KR102400031B1 - 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자에 관한 것으로, 별도의 담체를 포함하지 않음에도 불구하고 상술한 종양 조직 특이적 활성과 세포독성 안정화 등의 효과를 발휘할 뿐만 아니라, 암세포 사멸 효과가 매우 우수하며, 항종양 면역 상승효과를 동시에 발휘하여 암 성장 및 재발을 효율적으로 방지할 수 있다.

Description

항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자{Cancer-specific self-assembled nanoparticles for enhancing antitumor immunity}
본 발명은 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자에 관한 것이다.
암은 우리나라를 포함하는 대다수 선진국가의 사망원인 1위로, 인류가 극복해야할 가장 중요한 질환 가운데 하나이다. 암 치료는 일반적으로 화학 요법을 위한 카테터를 적용하여 수술로 종양을 제거하기 전에 종양을 수축시키는 것을 포함하는 침입 과정(intrusive processes)이 요구된다. 상술한 치료요법은 환자의 독성 부작용 및 삶의 질 저하와 관련된 문제를 야기한다.
이에 암 치료를 위하여 항암제를 덜 침습적이고 오래 지속적으로 전달할 수 있는 약물전달방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 나노입자는 약물 투여에 적합한 제제로, 암 치료를 위해 많이 이용되어 왔다. 이러한 나노크기의 약물 전달 시스템을 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 재료들이 개발되었으며, 단일클론 항체 베바시주맙은 노화 관련 황반 변성 치료를 위해 PLGA 나노입자가 사용되었다.
천연 바이오폴리머 중에서 인간 혈청 알부민이 가장 대표적이다. 인간 혈청 알부민은 생체 적합성, 생분해성 및 비독성이라는 장점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 알부민 나노입자는 다양한 약물과의 결합능과 내약성이 우수하여 많은 주목을 받았으나, 불안정하여 실제 임상적용에 많은 제약이 있다.
항 PD-L1 항체는 단독으로 체내에 투여될 시, 생체 내 동력학 (Pharmacokinetics), 종양 내 축적 효율 및 구조 안정성이 크게 떨어진다. 이를 해결하기 위하여 항 PD-L1 항체와 담체의 병용투여 방법이 개발되었으나, 이는 효능이 제한적이라는 단점이 존재한다. 따라서 효과적인 항암 면역치료가 가능한 개선된 약물에 대한 기술 개발이 필요하다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0015037호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 항 PD-L1 항체의 PD-1/PD-L1 신호 차단 능력을 갖는 제1 펩티드와 카텝신 B에 의해 분해되는 제2 펩티드로 구성된 양친매성 펩티드와 소수성 항암제가 결합되어 형성된 자가조립 나노입자를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와 서열번호 2로 표시되는 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드; 및 소수성 항암제;로 구성된 복합체를 포함하고,
상기 서열번호 1은 D-형태의 아미노산으로 구성되며,
상기 서열번호 2는 L-형태의 아미노산으로 구성되며,
상기 복합체는 자가조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자를 제공한다.
[서열번호 1]
Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe
[서열번호 2]
Xaa-Arg-Arg-Gly
상기 서열번호 2에서,
Xaa는 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile) 및 프롤린(Pro)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
상기 자가조립 나노입자의 평균 직경은 50 내지 500 nm일 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 양친매성 펩티드가 나노입자의 내부 또는 외부 표면에 위치하는 것일 수 있다.
상기 양친매성 펩티드의 C-말단에 소수성 항암제가 공유결합 또는 비공유 결합에 의해 접합된 것일 수 있다.
상기 자가조립 나노입자는 카텝신 B 효소에 의해 제2 펩티드가 분해되어, 소수성 항암제와 제1 펩티드를 방출하고, 암세포 사멸을 유도하는 것일 수 있다.
상기 소수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암은 위암, 폐암, 비소세포성 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 골암, 비소세포성 골암, 혈액암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 직장암, 항문 부근암, 결장암, 나팔관암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 침샘암, 육종암, 가성점액종, 간모세포종, 고환암, 교모세포종, 구순암, 난소생식세포종양, 기저세포암, 다발성골수종, 담낭암, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 복막암, 설암, 소세포암, 소아림프종, 신경모세포종, 십이지장암, 요관암, 성상세포종, 수막종, 신우암, 외음부암, 흉선암, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 암은 재발암(Recurrent cancer) 또는 항암제-내성암(Anticancer drug-resistanced cancer)일 수 있다.
상기 조성물은 항종양 면역성(Antitumor immunity)과 항종양 활성을 동시에 증진시키는 것일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(ⅰ) 본 발명은 하기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와 서열번호 2로 표시되는 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드; 및 소수성 항암제;로 구성된 복합체를 포함하는 자가조립 나노입자를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 자가조립 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물은 종양세포에 과발현되는 PD-L1 수용체에 결합하여, 세포 내에 리소좀을 통해 진입하며, 암세포 내에 과발현하는 카텝신 B 효소에 의해 특이적으로 분해되어 항암제를 방출함으로써, 항종양 면역성(Antitumor immunity)과 항종양 활성을 동시에 증진시킬 수 있다.
(ⅳ) 또한, 별도의 담체를 포함하지 않아도, 종양세포에 대한 특이성이 우수하고, 종양세포가 아닌 정상세포에 대해서는 안정성이 매우 우수하므로, 임상적 사용에 매우 유리하다.
(ⅴ) 또한, 종양세포내 축적효과가 우수하므로, 암뿐만 아니라 재발하는 암에 대해서도 현저히 우수한 항암 치료효능을 갖는다.
도 1은 항종양 면역 상승효과를 나타내는 자가조립 나노입자(IFDX)의 작동 메커니즘을 개략적으로 도시한 개념도이다.
도 2는 실시예 1의 양친매성 펩티드-소수성 항암제 복합체(IFDX)에 대한 화학적 합성과정을 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 입자 크기 분석기(DLS)로 분석한 그래프이다.
도 4는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 투과전자현미경(TEM)으로 촬영한 도면이다.
도 5는 카텝신 B 효소 존재하에서, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 다양한 시간(0 분, 10 분, 1 시간 및 3 시간)으로 반응한 후, 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RT-HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)과 비교예 1로부터 제조된 FRRG-DOX 자가조립 나노입자 및 독소루비신(DOX)를 CT26 대장암 세포에 각각 처리한 후, PD-L1 수용체 발현여부를 확인하기 위해, 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 7은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX) 및 독소루비신(DOX)를 CT26 대장암 세포에 각각 처리한 후, 세포 내 거동을 확인하기 위해, 공초점 형광 현미경으로 촬영한 결과이다.
도 8은 대장암 동물모델에, 실시예 1, 비교예 1, 2, 3 및 독소루비신 단독(DOX)을 각각 투여한 후, 종양크기를 시간별로 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
종래 항암 면역치료에 대한 우수한 임상효과가 알려지면서, 많은 연구가 진행되어 왔다. 그 중에서 PD-1/PD-L1 신호를 차단하는 면역관문 억제제에 대한 치료법 개발이 가장 활발하다. 그러나 종래 항암제 및 PD-1/PD-L1 항체는 생체 내 안정성, 약물동력학 및 종양 내 축적 효율이 매우 떨어질 뿐만 아니라, 두 약물을 병용 투여하더라도 항암 효능이 여전히 제한적이라는 단점이 있다. 나아가 이러한 병용 요법은 종래 항암제의 정상 조직에 대한 독성 문제를 해결할 수 없다는 단점이 있다.
이에 본 발명에서, 면역 관문 억제제인 PD-L1 길항근(antagonist) 펩티드와 소수성 항암제를 이용한 새로운 구조의 자가조립 나노입자를 개발하고자 노력한 바, 종양세포에서 특이적으로 활성화되어 항종양 면역 상승 효과를 나타내지만, 정상 세포 혹은 정상조직에 대해서는 비활성 상태로 유지되어 독성을 나타내지 않는 안정적인 자가조립 나노입자를 완성하게 되었다. 구체적으로 본 발명에서는 PD-L1 길항근 펩티드의 성질 및 기능이 제한되지 않는 범위 내에서 종양 세포 특이적 펩티드와 결합하여 종양 세포 특이적 활성화가 가능한 PD-L1 길항근 펩티드를 개발하였으며, 이를 소수성 항암제와 결합한 새로운 구조의 자가조립 나노입자를 제안하고 있다.
본 발명의 일 측면은 하기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와 서열번호 2로 표시되는 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드; 및 소수성 항암제;로 구성된 복합체를 포함하고, 상기 복합체는 자가조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자에 관한 것이다. 상기 서열번호 1은 D-형태의 아미노산으로 구성되며, 상기 서열번호 2는 L-형태의 아미노산으로 구성된다.
[서열번호 1]
Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe
[서열번호 2]
Xaa-Arg-Arg-Gly
상기 서열번호 2에서,
Xaa는 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile) 및 프롤린(Pro)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
서열번호 2에서, Xaa는 비극성 아미노산이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 페닐알라닌(Phenylalanine;Phe) 발린(Valine;Val), 루신(Leucine;Leu), 이소루신(Isoleucine;Ile), 프롤린(Proline;Pro) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 가장 바람직하게는 알라닌(Alanine; Ala)일 수 있다.
바람직하게 서열번호 2는 서열번호 3으로 표시되는 L-형태의 아미노산일 수 있다.
상기 자가조립 나노입자의 평균 직경은 50 nm 이상일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 500 nm일 수 있다. 만일 상기 자가조립 나노입자의 평균 직경이 하한치 미만일 경우, 종양세포 내 축적 효율 및 약물 동력학 특성이 발휘되지 않을 수 있으며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 세포내 투입효율이 떨어질 뿐만 아니라 세포 내 유동성이 감소될 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 양친매성 펩티드가 나노입자의 내부 또는 외부 표면에 위치하는 것일 수 있다. 이때, 소수성 항암제는 나노입자의 구조 내부에 위치하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 종양세포가 아닌 세포에 대해서는 항암제가 활성화되지 않으므로, 전혀 독성을 나타내지 않는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 자가조립 나노입자의 양친매성 펩티드는 서열번호 1 및 2로 표시되는 새로운 서열의 양친매성 펩티드로 구성됨에도 불구하고, 나노입자의 안정성이 우수하고, 물 등의 용매에 대한 충분한 용해도를 갖는 것을 확인하였다. 아미노산 서열은 하나만 달라져도 해당 아미노산이 단백질 입체구조를 변화시키게 되고, 결국 양친매성 펩티드의 기능에 영향을 준다. 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 양친매성 펩티드와 소수성 항암제와의 결합관계 및 이들 기능을 종합적으로 고려하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자는 종양세포에서 특이적으로 활성화되며, 항종양 면역 상승효과를 나타낼 수 있다. 그 결과, 기존 항암제의 한계인 독성 문제를 해결할 수 있고, 기존 항암제 및 면역 관문 억제제인 PD-L1 길항근 펩티드의 생체 내 안정성, 종양 내 축적 효율 및 약물 동력학을 크게 향상하여 치료 효능을 극대화할 수 있었다. 본 발명에 따른 항종양 면역 상승효과를 나타내는 종양세포 특이적 자가조립 나노입자는 약물전달체계 및 항암 면역치료의 발전에 큰 역할을 할 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드는 PD-L1 길항근 펩티드 (nyskptdrqyhf)로, 이는 면역 관문 중 한 신호인 PD-1/PD-L1을 차단하여, 항종양 면역 효과를 내며, 소수성 항암제와 상승 효과를 나타내어 우수한 항암 면역치료효능을 유도할 수 있다.
상기 서열번호 2로 제2 펩티드는 카텝신 B에 의해 절단되는 펩티드로, 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와의 결합을 통해, 카텝신 B에 의해 FRR' 또는 FRRG'의 위치가 절단되고, 이러한 절단위치로 인해 항암 활성에 전혀 악영향을 받지 않는다.
상기 제1 펩티드의 서열의 길이가 길어지거나, 아미노산 서열 중 어느 하나라도 치환되면 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 용액내에서 제대로 나노입자를 형성하지 못하며, 아미노산 서열 중 어느 하나라도 결실되어 길이가 짧아질 경우에는 제1 펩티드뿐만 아니라 전체 자가조립 나노입자의 기능이 제대로 발휘되지 못하게 되는 문제가 발생할 수 있다.
또한, 상기 양친매성 펩티드를 구성하는 아미노산 서열 중 그 어느 하나라도 변경되면 소수성 항암제와 성공적으로 결합할 수 없거나, 결합된 접합체가 용액상에서 자가조립을 통해 나노입자를 구성하지 못하거나, PD-L1 길항근 펩티드와 소수성 항암제가 제 기능을 발휘하지 못할 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 양친매성 펩티드의 일 말단에 소수성 항암제가 공유결합 또는 비공유 결합에 의해 접합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 용액 상에서 자가조립을 통해 구형의 나노입자 형태(전구약물 형태)를 형성하기 때문에, 종양 내 축적 효율이 비약적으로 향상되며, 비특이적으로 정상 세포와 조직에 축적된 접합체에 대해서는 정상 세포 내의 낮은 카텝신 B 농도에 의해 비활성 상태를 유지하여 세포독성을 전혀 나타내지 않을 수 있고, 생체 내 종양 조직 내 전달과 축적이 용이하여, 현저히 우수한 항암 효능을 가지게 된다.
상기 자가조립 나노입자는 카텝신 B 효소에 의해 제2 펩티드가 분해되어, 소수성 항암제와 제1 펩티드를 방출하고, 암세포 사멸을 유도할 수 있다.
상기 소수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 자가조립 나노입자는 생체 내에서 자기조립에 의해 나노입자로 형성되기 때문에, 나노입자 형태로 제조하기 위한 별도의 공정을 생략할 수 있으며, 종래 항 PD-L1 항체와 소수성 항암제가 가지고 있던 대부분의 문제(낮은 종양 내 축적 효율, 생체 내 안정성 및 약물동력학 등)를 해결할 수 있고, 일반 암뿐만 아니라 내성암에 대해서도 현저히 우수한 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있다.
하기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와 서열번호 2로 표시되는 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드; 및 소수성 항암제;로 구성된 복합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112020046085414-pat00001
본 발명에 따른 조성물은 (i) 어떠한 종류의 나노 담체없이도 자기조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하고, 평상시에 세포에 독성을 전혀 나타내지 않는 전구약물 형태로 존재하여, 부작용이 없고, (ii) 종양세포에 특이적 활성을 가지며, (iii) 낮은 농도에서도 매우 우수한 항암 효과를 나타내며, (iv) 일반 암뿐만 아니라 내성암에 대해서도 현저히 우수한 항암 효과를 나타내며 (v) 면역 관문 억제제인 PD-L1 길항근 펩티드와 항암제를 동시에 종양 조직에 전달하여 우수한 항종양 면역 상승효과를 기대할 수 있는 등 다양한 장점을 가지고 있어, 종래 기술들과 구별되는 차별성이 있다.
본 발명의 다른 측면은 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 내성암 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 항암보조제에 관한 것이다.
본 발명의 자가조립 나노입자의 항암 효과에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 기재를 생략하였다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 본 발명의 자가조립 나노입자가 암 또는 내성암에 대해 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
또한 상기 자가조립 나노입자를 유효성분으로 하는 암 또는 내성암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 자가조립 나노입자는 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mg/kg 이상 포함된다. 자가조립 나노입자는 용액 상에서 전구약물 형태인 나노입자로 형성되어, 세포에 전혀 독성을 나타내지 않은 매우 안정적인 상태로 존재하기 때문에 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 자가조립 나노입자의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양 내 국소 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 mg/㎏이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 항암 보조제는 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하나 비경구 투여시 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 자궁 내 경막주사, 뇌혈관 내 주사 또는 흉부 내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 항암 보조제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 항암 보조제의 일일 투여량은 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.05 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 항암 보조제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
본 발명의 실험예는 각 그룹간의 유의미한 차이를 통계적으로 분석하기 위하여, 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하였다. P 값이 0.05 미만이면 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였고, 이는 각 도면에 별표로 표시하였다.
실시예
<실험재료>
본 발명의 서열번호 1 및 3으로 이루어진 양친매성 펩티드(nyskptdrqyhf-FRRG)는 펩트론(대전, 한국)에서 구입하였다. 독소루비신은 퓨쳐켐(서울, 한국)에서 구입하였다.
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)(EDC), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)(NHS), 단백질 분해 억제제, 아세토니트릴(acetonitrile)(ACN), 트리플루오로아세틱 애시드(trifluoroacetic acid)(TFA), N,N-디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylformamide)(DMF, anhydrous), N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine)(DIPEA), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(DMSO), 메탄올(methanol)(MeOH)은 시그마 알드리치(Sigma aldrich)(미국)로부터 구입하였다.
카텝신 B 효소는 R&D systems(미네소타, 미국)로부터 구입하였다. TEM 시험판은 Electron Microscopy Sciences(미국)로부터 구입하였고, 세포 용해제, Streptividin-HRP, BCA 단백질 정량 키트는 Thermo Fisher Scientific(미국)로부터 구입하여 사용하였다.
또한 항 PD-L1 항체는 Abcam(하남, 한국)에서 구입하였으며, RPMI 1640 배지와 DMEM 배지, 항생제, 소태아혈청(Fetal bovine serum)은 WELGENE(대구, 한국)에서 구입하였다.
CT26 대장암 세포는 American Type Culture Collection(미국)으로부터 구입한 것을 사용하였고, Balb/c 실험쥐 및 Balb/c nu/nu 실험쥐는 Narabio(대전, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
<실시예 1. 자가조립 나노입자 제조>
하기 반응식에 따라, 양친매성 펩티드-소수성 항암제 복합체(IFDX)을 제조하였다. 이는 도 2에도 도시하였다.
[반응식 1]
Figure 112020046085414-pat00002
우선, PD-L1 길항근 기능을 갖는 제1 펩티드와 카텝신 B 특이적 절단 가능한 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드(Ac-nyskptdrqyhfFRRG)를 펩트론(대전, 한국)에 의뢰하여 제조하였다. 상기 양친매성 펩티드 10 ㎎, EDC(1.2 mg), NHS(1.4 mg) 및 독소루비신(Doxorubicin)(3 mg)을 2 ㎖의 디메틸포름아마이드(DMF)에 용해시키고, 상온에서 3 시간 동안 반응하여 양친매성 펩티드-소수성 항암제 복합체(IFDX)를 수득하였다.
상기 제조된 양친매성 펩티드-소수성 항암제 복합체(IFDX)는 생리식염수(1 mL, Saline)에 분산하였고, 별다른 과정없이 양친매성 펩티드-소수성 항암제 복합체(IFDX)는 액상에서 자가조립에 의해 구형의 나노입자로 형성된다. 이는 후술하는 실험을 통해 확인할 수 있다.
<비교예 1. FRRG-DOX 자가조립 나노입자(FDOX) 제조>
우선, FRRG 펩티드를 펩트론(대전, 한국)에 의뢰하여 제조하였다. 상기 펩티드 10 ㎎, EDC(1.2 mg), NHS(1.4 mg) 및 독소루비신(Doxorubicin)(3 mg)을 2 ㎖의 디메틸포름아마이드(DMF)에 용해시키고, 상온에서 3 시간 동안 반응하여 FRRG-DOX를 수득하였다.
상기 제조된 FRRG-DOX는 생리식염수(1 mL, Saline)에 분산하였고, 별다른 과정없이 액상에서 자가조립에 의해 구형의 나노입자로 형성되었다.
<비교예 2. FRRG-DOX 자가조립 나노입자와 PD-L1 길항근 펩티드의 병용 투여용 조성물(FDOX-combi) 제조>
비교예 1로부터 제조된 FRRG-DOX 자가조립 나노입자와 펩트론(대전, 한국)에 의뢰하여 제조한 PD-L1 길항근 기능을 갖는 펩티드(서열번호 1)를 혼합하여 조성물을 제조하였다. FRRG-DOX 자가조립 나노입자(2 mg/kg, 독소루비신 기준)와 PD-L1 길항근 펩티드(10 mg/kg)를 기준으로 제조하였다.
<비교예 3. 독소루비신(DOX)와 PD-L1 길항근 펩티드의 병용 투여용 조성물(DOX-combi) 제조>
종래 항암제인 독소루비신과 펩트론(대전, 한국)에 의뢰하여 제조한 PD-L1 길항근 기능을 갖는 펩티드(서열번호 1)를 혼합하여 조성물을 제조하였다. 독소루비신(2 mg/kg)과 PD-L1 길항근 펩티드(10 mg/kg)를 기준으로 제조하였다.
<실험예 1. 자가조립 나노입자(IFDX)의 입도 분석>
실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)의 입자 크기 및 형태를 분석하고자 하였다.
이를 위하여, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)(1 mg)를 생리식염수(1 ㎖, Saline)에 분산한 뒤, Zetasizer(NanoZS, Malvern, U.K.)을 이용하여 직경 및 크기 분포를 측정하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 평균 직경이 180 ㎚임을 확인하였다.
<실험예 2. 자가조립 나노입자(IFDX)의 형태 분석>
실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)의 형태를 분석하기 위하여 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 나노입자 형태를 분석하였다. 구체적으로 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 1 ㎎/㎖ 농도로 생리식염수에 용해하고, TEM 그리드(grid)에 분산시킨 후, 투과전자현미경(TEM)으로 분석하여, 도 4에 도시하였다.
도 4에 따르면, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 구 형태의 나노입자임을 확인하였다.
<실험예 3. 자가조립 나노입자(IFDX)의 카텝신 B 효소에 의한 활성화 여부 분석>
카텝신 B 효소의 존재 유무에 따른 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)의 활성화를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 카텝신 B 효소(10 μg)를 함유하는 2-(N-모르폴린)-에탄설포닉 애시드(2-(N-morpholine)-ethane sulphonic acid)(MES) 완충액(200 μL)을 준비하고, 여기에 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)(10 μmol)를 첨가한 뒤, 37 ℃ 조건하에서, 다양한 시간(0 분, 10 분, 1 시간 및 3 시간) 반응시킨 다음, 각각의 반응물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RT-HPLC)으로 분석하였다.
도 5는 카텝신 B 효소 존재하에서, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 다양한 시간(0 분, 10 분, 1 시간 및 3 시간)으로 반응한 후, 이를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RT-HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5에 따르면, 카텝신 B 효소가 존재할 때, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 효율적으로 절단되어, nyskptdrqyhfFRR 또는 nyskptdrqyhfFRRG; 및 G-독소루비신 또는 독소루비신;을 방출함을 확인하였다.
<실험예 4. 자가조립 나노입자(IFDX)의 PD-L1 결합능 평가>
시험관 내 (In vitro)에서 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)과 비교예 1로부터 제조된 FRRG-DOX 자가조립 나노입자의 PD-L1 결합능을 살펴보고자 하였다.
먼저, 6-웰 플레이트에 웰 당 2×104 세포(cell) 농도로 CT26(mouse colon adenocarcinoma) 대장암 세포를 분주하였다. 24 시간동안 안정화시킨 후, 세포에 각각 DOX, FRRG-DOX(비교예 1) 및 IFDX(실시예 1)를 2 μM 농도로 처리한 다음, 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 각 웰에 트립신(trypsin)-EDTA를 처리하고, 세포를 수득한 다음, 세포 용해제를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 전기영동법을 이용하여 분석하였다.
도 6은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)과 비교예 1로부터 제조된 FRRG-DOX 자가조립 나노입자 및 독소루비신(DOX)를 CT26 대장암 세포에 각각 처리한 후, PD-L1 수용체 발현여부를 확인하기 위해, 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 6에 따르면, 독소루비신(DOX)만을 단독으로 처리하거나, 비교예 1로부터 제조된 FRRG-DOX 자가조립 나노입자를 처리한 경우에는, 종양 세포가 면역 세포로부터 인식을 피하기 위해 발현하는 PD-L1 수용체의 발현이 크게 증가함을 확인할 수 있다.
이에 반해, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 처리한 세포에서는 PD-L1 수용체가 거의 증가하지 못함을 알 수 있다. 즉, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)를 종양세포에 처리할 경우, 면역세포에 대한 종양세포의 면역을 크게 저하시킬 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 5. 자가조립 나노입자(IFDX)의 종양세포 내 거동 평가>
시험관 내(In vitro)에서 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)의 CT26 대장암 세포 내 거동을 살펴보고자 하였다.
구체적으로, 공초점 현미경용 셀 배양 플레이트에 2×104 세포(cell) 농도로 CT26(mouse colon adenocarcinoma) 대장암 세포를 분주하였다. 세포에 각각 DOX 및 IFDX(실시예 1)를 2 μM 농도로 처리한 다음, 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 세포 내에 존재하는 리소좀을 염색할 수 있는 리소좀 트래커(Lysosome Tracker)를 1시간 처리하고, 10 분간 세포 고정액으로 반응시킨 뒤, DAPI로 염색(20 분)하여 공초점 형광 현미경으로 촬영하였다.
도 7은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX) 및 독소루비신(DOX)를 CT26 대장암 세포에 각각 처리한 후, 세포 내 거동을 확인하기 위해, 공초점 형광 현미경으로 촬영한 결과이다. 도 8에서 녹색은 리소좀 트래커로 염색된 리소좀이고, 청색은 DAPI로 염색된 핵이다. DOX는 적색으로 표시된다.
도 7에 따르면, 독소루비신(DOX)을 단독으로 처리한 경우, 녹색 반점으로 표시된 리소좀의 위치와 상관없이 1 시간 내에 세포의 핵에서 발견되는 것을 알 수 있다. 이에 반해 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 초기에는 리소좀과 동일한 위치에서 발견되며, 약 9시간이 흐른 뒤, 세포의 핵의 위치에서 발견됨을 알 수 있다.
즉, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)가 세포 표면에 발현된 PD-L1 수용체에 결합한 뒤 세포 내 진입을 하는 작용 기전을 가진 약물이기 때문에, 항암제인 독소루비신(DOX)과 비교하여 많은 양이 세포의 표면에서 발견된다. 또한, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 종양세포의 표면에 존재하는 수용체에 결합한 후, 리소좀을 통해 세포 내로 안정하게 유입되는 것을 확인할 수 있다. 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)는 종양세포의 PD-L1과 효과적으로 결합하고, 종양세포 내로 리소좀을 통해 유입되는 다중 단계를 거치기 때문에, 보다 암세포에 특이적으로 작용할 수 있다.
<실험예 6. 자가조립 나노입자(IFDX)의 항암 효능 평가>
1) 대장암 동물모델
모든 동물실험은 KIST(the Korea Institute of Science and Technology)의 가이드 라인을 따랐다. 실험쥐는 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하였고, 12시간의 명/암 주기로 사육하였다.
1 × 106 세포(cell) 농도의 MCF7 세포를 6주령의 Balb/c nu/nu 쥐의 왼쪽 허벅다리의 피하 주사하였다. 암 크기가 약 70 내지 100 ㎣ 만큼 성장할 때까지 사육하여 대장암 동물모델을 제조하였다.
2) 투여
대장암 동물모델에 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX), 비교예 1로부터 제조된 FDOX 자가조립 나노입자(FDOX) 및 독소루비신 단독(DOX)으로 3일 간격으로 정맥투여 하였고, 2일 간격으로 종양 크기를 측정하였다. 이때, 투여되는 각 시료의 농도는 2 mg/kg 였다.
비교예 2로부터 제조된 조성물(FDOX combi)과 비교예 3으로부터 제조된 조성물(DOX combi)은 2가지 물질이 포함된 병용 투여 제제로써, 동물모델에 3일마다 1회씩 5분 이내에 병용 투여하여(정맥투여), FDOX combi와 DOX combi군을 제조하였다. 2일마다 종양 크기를 측정하였다.
도 8은 대장암 동물모델에, 실시예 1, 비교예 1, 2, 3 및 독소루비신 단독(DOX)을 각각 투여한 후, 종양크기를 시간별로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(IFDX)가 투여된 대장암 동물모델은 종양의 크기가 현저히 억제되었음을 알 수 있다. 이는 비교예 1, 2, 3 및 독소루비신 단독(DOX)을 투여한 것에 비하여 유의적으로 낮은 수치이다.
상술한 실험결과를 종합하면, 본 발명의 자가조립 나노입자(IFDX)는 PD-L1 수용체에 결합할 수 있는 PD-L1 길항근 펩티드, 카텝신 B에 의해 절단되는 펩티드 및 소수성 항암제와의 결합을 통해, 종양세포의 PD-L1 수용체에 효과적으로 결합을 유도하여 세포내 진입이 용이할 뿐만 아니라 PD-L1 수용체를 효과적으로 차단할 수 있어, 항암 면역 치료효과를 가질 수 있다. 또한, 세포내 진입후 종양세포 특이적으로 과발현하는 효소인 카텝신 B에 의해 분해되어 활성 성분인 항암제(소수성 항암제)와 항종양 면역 상승효과가 일어나, 종양 성장을 현저히 억제할 수 있음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<결론>
종래 항암제 및 면역 관문 억제제인 PD-L1 항체 항암제의 생체 내 낮은 종양 축적 효율, 안정성 및 약물 동력학으로 인해 효율적인 면역치료를 기대하기 어려웠다. 본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위하여 종양세포에 특이적으로 작용하는, 항종양 면역 상승효과를 나타내는 자가조립 나노입자를 개발하였다. 상기 자가조립 나노입자는 서열번호 1 및 3으로 표시되는 양친매성 펩티드와 소수성 항암제가 접합되어 형성된 것으로, 수용액상에서 어떠한 중합체나 담체없이 자가조립을 통해 구형의 나노입자로 존재한다. 상기 나노입자는 평균 직경이 50 nm 이상인 것으로, 종양세포에 특이적으로 과발현하는 카텝신 B에 의해 성공적으로 절단되어 활성화된다는 장점을 갖고 있다.
즉, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 항암제 및 면역 관문 억제제의 생체 내 기능을 크게 향상하여 효율적인 항암 면역치료 효과를 나타내기 때문에, 항암 면역치료가 가능하며, 비활성 상태에서 종양세포 내 과발현하는 카텝신 B 효소에 의해 활성 상태로 전환되어 종양세포를 사멸하기 때문에, 기존 항암제의 정상 세포 및 조직에 대한 독성을 비약적으로 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한, 동물실험을 통해 종양 조직에서 항종양 면역 상승효과를 통해 우수한 항암 효능을 나타내는 것을 확인하였고, 성공적으로 생체 내 종양 조직에 축적되어, 종래 항암제 및 면역 관문 억제제의 병용사용보다 1.5~2배 이상 현저히 우수한 종양 전달 효율를 달성함을 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Cancer-specific self-assembled nanoparticles for enhancing antitumor immunity <130> HPC9247 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-peptide antagonists to target the PD-1/PD-L1 pathway <400> 1 Asn Tyr Ser Lys Pro Thr Asp Arg Gln Tyr His Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiphilic peptides <400> 2 Xaa Arg Arg Gly 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiphilic peptides <400> 3 Phe Arg Arg Gly 1

Claims (11)

  1. 하기 서열번호 1로 표시되는 제1 펩티드와 서열번호 2로 표시되는 제2 펩티드로 이루어진 양친매성 펩티드; 및 소수성 항암제;로 구성된 복합체를 포함하고,
    상기 제1펩티드의 N 말단과 제2펩티드의 C 말단이 결합되고, 상기 양친매성 펩티드의 제2펩티드 C 말단에 상기 소수성 항암제가 결합되는 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 1은 D-형태의 아미노산으로 구성되며, 상기 서열번호 2는 L-형태의 아미노산으로 구성되며, 상기 복합체는 자가조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하며,
    상기 소수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
    [서열번호 1]
    Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe
    [서열번호 2]
    Xaa-Arg-Arg-Gly
    상기 서열번호 2에서,
    Xaa는 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile) 및 프롤린(Pro)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자가조립 나노입자의 평균 직경은 50 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 양친매성 펩티드가 나노입자의 내부 또는 외부 표면에 위치하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 양친매성 펩티드의 C-말단에 소수성 항암제가 공유결합 또는 비공유 결합에 의해 접합된 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자가조립 나노입자는 정상세포에서는 독성을 나타내지 않는 전구약물 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 자가조립 나노입자는 카텝신 B 효소에 의해 제2 펩티드가 분해되어, 소수성 항암제와 제1 펩티드를 방출하고, 암세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  7. 삭제
  8. 제1항에 따른 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암은 위암, 폐암, 비소세포성 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 골암, 비소세포성 골암, 혈액암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 직장암, 항문 부근암, 결장암, 나팔관암, 자궁내막암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 침샘암, 육종암, 가성점액종, 간모세포종, 고환암, 교모세포종, 구순암, 난소생식세포종양, 기저세포암, 다발성골수종, 담낭암, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 복막암, 설암, 소세포암, 소아림프종, 신경모세포종, 십이지장암, 요관암, 성상세포종, 수막종, 신우암, 외음부암, 흉선암, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 암은 재발암(Recurrent cancer) 또는 항암제-내성암(Anticancer drug-resistanced cancer)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 항종양 면역성(Antitumor immunity)과 항종양 활성을 동시에 증진시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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