KR101930399B1 - 종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체 - Google Patents

종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 약물복합체는 종양조직에서 특이적으로 발현하는 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 독소루비신을 방출하는 프로드러그(prodrug)로, 자가조립형 나노입자 생성이 가능하며, 종양세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 예방 또는 치료과정에서 유도되는 심각한 세포 손상 및 사망 등의 부작용을 해결할 수 있다는 장점을 갖는다.

Description

종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체{Self-assembling drug nanocomplex of drug conjugated capthepsin B-cleavable peptide for specific tumor cell}
본 발명은 종양세포 특이적 감응형 약물복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종양세포에 존재하는 효소에 의해서만 분해되는 종양세포 효소특이성을 갖는, 새로운 나노구조의 약물복합체에 관한 것이다.
지난 십수년 동안, 사망원인 1위를 차지하는 질병인 암에 대한 다양한 항암치료제들이 개발되어 왔다. 개발된 세포독성 항암 치료제들은 암세포의 성장억제나 사멸에 우수한 효과를 나타내지만, 정상세포와 암세포 모두에게 성장억제와 사멸효과를 가지기 때문에, 심각한 부작용을 유발하는 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), MMAE(Monomethyl auristatin E) 등의 항암제를 특정 프로테아제와 특이적으로 반응하는 펩타이드나 링커와 결합시킴으로써, 정상세포에는 작용하지 않도록 종양세포의 세포 성장 신호전달, 수용체 및 유전적 변이를 타겟으로 하는 방법 및 치료제가 개발되어 왔다.
그럼에도 불구하고, 프로테아제(protease) 특이적 펩타이드와 약물을 결합시킨 항암치료제의 경우, 짧은 펩타이드 서열만으로 다양한 종양세포에서 발현되는 다양한 프로테아제를 광범위하게 특정하고, 이를 정확히 인식하도록 설계하는 것이 불가능하여 여전히 종양세포와 정상세포 모두에게 독성을 나타내는 문제가 발생했다.
또한, 특정 프로테아제를 타겟 대상으로 할 경우에는 종양세포 혹은 종양조직을 광범위하게 인식하기 어렵다는 한계가 있었고, 종양에 축적되지 못하고 특정 부위에 해당하는 종양조직으로 한정되어 상업화에 어려움이 있다.
따라서, 정상세포의 피해를 최소화하고 상술한 문제점을 극복하기 위해서 전이암을 포함하는 광범위한 종양세포와 종양조직을 특이적으로 인식할 수 있으며, 종양부위에 전달될 수 있으며, 약물의 예방 또는 치료효과가 우수한 새로운 항암치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 특2003-0096356호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 약물을 종양세포에 특이적으로 전달할 수 있는 약물복합체 및 자기조립 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 소수성 약물이 선택적으로 활성화되면서, 용매 중에서 자발적으로 구형의 나노입자를 형성하는 저분자 기반 약물복합체를 제공한다.
상기 약물복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 양친매성 펩타이드; 및 상기 양친매성 펩타이드의 일 말단에 결합되어 있는 소수성 약물;을 포함하며 자가조립 나노입자를 형성하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
[X0]n-X1-X2-X3-X4
상기 식에서,
X0, X1 및 X4는 각각 서로 독립적으로 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 이소루신(Isoleucine;I), 메티오닌(Methionine;M), 프롤린(Proline;P), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나이고,
X0, X2 및 X3은 각각 서로 독립적으로 아르기닌(Arginine;R), 세린(Serine;S), 트레오닌(Theronine;T), 티로신(Tyrosine;Y), 시스테인(Cysteine;C), 아스파라진(asparagine;N) 및 글루타민(Glutamine;Q) 중에서 선택되는 어느 하나이며,
n은 0 내지 5의 정수이다.
상기 화학식 1에서, 상기 X1이 페닐알라닌(Phenylalanine;F)이고, 상기 X2 및 X3은 서로 동일하며, 아르기닌(Arginine;R), 세린(Serine;S), 트레오닌(Theronine;T) 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 화학식 1에서, 상기 X1이 페닐알라닌(Phenylalanine;F)이고, 상기 X2 및 X3은 아르기닌(Arginine;R)이며, 상기 X0 및 X4는 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 양친매성 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 중에서 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다.
상기 소수성 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약물복합체의 분자량은 800 내지 3000 Da일 수 있다.
상기 약물복합체는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재하에서, 상기 양친매성 펩타이드가 분해되어 상기 소수성 약물이 방출되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 약물복합체가 용매 중에서 자발적으로 구형의 나노입자를 형성하고, 상기 나노입자는 상기 약물복합체의 소수성 부분이 코어를 형성하며, 친수성 부분이 상기 코어의 외부로 노출되어 있는 구조인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자를 제공한다.
상기 자기조립 나노입자는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재 하에서, 상기 약물복합체의 양친매성 펩타이드가 분해되어, 나노입자 코어 부분에 위치하던 상기 약물복합체의 소수성 약물이 방출되는 것일 수 있다.
상기 용매는 증류수, 인산염 완충액(PBS), 생리식염수, 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 증류수 및 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 자기조립 나노입자는 평균 직경이 50 내지 500 ㎚일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약물복합체는 종양조직에서 특이적으로 발현하는 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 독소루비신을 방출하는 프로드러그(prodrug)로, 종양세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 예방 또는 치료과정에서 유도되는 심각한 세포 손상 및 사망 등의 부작용을 해결할 수 있다.
본 발명은 카텝신 B 효소에 의해 절단되는 새로운 펩타이드(Arg-Arg, RR)와 소수성 펩티드(Phe, F), 글리신(Gly, G) 및 독소루비신의 결합으로 구성된 약물복합체로, 수성 상태에서 안정한 나노입자를 형성하므로, 정상세포에 독성을 나타내지 않는 안정하면서, 종양세포에 대해 특이적으로 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 약물복합체와 자기조립 나노입자는, 종래 항암치료제가 가지고 있던 독성 및 종양 특이적 활성을 비롯한 많은 문제를 해결했으며, 생체 내에서 별도의 담체, 전달체 및 나노 캐리어가 없어도 매우 우수한 종양세포로의 축적을 나타냄을 확인하였다.
도 1a는 FRRG-DOX의 합성과정을 도시한 도면이다. 독소루비신(Doxorubicin)은 고상 과정 후, 단일 과정에 의해 아실화펩타이드(acylated peptide)(FRRG)에 접합되어 약물복합체(FRRG-DOX)를 합성하였고, 이의 분자량은 1100 Da 정도로 작으며, 다른 합성 링커는 사용하지 않았다.
도 1b는 염분(saline;NaCl 0.9%)을 함유한 PBS용액에서, 약물복합체(FRRG-DOX)가 자기조립되어 형성된 나노입자를 촬영한 TEM 이미지이다.
도 1c는 염분(saline;NaCl 0.9%)을 함유한 PBS용액에서, 약물복합체(FRRG-DOX)가 자기조립되어 형성된 나노입자의 크기 분포를 동적 광산란(DLS)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1d는 다양한 비율로 혼합된 PBS와 DMSO의 공용매 하에서, 약물복합체(FRRG-DOX)를 첨가시 자기조립 나노입자의 형성 여부를 관찰하기 위하여, 용매 조건에 따른 실시예 3의 자기조립 나노입자의 형광을 측정하여 나타낸 사진(그래프 상단)과 그래프이다.
도 1e는 9 시간 동안 카텝신 B로 배양한 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)의 HPLC 그래프이다.
도 1f는 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 카텝신(Cathepsin) D, E, L 및 caspase-3를 포함한 다른 효소와 함께 배양한 후, 측정한 HPLC 그래프이다.
도 2a는 종양세포(HT29, 인간 결장암, MDA-MB231, 인간 유방암, MCF7, 인간 유방암, A549, 인간 폐암, U87, 뇌암) 및 정상 세포(H9C2; Rattus 심장, HDF, 인간 피부 섬유 아세포)에 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 각 경우에 대한 공초점 현미경 이미지이다.
도 2b는 종양세포(HT29) 및 정상세포(H9C2)에 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX), 독소루비신만 단독으로 처리한 경우(free DOX)에 대한, 시간에 따른 공초점 현미경 이미지이다.
도 2c, d는 도 2b에서의 결과를 정량적으로 도시한 그래프로, 도 2c는 종양세포(HT29)에서 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX)에 관한 것이고, 도 2d는 정상세포(H9C2)에서 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX)에 관한 것이다.
도 2e는 종양세포(HT29)(상단 그래프)와 정상세포(H92C)(하단 그래프)에서 다양한 농도(0.01~500 μM)로 독소루비신만 처리한 경우(free DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX), 세포 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2f는 다양한 암세포에서 카텝신 B 과발현을 확인하기 위한 웨스턴 블랏 분석 결과 그래프이다.
도 2g는 이미지 J 프로그램을 사용하여 도 2f의 웨스턴 블럿 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2h는 카텝신 B 억제효과를 갖는 Lipofectamine-siRNA 복합체로 처리한 HT29 세포에 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX+siRNA(Cat-B))에 대한 공초점 현미경 이미지이다. 이때 적색은 독소루비신이고, 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵이다. FRRG-DOX는 Lipofectamine-siRNA 복합체로 처리하지 않은 HT29 세포에 FRRG-DOX만 처리한 경우이다
도 2i는 도 2h로부터 측정된 형광 세기를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)가 생체 내에서 작용하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3b는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에서 세포 독성을 평가한 것으로, 종양을 종양동물모델의 오른쪽과 왼쪽 측면에 접종하고 카텝신 B siRNA 억제제를 왼쪽 종양에만 투여한 다음, 1 일 후와 15일 후의 증상 변화를 촬영한 사진이다.
도 3c는 도 3b의 동물종양모델로부터 시간에 따라 분리한 종양조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3d는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), 비교예 1의 RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각각의 종양동물모델에서 독소루비신을 표적화하는 근적외선 형광 영상이미지이다.
도 3e는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), 비교예 1의 RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각각의 종양동물모델에서 적출된 종양 조직의 독소루비신 발현 형광이미지이다.
도 3f는 상기 도 3e에서 발현하는 형광강도를 나타낸 그래프이다.
도 3g는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각 경우에 따른 종양동물모델로부터 얻은 종양조직을 DAPI로 염색한 사진과 독소루비신(DOX)의 형광을 측정한 사진이다.
도 4a는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에서, 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)(실시예 1)의 종양 성장 억제 효과를 분석한 것으로, 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 시간에 따른 종양의 부피(㎣)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4b는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 시간에 따라 종양동물모델로부터 분리한 종양 조직의 사진이다.
도 4c는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 종양동물모델의 생존율(survival rate(%))을 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 4d는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 종양동물모델로부터 적출된 다른 장기 조직들의 세포사멸 여부를, annexin V 염색을 통해 검출한 공초점 레이저 현미경 사진이다. 초록색은 anmexin V에 의해 염색된 세포사멸한 조직이고, 청색은 DAPI에 의해 염색된 세포의 핵이다.
도 4e는 렛트를 이용한 동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 각각의 경우에 대하여, 심장 독성을 확인하기 위한 것으로, 각각의 렛트를 이용한 동물모델로부터 혈액을 채취하여, 심장의 손상을 나타내는 대표적인 4개의 표지자(hs troponin-T, Troponin-I, CK-MM 및 CPK total)를 검출한 결과 그래프이다.
도 5a는 실시예 2, 3, 4로부터 제조된 약물복합체 각각에 대한 화학식을 나타낸 것이다.
도 5b는 실시예 2 내지 4로부터 제조된 약물복합체의 나노입자 형성 여부를 확인하고, 각각에 대한 입자 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 독소루비신(DOX), GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4)를 각각 세포에 처리한 후, 이를 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5d는 도 5c에서 각각의 세포에 대한 형광 강도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 Cytosol은 세포질에서 측정된 DOX의 형광강도이고, Nucleus는 세포 핵에서 측정된 DOX의 형광강도이다.
도 5e는 종양세포(HT29)에 독소루비신(DOX), GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4)를 처리한 후, 종양세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도5f는 도 5b 내지 도 5e의 실험결과를 통해 도출할 수 있는 GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4) 약물복합체의 세포 내 흡수경로를 도시한 도면이다.
도 6a는 FRRG-DOX(실시예 1)(0.2 μM)과 독소루비신(0.1 μM)로 처리한 hiPSC-CM에 대한 다중전극배열(multi-electrode array;MEA) 분석 측정결과이다.
도 6b는 FRRG-DOX(실시예 1)과 독소루비신로 처리한 ICR 마우스에서의 심전도 측정 결과이다.
도 7은 FRRG-DOX(실시예 1)의 proton-NMR 분석 결과이다.
도 8은 FRRG-DOX(실시예 1)의 MALDI-TOF 분석 결과이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.
본 발명에 따른 약물복합체를 발명함에 있어서, 가장 고려했던 부분은 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드와 소수성 약물 사이의 상호작용 혹은 상호관계였다. 즉, 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드라고 할지라도, 이들 모두가 소수성 약물과 효율적으로 결합하거나, 카텝신 B 효소에 특이적으로 분해되거나, 분해된 소수성 약물 부분이 종양세포에 대해 우수한 약물 효과를 나타내거나, 약물복합체 상태에서 높은 생체안정성을 가지는 등의 효과를 얻을 수는 없었다.
따라서 본 발명은 상술한 양친매성 펩타이드와 소수성 약물 사이의 상호작용을 고려하여, 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드를 아래와 같이 설계하고, 상기 양친매성 펩타이드에서 소수성 약물과 효과적인 결합을 형성할 수 있는 링커([X4]) 부분을 조율하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 측면은 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 양친매성 펩타이드; 및 상기 양친매성 펩타이드의 일 말단에 결합되어 있는 소수성 약물;을 포함하는 약물복합체를 제공한다.
[화학식 1]
[X0]n-X1-X2-X3-X4
상기 식에서,
X0, X1 및 X4는 각각 서로 독립적으로 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 이소루신(Isoleucine;I), 메티오닌(Methionine;M), 프롤린(Proline;P), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나이고,
X0, X2 및 X3은 각각 서로 독립적으로 아르기닌(Arginine;R), 세린(Serine;S), 트레오닌(Theronine;T), 티로신(Tyrosine;Y), 시스테인(Cysteine;C), 아스파라진(asparagine;N) 및 글루타민(Glutamine;Q) 중에서 선택되는 어느 하나이며,
n은 0 내지 5의 정수이다.
다만, 상기 화학식 1에서 X4는 단일 아미노산 혹은 단일 아미노산이 적어도 1 이상으로 반복되는 복수개의 아미노산일 수 있다. 예를들어 G, GG, GGG, GGGG, GGGGG, A, AA, AAA, AAAA, AAAAA 등 일 수 있다.
이에 상기 화학식 1은 다음 화학식 2와 같이 표기가 가능하다.
[X0]n-X1-X2-X3-[X4]m
이때, n은 0 내지 5의 정수이고, m은 1 내지 5의 정수이다.
본 발명에 따른 약물복합체에서 상기 양친매성 펩타이드는 친수성 펩타이드(X2 및 X3)와 소수성 펩타이드(X0, X1 및 X4)의 펩티드 결합을 통해 형성되고, 상기 약물복합체는 상기 양친매성 펩타이드의 소수성 펩타이드(X0, X1 및 X4)과 소수성 약물이 결합되어 형성되는 것으로, 가수분해에 대해 안정하므로 수상 및 분말상태에서 비효소적 가수분해가 일어나지 않으며, 구조적 안정성이 높다.
상기 양친매성 펩타이드는 도 1a에 나타난 일련의 합성과정을 통해 제조되며, 상기 양친매성 펩타이드의 경우 당업계에 공지된 화학적 합성 방법 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)). 구체적으로 상기 양친매성 펩타이드는 아미드가 C-말단에 고정되어 있는 형태인 링크 아미드 레진에 Fmoc으로 보호된 아미노산 단량체를 차례로 붙여나가는 SSPS(solid-phase peptide synthesis) 방법을 사용하여 합성하는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 양친매성 펩타이드의 화학적 안전성을 높이기 위하여, N-말단의 아미노기는 아세틸화하고, C-말단은 아미드 결합으로 하는 것이 바람직하다.
또한 상기 양친매성 펩타이드의 제조과정에서는 상기 양친매성 펩타이드의 아민의 질소 원자를 보호하기 위한 아민 보호기를 사용할 수 있다. 상기 아민 보호기는 당업계에 공지된 것을 제한없이 사용할 수 있고, 예를 들어 메틸옥시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, p-메톡시벤질옥시 카르보닐기, t-부틸옥시카르보닐기(Boc), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(FMOC), 알릴옥시카보닐(Alloc), 벤조일기(Bz), 벤질(Bn)기, p-메톡시벤질기(PMB), 3,4-디메톡시벤질기(DMPM), p-메톡시페닐기(PMP), 토실기(Ts), 트리메틸실릴에틸옥시 카르보닐기(Teoc), 벤즈하이드릴, 트리페닐메틸(Trityl), (4-메톡시페닐)디페닐메틸(Mmt), 디메톡시트리틸(DMT), 디페닐포스피노기 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약물복합체는 양친매성 펩타이드에 소수성 약물이 결합된 형태로, 양친매성 펩타이드와 소수성 약물의 상호작용에 의해, 정상세포에 대해 약물의 독성을 나타내지 않도록 안정화되었으므로, 종래 항암치료제가 가지고 있던 부작용 문제를 극복 및 해결함과 동시에 생체 내 구조적 안정성 및 용해성은 현저히 개선되었다.
즉, 본 발명의 약물복합체는 정상세포에 대해서도 독성을 나타내는 기존의 항암치료제의 부작용 문제를 개선하면서, 치료효과는 증대시킨 것으로, 본 발명의 소수성 약물인 독소루비신을 단독으로 사용할 경우, 심장 뿐만 아니라 다른 장기 조직까지 손상되거나 사멸하는 문제가 발생하는데, 본 발명의 약물복합체 구조를 가질 경우에는 정상세포에 대한 독성을 현저히 감소시키고, 종양조직에 대해서만 예방 또는 치료효과를 갖고 있음을 후술하는 다양한 실험예를 통해 입증되었다.
또한, 상기 약물복합체는 생리학적 용액에 쉽게 용해되므로, 흡수가 용이하여 생체 이용률이 뛰어나고, 안정성 및 종양세포 특이성이 개선되었으므로 예방 또는 치료 효과 또한 우수하다.
상기 약물복합체는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재하에서, 상기 양친매성 펩타이드가 분해되어 상기 소수성 약물이 방출되고, 상기 분해된 소수성 약물(G-DOX)은 종양세포 내에 흡수 및 전달되어 종양조직의 생장과 전이를 억제하며, 다른 작은 펩타이드 분자들은 독성이 없는 작은 분자로 분해되어 체내의 대사 과정에 참여하거나, 신장을 통해 체외로 배출되기 때문에 생체 적합성 역시 매우 우수하다.
본 발명에 대해 서술하면 상기 화학식 1로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나의 양친매성 펩타이드와 소수성 약물이 결합되어 형성된 약물복합체는, 수용액 및 생체의 생리학적 용액 내에서 더욱 안정화된 자기조립 나노입자로 형성하게 되며, 종양세포에 특이적으로 약물이 활성화되기 때문에 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
상기 카텝신 B 효소는 정상세포에서는 발현이 제한되면서 종양세포에서는 특이적으로 발현되는 것으로써, 특히 전이암에서 특이적으로 발현된다. 따라서 이를 표적으로 하고 있는 본 발명의 약물복합체는 암의 예방 또는 치료에 대해서 효과를 나타내나, 가장 바람직하게는 전이암의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다 할 수 있다.
또한 상기 카텝신 B 효소는 세포 외로 거의 분비되지 않으므로 종양세포 이외의 정상세포나 종양조직 이외의 다른 정상조직에서 위양성(false positive)를 나타낼 가능성이 매우 낮다. 이에 반해 카텝신 B 효소외에 다른 프로테이즈(protease)를 표적 대상으로 하는 경우, 해당 프로테이즈를 검출하기 위한 펩타이드의 설계도 어려울 뿐만 아니라, 어느 한 부위에 특징지어지기 때문에, 특정된 전립선암 등과 같이 특정 암에 대해서만 치료효과를 가지며, 전이암의 경우에는 해당하지 않으며, 세포외 분비 효소로서 위양성을 나타낼 수 있다는 문제점이 있다.
상기 양친매성 펩타이드는 바람직하게 상기 화학식 1에서, 상기 X1이 페닐알라닌(Phenylalanine;F)이고, 상기 X2 및 X3은 서로 동일하며, 아르기닌(Arginine;R), 세린(Serine;S), 트레오닌(Theronine;T) 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
그러나 보다 바람직하게 상기 양친매성 펩타이드는 상기 화학식 1에서, 상기 X1이 페닐알라닌(Phenylalanine;F)이고, 상기 X2 및 X3은 아르기닌(Arginine;R)이며, 상기 X0 및 X4는 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있는데, 이와 같이 [X0]n-F-R-R-[X4]m(n=0~5, m=1~5)일 때 종양세포에 대한 특이성이 가장 우수할 뿐만 아니라, 정상세포에 전혀 영향을 가하지 않음을 확인하였다. 즉, 가장 바람직하게 본 발명에 따른 양친매성 펩타이드는 F-R-R가 고정되어 있다면, 이를 기준으로 양 말단 혹은 어느 하나의 말단(우측)에 결합되는 아미노산 잔기에 따라 다른 크기의 나노입자를 형성하며, 효능에도 영향을 줄수 있음을 실험예를 통해 확인할 수 있다
구체적으로 X1이 삭제변경된 양친매성 펩타이드를 사용한 약물복합체와 비교하였을 때 종양세포에 대한 특이성을 비롯하여, 활성화된 종양세포 내에서 약물의 예방 또는 치료효과가 해당분야에서 유의미한 정도 이상의 효과적 상승을 나타내는 것으로 확인되었기 때문이다.
상기 X0의 경우, 상기 양친매성 펩타이드와 소수성 약물을 결합하여 형성딘 약물복합체의 유연성을 향상시키는 역할을 수행하는 것으로, 상기 X0은 소수성 약물이 종양세포 내에서 약물 활성을 나타냄에 있어서 영향을 주지 않는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나인 것이며, 가장 바람직하게는 글리신(G)일 수 있다. 상기 X0은 양친매성 펩타이드에 없어도 무방하나, 존재할 경우에도 약물복합체로써의 역할을 충분히 수행하고 있음을 확인하였고(n은 0 내지 5), 생체 내 생리환경에서 안정적으로 유동하여, 종양세포에 대한 특이성을 가지고 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인하였다.
상기 X4의 경우, 상기 양친매성 펩타이드와 소수성 약물을 결합하는 링커역할을 수행하는 것으로, 이는 약물복합체를 생체 내 생리환경에서 안정적인 결합상태를 유지하도록 하고, 카텝신 B 효소에 의해 분해될 때 소수성 약물과 분리되어 온전하게 소수성 약물을 방출하게 된다. 따라서 상기 X4는 링커로, 소수성 약물이 종양세포 내에서 약물 활성을 나타냄에 있어서 영향을 주지 않는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글리신(Glycine;G), 알라닌(Alanine;A), 발린(Valine;V), 루신(Leucine;L), 페닐알라닌(Phenylalanine;F) 및 트립토판(Tryptopham;W) 중에서 선택되는 어느 하나인 것이며, 가장 바람직하게는 글리신(G)일 수 있다. 또한 X4의 경우, 결합된 수(m)가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 1일 수 있는데, X4가 하나 이상으로 결합되어 있을 경우 카텝신 B 효소에 의해 분해된 소수성 약물에 둘 이상의 글리신(G)이 결합되어, 세포 내에서 약리효과가 약해지는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 본 발명의 약물복합체는 상기 양친매성 펩타이드가 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것일 때, 안정성, 생체적합성, 종양세포에 대한 특이적 활성, 정상세포에 대한 생체 적합성, 부작용 문제 억제 효과 및 약물의 예방 또는 치료효과를 총괄하여 가장 우수한 효과를 달성하고 있음을 확인하였다.
[서열번호 1]
FRRG
[서열번호 2]
GGGGFRRG
[서열번호 3]
GGFRRGGG
[서열번호 4]
FRRGGGGG
상기 소수성 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약물복합체의 분자량은 800 내지 3000 Da인 것이 바람직한데, 만약 분자량이 상기 범위보다 크거나 작을 경우, 수성 상태에서 자기조립 나노입자를 형성하는데 있어 제한적이거나, 형성된 나노입자의 크기가 과도하게 커져 세포내 진입이 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 약물복합체는, 작은 분자량의 양친매성 펩타이드에 소수성 약물을 결합하여 간단한 단일 과정을 통해 제조가 가능하나, 종래 거대분자 또는 고분자와 같이 분자량이 커질 경우, 합성과정이 복잡해지고 합성조건을 제어하기가 어려울뿐만 아니라, 단가가 급증하는 문제가 있다. 게다가 봉입되거나 결합하는 약물의 비율이 낮아(5% 미만) 임상 결과가 좋지 않으며, 원하는 임상 결과를 위해 과량의 약물이 투여되어야 하는 문제점이 존재했다(결국 과량의 약물이 투여되면 정상세포에서의 독성 부작용도 증가되는 문제점도 발생하였다).
이에 본 발명은, 간단한 합성법을 통하여 어떠한 추가적인 과정의 도입 없이 매우 높은 수율로 약물복합체를 제조할 수 있고, 종양세포에 존재하는 효소에 반응하여 약물을 방출하는 저분자의 약물복합체라는 점에서 종래 항암치료제보다 우수한 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 약물복합체는 앞서 설명한 바와 같이, 생체 내에 투여되면, 정상세포나 정상 조직에서는 상기 양친매성 펩타이드가 절단되지 않아 약물이 활성화되지 않고, 정상 세포 표면으로 소수성 약물이 발현되지 않지만, 종양세포나 종양조직에서는 세포 내에 발현되는 카뎁신 B 효소에 의해 양친매성 펩타이드가 소수성 약물과 절단되거나, 또는 양친매성 펩타이드의 일부 아미노산, 일부 아미노산과 소수성 약물이 절단되어, 세포 내 소수성 약물이 종양세포 내로 축적되고, 활성화됨으로써, 종양세포에 대해 특이적인 예방 혹은 치료효과를 나타내게 된다(도 1a 참조).
본 발명의 다른 측면은 상기 약물복합체가 용매 중에서 자발적으로 구형의 나노입자를 형성하고, 상기 나노입자는 상기 약물복합체의 소수성 부분이 코어를 형성하며, 친수성 부분이 상기 코어의 외부로 노출되어 있는 구조인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자를 제공한다.
본 발명의 자기조립 나노입자는 상기 약물복합체 간의 결합으로 인해, 더 안정한 구형의 나노입자를 형성한 것으로써, 약물의 안정성을 효과적으로 증대시키고, 종양세포에 대해 특이적 반응성을 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 경구 또는 비경구적으로 적용가능하다는 장점을 갖는다.
상기 자기조립 나노입자는 도 1a에 나타난 바와 같이, 양친매성의 약물복합체가 수중에 용해될 경우, 약물복합체의 응축 및 자기조립을 통해 형성된다.
구체적으로 도 1a에 도시한 바와 같이 상기 나노입자는 상기 약물복합체가 연결되어 형성된 내막과 외막으로 이루어진 구형의 입자이다. 상기 나노입자의 외막(쉘 영역)은 상기 약물복합체 중에서 친수성 펩타이드인 RRG 부위가 서로 연결되어 배열된 것이고, 상기 나노입자의 내막(코어 영역)에는 상기 약물복합체 중에서 소수성 펩타이드(F)와 소수성 약물이 서로 연결되어 배열되어 있다.
상기 자기조립 나노입자는 종양 조직 또는 종양세포를 특이적으로 인식함에 있어서 중요한 역할을 수행하는, 양친매성 펩타이드와 항암 효과를 갖는 소수성 약물로 이루어진 약물복합체로 구성된다. 상기 약물복합체에 대해서는 앞서 구체적으로 설명하였으므로, 본 단락에서 중복 기재되는 내용은 생략하기로 한다.
상기 자기조립 나노입자는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재 하에서, 상기 약물복합체의 양친매성 펩타이드가 분해되어, 상기 나노입자 코어 부분에 위치하던 상기 약물복합체의 소수성 약물이 방출되는 것일 수 있다.
상기 용매는 증류수, 인산염 완충액(PBS), 생리식염수, 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 증류수 및 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 자기조립 나노입자는 평균 직경이 50 내지 500 ㎚인 것이 바람직한데, 상기 평균 직경보다 작거나 클 경우에는 세포 내 진입이 어려워 예방 또는 치료효과를 발휘하는데 어려움이 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물 내 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자의 함량은 질환의 증상, 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 30 내지 80 중량%, 바람직하게는 50 내지 70 중량% 이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물 내 유효성분으로 함유되는 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자는 약제학으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등과 함께 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용 액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
여기에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 물, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제로 제제화되는 경우, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 가능하며, 이러한 고형제제는 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자 이외에 적어도 한 가지 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴, 칼슘카보네이트 등을 혼합하여 제조될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제로 제제화되는 경우, 현탁제, 내용액제, 시럽제, 유제 등이 가능하며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로 제제화되는 경우, 멸균된 수용액, 비수성 용제, 유제, 현탁제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리톨, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 좌제의 기제로는 위탭솔, 트윈 61, 라이린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자 함량을 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 환자의 나이, 성별, 체중, 식이, 배설율, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학조성물은 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환을 말하며, 바람직하게는 유방암, 난소암, 태반암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명은 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물의 용도, 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자의 용도, 인간을 포함한 포유류에 약제학적으로 허용가능한 양의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 투여하는 것을 포함하는 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학조성물은 그 자체로 이미 종양세포에 대해 우수한 특이성을 갖고 있기 때문에, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다.
암 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 본 발명의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 식품 또는 음료에 첨가할 수 있다.
본 발명의 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
건강 기능성 음료 조성물은 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
통계
실험군과 대조군의 차이는 one-way ANOVA을 사용하여 분석하였고, 통계적으로 유의하다고 간주되었다(도면에서 별표(*)로 표시함).
실시예 1 내지 실시예 4. 약물복합체(FRRG-DOX, GGGGFRRG-DOX, GGFRRGGG-DOX, FRRGGGGG-DOX) 합성.
Trt-Cl 수지와 모든 Fmoc 아미노산은 GL Biochem(Shanghai, China)로부터 구입하였다. 커플링 시약(coupling reagent)과 cleavage cocktail 시약은 Sigma Aldrich에서 구입하였으며, 이외 다른 용매들은 대정 화학(Daejung Chemical, Korea)에서 구입하였다.
펩타이드는 Fmoc SPPS(고상 펩타이드 합성; Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였고, 이때 장비는 ASP48S(Peptron, Inc., Korea)를 사용하였다. 이를 통해 FRRG(서열번호 1), GGGGFRRG(서열번호 2), GGFRRGGG(서열번호 3), FRRGGGGG(서열번호 4), RRG(서열번호 5)의 펩타이드를 각각 합성하였다.
상기 합성된 펩타이드는 Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜ㅧ22 ㎜, 10 ㎛, USA)를 사용한 역상 HPLC(Shimadzu prominence HPLC, Japan)으로 정제하였다. 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(10~75%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 펩타이드의 분자량(molercular weights)은 LC/MS(Shimadzu LC/MS-2020 series, Japan)을 사용하여 확인하였고, FDT12012(Operon, Korea)을 사용하여 동결건조하였다.
1) 양친매성 펩타이드(FRRG, GGGGFRRG, GGFRRGGG, FRRGGGGG) 합성
각 펩타이드는 일방적인 고상 펩타이드 합성 프로토콜에 따라 합성하였고, 이때 ASP48S(Peptron, Inc., Korea)의 펩티드 합성기를 이용하여 합성하고자 하는 아미노산 서열(FRRG(서열번호 1), GGGGFRRG(서열번호 2), GGFRRGGG(서열번호 3), FRRGGGGG(서열번호 4))을 합성하였다. 합성과정에서 표준 아미노산 보호기(fmoc)를 사용하였다.
구체적으로 상기 Fmoc 보호기를 제거하기 위하여, 10 분동안 2차례에 걸쳐 20% piperidine를 포함하는 DMF로 rocking하였고, DMF 용매 하에서, Fmoc 아미노산(8 eq), HOBT(8 eq), HBTU(8 eq), DIPEA(16 eq)를 사용하여 2 시간 동안 커플링(coupling)을 수행하였다. 각 단계에서 레진을 DMF와 메탄올로 2 차례에 걸쳐 세척한다.
설계된 시퀀스의 펩타이드가 완성된 후, crude 펩타이드를 레진으로부터 분리하기 위하여, TFA/EDT/Thioanisole/TIS/DW 용액(90/2.5/2.5/2.5/2.5 Volume)으로 2 시간동안 반응시켰다. 상기 용액을 차가운 에테르(Ether)로 침전시키고, 원심분리하여 펠렛(pellet)을 분리하였다. 이를 증발 과정을 통해 분말형태로 수득하였다.
상기 수득한 crude 펩타이드를 증류수에 용해하고, C18 컬럼을 통한 역상 HPLC로 정제하였다. 이때 용리과정(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(10~75%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 펩타이드는 동결 건조하여 보관하였다.
2) 약물복합체 합성
1) 단계를 통해 제조된 FRRG, GGGGFRRG, GGFRRGGG, FRRGGGGG 등의 양친매성 펩타이드를 각각 물에 녹이고, 독소루비신(doxorubicin)을 첨가한 후, 상온에서 24 시간동안 교반하였다. 얻어진 펩타이드를 역상 HPLC(물-아세토나이트릴, 0.1% TFA)로 정제하였다.
독소루비신(doxorubicin), FRRG 펩타이드 및 이들이 결합하여 형성된 약물복합체(FRRG-DOX)의 화학적 구조를 분석하기 위하여, DMSO-d6에 용해하고 600 MHz 1H-NMR(DD 2600 MHz FT NMR, Agilent Technologies, USA)로 특징 피크를 확인하였다. FRRG-DX와 G-DOX(FRRG-DOX로부터 절단된 펩타이드 단편)의 분자량은 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)(AB Sciex TOF/TOF 5800 System, USA)(with cyano-4-hydroycinnamic acid matrix)로 분석하였다.
3) 특성분석
생성된 약물복합체 혹은 양친매성 펩타이드의 특성을 분석한 결과, NMR에서 독소루비신 및 양친 매성 펩타이드 피크가 1.1-1.8ppm과 6.8-8.4ppm 사이에서 함께 관찰되었다(도 7). FRRG-DOX의 MALDI-TOF 결과는 [m/z 계산치:1101.5, 관측치:1102.4[M+H+] 및 1124.4[M+Na+]이였다. 카텝신 B에 의해 FRRG-DOX가 절단되어 형성된 G-DOX의 MALDI-TOF 결과는, [m/z 계산치:600.6, 관측치:602.3[M+2H+] 및 642.2[M+2H++K+]였다(도 8).
실시예 5. 약물복합체의 자기조립 나노입자
실시예 1 내지 4로부터 합성된 약물복합체(FRRG-DOX, GGGGFRRG-DOX, GGFRRGGG-DOX, FRRGGGGG-DOX)는 소수성 펩타이드와 친수성 펩타이드로 이루어진, 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드와 소수성 약물이 접합되어 있는 접합체이다. 상기 약물복합체는 용매 중에서 자발적으로 구형의 나노입자로 제조되며, 구체적으로 상기 나노입자는 상기 약물복합체가 연결되어 형성된 구형의 나노입자로, 상기 약물복합체의 소수성 부분이 코어를 형성하며, 친수성 부분이 상기 코어의 외부로 노출되어 있는 구조를 갖는다.
실시예 1 내지 4의 약물복합체 중에서 가장 효과가 우수한 실시예 1의 약물복합체를 다양한 조건의 용매에 용해한 다음, 형성된 자기조립 나노입자의 특성을 분석하였다.
도 1b는 염분(saline;NaCl 0.9%)을 함유한 PBS용액에서, 약물복합체(FRRG-DOX)가 자기조립되어 형성된 나노입자를 촬영한 TEM 이미지이다. 이때 상기 TEM 이미지는 CM-200(Philips, CA, USA)을 사용하여 측정하였다.
도 1b에 나타난 바와 같이, 양친매성 펩타이드와 소수성 약물(본 실험에서는 독소루비신)이 결합된 약물복합체(실시예 1의 FRRG-DOX)가 생리식염수에 용해될 경우, 자기조립 나노입자가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
도 1c는 염분(saline;NaCl 0.9%)을 함유한 PBS용액에서, 약물복합체(FRRG-DOX)가 자기조립되어 형성된 나노입자의 크기 분포를 동적 광산란(DLS)로 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Worcestershire, U.K)로 측정하였다.
도 1c에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 자기조립 나노입자의 평균 직경은 100 내지 1000 ㎚이고, 바람직하게는 50 내지 500 ㎚인 것을 확인할 수 있다.
도 1d는 다양한 비율로 혼합된 PBS와 DMSO의 공용매 하에서, 약물복합체(FRRG-DOX)를 첨가시 자기조립 나노입자의 형성 여부를 관찰하기 위하여, 용매 조건에 따른 실시예 3의 자기조립 나노입자의 형광을 측정하여 나타낸 사진(그래프 상단)과 그래프이다.
도 1d에 나타난 바와 같이 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)는 약물 전달체없이 완충액에서 자기조립 나노입자를 생성할 수 있음을 확인하였으며, 과량의 DMSO가 주입될 경우 구조가 붕괴될 수 있음을 확인하였다.
비교예 1. 약물복합체(RRG-DOX)의 합성
고상 펩타이드 합성 프로토콜에 따라 펩타이드를 합성할 때, 서열번호 1의 FRRG 대신에 서열번호 5의 RRG으로 이루어진 친수성 펩타이드를 합성한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 모두 동일하게 수행하였고, 그 결과 약물복합체(RRG-DOX)를 제조하였다.
실험예 1. 생체 외에서, 실시예 1로부터 제조된 FRRG-DOX의 카텝신 B와의 특이성 분석
실시예 1로부터 제조된 FRRG-DOX의 카텝신 B(cathepsin B) 절단 특이성을 확인하기 위하여, 우선 25 mM MES 완충액(2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid)에 용해한 카텝신 B(10 ㎍/㎖) 용액을 준비하고, 상기 카텝신 B 용액에 실시예 1 또는 실시예 3의 약물복합체(FRRG-DOX)(100 μM)를 첨가하여 37℃에서 0, 1, 3, 6, 9 시간 동안 배양한다. 카텝신 B와 반응한 실시예 1, 2의 약물복합체는 C18 분석용 컬럼(10 : 90 H2O : Acetonitrile to 60 : 40 H2O : Acetonitrile for 20 min at 210 nm)를 사용한 역상 HPLC(Agilent Technologies 1200 series, Agilent Technologies, USA)로 분석한다.
또한, 상기 실시예 1 또는 실시예 3의 약물복합체를 카텝신 B 외에 다양한 효소(10 ㎍/㎖ 카텝신 D,E,L) 혹은 PBS 완충액으로만 반응(비 효소적 가수분해 결과를 얻기 위함)시키고, 이를 HPLC로 37℃에서 9 시간동안 분석하였다.
도 1e는 9 시간 동안 카텝신 B로 배양한 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)의 HPLC 그래프이다.
도 1e에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 카텝신 B와 반응시켰을 때, 성공적으로 카텝신 B에 의해 절단되었음을 확인하였고, 절단된 펩타이드가 FRRG-DOX로부터 유리된 G-DOX임을 MADLI-TOF MS로 확인하였다.
도 1f는 약물복합체(FRRG-DOX)를 카텝신(Cathepsin) D, E, L 및 caspase-3를 포함한 다른 효소와 함께 배양한 후, 측정한 HPLC 그래프이다.
도 1f에 나타난 바와 같이 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)는 카텝신 B를 제외한 다른 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 L, 카스파제-3 등의 다른 효소로는 분해되지 않는 것을 확인하였다. 즉 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)는 카텝신 B에 의해서만 특이적으로 절단되는 것을 알 수 있다. 또한 인산완충액(PBS)에서 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)가 비 효소적 가수 분해가 발생하는지를 확인하였으나, 인산완충액에서 매우 안정함을 확인하였다.
실험예 2. 약물복합체의 생체 외에서(In vitro) 세포 내 전달 확인
독소루비신(Free DOX), 실시예 1의 FRRG-DOX의 세포 내 섭취를 관찰하기 위해, 인간유래 대장암 세포인 HT-29 세포를 35 ㎜ 커버글라스 바텀디쉬에 1 x 105 개씩 분주하고, 각각 독소루비신(Free DOX)(10 μM), 실시예 1의 FRRG-DOX(10 μM) 로 처리한 배양액에 48 시간까지 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 배양하였다.
또한, 상기 HT29 세포외에 다른 세포주(HT-29, U87, A549, MCF7, MDA-MB231, H9C2, HDF, Hela)를 이용해서, 상기와 동일한 과정을 수행하였다. 그리고 세포 고정액을 처리한 뒤 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액을 10분간 처리하여 핵 염색을 실시한 뒤, 공초점 현미경으로 흡수된 독소루비신과 4,6-디아미디노-2-페닐인돌을 관찰하였다.
HT29 세포에서 독소루비신의 발현을 확인하기 위하여 DBCO-Cy5를 5 μM씩 배양액과 혼합하여 처리한 뒤 다양한 시간으로 37℃ 배양기에서 배양한 뒤, Dulbecco's phosphate buffered Saline(DPBS)로 미반응 DBCO-Cy5를 세척하였다, 그리고 세포 고정액을 15 분간 처리한 뒤 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액을 10분간 처리하여 핵 염색을 실시한 뒤, 공초점 현미경으로 발현된 독소루비신과 결합된 DBCO-Cy5의 형광을 관찰하였다.
도 2a는 종양세포(HT29, 인간 결장암, MDA-MB231, 인간 유방암, MCF7, 인간 유방암, A549, 인간 폐암, U87, 뇌암) 및 정상 세포(H9C2; Rattus 심장, HDF, 인간 피부 섬유 아세포)에 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 각 경우에 대한 공초점 현미경 이미지이다(bar=50 ㎛).
도 2b는 종양세포(HT29) 및 정상세포(H9C2)에 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX), 독소루비신만 단독으로 처리한 경우(free DOX)에 대한, 시간에 따른 공초점 현미경 이미지이다(bar=50 ㎛). 이때 적색은 독소루비신이고, 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵이다.
도 2c, d는 도 2b에서의 결과를 정량적으로 도시한 그래프로, 도 2c는 종양세포(HT29)에서 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX)에 관한 것이고, 도 2d는 정상세포(H9C2)에서 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우(FRRG-DOX)에 관한 것이다.
도 2a에 나타난 바와 같이 실시예 1의 FRRG-DOX가 카텝신 B에 의해 특이적으로 분해되어 약물 독성을 나타냄을 확인하기 위하여, 우선 종양세포와 정상 세포에서 실시예 1로부터 제조된 FRRG-DOX의 기능적인 차이를 확인하기로 하였다.
도 2b, c, d에 나타난 바와 같이 시간에 따라, 세포 및 핵에서의 흡수를 관찰한 결과 HT29 종양세포와 H9C2 정상 세포에서 실시예 1로부터 제조된 FRRG-DOX는 흡수율이 두드러진 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
생체외에서 세포 생존율의 분석은 다음과 같은 과정을 통해 수행되었다. 독소루비신(Free DOX), 실시예 1의 FRRG-DOX의 세포 독성을 확인하기 위해, 우선 1 x 104 cell/웰로 HT-29를 96-웰 플레이트에 분주하였다. 안정화 후, HT-29 세포 각각에 독소루비신(Free DOX), 실시예 1의 FRRG-DOX를 각각을 다양한 농도(0.01, 0.1, 1, 10, 100 및 200 μM)로 처리하여 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각 웰에 10 ㎍의 CCK 용액을 첨가하고, 세포를 30 분 추가 배양하고, 각각의 96-웰 플레이트의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기(VERSAmaxTM, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 분석하였다. 대조실험으로, 종양세포 대신 H9C2 세포(정상세포)를 사용하여 상기 과정과 동일하게 진행하여, 이에 대한 세포생존율(%)을 측정하였다.
도 2e는 종양세포(HT29)(상단 그래프)와 정상세포(H92C)(하단 그래프)에서 다양한 농도(0.01~500 μM)로 독소루비신만 처리한 경우(free DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 경우, 세포 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2e에 나타난 바와 같이, 정상적인 심장근육(cardiomyocyte) 세포와 비교하여 종양세포에서 FRRG의 치료효과를 확인하였는 바, 구체적으로 본 발명의 실시예 1로 제조된 FRRG-DOX는 정상세포에 대해서는 독성을 나타내지 않으며, 종양세포의 성장만을 억제하고 있음을 알 수 있다.
종양세포에서는 실시예 1의 FRRG-DOX와 독소루비신만을 처리한 그룹(free DOX)의 차이가 거의 없는 것을 확인되었으나, .정상세포에서는 실시예 1의 FRRG-DOX와 독소루비신만을 처리한 그룹(free DOX)이 현저한 차이를 나타냄을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 FRRG-DOX는 성공적으로 종양세포의 카텝신 B에 의해서만 절단되었기 때문에, 활성화된 약물이 정상세포 핵에는 존재하지 않고, 종양세포의 핵에서 주로 발견되고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 FRRG-DOX는 정상세포의 핵 내에는 독소루비신을 축적시키 않았으나, 종양세포의 핵 내부로만 독소루비신을 축적하는 것을 확인할 수 있고, 핵 내부에 축적된 독소루비신은 복제 과정을 중지시켜, 종양세포의 생장을 억제하거나 사멸시키는 역할을 수행함을 확인하였다.
상술한 결과를 통해 생체 외에서(in vitro) 본 발명에 따른 FRRG-DOX는 효과적으로 종양세포에 대해 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.
카텝신 B 효소의 농도를 확인하기 위하여 HT-29, A549, MCF7, MDA-MB231, H9C2 및 HDF의 1 x 106 세포를 100 ㎜ 세포 배양 접시에 분주 및 배양하였다. 안정화 후에, 세포를 DPBS로 3 회 세척하고 lysis buffer(1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP-40, 25 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl 및 1% 프로테아제 억제제)에 분산시켰다. 회수한 용해물(lysate)로부터 세포 파편을 제거하기 위해 4℃에서 12,000 rpm으로 10 분 동안 스핀 다운시킨 후, BCA 분석 키트를 사용하여 용해물의 단백질을 정량 하였다. 각 시료의 정량된 단백질을 1xsodium dodecyl sulfate(SDS) 로딩 완충액(loading buffer)과 혼합한 다음 5 분간 가열한 뒤, 10 μg의 단백질을 12% SDS-polyacrylamide gel로 분리하였다. 다음 NC 멤브레인으로 이동시키고, 블로킹 용액(blocking solution)(5% 소혈청 알부민을 포함하는 TBST 완충액(buffer)(10 mol/L Tris, pH 7.4, 100 mol/L NaCl 및 0.1% Tween 20))에서 25℃, 1 시간 동안 처리하였다. 다음으로 상기 막을 4℃에서 밤새 마우스 항-인간 카텝신 B 항체를 포함하는 블로킹 용액(blocking solution)으로 배양하고, TBST 완충액으로 5 번 세척한 후, 토끼 항-염소 IgG-HRP 항체 0.2 μg/ml를 포함하는 블로킹 용액(blocking solution)으로 처리하였다. 이를 5 차례 더 세척한 후, ECL 시스템을 사용하여 pro-카텝신 B(37 KDa) 및 카텝신 B(25 KDa) 밴드를 검출하였다. 각각의 세포에서 카텝신 B의 HRP 신호 강도를 측정하고, 이를 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 2f는 다양한 암세포에서 카텝신 B 과발현을 확인하기 위한 웨스턴 블랏 분석 결과 그래프이고, 도 2g는 이미지 J 프로그램을 사용하여 도 2f의 웨스턴 블럿 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 2f, g에 나타난 바와 같이 종양 및 정상 세포에서 카텝신 B의 발현을 측정한 바, HT29(human colon adenocarcinoma), MDA-MB231 (human breast adenocarcinoma), MDA-MB231 (human breast adenocarcinoma) 등의 종양세포에서는 카텝신 B가 과발현되고 있음을 확인하였다.
다만, A549(인간 폐암)에서는 카텝신 B의 발현이 낮았으나, 효소 발현 수준을 상대적으로 비교한 결과에서는 유의한 증가를 확인할 수 있었다(미도시). 이에 반해 정상세포에서는 카텝신 B 발현이 거의 관찰되지 않았다.
상술한 결과들을 종합하면 본 발명에 따른 실시예 1의 FRRG-DOX는 종양세포에서만 발현되는 카텝신 B의 활성에 기반하여 세포 내로 약물이 흡수됨을 확인할 수 있다. 실시예 1의 FRRG-DOX는 HT-29, MDA-MB231, MCF7 및 A549와 같은 종양세포 내에 독소루비신이 축적되는데 반해, H9C2 및 HDF를 포함하는 정상세포에서는 세포 내에 독소루비신이 축적되지 않았음을 확인하였다.
일반적으로 항암치료제들은 종양세포 외에 다른 정상세포에도 독성을 나타내는 부작용이 가장 큰 문제점이였다. 특히 독소루비신의 경우 심장 세포에 독성을 나타내는 것이 가장 큰 부작용이였는데, 본 발명에 따른 FRRG-DOX는 신생아 심근세포인 H9C2에 대하여 활성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 핵 내로 독소루비신의 축적이 이루어지지 않음을 확인하였다.
이는 FRRG-DOX가 종양세포에 매우 특이적인 반응을 나타내도록, 적절하게 설계되었음을 의미하며, 종양세포와 정상세포를 명확하게 구분할 수 있는 기능을 갖고 있음을 의미한다. 이러한 본 발명의 약물복합체는 종래 항암치료제가 갖는 문제점을 해결하고 있을 뿐만 아니라, 안정성, 특이성이 현저히 향상된 새로운 항암치료제를 제공하고 있음을 알 수 있다.
실험예 3. 카텝신 B 억제제를 이용한 실시예 1의 FRRG-DOX의 암세포 독소루비신 발현 효율 평가
카텝신 B에 대해 실시예 1의 FRRG-DOX가 특이적 활성을 가지고 있음을 확인하기 위해, Lipofectamine 2000을 함유한 Cathepsin B siRNA(150 nM)를 37℃에서 30 분간 반응시켜 Lipofectamine-siRNA 복합체를 제조하였다.
인간유래 대장암 세포인 HT-29 세포를 35 ㎜ 커버글라스 바텀디쉬에 1 x 105 개씩 분주하여 24 시간 동안 세포만 배양한 뒤 Lipofectamine-siRNA 복합체(50 ㎍/L)를 처리하고 4 시간 동안 배양한 다음, 실시예 1의 FRRG-DOX(5 μM)를 처리한 후 24 시간 동안 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 배양하였다.
상술한 처리 과정을 거친 HT-29 세포를 DPBS로 2 회 세척하고 어두운 조건에서 20 분 동안 10 % 포름알데히드로 고정시키고, 고정시킨 후, 세포를 DPBS로 세척하고 실온에서 Hoechest (No. 33258)로 10 분 동안 염색 하였다. 상기 세포를 405 다이오드(405 nm), Ar(458, 488, 514 nm) 및 He-Ne(633 nm) 레이저를 사용하는 공초점 레이저 현미경(Leica TCS SP8, Leica Microsystems GmbH)을 사용하여 관찰하였다. 상기 세포에서 약물복합체 혹은 독소루비신의 NIRF 신호 세기를 이미지 J 소프트웨어(National Institutes of Health (NIH), Bethesda, USA)를 사용하여 분석 하였다.
도 2h는 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리한 다양한 조건의 HT29 세포를 공초점 현미경으로 촬영하여 나타낸 이미지이다.
FRRG-DOX는 Lipofectamine-siRNA 복합체로 처리하지 않은 HT29 세포에 FRRG-DOX만 처리한 경우이고, FRRG-DOX+Z-FA-FMK는 Z-FA-FMK(카텝신 활성 억제제)로 처리한 HT29 세포에 FRRG-DOX를 처리한 경우이며, FRRG-DOX+siRNA(Cat-B)는 카텝신 B 억제효과를 갖는 Lipofectamine-siRNA 복합체로 처리한 HT29 세포에 FRRG-DOX를 처리한 경우이다. 이때 적색은 독소루비신이고, 파란색은 DAPI로 염색된 세포의 핵이다.
도 2i는 도 2h로부터 측정된 형광 세기를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2h, i에 나타난 바와 같이, Cathepsin B를 억제하는 small interfering RNA(siRNA)와 lipofectamine 2000을 혼합한 복합체를 HT29 세포에 처리한 다음 약물복합체를 처리한 경우, 세포 핵 내로의 독소루비신 흡수가 감소되었음을 확인할 수 있다. 특히 세포 내로 흡수 및 축적된 독소루비신의 정량적 수치를 비교하면 그 차이를 더욱 명확함을 알 수 있다.
이를 통해 본 발명에 따른 약물복합체가 카텝신 B에 대해 특이적 활성을 나타낸다고 할 수 있다. 결국 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)는 종양세포에서 발현되는 카텝신 B에 대하여 특이적으로 분해되어 약물을 세포 내로 전달 및 방출하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 종양동물모델에 FRRG-DOX의 직접 조직 내 주입을 통한 독소루비신 발현 효율 평가
본 발명에서의 동물실험은 한국과학기술연구원(KIST)의 지침에 따라 수행되었으며, 기관윤리회(institutional committees)로부터 승인을 받았다.
종양동물모델은 Nara Bio INC(경기도, Korea)으로 구입한 흉선 누드 마우스(5.5 주령, 20-25 g, 수컷)를 이용하여 수행하였다. 상기 수컷 누드마우스에 1 X 107 개의 HT-29 세포를 양쪽 허벅지에 접종(n=6)하여 종양동물모델을 제작하였고, 5 주 후 종양의 크기가 250-300 ㎣ 일 때 실험을 실시하였다.
우선 종양 조직에서 카텝신 B 활성을 확인하기 위하여, 상기 종양동물모델의 종양의 크기가 250-300 ㎣ 일 때, 왼쪽 종양 조직에 카뎁신 B 억제효과를 갖는 카텝신 B siRNA를 종양조직에 직접 주입하였다. 1일이 지난 후, 양쪽 종양 조직에 실시예 1의 FRRG-DOX을 4 mg/kg을 주입하였고, 하루 2회 투여하였다. 다시 1일이 지난 뒤, 종양 조직 내 발현된 독소루비신을 표적화 하기 위하여, 100 μg의 아자디벤조사이클로옥틴-Cy5.5(DBCO-Cy5.5)(200 μL) 용량으로 정맥투여하고 6 시간 후 근적외선 형광영상을 실시하였다. 그리고 장기를 적출하여 장기 내 잔류하는 형광을 측정하였다. 종양 ROI의 NIRF 강도는 Living Imageㄾ 소프트웨어 (PerkinElmer, USA)를 사용하여 정량화하였다.
종양 조직 내 잔류하는 형광을 관찰하기 위하여, 종양 조직의 냉동절편을 제작한 후 공초점 현미경을 이용하여 관찰을 실시하였고, 분석과정은 상기 실험예 1, 2, 3에서 언급한 바와 동일하게 수행하였다.
도 3a는 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)가 생체 내에서 작용하는 과정을 개략적으로 도시한 도면으로, FRRG-DOX(실시예 1)을 기반으로 하는 나노입자는 EPR 효과에 의해 종양 조직 내에 축적될 수 있다. 이는 페닐알라닌 및 아르기닌을 갖는 양친매성 펩타이드가 나노입자 형성에 기여하기 때문이다. 또한 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)가 자발적으로 형성된 자기조립 나노입자는 별도의 링커를 사용하지 않음에도, 유연성 및 안정성이 유지되기 때문에 약물전달체이자 약물 전구체(prodrug)로 매우 효과적이다.
도 3b는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에서 세포 독성을 평가한 것으로, 종양을 종양동물모델의 오른쪽과 왼쪽 측면에 접종하고 카텝신 B siRNA 억제제를 왼쪽 종양에만 투여한 다음, 1 일 후와 15일 후의 증상 변화를 촬영한 사진이다. 도 3c는 도 3b의 동물종양모델로부터 시간에 따라 분리한 종양조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3b, c에 나타난 바와 같이, 카텝신 B 억제제가 같이 투여된 경우에는 항암 효과가 없음을 육안으로 확인하였다. 이에 반해 카텝신 B 억제제가 없는 종양조직에 실시예 1의 FRRG-DOX가 처리된 경우에는 종양조직의 크기가 정상조직과 거의 유사한 것을 확인할 수 있다. 즉 생체 내에서도, 생체 내 종양세포에서와 같이 종양조직에는 다량의 카텝신 B가 존재함을 확인할 수 있고, 다른 정상조직에서는 카텝신 B의 발현이 거의 없기 때문에 독소루비신의 축적 또한 이루어지지 않음을 알 수 있다.
또한, 도 3c를 참고하면 Cathepsin B 억제 siRNA를 투여한 종양 조직에서 FRRG-DOX의 활성화를 감소시켜, 카텝신 B siRNA가 투여한 종양의 크기가 카텝신 B siRNA를 투여하지 않고 FRRG-DOX를 투여한 종양의 크기에 비해 약 5 배 이상 더 성장하였음을 확인할 수 있다. 이를 통해 카텝신 B가 존재하는 곳에서만 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)가 활성화됨을 알 수 있다.
또한, FRRG-DOX의 선택적 활성화를 보다 구체적으로 확인하고자, 왼쪽 종양조직에는 카텝신 B 억제 siRNA를 처리하고, 오른쪽 종양조직에는 카텝신 B 억제 siRNA를 처리하지 않은 종양동물모델을 대상으로, 양 측면으로부터 적출된 종양 조직에서 카텝신 B 검출이 가능한 프로브를 이용하여 평균 방사값(형광강도)을 측정한 결과, 카텝신 B의 활성은 오른쪽 종양조직에서만 유지되고 있음을 확인하였다(미도시). 이러한 실험결과는 도 3의 실험의 연장선으로써 본 발명에 따른 약물복합체가 표적으로 하는 카텝신 B 효소가 종양조직에서만 발현될 뿐만 아니라, 상술한 실험에서 사용한 카텝신 B siRNA는 효과적으로 카텝신 B를 억제하고 있음을 확인하는 것이다. 즉, 상술한 카텝신 B siRNA를 사용한 본 발명의 실험결과의 신뢰성을 나타내고 있다.
실험예 5. 종양동물모델에 FRRG-DOX의 정맥투여를 통한 독소루비신 발현 효율 평가-1
독소루비신(free DOX) 및 실시예 1의 FRRG DOX이 생체 내에서도 항 종양 효과를 나타내는지 확인하고자, 상기 1)에서 제조된 종양동물모델의 오른쪽 측면에 1 x 107 개의 HT-29 세포를 직접 주사하였다(n=4, 각 군). 종양 크기가 약 250 - 300 ㎣에 도달하면 독소루비신(free DOX)(5 mg/kg) 및 실시예 1의 FRRG DOX(5 mg/kg)를 15 일 동안 3 일에 한번 종양동물모델의 정맥을 통해 투여하였다.
대조군으로 DPBS 200 ㎕를 종양동물모델에 정맥 주사하고, 3 일에 한번 15 일 동안 투여하였다.
Free DOX, FRRG-DOX 및 대조군의 치료 효능을 15 일 동안(최대 직경 x 최소 직경 2 x 0.53) 종양 부피를 측정하여 비교하였다. 종양동물모델의 생존율 및 체중도 하루 1 회 15 일 동안 측정하였다. 종양동물모델에서의 종양조직 내부에 Free Dox 및 FRRG-DOX이 축적되는지 여부는 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)을 통해 확인하였고, 종양조직에서 free DOX 및 FRRG-DOX 형광 강도의 정량은 Living Imageㄾ 소프트웨어 (PerkinElmer, Massachusetts , 미국).를 사용하였다.
도 3d는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), 비교예 1의 RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각각의 종양동물모델에서 독소루비신을 표적화하는 근적외선 형광 영상이미지이다.
도 3e는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), 비교예 1의 RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각각의 종양동물모델에서 적출된 종양 조직의 독소루비신 발현 형광이미지이다.
도 3f는 상기 도 3e에서 발현하는 형광강도를 나타낸 그래프이다.
도 3d, e, f에 나타난 바와 같이, 종양동물모델에서 형광강도는 현저한 차이를 나타내었다, 실시예 1의 FRRG-DOX를 투여하는 경우뿐만 아니라 정맥 투여법을 이용하는 경우에도 종양 조직에 특이적으로 독소루비신을 발현시킬 수 있었고, 종양조직에 발현된 독소루비신을 표적화하여 종양을 효과적으로 표지할 수 있음을 확인하였다.
도 3e에 나타난 바와 같이 적출된 종양조직에서도 FRRG-DOX를 정맥투여한 동물모델의 종양조직에서 형광 강도가 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
이에 반해 본 발명의 실시예 1의 FRRG-DOX와 유사한 비교예 1의 RRG-DOX은 형광강도가 독소루비신만 단독으로 처리한 경우보다도 형광강도가 낮은 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 실시예 1의 FRRG-DOX에서 펩타이드의 서열이 하나라도 빠지거나 변경될 경우 종양세포 특이적 활성을 나타낼 수 없음을 알 수 있다.
이는 FRRG-DOX가 종양조직 내에 존재하는 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되어, 약물(독소루비신;G-DOX)이 종양조직 내에만 축적됨을 의미하는 것으로, 자가조립 나노입자 형성으로 인해 종양조직에서 독소루비신의 농도의 증가가 나타나게 되는 현상을 말한다.
도 3g는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여한 경우(free DOX), 나노입자를 형성하지 못하는 RRG-DOX를 투여한 경우(RRG-DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우, 각 경우에 따른 종양동물모델로부터 얻은 종양조직을 DAPI로 염색한 사진과 독소루비신(DOX)의 형광을 측정한 사진이다.
도 3g에 나타난 바와 같이 실시예 1의 FRRG-DOX가 EPR 효과에 의해 종양조직에서 특이적으로 활성화되어, 독소루비신을 종양조직에 축적하고 있음을 알 수 있고, 이에 반해 비교예 1의 RRG-DOX 또는 독소루비신만 단독으로 처리한 경우에는 독소루비신을 조직 내에 효과적으로 축적시킬 수 없음을 알 수 있다.
실험예 6. 종양동물모델에 FRRG-DOX의 정맥투여를 통한 독소루비신 발현 효율 평가-2
독소루비신(free DOX) 및 실시예 1의 FRRG DOX이 생체 내에서도 항 종양 효과를 나타내는지 확인하고자, 상기 1)에서 제조된 종양동물모델의 오른쪽 측면에 1 x 107 개의 HT-29 세포를 직접 주사하였다(n=4, 각 군). 종양 크기가 약 200 ㎣에 도달하면 독소루비신(free DOX)(5 mg/kg) 및 실시예 1의 FRRG DOX(5 mg/kg)를 15 일 동안 3 일에 한번 종양동물모델의 꼬리정맥을 통해 투여하였다.
대조군으로 DPBS 200 ㎕를 종양동물모델에 꼬리정맥에 주사하고, 3 일에 한번 15 일 동안 투여하였다.
Free DOX, FRRG-DOX 및 대조군의 치료 효능을 15 일 동안(최대 직경 x 최소 직경 2 x 0.53) 종양 부피를 측정하여 비교하였다. 종양동물모델의 생존율 및 체중도 하루 1 회 15 일 동안 측정하였다. 종양동물모델에서의 종양조직 내부에 Free Dox 및 FRRG-DOX이 축적되는지 여부는 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)을 통해 확인하였고, 종양조직에서 free DOX 및 FRRG-DOX 형광 강도의 정량은 Living Imageㄾ 소프트웨어 (PerkinElmer, Massachusetts , 미국).를 사용하였다.
도 4a는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에서, 본 발명에 따른 약물복합체(FRRG-DOX)(실시예 1)의 종양 성장 억제 효과를 분석한 것으로, 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 시간에 따른 종양의 부피(㎣)를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4b는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 시간에 따라 종양동물모델로부터 분리한 종양 조직의 사진이다.
도 4a 및 도 4b는 종양동물모델에서 본 발명의 약물복합체의 치료 효과 및 부작용을 확인하기 위한 것으로, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이 독소루비신만 투여한 경우(free DOX)와 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 경우 모두 종양 성장을 유의하게 저해하고 있음을 확인되었으나, 독소루비신 처리 그룹(free DOX)은 정상 세포에 대한 독성이 관찰된 반면, 약물복합체가 투여된 그룹(FRRG-DOX)에서는 독성이 전혀 관찰되지 않았다.
즉, 독소루비신만 투여할 경우와 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 종양동물모델에 투여할 경우, 양 그룹 모두의 종양조직에서 암 치료효과라 판단될 수 있는 우수한 종양 억제 효과가 관찰되었다.
도 4c는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 종양동물모델의 생존율(survival rate(%))을 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 4c에 나타난 바와 같이, 독소루비신만 처리한 경우(DOX), 주입한 이후부터 종양동물모델의 체중이 감소하기 시작했고, 마침내 독소루비신의 정상세포에 대한 독성으로 인해 사망률이 급증하기 시작함을 확인하였다. 그러나 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여할 경우에는 동물종양모델의 생존율(%)이 16일 동안 100%를 유지하고 있음을 확인하였다. 실질적으로 노화의 제약이 없는 이상 16일 이후에도 종양 질환에 의한 사망은 발생하지 않을 것임을 알 수 있다.
상술한 결과를 통해서 본 발명의 약물복합체(FRRG-DOX) 형태로 독소루비신이 주입될 경우, 종양조직에만 약물이 활성화되기 때문에, 종양조직의 생장 및 전이만이 억제될 뿐 정상세포에는 전혀 약물의 독성이 영향을 끼치지 못하게 됨을 알 수 있다. 즉 본 발명의 약물복합체(FRRG-DOX)는 종래 약물전달체 혹은 약물이 갖고 있는 부작용 문제를 현저히 개선하였다 여겨진다.
상기 종양동물모델로부터 추출한 종양조직에서, 세포사멸(apoptosis)를 확인하기 위하여 Annexin V 염색을 사용하였고, 그 과정은 다음과 같다. 우선 추출한 종양조직의 절편 슬라이드(10 ㎛)를 DPBS로 3 회 세척하고, 37℃에서 20 분 동안 annexin V 용액(5 ㎕ annexin V-Cy5.5를 함유한 200 ㎕ 결합 완충액(binding buffer))과 함께 배양한 다음, 이를 실온에서 15 분동안 DAPI로 배양하고 커버 글래스(cover glass)에 놓은 후, 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다.
도 4d는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여(FRRG-DOX)한 다음, 종양동물모델로부터 적출된 다른 장기 조직들의 세포사멸 여부를, annexin V 염색을 통해 검출한 공초점 레이저 현미경 사진이다. 초록색은 anmexin V에 의해 염색된 세포사멸한 조직이고, 청색은 DAPI에 의해 염색된 세포의 핵이다.
본 발명의 목적이 종래 항암치료제의 독성 및 부작용을 억제하여, 장기간 투여에도 안정할 뿐만 아니라, 투여에 의한 이차적 부작용에 의한 사망을 방지할 수 있는, 효과적인 예방 또는 치료효과를 갖는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이기 때문에, 도 4d에서와 같이, 종양동물모델에 독소루비신만 처리할 경우와 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 처리하는 경우, 다른 장기로의 영향성을 평가하였다.
도 4d에 나타나는 바와 같이, 독소루비신을 단독으로 투여한 종양동물모델(free DOX)에서는 심장(heart), 비장(spleen) 및 종양조직(tumor) 모두에서 세포 사멸이 관찰되었는데 반해, 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 종양동물모델(FRRG-DOX)에서는 종양조직(tumor)에서만 세포사멸이 관찰되었다.
도 4e는 HT29 종양을 주입한 종양동물모델에 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 각각의 경우에 대하여, 심장 독성을 확인하기 위한 것으로, 각각의 종양동물모델로부터 혈액을 채취하여, 심장의 손상을 나타내는 대표적인 4개의 표지자(hs troponin-T, Troponin-I, CK-MM 및 CPK total)를 검출한 결과 그래프이다.
도 4e에 나타난 바와 같이, 독소루비신만 투여하거나(DOX), 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여하였을 때, 각 경우에서 심장 손상 여부를 확인한 결과 독소루비신을 단독으로 투여한 종양동물모델(free DOX)의 혈액에서는 모든 표지자가 다 높게 관찰되었는데 반해, 실시예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)를 투여한 종양동물모델(FRRG-DOX)에서는 심장 손상을 나타내는 표지자가 오히려 대조군(saline)과 비교하여 더 낮거나(약 2 배), 유사한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7. 종양동물모델에 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4로부터 제조된 약물복합체의 특성 및 약리효과 평가.
실시예 1의 FRRG DOX와 유사한 펩타이드 서열을 갖는 다양한 펩타이드(실시예 2 내지 4의 약물복합체)에 대하여 물리적 특성 및 항종양 효과를 확인하고자 하였다. 도 5a는 실시예 2, 3, 4로부터 제조된 약물복합체 각각에 대한 화학식을 나타낸 것이다.
도 5b는 실시예 2 내지 4로부터 제조된 약물복합체의 나노입자 형성 여부를 확인하고, 각각에 대한 입자 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5b에 나타난 바와 같이 실시예 1의 FRRG-DOX과 유사한 구조를 가진 GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4)는 서로 다른 크기의 나노입자를 형성하고 있음을 확인하였다.
구체적으로 GGGGFRRG-DOX(실시예 2)는 200 내지 600 ㎚, GGFRRGGG-DOX(실시예 3)는 50 내지 200 ㎚, FRRGGGGG-DOX(실시예 4)는 300 내지 700 ㎚로 측정되었다.
도 5c는 독소루비신(DOX), GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4)를 각각 세포에 처리한 후, 이를 공초점 현미경으로 촬영한 사진이고, 도 5d는 도 5c에서 각각의 세포에 대한 형광 강도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 Cytosol은 세포질에서 측정된 DOX의 형광강도이고, Nucleus는 세포 핵에서 측정된 DOX의 형광강도이다.
도 5c, 도 5d에 나타난 바와 같이, GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4) 모두 항종양 효과 혹은 세포 내 흡수 효과를 확인할 수 있었다.
구체적으로 FRRGGGGG-DOX(실시예 4)과 같이, FRR 서열 뒤에 결합되는 글리신(G) 아미노산 잔기가 연속으로 4 개 이상 존재하는 경우에는 세포 내부로 원활하게 흡수가 이루어지지 않으므로, FRRG-DOX(실시예 1), GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3)을 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다.
또한, GGFRRGGG-DOX(실시예 3)과 같이, FRR 서열 뒤에 결합되는 글리신(G) 아미노산 잔기가 연속으로 3개가 존재하는 경우에는 세포 내부로는 원활하게 흡수되나, 세포 핵 내로 흡수되는 양이 실시예 1, 2의 약물복합체에 비해 10 배 이상 저하되므로, FRRG-DOX(실시예 1), GGGGFRRG-DOX(실시예 2)를 사용하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.
도 5e는 종양세포(HT29)에 독소루비신(DOX), GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4)를 처리한 후, 종양세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
FRRGGGGG-DOX(실시예 4)는 페닐알라닌(F)의 친수성 아미노산에 다양한 펩타이드가 결합되기 때문에 세포 내로 흡수에 어려움이 있음을 확인할 수 있다. 따라서 바람직하게 본 발명에 따른 약물복합체의 양친매성 펩타이드는 '화학식 1'에서 n이 1을 초과하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
GGGGFRRG-DOX(실시예 2)의 경우 DOX와 동일한 항종양 효과를 나타내고 있음을 확인한 바, 가장 바람직하게는 FRRG-DOX(실시예 1) 및 GGGGFRRG-DOX(실시예 2)임을 알 수 있다.
도5f는 도 5b 내지 도 5e의 실험결과를 통해 도출할 수 있는 GGGGFRRG-DOX(실시예 2), GGFRRGGG-DOX(실시예 3), FRRGGGGG-DOX(실시예 4) 약물복합체의 세포 내 흡수경로를 도시한 도면이다.
실험예 8. 종양동물모델에 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4로부터 제조된 약물복합체의 특성 및 약리효과 평가.
1) 다중전극배열(multi-electrode array;MEA) 분석
다중전극배열 분석은 다음과 같이 수행하였다. 우선 인간 유도 다능성 줄기세포 유래 심근세포(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes;hiPSC-CMs)(Cellular Dynamics International [CDI], Madison, WI, USA)를 준비하였다. hiPSC-CM을 100 ㎜ 배양접시(dish)에서 해동한 후, 1 주일이 자난 후 50 ㎍/㎖ 피브로넥틴 용액으로 코팅된 MEA 플레이트 상에 분주하였다. 해동후 2 일째가 되는 날에 플레이팅 베지를 유지배지(CDI)로 교체해주었다. 2-3 일마다 새로운 유지배지로 교체하였고, 교체시 배양배지의 중에서 50%만 새로운 배지로 교체하였다. 자발적으로 박동하는 심근세포의 전계전위는 Maestro 시스템(Axion Biosystems Inc., Atlanta, GA, USA)을 사용하여 측정되었다. 측정은 플레이트 상에 분주한 날을 기준으로 2 주(week) 후에 측정하였다. 세포외전위(field potential)의 파형은 평형시간(equilibration period) 10분이 지난 후 기록하였다. inter-spike interval과 세포외전위(field potential duration;FPD)를 분석하고, 이를 정량화하였다. FPD에 대한 beat rate의 영향을 최소화하기 위해 FPDcF(corrected FPD)를 하기 식 1(Fridericia's 식)을 이용하여 계산하였다.
[식 1]
FPDcF = FPD/[inter-spike interval]1/3
2) 심전도(electrocardiography;ECG) 분석
ECG 분석은 한국독성연구소의 동물관리 위원회(the Institutional Animal Care and Use Committee at the Korea Institute of Toxicology)의 승인을 받아 수행하였고, 실험동물의 관리 및 실험 절차(National Institutes of Health guidelines for the care and use of laboratory animals)에 관해서는 국립 보건원 지침을 준수하여 진행하였습니다. ICR 마우스(25-35 g, Orient Bio Inc., Seoul, Korea)에 유속 2 cc/min으로 isoflourane과 산소의 혼합물을 마취가스로 주입하였다. 상기 마취가스를 animal bio amp(ADInstruments Pty Ltd, Bella Vista, Australia)로 주입하기 전에 ECG를 측정하였다. 이때 측정한 ECG가 baseline이 된다. 마취가스를 투여하고 난 후 6 시간동안 ECG를 측정하였다. 모든 마우스는 정맥을 통해 saline, 5 mg/kg doxorubicin(in saline) 또는 10 mg/kg FRRG-doxorubicin(실시예 1)(in saline)을 각각 주입하였다. 측정된 ECG 데이터는 LabChart 8 소프트웨어(ADInstruments Pty Ltd, Bella Vista, Australia)를 사용하여 분석하였다. Van de Water의 공식(식 2)과 Bazett의 공식(식 3) 을 사용하여 보정된 QT(corrected QT;QTc)를 계산했다.
[식 2]
QTc-V = 0.087 [(60 / HR)-1]
[식 3]
QTc-B = QT / (RR) 1/2
3) 심전도 관련 독성 분석 결과
도 6a는 FRRG-DOX(실시예 1)(0.2 μM)과 독소루비신(0.1 μM)로 처리한 hiPSC-CM에 대한 다중전극배열(multi-electrode array;MEA) 분석 측정결과이다.
도 6a에 나타난 바와 같이 독소루비신만으로 처리된 hiPSC-CM의 FPD와 FPDcF는 기준선과 비교하여 현저히 감소된 반면, FRRG-DOX(실시예 1)로 처리된 hiPSC-CM의 FPD와 FPDcF는 거의 변화가 없음을 확인할 수 있다. 즉 FRRG-DOX(실시예 1)는 독소루비신을 직접적으로 사용하였을 때보다 심장 독성이 현저히 감소되었음을 알 수 있다.
도 6b는 FRRG-DOX(실시예 1)과 독소루비신로 처리한 ICR 마우스에서의 심전도 측정 결과이다.
도 6b에 나타난 바와 같이 5 mg/kg의 독소루비신만으로 처리된 ICR 마우스에서 측정된 QTc는 대조군과 비교하여 연장되었음을 확인할 수 있다. 이에 반해 FRRG-DOX(실시예 1)로 처리된 ICR 마우스에서 측정된 QTc는 대조군과 유사하게 검출되었다. 따라서 FRRG-DOX(실시예 1)의 약물복합체는 동물실험 중 종양부위에서만 활성화되므로 심장, 간, 신장 및 비장과 같은 정상 장기에 대해서는 독성을 나타내지 않는 장점을 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 약물접합체(FRRG-DOX)는 종양 특이적 예방 또는 치료효과를 나타내었고, 동물실험을 통해서도 입증되었다. 게다가 다른 장기조직과 생명에 독성이 전혀 없는 안정한 약물임을 확인하였고, 제조과정 역시 매우 간단하므로 경제적인 측면이 우수함을 알 수 있었다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Self-assembling drug nanocomplex of drug conjugated capthepsin B-cleavable peptide for specific tumor cell <130> HPC7424 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 1 Phe Arg Arg Gly 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 2 Gly Gly Gly Gly Phe Arg Arg Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 3 Gly Gly Phe Arg Arg Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 4 Phe Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 5 Arg Arg Gly 1

Claims (14)

  1. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 양친매성 펩타이드; 및
    상기 양친매성 펩타이드의 일 말단에 결합되어 있는 소수성 약물;을 포함하고,
    상기 양친매성 펩타이드는 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 선택적으로 분해되어, 소수성 약물이 방출되며,
    상기 소수성 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 저분자 기반 약물복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약물복합체의 분자량은 800 내지 3000 Da인 것을 특징으로 하는 약물복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 약물복합체는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재하에서, 상기 양친매성 펩타이드가 분해되어 상기 소수성 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 약물복합체.
  9. 서열번호 1 내지 4 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 양친매성 펩타이드; 및 상기 양친매성 펩타이드의 일 말단에 결합되어 있는 소수성 약물;을 포함하고,
    상기 양친매성 펩타이드에서 친수성 부분이 쉘에 위치하고, 상기 소수성 약물 및 상기 양친매성 펩타이드에서 소수성 부분이 코어에 위하는 구조를 갖되,
    상기 소수성 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 자기조립 나노입자는 증류수, 인산염 완충액(PBS), 생리식염수, 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 증류수 및 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 용매 중에서 자발적으로 형성되는 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 자기조립 나노입자는 평균 직경이 50 내지 500 ㎚인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자.
  13. 제1항에 따른 약물복합체 또는 제9항에 따른 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  14. 제1항에 따른 약물복합체 또는 제9항에 따른 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200015036A (ko) * 2018-08-02 2020-02-12 가천대학교 산학협력단 광열 나노입자, 항암제 및 히알루론산 및 카텝신 b의 기질 펩타이드의 컨쥬게이트를 포함하는 광열 나노복합체
KR102228272B1 (ko) 2019-11-13 2021-03-17 한국과학기술연구원 항암 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자기조립 나노약물 복합체
KR20210032160A (ko) 2019-09-16 2021-03-24 한국과학기술연구원 종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체
KR102239752B1 (ko) 2019-12-11 2021-04-13 한국과학기술연구원 종양 특이적 약물복합체와 항pd-l1 항체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물
KR20210136252A (ko) * 2020-05-07 2021-11-17 한국과학기술연구원 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자
WO2022035244A1 (ko) 2020-08-14 2022-02-17 한국과학기술연구원 약물 반응성 예측을 위한 대장암 진단 또는 검출용 조성물, 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR20220071357A (ko) * 2020-11-24 2022-05-31 한국과학기술연구원 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111905108A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 北京医院 用于靶向治疗肝癌的纳米药物体系及其制备方法
CN112266409B (zh) * 2020-10-28 2022-05-13 南开大学 依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用
KR20230085578A (ko) * 2021-12-07 2023-06-14 한국과학기술연구원 암 예방 또는 치료를 위한 알부민 결합 전구약물, 이를 포함하는 약학 조성물
WO2024041535A1 (zh) * 2022-08-22 2024-02-29 赣州和美药业股份有限公司 纳米组合物及其制备方法和用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6592847B1 (en) * 1998-05-14 2003-07-15 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared flourescent probes
DE10121982B4 (de) 2001-05-05 2008-01-24 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Nanopartikel aus Protein mit gekoppeltem Apolipoprotein E zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP1531664A4 (en) * 2002-06-26 2005-11-16 Du Pont GENES ENCODING PROTEINS WITH PESTICIDAL ACTIVITY
CA2514089A1 (en) 2002-11-18 2004-06-03 The Johns Hopkins University Activation of peptide prodrugs by hk2
WO2007109364A2 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 The General Hospital Corporation Intramolecularly quenched fluorochrome conjugates and methods of use
KR20100058541A (ko) * 2007-08-15 2010-06-03 아뮤닉스 인코포레이티드 생물학적 활성 폴리펩티드의 특성을 변경하기 위한 조성물 및 방법
WO2011043502A1 (ko) * 2009-10-08 2011-04-14 국립암센터 광감각제 - 금속나노입자 복합물 및 이를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물
CN105963706B (zh) * 2016-04-15 2019-03-15 四川大学 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用
CN106421806B (zh) * 2016-11-14 2019-10-18 四川大学 一种逐级响应纳米自组装树枝状前药及制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjugate Chem., 28(9), 2316-2326, 2017.
International Journal of oncology, 42, 373-383, 2013.
Polymer Chemistry, 6, 3512-3520, 2015. 5. 19.

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102100360B1 (ko) 2018-08-02 2020-04-14 가천대학교 산학협력단 광열 나노입자, 항암제 및 히알루론산 및 카텝신 b의 기질 펩타이드의 컨쥬게이트를 포함하는 광열 나노복합체
KR20200015036A (ko) * 2018-08-02 2020-02-12 가천대학교 산학협력단 광열 나노입자, 항암제 및 히알루론산 및 카텝신 b의 기질 펩타이드의 컨쥬게이트를 포함하는 광열 나노복합체
KR20210032160A (ko) 2019-09-16 2021-03-24 한국과학기술연구원 종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체
KR102270641B1 (ko) 2019-09-16 2021-06-30 한국과학기술연구원 종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체
KR102228272B1 (ko) 2019-11-13 2021-03-17 한국과학기술연구원 항암 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자기조립 나노약물 복합체
US11498946B2 (en) 2019-12-11 2022-11-15 Korea Institute Of Science And Technology Pharmaceutical composition for combination therapy for preventing or treating cancer containing tumor-specific drug conjugate and anti-PD-L1 antibody as active ingredients
KR102239752B1 (ko) 2019-12-11 2021-04-13 한국과학기술연구원 종양 특이적 약물복합체와 항pd-l1 항체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성물
KR20210136252A (ko) * 2020-05-07 2021-11-17 한국과학기술연구원 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자
KR102400031B1 (ko) 2020-05-07 2022-05-20 한국과학기술연구원 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자
KR20220021509A (ko) 2020-08-14 2022-02-22 한국과학기술연구원 약물 반응성 예측을 위한 대장암 진단 또는 검출용 조성물, 대장암 예방 또는 치료용 조성물
WO2022035244A1 (ko) 2020-08-14 2022-02-17 한국과학기술연구원 약물 반응성 예측을 위한 대장암 진단 또는 검출용 조성물, 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR20220071357A (ko) * 2020-11-24 2022-05-31 한국과학기술연구원 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물
KR102458709B1 (ko) * 2020-11-24 2022-10-26 한국과학기술연구원 난소암 예방 또는 치료를 위한 복강 내 투여용 조성물

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