JP2024510326A - ヌクレオリン結合ペプチドを含む抗ウイルス組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヌクレオリンに特異的に結合する新規なペプチドの抗ウイルス用途に関し、さらに詳しくは、特定のアミノ酸配列で表示されるペプチドを含む抗ウイルス組成物、前記ペプチドと細胞透過性ペプチドが結合した融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物、前記組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用組成物、およびウイルス感染症の予防または改善用保健機能食品組成物に関する。本発明では、MAP合成法及びOBOC組み合わせ法を使用してスクリーニングしたAGMペプチドリガンド及びその変異体がウイルスの増殖及び複製を抑制することを確認した(in vitro及びin vivo)。したがって、NCL標的化AGMは、抗ウイルス用途に有用に利用することができる。

Description

本発明は、ヌクレオリンに特異的に結合する新規なペプチドの抗ウイルス用途に関し、さらに詳しくは、特定のアミノ酸配列で表示されるペプチドを含む抗ウイルス組成物、前記ペプチドと細胞透過性ペプチドが結合した融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物、前記組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用組成物、およびウイルス感染症の予防または改善用の保健機能食品の組成物に関する。
古典的な診断および治療方法の対案として、治療効率を高め、ナノ粒子および抗体がん治療法に関連する副作用を減らすために、がん特異的ペプチドを使用することができる(Mori T. Curr Pharm Des. 2004; 10: 2335-43)。ペプチドリガンドは、容易な大量合成、低免疫原性、無毒性代謝物の生成、および高いin vivo生体適合性を含む多くの利点がある(McGregor DP. Curr Opin Pharmacol. 2008; 8: 616-9)。ペプチドを発掘する多くの方法の中で、OBOC(one-bead-one-compound)組み合わせ法は、ペプチドリガンドをスクリーニングする強力な方法の一つである(Lam KS, et al. Chem Rev. 1997; 97: 411-48)。OBOC組み合わせライブラリに基づくペプチドスクリーニングアプローチは、がんおよび他の疾患における細胞標的化のための新規ペプチドリガンドの発見を促進した(Mikawa M, et al. Mol Cancer Ther. 2004; 3: 1329-34)。多くのがん特異的ペプチドがin vitro OBOCコンビネーションスクリーニングやその他の方法を用いて分離されたが、いくつかの課題が残っている。特に、ペプチドを薬物として使用する際の主な欠点として、他のペプチダーゼ(peptidase)による非常に速い切断による非常に短い半減期が挙げられる(Borchardt TR, et al. Adv Drug Deliv Rev. 1997; 27: 235-56)。本発明者らは、多重抗原ペプチド(multiple-antigen peptide、MAP)のデンドリマー形態(dendrimeric form)の生活性ペプチドを合成する専用アプローチを開発することにより、前記問題点を克服しようとした。デンドリマー形態の単量体ペプチドの合成は、タンパク質分解酵素(protease)およびペプチダーゼ活性に対する獲得抵抗性により安定性を高めることができる(McGuire MJ, et al. Sci Rep. 2014; 4: 4480)。
そこで、本発明者らは、OBOCコンビネーションスクリーニングとMAP合成を結合して、ヒト乳がん(breast cancer)および結腸直腸がん(colorectal cancer)細胞に特異的に結合するAGMまたはAGMペプチドと名付けられたペプチドリガンドシリーズを発明した。さらに、プルダウン分析およびLC-MS/MSにより、ヌクレオリン(nucleolin、NCL)がAGMの標的タンパク質であることを確認した。NCLは、リン(nucleolus)に最も多く存在するタンパク質である。本発明では、抗NCL抗体などを用いてウイルス感染によってNCL発現が増加することを確認し、コロナウイルス(Corona virus)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)などを含む様々な種類のウイルスに感染した細胞にAGMペプチドを処理した場合、ウイルスの増殖及び複製を抑制して抗ウイルス効能を示すことを確認し、本発明を完成した。
本背景技術に記載された前記情報は、あくまでも本発明の背景に対する理解を深めるためのものであり、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって既に知られている先行技術を形成する情報を含まない場合がある。
本発明の目的は、ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するペプチドを含む抗ウイルス組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、ヌクレオリンに特異的に結合するペプチドと細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)が結合された融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗ウイルス組成物を投与する段階を含むウイルス感染症の予防または治療方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ウイルス感染症の予防または治療のための前記抗ウイルス組成物の用途を提供することである。
本発明の他の目的は、ウイルス感染症の予防または治療用薬剤の製造のための前記抗ウイルス組成物の使用を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、
(a) 配列番号1ないし配列番号8のいずれかで表されるアミノ酸配列、及び
(b) 配列番号1で示されるアミノ酸配列において以下の群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列。
(i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
(ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
(iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドを含む抗ウイルス組成物を提供する。
本発明はまた、前記ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドと細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)が結合されたAGMペプチドCPP融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物を提供する。
本発明はまた、前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用組成物を提供する。
本発明はまた、前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を投与する段階を含むウイルス感染症の予防または治療方法を提供する。
本発明はまた、ウイルス感染症の予防または治療のための前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の用途を提供する。
本発明はまた、ウイルス感染症の予防または治療用薬剤の製造のための前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の使用を提供する。
図１は、本発明によるAGM-330とPEGが接合された接合体(conjugate)の単量体(AGM-330m)、二量体(AGM-330d)、四量体(AGM-330t)の構造を示す。 図２は、本発明によるAGM-330-PEG接合体(conjugate)と細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)が結合されたAGM-330-CPP融合ペプチドの構造を示す。 図３は、ペプチドライブラリ合成及びスクリーニング段階を表現した模式図である。1)Split-mix合成法を行い、組み合わせOBOCライブラリを構築する。2)約~2,600,000個のライブラリを合成する。3)OBOCライブラリをCO2インキュベーターでがん細胞と一緒に培養する。4)細胞表面分子に対する親和性を有するリガンドを運ぶビーズは細胞で覆われる。5)positiveビーズを倒立顕微鏡下でピペットで採取。6)positiveビーズの配列をEdman microsequencingで測定。7)OBOCコンビネーションペプチドライブラリスクリーニングから確認されたがん特異的ペプチドリガンド候補。 図４は、がん特異的リガンドに対するOBOCライブラリのスクリーニングとMAP合成を示す。
図４aは、がん細胞株及び正常細胞に対するペプチドの結合特異性を示し、図４bは、選択された8つのビーズの細胞結合特異性を示す全体細胞結合の分析結果で、多数の乳がん及び結腸直腸がん細胞と正常乳房及び結腸直腸細胞を106cells/mlに再懸濁し、ビーズと共に培養した。全ての実験は3回繰り返し、Scale barは200μmである。図４cは、FITC-labeled AGM-330、AGM-331およびAGM-332の免疫蛍光の共焦点イメージングによって決定された結合特異性を示し、核はDAP(blue)で染色され、Scale barは50μmである。図４dは、AGM-330の結合特異性を示し、AGM-330の細胞結合を決定するために全細胞結合分析を行い、Scale barは200μmである。図４eは、AGM-330の合成手順を示し、試薬及び条件は以下の通りである。(i) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、piperidine、DMF。(ii) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH、piperidine、DMF。(iii) RHGAMVYLK-OH、piperidine。(iv) piperidine、DMF. Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl、DMF = dimethylformamide。図４fは、多数の乳がん及び結腸直腸がん細胞と正常乳がん及び結腸直腸細胞のうちがん細胞に対するAGM-330の特異性を示すFACS分析結果で、棒グラフは平均±SDを示し、one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisonで統計分析を行った。*、**および ***は、それぞれ P < 0.05、P < 0.01およびP < 0.001を示す。
図５は、AGM-330(AGM-330m、AGM-330d、AGM-330t)によるペプチドのin vivo安定性の評価結果である。AGM-330 2mg/kgをマウスの尾静脈を通して注入した後、0、0.167、1、2、4、6、8、12、24、48時間ごとにヘパリンがコーティングされた管を利用して目から血液を採取した。4℃で血液凝固を許容した後、4℃で10分間5000rpmで遠心分離して血清を収集した。残った血清中のペプチド部分は、抗AGM-330抗体でELISAプレートに直ちに固定化した。吸光度はVersaMax ELISA plate reader(Molecular Devices)を使用して450nmの波長で測定し、薬物動態学(Pharmacokinetics)は、phoenix WinNonlin 8.1(Pharsight Corporation、Mountain View、CA、USA)プログラムで分析した。 図６は、AGM-330の分子標的および特性を確認した結果を示す。 図６aは、biotin pull-down分析、質量分析及びウエスタンブロットの模式図を示す。図６bは、10% SDS-PAGEによる分離後、親和性カラムから溶出されたタンパク質のCoomassie brilliant blue染色結果で、Lane 1: protein marker、Lane 2: total lysate before biotin pull-down assay、Lane 3: flow-through after incubation with AGM-330-biotin、Lane 4-6: bead washing fraction、Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteinsである。* 赤い星印は、タンパク質バンドがゲル内分解のために切断された後にLC-MS/MS分析が行われたことを示す。図６cは、MSで検出されたペプチドのタンパク質データベース検索でAGM-330結合パートナーとしてNCLを確認した結果である。図６dは、LC-MS/MS分析から得られた遺伝子リストで、confidence scoreは識別されたタンパク質のmascot scoreを示す。図６eは、抗NCL抗体を用いたbiotin pull-downから溶出されたタンパク質の免疫ブロッティング分析結果であり、矢印はNCLの存在を意味する。図６fは、AGM-330に結合するNCLドメインの分析結果で、異なるGFP-NCL constructをHEK293T細胞に形質導入し、AGM-330-biotinをstreptavidinビーズに結合したNCL residues 1-710、residues 1-322またはresidues 323-710に添加し、ビーズ上のタンパク質を抗GFP抗体を用いて免疫ブロッティングで分析した。 図７は、NCLに対するAGM-330の親和性をSPRで評価した結果で、Kdで示されている。示されているSPRセンサーグラムは、類似した結果を持つ異なるセンサーチップを使用した3つの別々の実験セットを代表する実験から得られた実験結果である。組換えNCLは、CM5センサーチップに固定された。様々な濃度のAGM-330(20 nM-2.5μM)を固定化されたNCLと一緒に培養し、Biacore T-200装置で分析した。 図８は、biotin pull-down分析によるAGM-330と精製されたNCL間の直接的な相互作用の分析結果で、溶出されたタンパク質の免疫ブロッティング分析は、抗NCL抗体を使用してbiotin pull-downを形成する。Lane 1: protein marker、Lane 2: input of purified NCL、Lane 3: flow through after incubated with AGM-330-biotin、Lane 4-6: bead washing fraction、Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins。矢印はNCLの存在を示す。 図９は、AGM-330t-mCPP融合ペプチドの合成過程を示す。 図１０は、AGM-330t-mCPP融合ペプチドとAGM-330tおよびmaleimide-CPPのHPLCおよびMS分析結果を示す。 図１１は、AGM-330によるinfluenza A virus(IAV)の増殖抑制効果を示す。 図１２は、AGM-330によるbovine coronavirus(BCoV)の抑制効果を示す。 図１３は、AGM-330によるporkine epidemic diarrhea virus(PEDV)の抑制効果を示す。 図１４は、AGM-330によるbovine rotavirus(RVA)の抑制効果を示す。 図１５は、AGM-330によるporkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)の増殖抑制効果を示す。 図１６は、AGM-330によるporkine sapovirus(PSaV)の増殖抑制効果を示す。 図１７は、AGM-330による半数最大細胞毒性濃度(half maximal cytotoxic concentration、CC50)とAGM-330のinfluenza A virus(IAV)、bovine coronavirus(BCoV)、porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)、bovine rotavirus(RVA)、porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)、porcine sapovirus(PSaV) の半数最大阻害濃度(half maximal inhibitory concentration、IC50) および選択指数(selective index、[SI = CC50/IC50])を示す。 図１８は、AGM-330による半数最大細胞毒性濃度(half maximal cytotoxic concentration、CC50)とAGM-330のsevere acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2) の半数最大阻害濃度(half maximal inhibitory concentration、IC50)及び選択指数(selective index、[SI = CC50/IC50]を示す。 図１９は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対するAGM-330d-mCPP(AGM-380D)の体重変化を示す。 図２０は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対するAGM-330d-mCPP(AGM-380D)の改善された肺肉眼的病変率を示す。 図２１は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対する陰性対照群(NC)肺組織の肉眼的肺病変度を示す。 図２２は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対するウイルス対照群(VC)肺組織の肉眼的肺病変度を示す。 図２３は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対してAGM-330d-mCPP(AGM-380D、0.2mg/kg)を投与した肺組織の肉眼的肺病変度を示す。 図２４は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対してAGM-330d-mCPP(AGM-380D、2mg/kg)を投与した肺組織の肉眼的肺病変度を示す。 図２５は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対してAGM-330d-mCPP(AGM-380D、6mg/kg)を投与した肺組織の肉眼的肺病変度を示す。 図２６は、SARS-CoV-2感染ハムスターに対する対照群及び試験群の肺組織病理分析を示す。 図２７は、AGM-330のinfluenza A virus(IAV)感染に対するin vivo抗ウイルス効果を示す。 図２８は、AGM-330とoseltamivirの混合投与によるinfluenza A virus(IAV)感染に対するin vivo抗ウイルス効果を示す。 図２９は、AGM-330のinfluenza A virus(IAV)の複製抑制効果を示す。
他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
本発明は一観点から、
ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドを含む抗ウイルス組成物であり、前記AGMペプチドは、次の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ウイルス組成物に関する。
(a) 配列番号1ないし配列番号8のいずれかで表されるアミノ酸配列、及び
(b) 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、以下の群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列。
(i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
(ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
(iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入。
機能的かつ具体的に腫瘍を標的とすることができるペプチドリガンドの発見は、がんの診断と治療に新たな機会を提供している。しかし、ペプチドリガンドの使用は、その短い生物学的半減期のために大きく制限されてきた。
本発明では、多重抗原ペプチド(multiple-antigen-peptide、MAP)合成法と一緒にOBOC(one-bead-one-compound)組み合わせ法を使用して2,600,000個のペプチドライブラリを合成した後、そこから表１に記載のアミノ酸配列を持つ新規ながん特異的ペプチドリガンドであるAGM-330、AGM-331、AGM-332、AGM-333、AGM-334、AGM-335、AGM-336、AGM-337を同定し(図３参照)、細胞結合分析、柔細胞分析及び蛍光共焦点顕微鏡を利用して、試験管内(in vitro)及び生体内(in vivo)で前記ペプチドリガンドががん細胞に特異的に結合することを確認した。
また、pull-down分析およびLC-MS/MS分析により、膜ヌクレオリン(nucleolin、NCL)がAGM-330、AGM-331、AGM-332、AGM-333、AGM-334、AGM-335、AGM-336、AGM-337の標的タンパク質であることを確認した。
前記８つのペプチドのうち3つ(AGM-330、AGM-331およびAGM-332)は、乳がん細胞株(MDA-MB-231)に対して強く、特異的かつ優先的な結合を示し、ヒト正常乳房細胞株(MCF-10A)には結合しないか、または弱く結合した(図４aおよび図４b参照)。
また、配列番号1のアミノ酸配列を持つAGM-330で、一部のアミノ酸残基の変異を持つ場合でも、ヌクレオリンに対する強い特異的な結合特性を維持することを確認した。
具体的には、本発明において、前記アミノ酸変異は、配列番号1のアミノ酸配列から、
(i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
(ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
(iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入。
からなる群から選択された1つ以上の変異体であってよいが、これに限定されない。
好ましくは、前記アミノ酸変異は、配列番号1のアミノ酸配列において、
(i) N末端から5番目のメチオニン(methionine)残基のロイシン(leucine)またはノルロイシン(norleucine)への置換、
(ii) N末端から7番目のチロシン(tyrosine)残基のフェニルアラニン(phenylalanine)への置換、および
(iii) C末端にロイシン(leucine)およびリジン(lysine)残基の挿入
からなる群から選択された1つ以上の変異であってよいが、これに限定されない。
本発明において、前記変異を含むアミノ酸配列は、配列番号9ないし配列番号15及び配列番号20からなる群から選択されることを特徴とするが、これに限定されない(表２)。
本発明において、「AGM」、「AGMペプチド」または「AGMペプチドリガンド」とは、前記配列番号1ないし配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを総称、またはそのうち1つ以上のペプチドを意味する。
本発明において、前記AGMペプチドは、ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合することを特徴とする。
正常細胞においてヌクレオリンは、主に核小体に存在するが、核質、細胞質または細胞膜にも一部存在し、リボソーム生合成、染色体の再構成および安定性、DNAおよびRNA代謝、rRNA転写、細胞周期調節、細胞分裂、新生血管生成およびmicroRNA処理などの様々な細胞機能に関与している(Dario Palmieri, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jul 28;112(30):9418-23)。
NCLの発現は、様々ながん細胞(甲状腺がん、乳がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がんなど)で有意に上方制御されることが報告されており(Shen N, et al. Oncotarget. 2014; 5: 5494-509)、上方制御されたNCLの発現は、悪性腫瘍およびがん転移に関連する。
細胞質に過剰発現したNCLは、Bcl-2、IL2などの抗anti-apoptotic因子を安定化させ、p53などの腫瘍抑制因子の発現を抑制することでがん細胞の増殖と分化に関与する。細胞膜に過剰発現されたNCLは、HDGFやVEGFなどの成長因子の受容体として作用し、endocytosisによって核内に移動してがん細胞の増殖及び転移を促進させる役割を果たす。細胞膜NCLは、ウイルス(RSV、HIV、H1N1、H3N2、H5N1およびH7N9)の付着または宿主細胞への侵入を媒介し、ウイルス感染と拡散に影響を与える(Kotb Abdelmohsen and Myriam Gorospe, RNA Biology. 2012; 9: 799-808)。
人体細胞は、がん発生及びウイルス感染によってヌクレオリンを異常に過剰発現させ、これらの過剰発現したNCLが細胞膜と細胞質に高い濃度で分布するため、NCLは、抗腫瘍及び抗ウイルス薬物開発のための新規標的となる可能性がある。
本発明の一実施形態において、AGMペプチド、具体的にAGM-330は、抗がん活性を示すだけでなく、ウイルスの増殖及び複製を抑制し、ウイルス感染を抑制する抗ウイルス活性を示すことを確認した。
本発明における用語、「抗ウイルス(anti-virus)活性」または「抗ウイルス(効)能」とは、前記ウイルスの様々な亜型と変異型ウイルス粒子が宿主細胞で複製または増殖するのを阻害する能力を意味する。
本発明において、前記抗ウイルス組成物は、前記AGMペプチドに、-[CH2-CH2-O]-の構造を有するエチレングリコール基(ethylene glycol group)を2つ以上含むポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)鎖(chain)が接合されたAGMペプチドPEG接合体を含むことを特徴とする。
本発明において、ポリエチレングリコール鎖は、化学式1の構造を有する一般的なポリエチレングリコール鎖だけでなく、その誘導体(derivatives)を全て含む概念として用いられ、ポリエチレングリコール鎖の誘導体としては、化学式2の構造を有するアミノポリエチレングリコールカルボン酸(amino polyethylene glycol carboxylic acid)が例示できるが、これに限定されない。
ポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)とのコンジュゲーション(PEGylation)は、治療用タンパク質の薬理学的特性を改善するために広く使用されてきた(Gupta V, et al. J Cell Commun Signal. 2019; 13: 319-30)。本発明においては、立体障害を減らし、親水性を高めるために、PEGylationを使用した。しかし、PEGは、免疫原性のため、治療分子に否定的な臨床的影響を与える(Moreno A, et al. Cell Chem. Biol. 2019; 26: 634-44.e3)。以前の研究は、PEGylationされた分子に対する抗PEG免疫反応は、PEGylation程度の免疫原性とPEGの分子量に依存することを提案した(Wan X, et al. Process Biochem. 2017; 52: 183-91)。
本発明において、前記ポリエチレングリコール鎖は、2ないし24個のエチレングリコール単位を有することを特徴とし、好ましくは4ないし20個、さらに好ましくは6ないし18個、最も好ましくは6ないし12個のエチレングリコール単位を有することを特徴とするが、これらに限定されない。
前記ポリエチレングリコール鎖は、AGMペプチドとリンカーを介して連結されていることを特徴とする。これにより、AGMペプチドPEG接合体は、次の構造式1の形態を有するが、これに限定されない。
AGM-L1-PEG (構造式1)
前記構造式1において、「PEG」はポリエチレングリコール鎖を意味し、L1はリンカーを意味する。
前記リンカーL1は、好ましくは、単一結合(直接結合)、C1-C20アルキル、C1-C20アルキレン、-S-、-NH-及び-O-からなる群から選択されるが、これらに限定されなく、AGMペプチドのC末端アミノ酸のカルボキシ基と共に-CONH-の形態をなすペプチド結合(peptide bond)を含むことがあるが、これらに限定されない。
また、前記構造式1のAGMペプチドPEG接合体のうち、AGMと結合しているPEGに、他方の末端には他の物質、好ましくは薬物(drug)を接合させるための官能基(functional group)が導入されることがある。このような官能基には、カルボキシル(COOH)、アミン(NH2)およびチオール(thiol)基などが例示されるが、これらに限定されない。
例示的に、構造式2ないし構造式4のように、AGMペプチドPEG接合体のうち、AGMペプチドと結合しているPEGの他方の末端にアミン(NH2)を有するリジン(Lysine、K)及び／又はチオール基を有するシステイン(Cysteine、C)が接合された形態であるが、これに限定されない。
AGM-L1-PEG-K (構造式2)
AGM-L1-PEG-C (構造式3)
AGM-L1-PEG-K-C (構造式4)
例示的に、本発明の一実施形態において、AGMペプチドのうちAGM-300とPEGの接合体であるAGM-330-PEG接合体のAGMと結合しているPEGの他方の末端にリジンおよびシステインが導入されたAGM-330 monomer(AGMm)は、構造式5のような形態である。
RHGAMVYLK-L1-PEG-K-C (構造式5)
前記構造式5において、PEGは、AGM-330 C末端のリジン(K)のカルボキシ基とアミンが縮合反応により構造式6のような形のペプチド結合を含むリンカー(L1)によって連結された形態であってよいが、これに限定されない。
本発明において、前記組成物は、前記AGMペプチドPEG接合体を2つ以上含む多量体(multimer)を含むことを特徴とする。
本発明において、前記多量体は、2ないし8個のAGMペプチド、またはAGMペプチドPEG複合体を含み、好ましくは2ないし6個、より好ましくは2ないし4個のAGMペプチド、またはAGMペプチドPEG複合体を含むことを特徴とするが、これらに限定されない。
例示的に、本発明において、前記多量体のうち二量体(dimer)は、2つのAGMペプチド、またはAGMペプチドPEG接合体がリンカー(L2)によって互いに連結されることを特徴とし、多量体のうち四量体(tetramer)は、前記二量体が追加のリンカー(L3)によって互いに連結されることを特徴とするが、これに限定されない。さらに、六量体(hexamer)や八量体(octamer)及びそれ以上の多量体も類似した形で連結されることは、当業者には自明である。
例示的に、本発明によるAGMペプチドPEG複合体の二量体および四量体は、構造式7および構造式8のような形態を有するが、これに限定されない。
前記リンカーL2およびL3は、互いに同一または相異なるもので、独立して切断可能(cleavable)または切断不可(non-cleavable)である。
前記リンカーL2およびL3は、独立して単一結合(直接結合)、アミノ酸またはその誘導体(derivatives)、C1-C20アルキル、C1-C20アルキレン、-S-、-NH-および-O-からなる群から選択されるが、これらに限定されなく、好ましくはアミノ酸またはその誘導体、より好ましくは2以上のアミノ基を有するリジン(Lys、K)またはアルギニン(Arg、R)であるが、これらに限定されない。
最も好ましくは、前記リンカーL2及びL3としては、リジン(Lys、K)を使用することができ、前記リジンのアミン基(NH2)が-C-CONH-のようなペプチド結合と類似した形でPEGと連結することがあるが、これに限定されない。
また、前記AGMペプチド、またはAGMペプチドPEG複合体のリンカーの一末端には、他の物質、好ましくは薬物(drug)を接合させるための官能基(functional group)が導入されることがある。例えば、前記構造式7でのL2、構造式8でのL3に薬物(drug)を接合させるための官能基(functional group)が導入されることがある。
これらの官能基には、アミン(NH2)およびチオール(thiol)基などが例示できるが、これらに限定されなく、例示的にアミン(NH2)を有するリジン(Lysine、K)および/またはチオール基を有するシステイン(Cysteine、C)が導入された形態であるが、これに限定されない。
例示的に、本発明の一実施形態において、AGM-330 dimer(AGM-330d)およびAGM-330 tetramer(AGM-330t)は、後記の表３のような構造を有することがあるが、これに限定されない。
本発明において、前記組成物は、コロナウイルス(Coronavirus、CoV)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)、豚流行性下痢ウイルス(Porkine epidemic diarrhea virus、PEDV)、牛ロタウイルス(Bovine rotavirus、RVA)、豚サポウイルス(Porkine sapovirus)、豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Porkine reproductive and respiratory syndrome virus)、アルフイウイルス(Alfuy virus)、バンジウイルス(Banzi virus)、チクングンヤウイルス(Chikungunya virus)、デング熱ウイルス(Dengue virus)、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus、HBV)、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus、HCV)、ヒトサイトメガロウイルス(Human cytomegalovirus)、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus、HIV)、日本脳炎ウイルス(Japanese encephalitis virus)、ココベラウイルス(Kokobera virus)、クンジンウイルス(Kunjin virus)、キヤサナ森林病ウイルス(Kyasanur forest disease virus)、ループ病ウイルス(louping ill virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、メタニューモウイルス(Metapneumovirus)、モザイクウイルス(Mosaic Virus)、マレーバレーウイルス(Murray Valley virus)、パラインフルエンザウイルス(parainfluenza virus)、ポリオウイルス(polio virus)、ポワサンウイルス(Powassan virus)、呼吸器細胞融合ウイルス(Respiratory syncytial virus、RSV)、ロシオウイルス(Rocio virus)、セントルイス脳炎ウイルス(Saint Louis encephalitis virus)、ダニ媒介脳炎ウイルス(Tick-borne encephalitis virus)、ウエストナイルウイルス(West Nile virus)及び黄熱病ウイルス(Yellow fever virus)からなる群から選択される1種以上に対する抗ウイルス活性を有することを特徴とするが、これに限定されない。
好ましくは、前記コロナウイルスは、SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2、SARS-CoV-2)または牛コロナウイルス(Bovine coronavirus、BCoV)であり、前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス(IAV)であることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、前記抗ウイルス組成物は、既に使用されている薬物、好ましくは、抗ウイルス剤と併用して使用することができる。
本発明の抗ウイルス組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。
本発明の組成物に使用される担体は、薬剤学的に許容される担体、補助剤およびビヒクルを含み、総称して「薬剤学的に許容される担体」という。本発明の組成物に使用できる薬剤学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、イオン交換、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝剤(例えば、複数のリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物)、水、塩または電解質(例えば、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムおよび亜鉛塩)、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロッキングポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛紙などが挙げられる。
本発明による組成物は、経口投与または非経口投与することができ、非経口投与は、鼻内、鼻腔内、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、腸管、局所、舌下または直腸投与の形で投与することができるが、これらに限定されない。
好ましくは、経口投与されるか、鼻内または鼻腔内投与され、特に鼻内または非経口投与の場合は、スプレー(spray)またはエアロゾル(aerosol)形態での投与、または吸入(inhalation)投与されることがより好ましいが、これらに限定されない。前記鼻内または鼻腔内投与用組成物は、薬剤の分野でよく知られている技術に従って製造し、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生体利用率を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび/またはその他の本分野で知られている可溶化剤または分散剤を使用して塩水中の溶液として製造することができる。
別の態様として、本発明による組成物は、無菌注射用の水性または油性懸濁液としての無菌注射用製剤の形態である。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤(例えば、ツイン80)および懸濁剤を使用して、この分野における公知の技術に従って製剤化することができる。また、滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液(例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液)であってよい。許容的に使用できるビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油が通常、溶媒または懸濁化媒体として使用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含み、刺激性の低い任意の不揮発性油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が薬剤学的に許容される天然油(例えば、オリーブ油またはヒマシ油)、特にこれらのポリオキシエチル化されたものが注射製剤に有用である。
本発明の組成物は、これらに限定されないが、カプセル、錠剤及び水性懸濁液及び溶液を含み、経口的に許容される任意の容量形で経口投与することができる。経口錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的に添加される。カプセル剤として経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液を経口投与する場合の有効成分は、乳化剤および懸濁剤と配合される。必要に応じて、甘味料および／または香料および／または着色剤を添加することができる。
また、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の形で投与することもできる。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であるが直腸温度では液体である適切な非刺激性賦形剤と混合して製造することができる。これらの物質としては、これらに限定されないが、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明による組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤として製剤化することができる。
好ましい態様として、経口投与のための医薬組成物は、固体状の賦形剤と共に有効成分を混合することによって製造することができ、錠剤または糖衣錠の形で製造するために顆粒の形で製造することができる。適切な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソビトールなどの糖類、またはトウモロコシ、小麦粉、米、ジャガイモまたは他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビアゴム、タガカンスガムを含むガム類などのカルボヒドラート、またはゼラチン、コラーゲンなどのタンパク質ピーラーを使用することができる。必要に応じて、架橋されたポリビニルピロリドン、アガおよびアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなど、それぞれの塩の形の崩壊剤または溶解剤を添加することができる。
本発明は別の観点から、ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドと細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)が結合したAGMペプチドCPP融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物であり、前記AGMペプチドは、次の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ウイルス組成物に関する。
(a) 配列番号1ないし配列番号8のいずれかで表されるアミノ酸配列、及び
(b) 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、後記の群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列。
(i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
(ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
(iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入。
本発明における用語、「細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)」は、一種のシグナルペプチド(signal peptide)として、タンパク質、DNA、RNAなどの高分子物質を細胞内に伝達する目的で使用される特定のアミノ酸配列の組み合わせのペプチドである。現在まで様々な低分子化合物、タンパク質、ペプチド、RNA、DNAなどの高分子物質の細胞内伝達のために利用されている。細胞透過性ペプチドのほとんどは、タンパク質透過ドメイン(protein-transduction domain)や膜移動シーケンス(membranetranslocating sequence)から誘導され、一般的な外部物質の細胞内流入経路とは異なり、細胞膜の損傷を与えずに細胞内に移動し、細胞膜を通過できないものと知られているDNAやタンパク質まで細胞内に伝達させることができる画期的な役割を果たすことが期待されている。
本発明の融合ペプチドは、細胞透過性ペプチドを利用しており、前記細胞透過性ペプチドは、細胞内在化(endocytosis)機序により細胞内に入る特徴を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは、後記表4に列挙した細胞透過性ペプチドまたはその変異体で構成される群から選択して使用することができる。
さらに好ましくは、前記細胞透過性ペプチドは、後記表５に列挙された細胞透過性ペプチドまたはその変異体で構成される群から選択されることを特徴とし、後記表５のペプチドの製造及び特性は、韓国登録特許第10-1169030号を参照することができる。最も好ましくは、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号38のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。

本発明の一実施例においては、前記表５のDS4-3ペプチドで示される配列番号38の細胞透過性ペプチドを選択して実験を行ったが、実際に使用した前記細胞透過性ペプチド以外に他の細胞透過性ペプチドを本発明のペプチドと融合させた場合にも、本発明と同様の効果が現れることは当業者にとって自明であろう。
本発明において、前記AGMペプチドPEG複合体と細胞透過性ペプチドは、リンカーを介して連結されていることを特徴とする。好ましくは、maleimide-carboxy bifunctional linkerを介して連結されることを特徴とするが、これに限定されない。
本発明において、AGMペプチドCPP融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物は、AGMペプチドを含む抗ウイルス組成物に関する説明を準用することができ、アミノ酸配列、AGMペプチドPEG接合体、多量体およびウイルスの種類などは、先に定義したものと同様に解釈される。
本発明は、別の観点から、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用医薬的組成物に関する。
本発明は、別の観点から、前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を投与する段階を含むウイルス感染症の予防または治療方法に関する。
本発明は、別の観点から、ウイルス感染症の予防または治療のための前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の用途に関する。
本発明は、別の観点から、ウイルス感染症の予防または治療用薬剤の製造のための前記ペプチド、融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の使用に関する。
本発明において、前記薬学的組成物、方法、用途および使用は、本発明によるAGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を含むので、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物と重複する内容は、その記載を省略する。
本発明において、用語「予防」とは、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の投与により、ウイルス感染症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。また、用語「治療」とは、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物の投与により、ウイルス感染症の症状が改善または完治するあらゆる行為を意味する。
本発明によるウイルス感染症の予防または治療用組成物は、薬学的に有効な量の前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を単独で含むか、または1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む。前記薬学的に有効な量とは、ウイルス感染症の症状を予防、改善および治療するのに十分な量をいう。
前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されたときに、通常、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応またはこれと類似した反応を引き起こさないものを意味する。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、キシリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムケイ酸塩、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。さらに、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。薬学的に許容される適切な担体および製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
また、本発明の医薬的組成物は、AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物とともに、ウイルス感染症の治療効果を有する公知の有効成分を1種以上含む。
本発明の組成物は、ヒトを除く哺乳動物に投与された後、有効成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように、当業界で公知の方法を使用して製剤化することができる。製剤は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態である。
本発明の組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む複数の経路を介して投与することができ、有効成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの複数の因子に応じて適切に選択することができ、本発明によるウイルス感染症の予防または治療用組成物は、ウイルス感染症の症状を予防、改善または治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
本発明において、前記ウイルス感染症は、前記抗ウイルス組成物が抗ウイルス活性を示すウイルスによる感染症であることを特徴とし、非限定的な例として、風邪、インフルエンザ、伝染性単核球症、サイトメガロウイルス感染症、麻疹、急性灰白髄炎(ポリオ)、黄熱、デング熱、B型肝炎、C型肝炎、エイズおよびCovid-19が含まれる。
本発明は、別の観点から、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または改善用の保健機能食品の組成物に関する。
本発明の機能性食品は、酸化予防のための薬剤、食品及び飲料などに多様に利用することができる。本発明の機能性食品は、例えば、各種食品類、キャンディー、チョコレート、飲料、ガム、お茶、複合ビタミン剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲料の形で使用することができる。
本発明の前記抗ウイルス組成物は、ウイルス感染症の予防または改善を目的として食品または飲料に添加することができる。このとき、食品または飲料中の前記抽出物の量は、一般的に、本発明の保健機能食品の組成物は、食品全体重量の0.01ないし50重量％、好ましくは0.1ないし20重量％で添加することができ、健康飲料の組成物は、100mlを基準として0.02ないし10g、好ましくは0.3ないし1gの割合で添加することができるが、これに限定されない。
本発明の健康飲料の組成物は、必須成分として指示された割合で前記抽出物を含有すること以外に、液体成分には特に制限はなく、通常の飲料と同様に、各種の香料や天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前記天然炭水化物の例としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖などの二糖類、例えば、マルトース、シュクロースなどの多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖類及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。前記以外の香料として、天然香料(タウマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオシドA、グリチルリチンなど)及び合成香料(サッカリン、アスパルテームなど)を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物100ml当たり、通常約1ないし20g、好ましくは約5ないし12gである。
本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成香料及び天然香料などの香料、着色剤及び中間剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸剤などを含有することができる。その他、本発明の組成物は、天然フルーツジュース及びフルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。これらの添加剤の割合はそれほど重要ではないが、本発明の組成物100重量部あたり0ないし約20重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
本発明において、前記保健機能食品の組成物は、本発明によるAGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物を含むので、前記AGMペプチド、AGMペプチドCPP融合ペプチドまたは抗ウイルス組成物と重複する内容は、その記載を省略する。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、あくまでも本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業者にとって自明であろう。
実施例１：材料及び方法
実施例 1-1: OBOCライブラリ合成
OBOC ライブラリを solid-phase TentaGel MB NH2 resin (Rapp Polymere GmbH、Tubingen、Germany) で合成した。「split-mix」合成法を行い、それぞれ数百万個のbeads/ligandsのランダムライブラリを含む組み合わせOBOCライブラリを構築した。約2,600,000個のOBOCライブラリの合成のために、5gのTentagel MB NH2 resin(200μm、520,000beads/g)が使用された。ビーズ表面上のリガンドは、9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) chemistryおよびN-hydroxybenzotriazole(HOBt)(GL Biochem、Shanghai、China)/N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC)(GL Biochem) couplingを用いた標準固体状ペプチド合成技術によって合成された。カップリングの完了はninhydrinテストで確認した。ビーズは使用するまで4℃の70%エタノールに保存した。
実施例1-2：倫理及び細胞培養
人間の組織に関連するすべての研究は、韓国の光州科学技術院(Gwangju Institute of Science and Technology)の研究倫理審議委員会(IRB)によって事前承認された(#20191008-BR-48-03-02)。すべての動物実験は、光州科学技術院の実験動物運営委員会(IACUC)の指針に従って行われた(GIST-2019-040)。すべての培養物を95% air/5%のCO2とともに37℃で維持される加湿インキュベーターで成長させた。正常ヒト乳房細胞株MCF-10Aは、American Type Culture Collectionから入手し、bovine pituitary extract(Cambrex Bioscience、Walkersville、MD)を添加したMEGM完全増殖培地(MEGM、Lonza、Walkersville、MD)で増殖させた。正常ヒト結腸直腸細胞株CCD-18Coは、韓国細胞株銀行(Seoul、Republic of Korea)から入手した。MCF-7、MDA-MB-231、HT-29およびHCT-116を含むヒト乳がんおよび結腸直腸がん細胞株は、韓国細胞株銀行から入手した。Jurkat T細胞も韓国細胞株銀行から入手した。Luciferase-発現MDA-MB-231がん細胞株は、PerkinElmer(PerkinElmer、Hopkinton、MA)から入手した。各がん細胞株は、10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)(Gibco)、0.1mg/ml streptomycin(Gibco)及び100units/ml penicillin(Gibco)を添加したRPMI1640(Gibco、Waltham、USA)及びDMEM(Gibco)で培養した。
実施例1-3：がん特異的リガンドに対するOBOCライブラリのスクリーニング
スクリーニング前にビーズを二重蒸留水及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Welgene Inc.、Republic of Korea)で広範囲に洗浄した。trypsin/EDTA(Gibco)を用いてがん細胞及び正常細胞を培養皿から分離し、対応する培養培地で洗浄した。106cells/mlで再懸濁し、ペトリ皿のOBOCビーズと37℃の加湿CO2インキュベーターで撹拌しながら(60rpm)培養した。細胞によって結合されたビーズは、顕微鏡下で1つ以上の細胞層で覆われた中心ビーズを有するバラ型(rosettes)として現れた。倒立顕微鏡(inverted microscope)下でpositiveビーズをピペットで取り出し、guanidine-HCL(8M、20min)で処理してビーズ表面の細胞及びタンパク質を除去し、正常乳房上皮細胞で2次スクリーニングを行い、偽陽性結合を除去した。両ラウンドで細胞結合を有するビーズのみを選別し、ペプチドシークエンシングを行った。
実施例1-4：血清安定性試験
予熱した100%ヒト血清(Sigma-Aldrich)を用いてペプチドの保存溶液(100μM)を10倍に希釈し、37℃で0、3、6、9、24時間培養した。PBS中のペプチドが対照群として含まれた。4℃で10分間3Mの最終濃度で尿素(urea)で血清タンパク質を変性させた後、最終濃度7%(v/v)(4℃、10分)でtrichloroacetic acidで血清タンパク質を沈殿させ、遠心分離(17,000×g、10分)して反応を停止させた。それぞれのサンプルの上層液を回収し、solvent A(0.05%(v/v) TFA in H2O)で5-65% solvent B(acetonitrile 90%(v/v) with 0.045%(v/v) TFA in H2O)の線形勾配を使用して215nmでモニタリングしながら1ml/minの流速で25分かけてanalytical columnを行った。各ペプチドの溶出プロファイルは、0時点からPBSサンプルによって確認された。血清処理されたサンプルに残っているペプチドの割合は、各時点で得られたペプチドのピークの高さと0時点で得られたペプチドのピークの高さを比較することによって決定した。各実験は3回行った。
実施例1-5: Biotin pull-down analysis
細胞溶解物(500μg/ml)をbiotinylated AGM-330(500ng/ml)と一緒に4℃で12時間培養した後、streptavidin beads(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)によって1時間室温でpull-downさせた。培養後、ビーズを洗浄バッファーで3回洗浄した。溶出バッファーをビーズに加え、ビーズからタンパク質を抽出し、最終的にSDS-PAGEで分析した。Biotin pull-down分析から由来したタンパク質を識別し、特徴づけるために、ProteomeTech(Seoul、Korea)でLC-coupled ESI-MS/MS分析を行った。
実施例1-6: AGM-330結合ドメインの識別
ヒトNCL cDNAクローン(Addgene)からGFP-NCL(残基1-710)、GFP-△N-NCL(residues 322-710)およびGFP-△C-NCL(residues 1-321)を含むNCL constructsを作成し、pEGFP-C2ベクター(Addgene)のXhoIおよびBamHI sitesにサブクローニングした。これらのベクターは、メーカーの勧告に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)によって形質導入(transfection)させた。Biotinylated AGM-330ペプチドをstreptavidin beads(Thermo Fisher Scientific)に添加し、混合物を室温で1時間攪拌しながら培養した。ビーズは、洗浄バッファーで3回洗浄した。洗浄後、GFP-tagged NCLタンパク質を含む形質導入された細胞溶解物から調製した溶解物(300μl)にビーズを添加した。反応混合物を4℃で12時間培養し、AGM-330とGFP-tagged NCLタンパク質が結合するようにした。その後、ビーズを洗浄バッファーで洗浄した。同じ容量の2X電気泳動サンプルバッファーをビーズに添加し、95℃で5分間加熱することでビーズからタンパク質を抽出した。SDS-PAGEおよび免疫ブラット分析でタンパク質を最終的に分析した。
実施例1-7：Jurkat細胞からのNCLの精製
25mlの20mM Tris/HCl、pH 7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、5mM β-mercaptoethanol、0.5%(v/v) Triton X-100、1mM marimastat(AdooQ Bioscience、Irvine、CA、USA)、protease inhibitor cocktail(Millipore、Billerica、MA、USA)で1.0X109 Jurkat細胞を4℃で1時間溶解してNCLを製造した。v) Triton X-100、1mMマリマスタット(AdooQ Bioscience、Irvine、CA、USA)、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Millipore、Billerica、MA、USA)。核を1200xgで5分間遠心分離してペレット化した後、上層液を12,000xgで30分間遠心分離し、-80℃で保存した。核のない(nuclear-free)抽出物からNCLを精製するために、迅速な2段階のクロマトグラフィー技法を使用した。すべての段階は、1mM marimastat及び完全なprotease inhibitor cocktailの存在下、氷冷バッファーとカラムを使用して4℃で実施した。Jurkat細胞(25ml)の細胞質抽出物をpH 7.0、20mMリン酸ナトリウムで10倍希釈し、5mlのMono Q 5/50 GLカラム(Sigma-Aldrich)に通した。pH 7.0、150mlの20mMリン酸ナトリウムでカラムを洗浄した後、1M NaClを含む10mlの同じバッファーで吸着されたタンパク質を溶出した。溶出液を50mM Tris/HCl、pH 7.9、5mM MgCl2、0.1mM EDTA、1mM β-mercaptoethanol(buffer A)で10倍希釈し、同じバッファーで平衡化した1ml HiFiQ heparin HP column(Protein Ark、UK)にロードした。0.2M ammonium sulfateを含む20mlのバッファーAでゲルを洗浄し、0.6M ammonium sulfateを含む2mlのバッファーAでタンパク質を50μl分画して溶出させた。NCLを集め、4℃で2時間1mM marimastatを含むPBSに透析し、-80℃で保存した。Coomassie blueで染色した10% SDS acrylamide gelの追加コントロールは、単一の105 kDaタンパク質バンドとして精製されたNCLの存在を確認した。NCLの部分分解産物に該当する2つの70および50 kDaのタンパク質バンドが、全タンパク質の10%未満の量で観察された。
実施例1-8：結合親和性
AGM-330の結合親和性は、SPR(surface plasmone resonance) spectroscopy(Biacore T-200)によってテストされた。組換えnucleolinタンパク質をCM5 sensorchipに固定した後、AGM-330を濃度別(20nM - 2.5μM)に処理してそれぞれに対するsensogramを分析し、KD値を決定した。
実施例1-9：統計分析
すべての統計データは、平均±SD(n = 3)で表示した。二つのグループ間の統計的比較は、Student's t testによって決定され、複数のグループ間の比較は、one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisonによって決定された。in vivo実験の場合、マウスの数は各凡例に示した。Log-rankテストは、Kaplan-Meier analysisに使用されt。*、**、及び***は、それぞれP < 0.05、P < 0.01、P < 0.001を示す。
実施例２：OBOCコンビネーションスクリーニング及びMAP合成法によるがん標的化ペプチドリガンドの同定及び特性の確認
新しいがん特異的ペプチドリガンドを同定するために、5gのTentagel MB NH2 resins(200μm、520,000beads/g、図３)を使用して、約2,600,000個のライブラリを合成した。ビーズに記載されたペプチドライブラリ(一度に50,000～100,000個のビーズを使用)をヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231)と混合した。合計約1,000,000個のビーズをスクリーニングし、8個のポジティブなビーズを検出し、マイクロシークエンスのために分離した。これらの8つのペプチドのうち3つ(AGM-330、AGM-331およびAGM-332)は、MDA-MB-231に対して強い優先的な結合を示し、ヒト正常乳房細胞株(MCF-10A)には結合しないか、または弱く結合した(図４a、図４b)。次に、これらの3つのペプチドをfluorescein isothiocyanate(FITC)でラベリングし、MDA-MB-231細胞に結合できるかどうかを確認した。AGM-331およびAGM-332と比較すると、AGM-330で最も強い蛍光シグナルが検出された(図４c)。細胞成長ビーズ分析(cell-growth-on-bead assay)と蛍光イメージングからスクリーニング結果を確認するために、AGM-330をTentagel MB NH2 resinで再合成した。細胞成長ビーズ分析の結果、AGM-330ビーズは、15分以内にヒト乳がん細胞株(MCF7およびMDA-MB-231)とヒト結腸直腸がん細胞株(HT-29およびHCT-116)によって完全に覆われた(図４d)。一方、AGM-331およびAGM-332は、比較的非特異的で、ヒト正常乳房細胞株(MCF-10A)およびヒト正常結腸直腸細胞株(CCD-18Co)に結合した。さらに、AGM-330は、MCF-10AまたはCCD-18Co細胞に非常に弱く結合するか、まったく結合しなかったため、イメージングおよび治療的標的化製剤の両方に対する優れた候補となる可能性がある。
現在、安定性が低いため、治療薬としてのペプチドの使用は大きく制限されてきた。ペプチドは、in vivoで主にプロテアーゼ及びペプチダーゼによって分解される(Bottger R, et al. PLoS One. 2017; 12: e0178943)。本発明では、ペプチドリガンドの安定性を改善するために、MAPデンドリマー形態のAGM-330を合成し、これはプロテアーゼおよびペプチダーゼ活性に対して獲得された抵抗性により、増加した安定性を示すことができる。AGM-330の合成(図４e)は、lysine core-conjugated Wang resin(2,3)を作るために、20% piperidineおよびDMFの存在下でFmoc-Cys(Trt)Wang resin(1)およびFmoc-Lys(Fmoc)-OHで開始される。続いて、20% piperidineの存在下でRHGAMVYLK-PEG12-OHで処理し、Fmoc-およびTrt-保護されたAGM-330(4)を製造した。AGM-330(4)のFmoc-およびTrt-保護基は、DMFのpiperidineによって速やかに除去され、AGM-330(5)が製造された。
選定されたペプチドリガンドAGM-330の生体内安定性と結合力の増進のために、MAP(Multiple Antigen Peptide)合成法により二量体、四量体の形で合成した。
ペプチドの安定性の増進有無を評価するために、ペプチドのin vivo半減期を分析した。AGM-330m、AGM-330d、AGM-330t 2mg/kgをC57BL/6マウスの尾静脈を通して注入し、残った血清中のペプチド部分は抗AGM-330抗体を通してELISAプレートに直ちに固定させた。吸光度は、VersaMax ELISA plate reader(Molecular Devices)を使用して450nmの波長で測定し、薬物動態(Pharmacokinetics)は、phoenix WinNonlin 8.1(Pharsight Corporation、Mountain View、CA、USA)プログラムで分析した。分析結果、AGM-330m、AGM-330d、AGM-330tの半減期(T1/2)は、それぞれ0.42±0.33時間、1.82±0.36時間、9.43±1.21時間であり、血中最大集中時間(Tmax)は、全て0.167時間であった。血中最大濃度(Cmax)は、それぞれ1.27±0.12μg/mL、1.71±0.11μg/mL、1.875±0.67μg/mLであり、曲線下面積(AUC)は、それぞれ0.64±0.09μg/h/mL、1.77±0.12μg/h/mL、21.42±0.81μg/h/mLであった(図５)。その結果、四量体AGM-330(AGM-330t)が単量体または二量体ペプチドよりも安定性が高いことが確認された。
次に、MAPリガンドががん細胞に選択的に結合できるかどうかを調べるために、FITC-標識されたAGM-330(AGM-330-FITC)で処理されたがん細胞を非処理細胞と比較した。AGM-330-FITCを無血清培地で37℃、2時間、細胞(1X105)と培養し、接合体(conjugates)をそのまま維持させた。その後、固有蛍光ペプチド処理された細胞を非処理細胞に対して、平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)の変化に基づいて比較し、測定した(図４f)。その結果、AGM-330-FITCは、MCF-7、MDA-MB-231、HT-29およびHCT-116に対する有意ながん細胞結合を示し、これは非処理細胞と比較して処理細胞のMFIの相対的な増加によって証明されたことと同じである。対照的に、2時間培養後の接合体は、MCF-10AおよびCCD-18Coを含む正常細胞に対して著しく減少した結合を示したが、がん細胞に対しては強い優先的結合を示した。
実施例３：AGM-330の潜在的な標的であるがん細胞成長の強力な調節因子NCL
AGM-330の未知の標的タンパク質を特定するために、親和性カラムクロマトグラフィー(affinity column chromatography)と質量分析法に基づくプロテオミクス的アプローチを用いて、MDA-MB-231細胞の細胞溶解物からAGM-330相互作用タンパク質を確認した(図６a)。親和性カラムクロマトグラフィー後、SDS-PAGE分析により、溶出画分にのみ存在する複数の異なるタンパク質バンド(55-100kDa)を確認した(図６b)。LC-MS/MS分析を使用して6つのタンパク質を確認し、これらの切除されたバンドのペプチド識別は、100kDaにおいて主要なタンパク質バンドの1つがヌクレオリン(NCL)として特性化されたことを示した。NCLは、710個のアミノ酸で構成され、LC-MS/MS分析によって識別された22個の異なるペプチド断片は、NCLのアミノ酸配列と一致した(NCBIデータベースのヒトNCL(accession number: gi189306)に対するtotal score 881及び24% sequence coverage)(図６d-d)。さらに、抗NCL抗体を用いた免疫ブロット分析により、AGM-330親和性カラムからの溶出物におけるNCLの濃縮をさらに確認した(図６e)。したがって、プロテオミクス研究は、NCLがAGM-330-相互作用タンパク質であることを示唆している。
AGM-330のNCLに対する結合親和度を確認するために、AGM-330を使用してSPR(surface plasmone resonance) testを行った。図７に示すように、Kd値が約57.7nMで、NCLに対して非常に高い結合親和度を示すことを確認した。
AGM-330とNCLの相互作用に関与するドメインを調べるためにbiotin pull-down分析を使用した。Biotinylated AGM-330(AGM-330-Biotin)をbaitとして使用し、NCL変異体をプルダウンさせた。NCLのいくつかの欠失変異体が生成された。いずれもGFPに融合した野生型および様々なNCL変異体、NCL1(1-710)、NCL2(323-710)およびNCL3(1-322)をコードする発現ベクターで形質転換したHEK293T細胞から細胞抽出物を製造した。AGM-330-Biotinは、野生型NCL1(1-710)およびNCL3(1-322)をプルダウンさせたが、NCL2(323-710)はプルダウンさせなかった(図６f)。これらの結果は、NCLのN末端領域(1-322)がAGM-330の結合において重要であることを示している。AGM-330とNCLの直接的な相互作用をさらに確認するために、精製されたNCLとAGM-330-Biotinをbiotin pull-down分析に使用した。抗NCL抗体を用いた免疫ブロット分析により、溶出画分におけるNCLの濃縮を確認した(図８)。まとめると、AGM-330がNCLと直接的に相互作用することを意味する。
実施例４：AGM-330とCPPが結合した融合ペプチドの合成
AGM-330の細胞透過性を増加させるために、細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)を結合させて融合ペプチドを製作した。
AGM-330tにmaleimideと結合したCPP(RIMRILRILKLAR、配列番号38)をpH 7.0～7.5で反応させると、AGM-330tの官能基であるthiol基とthiol-maleimide reactionにより結合し、AGM-330t-mCPP融合ペプチドが合成される(図９)。
製作されたAGM-330t-mCPP融合ペプチドのHPLC及びMS分析の結果、retention timeは23.2分、分子量は7876 Daであることを確認し、AGM-330t、maleimide-mCPPの分析結果とともに図１０に示した。
実施例５：in vitro実験によるAGM-330のinfluenza A virus(IAV)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるinfluenza A virus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したA549細胞(Lung cancer cell line、American Type Culture Collection [ATCC])がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、influenza A virus(IAV、 Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1)、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で24時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、rabbit polyclonal primary antibody against influenza A virus PB1 antigenとHRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-380d-mCPPとAGM-380t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１１A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるinfluenza A virus増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するために、immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したA549細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、influenza A virus(IAV、Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1)、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で8時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against influenza A virus M2 antigenを各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合した goat anti-mouse IgG polyclonal antibody希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１１B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるinfluenza A virus増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するためにreal-time PCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したA549細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、influenza A virus(IAV、Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1)、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地で24時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を利用してRNAを抽出した。抽出したRNAは、Random hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。その後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、influenza A virusのPB1に特異的なforward primer(5'-CTGCCAGAAGAAGACAATGAACC-3'、配列番号71)と reverse primer(5'-GGCCATTGCTTCCAATACAC-3'、配列番号72)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１１C)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるinfluenza A virus子孫ウイルス産生の減少を検出するためにcell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したA549細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、influenza A virus(IAV、Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1)、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地で8時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したA549細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against influenza A virus nucleoprotein(NP)抗原を各wellに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 488が結合したgoat anti-mouse IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色し、glycerolで封入後、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１１D)。
その結果、ウイルスタンパク質(PB1)、細胞内ウイルス抗原(M2)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数は、NCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１１)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがinfluenza A virus感染を抑制することが検証された。
実施例６：in vitro実験によるAGM-330のbovine coronavirus(BCoV)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine coronavirus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞(Human cororectal adenocarcinoma cell line、ATCC)がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、bovine coronavirus(BCoV、KWD20 strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、5μg/mL porcine pancreatin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で36時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S) antigenとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１２A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine coronavirus増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するためにimmunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、bovine coronavirus(BCoV、KWD20 strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、5μg/mL porcine pancreatin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で24時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S)抗原を各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合したgoat anti-mouse IgG polyclonal抗体希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄した後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１２B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine coronavirus増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するために、リアルタイムPCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、bovine coronavirus(BCoV、KWD20 strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、5μg/mL porcine pancreatin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地で24時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を利用してRNAを抽出した。抽出したRNAは、Random hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。その後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、bovine coronavirusのN geneに特異的なforward primer(5'-TGGATCAAGATTAGAGAGTTGGC-3'、配列番号73)と reverse primer(5'-CCTTGTGTCCATTCTTCTGACC-3'、配列番号74)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１２C)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine coronavirus子孫ウイルス生産の減少を検出するために、cell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、bovine coronavirus(BCoV、KWD20 strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、5μg/mL porcine pancreatin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地で8時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S)抗原を各wellに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 488が結合した goat anti-mouse IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄した後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色した後、glycerolで封入し、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１２D)。
その結果、ウイルスタンパク質(S)、細胞内ウイルス抗原(S)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数はNCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１２)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがbovine coronavirus感染を抑制することが検証された。
実施例７：in vitro実験によるAGM-330のporkine epidemic diarrhea virus(PEDV)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporkine epidemic diarrhea virus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したVero E6細胞(African green monkey kidney epithelial cell line、ATCC)がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine epidemic diarrhea virus(PEDV、QIAP1401、A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、3μg/mL porcine pancreatic trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で36時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N)抗原とHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１３A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporkine epidemic diarrhea virus増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するためにimmunofluorescence assayを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したVero E6細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine epidemic diarrhea virus(PEDV、QIAP1401、A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、3μg/mL porcine pancreatic trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で24時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N)抗原を各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合した goat anti-mouse IgG polyclonal antibody希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１３B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporkine epidemic diarrhea virus増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するために、real-time PCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したVero E6細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine epidemic diarrhea virus(PEDV、QIAP1401、A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、3μg/mL porcine pancreatic trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を利用してRNAを抽出した。抽出したRNAはRandom hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。その後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、porkine epidemic diarrhea virusのN geneに特異的なforward primer(5'-GCTATGCTCAGATCGCCAGT-3'、配列番号75)と reverse primer(5'-TCTCGTAAGAGTCCGCTAGCTC-3'、配列番号76)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１３C)。
AGM-330d-mCPP と AGM-330t-mCPP による porcine epidemic diarrhea virus 子孫ウイルス産生の減少を検出するためにcell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したVero E6細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine epidemic diarrhea virus(PEDV、QIAP1401、A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、3μg/mL porcine pancreatic trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に18時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したHRT-18G細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N)抗原を各wellに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 488が結合した goat anti-mouse IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色し、glycerolで封入後、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１３D)。
その結果、ウイルスタンパク質(N)、細胞内ウイルス抗原(N)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数はNCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１３)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがPEDV感染を抑制することが検証された。
実施例８：in vitro実験によるAGM-330のbovine rotavirus(RVA)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine rotavirus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したMA104細胞(African green monkey kidney epithelial cell line、ATCC)がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、10μg/mL crystalized trypsinで活性化したbovine species A rotavirus(RVA、NCDV strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で12時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、mouse monoclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigenとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１４A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine rotavirus増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するためにimmunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したMA104細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。10μg/mL crystalized trypsinで活性化したbovine species A rotavirus(RVA、NCDV strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で8時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、mouse monoclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigenを各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合した goat anti-mouse IgG polyclonal抗体希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄した後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１４B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine rotavirus増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するために、real-time PCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したMA104細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、10μg/mL crystalized trypsinで活性化したbovine species A rotavirus(RVA、NCDV strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で12時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を利用してRNAを抽出した。抽出したRNAはRandom hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。その後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、rotavirus VP6 geneに特異的なforward primer(5'-TAGACCAAATAACGTTGAAGTTGA-3'、配列番号77)と reverse primer(5'-GATTCACAAACTGCAGATTCAA-3'、配列番号78)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１４C)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine rotavirus子孫ウイルス産生の減少を検出するためにcell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したMA104細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、10μg/mL crystalized trypsinで活性化したbovine species A rotavirus(RVA、NCDV strain、ATCC)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で8時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したMA104細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために、各wellに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、goat polyclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigenを各wellに入れた後、4℃で8時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、fluorescein isothiocyanate(FITC)が結合したrabbit anti-goat IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色した後、glycerolで封入し、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１４D)。
その結果、ウイルスタンパク質(VP6)、細胞内ウイルス抗原(VP6)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数はNCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１４)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがbovine rotavirus感染を抑制することが検証された。
実施例９：in vitro実験によるAGM-330のporkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporcine reproductive and respiratory syndrome virus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したMARC-145細胞(African green monkey kidney epithelial cell line、ATCC)がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV、LMY strain、a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で36時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、rabbit polyclonal primary antibody against porcine reproductive and respiratory syndrome virus membrane(M) antigenとHRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１５A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるbovine rotavirus増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するためにimmunofluorescence assayを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したMARC-145細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV、LMY strain、a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で16時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。この後、rabbit polyclonal primary antibody against porcine reproductive and respiratory syndrome virus membrane(M) antigenを各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合した goat anti-rabbit IgG polyclonal抗体希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄した後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１５B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporkine reproductive and respiratory syndrome virus増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するために、real-time PCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したMARC-145細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV、LMY strain、a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で36時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を利用してRNAを抽出した。抽出したRNAはRandom hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。この後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、PRRSV M geneに特異的なforward primer(5'-CACCTCCAGATGCCGATGCCGTTTG-3'、配列番号79)とreverse primer(5'-ATGCGTGGTTATCATTTGCC-3'、配列番号80)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１５C)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるPRRSV子孫ウイルス産生の減少を検出するためにcell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したMARC-145細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV、LMY strain、a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency、Korea)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、1μg/mL crystalized trypsin、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で16時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したMARC-145細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために、各wellに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。その後、rabbit polyclonal primary antibody against PRRSV M antigenを各wellに入れた後、4℃で8時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 488が結合した goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄した後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色した後、glycerolで封入し、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１５D)。
その結果、ウイルスタンパク質(M)、細胞内ウイルス抗原(M)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数はNCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１５)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがporkine reproductive and respiratory syndrome virus感染を抑制することが検証された。
実施例１０：in vitro実験によるAGM-330のporkine sapovirus(PSaV)抑制効果の確認
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるporkine sapovirus増殖抑制によるウイルス抗原量の減少を検出するためにwestern blot analysisを行った。まず、コンフルエント(confluent)に達したLLC-PK細胞(Pig kidney epithelial cell line、ATCC)がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine sapovirus(PSaV、Cowden strain、a kind gift from Dr. K.O. Chang、Kansas State、USA)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid)、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で24時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigenとHRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibodyを利用してウエスタンブロッティングを行った。また、AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるウイルス抗原の減少量を定量するために、宿主タンパク質であるGAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)に対するmouse monoclonal primary antibodyとHRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyを用いてウエスタンブロッティングを行った(図１６A)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるPSaV増殖抑制による細胞質内ウイルス抗原量の減少を検出するためにimmunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したLLC-PK細胞がある8-well chamber slideの各chamberをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine sapovirus(PsaV、Cowden strain、a kind gift from Dr. K.O. Chang、Kansas State、USA)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid)、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で16時間培養した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。各chamberに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために各chamberに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。その後、rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigenを各chamberに入れた後、4℃で12時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各チャンバーを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 594が結合した goat anti-rabbit IgG secondary antibody希釈液を各チャンバーに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、核を染色するDAPIを含むSlowFade Gold antifade溶液で各slideを封入し、LSM 800 confocal microscopeで観察した(図１６B)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるPSaV増殖抑制によるウイルスゲノム数の減少を検出するために、real-time PCRを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したLLC-PK細胞がある12-well plateの各wellをDPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine sapovirus(PSaV、Cowden strain、a kind gift from Dr. K.O. Chang、Kansas State、USA)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid)、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で24時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、RNeasy mini kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAはRandom hexamerとpoly(rA)-oligo(dT)を含むTOPscriptTM cDNA Synthesis kit(Enzynomics)を用いてcDNAを合成した。 その後、TOPrealTM qPCR 2X PreMix(Enzynomics)溶液内に合成したcDNA、PSaV VPgに特異的なforward primer(5'-CGAAAGGGAAAAACAAACGC-3'、配列番号81)とreverse primer(5'-TCACTCACTGTCACTGTCATAGGTGTCACC-3'、配列番号82)を入れた後、LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer、Hangzhou、China)でreal-time PCRを行った(図１６C)。
AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPによるPSaV子孫ウイルス産生の減少を検出するためにcell culture immunofluorescence assayを実施した。まず、コンフルエント(confluent)に達したLLC-PK細胞がある12-well plateの各wellをDPBSで2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。次に、porkine sapovirus(PSaV、Cowden strain、a kind gift from Dr. K.O. Chang、Kansas State、USA)を0.1 MOI FFU/mLで細胞に接種し、1時間培養した(吸着)。ウイルス吸着後、細胞をDPBSで再度2回洗浄し、指定濃度の化合物、200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid)、1% penicillin、1% streptomycinを含む保存培地と共に36℃で16時間培養した。その後、各plateを3回の凍結及び解凍過程を経て細胞を各wellから取り出した後、上層液を10倍階段希釈した後、コンフルエント(confluent)に達したLLC-PK細胞がある96-well plateの各wellに分注した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄後、洗浄液を捨てた。各wellに4% paraformaldehyde固定液を入れ、20℃で10分間固定した。細胞の透過性を高めるために、各wellに0.2% Triton-Xを20℃で10分間処理した。その後、各wellをリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で2回洗浄した後、洗浄液を捨てた。この後、rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigenを各wellに入れた後、4℃で8時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)で各chamberを3回洗浄後、洗浄液を捨て、Alexa Fluor 488が結合したgoat anti-rabbit IgG polyclonal antibody希釈液を各wellに入れた後、20℃で1時間作用させた。リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.8)で各wellを3回洗浄後、洗浄液を捨て、propidium iodideで核を染色し、glycerolで封入後、倒立蛍光顕微鏡で陽性細胞数を検査した(図１６D)。
その結果、ウイルスタンパク質(VPg)、細胞内ウイルス抗原(VPg)量、ウイルスゲノム数、ウイルス子孫数はNCL標的ペプチドリガンド処理濃度に応じて減少した(図１６)。したがって、NCL標的ペプチドリガンドがporkine sapovirus感染を抑制することが検証された。
実施例１１：in vitro実験によるAGM-330のCC50とAGM-330のIAV、BCoV、PEDV、RVA、PRRSV、PSaVに対するIC50及び選択指数(selective index)確認
AGM-330の半数最大細胞毒性濃度(half maximal cytotoxic concentration、CC50)を確認するために、96-well plateで成長したコンフルエント(confluent) A549、MDCK、Vero E6、MA104、MARC-145、LLC-PK細胞にNCL標的ペプチドリガンド(AGM-330d-mCPP、AGM-330t-mCPP)を低濃度で10μM濃度まで希釈したものを処理した後、24時間培養した。それぞれの培養液を除去した後、200μLの3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)溶液を入れた後、36℃の5% CO2 incubatorで4時間培養した。この後、150μLのDMSO溶液を各wellに添加した後、20℃で作用させた。その後、optical density(OD)はenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) readerで570nm波長で測定した(表６)。
AGM-330の各ウイルスに対する半数最大阻害濃度(half maximal inhibitory concentration、IC50)を確認するために、12-well plateで成長させたコンフルエント(confluent) A549、MDCK、Vero E6、MA104、MARC-145、LLC-PK細胞の上層液を除去し、これにinfluenza A virus(IAV、PR8 strain)、bovine coronavirus(BCoV、KWD20 strain)、porcine epidemic diarrhea virus(PEDV、QIAP1401 strain)、bovine rotavirus(RVA、NCDV strain)、porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV、LMY strain)、porcine sapovirus(PSaV、Cowden strain)をそれぞれ0.1 MOIで接種した後、1時間ウイルスを細胞に吸着させた。その後、NCL標的ペプチドリガンド(AGM-330d-mCPP、AGM-330t-mCPP)を低濃度で10μM濃度に段階的に希釈したものを含む培養液2mlを添加した後、influenza A virus、bovine rotavirusが感染した細胞は24時間、bovine coronavirus、porcine epidemic diarrhea virus、porcine sapovirusが感染した細胞は36時間、porkine reproductive and respiratory syndrome virusが感染した細胞は48時間培養した。培養終了後、各plateは3回の凍結及び解凍を行った後、上層液を10倍階段希釈した。ウイルスの力価(titer)を検査するために、96-well plateで成長したコンフルエント(confluent) A549、MDCK、Vero E6、MA104、MARC-145、LLC-PK細胞の上層液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを洗浄した。上層液を除去した後、それぞれ10倍希釈したウイルス液100μLをA549、MDCK、Vero E6、MA104、MARC-145、LLC-PK細胞がコンフルエントに達したそれぞれの96-well plateのwellに接種した後、36℃の5% CO2 incubatorで18時間培養した。上層液を除去した後、4%パラホルムアルデヒド溶液で15分間固定した後、リン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを洗浄した後、0.2% Triton X-100で20℃で10分間処理した。リン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを水洗した後、influenza A virusのNP抗原、bovine coronavirusのS抗原、porkine epidemic diarrhea virusのN抗原、species rotavirus VP6抗原、porkine reproductive and respiratory syndrome virus M抗原、porkine sapovirus VPg抗原に対する100~200倍希釈された1次抗体をそれぞれのwellに分注した後、12時間4℃冷蔵庫で作用させた。その後、上層液を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを洗浄した後、100～200倍希釈したAlexa Fluor 488あるいはfluorescein isothiocyanateが結合した2次抗体を各wellに分注した後、2時間室温で作用させた。この後、上層液を除去した後、propidium iodide溶液で核を染色した後、60% glycerol溶液をそれぞれのwellに入れた後、蛍光顕微鏡でそれぞれのウイルス陽性細胞を検査した。以上の実験に基づいてCC50値とIC50値を計算した後、選択指数(selective index、SI)値はCC50値をIC50値で割って(CC50/IC50)計算した(表７)。
その結果、NCL標的ペプチドリガンド(AGM-330d-mCPP、AGM-330t-mCPP)は10μMの高濃度でも顕著な細胞毒性を示さず、低濃度でもinfluenza A virus、bovine coronavirus、porcine epidemic diarrhea virus、bovine rotavirus、porcine reproductive and respiratory syndrome virus、porcine sapovirus感染を抑制することが検証された(図１７)。
実施例１２：in vitro実験によるAGM-330のSARS-CoV-2抑制効果の確認
AGM-330の半数最大細胞毒性濃度(CC50)を確認するために、96-well plateで成長したコンフルエント(confluent) Vero細胞株(African green monkey kidney cell line、ATCC)に細胞にNCL標的ペプチドリガンド(AGM-330d-mCPP、AGM-330t-mCPP)を低濃度で20μM濃度まで希釈したものを処理した後、24時間培養した。それぞれの培養液を除去した後、200μLの3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)溶液を入れた後、36℃の5% CO2 incubatorで4時間培養した。この後、150μLのDMSO溶液を各wellに添加した後、20℃で作用させた。その後、optical density(OD)はenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) readerで570nm波長で測定した。
AGM-330のSARS-CoV-2に対する半数最大阻害濃度(IC50)を確認するために、384-well microplateで成長したコンフルエント(confluent) Vero E6細胞に0.0125 MOIで接種した後、1時間ウイルスを細胞に吸着させました。NCL標的ペプチドリガンド(AGM-330d-mCPP、AGM-330t-mCPP)とpositive controlとしてchloroquine、remdesivirまたはlopinavirを低濃度で20μM濃度に段階的に希釈したものを含む培養液をウイルス接種1時間前および1時間後に細胞に処理した。NCL標的ペプチドリガンドとpositive controlを処理した後、24時間培養した。培養が終了後、各plateはリン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを洗浄した。その後、SARS-CoV-2 nucleocapsid(N)に対する1次抗体をそれぞれのwellに分注後、12時間4℃冷蔵庫で作用させた。その後、上層液を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水で3回各wellを水洗した後、Alexa Fluor 488が結合した2次抗体を各wellに分注した後、2時間室温で作用させた。この後、上層液を除去した後、Hoechst 33342で核を染色した後、感染した細胞の蛍光イメージは、大容量イメージ分析機器であるOperettaで検出した。以上の実験に基づいてCC50値とIC50値を計算した後(表８)、SI値はCC50値をIC50値で割って計算した。
NCL標的ペプチドリガンドは、positive controlとして使用した既存の薬物と比較して増進したIC50値を示し、20μMの高濃度でも顕著な細胞毒性を示さなかった(図１８)。
その結果、NCL標的ペプチドリガンドがSAR-CoV-2の感染を抑制することを確認した。
実施例１３：ハムスターCOVID-19感染モデルを用いたAGM-330の抗ウイルス効能評価
Syrian hamster(Female、11 weeks、(株)Raon Bio)にSARS-CoV-2(2x105pfu/mL)を鼻腔内点滴で感染させた。
感染させたハムスター動物モデルにNCL標的ペプチドリガンドであるAGM-330d-mCPP(AGM-380D)(0.2、2、6mg/kg)を12時間間隔で4日間、計8回腹腔内投与した。感染後5日間の死亡率及び一般症状を観察した結果、試験期間中に死亡動物は発生せず、試験物質に関連した臨床的異常所見は観察されなかった。感染当日、感染後2日目、感染後4日目に体重を測定した結果、正常対照群(NC)を除くウイルス対照群(VC)と試験群で体重が減少した。ウイルス対照群と試験群の間に有意な体重変化は観察されなかった(図１９)。
感染後4日目に病理解剖を行った結果、正常対照群を除くウイルス対照群と試験群の肺腸にウイルス感染による充血・出血、浮腫を含む肉眼的変化が確認された。AGM-330d-mCPP(6mg/kg)を投与した群で、ウイルス対照群と比較すると、肉眼的変化が有意に緩和された(図２０ないし図２５)。
肺腸の病理組織学的な観察でも、ウイルス感染による肺胞腔および間質組織の炎症細胞浸潤、出血、ガラス質膜形成(hyaline membrane)などの所見が観察された(表９)。AGM-330d-mCPP(6mg/kg)を投与した群で、ウイルス対照群に比べ病理組織学的病変が有意に減少した(図２６)。
実施例１４：AGM-330のinfluenza A virusに対するin vivo抗ウイルス効果の確認
C57BL/6マウスにinfluenza Aウイルスを経鼻投与で感染させ(1x104pfu/ml、50μl)、NCL標的ペプチドリガンドを各濃度別に5日間、1日1回腹腔内投与(interaperitoneal administration)して16日間の生存率を観察した。AGM-330d-mCPPの場合、各0.04、0.2、1.00mg/kgの投与濃度で有意に増進した生存率を示し(図２７A)、AGM-330t-mCPPの場合、各0.334、1.67mg/kgの投与濃度で有意に増進した生存率を示した(図２７B)。
実施例１５：AGM-330とoseltamivirの混合投与のin vivo抗ウイルス効果を確認する。
C57BL/6マウスにinfluenza Aウイルスを経鼻投与した後(1x104pfu/ml、50μl)、NCL標的ペプチドリガンドであるAGM-380d-mCPP 1.00mg/kg、NCL標的ペプチドリガンドであるAGM-330t-mCPP 1.67mg/kg、AGM-330d-mCPP 1.00mg/kgとoseltamivir 2mg/kg、AGM-330t-mCPP 1.67mg/kgとoseltamivir 2mg/kgを5日間1日投与した。AGM-330d-mCPPとAGM-330t-mCPPは腹腔内投与(interaperitoneal administration)、oseltamivirは経口投与(oral administration)を行った。ウイルス接種後16日間の生存率を観察した。AGM-330d-mCPP単独及びAGM-330t-mCPP単独投与と比較して、AGM-330d-mCPPとoseltamivirの混合投与の場合、100%の生存率(図２８A)を、AGM-330t-mCPPとoseltamivirの混合投与の場合、90%の生存率(図２８B)を示し、oseltamivirとの混合投与が明らかなinfluenza A virus感染症の治療効果があることが分かった。
実施例１６：AGM-330のinfluenza A virus複製に対するin vivo抑制効果の確認
実施例１４の4及び6 DPI(Days post infection)におけるNCL標的ペプチドリガンド実験群マウスの肺組織におけるPB1 mRNA及びタンパク質発現程度とウイルスtiterを確認した。
その結果、4 DPIおよび6 DPIにおけるPB1のmRNAおよびタンパク質の発現水準が著しく減少することを確認した。また、ウイルスtiterの確認結果、influenza A virusはNCL標的ペプチドにより感染が抑制され、ウイルス個体数も著しく減少することを確認した。この結果は、NCL標的ペプチドリガンドによりウイルス個体数が減少することを意味し、これらの結果は実施例14の生存率に関連することを意味する(図２９)。
本発明では、MAP合成法およびOBOC組み合わせ法を使用してスクリーニングしたAGMペプチドリガンドおよびその変異体がウイルスの増殖および複製を抑制することを確認した(in vitroおよびin vivo)。したがって、NCL標的化AGMは、抗ウイルス用途に有用に利用できる。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明したが、当業者にとって、これらの具体的な技術は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
配列リストFree Text
電子ファイルを添付した。

Claims (17)

  1. ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドを含む抗ウイルス組成物であって、
    前記AGMペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ウイルス組成物：
    (a) 配列番号1ないし配列番号8のいずれかで表されるアミノ酸配列、及び
    (b) 配列番号1で示されるアミノ酸配列から以下の群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列。
    (i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
    (ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
    (iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入。
  2. 前記(b)のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列は、配列番号9ないし配列番号15及び配列番号20からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗ウイルス組成物。
  3. 前記AGMペプチドにポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)鎖(chain)が接合されたAGMペプチドPEG接合体(conjugate)を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ウイルス組成物。
  4. 前記ポリエチレングリコール鎖は、2ないし24個のエチレングリコール基を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗ウイルス組成物。
  5. 前記AGMペプチドとポリエチレングリコール鎖は、リンカーを介して連結されることを特徴とする、請求項３に記載の抗ウイルス組成物。
  6. 前記AGMペプチドPEG接合体を2つ以上含む多量体(multimer)を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗ウイルス組成物。
  7. ２ないし８個のAGMペプチドPEG接合体を含むことを特徴とする、請求項６に記載の抗ウイルス組成物。
  8. 前記2つ以上のAGMペプチドPEG複合体がリンカーによって互いに連結されていることを特徴とする、請求項７に記載の抗ウイルス組成物。
  9. 前記組成物は、コロナウイルス(Coronavirus)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)、豚流行性下痢ウイルス(Porkine epidemic diarrhea virus)、牛ロタウイルス(Bovine rotavirus)、豚サポウイルス(Porkine sapovirus)、豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Porkine reproductive and respiratory syndrome virus)、アルフイウイルス(Alfuy virus)、バンジウイルス(Banzi virus)、チクングニアウイルス(Chikungunya virus)、デング熱ウイルス(Dengue virus)、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus、HBV)、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus、HCV)、ヒトサイトメガロウイルス(Human cytomegalovirus)、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus、HIV)、日本脳炎ウイルス(Japanese encephalitis virus)、ココベラウイルス(Kokobera virus)、クンジンウイルス(Kunjin virus)、キヤサナ森林病ウイルス(Kyasanur forest disease virus)、ループ病ウイルス(louping ill virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、メタニューモウイルス(Metapneumovirus)、モザイクウイルス(Mosaic Virus)、マレーバレーウイルス(Murray Valley virus)、パラインフルエンザウイルス(parainfluenza virus)、ポリオウイルス(polio virus)、ポワサンウイルス(Powassan virus)、呼吸器細胞融合ウイルス(Respiratory syncytial virus、RSV)、ロシオウイルス(Rocio virus)、セントルイス脳炎ウイルス(Saint Louis encephalitis virus)、ダニ媒介脳炎ウイルス(Tick-borne encephalitis virus)、ウエストナイルウイルス(West Nile virus)及び黄熱病ウイルス(Yellow fever virus)からなる群から選択される1種以上に対する抗ウイルス活性を有することを特徴とする、 請求項１～８のいずれか1項に記載の抗ウイルス組成物。
  10. ヌクレオリン(nucleolin、NCL)に特異的に結合するAGMペプチドと細胞透過性ペプチド(Cell Penetrating Peptide、CPP)が結合したAGMペプチドCPP融合ペプチドを含む抗ウイルス組成物であって、
    前記AGMペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗ウイルス組成物。
    (a) 配列番号1ないし配列番号8のいずれかで表されるアミノ酸配列、及び
    (b) 配列番号1で示されるアミノ酸配列から以下の群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列。
    (i) N末端から5番目のメチオニン残基の置換、
    (ii) N末端から7番目のタイロシン残基の置換、および
    (iii) C末端にロイシンまたはリジン残基の挿入。
  11. 前記(b)のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列は、配列番号9ないし配列番号15及び配列番号20からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の抗ウイルス組成物。
  12. 前記AGMペプチドにポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)鎖(chain)が接合されたAGMペプチドPEG接合体(conjugate)を含むことを特徴とする,
    請求項１０に記載の抗ウイルス組成物。
  13. 前記AGMペプチドPEG複合体を2つ以上含む多量体(multimer)を含むことを特徴とする 請求項１２に記載の抗ウイルス組成物。
  14. 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号21ないし配列番号70のアミノ酸配列からなる群から選択されることを特徴とする, 請求項１０に記載の抗ウイルス組成物。
  15. 前記組成物は、コロナウイルス(Coronavirus)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)、豚流行性下痢ウイルス(Porkine epidemic diarrhea virus)、牛ロタウイルス(Bovine rotavirus)、豚サポウイルス(Porkine sapovirus)、豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Porkine reproductive and respiratory syndrome virus)、アルフイウイルス(Alfuy virus)、バンジウイルス(Banzi virus)、チクングニアウイルス(Chikungunya virus)、デング熱ウイルス(Dengue virus)、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus、HBV)、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus、HCV)、ヒトサイトメガロウイルス(Human cytomegalovirus)、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus、HIV)、日本脳炎ウイルス(Japanese encephalitis virus)、ココベラウイルス(Kokobera virus)、クンジンウイルス(Kunjin virus)、キヤサナ森林病ウイルス(Kyasanur forest disease virus)、ループ病ウイルス(louping ill virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、メタニューモウイルス(Metapneumovirus)、モザイクウイルス(Mosaic Virus)、マレーバレーウイルス(Murray Valley virus)、パラインフルエンザウイルス(parainfluenza virus)、ポリオウイルス(polio virus)、ポワサンウイルス(Powassan virus)、呼吸器細胞融合ウイルス(Respiratory syncytial virus、RSV)、ロシオウイルス(Rocio virus)、セントルイス脳炎ウイルス(Saint Louis encephalitis virus)、ダニ媒介脳炎ウイルス(Tick-borne encephalitis virus)、ウエストナイルウイルス(West Nile virus)及び黄熱病ウイルス(Yellow fever virus)からなる群から選択される1種以上に対する抗ウイルス活性を有することを特徴とする、
    請求項１０～１４のいずれか1項に記載の抗ウイルス組成物。
  16. 請求項１または請求項１０に記載の抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または治療用組成物。
  17. 請求項１または請求項１０に記載の抗ウイルス組成物を含むウイルス感染症の予防または改善用保健機能食品組成物。
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