元、試劑、酸、鹼、固相樹脂、溶媒可依原樣使用市售品，或者由熟習該項技術者使用有機化學手法予以合成。另外，包含保護基之胺基酸在沒有特別記載之前提下，係依原樣使用市售品。

固相樹脂中之胜肽鏈的伸長係以各實施例所記載之樹脂作為起始原料，使用通常所使用之胜肽偶合反應條件及Fmoc去除反應條件施行。反應係使用屬於胜肽自動合成機之CEM公司的Liberty Blue或Biotage公司的Siro I，依照製造商的手冊施行。

作為例，下述列舉所使用之一般的胺基酸的一部分，側鏈保護基示於括號內。 Fmoc-Trp(Boc)-OH； Fmoc-Gly-OH； Fmoc-Asp(OMpe)-OH； Fmoc-Phe-OH； Fmoc-His(Boc)-OH； Fmoc-Tyr(tBu)-OH； Fmoc-Val-OH； Fmoc-Cys(Trt)-OH； Fmoc-Asn(Trt)-OH。

作為所獲得之粗精製胜肽的精製方法，係藉由Waters公司AutoPurification System-SQD2 single quadruple mass spectrometer使用逆相製備型HPLC，一面監控源自目標物之m/z離子一面進行溶出。確認以ESI-positive的掃描模式所獲得之質譜及包含由目標物的分子式所計算出之多價離子之質譜在所使用之質量分析器的誤差範圍中一致。另外，包含所使用之管柱之精製條件示於各實施例。

化學合成而得之胜肽的結構決定係藉由質譜分析法中之ESI-MS(+)確認分子量，該分子量係考慮到依照目標序列所使用之胺基酸及視需要使用之建構組元並加以計算而得。另外，所謂「ESI-MS(+)」，係表示在正離子模式下實施之電噴灑離子化質譜分析法。所檢測而得之質量係藉由「m/z」單位標示進行報告。另外，分子量約大於1000之化合物係以高頻率被檢測為2價離子或3價離子。 實施例1：TGFb1_001(SEQ ID NO：2)的合成

在本實施例中，合成具有以下結構之TGFb1_001(SEQ ID NO：2)。

使用Fmoc-Sieber amide resin(渡邊化學，0.47mmol/g，0.213g)，依前述一般的化學合成方法，從Fmoc基的去除開始，合成目標胜肽。此時，使用CEM公司的Liberty Blue HT作為固相合成機，依照製造商的手冊施行合成。

在各殘基的導入中，相對於樹脂1當量而言，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure(5.25當量/10當量/5當量)，在DMF中於90℃下施行反應1次共3分鐘。惟，第9個殘基係於90℃下施行反應2次共10分鐘。第14個殘基、第16個殘基係於50℃下施行反應1次共15分鐘。

此外，Fmoc的去除係以與20%哌啶的DMF溶液於75℃下進行反應3分鐘為基本條件。惟，第1個殘基、第2個殘基、第3個殘基、第4個殘基、第5個殘基、第6個殘基、第7個殘基及第8個殘基的Fmoc的去除係與20%哌啶的DMF溶液於25℃下施行反應2次共5分鐘。

氯乙醯基的導入係藉由對保持有前步驟中所獲得之經Fmoc保護之胜肽之固相樹脂，以前述之方法去除α-胺基的Fmoc基之後，將0.2M氯醋酸(約5當量)的DMF溶液、0.5M HATU(約5當量)的DMF溶液、1M DIEA(約10當量)的DMF溶液加入固相樹脂中，於室溫振盪30分鐘而施行。

側鏈的脫保護及從固相樹脂之切出係首先將在氯乙醯基導入步驟後所獲得之樹脂以DMF洗淨5次及以二氯甲烷洗淨3次後，於減壓下進行乾燥，繼而，在裝有固相樹脂之反應容器中，加入反應劑調和物-A(5mL，TFA/H ₂O/TIS/DODT的體積比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，於室溫振盪60分鐘。

從玻料過濾回收反應液。殘留於反應容器中之固相樹脂與切出用調和物再度進行振盪，從玻料回收溶液成分，與前述濾液進行混合。若將此濾液加入冷卻至0℃之過量的二異丙基醚/己烷(1/1)的混合溶媒中，則產生沉澱。將此混合物進行離心分離(9000rpm，1分鐘)，將溶液進行傾析。將所獲得之固體以再度冷卻至0℃之15mL的二乙基醚洗淨3次後，於減壓下進行乾燥。將所獲得之固體用於下一個環化反應。

胜肽的環化反應係以胜肽的終濃度以固相樹脂的莫耳數為基準計成為5mM之方式溶解於DMSO中後，加入10當量的三乙基胺，於室溫振盪約5小時。將所獲得之反應溶液使用Genevac公司的EZ-2進行減壓濃縮(未滿40℃，減壓時間14小時)。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 30×150 mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA (MeCN中)；溫度：40℃；梯度(%B)：耗費3分鐘13-38%，隨後耗費8分鐘38-43%，隨後耗費1分鐘43-60%；流量：45mL/分鐘。

目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為96.0%。 分析條件：保持時間=15.01分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1×150mm，100Å；移動相：A= 0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費20分鐘20-60%，隨後耗費1分鐘60-95%，隨後耗費5分鐘95-95%；流量：0.25mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1112.53(M+2H) ²⁺實施例2：TGFb1_012(SEQ ID NO：13)的合成

在本實施例中，合成具有以下結構之TGFb1_012(SEQ ID NO：13)。

使用Fmoc-Sieber amide resin(渡邊化學，0.65mmol/g，0.115g)，依前述一般的化學合成方法，從Fmoc基的去除開始，合成目標胜肽。此時，使用Biotage公司的Siro I作為固相合成機，依照製造商的手冊施行合成。

在各殘基的導入中，相對於樹脂1當量而言，使用Fmoc-AA/HATU/DIPEA(4.2當量/4當量/8當量)，在DMF中於75℃下施行反應2次共20分鐘。惟，第11個殘基、第12個殘基、第13個殘基係於75℃下施行反應1次共20分鐘。第14個殘基係於室溫下施行反應1次共60分鐘。第15個殘基係於75℃下施行反應1次共20分鐘。第17個殘基係於75℃下施行反應1次共10分鐘。第16個殘基係於室溫下施行反應1次共20分鐘。

此外，Fmoc的去除係以與20%哌啶的DMF溶液於室溫下進行反應5分鐘及15分鐘為基本條件。

氯乙醯基的導入係藉由對保持有前步驟中所獲得之經Fmoc保護之胜肽之固相樹脂，以前述之方法去除α-胺基的Fmoc基之後，將0.2M氯醋酸(約5當量)的DMF溶液、0.2M DIPCI(約5當量)的DMF溶液、0.2M HOSu(約5當量)的DMF溶液加入固相樹脂中，於室溫振盪90分鐘而施行。

側鏈的脫保護及從固相樹脂之切出係首先將在氯乙醯基導入步驟後所獲得之樹脂以DMF洗淨5次及以二氯甲烷洗淨3次後，於減壓下進行乾燥，繼而，在裝有固相樹脂之反應容器中，加入反應劑調和物-A(3mL，TFA/H ₂O/TIS/DODT的體積比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，於室溫振盪60分鐘。

從玻料過濾回收反應液。殘留於反應容器中之固相樹脂與切出用調和物再度進行振盪，從玻料回收溶液成分，與前述濾液進行混合。若將此濾液加入冷卻至0℃之過量的二異丙基醚溶媒中，則產生沉澱。將此混合物進行離心分離(9000rpm，3分鐘)，將溶液進行傾析。將所獲得之固體以再度冷卻至0℃之10mL的二乙基醚洗淨3次後，於減壓下進行乾燥。將所獲得之固體用於下一個環化反應。

胜肽的環化反應係以胜肽的終濃度以固相樹脂的莫耳數為基準計成為2.5mM之方式溶解於DMSO/水(9/1)的混合溶液中後，加入10當量的三乙基胺，於室溫振盪約18.5小時。在反應液中添加20當量的醋酸後，將所獲得之反應溶液使用Genevac公司的EZ-2進行減壓濃縮(未滿40℃，減壓時間16小時)。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 19×150mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B)：耗費3分鐘5-30%，隨後耗費8分鐘30-35%，隨後耗費1分鐘35-60%；流量：17mL/分鐘。

目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為90.5%。 分析條件：保持時間=3.62分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1×150mm，100Å；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費7.15分鐘20-60%，隨後耗費0.3分鐘60-95%，隨後耗費1.55分鐘95-95%；流量：0.5mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1204.64(M+2H) ²⁺實施例3：TGFb1_031(SEQ ID NO：32)的合成

在本實施例中，合成具有以下結構之TGFb1_031(SEQ ID NO：32)。

使用Fmoc-Sieber amide resin(渡邊化學，0.48mmol/g，0.521g)，依前述一般的化學合成方法，從Fmoc基的去除開始，合成目標胜肽。此時，使用CEM公司的Liberty Blue HT作為固相合成機，依照製造商的手冊施行合成。

在各殘基的導入中，相對於樹脂1當量而言，使用Fmoc-AA/DIPCI/Oxyma pure(4.2當量/8當量/4當量)，在DMF中於90℃下施行反應1次共3分鐘。惟，第3個殘基、第4個殘基、第6個殘基、第7個殘基、第11個殘基、第15個殘基係於75℃下施行反應1次共20分鐘。第9個殘基係於90℃下施行反應2次共3分鐘。第10個殘基係於75℃下施行反應2次共20分鐘。第14個殘基係於50℃下施行反應1次共15分鐘。

此外，Fmoc的去除係以與20%哌啶的DMF溶液於75℃下進行反應3分鐘為基本條件。惟，第1個殘基、第2個殘基、第3個殘基、第4個殘基、第5個殘基、第6個殘基、第7個殘基、第8個殘基、第11個殘基、第12個殘基、第13個殘基、第15個殘基、第17個殘基及第18個殘基的Fmoc的去除係與20%哌啶的DMF溶液於25℃下施行反應2次共5分鐘。

氯乙醯基的導入係藉由對保持有前步驟中所獲得之經Fmoc保護之胜肽之固相樹脂，以前述之方法去除α-胺基的Fmoc基之後，將0.1M氯醋酸(約5當量)的DMF溶液、0.1M HATU(約5當量)的DMF溶液、0.2M DIEA(約10當量)的DMF溶液加入固相樹脂中，於室溫振盪30分鐘而施行。

側鏈的脫保護及從固相樹脂之切出係首先將在氯乙醯基導入步驟後所獲得之樹脂以DMF洗淨5次及以二氯甲烷洗淨3次後，於減壓下進行乾燥，繼而，在裝有固相樹脂之反應容器中，加入反應劑調和物-A(5mL，TFA/H ₂O/TIS/DODT的體積比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，於室溫振盪60分鐘。

從玻料過濾回收反應液。殘留於反應容器中之固相樹脂與切出用調和物再度進行振盪，從玻料回收溶液成分，與前述濾液進行混合。若將此濾液加入冷卻至0℃之過量的二異丙基醚/己烷(1/1)的混合溶媒中，則產生沉澱。將此混合物進行離心分離(9000rpm，2分鐘)，將溶液進行傾析。將所獲得之固體以再度冷卻至0℃之15mL的二乙基醚洗淨3次後，於減壓下進行乾燥。將所獲得之固體用於下一個環化反應。

胜肽的環化反應係以胜肽的終濃度以固相樹脂的莫耳數為基準計成為5mM之方式溶解於DMSO中後，加入10當量的三乙基胺，於室溫振盪約16小時。將所獲得之反應溶液使用Thermo Scientific公司的Savant Explorer SpeedVac進行減壓濃縮(未滿40℃，減壓時間3小時)。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 50×150 mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA(MeCN中)；溫度：40℃；梯度(%B)：耗費3分鐘5-28%，隨後耗費8分鐘28-33%，隨後耗費1分鐘33-60%；流量：120mL/分鐘。

目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為99.2%。將此處所獲得之胜肽視為胜肽A。 分析條件：保持時間=1.20分鐘；管柱：CSH Ph-hexyl 1.7μm 2.1×30mm；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費1.14分鐘5-95%，隨後耗費0.86分鐘95-95%；流量：0.72mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1269.3(M+4H) ⁴⁺

將上述所獲得之胜肽A(16.5μmol)以胜肽的終濃度成為25mM之方式溶解於DMSO/水(9/1)的混合溶液中後，加入1.2當量的MePEG8c、1.1當量的HATU、3當量的DIPEA，於室溫振盪約1小時。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 19×150mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA(MeCN中)；溫度：50℃；梯度(%B)：耗費3分鐘7-32%，隨後耗費8分鐘32-37%，隨後耗費1分鐘37-60%；流量：17mL/分鐘。 目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為98.2%。 分析條件：保持時間=4.09分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1×150mm，100Å；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費7.15分鐘20-60%，隨後耗費0.3分鐘60-95%，隨後耗費1.55分鐘95-95%；流量：0.5mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=977.70(M+3H) ³⁺實施例4：TGFb1_032(SEQ ID NO：33)的合成

在本實施例中，合成具有以下結構之TGFb1_032(SEQ ID NO：33)。

將TGFb1_031(SEQ ID NO：32)的合成中所獲得之胜肽A(4.5μmol)以胜肽的終濃度成為25mM之方式溶解於乙腈/水(1/1)的混合溶液後，加入0.67當量的NHS-OCOmPEG10000、5當量的DIPEA，於室溫振盪約1小時。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 30×150mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA(MeCN中)；溫度：50℃；梯度(%B)：耗費0.5分鐘35-35%，隨後耗費11.5分鐘35-60%；流量：45mL/分鐘。

目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為99.3%。 分析條件：保持時間=3.16分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1×150mm，100Å；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費7.15分鐘40-80%，隨後耗費0.3分鐘80-95%，隨後耗費1.55分鐘95-95%；流量：0.5mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1331.06(中央值) 實施例5：TGFb1_024(SEQ ID NO：25)的合成

在本實施例中，合成具有以下結構之TGFb1_024(SEQ ID NO：25)。

使用Fmoc-Sieber amide resin(渡邊化學，0.48mmol/g，0.156g)，依前述一般的化學合成方法，從Fmoc基的去除開始，合成目標胜肽。此時，使用Biotage公司的Siro I作為固相合成機，依照製造商的手冊施行合成。

在各殘基的導入中，相對於樹脂1當量而言，使用Fmoc-AA/HATU/DIPEA(4.2當量/4當量/8當量)，在DMF中於75℃下施行反應2次共20分鐘。惟，第4個殘基、第9個殘基係於75℃下施行反應2次共30分鐘。第14個殘基係於室溫下施行反應2次共30分鐘。第15個殘基係於75℃下施行反應1次共20分鐘。第16個殘基係於室溫下施行反應1次共20分鐘。第17個殘基係於75℃下施行反應1次共10分鐘。

此外，Fmoc的去除係以與20%哌啶的DMF溶液於室溫下進行反應5分鐘及15分鐘為基本條件。

氯乙醯基的導入、側鏈的脫保護及從固相樹脂之切出以及胜肽的沉澱下係按照TGFb1_012(SEQ ID NO：13)的合成方法施行。

胜肽的環化反應係以胜肽的終濃度以固相樹脂的莫耳數為基準計成為2.5mM之方式溶解於乙腈/水(1/1)的混合溶液中後，加入10當量的三乙基胺，於室溫振盪約3小時。在反應液中添加20當量的醋酸後，將所獲得之反應溶液使用Genevac公司的EZ-2進行減壓濃縮(未滿40℃，減壓時間16小時)。

將所獲得之粗生成物使用以下條件進行精製。管柱：Waters XBridge(註冊商標)C18 5μm 50×150mm；移動相：A=0.1%TFA(水中)，B=0.1%TFA(MeCN中)；溫度：40℃；梯度(%B)：耗費3分鐘5-26%，隨後耗費8分鐘26-31%，隨後耗費1分鐘31-60%；流量：17mL/分鐘。

目標物的純度係由分析條件的LC/MS(UV波長225nm)層析圖的面積比算出，為79.9%。 分析條件：保持時間=3.01分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm 2.1×150mm，100Å；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費7.15分鐘20-60%，隨後耗費0.3分鐘60-95%，隨後耗費1.55分鐘95-95%；流量：0.5mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1336.96(M+2H) ²⁺實施例6：TGFb1_068(SEQ ID NO：69)的合成

使用HA tag resin(0.65mmol/g，0.004mg，2.5μmol scale)，依前述一般的方法，從Fmoc基的去除開始，合成目標胜肽。此時，使用Biotage公司的Siro II作為固相合成機，依照製造商的手冊施行合成。

相對於固相樹脂1當量而言，使用Fmoc-AA/ HATU/DIPEA(4.2當量/3.9當量/8.4當量)，在DMF中於75℃下施行反應2次共20分鐘。惟，第5個殘基、第7個殘基、第8個殘基、第9個殘基、第10個殘基、第12個殘基、第13個殘基、第17個殘基係於75℃下施行反應2次共10分鐘。第14個殘基、第16個殘基係於50℃下施行反應2次共30分鐘。第18個殘基係於室溫下施行反應1次共60分鐘。此外，Fmoc的去除係以與20%哌啶的DMF溶液於室溫下進行反應5分鐘後，進行反應15分鐘為基本條件。

氯乙醯基的導入係藉由對保持有前步驟中所獲得之經Fmoc保護之胜肽之固相樹脂，以前述之方法去除α-胺基的Fmoc基之後，將0.3M氯醋酸的DMF溶液(4.2當量)、0.28M HATU的DMF溶液(3.9當量)、1.05M DIPEA的DMF溶液(8.4當量)加入固相樹脂中，重複2次於室溫下振盪30分鐘而施行。

側鏈的脫保護及從固相樹脂之切出係首先將在氯乙醯基導入步驟後所獲得之樹脂以DMF洗淨5次及以二氯甲烷洗淨3次後，於減壓下進行乾燥。繼而，在裝有固相樹脂之反應容器中，加入反應劑調和物-A(TFA/H2O/ TIS/DODT的體積比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，於室溫振盪60分鐘。

從玻料過濾回收反應液。殘留於反應容器中之固相樹脂與切出用調和物再度進行振盪，從玻料回收溶液成分，與前述濾液進行混合。若將此濾液加入冷卻至0℃之二異丙基醚(1.5mL)中，則產生沉澱。將此混合物進行離心分離(8500rpm，30秒)，藉由傾析去除溶液。將所獲得之固體以再度冷卻至0℃之二乙基醚/己烷(1：1，1mL)洗淨2次後，於減壓下進行乾燥。將所獲得之固體用於下一個環化反應。

胜肽的環化反應係以胜肽的終濃度以固相樹脂的莫耳數為基準計成為25mM(2.5μmol/0.1mL)之方式溶解於異丙醇/水/DMSO(1：1：18)中後，加入20當量的三乙基胺，於室溫下振盪63小時。在所獲得之反應溶液中加入40當量的醋酸。

所獲得之上述反應溶液係使用Gilson公司的管柱進行固相萃取(管柱：Gilson ASPEC C18 500mg 3mL)。 (i)將管柱以萃取液A(0.1%TFA於95%MeCN/水，3mL)洗淨。 (ii)以萃取液B(0.1%TFA於5%MeCN/水，3mL)將管柱進行平衡化。 (iii)將上述反應溶液0.1mL裝載至管柱。 (iv)以萃取液B(4mL)將管柱洗淨。 (v)以萃取液A(4mL)進行萃取。將所獲得之萃取液使用EZ-2 Elite進行減壓濃縮。

目標物主要的峰之一的純度係由以下分析條件的LC/MS(UV波長220nm)層析圖的面積比算出，為21.8%。 分析條件：保持時間=1.74分鐘；管柱：Kinetex EVO C18 1.7μm 2.1×50mm，100Å；移動相：A=0.025%TFA(水中)，B=0.025%TFA(MeCN中)；溫度：60℃；梯度(%B conc)：耗費2.10分鐘5-95%，隨後耗費0.75分鐘95-95%；流量：0.6mL/分鐘 ESI-MS(+)觀測值m/z=1903.5(M+2H) ²⁺實施例7：各種胜肽合成

在本實施例中，與實施例1-6同樣地化學合成各種環狀胜肽。將所合成之胜肽的序列示於表1及表4。在表1中，SEQ ID NO：2、4-13、15-33係在胺基酸序列呈環化結構之環狀胜肽的C末端附加甘胺酸(G)連結子。SEQ ID NO：32係在G連結子之前進一步附加K(MePEG8c)，又，SEQ ID NO：33係在G連結子之前進一步附加K (OCOmPEG10000)。另外，SEQ ID NO：3為與SEQ ID NO：2相同的胺基酸序列，但未附加C末端的甘胺酸(G)連結子。另外，SEQ ID NO：14為與SEQ ID NO：13相同的胺基酸序列，但未附加C末端的甘胺酸(G)連結子。

由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之胜肽亦在呈環化結構之環狀胜肽的C末端鍵結有G作為連結子。另外，在表4中，在由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之胜肽的C末端連結子的G之前鍵結有HA-tag。此為藉由ELISA評估TGF-β阻礙胜肽及與TGF-β1之結合時所需之胺基酸序列，不會對活性造成影響。

所合成之胜肽係以實施例1-6所記載之分析條件進行分析，藉由質譜分析法中之ESI-MS(+)確認結構。將所獲得之ESI-MS(+)觀測值及該情況下之價數示於表1、表4。 實施例8：經由表面電漿共振(SPR)之TGF-β與胜肽之分子間相互作用評估試驗

在本實施例中，(1)為了評估針對實施例1-5及實施例7中所合成之由SEQ ID NO：2-33的胺基酸序列所構成之各種胜肽之對TGF-β之結合活性，此外，(2)為了確認實施例2中所合成之由SEQ ID NO：13的胺基酸序列所構成之胜肽對TGF-β的2種異型體(TGF-β1、β2)之結合活性及選擇性，便將胜肽對TGF-β經由表面電漿共振(SPR)之分子間相互作用藉由以下所示之方法實施試驗。將具體的試驗方法示於下。 [SPR測定]

在BiacoreT200(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)插入CM3感測器晶片(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)，以電泳緩衝液：HBS-EP+(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)實施初始操作3次，以流速30μL/分鐘進行平衡化。

使60mM EDC溶液(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)、650mM NHS溶液(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)各50μL進行混合後，以流速10μL/分鐘使其進行反應420秒。調製150μL經10mM醋酸溶液(pH5.0)稀釋之0.2μM TGF-β溶液，以流速10μL/分鐘使其進行反應420秒，將TGF-β固定化至CM3感測器晶片。TGF-β為源自人類之TGF-β1或β2(重組人類TGF-β1、2)，購自R＆D systems。固定化後，使1.0M乙醇胺水溶液(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)以流速10μL/分鐘進行反應420秒，施行封端。

將在DMSO溶液中調製成10mM之胜肽溶解液以終濃度成為10μM的胜肽溶解液之方式以電泳緩衝液進行稀釋後，製作50nM、25nM、12.5nM、5nM、2.5nM的胜肽溶液。使用上述樣品，藉由SPR測定取得胜肽對TGF-β之動力學。

動力學評估模型係設為Single Cycle Kinetics，使用Biacore T200 Evaluation Software Version 3.0(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)施行曲線擬合。對所獲得之感測圖譜實施經由最小平方法之曲線擬合，藉由求出其KD值而評估各種胜肽對TGF-β之結合。 (1)將由SEQ ID NO：2-33的胺基酸序列所構成之胜肽的KD值示於表2、表3。如表2、表3所示，SEQ ID NO：2-33的胜肽顯示出具有對TGF-β1之結合能力。另外，針對SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：14的胜肽，構成環狀胜肽結構之胺基序列分別與SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：13相同，差異僅為連結子部位有無附加甘胺酸。關於該等胜肽對TGF-β1之結合能力，SEQ ID NO：3的胜肽的KD為0.46nM，SEQ ID NO：14的胜肽的KD為0.82nM，與附加有甘胺酸之SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：13的KD幾乎沒有改變。由此，暗示即便將連結子附加至本發明之胜肽，亦能夠結合至TGF-β1。 (2)關於由SEQ ID NO：13的胺基酸序列所構成之胜肽對TGF-β的2種異型體(TGF-β1、β2)之KD值，針對TGF-β1，如表2所記載，為0.86nM。針對TGF-β2，為2.0nM。由以上結果，顯示出本發明之胜肽對TGF-β1、2進行特異性結合。 實施例9：評估TGF-β阻礙活性

在本實施例中，藉由使用SBE報導子-HEK293細胞系(BP Bioscience)之SBE報導子檢驗，如下述評估實施例1-5及實施例7中所合成之由SEQ ID NO：2-33的胺基酸序列所構成之胜肽的TGF-β1阻礙活性。

此外，為了確認本發明之胜肽對TGF-β的異型體(TGF-β1、β2)之選擇性，便使用實施例2中所合成之由SEQ ID NO：13的胺基酸序列所構成之胜肽評估對TGF-β1及TGF-β2之阻礙活性。

將SBE報導子-HEK293細胞以包含10%FBS (Sigma)之E-MEM(Wako)進行培養。使用Accutase (Innovative cell technologies)將細胞進行剝離後，懸浮於包含0.5%FBS之E-MEM中，以每1孔成為45,000個細胞之方式接種於96孔盤，培養一晩。翌日，加入胜肽，靜置20分鐘後，以成為0.13nM之方式添加重組人類TGF-β1(R＆D systems)、重組人類TGF-β2(R＆D systems)，施行培養18小時。

隨後，在各孔中加入螢光素酶檢驗ONE-Glo試劑，振盪5分鐘。在訊息的檢測中，係使用SpectraMax Paradigm multimode microplate reader(Molecular Devices)。將所獲得之訊息以GraphPad Prism進行解析，可將TGF-β所誘導出之訊息的最大值設為0%阻礙，將無刺激設為100%阻礙而算出胜肽的阻礙活性。

將實施例1-5及實施例7中所合成之由SEQ ID NO：2-33的胺基酸序列所構成之胜肽的TGF-β1阻礙活評估結果示於表2、表3。如表2、表3所示，所合成之各種胜肽顯示出具有TGF-β1拮抗活性。另外，針對SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：14的胜肽，如前述，構成環狀胜肽結構之胺基序列分別與SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：13相同，差異僅為連結子部位有無甘胺酸，由於與實施例8相比而言結合活性亦沒有改變，故省略SBE報導子的結果。

此外，將對TGF-β的異型體(TGF-β1、β2)之選擇性評估的結果示於圖1。如圖1所示，實施例2中所合成之由SEQ ID NO：13的胺基酸序列所構成之胜肽顯示出對TGF-β1及TGF-β2之阻礙活性。由此，顯示出由本發明之SEQ ID NO：13的胺基酸序列所構成之胜肽不僅阻礙TGF-β1，亦阻礙TGF-β2。 實施例10：經由ELISA之TGF-β與胜肽之結合評估

在本實施例中，針對實施例6及實施例7中所合成之由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之各種胜肽，使用ELISA評估與TGF-β1之結合。在由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之胜肽的C末端連結子的G之前鍵結HA-tag。本說明書中，所謂「HA-tag」，係意味PEG10c-Y-P-Y-D-V-P-D-Y-A(SEQ ID NO：70)的胺基酸序列。此為藉由ELISA評估TGF-β阻礙胜肽及與TGF-β1之結合時所需之胺基酸序列。不會對與TGF-β1之結合活性造成影響。

藉由使用經鍵結HA-tag之由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之胜肽及TGF-β1珠粒之ELISA，調查胜肽與TGF-β1之結合活性。 ＜TGF-β1珠粒的製作＞

將重組人類TGF-β1(R＆D Systems)固定化於Dynabead M-270 Carboxylic Acid(Thermo fisher scientific)，製作TGF-β1珠粒。固定化反應係使用Amine Coupling kit(同仁化學研究所)。 ＜ELISA＞

使TGF-β1珠粒及在C末端附加HA標籤序列而得之胜肽在包含0.1%Tween20(Nacalai Tesque)之PBS(PBS-T)中進行反應1小時後，藉由PBS-T洗淨。為了檢測結合至TGF-β1珠粒之胜肽，便在包含1%BSA之PBS-T中使Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT(MBL)及前述TGF-β1珠粒進行反應30分鐘。以PBST洗淨後，藉由SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard＆Perry Laboratories)顯色10分鐘後，添加TMB stop solution(Kirkegaard＆Perry Laboratories)，使顯色反應停止。在吸光度測定中，係使用EnSpire(Perkin Elmer)。

另外，結合活性係以將TGFb1_061(SEQ ID NO：62)的胜肽對TGF-β1之結合能力設為100%時之相對值之形式表示。將結果示於表4。如表4所示，由SEQ ID NO：34-69的胺基酸序列所構成之胜肽顯示出具有對TGF-β1之結合能力。

表1之SEQ ID NO：32及33的m/z分別為屬於連結子之K(MePEG8c)、K(OCOmPEG10000)中附加MePEG8c、OCOmPEG10000結構之前之值。

表2及表3之SBE reporter欄下之濃度(nM)係記載使用於實際的測定之胜肽的濃度。

表4之對TGF-β之結合活性係以將TGFb1_061 (SEQ ID NO：62)的胜肽對TGF-β1之結合能力設為100%時之相對值之形式表示。 參考例：新穎非天然胺基酸的合成

本參考例示出本發明之胜肽中所包含之非天然胺基酸的合成。 (KCOmeglumine的合成)

在N2-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-離胺酸-2-丙烯-1-基酯鹽酸鹽(8.00g，17.98mmol)的二氯甲烷(80mL)溶液中，於冰冷下加入三光氣(2.67g，8.99mmol)後，滴加DIEA(10.1mL，57.5mmol)，於冰冷下攪拌30分鐘。在反應液中加入二噁烷(80mL)後，加入含有葡甲胺(14.0g，71.9mmol)之0.5mol/L碳酸氫鈉水溶液(80mL)。將反應液於冰冷下攪拌整夜。將反應液以醋酸乙酯稀釋，將有機層以水、0.5mol/L檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨，以硫酸鈉進行乾燥。將該溶液進行過濾，將濾液於減壓下進行濃縮。將所獲得之殘渣以矽膠管柱層析進行精製(二氯甲烷/甲醇=100/0-60/40)，以白色非晶質之形式獲得所期望的生成物(8.70g，13.82mmol)。

將所獲得之生成物(8.70g，13.82mmol)溶於二氯甲烷(100mL)中，於冰冷下加入咪唑(2.35g，34.5 mmol)、三異丙基氯矽烷(3.33g，17.27mmol)，於室溫攪拌5日。將反應液以醋酸乙酯稀釋，以水洗淨3次。將萃取層以硫酸鈉進行乾燥，進行過濾，將濾液於減壓下進行濃縮。

將所獲得之殘渣以矽膠管柱層析進行精製(醋酸乙酯/己烷=0/100-60/40，隨後二氯甲烷/甲醇=100/  0-90/10)，以白色非晶質之形式獲得所期望的生成物(9.30g，11.83mmol)。

將所獲得之生成物(10.4g，13.23mmol)溶於二氯甲烷(50mL)中，加入苯基矽烷(3.3mL，26.5mmol)、肆(三苯基膦)鈀(0)(0.38g，0.331mmol)，於室溫攪拌2小時。將反應液進行濃縮後，以矽膠管柱層析進行精製(醋酸乙酯/己烷=0/100-60/40，隨後二氯甲烷/甲醇=100/0-90/ 10)，獲得標題物質(7.7g，10.3mmol)。 ESI-MS(+)觀測值m/z=746.6(M+H) ⁺[產業上之可利用性]

本發明所涉及之胜肽對TGF-β具有結合活性，又，較佳係具有TGF-β拮抗活性。能夠利用作為癌症或肝疾患等的醫藥用組成物、診斷用組成物及研究用組成物等。

[圖1]圖1示出針對於TGF-β1、TGF-β2之經由TGFb1_012(SEQ ID NO：13)的SBE報導子檢驗之阻礙活性測定的結果。圖1中，黑色圓圈表示TGF-β1，黑色方塊表示TGF-β2。橫軸表示TGF-β1_012(SEQ ID NO：13)的濃度(nM)，縱軸表示阻礙活性。

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Claims (30)

1. 一種胜肽，其包含以下胺基酸序列： F-Nal1-V-V-N-V-Y-D-D-PeG-V-Nal1-Y-H-V-C-G(SEQ ID NO：2)； 或者 在上述胺基酸序列的選自由第2個、第4個、第7個、第8個、第9個、第10個、第12個、第13個、第14個、第15個及第17個胺基酸殘基所構成之群組之1-11個胺基酸殘基中，具有取代、附加、缺失或插入之胺基酸序列。
2. 一種胜肽，其包含以下胺基酸序列： F-X1-V-X2-N-V-X3-X4-X5-X6-V-X7-X8-X9-X10-C(SEQ ID NO：1)， 其中， X1為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X2為任意的胺基酸； X3為任意的胺基酸； X4為任意的胺基酸； X5為任意的胺基酸； X6為在側鏈具有可經取代之烷基之胺基酸，或具有可經取代之烷基之二級胺基酸； X7為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X8為在側鏈具有可經取代之芳香族環之胺基酸； X9為任意的胺基酸； X10為任意的胺基酸。
3. 如請求項2之胜肽，其中，X1為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。
4. 如請求項2之胜肽，其中，X1為Nal1、W6N、W7N或W。
5. 如請求項2至4中任一項之胜肽，其中，X2為V、K、KCOpipzaa、KCOmeglumine或Q。
6. 如請求項2至4中任一項之胜肽，其中，X2為V、K、KCOpipzaa或KCOmeglumine。
7. 如請求項2至6中任一項之胜肽，其中，X3為Y、4Py、A、E、F4G、Q、K、F3G或3Py。
8. 如請求項2至6中任一項之胜肽，其中，X3為Y或4Py。
9. 如請求項2至8中任一項之胜肽，其中，X4為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。
10. 如請求項2至8中任一項之胜肽，其中，X4為D、A、Q、K或E。
11. 如請求項2至10中任一項之胜肽，其中，X5為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。
12. 如請求項2至10中任一項之胜肽，其中，X5為D、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、A、Q或K。
13. 如請求項2至12中任一項之胜肽，其中，X6為PeG、K或MeG。
14. 如請求項2至13中任一項之胜肽，其中，X7為在側鏈具有可經取代之縮合環之胺基酸。
15. 如請求項2至13中任一項之胜肽，其中，X7為Nal1、W6N或W。
16. 如請求項2至15中任一項之胜肽，其中，X8為Y、4Py、3Py或E。
17. 如請求項2至15中任一項之胜肽，其中，X8為Y或4Py。
18. 如請求項2至17中任一項之胜肽，其中，X9為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。
19. 如請求項2至17中任一項之胜肽，其中，X9為H、A、Q或E。
20. 如請求項2至19中任一項之胜肽，其中，X10為經取代或未經取代之芳香族胺基酸及含硫胺基酸以外之胺基酸。
21. 如請求項2至19中任一項之胜肽，其中，X10為V、E、KCOpipzaa、KCOmeglumine、Q、K或A。
22. 如請求項1至21中任一項之胜肽，其包含下列者中之任1種胺基酸序列，或由下列者中之任1種胺基酸序列所構成： SEQ ID NO：2-33，或者 SEQ ID NO：2、4-13、15-33中不具有C末端的甘胺酸(G)之胺基酸序列。
23. 如請求項1至22中任一項之胜肽，其中，前述胜肽為環狀胜肽。
24. 如請求項23之環狀胜肽，其具有經氯乙醯化之胺基酸與前述胜肽中所包含之半胱胺酸殘基進行鍵結而得之環狀結構。
25. 如請求項1至24中任一項之胜肽，其進一步包含附加的胺基酸殘基。
26. 如請求項1至21、23至25中任一項之胜肽，其中，在其C末端包含連結子。
27. 如請求項1至26中任一項之胜肽，其具有TGF-β結合活性。
28. 如請求項1至27中任一項之胜肽，其具有TGF-β拮抗活性。
29. 一種醫療用、診斷用組成物，其包含如請求項1至28中任一項之胜肽。
30. 一種研究用組成物，其包含如請求項1至28中任一項之胜肽，惟，排除使用作為供予用於培養類器官之培養基之添加劑之組成物。

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