KR20220156467A - 뉴클레오린-결합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물 - Google Patents

뉴클레오린-결합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레오린에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드의 항바이러스 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물, 상기 펩타이드와 세포투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물, 상기 조성물들을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 및 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 MAP 합성 방법 및 OBOC 조합 방법을 사용하여 스크리닝한 AGM 펩타이드 리간드 및 그 변이체들이 바이러스의 증식 및 복제를 억제하는 것을 확인하였다(in vitro 및 in vivo). 따라서, NCL-표적화 AGM은 항바이러스 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

뉴클레오린-결합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물{An Antiviral Composition Comprising a Nucleolin-Binding Peptide}
본 발명은 뉴클레오린에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드의 항바이러스 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물, 상기 펩타이드와 세포투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물, 상기 조성물들을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물 및 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
고전적인 진단 및 치료 방법에 대한 대안으로, 치료 효율을 높이고 나노입자 및 항체 암 치료법과 관련된 부작용을 줄이기 위해서, 암-특이 펩타이드가 사용될 수 있다(Mori T. Curr Pharm Des. 2004; 10: 2335-43). 펩타이드 리간드는 쉬운 대량 합성, 낮은 면역원성, 무독성 대사산물의 생성 및 높은 in vivo 생체적합성을 포함하여 많은 장점을 가지고 있다(McGregor DP. Curr Opin Pharmacol. 2008; 8: 616-9). 펩타이드를 발굴하는 많은 방법 중에서, OBOC(one-bead-one-compound) 조합 방법은 펩타이드 리간드를 스크리닝하는 강력한 방법 중 하나이다(Lam KS, et al. Chem Rev. 1997; 97: 411-48). OBOC 조합 라이브러리에 기초한 펩타이드 스크리닝 접근법은 암 및 다른 질병에서의 세포 표적화를 위한 신규 펩타이드 리간드의 발견을 촉진시켰다(Mikawa M, et al. Mol Cancer Ther. 2004; 3: 1329-34). 다수의 암-특이적 펩타이드가 in vitro OBOC 조합 스크리닝 또는 다른 방법을 사용하여 분리되었지만, 몇 가지 과제가 남아있다. 특히, 펩타이드를 약물로 사용함에 있어 주요 단점으로는 다른 펩티다아제(peptidase)에 의한 매우 빠른 절단으로 인한 매우 짧은 반감기를 들 수 있다(Borchardt TR, et al. Adv Drug Deliv Rev. 1997; 27: 235-56). 본 발명자들은 다중-항원 펩타이드(multiple-antigen peptide; MAP) 덴드리머 형태(dendrimeric form)의 생활성 펩타이드를 합성하는 전용 접근법을 개발함으로써 상기 기재한 문제점들을 극복하고자 하였다. 덴드리머 형태의 단량체 펩타이드의 합성은 단백질분해효소(protease) 및 펩티다아제 활성에 대한 획득 저항성으로 인해 안정성을 증가시킬 수 있다(McGuire MJ, et al. Sci Rep. 2014; 4: 4480).
이에 본 발명자들은, OBOC 조합 스크리닝과 MAP 합성을 결합하여, 인간 유방암(breast cancer) 및 결장직장암(colorectal cancer) 세포에 특이적으로 결합하는 AGM 또는 AGM 펩타이드라 명명된 펩타이드 리간드 시리즈들을 발명하였다. 나아가, pull-down 분석 및 LC-MS/MS을 통해 뉴클레오린(nucleolin; NCL)이 AGM의 표적 단백질임을 확인하였다. NCL은 인(nucleolus)에 가장 많이 존재하는 단백질이다. 본 발명에서는, 항-NCL 항체 등을 이용하여 바이러스 감염에 의해 NCL 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 코로나 바이러스(Corona virus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 등을 포함하는 여러 종류의 바이러스에 감염된 세포에 AGM 펩타이드를 처리하는 경우, 바이러스의 증식 및 복제를 억제하여 항바이러스 효능을 나타낸 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뉴클레오린에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항바이러스 조성물들을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항바이러스 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 항바이러스 조성물의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항바이러스 조성물의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
(b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
(i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
(ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
(iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입;
으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드와 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스 감염증의 예방 도는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 사용을 제공한다.
본 발명에서는 MAP 합성 방법 및 OBOC 조합 방법을 사용하여 스크리닝한 AGM 펩타이드 리간드 및 그 변이체들이 바이러스의 증식 및 복제를 억제하는 것을 확인하였다(in vitro 및 in vivo). 따라서, NCL-표적화 AGM은 항바이러스 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 AGM-330과 PEG가 접합된 접합체(conjugate)의 단량체(AGM-330m), 이량체(AGM-330d), 사량체(AGM-330t) 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 AGM-330-PEG 접합체(conjugate)와 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 AGM-330-CPP 융합 펩타이드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 펩타이드 라이브러리 합성 및 스크리닝 단계를 표현한 모식도이다: 1, Split-mix 합성 방법을 수행하여 조합 OBOC 라이브러리를 구축; 2, 대략 ~2,600,000개의 라이브러리 합성; 3, OBOC 라이브러리를 CO2 인큐베이터에서 암 세포와 함께 배양; 4, 세포 표면 분자에 대한 친화성을 갖는 리간드를 운반하는 비드는 세포로 덮임; 5, positive 비드를 도립 현미경 하에서 피펫으로 채취; 6, positive 비드의 서열을 Edman microsequencing으로 측정; 7, OBOC 조합 펩타이드 라이브러리 스크리닝으로부터 확인된 암-특이적 펩타이드 리간드 후보.
도 4는 암-특이적 리간드에 대한 OBOC 라이브러리의 스크리닝 및 MAP 합성을 나타낸 것이다.
도 4A는 암 세포주 및 정상 세포에 대한 펩타이드의 결합 특이성을 나타낸 것이며, 도 4B는 선택된 8개 비드의 세포 결합 특이성을 나타내는 전체-세포 결합 분석 결과로, 다수의 유방암 및 결장직장암 세포와 정상 유방 및 결장직장 세포를 106cells/ml에 재현탁시키고 비드와 함께 배양하였다. 모든 실험을 3회 반복하였고, Scale bar는 200μm이다. 도 4C는 FITC-labeled AGM-330, AGM-331 및 AGM-332의 면역형광의 공초점 이미징에 의해 결정된 결합 특이성을 나타낸 것으로, 핵은 DAP(blue)로 염색되었고, Scale bar는 50μm이다. 도 4D는 AGM-330의 결합 특이성을 나타낸 것으로, AGM-330의 세포 결합을 결정하기 위해 전체-세포 결합 분석을 수행하였으며, Scale bar는 200μm이다. 도 4E는 AGM-330의 합성 절차를 나타낸 것으로, 시약 및 조건은 다음과 같다: (i) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH, piperidine, DMF; (ii) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH, piperidine, DMF; (iii) RHGAMVYLK-OH, piperidine; (iv) piperidine, DMF. Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl, DMF = dimethylformamide. 도 4F는 다수의 유방암 및 결장직장암 세포와 정상 유방 및 결장직장 세포 중 암 세포에 대한 AGM-330의 특이성을 나타내는 FACS 분석 결과로, 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타내고, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001을 나타낸다.
도 5는 AGM-330(AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t)에 의한 펩타이드 in vivo 안정성 평가 결과이다. AGM-330 2mg/kg을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입한 후, 0, 0.167, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 및 48시간마다 헤파린이 코팅된 관을 이용해 눈에서 혈액을 채취하였다. 4℃에서 혈액 응고를 허용한 후, 4℃에서 10분 동안 5000rpm으로 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 남아있는 혈청내 펩타이드 부분은 항-AGM-330 항체를 통해 ELISA 플레이트에 즉시 고정시켰다. 흡광도는 VersaMax ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었으며 약물동태학(Pharmacokinetics)은 phoenix WinNonlin 8.1(Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA) 프로그램으로 분석하였다.
도 6은 AGM-330의 분자 표적 및 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6A는 biotin pull-down 분석, 질량 분석 및 웨스턴 블랏의 모식도를 나타낸 것이다. 도 6B는 10% SDS-PAGE에 의한 분리 후 친화성 컬럼으로부터 용출된 단백질의 Coomassie brilliant blue 염색 결과로, Lane 1: protein marker; Lane 2: total lysate before biotin pull-down assay; Lane 3: flow-through after incubation with AGM-330-biotin; Lane 4-6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins이다. * 빨간색 별 표시는 단백질 밴드가 겔 내 분해를 위해 절단된 후 LC-MS/MS 분석이 수행되었음을 나타낸다. 도 6C는 MS로 검출된 펩타이드의 단백질 데이터베이스 검색으로 AGM-330 결합 파트너로서 NCL을 확인한 결과이다. 도 6D는 LC-MS/MS 분석으로부터 얻은 유전자 목록으로, confidence score는 식별된 단백질의 mascot score를 나타낸다. 도 6E는 항-NCL 항체를 사용한 biotin pull-down으로부터 용출된 단백질의 면역 블랏팅 분석 결과로, 화살표는 NCL의 존재를 의미한다. 도 6F는 AGM-330에 결합하는 NCL 도메인의 분석 결과로, 상이한 GFP-NCL construct를 HEK293T 세포로 형질주입시키고, AGM-330-biotin을 streptavidin 비드에 결합된 NCL residues 1-710, residues 1-322 또는 residues 323-710에 첨가하였으며, 비드상의 단백질을 항-GFP 항체를 이용하여 면역 블랏팅으로 분석하였다.
도 7은 NCL에 대한 AGM-330의 친화도를 SPR에 의해 평가한 결과로, K d로 표시되었다. 표시된 SPR 센서 그램은 유사한 결과를 가진 서로 다른 센서 칩을 사용하는 세 가지 개별 실험 세트를 대표하는 실험에서 가져온 실험 결과이다. 재조합 NCL은 CM5 센서 칩에 고정되었다. 다양한 농도의 AGM-330(20 nM-2.5μM)을 고정된 NCL과 함께 배양하고 Biacore T-200 장치에서 분석하였다.
도 8은 biotin pull-down 분석에 의한 AGM-330과 정제된 NCL 간의 직접적인 상호작용 분석 결과로, 용출된 단백질의 면역 블랏팅 분석은 항-NCL 항체를 사용하여 biotin pull-down을 형성한다. Lane 1: protein marker; Lane 2: input of purified NCL; Lane 3: flow through after incubated with AGM-330-biotin; Lane 4-6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins. 화살표는 NCL의 존재를 의미한다.
도 9는 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드의 합성 과정을 나타낸 도면이다.
도 10은 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드와 AGM-330t 및 maleimide-CPP의 HPLC 및 MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 AGM-330에 의한 influenza A virus(IAV) 증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 AGM-330에 의한 bovine coronavirus(BCoV) 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 13은 AGM-330에 의한 porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 14는 AGM-330에 의한 bovine rotavirus(RVA) 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 15는 AGM-330에 의한 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 AGM-330에 의한 porcine sapovirus(PSaV) 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 AGM-330에 의한 반수 최대 세포독성 농도(half maximal cytotoxic concentration, CC50)와 AGM-330의 influenza A virus(IAV), bovine coronavirus(BCoV), porcine epidemic diarrhea virus(PEDV), bovine rotavirus(RVA), porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), porcine sapovirus(PSaV)의 반수 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration, IC50) 및 선택지수(selective index [SI = CC50/IC50])를 나타낸 그래프이다.
도 18은 AGM-330에 의한 반수 최대 세포독성 농도(half maximal cytotoxic concentration, CC50)와 AGM-330의 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)의 반수 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration, IC50) 및 선택지수(selective index, [SI = CC50/IC50])를 나타낸 그래프이다.
도 19는 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대한 AGM-330d-mCPP(AGM-380D)의 체중변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대한 AGM-330d-mCPP(AGM-380D)의 개선된 폐육안적 병변율을 나타낸 도면이다.
도 21은 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대한 음성 대조군(NC) 폐조직의 육안적 폐병변도를 나타낸 도면이다.
도 22는 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대한 바이러스 대조군(VC) 폐조직의 육안적 폐병변도를 나타낸 도면이다.
도 23은 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대해 AGM-330d-mCPP(AGM-380D, 0.2mg/kg)를 투여한 폐조직의 육안적 폐병변도를 나타낸 도면이다.
도 24는 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대해 AGM-330d-mCPP(AGM-380D, 2mg/kg)를 투여한 폐조직의 육안적 폐병변도를 나타낸 도면이다.
도 25는 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대해 AGM-330d-mCPP(AGM-380D, 6mg/kg)를 투여한 폐조직의 육안적 폐병변도를 나타낸 도면이다.
도 26은 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 대한 대조군 및 시험군의 폐조직병리분석을 나타낸 도면이다.
도 27은 AGM-330의 influenza A virus(IAV) 감염에 대한 in vivo 항바이러스 효과를 나타낸 도면이다.
도 28은 AGM-330과 oseltamivir의 혼합투여에 의한 influenza A virus(IAV) 감염에 대한 in vivo 항바이러스 효과를 나타낸 도면이다.
도 29는 AGM-330의 influenza A virus(IAV) 복제 억제 효과를 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서,
뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물로서, 상기 AGM 펩타이드는 다음의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다:
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
(b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
(i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
(ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
(iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입.
기능적이고 구체적으로 종양을 표적할 수 있는 펩타이드 리간드의 발견은 암 진단 및 치료에 새로운 기회를 제공한다. 그러나, 펩타이드 리간드의 사용은 그들의 짧은 생물학적 반감기 때문에 크게 제한되어왔다.
본 발명에서는, 다중-항원-펩타이드(multiple-antigen-peptide; MAP) 합성 방법과 함께 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 방법을 사용하여 2,600,000개의 펩타이드 라이브러리를 합성한 후, 이로부터 표 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 새로운 암-특이적 펩타이드 리간드인 AGM-330, AGM-331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM-337을 동정하였으며(도 3 참조), 세포 결합 분석, 유세포 분석 및 형광 공초점 현미경을 이용하여 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 상기 펩타이드 리간드들이 암 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, pull-down 분석 및 LC-MS/MS 분석을 통해 막 뉴클레오린(nucleolin; NCL)이 AGM-330, AGM-331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM-337의 표적 단백질임을 확인하였다.
Name 아미노산 서열 서열번호
AGM-330 RHGAMVYLK 1
AGM-331 ADHRHRRSG 2
AGM-332 AVARARRRR 3
AGM-333 RFLKNKKAR 4
AGM-334 RWLKNKKAR 5
AGM-335 FGRLKKPLK 6
AGM-336 KRRRRERAG 7
AGM-337 KRRRKAPTD 8
상기 8개의 펩타이드 중 3개(AGM-330, AGM-331 및 AGM-332)는 유방암 세포주(MDA-MB-231)에 대해 강하고 특이적이며, 우선적인 결합을 나타냈으며, 인간 정상 유방 세포주(MCF-10A)에는 결합하지 않거나, 약하게 결합하였다(도 4A 및 도 4B 참조).
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 AGM-330에서 일부 아미노산 잔기의 변이를 가질 경우에도 여전히 뉴클레오린에 대한 강하고 특이적인 결합 특성을 유지하는 것을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에 있어서, 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서,
(i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
(ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
(iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입;
으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서,
(i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌(methionine) 잔기의 류신(leucine) 또는 노르루신(norleucine)으로의 치환;
(ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신(tyrosine) 잔기의 페닐알라닌(phenylalanine)으로의 치환; 및
(iii) C-말단에 류신(leucine) 및 라이신(lysine) 잔기의 삽입;
으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 15 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(표 2).
AGM -330에서의 아미노산 변이 아미노산 서열 서열번호
R1 →K1 KHGAMVYLK 9
H2 →R2 RRGAMVYLK 10
A4 →L4 RHGLMVYLK 11
M5 →L5 RHGALVYLK 12
M5 →Nle5(Nle: Norleucine) RHGA(Nle)VYLK 13
V6 →A6 RHGAMAYLK 14
Y7 →F7 RHGAMVFLK 15
R1H2 →Deletion GAMVYLK 16
R1H2 →Insertion RHRHGAMVYLK 17
R1H2R3H4 →Insertion RHRHRHGAMVYLK 18
Reverse sequence KLYVMAGHR 19
L10K11L12K13 →Insertion RHGAMVYLKLKLK 20
상기 서열번호 13의 아미노산 서열에서, “Nle”는 Norleucine을 의미한다.
본 발명에 있어서, “AGM”, “AGM 펩타이드” 또는 “AGM 펩타이드 리간드”는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 통칭하거나, 그 중에서 하나 이상의 펩타이드를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 AGM 펩타이드는 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
정상세포에서 뉴클레오린은 주로 핵소체에 존재하나, 핵질, 세포질 또는 세포막에서도 일부 발견되며, 리보솜 생합성, 염색질 재구성 및 안정성, DNA 및 RNA 대사, rRNA 전사, 세포 주기 조절, 세포 분열, 신생혈관 생성 및 microRNA 처리와 같은 다양한 세포 기능에 관여한다(Dario Palmieri, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jul 28;112(30):9418-23).
NCL의 발현은 다양한 암세포(갑상선암, 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 전립선암 등)에서 유의미하게 상향조절되는 것이 보고되고 있으며(Shen N, et al. Oncotarget. 2014; 5: 5494-509), 상향조절된 NCL의 발현은 악성종양 및 암전이와 관련된다.
세포질에 과발현된 NCL은 Bcl-2, IL2와 같은 anti-apoptotic 인자를 안정화시키고, p53과 같은 종양 억제인자의 발현을 억제함으로써 암세포의 증식과 분화에 관여한다. 세포막에 과발현된 NCL은 HDGF 또는 VEGF와 같은 성장인자의 수용체로 작용하고, endocytosis에 의해 핵 안으로 이동하여 암세포 증식 및 전이를 촉진시키는 역할을 한다. 세포막 NCL은 바이러스(RSV, HIV, H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9)의 부착 또는 숙주세포로의 진입을 매개하여 바이러스 감염과 확산에 영향을 미친다(Kotb Abdelmohsen and Myriam Gorospe, RNA Biology. 2012; 9: 799-808).
인체 세포는 암발생 및 바이러스 감염에 의해 뉴클레오린을 비정상적으로 과발현하고, 이들 과발현된 NCL이 세포막과 세포질에 높은 농도로 분포하게 되는 바, NCL은 항종양 및 항바이러스 약물 개발을 위한 신규 표적이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, AGM 펩타이드, 구체적으로 AGM-330은 항암 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 바이러스의 증식 및 복제를 억제하여, 바이러스 감염을 억제하는 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어, “항바이러스(anti-virus) 활성” 또는 “항바이러스 (효)능”이란 상기 바이러스의 다양한 아형과 변이형 바이러스 입자가 숙주세포에서 복제 또는 증식하는 것을 억제하는 능력을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 항바이러스 조성물은, 상기 AGM 펩타이드에 -[CH2-CH2-O]-의 구조를 갖는 에틸렌 글리콜기(ethylene glycol group)를 2개 이상 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 쇄(chain)가 접합된 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 화학식 1의 구조를 가지는 일반적인 폴리에틸렌 글리콜 쇄 뿐 아니라, 이의 유도체(derivatives)를 모두 포함하는 개념으로 사용되며, 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 유도체로는 화학식 2의 구조를 가지는 아미노 폴리에틸렌 글리콜 카르복실산(amino polyethylene glycol carboxylic acid)이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure pat00001
폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG)과의 컨쥬게이션(PEGylation)은 치료용 단백질의 약리학적 특성을 개선하기 위해 널리 사용되어왔다(Gupta V, et al. J Cell Commun Signal. 2019; 13: 319-30). 본 발명에서, 입체 장애를 줄이고 친수성을 증가시키기 위해, PEGylation을 사용했다. 그러나, PEG는 면역원성 때문에, 치료 분자에 부정적인 임상적 영향을 미친다(Moreno A, et al. Cell Chem. Biol. 2019; 26: 634-44.e3). 이전의 연구는 PEGylation된 분자에 대한 항-PEG 면역 반응이 PEGylation 정도의 면역원성과 PEG의 분자량에 의존한다는 것을 제안했다(Wan X, et al. Process Biochem. 2017; 52: 183-91).
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 2 내지 24개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 20개, 더욱 바람직하게는 6 내지 18개, 가장 바람직하게는 6 내지 12개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 AGM 펩타이드와 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 따라 AGM 펩타이드-PEG 접합체는 다음 구조식 1의 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
AGM-L1-PEG (구조식 1)
상기 구조식 1에서, ‘PEG’는 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 의미하며, L1은 링커를 의미한다.
상기 링커 L1은 바람직하게는 단일 결합(직접 결합), C1-C20 알킬, C1-C20 알킬렌, -S-, -NH- 및 -O- 로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, AGM 펩타이드의 C-말단 아미노산의 카르복시 그룹과 함께 -CONH-의 형태를 이루는 펩타이드 결합(peptide bond)을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 1의 AGM 펩타이드-PEG 접합체 중에 AGM과 결합하고 있는 PEG에 다른 쪽 말단에는 다른 물질, 바람직하게는 약물(drug)을 접합시키기 위한 기능기(functional group)가 도입될 수 있다. 이러한 기능기에는 카르복실(COOH), 아민(NH2) 및 티올(thiol) 기 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적으로 구조식 2 내지 구조식 4와 같이 AGM 펩타이드-PEG 접합체 중에 AGM 펩타이드와 결합하고 있는 PEG의 다른 쪽 말단에 아민(NH2)을 가지는 라이신(Lysine, K) 및/또는 티올기를 가지는 시스테인(Cysteine, C)이 접합된 형태일 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
AGM-L1-PEG-K (구조식 2)
AGM-L1-PEG-C (구조식 3)
AGM-L1-PEG-K-C (구조식 4)
예시적으로, 본 발명의 일 실시예에서, AGM 펩타이드 중에서 AGM-300과 PEG의 접합체인 AGM-330-PEG 접합체의 AGM과 결합하고 있는 PEG의 다른 쪽 말단에 라이신과 시스테인이 도입된 AGM-330 monomer(AGMm)는 구조식 5와 같은 형태일 수 있다.
RHGAMVYLK-L1-PEG-K-C (구조식 5)
상기 구조식 5에서, PEG는 AGM-330 C-말단의 라이신(K)의 카르복시 그룹과 아민이 축합반응을 통해 구조식 6과 같은 형태의 펩타이드 결합을 포함하는 링커(L1)에 의해 연결된 형태일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure pat00002
(구조식 6)
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 상기 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체(multimer)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다량체는 2 내지 8개의 AGM 펩타이드, 또는 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 6, 더욱 바람직하게는 2 내지 4개의 AGM 펩타이드, 또는 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적으로 본 발명에 있어서, 상기 다량체 중 이량체(dimer)는 2개의 AGM 펩타이드, 또는 AGM 펩타이드-PEG 접합체가 링커(L2)에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 다량체 중 사량체(tetramer)는 상기 이량체가 추가적인 링커(L3)에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 육량체(hexamer)나 팔량체(octamer) 및 그 이상의 다량체도 유사한 형태로 연결될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명하다.
예시적으로 본 발명에 따른 AGM 펩타이드-PEG 접합체의 이량체 및 사량체는 구조식 7 및 구조식 8과 같은 형태를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure pat00003
(구조식 7)
Figure pat00004
(구조식 8)
상기 링커 L2 및 L3는 서로 동일 또는 상이한 것일 수 있으며, 독립적으로 절단성(cleavable) 또는 비절단성(non-cleavable)일 수 있다.
상기 링커 L2 및 L3는 독립적으로 단일 결합(직접 결합), 아미노산 또는 그 유도체(derivatives), C1-C20 알킬, C1-C20 알킬렌, -S-, -NH- 및 -O- 로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 아미노산 또는 그 유도체, 더욱 바람직하게는 2 이상의 아민기를 가지는 라이신(Lys, K) 또는 아르기닌(Arg, R) 일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
가장 바람직하게는 상기 링커 L2 및 L3는 라이신(Lys, K)이 사용될 수 있으며, 상기 라이신의 아민 그룹(NH2)이 -C-CONH-와 같은 펩타이드 결합과 유사한 형태로 PEG와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 AGM 펩타이드, 또는 AGM 펩타이드-PEG 접합체의 링커의 일 말단에는 다른 물질, 바람직하게는 약물(drug)을 접합시키기 위한 기능기(functional group)가 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 구조식 7에서의 L2, 구조식 8에서의 L3에 약물(drug)을 접합시키기 위한 기능기(functional group)가 도입될 수 있다.
이러한 기능기에는 아민(NH2) 및 티올(thiol) 기 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 예시적으로 아민(NH2)을 가지는 라이신(Lysine, K) 및/또는 티올기를 가지는 시스테인(Cysteine, C)이 도입된 형태일 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적으로 본 발명의 일 실시예에서, AGM-330 dimer(AGM-330d) 및 AGM-330 tetramer(AGM-330t)는 하기 표 3과 같은 구조를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Name 구조식
AGM-330d
Figure pat00005
AGM-330t
Figure pat00006
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 코로나바이러스(Coronavirus; CoV), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV), 소 로타바이러스(Bovine rotavirus; RVA), 돼지 사포바이러스(Porcine sapovirus), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 알푸이 바이러스(Alfuy virus), 반지 바이러스(Banzi virus), 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV), 인간 시토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 코코베라 바이러스(Kokobera virus), 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 키야사나 삼림병 바이러스(Kyasanur forest disease virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 홍역 바이러스(measles virus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 모자이크 바이러스(Mosaic Virus), 머레이 밸리 바이러스(Murray Valley virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 포와산 바이러스(Powassan virus), 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV), 로시오 바이러스(Rocio virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(Saint Louis encephalitis virus), 진드기-매개 뇌염 바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 및 황열 바이러스(Yellow fever virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 코로나바이러스는 사스-코로나바이러스-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2) 또는 소 코로나바이러스(Bovine coronavirus; BCoV)이고, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(IAV)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항바이러스 조성물은, 이미 사용되고 있는 약물, 바람직하게는, 항바이러스제와 함께 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항바이러스 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이에 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명에 따른 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 비내, 비강내, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 피내, 복강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 투여 형태로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 경구 투여되거나, 비내 또는 비강내 투여될 수 있으며, 특히 비내 또는 비경구 투여시에는 스프레이(spray) 또는 에어로솔(aerosol) 형태로의 투여, 또는 흡입(inhalation) 투여되는 것이 더욱 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 비내 또는 비강내 투여용 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체 이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.
또 다른 형태로서, 본 발명에 따른 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
본 발명의 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토스 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서,
뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드와 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물로서, 상기 AGM 펩타이드는 다음의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다:
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
(b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
(i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
(ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
(iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입
본 발명에서 용어, “세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)”는 일종의 신호 펩타이드(signal peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 특정 아미노산 서열의 조합인 펩타이드이다. 현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 등 고분자 물질의 세포 내 전달을 위해 이용되고 있다. 세포투과성 펩타이드 대부분 단백질-투과 도메인(protein-transduction domain)이나 막-이동 시퀀스(membranetranslocating sequence)로부터 유도되었으며, 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와는 달리 세포막 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있는 DNA나 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있는 획기적인 역할을 할 것으로 기대되고 있다.
본 발명의 융합 펩타이드는 세포투과성 펩타이드를 이용하고 있으며, 상기 세포투과성 펩타이드는 세포 내재화(endocytosis) 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기 표 4에 나열된 세포투과성 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다.
펩타이드 References 서열 서열번호
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더욱 바람직하게는, 상기 세포투과성 펩타이드는 하기 표 5에 나열된 세포투과성 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 하기 표 5의 펩타이드의 제조 및 특성은 한국등록특허 제10-1169030호를 참조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
펩타이드 서열 서열번호
DS4 VQIFRIMRILRILKLARHST 35
DS4-1 RIMRILRILKLARHST 36
DS4-2 VQIFRIMRILRILKLAR 37
DS4-3 RIMRILRILKLAR 38
KS4 FRLVRLLRFLRILLIIS 39
KS4-1 FRLVRLLRFLRILL 40
KS4-2 RLVRLLRFLR 41
N1 RIL 42
N3 RILRILRIL 43
N5 RILRILRILRILRIL 44
N7 RILRILRILRILRILRILRIL 45
K3 RIFWVIKLARHFI 46
C3 KSLRVLRVLRPLKTIK 47
C4 RLFRVMRLVKLLSRG 48
S2 RSFRLLRVFKLAKSW 49
S4 RVIRLARIGRILRLVKGAKGIR 50
D1 RAGRILRILKLAR 51
D2 RIMRGLRILKLAR 52
D3 RIMRILRLMKLAR 53
D4 RIMRILRILKMFR 54
D5 RIMRILRALKLAR 55
D6 RIMRGMRILKLAR 56
D7 RLFRILRILKLAR 57
D8 RIMRMVRILKLAR 58
D9 RIMRILRLVKLAR 59
D10 RIMRILRILKGVR 60
D11 RNLRILRILKLAR 61
D12 RIMRDIRILKLAR 62
D13 RIMRILRELKLAR 63
D14 RIMRILRILKQLR 64
D15 RIMRILRHMKLAR 65
D16 RIMRSVRILKLAR 66
D17 RTMRILRILKLAR 67
D18 RIMRYARILKLAR 68
D19 RIMRILRQIKLAR 69
D20 RIMRILRILKEVR 70
본 발명의 일 실시예에서는 상기 표 5의 DS4-3 펩타이드로 표시된 서열번호 38의 세포투과성 펩타이드를 선택하여 실험을 수행하였으며, 상기 실제로 사용한 세포투과성 펩타이드 외에 다른 세포투과성 펩타이드를 본 발명의 펩타이드와 융합시킨 경우에도 본 발명과 유사한 효과가 나타남은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 AGM 펩타이드-PEG 접합체와 세포투과성 펩타이드는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 maleimide-carboxy bifunctional linker를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물은 AGM 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 설명이 준용될 수 있으며, 아미노산 서열, AGM 펩타이드-PEG 접합체, 다량체 및 바이러스 종류 등은 앞서 정의한 바와 동일하게 해석된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 바이러스 감염증의 예방 도는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드, 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물, 방법, 용도 및 사용은 본 발명에 따른 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 포함하기 때문에, 상술한 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명에서, 용어 “예방”은, 상기 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 투여로 바이러스 감염증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 용어 “치료”는, 상기 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물의 투여로 바이러스 감염증의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 바이러스 감염증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물과 함께 바이러스 감염증의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물은 바이러스 감염증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스 감염증은 상술된 항바이러스 조성물이 항바이러스 활성을 나타내는 바이러스에 의한 감염증인 것을 특징으로 할 수 있으며, 비제한적 예로서, 감기, 독감(인플루엔자), 감염성 단핵구증, 거대세포바이러스감염, 홍역, 소아마비(폴리오), 황열, 뎅기열, B형 간염, C형 간염, 에이즈 및 코비드-19를 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 기능성 식품은 산화 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 항바이러스 조성물은 바이러스 감염증의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 본 발명에 따른 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물을 포함하기 때문에, 상술한 AGM 펩타이드, AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드 또는 항바이러스 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: OBOC 라이브러리 합성
OBOC 라이브러리를 solid-phase TentaGel MB NH2 resin(Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)에서 합성하였다. “split-mix” 합성 방법을 수행하여 각각 수백만 개의 beads/ligands의 랜덤 라이브러리를 함유하는 조합 OBOC 라이브러리를 구축하였다. 약 2,600,000개의 OBOC 라이브러리 합성을 위해 5g의 Tentagel MB NH2 resins(200μm, 520,000beads/g)이 사용되었다. 비드 표면상의 리간드는 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) chemistry 및 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) (GL Biochem, Shanghai, China)/N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC) (GL Biochem) coupling을 이용한 표준 고체상 펩타이드 합성 기술에 의해 합성되었다. 커플링 완료는 ninhydrin 테스트로 확인하였다. 비드는 사용하기 전까지 4℃에서 70% 에탄올에 저장되었다.
실시예 1-2: 윤리 및 세포 배양
인간 조직과 관련된 모든 연구는 광주과학기술원(Gwangju Institute of Science and Technology)의 연구윤리심의위원회(IRB)에 의해 사전 승인되었다(#20191008-BR-48-03-02). 모든 동물 실험은 광주과학기술원의 실험동물운영위원회(IACUC)의 지침에 따라 수행되었다(GIST-2019-040). 모든 배양물을 95% air/5% CO2와 함께 37℃에서 유지되는 가습 인큐베이터에서 성장시켰다. 정상 인간 유방 세포주 MCF-10A는 American Type Culture Collection으로부터 입수하였고, bovine pituitary extract(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)이 보충된 MEGM 완전 성장 배지(MEGM, Lonza, Walkersville, MD)에 증식시켰다. 정상 인간 결장직장 세포주 CCD-18Co는 한국세포주은행(Seoul, Republic of Korea)에서 입수하였다. MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCT-116을 포함하는 인간 유방암 및 결장직장암 세포주는 한국세포주은행에서 입수했다. Jurkat T 세포 역시 한국세포주은행에서 입수하였다. Luciferase-발현 MDA-MB-231 암 세포주는 PerkinElmer(PerkinElmer, Hopkinton, MA)로부터 입수했다. 각각의 암 세포주는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)(Gibco), 0.1mg/ml streptomycin(Gibco) 및 100units/ml penicillin(Gibco)이 보충된 RPMI1640(Gibco, Waltham, USA) 및 DMEM(Gibco)에서 성장시켰다.
실시예 1-3: 암-특이적 리간드에 대한 OBOC 라이브러리 스크리닝
스크리닝 전에 비드를 이중 증류수 및 인산염완충식염수(PBS; Welgene Inc., Republic of Korea)로 광범위하게 세척하였다. trypsin/EDTA(Gibco)를 이용하여 암 세포 및 정상 세포를 배양 접시로부터 분리하고, 상응하는 배양 배지로 세척하였다. 106cells/ml로 재현탁시키고, 페트리 접시의 OBOC 비드와 37℃ 가습 CO2 인큐베이터에서 진탕하면서(60rpm) 배양하였다. 세포에 의해 결합된 비드는 현미경 하에서 하나 이상의 세포 층으로 덮인 중심 비드를 갖는 장미 모양(rosettes)으로 나타났다. 도립 현미경(inverted microscope) 하에서 positive 비드를 피펫으로 골라내고, guanidine-HCL(8M, 20min)로 처리하여 비드 표면의 세포 및 단백질을 제거하고, 정상 유방 상피 세포로 2차 스크리닝을 수행하여 false 양성 결합을 제거하였다. 양 라운드에서 세포 결합을 갖는 비드만을 선별하여 펩타이드 시퀀싱을 수행하였다.
실시예 1-4: 혈청 안정성 시험
예열된 100% 인간 혈청(Sigma-Aldrich)을 이용하여 펩타이드의 저장용액(100μM)을 10배로 희석하고, 37℃에서 0, 3, 6, 9 및 24시간 동안 배양하였다. PBS에서의 펩타이드가 대조군으로 포함되었다. 4℃에서 10분 동안 3M의 최종 농도에서 요소(urea)로 혈청 단백질을 변성시킨 후, 최종 농도 7%(v/v)(4℃, 10분)에서 trichloroacetic acid로 혈청 단백질을 침전시키고 원심분리(17,000×g, 10분)하여 반응을 정지시켰다. 각각의 샘플의 상층액을 회수하고, solvent A(0.05%(v/v) TFA in H2O)에서 5-65% solvent B(acetonitrile 90%(v/v) with 0.045%(v/v) TFA in H2O)의 선형 구배를 사용하여 215nm에서 모니터링하면서 1ml/min의 유속에서 25분에 걸쳐 analytical column을 수행하였다. 각 펩타이드의 용출 프로파일은 0 시점으로부터 PBS 샘플에 의해 확인되었다. 혈청-처리된 샘플에 남아있는 펩타이드의 백분율은 각 시점에서 수득된 펩타이드 피크의 높이와 0 시점에서 수득된 펩타이드 피크의 높이를 비교함으로써 결정하였다. 각 실험은 3회 수행되었다.
실시예 1-5: Biotin pull-down 분석
세포 용해물(500μg/ml)을 biotinylated AGM-330(500ng/ml)과 함께 4℃에서 12시간 동안 배양한 후, streptavidin beads(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)에 의해 1시간 동안 실온에서 pull-down시켰다. 배양 후, 비드를 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 용출 버퍼를 비드에 첨가하고, 비드로부터 단백질을 추출한 뒤, 최종적으로 SDS-PAGE로 분석하였다. Biotin pull-down 분석에서 유래된 단백질을 식별하고 특징 짓기 위해, ProteomeTech(Seoul, Korea)에서 LC-coupled ESI-MS/MS 분석을 수행하였다.
실시예 1-6: AGM -330 결합 도메인 식별
인간 NCL cDNA clone(Addgene)으로부터 GFP-NCL(residues 1-710), GFP-△N-NCL(residues 322-710) 및 GFP-△C-NCL(residues 1-321)을 포함하는 NCL constructs를 만들었고, pEGFP-C2 벡터(Addgene)의 XhoI 및 BamHI sites로 서브클로닝시켰다. 이들 벡터는 제조사의 권고에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 의해 형질주입(transfection)시켰다. Biotinylated AGM-330 펩타이드를 streptavidin beads(Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 비드는 세척 버퍼로 3회 세척되었다. 세척 후, GFP-tagged NCL 단백질을 함유하는 형질주입된 세포 용해물로부터 제조된 용해물(300μl)에 비드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 12시간 동안 배양하여 AGM-330과 GFP-tagged NCL 단백질이 결합되도록 하였다. 이어서 비드를 세척 버퍼로 세척하였다. 동일한 부피의 2X 전기영동 샘플 버퍼를 비드에 첨가하고, 95℃에서 5분 동안 가열함으로써 비드로부터 단백질을 추출하였다. SDS-PAGE 및 면역블랏 분석으로 단백질을 최종적으로 분석하였다.
실시예 1-7: Jurkat 세포로부터 NCL의 정제
25ml의 20mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 5mM MgCl2, 5mM β-mercaptoethanol, 0.5%(v/v) Triton X-100, 1mM marimastat(AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA), protease inhibitor cocktail(Millipore, Billerica, MA, USA)에서 1.0X109 Jurkat 세포를 4℃에서 1시간 동안 용해시켜 NCL을 제조하였다. v) 트리톤 X-100, 1mM 마리 마 스타트(AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA), 프로테아제 저해제 칵테일(Millipore, Billerica, MA, USA). 핵을 1200xg에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화 한 다음, 상층액을 12,000xg에서 30분 동안 원심분리하고 -80℃에서 저장하였다. 핵이 없는(nucleus-free) 추출물로부터 NCL을 정제하기 위해 빠른 2단계 크로마토그래피 절차를 사용하였다. 모든 단계는 1mM marimastat 및 완전한 protease inhibitor cocktail의 존재 하에 빙냉(ice-cold) 버퍼 및 컬럼을 사용하여 4℃에서 수행하였다. Jurkat 세포(25ml)의 세포질 추출물을 pH 7.0, 20mM 인산나트륨으로 10배 희석하고, 5ml의 Mono Q 5/50 GL 컬럼(Sigma-Aldrich)에 통과시켰다. pH 7.0, 150ml의 20mM 인산나트륨으로 컬럼을 세척한 후, 1M NaCl을 함유하는 동일 버퍼 10ml로 흡착된 단백질을 용출시켰다. 용출액을 50mM Tris/HCl, pH 7.9, 5mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM β-mercaptoethanol(buffer A)로 10배 희석하고, 동일 버퍼로 평형시킨 1ml HiFiQ heparin HP column(Protein Ark, UK)에 로딩하였다. 0.2M ammonium sulfate를 함유하는 20ml의 버퍼 A로 겔을 세척하고, 0.6M ammonium sulfate를 함유한 2ml의 버퍼 A로 단백질을 50μl 분획으로 용출시켰다. NCL을 모아 4℃에서 2시간 동안 1mM marimastat를 함유하는 PBS에 투석한 뒤, -80℃에서 저장하였다. Coomassie blue로 염색된 10% SDS acrylamide gel에 대한 추가 제어는 단일 105 kDa 단백질 밴드로서 정제된 NCL의 존재를 확인하였다. NCL의 부분 분해 산물에 해당하는 2개의 70 및 50 kDa 단백질 밴드가 전체 단백질의 10% 미만의 양으로 관찰되었다.
실시예 1-8: 결합 친화도
AGM-330의 결합 친화도는 SPR(surface plasmone resonance) spectroscopy(Biacore T-200)에 의해 테스트되었다. 재조합 nucleolin 단백질을 CM5 sensorchip에 고정한 후, AGM-330을 농도별로 (20nM - 2.5μM)로 처리하여 각각에 대한 sensogram을 분석하고 K D 값을 결정하였다.
실시예 1-9: 통계 분석
모든 통계 데이터는 평균±SD(n = 3)로 표시되었다. 두 그룹 사이의 통계적 비교는 Student's t test에 의해 결정되었고, 여러 그룹 사이의 비교는 one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison에 의해 결정되었다. in vivo 실험의 경우, 마우스의 수는 각 범례에 표시되었다. Log-rank 테스트는 Kaplan-Meier analyses에 사용되었다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001을 나타낸다.
실시예 2: OBOC 조합 스크리닝 및 MAP 합성 방법에 의한 암- 표적화 펩타이드 리간드의 동정 및 특성 확인
새로운 암-특이적 펩타이드 리간드를 동정하기 위해, 5g의 Tentagel MB NH2 resins(200μm, 520,000beads/g, 도 3)을 사용하여 ~ 2,600,000개 라이브러리를 합성했다. 비드에 나열된 펩타이드 라이브러리(한 번에 50,000 ~ 100,000개의 비드가 사용됨)를 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231)와 혼합했다. 총 ~ 1,000,000개의 비드를 스크리닝하고, 8개의 positive 비드를 검출하였으며, 마이크로시퀀싱을 위해 분리하였다. 이들 8개 펩타이드 중 3개(AGM-330, AGM-331 및 AGM-332)는 MDA-MB-231에 대해 강한 우선적인 결합을 나타냈으며, 인간 정상 유방 세포주(MCF-10A)에는 결합하지 않거나, 약하게 결합하였다(도 4A, 도 4B). 그 다음, 이 3개의 펩타이드를 fluorescein isothiocyanate(FITC)로 라벨링하고, MDA-MB-231 세포에 결합할 수 있는지 여부를 확인하였다. AGM-331 및 AGM-332와 비교할 때, AGM-330에서 가장 강한 형광 신호가 검출되었다(도 4C). 세포 성장 비드 분석(cell-growth-on-bead assay) 및 형광 이미징으로부터 스크리닝 결과를 확인하기 위해, AGM-330을 Tentagel MB NH2 resin에서 재합성 하였다. 세포 성장 비드 분석 결과, AGM-330 비드는 15분 내에 인간 유방암 세포주(MCF7 및 MDA-MB-231)와 인간 결장직장암 세포주(HT-29 및 HCT-116)에 의해 완전히 덮였다(도 4D). 한편, AGM-331 및 AGM-332는 상대적으로 비특이적이며, 인간 정상 유방 세포주(MCF-10A) 및 인간 정상 결장직장 세포주(CCD-18Co)에 결합하였다. 또한, AGM-330은 MCF-10A 또는 CCD-18Co 세포에 매우 약하게 결합하거나, 전혀 결합하지 않았으므로, 이미징 및 치료적 표적화 제제 모두에 대한 우수한 후보가 될 수 있다.
현재 안정성이 낮기 때문에 치료제로서 펩타이드의 사용은 크게 제한되어왔다: 펩타이드는 in vivo에서 주로 프로테아제 및 펩티다아제에 의해 분해된다(Bottger R, et al. PLoS One. 2017; 12: e0178943). 본 발명에서는, 펩타이드 리간드의 안정성을 개선하기 위해, MAP 덴드리머 형태의 AGM-330을 합성하였으며, 이는 프로테아제 및 펩티다아제 활성에 대해 획득된 저항성으로 인해 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. AGM-330의 합성(도 4E)은 lysine core-conjugated Wang resin(2,3)을 만들기 위해, 20% piperidine 및 DMF의 존재 하에 Fmoc-Cys(Trt) Wang resin(1) 및 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH로 개시된다. 이어서, 20% piperidine 존재 하에 RHGAMVYLK-PEG12-OH로 처리하여 Fmoc- 및 Trt-보호된 AGM-330(4)을 제조하였다. AGM-330(4)의 Fmoc- 및 Trt- 보호기는 DMF의 piperidine에 의해 신속하게 제거되어 AGM-330(5)이 제조되었다.
선정된 펩타이드 리간드 AGM-330의 생체 내 안정성과 결합력 증진을 위해, MAP(Multiple Antigen Peptide) 합성법을 통하여 이량체, 사량체 형태로 합성하였다.
펩타이드 안정성을 증진 여부를 평가하기 위해, 펩타이드의 in vivo 반감기를 분석하였다. AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t 2mg/kg을 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였고, 남아있는 혈청내 펩타이드 부분은 항-AGM-330 항체를 통해 ELISA 플레이트에 즉시 고정시켰다. 흡광도는 VersaMax ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었으며, 약물동태(Pharmacokinetics)는 phoenix WinNonlin 8.1(Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA) 프로그램으로 분석하였다. 분석 결과, AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t의 반감기(T1/2)는 각각 0.42±0.33시간, 1.82±0.36시간, 9.43±1.21시간이었으며, 혈중 최대 집중 시간(Tmax)은 모두 0.167시간이었다. 혈중 최대 농도(Cmax)는 각각 1.27±0.12μg/mL, 1.71±0.11μg/mL, 1.875±0.67μg/mL였고, 커브 밑의 면적(AUC)은 각각 0.64±0.09μg/h/mL, 1.77±0.12μg/h/mL, 21.42±0.81μg/h/mL였다(도 5). 결과적으로, 사량체 AGM-330(AGM-330t)가 단량체 또는 이량체 펩타이드보다 안정성이 높은 것으로 확인되었다.
다음으로, MAP 리간드가 암 세포에 선택적으로 결합할 수 있는지를 조사하기 위해, FITC-표지된 AGM-330(AGM-330-FITC)으로 처리된 암 세포를 비처리 세포와 비교하였다. AGM-330-FITC를 무혈청 배지에서 37℃, 2시간 동안 세포(1X105)와 배양하여 접합체(conjugates)를 온전하게 유지시켰다. 그 다음, 고유 형광 펩타이드-처리된 세포를 비처리 세포에 대해, 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)의 변화에 기초하여 비교하고 측정하였다(도 4F). 그 결과, AGM-330-FITC는 MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCT-116에 대한 유의한 암 세포 결합을 나타냈으며, 이는 비처리 세포에 대비 처리 세포의 MFI의 상대적인 증가에 의해 입증된 바와 같다. 대조적으로, 2시간 배양 후 접합체는 MCF-10A 및 CCD-18Co를 포함하는 정상 세포에 대해 현저히 감소된 결합을 나타낸 반면, 암 세포에 대해서는 강한 우선적 결합을 나타냈다.
실시예 3: AGM -330의 잠재적 표적인 암 세포 성장의 강력한 조절인자 NCL
AGM-330의 미지의 표적 단백질을 확인하기 위해, 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography) 및 질량 분석법 기반의 단백질체학적 접근 방식을 사용하여, MDA-MB-231 세포의 세포 용해물로부터 AGM-330-상호작용 단백질을 확인하였다(도 6A). 친화성 컬럼 크로마토그래피 후, SDS-PAGE 분석을 통해 용출 분획에만 존재하는 여러 가지 별개의 단백질 밴드(55-100kDa)를 확인하였다(도 6B). LC-MS/MS 분석을 사용하여 6개의 단백질을 확인하였고, 이들 절제된 밴드의 펩타이드 식별은 100kDa에서 주요 단백질 밴드 중 하나가 뉴클레오린(NCL)으로 특성화되었음을 보여 주었다. NCL은 710개의 아미노산으로 구성되며 LC-MS/MS 분석에 의해 식별된 22개의 다른 펩타이드 단편은 NCL의 아미노산 서열과 일치하였다(NCBI 데이터베이스의 인간 NCL(accession number: gi189306)에 대한 total score 881 및 24% sequence coverage)(도 6C-D). 또한, 항-NCL 항체를 사용한 면역블랏 분석을 통해 AGM-330 친화성 컬럼에서의 용출물에서 NCL의 농축을 추가로 확인하였다(도 6E). 따라서, 단백질체학적 연구는 NCL이 AGM-330-상호작용 단백질이라는 것을 시사한다.
AGM-330의 NCL에 대한 결합 친화도를 확인하기 위해, AGM-330을 사용하여 SPR(surface plasmone resonance) test를 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, K d 값이 약 57.7nM로, NCL에 대해 매우 높은 결합 친화도를 나타냄을 확인하였다.
AGM-330과 NCL 간의 상호작용에 관여하는 도메인을 조사하기 위해 biotin pull-down 분석을 사용했다. Biotinylated AGM-330(AGM-330-Biotin)을 bait로 사용하여 NCL 돌연변이체를 풀다운시켰다. NCL의 몇몇 결실 돌연변이체가 생성되었다. 모두 GFP에 융합된 야생형 및 다양한 NCL 돌연변이체, NCL1(1-710), NCL2(323-710) 및 NCL3(1-322)을 코딩하는 발현 벡터로 형질주입된 HEK293T 세포로부터 세포 추출물을 제조하였다. AGM-330-Biotin은 야생형 NCL1(1-710) 및 NCL3(1-322)을 풀다운시켰지만, NCL2(323-710)는 풀다운시키지 않았다(도 6F). 이러한 결과는 NCL의 N-말단 영역(1-322)이 AGM-330의 결합에 중요하다는 것을 나타낸다. AGM-330과 NCL 사이의 직접적인 상호작용을 추가로 확인하기 위해, 정제된 NCL 및 AGM-330-Biotin을 biotin pull-down 분석에 사용하였다. 항-NCL 항체를 사용한 면역블랏 분석을 통해 용출 분획에서 NCL의 농축을 확인하였다(도 8). 종합하면, AGM-330이 NCL과 직접적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
실시예 4: AGM -330과 CPP가 결합된 융합 펩타이드의 합성
AGM-330의 세포 투과성을 증가시키기 위하여, 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)를 결합시켜 융합 펩타이드를 제작하였다.
AGM-330t에 maleimide와 결합한 CPP(RIMRILRILKLAR; 서열번호 38)를 pH 7.0~7.5에서 반응시키면, AGM-330t의 기능기인 thiol기와 thiol-maleimide reaction에 의해 결합되어 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드가 합성된다(도 9).
제작된 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드의 HPLC 및 MS 분석 결과, retention time 23.2분 및 분자량 7876 Da인 것을 확인하였으며, AGM-330t, maleimide-mCPP의 분석 결과와 함께 도 10에 도시하였다.
실시예 5: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 influenza A virus( IAV ) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 influenza A virus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 A549 세포(Lung cancer cell line, American Type Culture Collection [ATCC])가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, influenza A virus(IAV, Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1), ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, rabbit polyclonal primary antibody against influenza A virus PB1 antigen과 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-380d-mCPP와 AGM-380t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 11A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 influenza A virus 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 A549 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, influenza A virus(IAV, Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1), ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 8시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against influenza A virus M2 antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 11B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 influenza A virus 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 A549 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, influenza A virus(IAV, Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1), ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 24시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, influenza A virus의 PB1에 특이적인 forward primer(5'-CTGCCAGAAGACAATGAACC-3', 서열번호 71)와 reverse primer(5'-GGCCATTGCTTCCAATACAC-3', 서열번호 72)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 11C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 influenza A virus 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 A549 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, influenza A virus(IAV, Puerto Rico/8 (PR8) (H1N1), ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-treated trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 8시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 A549 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against influenza A virus nucleoprotein(NP) antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 488가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 11D).
그 결과, 바이러스 단백질(PB1), 세포 내 바이러스 항원(M2) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 11). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 influenza A virus 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 6: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 bovine coronavirus ( BCoV ) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine coronavirus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G 세포(Human cororectal adenocarcinoma cell line, ATCC)가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, bovine coronavirus(BCoV, KWD20 strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 5μg/mL porcine pancreatin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 36시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S) antigen과 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 12A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine coronavirus 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, bovine coronavirus(BCoV, KWD20 strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 5μg/mL porcine pancreatin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S) antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 12B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine coronavirus 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, bovine coronavirus(BCoV, KWD20 strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 5μg/mL porcine pancreatin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 24시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, bovine coronavirus의 N gene에 특이적인 forward primer(5'-TGGATCAAGATTAGAGTTGGC-3', 서열번호 73)와 reverse primer(5'-CCTTGTCCATTCTTCTGACC-3', 서열번호 74)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 12C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine coronavirus 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, bovine coronavirus(BCoV, KWD20 strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 5μg/mL porcine pancreatin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 8시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against bovine coronavirus spike(S) antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 488가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 12D).
그 결과, 바이러스 단백질(S), 세포 내 바이러스 항원(S) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 12). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 bovine coronavirus 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 7: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine epidemic diarrhea virus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 Vero E6 세포(African green monkey kidney epithelial cell line, ATCC)가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, QIAP1401, A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 3μg/mL porcine pancreatic trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 36시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N) antigen과 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 13A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine epidemic diarrhea virus 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 Vero E6 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, QIAP1401, A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 3μg/mL porcine pancreatic trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N) antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 13B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine epidemic diarrhea virus 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 Vero E6 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, QIAP1401, A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 3μg/mL porcine pancreatic trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, porcine epidemic diarrhea virus의 N gene에 특이적인 forward primer(5'-GCTATGCTCAGATCGCCAGT-3', 서열번호 75)와 reverse primer(5'-TCTCGTAAGAGTCCGCTAGCTC-3', 서열번호 76)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 13C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine epidemic diarrhea virus 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 Vero E6 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, QIAP1401, A kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 3μg/mL porcine pancreatic trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 18시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 HRT-18G 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid(N) antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 488가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 13D).
그 결과, 바이러스 단백질(N), 세포 내 바이러스 항원(N) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 13). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 PEDV 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 8: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 bovine rotavirus( RVA ) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine rotavirus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MA104 세포(African green monkey kidney epithelial cell line, ATCC)가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, 10μg/mL crystalized trypsin로 활성화된 bovine species A rotavirus(RVA, NCDV strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 12시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, mouse monoclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigen과 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 14A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine rotavirus 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MA104 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 10μg/mL crystalized trypsin로 활성화된 bovine species A rotavirus(RVA, NCDV strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 8시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 mouse monoclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-mouse IgG polyclonal antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 14B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine rotavirus 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MA104 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, 10μg/mL crystalized trypsin로 활성화된 bovine species A rotavirus(RVA, NCDV strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 12시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, rotavirus VP6 gene에 특이적인 forward primer(5'-TAGACCAAATAACGTTGAAGTTGA-3', 서열번호 77)와 reverse primer(5'-GATTCACAAACTGCAGATTCAA-3', 서열번호 78)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 14C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine rotavirus 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MA104 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, 10μg/mL crystalized trypsin로 활성화된 bovine species A rotavirus(RVA, NCDV strain, ATCC)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 8시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 MA104 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 well에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 goat polyclonal primary antibody against species A rotavirus VP6 antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 8시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, fluorescein isothiocyanate(FITC)가 결합된 rabbit anti-goat IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 14D).
그 결과, 바이러스 단백질(VP6), 세포 내 바이러스 항원(VP6) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 14). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 bovine rotavirus 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 9: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 porcine reproductive and respiratory syndrome virus( PRRSV ) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine reproductive and respiratory syndrome virus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MARC-145 세포(African green monkey kidney epithelial cell line, ATCC)가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, LMY strain, a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 36시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, rabbit polyclonal primary antibody against porcine reproductive and respiratory syndrome virus membrane(M) antigen과 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 15A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 bovine rotavirus 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MARC-145 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, LMY strain, a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 16시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 rabbit polyclonal primary antibody against porcine reproductive and respiratory syndrome virus membrane(M) antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 15B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine reproductive and respiratory syndrome virus 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MARC-145 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, LMY strain, a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 36시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, PRRSV M gene에 특이적인 forward primer(5'-CACCTCCAGATGCCGTTTG-3', 서열번호 79)와 reverse primer(5'-ATGCGTGGTTATCATTTGCC-3', 서열번호 80)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 15C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 PRRSV 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 MARC-145 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, LMY strain, a kind gift from Animal and Plant Quarantine Agency, Korea)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 1μg/mL crystalized trypsin, 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 16시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 MARC-145 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 well에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 rabbit polyclonal primary antibody against PRRSV M antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 8시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 488가 결합된 goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 15D).
그 결과, 바이러스 단백질(M), 세포 내 바이러스 항원(M) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 15). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 porcine reproductive and respiratory syndrome virus 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 10: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 porcine sapovirus ( PSaV ) 억제 효과 확인
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 porcine sapovirus 증식 억제에 의한 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 western blot analysis를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 LLC-PK 세포(Pig kidney epithelial cell line, ATCC)가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine sapovirus(PSaV, Cowden strain, a kind gift from Dr. K.O. Chang, Kansas State, USA)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid), 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigen과 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 또한 AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 바이러스 항원의 감소양을 정량하기 위해 숙주 단백질인 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 mouse monoclonal primary antibody와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다(도 16A).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 PSaV 증식 억제에 의한 세포질 내 바이러스 항원량 감소를 검출하기 위해 immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 LLC-PK 세포가 있는 8-well chamber slide의 각 chamber를 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine sapovirus(PSaV, Cowden strain, a kind gift from Dr. K.O. Chang, Kansas State, USA)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid), 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 16시간 배양하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 chamber에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 chamber에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigen을 각 chamber에 넣은 후 4℃에서 12시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 594가 결합된 goat anti-rabbit IgG secondary antibody 희석액을 각 chamber에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, 핵을 염색하는 DAPI가 포함된 SlowFade Gold antifade 용액으로 각 slide를 봉입한 다음 LSM 800 confocal microscope로 관찰하였다(도 16B).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 PSaV 증식 억제에 의한 바이러스 게놈 수 감소를 검출하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 LLC-PK 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine sapovirus(PSaV, Cowden strain, a kind gift from Dr. K.O. Chang, Kansas State, USA)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid), 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Random hexamer와 poly(rA)-oligo(dT)가 포함된 TOPscript™ cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이 후, TOPreal™ qPCR 2X PreMix(Enzynomics) 용액 내에 합성한 cDNA, PSaV VPg에 특이적인 forward primer(5'-CGAAAGGGAAAAACAAACGC-3', 서열번호 81)와 reverse primer(5'-TCACTCACTGTCATAGGTGTCACC-3', 서열번호 82)를 넣은 후, LineGene 9600 Plus Real-time PCR detection system(Bioer, Hangzhou, China)에서 real-time PCR을 수행하였다(도 16C).
AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP에 의한 PSaV 자손 바이러스 생산 감소를 검출하기 위해 cell culture immunofluorescence assay를 수행하였다. 먼저 융합성(confluent)으로 성장한 LLC-PK 세포가 있는 12-well plate의 각 well을 DPBS로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 그 다음, porcine sapovirus(PSaV, Cowden strain, a kind gift from Dr. K.O. Chang, Kansas State, USA)를 0.1 MOI FFU/mL로 세포에 접종하고, 1시간 동안 배양하였다(흡착). 바이러스 흡착 후 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고, 지정된 농도의 화합물, 200μM GCDCA(glycochenodeoxycholic acid), 1% penicillin, 1% streptomycin을 포함하는 보존배지와 함께 36℃에서 16시간 배양하였다. 이후 각 plate를 3번의 냉동 및 해동 과정을 통해 세포를 각 well에서 떼어낸 후, 상층액을 10배 계단 희석한 후, 융합성(confluent)으로 성장한 LLC-PK 세포가 있는 96-well plate의 각 well에 분주하였다. 이후 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 각 well에 4% paraformaldehyde 고정액을 넣고 20℃에서 10분간 고정시켰다. 세포의 투과성을 높이기 위해 각 well에 0.2% Triton-X를 20℃에서 10분간 처리하였다. 이후 각 well을 인산완충식염수(pH 7.4)로 2회 세척 후, 세척액을 버렸다. 이 후 rabbit polyclonal primary antibody against PSaV VPg antigen을 각 well에 넣은 후 4℃에서 8시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.4)로 각 chamber를 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, Alexa Fluor 488가 결합된 goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody 희석액을 각 well에 넣은 후 20℃에서 1시간 작용시켰다. 인산완충생리식염수(pH 7.8)로 각 well을 3회 세척 후, 세척액을 버린 다음, propidium iodide로 핵을 염색한 다음, glycerol로 봉입 후, 도립 형광현미경으로 양성세포 수를 검사하였다(도 16D).
그 결과, 바이러스 단백질(VPg), 세포 내 바이러스 항원(VPg) 양, 바이러스 게놈 수, 바이러스 자손 수는 NCL 표적 펩타이드 리간드 처리 농도에 따라 감소하였다(도 16). 따라서, NCL 표적 펩타이드 리간드가 porcine sapovirus 감염을 억제하는 것이 검증되었다.
실시예 11: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 CC 50 과 AGM -330의 IAV , BCoV , PEDV, RVA , PRRSV , PSaV에 대한 IC 50 및 선택지수(selective index) 확인
AGM-330의 반수 최대 세포독성 농도(half maximal cytotoxic concentration, CC50)를 확인하기 위해서 96-well plate에서 성장한 융합성(confluent) A549, MDCK, Vero E6, MA104, MARC-145, LLC-PK 세포에 NCL 표적 펩타이드 리간드(AGM-330d-mCPP, AGM-330t-mCPP)를 저농도에서 10μM 농도까지 희석한 것을 처리한 후, 24시간 배양하였다. 각각의 배양액을 제거한 후, 200μL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 용액을 넣은 후 36℃의 5% CO2 incubator에서 4시간 배양하였다. 이 후 150μL의 DMSO 용액을 각 well에 추가한 후 20℃에서 작용시켰다. 이 후 optical density(OD)는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader로 570nm 파장에서 측정하였다(표 6).
상이한 세포주에서 세포 NAD(P)H-의존성 세포 산화환원효소(oxidoreductase) 측정(MTT assay)으로 결정된 AGM-380d-mCPP 및 AGM-380t-mCPP의 반수 최대 세포독성 농도(CC50)
Cell lines CC 50 ( μM )
AGM -330d- mCPP AGM -330t- mCPP
A549 102.00 92.50
HRT-18 89.53 91.93
Vero E6 107.50 99.92
MA-104 99.93 89.95
MARC-145 97.97 88.68
LLC-PK 101.30 92.70
AGM-330의 각 바이러스에 대한 반수 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration, IC50)를 확인하기 위해서 12-well plate에서 성장한 융합성(confluent) A549, MDCK, Vero E6, MA104, MARC-145, LLC-PK 세포의 상층액을 제거하고, 여기에 influenza A virus(IAV, PR8 strain), bovine coronavirus(BCoV, KWD20 strain), porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, QIAP1401 strain), bovine rotavirus(RVA, NCDV strain), porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV, LMY strain), porcine sapovirus(PSaV, Cowden strain)를 각각 0.1 MOI로 접종 한 다음, 1시간 동안 바이러스를 세포에 흡착시켰다. 이 후 NCL 표적 펩타이드 리간드(AGM-330d-mCPP, AGM-330t-mCPP)를 저농도에서 10μM 농도로 계단 희석한 것이 포함된 배양액 2ml를 첨가한 후, influenza A virus, bovine rotavirus가 감염된 세포는 24시간, bovine coronavirus, porcine epidemic diarrhea virus, porcine sapovirus가 감염된 세포는 36시간, porcine reproductive and respiratory syndrome virus가 감염된 세포는 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 각 plate는 3번의 냉동 및 해동을 시킨 후, 상층액을 10배 계단 희석하였다. 바이러스의 역가(titer)를 검사하기 위해, 96-well plate에서 성장한 융합성(confluent) A549, MDCK, Vero E6, MA104, MARC-145, LLC-PK 세포의 상층액을 제거하고, 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세하였다. 상층액을 제거한 다음 각각의 10배 계단 희석된 바이러스액 100μL를 A549, MDCK, Vero E6, MA104, MARC-145, LLC-PK 세포가 융합성으로 성장한 각각의 96-well plate의 well에 접종한 다음, 36℃의 5% CO2 incubator에서 18시간 배양하였다. 상층액을 제거 후, 4% 파라포름알데하이드 용액으로 15분간 고정 후, 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세한 다음 0.2% Triton X-100로 20℃에서 10분간 처리하였다. 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세한 후, influenza A virus의 NP 항원, bovine coronavirus의 S 항원, porcine epidemic diarrhea virus의 N 항원, species rotavirus VP6 항원, porcine reproductive and respiratory syndrome virus M 항원, porcine sapovirus VPg 항원에 대한 100~200배 희석된 1차 항체를 각각의 well에 분주 후, 12시간 동안 4℃ 냉장고에서 작용시켰다. 이 후 상층액을 제거한 후, 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세한 다음 100~200배 희석된 Alexa Fluor 488 혹은 fluorescein isothiocyanate가 결합된 2차 항체를 각각의 well에 분주 후, 2시간 동안 실온에서 작용시켰다. 이 후 상층액을 제거한 후, propidium iodide 용액으로 핵을 염색 후, 60% glycerol 용액을 각각의 well에 넣은 후, 형광현미경에서 각각의 바이러스 양성 세포들을 검사하였다. 이상의 실험을 바탕으로 CC50 값과 IC50 값을 계산한 후, 선택지수(selective index, SI) 값은 CC50 값을 IC50 값으로 나누어서(CC50/ IC50) 계산하였다(표 7).
6가지 RNA 바이러스에 대한 AGM-380d-mCPP 및 AGM-380t-mCPP의 반수 최대 억제 농도(IC50) 및 선택지수(SI)
Viruses AGM -330d- mCPP ( μM ) AGM -330t- mCPP ( μM )
IC 50 SI IC 50 SI
IAV 1.40 72.90 1.10 84.1
BCoV 1.27 70.49 1.31 70.17
PEDV 2.82 38.12 1.89 52.86
RVA 1.88 53.15 1.32 68.14
PRRSV 2.26 43.26 2.80 31.67
PSaV 9.80 10.30 5.20 17.80
그 결과, NCL 표적 펩타이드 리간드(AGM-330d-mCPP, AGM-330t-mCPP)는 10μM의 고농도에서도 현저한 세포독성을 보이지 않았으며, 저농도에서도 influenza A virus, bovine coronavirus, porcine epidemic diarrhea virus, bovine rotavirus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine sapovirus 감염을 억제하는 것이 검증되었다(도 17).
실시예 12: in vitro 실험을 통한 AGM -330의 SARS- CoV -2 억제 효과 확인
AGM-330의 반수 최대 세포독성 농도(CC50)를 확인하기 위해서 96-well plate에서 성장한 융합성(confluent) Vero 세포주(African green monkey kidney cell line, ATCC)에 세포에 NCL 표적 펩타이드 리간드(AGM-330d-mCPP, AGM-330t-mCPP)를 저농도에서 20μM 농도까지 희석한 것을 처리한 후, 24시간 배양하였다. 각각의 배양액을 제거한 후, 200μL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 용액을 넣은 후 36℃의 5% CO2 incubator에서 4시간 배양하였다. 이 후 150μL의 DMSO 용액을 각 well에 추가한 후 20℃에서 작용시켰다. 이 후 optical density(OD)는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader로 570nm 파장에서 측정하였다.
AGM-330의 SARS-CoV-2에 대한 반수 최대 억제 농도(IC50)를 확인하기 위해서 384-well microplate에서 성장한 융합성(confluent) Vero E6세포에 0.0125 MOI로 접종한 다음, 1시간 동안 바이러스를 세포에 흡착시켰다. NCL 표적 펩타이드 리간드(AGM-330d-mCPP, AGM-330t-mCPP)와 positive control로 chloroquine, remdesivir 또는 lopinavir를 저농도에서 20μM 농도로 계단 희석한 것이 포함된 배양액은 바이러스 접종 1시간 전 및 1시간 후에 세포에 처리하였다. NCL 표적 펩타이드 리간드와 positive control을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료 후 각 plate는 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세하였다. 이 후 SARS-CoV-2 nucleocapsid(N)에 대한 1차 항체를 각각의 well에 분주 후, 12시간 동안 4℃ 냉장고에서 작용시켰다. 이 후 상층액을 제거한 후, 인산완충생리식염수로 3번 각 well을 수세한 다음 Alexa Fluor 488가 결합된 2차 항체를 각각의 well에 분주 후, 2시간 동안 실온에서 작용시켰다. 이 후 상층액을 제거한 후, Hoechst 33342로 핵을 염색 후, 감염된 세포의 형광 이미지는 대용량 이미지 분석 기기인 Operetta로 검출하였다. 이상의 실험을 바탕으로 CC50 값과 IC50 값을 계산한 후(표 8), SI 값은 CC50 값을 IC50 값으로 나누어서 계산하였다.
Type IC 50 ( μM ) CC 50 ( μM )
Chloroquine 8.25 >150
Remdesivir 10.87 >50
Lopinavir 15.45 >50
AGM-330t-mCPP 7.22 >20
AGM-330d-mCPP 12.46 >20
AGM-330d-dCPP 5.2 7.73
NCL 표적 펩타이드 리간드는 positive control로 사용한 기존의 약물들에 비해 증진된 IC50 값을 나타냈으며, 20μM의 고농도에서도 현저한 세포독성을 보이지 않았다(도 18).
결과적으로, NCL 표적 펩타이드 리간드가 SAR-CoV-2의 감염을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 13: 햄스터 코로나 19 감염 모델을 이용한 AGM -330의 항바이러스 효능 평가
Syrian hamster(Female, 11 weeks, ㈜라온바이오)에 SARS-CoV-2(2x105pfu/mL)를 비강 점적을 통해 감염시켰다.
감염시킨 햄스터 동물 모델에 NCL 표적 펩타이드 리간드인 AGM-330d-mCPP(AGM-380D) (0.2, 2, 6mg/kg)를 12시간 간격으로 4일 간 총 8회 복강으로 투여하였다. 감염 후 5일간의 사망률 및 일반증상을 관찰한 결과, 시험 기간 중 사망 동물은 발생하지 않았으며, 시험 물질과 관련한 임상적 이상소견은 관찰되지 않았다. 감염 당일, 감염 후 2일차, 감염 후 4일차에 체중을 측정한 결과, 정상대조군(NC)을 제외한 바이러스 대조군(VC)과 시험군에서 체중이 감소하였다. 바이러스 대조군과 시험군 사이에 유의적인 체중변화는 관찰되지 않았다(도 19).
감염 후 4일차에 부검을 실시한 결과, 정상대조군을 제외한 바이러스 대조군과 시험군의 폐장에서 바이러스 감염에 의한 충/출혈, 부종을 포함한 육안적 변화가 확인되었다. AGM-330d-mCPP(6mg/kg)를 투여한 군에서 바이러스 대조군과 비교할 때 육안적 변화가 유의적으로 완화되었다(도 20 내지 도 25).
폐장에 대한 병리조직학적 관찰에서도 바이러스 감염에 의한 폐포강 및 간질조직의 염증세포침윤, 출혈, 유리질막 형성(hyaline membrane) 등의 소견이 관찰되었다(표 9). AGM-330d-mCPP(6mg/kg)를 투여한 군에서 바이러스 대조군과 비교할 때 병리조직학적 병변이 유의적으로 감소하였다(도 26).
폐 병리조직학적 소견의 발생률 및 중증도(AGM-1: AGM-380D 0.2mg/kg, AGM-2: AGM-380D 2mg/kg, AGM-3: AGM-380D 6mg/kg)
Organ/
Findings		 Group NC VC AGM-1 AGM-2 AGM-3
Dose (mg/kg) 0 0 0.2 2 6
No of Animals 5 5 5 5 5
Lung Neutrophilic/
lymphocytic cell,
alveolar		 Normal 5 0 0 0 0
Minimal 0 1 2 2 5
Mild 0 3 3 3 0
Moderate 0 1 0 0 0
Inflammatory cell,
intestinal		 Normal 5 0 0 0 0
Minimal 0 1 0 0 2
Mild 0 0 2 1 3
Moderate 0 3 3 3 0
Severe 0 1 0 1 0
Hyaline membrane Normal 5 0 0 0 0
Minimal 0 1 0 0 4
Mild 0 0 3 3 1
Moderate 0 4 2 2 0
Severe 0 0 0 0 0
Hemorrhage Normal 5 1 0 0 0
Minimal 0 1 3 2 5
Mild 0 3 2 3 0
Moderate 0 0 0 0 0
Severe 0 0 0 0 0
Proteinaceous debris Normal 5 0 0 0 0
Minimal 0 1 3 3 4
Mild 0 4 2 2 1
Moderate 0 0 0 0 0
Severe 0 0 0 0 0
Alveolar wall
thickening		 Normal 4 0 0 0 0
Minimal 0 1 0 0 2
Mild 0 2 3 3 3
Moderate 1 2 2 2 0
Severe 0 0 0 0 0
실시예 14: AGM -330의 influenza A virus에 대한 in vivo 항바이러스 효과 확인
C57BL/6 마우스에 influenza A 바이러스를 비강투여로 감염시켜(1x 104pfu/ml, 50μl), NCL 표적 펩타이드 리간드를 각 농도별로 5일간 하루 한번 복강투여(interaperitoneal administration)하여 16일간의 생존율을 관찰하였다. AGM-330d-mCPP의 경우 각 0.04, 0.2, 1.00mg/kg의 투여 농도에서 유의미하게 증진된 생존율을 보였고(도 27A), AGM-330t-mCPP의 경우 각 0.334, 1.67mg/kg의 투여 농도에서 유의미하게 증진된 생존율을 보였다(도 27B).
실시예 15: AGM - 330와 oseltamivir 혼합투여의 influenza A virus에 대한 in vivo 항바이러스 효과 확인
C57BL/6 마우스에 influenza A 바이러스를 비강투여로 감염시킨 후(1x104pfu/ml, 50μl), NCL 표적 펩타이드 리간드인 AGM-380d-mCPP 1.00mg/kg, NCL 표적 펩타이드 리간드인 AGM-330t-mCPP 1.67mg/kg, AGM-330d-mCPP 1.00mg/kg과 oseltamivir 2mg/kg, AGM-330t-mCPP 1.67mg/kg과 oseltamivir 2mg/kg를 5일간 하루 투여하였다. AGM-330d-mCPP와 AGM-330t-mCPP는 복강투여(interaperitoneal administration) 하였으며, oseltamivir는 구강투여(oral administration)하였다. 바이러스 접종 후 16일간의 생존율을 관찰하였다. AGM-330d-mCPP 단독 및 AGM-330t-mCPP 단독 투여와 비교하여, AGM-330d-mCPP와 oseltamivir 혼합투여의 경우 100%의 생존률(도 28A)을, AGM-330t-mCPP와 oseltamivir 혼합투여의 경우 90%의 생존률(도 28B)을 보여 oseltamivir와의 혼합투여가 뚜렷한 influenza A virus 감염증의 치료효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 16: AGM -330의 influenza A virus 복제에 대한 in vivo 억제 효과 확인
실시예 14의 4 및 6 DPI(Days post infection)에서의 NCL 표적 펩타이드 리간드 실험군 마우스 폐 조직에서의 PB1 mRNA 및 단백질 발현 정도와 바이러스 titer를 확인하였다.
그 결과, 4 DPI 및 6 DPI에서의 PB1의 mRNA 및 단백질 발현 수준이 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한 바이러스 titer의 확인 결과, influenza A virus가 NCL 표적 펩타이드로 인해 감염이 억제되며, 바이러스 개체수도 확연히 감소됨을 확인하였다. 이 결과는 NCL 표적 펩타이드 리간드로 인해 바이러스 개체수가 감소함을 뜻하며, 이러한 결과는 실시예 14의 생존율과 관련됨을 의미한다(도 29).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> ANYGEN CO., LTD. <120> An Antiviral Composition Comprising a Nucleolin-Binding Peptide <130> P22-B026 <150> KR 2021-0064140 <151> 2021-05-18 <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 1 Arg His Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-331 <400> 2 Ala Asp His Arg His Arg Arg Ser Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-332 <400> 3 Ala Val Ala Arg Ala Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-333 <400> 4 Arg Phe Leu Lys Asn Lys Lys Ala Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-334 <400> 5 Arg Trp Leu Lys Asn Lys Lys Ala Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-335 <400> 6 Phe Gly Arg Leu Lys Lys Pro Leu Lys 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-336 <400> 7 Lys Arg Arg Arg Arg Glu Arg Ala Gly 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-337 <400> 8 Lys Arg Arg Arg Lys Ala Pro Thr Asp 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 9 Lys His Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 10 Arg Arg Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 11 Arg His Gly Leu Met Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 12 Arg His Gly Ala Leu Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 13 Arg His Gly Ala Xaa Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 14 Arg His Gly Ala Met Ala Tyr Leu Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 15 Arg His Gly Ala Met Val Phe Leu Lys 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 16 Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 17 Arg His Arg His Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 18 Arg His Arg His Arg His Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 19 Lys Leu Tyr Val Met Ala Gly His Arg 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AGM-330 <400> 20 Arg His Gly Ala Met Val Tyr Leu Lys Leu Lys Leu Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 21 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT(48-60) <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT(49-57) <400> 23 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Penetratin <400> 24 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R8 <400> 25 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R9-TAT <400> 26 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 27 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hph-1 <400> 28 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP <400> 29 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pVEC <400> 30 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4 <400> 31 Val Gln Ile Phe Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Arg His Ser Thr 20 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transportan <400> 32 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gH625 <400> 33 His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu 1 5 10 15 Ile Arg Ala Phe 20 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 34 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4 <400> 35 Val Gln Ile Phe Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Arg His Ser Thr 20 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-1 <400> 36 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Thr 1 5 10 15 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-2 <400> 37 Val Gln Ile Phe Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Arg <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-3 <400> 38 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4 <400> 39 Phe Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ile Leu Leu Ile Ile 1 5 10 15 Ser <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4-1 <400> 40 Phe Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ile Leu Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4-2 <400> 41 Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 42 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N1 <400> 42 Arg Ile Leu 1 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N3 <400> 43 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu 1 5 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N5 <400> 44 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N7 <400> 45 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg 1 5 10 15 Ile Leu Arg Ile Leu 20 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K3 <400> 46 Arg Ile Phe Trp Val Ile Lys Leu Ala Arg His Phe Ile 1 5 10 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 <400> 47 Lys Ser Leu Arg Val Leu Arg Val Leu Arg Pro Leu Lys Thr Ile Lys 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4 <400> 48 Arg Leu Phe Arg Val Met Arg Leu Val Lys Leu Leu Ser Arg Gly 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S2 <400> 49 Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp 1 5 10 15 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4 <400> 50 Arg Val Ile Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys 1 5 10 15 Gly Ala Lys Gly Ile Arg 20 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1 <400> 51 Arg Ala Gly Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2 <400> 52 Arg Ile Met Arg Gly Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3 <400> 53 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Leu Met Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4 <400> 54 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Met Phe Arg 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D5 <400> 55 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ala Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D6 <400> 56 Arg Ile Met Arg Gly Met Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D7 <400> 57 Arg Leu Phe Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D8 <400> 58 Arg Ile Met Arg Met Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D9 <400> 59 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D10 <400> 60 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gly Val Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D11 <400> 61 Arg Asn Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D12 <400> 62 Arg Ile Met Arg Asp Ile Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13 <400> 63 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D14 <400> 64 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D15 <400> 65 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg His Met Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16 <400> 66 Arg Ile Met Arg Ser Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D17 <400> 67 Arg Thr Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D18 <400> 68 Arg Ile Met Arg Tyr Ala Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D19 <400> 69 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Gln Ile Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D20 <400> 70 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Glu Val Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ctgccagaag acaatgaacc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ggccattgct tccaatacac 20 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 tggatcaaga ttagagttgg c 21 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ccttgtccat tcttctgacc 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 gctatgctca gatcgccagt 20 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 tctcgtaaga gtccgctagc tc 22 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tagaccaaat aacgttgaag ttga 24 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 gattcacaaa ctgcagattc aa 22 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 cacctccaga tgccgtttg 19 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 atgcgtggtt atcatttgcc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 cgaaagggaa aaacaaacgc 20 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 tcactcactg tcataggtgt cacc 24

Claims (17)

  1. 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물로서,
    상기 AGM 펩타이드는 다음의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물:
    (a) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
    (b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
    (i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
    (ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
    (iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 15 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 AGM 펩타이드에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 쇄(chain)가 접합된 AGM 펩타이드-PEG 접합체(conjugate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 2 내지 24개의 에틸렌 글리콜기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 AGM 펩타이드와 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체(multimer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 2 내지 8개의 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 2개 이상의 AGM 펩타이드-PEG 접합체가 링커에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 코로나바이러스(Coronavirus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus), 소 로타바이러스(Bovine rotavirus), 돼지 사포바이러스(Porcine sapovirus), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 알푸이 바이러스(Alfuy virus), 반지 바이러스(Banzi virus), 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV), 인간 시토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 코코베라 바이러스(Kokobera virus), 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 키야사나 삼림병 바이러스(Kyasanur forest disease virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 홍역 바이러스(measles virus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 모자이크 바이러스(Mosaic Virus), 머레이 밸리 바이러스(Murray Valley virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 포와산 바이러스(Powassan virus), 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV), 로시오 바이러스(Rocio virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(Saint Louis encephalitis virus), 진드기-매개 뇌염 바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 및 황열 바이러스(Yellow fever virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  10. 뉴클레오린(nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 AGM 펩타이드와 세포투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 AGM 펩타이드-CPP 융합 펩타이드를 포함하는 항바이러스 조성물로서,
    상기 AGM 펩타이드는 다음의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물:
    (a) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
    (b) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
    (i) N-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
    (ii) N-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
    (iii) C-말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (b)의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 15 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 AGM 펩타이드에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 쇄(chain)가 접합된 AGM 펩타이드-PEG 접합체(conjugate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 AGM 펩타이드-PEG 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체(multimer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 21 내지 서열번호 70의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 코로나바이러스(Coronavirus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus), 소 로타바이러스(Bovine rotavirus), 돼지 사포바이러스(Porcine sapovirus), 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 알푸이 바이러스(Alfuy virus), 반지 바이러스(Banzi virus), 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV), 인간 시토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 코코베라 바이러스(Kokobera virus), 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 키야사나 삼림병 바이러스(Kyasanur forest disease virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 홍역 바이러스(measles virus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 모자이크 바이러스(Mosaic Virus), 머레이 밸리 바이러스(Murray Valley virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 포와산 바이러스(Powassan virus), 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV), 로시오 바이러스(Rocio virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(Saint Louis encephalitis virus), 진드기-매개 뇌염 바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus) 및 황열 바이러스(Yellow fever virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항바이러스 조성물.
  16. 제1항 또는 제10항에 따른 항바이러스 조성물을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물.
  17. 제1항 또는 제10항에 따른 항바이러스 조성물을 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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