KR102270641B1 - 종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체 - Google Patents

종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양세포 특이적 감응형 약물복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종양세포에 존재하는 효소에 의해서 분해되어, 활성성분인 항암 약물을 방출할 수 있는 항암 약물복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는 종양조직에서 특이적으로 발현하는 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 독소루비신을 방출하는 프로드러그(prodrug)로, 종양세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 예방 또는 치료과정에서 유도되는 심각한 세포 손상 및 사망 등의 부작용을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는 수성 상태에서 안정한 나노입자를 형성하므로 정상세포에 독성을 나타내지 않으며, 종양세포에 대해 특이적으로 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는, 암 세포 사멸 효과가 매우 우수하다.

Description

종양세포 특이적 감응형 자가조립 나노약물복합체{Self-assembling drug nanocomplex of drug conjugated capthepsin B-cleavable peptide for specific tumor cell}
본 발명은 종양세포 특이적 감응형 약물복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종양세포에 존재하는 효소에 의해서 분해되어, 활성성분인 항암 약물을 방출할 수 있는 항암 약물복합체에 관한 것이다.
최근, 종양세포에 특이적으로 과발현되는 것으로 알려진 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 양친매성(amphiphilic)의 펩타이드 서열을 항암제(doxorubicin)에 화학적으로 결합하여 나노입자를 형성할 수 있는 자기조립 나노약물 복합체가 개발되었다(특허문헌 001 참조). 이는 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 활성화되기 때문에, 정상 세포에 독성을 최소화하며 암 세포를 사멸시킬 수 있다는 점에서 기존 항암제보다 독성이 현저히 감소하고 특히, 암 축적 효율이 비약적으로 증가되어, 치료 효능이 향상되었다. 하지만, 상기의 발명은 효소에 의해 특이적으로 절단되어 기존의 항암제인 독소루비신(Doxorubicin)이 방출되는 것이 아닌, 글라이신이 결합된 독소루비신(Glycine-Doxorubicin, G-DOX)가 방출되며 이는 독소루비신과 비교하여 약 30 % 감소된 암 세포 사멸 효과를 보이기 때문에 항암제로서의 치료 효능은 여전히 제한적이다.
본 발명자들은 상기 자기조립 나노 약물복합체에 자가소멸 링커(Silf-immolative linker)를 결합하는 경우 상기 약물복합체의 암 세포 사멸 효과가 현저히 증대되는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1930399 B
본 발명의 목적은 암 세포 사멸 효과가 현저히 증대된 항암 약물복합체, 자기조립 나노입자 및 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 순차적으로 연결된, (ⅰ) 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드; (ⅱ) 파라 아미노벤질옥시카르보닐, 아미노에틸-N-메틸카르보닐, 덴드리틱 링커 및 세파로스포린을 기반으로 한 링커로 이루어진 군에서 선택되는 링커; 및 (ⅲ) 소수성 항암 약물을 포함하고, 상기 양친매성 펩타이드는 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 소수성 항암 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 항암 약물복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 순차적으로 연결된, (ⅰ) 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드; (ⅱ) 파라 아미노벤질옥시카르보닐, 아미노에틸-N-메틸카르보닐, 덴드리틱 링커 및 세파로스포린을 기반으로 한 링커로 이루어진 군에서 선택된 링커; 및 (ⅲ) 소수성 항암 약물을 포함하고, 상기 양친매성 펩타이드에서 친수성 부분이 쉘에 위치하고, 상기 링커, 소수성 항암 약물 및 상기 양친매성 펩타이드에서 소수성 부분이 코어에 위치하는 구조를 갖되, 상기 소수성 항암 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 자기조립 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항암 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항암 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는 종양조직에서 특이적으로 발현하는 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 독소루비신을 방출하는 프로드러그(prodrug)로, 종양세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 예방 또는 치료과정에서 유도되는 심각한 세포 손상 및 사망 등의 부작용을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는 수성 상태에서 안정한 나노입자를 형성하므로 정상세포에 독성을 나타내지 않으며, 종양세포에 대해 특이적으로 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 약물복합체 또는 자기조립 나노입자는, 암 세포 사멸 효과가 매우 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 의한 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 작동 메커니즘을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 합성 방법을 나타낸다.
도 3은 도 2(FRR-PABC-DOX의 합성 방법)에 개시된 중간체 1의 구조 (a)와 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과 (b) 및 질량 분석 액체크로마토그래피 (LC-MS) 분석 결과 (c)를 나타낸다.
도 4는 도 2(FRR-PABC-DOX의 합성 방법)에 개시된 중간체 2의 구조 (a)와 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과 (b) 및 질량 분석 액체크로마토그래피(LC-MS) 분석 결과 (c)를 나타낸다.
도 5는 도 2(FRR-PABC-DOX의 합성 방법)에 개시된 최종 물질의 구조 (a)와 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과 (b) 및 질량 분석 액체크로마토그래피(LC-MS) 분석 결과 (c)를 나타낸다.
도 6은 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 나노입자의 크기 분포를 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)와 카텝신 B를 반응시킨 후, 상기 카텝신 B에 의한 약물복합체의 특이적 절단을 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)를 카텝신 B(Cathepsin B)와 반응시킨 후, 절단 결과 방출되는 물질의 질량 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 독소루비신(Doxorubicin)과 글라이신이 결합된 독소루비신(Glycine-doxorubicin, G-DOX)의 세포 사멸 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
도 10은 비교예 1의 약물복합체(FRRG-DOX) 및 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)를 유방암 세포(MDA-MB231)에 처리한 후의 세포 사멸 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 언급하는 "종양 세포(tumor cell)"는 암 조직, 양성 또는 악성 타입의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 "암(cancer)" 또는 "종양(tumor)"의 용어는 신체의 일부분 또는 세포로부터 기인하는 암을 의미한다. 이는 상피성암(carcinoma), 육종(sarcoma), 림프종(lymphoma), 생식세포종(germ cell tumors), 및 아세포종(blastoma)을 포함하며, 이에 한정하지 않는다. 몇몇 구현예에 따르면, 암은 신체의 특이 위치 또는 특이 질병과 연관되어 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
항암 약물복합체
본 발명은 순차적으로 연결된, (ⅰ) 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드; (ⅱ) 파라 아미노벤질옥시카르보닐, 아미노에틸-N-메틸카르보닐, 덴드리틱 링커 및 세파로스포린을 기반으로 한 링커로 이루어진 군에서 선택되는 링커; 및 (ⅲ) 소수성 항암 약물을 포함하고, 상기 양친매성 펩타이드는 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 소수성 항암 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 항암 약물복합체에 관한 것이다.
이하 본 발명에서 언급하는 바에 따르면, 본 발명에서 제시하는 항암 약물복합체는 세포사멸유도 방법, 세포사멸 증폭 방법 및 암 치료법 등에 유용하다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 약물복합체를 발명함에 있어서, 가장 고려했던 부분은 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되는 양친매성 펩타이드 및 소수성 약물을 포함하는 약물결합체의 분해 후에 방출되는 약물이 글라이신이 결합된 소수성 약물이 아닌 온전한 소수성 약물이 되도록 하는 것이었다.
이러한 목적을 이루기 위한 본 발명의 항암 약물복합체는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드 및 상기 소수성 항암 약물의 사이에 파라 아미노벤질옥시카르보닐, 아미노에틸-N-메틸카르보닐, 덴드리틱 링커 및 세파로스포린을 기반으로 한 링커로 이루어진 군에서 선택되는 링커가 결합된 것이다.
본 발명의 약물복합체는 양친매성 펩타이드; 자가소멸 링커; 및 소수성 약물이 순차적으로 연결된 형태로, 양친매성 펩타이드와 소수성 약물의 상호작용에 의해, 정상세포에 대해 약물의 독성을 나타내지 않도록 안정화되었으므로, 종래 항암치료제가 가지고 있던 부작용 문제를 극복 및 해결함과 동시에 생체 내 구조적 안정성 및 용해성은 현저히 개선되었다. 또한, 상기 자가소멸 링커에 의해 글라이신이 결합된 소수성 약물이 아닌 온전한 소수성 약물이 방출됨으로써 암 세포 사멸 효과가 현저히 증가하였다.
상기 약물복합체는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재하에서, 상기 양친매성 펩타이드가 분해되고, 상기 링커는 자가소멸함으로써 상기 소수성 약물이 방출되고, 상기 방출된 소수성 약물은 종양세포 내에 흡수 및 전달되어 종양조직의 생장과 전이를 억제하며, 다른 작은 펩타이드 분자들은 독성이 없는 작은 분자로 분해되어 체내의 대사 과정에 참여하거나, 신장을 통해 체외로 배출되기 때문에 생체 적합성 역시 매우 우수하다.
한편, 상기 카텝신 B 효소는 세포 외로 거의 분비되지 않으므로 종양세포 이외의 정상세포나 종양조직 이외의 다른 정상조직에서 위양성(false positive)를 나타낼 가능성이 매우 낮다. 이에 반해 카텝신 B 효소외에 다른 프로테이즈(protease)를 표적 대상으로 하는 경우, 해당 프로테이즈를 검출하기 위한 펩타이드의 설계도 어려울 뿐만 아니라, 어느 한 부위에 특징지어지기 때문에, 특정된 전립선암 등과 같이 특정 암에 대해서만 치료효과를 가지며, 전이암의 경우에는 해당하지 않으며, 세포외 분비 효소로서 위양성을 나타낼 수 있다는 문제점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 약물복합체는 상기 양친매성 펩타이드가 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것일 때, 안정성, 생체적합성, 종양세포에 대한 특이적 활성, 정상세포에 대한 생체 적합성, 부작용 문제 억제 효과 및 약물의 예방 또는 치료효과를 총괄하여 가장 우수한 효과를 달성하고 있음을 확인하였다.
[서열번호 1]
FRRG
[서열번호 2]
GGGGFRRG
[서열번호 3]
GGFRRGGG
[서열번호 4]
FRRGGGGG
상기 소수성 항암 약물은 택솔, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 아드리아마이신, 다우노마이신(daunomycin), 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 항암 약물복합체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드-파라 아미노벤질옥시카르보닐-독소루비신(FRR-PABC-DOX)으로 구성되는 것이 보다 바람직하다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 작동 메커니즘을 나타내는 개략도이다.
상기 약물복합체의 분자량은 800 내지 3000 Da인 것이 바람직한데, 만약 분자량이 상기 범위보다 크거나 작을 경우, 수성 상태에서 자기조립 나노입자를 형성하는데 있어 제한적이거나, 형성된 나노입자의 크기가 과도하게 커져 세포내 진입이 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 약물복합체는, 작은 분자량의 양친매성 펩타이드, 링커 및 소수성 약물을 결합하여 간단한 단일 과정을 통해 제조가 가능하나, 종래 거대분자 또는 고분자와 같이 분자량이 커질 경우, 합성과정이 복잡해지고 합성조건을 제어하기가 어려울 뿐만 아니라, 단가가 급증하는 문제가 있다. 게다가 봉입되거나 결합하는 약물의 비율이 낮아(5% 미만) 임상 결과가 좋지 않으며, 원하는 임상 결과를 위해 과량의 약물이 투여되어야 하는 문제점이 존재했다(결국 과량의 약물이 투여되면 정상세포에서의 독성 부작용도 증가되는 문제점도 발생하였다).
이에 본 발명은, 간단한 합성법을 통하여 어떠한 추가적인 과정의 도입 없이 매우 높은 수율로 약물복합체를 제조할 수 있고, 종양세포에 존재하는 효소에 반응하여 약물을 방출하는 저분자의 약물복합체라는 점에서 종래 항암치료제보다 우수한 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 약물복합체는 앞서 설명한 바와 같이, 생체 내에 투여되면, 정상세포나 정상 조직에서는 상기 양친매성 펩타이드가 절단되지 않아 약물이 활성화되지 않고, 종양세포나 종양조직에서는 세포 내에 발현되는 카뎁신 B 효소에 의해 양친매성 펩타이드가 소수성 약물과 절단되거나, 또는 양친매성 펩타이드의 일부 아미노산, 일부 아미노산과 소수성 약물이 절단되어, 소수성 약물이 종양세포 내로 축적되고 활성화됨으로써, 종양세포에 대해 특이적인 예방 혹은 치료효과를 나타내게 된다.
자기조립 나노입자
본 발명의 다른 측면은 상기 약물복합체가 용매 중에서 자발적으로 구형의 나노입자를 형성하고, 상기 나노입자는 상기 약물복합체의 소수성 부분이 코어를 형성하며, 친수성 부분이 상기 코어의 외부로 노출되어 있는 구조인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자를 제공한다.
본 발명의 자기조립 나노입자는 상기 약물복합체 간의 결합으로 인해, 더 안정한 구형의 나노입자를 형성한 것으로써, 약물의 안정성을 효과적으로 증대시키고, 종양세포에 대해 특이적 반응성을 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 경구 또는 비경구적으로 적용가능하다는 장점을 갖는다.
상기 자기조립 나노입자는 양친매성의 약물복합체가 수중에 용해될 경우, 약물복합체의 응축 및 자기조립을 통해 형성된다.
구체적으로 상기 나노입자는 상기 약물복합체가 연결되어 형성된 내막과 외막으로 이루어진 구형의 입자이다. 상기 나노입자의 외막(쉘 영역)은 상기 약물복합체 중에서 친수성 펩타이드인 RRG 부위가 서로 연결되어 배열된 것이고, 상기 나노입자의 내막(코어 영역)에는 상기 약물복합체 중에서 소수성 펩타이드(F); 링커; 및 소수성 약물이 서로 연결되어 배열되어 있다.
상기 자기조립 나노입자는 종양 조직 또는 종양세포를 특이적으로 인식함에 있어서 중요한 역할을 수행하는, 양친매성 펩타이드; 온전한 소수성 약물이 방출되도록 하는 자가소멸 링커; 및 항암 효과를 갖는 소수성 약물;로 이루어진 약물복합체로 구성된다. 상기 약물복합체에 대해서는 앞서 구체적으로 설명하였으므로, 본 단락에서 중복 기재되는 내용은 생략하기로 한다.
상기 자기조립 나노입자는 종양세포의 카텝신 B 효소 존재 하에서, 상기 약물복합체의 양친매성 펩타이드가 분해되어, 상기 나노입자 코어 부분에 위치하던 상기 약물복합체의 소수성 약물이 방출되는 것일 수 있다. 상기 용매는 증류수, 인산염 완충액(PBS), 생리식염수, 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 증류수 및 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
약학 조성물
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 약물복합체 또는 상기 자기조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물 내 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자의 함량은 질환의 증상, 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 30 내지 80 중량%, 바람직하게는 50 내지 70 중량% 이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물 내 유효성분으로 함유되는 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자는 약제학으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등과 함께 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용 액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
여기에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 물, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제로 제제화되는 경우, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 가능하며, 이러한 고형제제는 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자 이외에 적어도 한 가지 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴, 칼슘카보네이트 등을 혼합하여 제조될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제로 제제화되는 경우, 현탁제, 내용액제, 시럽제, 유제 등이 가능하며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로 제제화되는 경우, 멸균된 수용액, 비수성 용제, 유제, 현탁제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리톨, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 좌제의 기제로는 위탭솔, 트윈 61, 라이린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자 함량을 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 환자의 나이, 성별, 체중, 식이, 배설율, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학조성물은 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환을 말하며, 바람직하게는 유방암, 난소암, 태반암, 위암, 결장암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명은 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물의 용도, 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자의 용도, 인간을 포함한 포유류에 약제학적으로 허용가능한 양의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 투여하는 것을 포함하는 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학조성물은 그 자체로 이미 종양세포에 대해 우수한 특이성을 갖고 있기 때문에, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다.
건강기능식품 조성물
암 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 본 발명의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 식품 또는 음료에 첨가할 수 있다.
본 발명의 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
건강 기능성 음료 조성물은 상기 약물복합체 혹은 자기조립 나노입자를 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
<실시예>
통계
실험군과 대조군의 차이는 one-way ANOVA을 사용하여 분석하였고, 통계적으로 유의하다고 간주되었다(도면에서 별표(*)로 표시함).
실험재료
독소루비신(Doxorubicin)은 퓨쳐켐(서울, 한국)에서 구입하였다. 카텝신 B(Cathepsin B) 효소는 Abcam(하남, 한국)에서 구입하였다.
N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide; EDC), N-히드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 5β-콜란산(5β-cholanic acid), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF, 순도 ＞99%), 메탄올(순도 ＞99%), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO, 순도 ＞99%)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
세포배양실험을 위하여, 유방암 세포주(MDA-MB231, human breast adenocarcinoma)를 ATCC(VA, USA)로부터 구입하였다. FBS, DMEM 배지 (DMEM media), 인산완충용액 (DPBS), 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics; AA)는 WelGENE (대구, 한국)에서 구입하였다.
실시예 1. 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 합성
도 2는 약물복합체(FRR-PABC-DOX)의 합성방법을 개략적으로 나타내는 반응식이다.
먼저, 양친매성 펩타이드(Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-COOH, 7 mg), 4-Aminibenzyl alcohol(2 mg) 및 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline(3 mg)을 2 mL의 Dimethylformamide(DMF)에 용해시킨 뒤, 10 ℃에서 3 일(72 시간)동안 반응하여 Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PAB-OH를(도 2의 중간체 1) 수득하였다. 상기 수득된 중간체 1, Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PAB-OH의 구조식 (a), 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과(b) 및 질량 분석 액체크로마토그래피(LC-MS) 분석 결과(c)를 도 3에 나타내었다.
그리고, Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PAB-OH 수용액에 Doxorubicin(4.3 mg)를 첨가한 뒤 6 시간 반응하여 Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PABC-Doxorubicin(도 2의 중간체 2)을 수득하였다. 상기 수득된 중간체 2, Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PABC-Doxorubicin의 구조식(a), 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과(b) 및 질량분석 액체크로마토그래피(LC-MS) 분석 결과(c)를 도 4에 나타내었다.
또한, Ac-FR(Alloc)2R(Alloc)2-PABC-Doxorubicin 수용액에 Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(Pd(PPh3)4, 8 mg) 및 Tributyltin hydride(N-Bu3-SnH, 3.2 mg)을 첨가한 뒤, Acetic acid(AcOH)를 추가로 첨가하여 수용액의 pH를 5.0 으로 조정한 뒤 상온에서 1 시간 동안 반응하여 최종 물질인 Ac-FRR-para amino benzyl alcohol-doxorubicin(Ac-FRR-PABC-DOX)를 수득하였다. 상기 수득된 최종물질인 Ac-FRR-PABC-DOX의 구조식(a), 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC) 분석 결과(b) 및 질량분석 액체크로마토그래피(LC-MS) 분석 결과(c)를 도 5에 나타내었다.
비교예 1. 약물복합체(FRRG-DOX)의 합성
한국등록특허 제10-1930399호, 한국과학기술연구원, "종양세포 특이적 감응형 자기조립 나노약물복합체"에서의 제조방법을 참고하여, 링커가 결합되지 않은 약물복합체(FRRG-DOX)를 제조하였다.
실험예 1. 생체 외에서, 실시예 1로부터 제조된 FRR-PABC-DOX의 카텝신 B와의 특이성 분석
자가 소멸 연결기가 결합된 나노제형화 자기조립 나노약물 복합체(FRR-PABC-DOX)의 입자 크기를 분석하고자 하였다.
이를 위하여, FRR-PABC-DOX(1.0 mg 또는 3.0 mg)를 생리식염수(1 mL, Saline)에 분산한 뒤, 형성되는 자기조립 나노입자를 Zetasizer(NanoZS, Malvern, U.K.)을 이용하여 직경 및 크기 분포를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 FRR-PABC-DOX를 식염수(Saline)에 용해한 다음, 형성된 자기조립 나노입자의 크기 분포를 분석하여 나타낸 것이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 약물복합체를 용매에 용해하여 형성되는 자기조립 나노입자의 평균 직경은 20 nm인 것을 확인 할 수 있다.
FRR-PABC-DOX의 카텝신 B에 의한 활성화를 확인하기 위하여, FRR-PABC-DOX(10 μmol)을 카텝신 B 효소(10 μg)을 함유하는 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid(MES) buffer(200 μL)에 분산한 뒤, 37 ℃ 인큐베이터에 보관하며 0, 1, 3, 6 및 9 시간에 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RT-HPLC)를 이용하여 카텝신 B 특이적 절단을 평가하고자 하였다.
도 7은 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)를 카텝신 B와 각각 0, 1, 및 3 시간 동안 반응시킨 후, 효소 반응에 의하여 상기 약물복합체가 절단되는 것을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석한 결과이다.
상기 도 7을 통해, FRR-PABC-DOX를 카텝신 B와 반응시키는 경우 상기 FRR-PABC-DOX이 절단되어 독소루비신을 방출하는 것을 구체적으로 확인하였다.
상기 약물복합체의 카텝신 B 특이적 절단 후 방출된 물질이 독소루비신이 맞는지를 확인하고자 질량 분석을 하였다.
이를 위하여, 상기의 카텝신 B 절단 평가 후 방출된 물질(10 nmol)을 메탄올에 분산시킨 후 고분해능 거대질량 분석기(MALDI-TOF)를 이용하여 분자량을 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 도 8의 MALDI-TOF 결과를 통해, FRR-PABC-DOX를 카텝신 B와 반응시킨 후, 상기 FRR 펩타이드의 절단 결과 방출되는 물질이 독소루비신(DOX)인 것을 구체적으로 확인하였다.
실험예 2. 생체 외에서, 실시예 1로부터 제조된 FRR-PABC-DOX의 세포 독성 평가
생체 외에서, 독소루비신, 및 실시예 1(FRR-PABC-DOX) 및 비교예 1(FRRG-DOX)의 약물복합체의 암 세포에 대한 독성을 평가하고자 하였다.
먼저, 96-웰 플레이트에 웰 당 5 x 103 cell개의 MDA-MB231(human breast adenocarcinoma)을 분주하였다. 24 시간 안정화 후, 세포 각각에 독소루비신, FRRG-DOX 및 FRR-PABC-DOX 각각을 다양한 농도(0.01, 0.1, 1, 10, 100 μM)로 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각 웰에 10 ㎍의 CCK 용액을 함유한 세포 배양액을 넣은 뒤, 세포를 20 분 추가배양하고, 96-웰 플레이트의 흡광도를 VERSAmaxTM (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 분석하였다. 대조실험으로, 종양세포 대신 H9C2 세포(정상세포)를 사용하여 상기 과정과 동일하게 진행하여, 이에 대한 세포 독성을 평가하였다.??
도 9는 종양세포(MDA-MB231)에 비교예 1의 약물복합체로부터 방출되는 약물인 G-DOX 또는 실시예 1의 약물복합체로부터 방출되는 약물인 독소루비신(Doxorubicin)을 각각 처리한 후, 종양세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9를 살펴보면, 독소루비신을 처리한 경우, 비교예 1의 약물복합체로부터 방출되는 글라이신-독소루비신(G-DOX)에 비해 종양세포의 생존율이 현저히 낮아지는 것을 구체적으로 확인할 수 있다.
도 10은 종양세포(MDA-MB231)에 비교예 1의 약물복합체(FRRG-DOX) 및 실시예 1의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)를 각각 처리한 후, 종양세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10을 살펴보면, 실시예 1의 약물복합체를 처리한 경우, 종양세포의 생존율이 현저히 낮아지는 것을 구체적으로 확인할 수 있다.
상기 실험예의 결과에 따르면, 본 발명의 약물복합체는 카텝신 B에 의해 분해될 때 자가소멸 링커의 존재로 인해 글라이신이 결합되지 않은 독소루비신을 방출하게 됨으로써 암 세포 사멸 효과가 우수하다.
즉, 본 발명의 약물복합체(FRR-PABC-DOX)는 비교예 1의 약물복합체(FRRG-DOX)에 비해 암 세포 사멸 효과가 현저히 높다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Self-assembling drug nanocomplex of drug conjugated capthepsin B-cleavable peptide for specific tumor cell <130> HPC8873 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 1 Phe Arg Arg Gly 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 2 Gly Gly Gly Gly Phe Arg Arg Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 3 Gly Gly Phe Arg Arg Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor-specific amphiphilic prodrug <400> 4 Phe Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly 1 5

Claims (8)

  1. 순차적으로 연결된, (ⅰ) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드; (ⅱ) 파라 아미노벤질옥시카르보닐로 이루어진 링커; 및 (ⅲ) 소수성 항암 약물인 독소루비신;을 포함하고,
    상기 양친매성 펩타이드는 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 분해되어, 소수성 항암 약물이 방출되는 것을 특징으로 하는 항암 약물복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 순차적으로 연결된, (ⅰ) 종양세포의 카텝신 B 효소에 의해 분해되는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양친매성 펩타이드; (ⅱ) 파라 아미노벤질옥시카르보닐로 이루어진 링커; 및 (ⅲ) 소수성 항암 약물인 독소루비신을 포함하고,
    상기 양친매성 펩타이드에서 친수성 부분이 쉘에 위치하고, 상기 링커, 소수성 항암 약물 및 상기 양친매성 펩타이드에서 소수성 부분이 코어에 위치하는 구조를 갖는 것을 특징으로 자기조립 나노입자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자기조립 나노입자는 증류수, 인산염 완충액(PBS), 생리식염수, 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 증류수 및 0.5 내지 1% NaCl을 함유한 인산염 완충액(PBS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매 중에서 자발적으로 형성되는 것을 특징으로 하는 자기조립 나노입자.
  6. 제1항에 따른 항암 약물복합체 또는 제4항에 따른 자기조립 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 정맥투여, 경구투여, 경피투여 또는 직장투여를 위한 것인 약학 조성물.
  8. 제1항에 따른 항암 약물복합체 또는 제4항에 따른 자기조립 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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