CN109513010B - 肿瘤细胞特异性响应的自组装药物纳米缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种作为前体药物的药物缀合物，其被在肿瘤组织中特异性表达的组织蛋白酶B降解以释放阿霉素。所述药物缀合物可以形成自组装纳米粒子。此外，所述药物缀合物对肿瘤细胞特异性响应并在肿瘤细胞中被活化。因此，使用所述药物缀合物可以减少在癌症预防或治疗过程中副作用(例如，细胞损伤和细胞凋亡)的发生。

Description

肿瘤细胞特异性响应的自组装药物纳米缀合物
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119要求于2017年09月20日提交到韩国知识产权局的韩国专利申请No.10-2017-0121169的优先权，该申请的公开内容通过引用全部并入本申请中。
技术领域
本发明涉及一种肿瘤细胞特异性响应药物缀合物，更具体地，涉及一种新型的对肿瘤细胞具有酶特异性的药物缀合物的纳米结构，其被肿瘤细胞中存在的酶选择性地降解。
背景技术
癌症是世界各地的主要死因。许多用于癌症的治疗剂已经开发十多年。开发的用于癌症的细胞毒性治疗剂在抑制癌细胞生长或杀死癌细胞方面非常有效，但是具有抑制正常细胞生长和杀死正常细胞的作用，引起严重的副作用。
为了解决这些问题，通过将抗癌剂(例如，阿霉素、紫杉醇和一甲基澳瑞他汀E(MMAE))和与特定蛋白酶特异性反应的肽或连接体缀合以防止抗癌剂对正常细胞起作用，已经开发了靶向肿瘤细胞生长信号传导、受体和基因突变的方法和治疗剂。
然而，在具有短氨基酸序列的蛋白酶特异性肽与药物缀合的癌症用治疗剂的情况下，肽无法设计成使其以在各种肿瘤细胞中表达的特定蛋白酶为靶向，并准确地识别靶向蛋白酶。因此，仍然出现对肿瘤细胞以及正常细胞具有毒性的问题。
靶向特定蛋白酶的肽难以识别大范围的肿瘤细胞和组织，并且累积在对应于特定位点的有限的肿瘤组织中，因此不适合商业化。
为了解决上述问题同时使对正常细胞的损害最小化，需要开发用于癌症的新型治疗剂，其可以特异性识别大范围的肿瘤细胞和组织，包括转移性癌症，可以被输送至肿瘤部位，并且确保药物的优异预防或治疗效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：韩国专利公开No.2003-0096356
发明内容
技术问题
鉴于上述问题而做出本发明，本发明的一个目的是提供一种能够将药物特异性输送至肿瘤细胞中的药物缀合物和自组装纳米粒子。
本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物和保健功能食品组合物，它们各自包含所述药物缀合物或所述自组装纳米粒子作为活性成分。
技术方案
本发明的一个方面提供一种低分子量药物缀合物，其包含被肿瘤细胞中的组织蛋白酶B选择性活化的疏水性药物，并且在溶剂中自发形成球形纳米粒子。
所述药物缀合物可以包含由式1表示的两亲性肽：
[X0]n-X1-X2-X3-X4 (1)
其中，X0、X1和X4各自独立地选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)，X2和X3各自独立地选自精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)，n是0至5的整数，疏水性药物缀合至两亲性肽的一个末端并形成自组装纳米粒子。
在式1中，X1可以是苯丙氨酸(F)，X2和X3可以彼此相同并且可以选自精氨酸(R)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
在式1中，X1可以是苯丙氨酸(F)，X2和X3可以是精氨酸(R)，X0和X4可以选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)。
两亲性肽可以具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中任意一个所示的序列。
所述疏水性药物可以选自紫杉酚、苯达莫司汀、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、多柔比星、道诺霉素、异环磷酰胺、美法仑、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、门冬酰胺酶、卡培他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、放线菌素D、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、聚乙二醇化脂质体阿霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、顺铂、奥沙利铂、阿仑单抗、BCG、贝伐单抗、西妥昔单抗、地诺单抗、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、干扰素、伊匹单抗、拉帕替尼、帕尼单抗、利妥昔单抗、舒尼替尼、索拉非尼、西罗莫司脂化物、曲妥单抗、氯膦酸盐、伊班膦酸、帕米膦酸盐和唑来膦酸。
所述药物缀合物的分子量可以为800Da至3000Da。
所述两亲性肽可以被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解以释放疏水性药物。
本发明的另一方面提供球形自组装纳米粒子，其由所述药物缀合物在溶剂中自发形成，并且具有如下结构：药物缀合物的疏水部分形成核，药物缀合物的亲水部分暴露于所述核的外部。
药物缀合物的两亲性肽可以被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解以释放位于纳米粒子的核的疏水性药物。
溶剂可以选自蒸馏水、磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水、含有0.5％至1％的NaCl的蒸馏水以及含有0.5％至1％的NaCl的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
自组装纳米粒子的平均直径可以为50nm至500nm。
本发明的另一方面提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，其含有所述药物缀合物或所述自组装纳米粒子作为活性成分。
本发明的又一方面提供一种用于预防或减轻癌症的保健功能食品组合物，其含有所述药物缀合物或所述自组装纳米粒子作为活性成分。
有益效果
本发明的药物缀合物是通过在肿瘤组织中特异性表达的组织蛋白酶B降解以释放阿霉素的前体药物。本发明的药物缀合物对肿瘤细胞特异性响应并在肿瘤细胞中被活化。因此，使用所述药物缀合物减少了在癌症预防或治疗过程中副作用(例如，细胞损害和细胞凋亡)的发生。
另外，本发明的药物缀合物可以被组织蛋白酶B分解；由亲水性肽(Arg-Arg，RR)、疏水性氨基酸苯丙氨酸(Phe，F)和甘氨酸(Gly，G)组成，并且阿霉素缀合至两亲性肽；由于形成水性状态的稳定的纳米粒子而稳定，对正常细胞不产生毒性；并且对肿瘤细胞具有特异性预防或治疗效果。
另外，本发明的药物缀合物和自组装纳米粒子可以解决常规癌症用治疗剂遇到的毒性和肿瘤特异性活性的问题。此外，本发明的药物缀合物和自组装纳米粒子在肿瘤细胞中累积而不需要使用载体、媒介物和纳米载体。
附图说明
结合以下附图，根据下面的实施方案的描述，本发明的这些和/或其它方面和优点将变得清楚和更容易理解：
图1A示出了不使用任何合成连接体来合成具有低至约1100Da的分子量的FRRG-DOX的方法，其中，在固相合成技术之后，通过一步法将阿霉素缀合至酰化肽(FRRG)；
图1B示出了在含有生理盐水(0.9％的NaCl)的PBS溶液中通过药物缀合物FRRG-DOX的自组装形成的纳米粒子的TEM图像；
图1C示出了通过动态光散射测量的在含有生理盐水(0.9％的NaCl)的PBS溶液中通过药物缀合物FRRG-DOX的自组装形成的纳米粒子的尺寸分布；
图1D示出了显示实施例1的药物缀合物(FRRG-DOX)的自组装纳米粒子在不同比例的PBS与DMSO的共溶剂中的荧光性的图像(上部)和柱状图，测量它们来观察当添加药物缀合物FRRG-DOX时是否形成自组装纳米粒子；
图1E示出了与组织蛋白酶B培养9小时的过程中实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的HPLC结果；
图1F示出了与其它酶，包括组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶L和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3培养的过程中实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的HPLC结果；
图2A示出了用实施例1的药物缀合物(FRRG-DOX)处理过的肿瘤细胞(HT29人结肠癌细胞、MDA-MB231人乳腺癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞和U87脑癌细胞)和正常细胞(H9C2鼠心肌细胞和人皮肤成纤维细胞(HDF))的共聚焦显微镜图像；
图2B示出了用实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理之后和单独用阿霉素(游离DOX)处理之后，在不同的时间点得到的肿瘤细胞(HT29)和正常细胞(H9C2)的共聚焦显微镜图像；
图2C和图2D分别示出了图2B的定量结果，具体地是用实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理过的肿瘤细胞(HT29)和正常细胞(H9C2)的定量结果；
图2E示出了用不同浓度(0.01μM至500μM)的阿霉素(游离DOX)和实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理过的肿瘤细胞(HT29，上部)和正常细胞(H92C，下部)的细胞活性(％)；
图2F示出了通过蛋白免疫印迹确定的各种癌细胞中组织蛋白酶B的过表达水平；
图2G使用Image J程序对图2F的蛋白免疫印迹结果定量；
图2H示出了依次用对组织蛋白酶B具有抑制作用的lipofectamine-siRNA(脂质体-siRNA)缀合物和药物缀合物(FRRG-DOX)处理过的HT29细胞的共聚焦显微镜图像(“FRRG-DOX+siRNA(Cat-B)”)。此处，红色表示阿霉素，蓝色表示用DAPI染色的细胞核。“FRRG-DOX”示出了未用lipofectamine-siRNA缀合物处理过而是单独用FRRG-DOX处理过的HT29细胞；
图2I对由图2H确定的荧光强度的结果定量；
图3A示意性示出了根据本发明的药物缀合物(FRRG-DOX)的体内作用机理；
图3B示出了将HT29肿瘤接种到肿瘤动物模型的右侧和左侧，并且仅对左侧肿瘤给药组织蛋白酶B siRNA抑制剂之后，在第1天和第15天拍摄的肿瘤动物模型的照片，得到它们来观察动物模型的状况的变化，并且评价组织蛋白酶B siRNA抑制剂在动物模型中的细胞毒性；
图3C示出了在不同时间点从图3B的动物肿瘤模型中切离的肿瘤组织的尺寸；
图3D示出了单独给药阿霉素(游离DOX)、比较例1的RRG-DOX(RRG-DOX)和实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的肿瘤动物模型的阿霉素靶向近红外荧光图像；
图3E示出了在单独给药阿霉素(游离DOX)、比较例1的RRG-DOX和实施例1的药物缀合物(FRRG-DOX)之后，在从肿瘤动物模型切离的肿瘤组织中表达的阿霉素的荧光图像；
图3F示出了图3E的图像的荧光强度；
图3G示出了在单独给药阿霉素(游离DOX)、RRG-DOX和药物缀合物FRRG-DOX之后，从肿瘤动物模型得到的DAPI染色的肿瘤组织的图像，以及阿霉素(DOX)的荧光图像；
图4A示出了在注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中，实施例1的药物缀合物(FRRG-DOX)对肿瘤生长的抑制作用，其通过比较在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后在不同的时间点测量的肿瘤体积(mm3)来分析；
图4B示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，在不同的时间点从注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中切离的肿瘤组织的图像；
图4C示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型在不同的时间点的存活率(％)；
图4D示出了通过膜联蛋白V染色测量的在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，从注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中切离的器官组织的共聚焦激光显微图像，以研究在器官组织中是否发生细胞凋亡。此处，绿色是发生细胞凋亡的膜联蛋白V染色的组织，蓝色是DAPI染色的细胞核；
图4E示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，在作为动物模型的大鼠血液样品中指示心脏损伤的四种典型标记物(包括hs肌钙蛋白-T、肌钙蛋白-I、CK-MM和CPK总数)，检测它们来研究动物模型中的心脏毒性；
图5A示出了在实施例2至4中制备的药物缀合物的化学式；
图5B示出了由在实施例2至4中制备的药物缀合物形成纳米粒子和粒子的测量尺寸；
图5C示出了用阿霉素(DOX)处理过的细胞、用GGGGFRRG-DOX(实施例2)处理过的细胞、用GGFRRGGG-DOX(实施例3)处理过的细胞和用FRRGGGGG-DOX(实施例4)处理过的细胞的共聚焦显微镜图像；
图5D示出了图5C的图像的荧光强度。此处，“细胞溶质”和“细胞核”分别表示在细胞溶质和细胞核中测量的DOX的荧光强度；
图5E示出了用阿霉素(DOX)、GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)或FRRGGGGG-DOX(实施例4)处理后肿瘤细胞(HT29)的细胞活性(％)；
图5F示出了由图5B至图5E的实验结果得到的药物缀合物GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)的细胞内吸收路径；
图6A示出了用FRRG-DOX(实施例1)(0.2μM)和阿霉素(0.1μM)处理过的hiPSC-CM的多电极阵列(MEA)分析结果；
图6B示出了用FRRG-DOX(实施例1)和阿霉素处理过的ICR小鼠的心电图；
图7示出了FRRG-DOX(实施例1)的质子-核磁共振波谱；
图8A和图8B分别示出了FRRG-DOX(实施例1)和G-DOX的MALDI-TOF波谱。
具体实施方式
现在将更详细地描述本发明的若干方面和各种实施方案。
如本文中所使用，术语“肽”指氨基酸残基通过肽键彼此结合的线性分子。
作为参考，典型的氨基酸及其缩写如下：丙氨酸(Ala，A)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、蛋氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp，W)、缬氨酸(Val，V)、天冬酰胺(Asn，N)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Try，Y)、天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)和赖氨酸(Lys，K)。
在制备本发明的药物缀合物中最重要的考虑因素是被组织蛋白酶B特异性降解的两亲性肽和疏水性药物之间的相互作用或关系。换言之，被组织蛋白酶B特异性降解的所有肽都不与疏水性药物有效地缀合，从被组织蛋白酶B特异性降解的肽释放的疏水性药物并不总是保持其对肿瘤细胞的良好作用，或者药物缀合物不能确保理想的效果(例如，高的生物稳定性)。
考虑到两亲性肽与疏水性药物之间的这种相互作用，本发明人特别设计被组织蛋白酶B特异性降解的两亲性肽，改性连接体([X4])，两亲性肽可以通过该连接体有效地与疏水性药物缀合，从而最终完成本发明。
本发明的一个方面提供一种包含由式1表示的两亲性肽的药物缀合物：
[X0]n-X1-X2-X3-X4 (1)
其中，X0、X1和X4各自独立地选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)，X2和X3各自独立地选自精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)，n是0至5的整数，并且疏水性药物缀合至两亲性肽的一个末端。
在式1中，X4可以是单个氨基酸或由一个或多个重复氨基酸组成的肽，例如，G、GG、GGG、GGGG、GGGGG、A、AA、AAA、AAAA或AAAAA。
因此，式1可以由[X0]n-X1-X2-X3-[X4]m(其中，n是0至5的整数，m是1至5的整数)表示。
在本发明的药物缀合物中，两亲性肽由通过肽键彼此结合的亲水性氨基酸(X2和X3)和疏水性氨基酸(X0、X1和X4)组成。所述药物缀合物通过使两亲性肽的疏水性氨基酸(X0、X1和X4)与疏水性药物缀合而制备，由于其对水解的稳定性而不经历在水溶液和粉末形式下的非酶促水解，并且在结构上非常稳定。
两亲性肽通过图1A中所示的一系列步骤制备。两亲性肽可以通过本领域中已知的任何合适的化学合成方法制备，特别是固相合成技术(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54(1963)；Stewart，et al.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd.ed.，PierceChem.Co.：Rockford，111(1984))。对两亲性肽的合成方法没有特别地限制。优选地，两亲性肽通过固相肽合成(SSPS)方法制备，其中，芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护的氨基酸单体依次与具有C端酰胺基的Rink酰胺树脂结合。
优选地，两亲性肽的化学稳定性通过使N-末端氨基乙酰化并且使C-末端酰胺化来增强。
在制备两亲性肽时，可以使用氨基保护基来保护两亲性肽的氨基的氮原子。可以使用本领域中已知的合适的氨基保护基而没有限制，其实例包括：甲氧基羰基、苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、烯丙氧基羰基(allyloxycarbonyl)(Alloc)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、3，4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、二苯甲基、三苯基甲基(Trityl)、(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(Mmt)、二甲氧基三苯甲基(DMT)和二苯基膦基。
在本发明的药物缀合物中，疏水性药物与两亲性肽缀合。两亲性肽与疏水性药物之间的相互作用使药物缀合物稳定，以保护正常细胞免于药物的毒性。这种稳定化显著改善了药物缀合物的体内结构稳定性和溶解度，同时克服和解决了常规癌症用治疗剂遇到的副作用的问题。
换言之，本发明的药物缀合物基本上对正常细胞没有毒性，这是常规癌症用治疗剂的问题，并且对癌症具有增强的治疗效果。本发明的药物缀合物使用阿霉素作为疏水性药物。单独使用阿霉素引起对心脏组织乃至其它有机组织的损害或细胞凋亡。相反，本发明的药物缀合物显著降低了药物对正常细胞的毒性，并且对肿瘤组织具有预防或治疗作用，这通过下面大量的实验例得到证明。
由于其在生理溶液中的高溶解度，本发明的药物缀合物容易被吸收，实现高的生物利用度。此外，本发明的药物缀合物具有改善的对肿瘤细胞的稳定性和特异性，因此在预防或治疗癌症方面有效。
根据本发明的药物缀合物的两亲性肽被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解。结果，疏水性药物以G-DOX的形式释放并被吸收，并且被输送至肿瘤细胞中以抑制肿瘤组织的生长和转移。其它小的肽分子被降解成无毒的小分子，它们参与体内代谢或通过肾脏体外排放。由于这些原因，本发明的药物缀合物高度生物相容。
由式1表示的两亲性肽与疏水性药物彼此缀合的本发明的药物缀合物在水溶液和生理溶液中自组装成更稳定的纳米粒子。由于这种自组装，药物在肿瘤细胞中被特异性活化。由于这些原因，本发明的药物缀合物在治疗上非常有效。
组织蛋白酶B在肿瘤细胞中，特别是在转移性癌症中特异性表达，并且其在正常细胞中的表达受到限制。因此，本发明的组织蛋白酶B靶向药物缀合物在预防或治疗癌症，最优选地为转移性癌症方面有效。
由于组织蛋白酶B在体外基本上不分泌，因此，组织蛋白酶B在除了肿瘤细胞以外的正常细胞中以及在除了肿瘤组织以外的正常组织中为假阳性的可能性非常低。相反，在药物缀合物以蛋白酶而不是组织蛋白酶B为靶向的情况下，难以设计用于检测相应蛋白酶的肽，并且仅对特定位点有特异性的药物缀合物的治疗效果限于特定的癌症疾病，如前列腺癌，并且不扩展至转移性癌症。此外，蛋白酶会在体外分泌，引起假阳性。
在式1中，优选地，X1是苯丙氨酸(F)，X2和X3彼此相同并且选自精氨酸(R)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
在式1中，更优选地，X1是苯丙氨酸(F)，X2和X3是精氨酸(R)，X0和X4选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)。当两亲性肽由[X0]n-F-R-R-[X4]m(n＝0至5，m＝1至5)表示时，其对肿瘤细胞具有最高的特异性而不影响正常细胞。即，最优选地，将序列F-R-R固定在两亲性肽中。在这种情况下，两亲性肽形成纳米粒子，该纳米粒子的尺寸根据与肽F-R-R的一个(例如，右侧)或两个末端结合的氨基酸残基而变化。药物缀合物的疗效也由末端氨基酸残基确定，这通过下面的实验例得到证明。
具体地，当与使用X1缺失或改变的两亲性肽的药物缀合物相比时，本发明的药物缀合物对肿瘤细胞有高度特异性，并且在活化的肿瘤细胞中具有显著提高的药物的协同预防或治疗效果。
式1中的X0用于改善两亲性肽与疏水性药物缀合的药物缀合物的柔韧性。对X0没有特别地限制，只要它不影响肿瘤细胞中疏水性药物的活性即可。X0优选地选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)。X0最优选地为甘氨酸(G)。X0可以不存在于两亲性肽中，但是，即使存在，药物缀合物也可以充分发挥其作用(n为0至5)。药物缀合物在体内生理环境中稳定地流动，确保对肿瘤细胞的特异性，这通过下面的实验例得到证明。
X4充当连接体，两亲性肽通过该连接体与疏水性药物缀合。X4在体内生理环境中保持药物缀合物的稳定缀合状态。当两亲性肽被组织蛋白酶B降解时，X4使得从两亲性肽中分离的疏水性药物完整释放。因此，对连接体X4没有特别地限制，只要它不影响肿瘤细胞中疏水性药物的活性即可。X4优选地选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)，最优选地为甘氨酸(G)。对X4的结合数目(m)没有具体地限制，但是优选为1。当X4的结合数目为1以上时，两个以上的甘氨酸(G)残基结合至被组织蛋白酶B降解的疏水性药物上，减弱疏水性药物在细胞中的药理作用。
根据本发明的一个实施方案，当两亲性肽具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中任意一个所示的序列时，本发明的药物缀合物在实现稳定性、生物相容性、对肿瘤细胞的特异性活性、与正常细胞的生物相容性、抑制副作用以及药物的预防或治疗效果方面最有效：
FRRG (1)
GGGGFRRG (2)
GGFRRGGG (3)
FRRGGGGG (4)
疏水性药物可以选自：紫杉酚、苯达莫司汀、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、多柔比星、道诺霉素、异环磷酰胺、美法仑、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、门冬酰胺酶、卡培他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、放线菌素D、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、聚乙二醇化脂质体阿霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、依托泊苷、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、顺铂、奥沙利铂、阿仑单抗、BCG、贝伐单抗、西妥昔单抗、地诺单抗、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、干扰素、伊匹单抗、拉帕替尼、帕尼单抗、利妥昔单抗、舒尼替尼、索拉非尼、西罗莫司脂化物、曲妥单抗、氯膦酸盐、伊班膦酸、帕米膦酸盐和唑来膦酸。
药物缀合物的分子量优选在800Da至3000Da的范围内。超出所述范围，在水性状态下形成自组装纳米粒子存在限制。即使形成，自组装纳米粒子的尺寸也过度增加，难以进入细胞。
本发明的药物缀合物可以通过使疏水性药物缀合至低分子量的两亲性肽的简单的一步法来制备。相反，如大分子或聚合物一样的具有高分子量的常规药物缀合物通过难以控制条件的复杂工艺以高成本合成。此外，载入或结合至常规药物缀合物中的药物的比例低(＜5％)，导致不令人满意的临床结果。此外，为了得到理想的临床结果需要给予过量的药物，导致对正常细胞的毒性引起的副作用增加。
本发明的药物缀合物可以通过简单的合成方法以非常高的产率制备，而不需要引入任何附加步骤。此外，本发明的低分子量的药物缀合物与肿瘤细胞中存在的酶反应以释放药物。由于这些优点，本发明的药物缀合物在治疗癌症方面比常规癌症用治疗剂更有效。
如前面所描述，当本发明的药物缀合物在体内给药时，两亲性肽在正常细胞或组织中不分解。结果，疏水性药物不被活化并且不暴露于正常细胞的表面。相反，两亲性肽与疏水性药物，或两亲性肽的一些氨基酸与疏水性药物在肿瘤细胞或组织中被细胞中表达的组织蛋白酶B分解。分解的疏水性药物在肿瘤细胞中累积并活化，实现对肿瘤细胞的特异性预防或治疗作用(参见图1A)。
本发明的另一方面提供由所述药物缀合物在溶剂中自发形成的球形自组装纳米粒子，其具有如下结构：药物缀合物的疏水部分形成核，并且药物缀合物的亲水部分暴露于所述核的外部。
药物缀合物分子之间的结合使得自组装纳米粒子稳定且为球形，有效地提高药物的稳定性，提高自组装纳米粒子对肿瘤细胞的特异性响应，并且使自组装纳米粒子能够内服或肠胃外施用。
如图1A中所示，当两亲性药物缀合物在水中溶解时，自组装纳米粒子通过药物缀合物的聚集和自组装形成。
具体地，图1A中示出的纳米粒子为球形，并且由通过彼此连接的药物缀合物分子形成的内膜和外膜组成。纳米粒子的外膜指由彼此连接的药物缀合物的亲水性肽RRG形成的壳，纳米粒子的内膜指由彼此连接的药物缀合物的疏水性氨基酸(F)和疏水性药物形成的核。
构成自组装纳米粒子的药物缀合物在特异性识别肿瘤组织或细胞中起重要作用。由两亲性肽和疏水性药物组成的药物缀合物具有抗癌作用。药物缀合物的结构与上面描述的相同，并且省略对其的描述以避免重复。
药物缀合物的两亲性肽被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解，以释放位于纳米粒子的核中的疏水性药物。
溶剂可以选自蒸馏水、磷酸缓冲溶液、生理盐水、含有0.5％至1％的NaCl的蒸馏水和含有0.5％至1％的NaCl的磷酸缓冲溶液(PBS)。
自组装纳米粒子的平均直径优选在50nm至500nm的范围内。超出所述范围，自组装纳米粒子难以进入细胞，不能起到预防或治疗作用。
本发明的另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述药物缀合物或所述自组装纳米粒子作为活性成分。
本发明的药物组合物中药物缀合物或自组装纳米粒子的含量可以根据诸如疾病的症状和进展以及患者的状况的各种因素适当地调节。基于组合物的总重量，药物缀合物或自组装纳米粒子以30重量％至80重量％，优选地以50重量％至70重量％的量存在，但是不限于此。
作为活性成分的药物缀合物或自组装纳米粒子可以与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起配制。
本发明的药物组合物可以根据适合于各个制剂的常规方法配制成内服制剂，如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂，以及其它制剂，如外用制剂、栓剂和无菌注射液。
适合于根据本发明的药物组合物的制剂的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括，但是不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、水、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
本发明的药物组合物还可以包含选自本领域中常用的稀释剂和赋形剂中的一种或多种药学上可接受的添加剂，如填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。
本发明的药物组合物可以被配制成用于内服给药的固体制剂，如片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊。这种固体制剂可以通过将至少一种赋形剂，如淀粉、蔗糖、乳糖、明胶或碳酸钙与药物缀合物或自组装纳米粒子混合来制备。
本发明的药物组合物可以被配制成用于内服给药的液体制剂，如悬浮剂、内服液体、糖浆剂和乳剂。这种液体制剂可以包含本领域中常用的简单稀释剂如水和液体石蜡，以及各种类型的赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
本发明的药物组合物可以被配制成用于肠胃外给药的制剂。这种用于肠胃外给药的制剂的实例包括：无菌水溶液、非水溶剂、乳剂、悬浮剂、冷冻干燥剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂可以是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油，以及诸如油酸乙酯的可注射酯。可以使用Witepsol、Tween 61、月桂脂肪和甘油明胶作为栓剂的基质。
根据本发明的药物组合物的优选剂量取决于患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物的形式以及给药的途径和时间，但是可以由本领域技术人员适当选择。为了得到理想的效果，作为活性成分的药物缀合物或自组装纳米粒子以对于成人为0.0001mg/kg至100mg/kg，优选地为0.001mg/kg至60mg/kg的量给药。本发明的药物组合物可以每天以单剂量或分剂量给药。考虑到患者的年龄、性别、体重、饮食和排泄率以及目前摄入的其它药物，可以适当增加或减少根据本发明的药物组合物的剂量。本发明的药物组合物考虑活性成分的有效量来制备。本发明的药物组合物可以以单位剂量形式提供。根据需要，可以根据指导或观察给药的专家的判断以及个人要求，使用专门的剂量方案给药单位剂量形式。或者，单位剂量形式可以以规定的时间间隔以分剂量给药。
本发明的药物组合物可以通过多种途径，例如，内服或腹腔内、直肠内、静脉内、肌肉内、皮下或者子宫内或脑内血管内注射而给药于哺乳动物，如大鼠、小鼠、家畜和人。
本发明的药物组合物在预防或治疗常规癌症疾病，包括实体瘤和血液肿瘤方面有效。这种癌症疾病的非限制性实例包括：乳腺癌、卵巢癌、胎盘癌、胃癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、骨癌、头或颈癌、皮肤或眼部恶性黑色素瘤、子宫癌、结肠直肠癌、小肠癌、直肠癌、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、急性或慢性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤和纤维肉瘤。
因此，本发明提供用于预防或治疗上述疾病的药物组合物的用途、用于制备用于预防或治疗上述疾病的药剂的药物缀合物或自组装纳米粒子的用途，以及预防或治疗上述疾病的方法，包括将药学上可接受的量的药物缀合物或自组装纳米粒子给药于包括人的哺乳动物。
在根据本发明的预防或治疗癌症的方法中，由于对肿瘤细胞的高度特异性，所述药物组合物可以通过常规的给药途径给药。对给药途径没有限制，只要药物组合物可以到达目标组织即可。根据其使用目的，本发明的药物组合物可以腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、内服、鼻内、肺内或直肠内给药。然而，对药物组合物的给药途径没有特别地限制。
为了预防或减轻癌症，可以将药物缀合物或自组装纳米粒子添加到食物或饮料中。
当将药物缀合物或自组装纳米粒子用作食品添加剂时，它们可以不经进一步处理而加入，或者可以根据本领域中已知的方法选择性地与其它食物或食物成分一起使用。活性成分的量可以根据它们的使用目的(如预防、保健或治疗目的)适当地确定。当生产食物或饮料时，基于100重量份的食物或饮料的原料，药物缀合物或自组装纳米粒子通常以15重量份以下，优选地以10重量份以下的量添加。在为了健康和卫生或保健的目的而长时间服用食物或饮料的情况下，可以将活性成分的量调节至小于上面限定的下限。活性成分也可以以超过上面限定的上限的量使用，因为它们没有安全问题。
对食物的种类没有特别地限制。含有药物缀合物或自组装纳米粒子的食物的实例包括：肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、饼干、曲奇、披萨、面制品(例如，方便面)、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、汤类、饮料、茶、酒水、酒精饮料和维生素复合物。在广义方面，食物旨在包括保健功能食品。
本发明的保健功能饮料组合物还可以如常规饮料一样，包含各种调味剂或天然糖类。例如，天然糖类可以是：单糖，如葡萄糖和果糖；二糖，如麦芽糖和蔗糖；多糖，如糊精和环糊精；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。保健功能饮料组合物还可以包含天然或合成甜味剂。天然甜味剂包括索马甜和甜叶菊提取物。合成甜味剂包括糖精和阿斯巴甜。
本发明的保健功能食品组合物还可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成和天然香料、着色剂、填充剂(奶酪和巧克力)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和用于碳酸饮料的碳酸化剂。
将参照下面的实施例将更详细地说明本发明。然而，这些实施例不应理解为局限或限制本发明的范围和公开内容。应当理解的是，基于包括下面的实施例的本发明的构思，本领域技术人员可以容易地实施其实验结果没有明确呈现的本发明的其它实施方案。这种修改和变化旨在落入所附权利要求书的范围之内。
下面的实施例(包括比较例)的实验结果仅是代表性的，并且在下文中未明确呈现的本发明的示例性实施方案的效果可以在相应部分中具体找到。
统计学
实验组和对照组之间的差异使用单因素方差分析进行分析，并且被认为具有统计学显著性(图中以星号(*)表示)。
实施例1-4：药物缀合物FRRG-DOX、GGGGFRRG-DOX、GGFRRGGG-DOX和FRRGGGGG-DOX 的合成
Trt-Cl树脂和所有的Fmoc氨基酸购自GL Biochem(中国上海)。偶联剂和分解混合试剂(cleavage cocktail reagents)购自Sigma Aldrich，其它溶剂购自DaejungChemical(韩国)。
使用ASP48S(Peptron，Inc.，韩国)通过Fmoc固相肽合成(SPPS)来合成FRRG(SEQID NO：1)、GGGGFRRG(SEQ ID NO：2)、GGFRRGGG(SEQ ID NO：3)、FRRGGGGG(SEQ ID NO：4)和RRG(SEQ ID NO：5)。
使用Vydac Everest C18色谱柱(250mm×22mm，10μm，USA)通过反相HPLC(Shimadzu prominence HPLC，日本)对肽进行纯化。用含有0.1％(v/v)的三氟乙酸的水-乙腈线性梯度(10％(v/v)至75％(v/v)的乙腈)进行洗脱。通过LC/MS(Shimadzu LC/MS-2020series，日本)确认纯化后的肽的分子量。使用FDT12012(Operon，韩国)将纯化后的肽冻干。
1)两亲性肽FRRG、GGGGFRRG、GGFRRGGG和FRRGGGGG的合成
根据常规固态肽合成方案合成各个肽。使用肽合成仪(ASP48S，Peptron，Inc.，韩国)合成目标氨基酸序列FRRG(SEQ ID NO：1)、GGGGFRRG(SEQ ID NO：2)、GGFRRGGG(SEQ IDNO：3)和FRRGGGGG(SEQ ID NO：4)。使用Fmoc作为用于肽合成的标准氨基酸保护基团。
具体地，用包含20％的哌啶的DMF进行两次摇动10分钟，以除去Fmoc保护基团。在DMF中与Fmoc氨基酸(8当量)、HOBT(8当量)、HBTU(8当量)和DIPEA(16当量)进行偶联2小时。在各阶段中，用DMF和甲醇(各2次)洗涤树脂。
具有所设计的序列的各个肽的合成完成之后，通过与TFA/EDT/茴香硫醚/TIS/DW溶液(90/2.5/2.5/2.5/2.5体积)反应2小时从树脂中分离粗制肽。用冷乙醚使溶液沉淀，通过离心收集颗粒。通过蒸发得到粉末。
将粗制肽溶解在蒸馏水中并用C18色谱柱通过反相HPLC纯化。用含有0.1％(v/v)的三氟乙酸的水-乙腈线性梯度(10％(v/v)至75％(v/v)的乙腈)进行洗脱。将纯化后的肽冻干并储存。
2)药物缀合物的合成
将在1)中制备的各个两亲性肽FRRG、GGGGFRRG、GGFRRGGG和FRRGGGGG溶解在水中，并向其中添加阿霉素。在室温下搅拌混合物24小时。通过反相HPLC(水-乙腈，0.1％的TFA)对得到的肽结构进行纯化。
将阿霉素、肽FRRG和药物缀合物FRRG-DOX溶解在DMSO-d6中，并通过600MHz 1H-NMR(DD 2600MHz FT NMR，Agilent Technologies，USA)确定它们的特征峰以分析它们的化学结构。通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI，AB Sciex TOF/TOF 5800 System，USA)(具有氰基-4-羟基肉桂酸(cyano-4-hydroycinnamic acid)基质)分析FRRG-DOX和G-DOX(从FRRG-DOX分解的肽片段)的分子量。
3)表征
通过NMR表征药物缀合物或两亲性肽。结果，阿霉素和两亲性肽的峰出现在1.1ppm至1.8ppm和6.8ppm至8.4ppm(图7)。FRRG-DOX的MALDI-TOF波谱产生以下结果：m/z计算值：1101.5，实测值：1102.4[M+H+](图8A)。FRRG-DOX被组织蛋白酶B分解的产物，即，G-DOX的MALDI-TOF波谱产生以下结果：m/z计算值：600.6，实测值：602.3[M+2H+]和642.2[M+2H+K+](图8B)。
实施例5：药物缀合物的自组装纳米粒子
在实施例1至4中合成的药物缀合物FRRG-DOX、GGGGFRRG-DOX、GGFRRGGG-DOX和FRRGGGGG-DOX是如下缀合物：疏水性药物缀合至包含疏水性氨基酸和亲水性氨基酸的两亲性肽，并且被组织蛋白酶B特异性降解。药物缀合物在溶剂中自发地形成球形纳米粒子。具体地，球形纳米粒子由彼此连接的药物缀合物分子形成。球形纳米粒子具有如下结构：药物缀合物的疏水部分形成核，并且药物缀合物的亲水部分暴露于核的外部。
将在实施例1至4的药物缀合物中被证实为最有效的实施例1的药物缀合物溶解在不同溶剂中以表征其自组装的纳米粒子。
图1B示出了在含有生理盐水(0.9％的NaCl)的PBS溶液中通过药物缀合物FRRG-DOX的自组装形成的纳米粒子的TEM图像。使用CM-200(Philips，CA，USA)测量TEM图像。
如图1B中所示，可以发现，两亲性肽与疏水性药物阿霉素缀合的实施例1的药物缀合物FRRG-DOX在溶解于生理盐水中时形成自组装纳米粒子。
图1C示出了通过动态光散射测量的在含有生理盐水(0.9％的NaCl)的PBS溶液中通过药物缀合物FRRG-DOX的自组装形成的纳米粒子的尺寸分布。使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments，Worcestershire，U.K)测量尺寸分布。
如图1C中所示，可以发现，实施例1的自组装纳米粒子的平均直径为100nm至1000nm，优选地为50nm至500nm。
图1D示出了显示实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的自组装纳米粒子在不同比例的PBS与DMSO的共溶剂中的荧光性的图像(上部)和柱状图，测量它们来观察当添加药物缀合物FRRG-DOX时是否形成自组装纳米粒子。
如图1D中所示，自组装纳米粒子由实施例1的药物缀合物FRRG-DOX在缓冲液中形成而不使用任何药物载体，并且当使用过量的DMSO时其结构塌陷。
比较例1：药物缀合物RRG-DOX的合成
除了使用根据固态肽合成方案合成的具有SEQ ID NO：5中所示的序列RRG的亲水性肽代替具有SEQ ID NO：1中所示的序列FRRG的亲水性肽之外，以与实施例1中相同的方式制备药物缀合物RRG-DOX。
实验例1：在实施例1中制备的FRRG-DOX对组织蛋白酶B的体外特异性的分析
在该实验例中，研究在实施例1中制备的FRRG-DOX被组织蛋白酶B分解的特异性。首先，将组织蛋白酶B(10μg/ml)溶解于25mM的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸(MES)缓冲液中。将实施例1的药物缀合物FRRG-DOX(100μM)添加到组织蛋白酶B溶液中。将混合物分开后的部分在37℃下培养0小时、1小时、3小时、6小时和9小时。使用C18分析柱(10∶90的H2O∶乙腈至60∶40的H2O∶乙腈)，通过反相HPLC(Agilent Technologies 1200 series，AgilentTechnologies，USA)在210nm处分析已经与组织蛋白酶B反应后的实施例1的药物缀合物20分钟。
使实施例1的药物缀合物与其它酶(10μg/ml的组织蛋白酶D、E和L)反应，以及仅与PBS缓冲液(在这种情况下，得到非酶促水解产物)反应，并且在37℃下通过HPLC分析反应产物9小时。
图1E示出了在与组织蛋白酶B培养9小时的过程中在实施例1中制备的药物缀合物FRRG-DOX的HPLC结果。
如图1E中所示，实施例1的药物缀合物FRRG-DOX在与组织蛋白酶B反应时被组织蛋白酶B成功地分解，并且得到的分解后的肽是从FRRG-DOX释放的G-DOX。分解产物通过MALDI-TOF MS确定。
图1F示出了与其它酶，包括组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶L和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3培养的过程中药物缀合物FRRG-DOX的HPLC结果。
如图1F中所示，实施例1的药物缀合物FRRG-DOX不被除了组织蛋白酶B以外的组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶L和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3降解。即，药物缀合物FRRG-DOX被组织蛋白酶B特异性分解。实施例1的药物缀合物FRRG-DOX在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中非酶促水解，但是发现在磷酸盐缓冲盐水中非常稳定。
实验例2：实施例1的药物缀合物的体外细胞内输送
在该实验例中，观察到阿霉素(游离DOX)和实施例1的FRRG-DOX的细胞内吸收。首先，将HT-29人结肠直肠癌细胞接种在35mm的盖玻片底部培养皿(各1×105个细胞)上，用阿霉素(游离Dox，10μM)和实施例1的FRRG-DOX(10μM)处理，并在37℃的二氧化碳培养箱中培养48小时。
除了使用细胞系U87、A549、MCF7、MDA-MB231、H9C2、HDF和Hela代替HT29细胞之外，重复相同的步骤。用细胞固定剂处理细胞，并通过用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的溶液处理10分钟使细胞核染色。通过共聚焦显微镜观察吸收的阿霉素和4，6-二脒基-2-苯基吲哚。
研究阿霉素在HT29细胞中的表达。为此，用DBCO-Cy5(各5μM)处理培养液并在37℃的培养箱中培养不同的时间。用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞以除去未反应的DBCO-Cy5。用细胞固定剂处理细胞15分钟，并通过用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液处理10分钟使细胞核染色。通过共聚焦显微镜观察与表达的阿霉素结合的DBCO-Cy5的荧光性。
图2A示出了用实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理过的肿瘤细胞(HT29人结肠癌细胞、MDA-MB231人乳腺癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞和U87脑癌细胞)和正常细胞(H9C2鼠心肌细胞和人皮肤成纤维细胞(HDF))的共聚焦显微镜图像(比例尺＝50μm)。
图2B示出了用实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理之后和仅用阿霉素(游离DOX)处理之后，在不同的时间点得到的肿瘤细胞(HT29)和正常细胞(H9C2)的共聚焦显微镜图像(比例尺＝50μm)。
图2C和图2D分别示出了图2B的定量结果，具体地为用实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理过的肿瘤细胞(HT29)和正常细胞(H9C2)的定量结果。
如图2A中所示，研究在肿瘤细胞和正常细胞中FRRG-DOX(实施例1)的功能差异，以确认FRRG-DOX是否被组织蛋白酶B特异性降解并表现出药物毒性。
如图2B、图2C和图2D中所示，观察细胞和细胞核中FRRG-DOX随时间的吸收。结果，在HT29肿瘤细胞和H9C2正常细胞中FRRG-DOX的吸收显著不同。
通过评价阿霉素(游离DOX)和实施例1的FRRG-DOX的细胞毒性来分析体外细胞活性。首先，将HT-29细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中。稳定之后，用不同浓度(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM和200μM)的阿霉素(游离DOX)和实施例1的FRRG-DOX处理HT-29细胞，并在37℃下培养48小时。然后，将10μg的CCK溶液添加到各孔中。进一步培养30分钟之后，使用酶标仪(VERSAmaxTM，Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)分析各个96孔板在450nm处的吸光度。为了比较，以与上述相同的方式测量H9C2细胞(正常细胞)的细胞活性(％)。
图2E示出了用不同浓度(0.01μM至500μM)的阿霉素(游离DOX)和实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理过的肿瘤细胞(HT29，上部)和正常细胞(H92C，下部)的细胞活性(％)。
通过与正常心肌细胞进行比较来确认FRRG对肿瘤细胞的治疗作用。具体地，如图2E中所示，实施例1的FRRG-DOX对正常细胞不表现出毒性，并且选择性地抑制肿瘤细胞的生长。
在肿瘤细胞中，在用实施例1的FRRG-DOX处理过的组和仅用阿霉素(游离DOX)处理过的组之间细胞活性没有实质性差异。在正常细胞中，在用实施例1的FRRG-DOX处理过的组和仅用阿霉素(游离DOX)处理过的组之间细胞活性存在显著差异。
换言之，FRRG-DOX在肿瘤细胞中被组织蛋白酶B成功地分解，结果，活化的药物未在正常细胞核中发现，而是主要在肿瘤细胞核中发现。
当用FRRG-DOX处理时，阿霉素在正常细胞核中不累积，而是在肿瘤细胞核中累积。可以发现，在肿瘤细胞核中累积的阿霉素阻止肿瘤细胞的复制，以抑制肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞。
这些结果得出结论，FRRG-DOX对肿瘤细胞具有体外预防或治疗作用。
通过下面的步骤研究组织蛋白酶B的浓度。首先，将HT-29、A549、MCF7、MDA-MB231、H9C2和HDF细胞(各1×106个)接种并培养在100mm的细胞培养皿中。稳定之后，用DPBS洗涤细胞三次并分散在裂解缓冲液(1％的脱氧胆酸钠、0.1％的SDS、1％的NP-40、25mM的三羟甲基氨基甲烷-HCl(tris-HCl)、150mM的NaCl和1％的蛋白酶抑制剂)中。将收集的裂解物在4℃下以12,000rpm慢速旋转(spun down)10分钟以除去细胞碎片，并使用BCA分析试剂盒对裂解物中的蛋白质浓度定量。将各个样品的定量蛋白质与作为加样缓冲液的十二烷基硫酸钠(SDS)混合，并加热5分钟。之后，在12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离10μg的蛋白质。然后，将分离的蛋白质转移至NC膜中，并在25℃的封闭液(补充有5％的牛血清白蛋白(10mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH为7.4，100mol/L的NaCl和0.1％的Tween 20)的TBST缓冲液)中处理1小时。然后，在4℃下将膜在补充有小鼠抗人组织蛋白酶B抗体的封闭液中培养一夜，用TBST缓冲液洗涤五次，并用补充有0.2μg/ml的兔抗山羊IgG-HRP抗体的封闭液处理。重复洗涤五次。之后，使用ECL系统检测前组织蛋白酶B(37KDa)和组织蛋白酶B(25KDa)带。使用Image J软件测量和分析细胞中组织蛋白酶B的HRP信号强度。
图2F示出了通过蛋白免疫印迹确定的组织蛋白酶B在各种癌细胞中的过表达水平，图2G使用Image J程序对图2F的蛋白免疫印迹结果定量。
如图2F和图2G中所示，与正常细胞中不同，组织蛋白酶B在包括HT29(人结肠腺癌)、MDA-MB231(人乳腺癌)和MDA-MB231(人乳腺癌)细胞的肿瘤细胞中过表达。
组织蛋白酶B在A549(人肺癌)中的表达水平低，但是与其它酶(未示出)相比显著高。相反，在正常细胞中未观察到组织蛋白酶B的实质性表达。
这些结果共同表明，基于仅在肿瘤细胞中表达的组织蛋白酶B的活性，FRRG-DOX的药物被吸收到细胞中。当用FRRG-DOX处理时，阿霉素在包括HT-29、MDA-MB231、MCF7和A549细胞的肿瘤细胞中累积，但是在包括H9C2和HDF细胞的正常细胞中不累积。
常规癌症用治疗剂的最严重的问题是它们在正常细胞以及肿瘤细胞中的毒性。特别地，阿霉素最严重的副作用是对心脏细胞有毒性。FRRG-DOX对H9C2细胞、新生心肌细胞不表现出活性，并且阿霉素在细胞核中不累积。
这些结果得出结论，FRRG-DOX被适当地设计为对肿瘤细胞非常特异性地响应，并且具有清楚地区分肿瘤细胞和正常细胞的功能。此外，药物缀合物FRRG-DOX可以解决常规癌症用治疗剂的问题，并且具有提供具有显著改善的稳定性和特异性的新型癌症用治疗剂的潜力。
实验例3：使用组织蛋白酶B抑制剂评价FRRG-DOX的阿霉素在癌细胞中的表达效率
在该实验例中，研究实施例1的FRRG-DOX对组织蛋白酶B的特异性。为此，使含有lipofectamine 2000的组织蛋白酶B siRNA(150nM)在37℃下反应30分钟以制备lipofectamine-siRNA缀合物。
将1×105个HT-29人源性结肠直肠癌细胞接种在35mm的盖玻片底部培养皿中，培养24小时，用lipofectamine-siRNA缀合物(50μg/L)处理，培养4小时，用实施例1的FRRG-DOX(5μM)处理，并在37℃的二氧化碳培养箱中培养24小时。
将处理过的HT-29细胞用DPBS洗涤两次，在黑暗中在10％的甲醛中固定20分钟，用DPBS洗涤，并在室温下用Hoechest(No.33258)染色10分钟。使用405二极管(405nm)、Ar(458nm、488nm和514nm)激光和He-Ne(633nm)激光在共聚焦激光显微镜(Leica TCS SP8，Leica Microsystems GmbH)下观察细胞。使用Image J软件(National Institutes ofHealth(NIH)，Bethesda，USA)分析细胞中药物缀合物和阿霉素的NIRF信号强度。
图2H示出了在不同的条件下用FRRG-DOX处理过的HT29细胞的共聚焦显微镜图像。
在图2H中，“FRRG-DOX”表示用FRRG-DOX处理而未用lipofectamine-siRNA缀合物处理HT29细胞，“FRRG-DOX+Z-FA-FMK”表示用Z-FA-FMK(组织蛋白酶活性抑制剂)和随后的FRRG-DOX处理HT29细胞，“FRRG-DOX+siRNA(Cat-B)”表示用对组织蛋白酶B具有抑制作用的lipofectamine-siRNA缀合物和随后的FRRG-DOX处理HT-29细胞。红色表示阿霉素，蓝色表示用DAPI染色的细胞核。
图2I对由图2H确定的荧光强度的结果定量。
如图2H和图2I中所示，当用对组织蛋白酶B具有抑制作用的小干扰RNA(siRNA)和lipofectamine 2000的缀合物处理HT-29细胞，然后用药物缀合物处理时，吸收到细胞核中的阿霉素的量减少。特别地，当比较吸收到和积累在细胞中的阿霉素的数值时，这种差异变得明显。
这些结果表明药物缀合物FRRG-DOX对组织蛋白酶B的特异性活性。总之，药物缀合物FRRG-DOX被肿瘤细胞中表达的组织蛋白酶B特异性分解以输送药物并将药物释放到细胞中。
实验例4：通过直接注入肿瘤动物模型的组织中来评价FRRG-DOX的阿霉素的表达 效率
按照韩国科学技术研究院(KIST)的指导方针并经机构委员会的批准进行动物实验。
从Nara Bio INC(Gyeonggi-do，韩国)购买5.5周龄的雄性无胸腺裸鼠(20g至25g)。将1×107个HT-29细胞接种到每只雄性裸鼠(n＝6)的两个大腿中以构建肿瘤动物模型。接种5周之后，肿瘤尺寸达到250mm3至300mm3。
首先，研究组织蛋白酶B在肿瘤组织中的活性。当肿瘤动物模型的肿瘤尺寸达到250mm3至300mm3时，将对组织蛋白酶B具有抑制作用的组织蛋白酶B siRNA直接注射到肿瘤组织中。1天后，将实施例1的FRRG-DOX每天两次(每次4mg/kg)注射到两个肿瘤组织中。再过1天后，静脉内给药100μg的氮杂二苯并环辛炔-Cy5.5(DBCO-Cy5.5)(200μL)以在肿瘤组织中表达的阿霉素为靶向。给药后6小时，记录近红外荧光图像。切离器官并测量其中残留的荧光性。使用Living Image软件(PerkinElmer，USA)对肿瘤ROI中的NIRF强度定量。
构建肿瘤组织的冷冻切片，并在共聚焦显微镜下观察其中残留的荧光性。以与实验例1、2和3中提出的相同的方式进行分析过程。
图3A示意性示出了药物缀合物FRRG-DOX的体内作用机理。基于FRRG-DOX(实施例1)的纳米粒子可以通过EPR效应在肿瘤组织中累积。这是因为，由于存在苯丙氨酸和精氨酸，两亲性肽有助于纳米粒子的形成。此外，即使不使用连接体，由药物缀合物FRRG-DOX自发形成的自组装纳米粒子仍保持其柔韧性和稳定性。因此，自组装纳米粒子作为药物载体和前体药物非常有效。
图3B示出了将HT29肿瘤接种到肿瘤动物模型的右侧和左侧，并仅对左侧肿瘤给药组织蛋白酶B siRNA抑制剂之后，在第1天和第15天拍摄的肿瘤动物模型的照片，得到它们来观察动物模型的状况的变化，并且评价动物模型中组织蛋白酶B siRNA抑制剂的细胞毒性。图3C示出了在不同的时间点从图3B的动物肿瘤模型中切离的肿瘤组织的尺寸。
如图3B和图3C中所示，当组织蛋白酶B抑制剂与实施例1的FRRG-DOX一起给药时，视觉上观察不到抗癌作用。相反，当用实施例1的FRRG-DOX处理未用组织蛋白酶B抑制剂处理过的肿瘤组织时，发现肿瘤组织的尺寸与正常组织的尺寸相似。这些结果表明，如在肿瘤细胞中一样，在肿瘤组织中存在大量的组织蛋白酶B，并且在组织蛋白酶B基本上不表达的其它正常组织中阿霉素不累积。
参照图3C，组织蛋白酶B抑制性siRNA的施加减少了肿瘤组织中FRRG-DOX的活化，结果，与未给药组织蛋白酶B siRNA而是给药FRRG-DOX后的肿瘤尺寸相比，肿瘤尺寸增大5倍。从这些结果可以得出结论，药物缀合物FRRG-DOX仅在组织蛋白酶B的存在下被活化。
更详细地研究FRRG-DOX的选择性活化。为此，用组织蛋白酶B抑制性siRNA处理左侧肿瘤组织，右侧肿瘤组织不用组织蛋白酶B抑制性siRNA处理。使用能够进行组织蛋白酶B检测的探针测量从两侧切离的肿瘤组织的平均照射值(荧光强度)。结果，仅在右侧肿瘤组织(未示出)中保留组织蛋白酶B的活性。这些实验结果是图3的实验的延伸，并且可以确认，目标组织蛋白酶B仅在肿瘤组织中表达并且所使用的组织蛋白酶B siRNA有效地抑制组织蛋白酶B，使得使用组织蛋白酶B siRNA的实验结果可靠。
实验例5：通过对肿瘤动物模型-1静脉内给药来评价FRRG-DOX的阿霉素的表达效 率
在该实验例中，研究阿霉素(游离DOX)和实施例1的FRRG-DOX的体内抗癌作用。首先，将1×107个HT-29细胞直接注入在1)中构建的各个肿瘤动物模型的右侧(每组n＝4)。当肿瘤尺寸达到约250mm3至300mm3时，每三天一次静脉内给药阿霉素(游离DOX，5mg/kg)和实施例1的FRRG DOX(5mg/kg)，持续15天。
每三天一次将DPBS(各200μl)静脉内注射到肿瘤动物模型中，持续15天(对照)。
通过测量肿瘤体积(最大直径×最小直径为2×0.53)来比较游离DOX、FRRG-DOX和对照的治疗效果，持续15天。每天一次测量肿瘤动物模型的活性和重量，持续15天。使用IVIS Lumina Series III(PerkinElmer，Massachusetts，USA)监测肿瘤动物模型的肿瘤组织中游离DOX和FRRG-DOX的累积。使用Living Image软件(PerkinElmer，Massachusetts，USA)对肿瘤组织中游离DOX和FRRG-DOX的荧光强度定量。
图3D示出了单独给药阿霉素(游离DOX)、比较例1的RRG-DOX(RRG-DOX)和实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的肿瘤动物模型的阿霉素靶向近红外荧光图像。
图3E示出了在单独给药阿霉素(游离DOX)、比较例1的RRG-DOX和实施例1的药物缀合物(FRRG-DOX)之后，在从肿瘤动物模型切离的肿瘤组织中表达的阿霉素的荧光图像。
图3F示出了来自图3E的图像的荧光强度。
如图3D、图3E和图3F中所示，肿瘤动物模型的荧光强度存在显著差异。当不仅直接给药而且静脉内给药实施例1的FRRG-DOX时，阿霉素可以在肿瘤组织中特异性表达。此外，在肿瘤组织中表达的阿霉素的靶向能够实现有效的肿瘤标记。
如图3E中所示，静脉内给药FRRG-DOX之后，从动物模型切离的肿瘤组织中观察到更高的荧光强度。
相反，比较例1的RRG-DOX在结构上与实施例1的FRRG-DOX类似，但是，与单独用阿霉素处理时相比，用比较例1的RRG-DOX处理时观察到低的荧光强度。这些结果表明，当实施例1的FRRG-DOX的肽的任何一个氨基酸缺失或改变时，FRRG-DOX对肿瘤细胞没有特异性活性。
总之，FRRG-DOX被肿瘤组织中存在的组织蛋白酶B特异性降解引起药物(阿霉素；G-DOX)仅在肿瘤组织中累积。此外，自组装纳米粒子的形成引起肿瘤组织中阿霉素的浓度增加。
图3G示出了在单独给药阿霉素(游离DOX)、RRG-DOX和药物缀合物FRRG-DOX之后，从肿瘤动物模型得到的DAPI染色的肿瘤组织的图像，以及阿霉素(DOX)的荧光图像。
如图3G中所示，实施例1的FRRG-DOX通过EPR效应在肿瘤组织中被特异性活化，结果，阿霉素在肿瘤组织中累积。相反，当用比较例1的RRG-DOX或仅用阿霉素处理时，阿霉素不能有效地在组织中累积。
实验例6：通过对肿瘤动物模型-2静脉内给药来评价FRRG-DOX的阿霉素的表达效 率
在该实验例中，研究阿霉素(游离DOX)和实施例1的FRRG-DOX的体内抗癌作用。首先，将1×107个HT-29细胞直接注射到在1)中构建的各个肿瘤动物模型的右侧(每组n＝4)。当肿瘤尺寸达到约200mm3时，每三天一次通过尾静脉注射给药阿霉素(游离DOX，5mg/kg)和实施例1的FRRG DOX(5mg/kg)，持续15天。
每三天一次通过尾静脉将DPBS(200μl)注入肿瘤动物模型中，持续15天(对照)。
通过测量肿瘤体积(最大直径×最小直径为2×0.53)来比较游离DOX、FRRG-DOX和对照的治疗效果，持续15天。每天一次测量肿瘤动物模型的活性和重量，持续15天。使用IVIS Lumina Series III(PerkinElmer，Massachusetts，USA)监测肿瘤动物模型的肿瘤组织中游离DOX和FRRG-DOX的累积。使用Living Image软件(PerkinElmer，Massachusetts，USA)对肿瘤组织中游离DOX和FRRG-DOX的荧光强度定量。
图4A示出了在注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中，实施例1的药物缀合物FRRG-DOX对肿瘤生长的抑制作用，其通过比较在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后在不同的时间点测量的肿瘤体积(mm3)来分析。图4B示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，在不同的时间点从注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中切离的肿瘤组织的图像。
图4A和图4B表明药物缀合物FRRG-DOX在肿瘤动物模型中的治疗作用和副作用。如图4A和图4B中所示，单独给药阿霉素(游离DOX)和给药药物缀合物FRRG-DOX被证实显著抑制肿瘤生长。在阿霉素处理组(游离DOX)中观察到对正常细胞的毒性，而在药物缀合物给药组(FRRG-DOX)中未观察到毒性。
换言之，在单独给药阿霉素的组和给药实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的组中观察到对肿瘤的良好抑制作用。阿霉素和FRRG-DOX对肿瘤的抑制作用可以被确定为对癌组织中的癌的治疗作用。
图4C示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型在不同的时间点的存活率(％)。
如图4C中所示，单独用阿霉素(DOX)处理后，肿瘤动物模型的重量开始下降，并且由于阿霉素对正常细胞的毒性，最终，其死亡率开始迅速增加。相反，当给药实施例1的药物缀合物FRRG-DOX时，动物肿瘤模型的存活率(％)保持恒定为100％达16天。只要不受年龄的实质影响，预计即使在16天后也不会由肿瘤疾病引起死亡。
这些结果得出结论，由于以药物缀合物FRRG-DOX形式注射的阿霉素仅在肿瘤组织中被活化，因此，其抑制肿瘤组织的生长和转移而不引起对正常细胞的毒性。换言之，可以认为，药物缀合物FRRG-DOX基本上没有常规药物载体或药物的副作用。
进行膜联蛋白V染色来确认在从肿瘤动物模型切离的肿瘤组织中发生细胞凋亡。首先，将切离的肿瘤组织的切片(10μm)用DPBS洗涤三次，在37℃下用膜联蛋白V溶液(200μl的含有5μl的膜联蛋白V-Cy5.5的结合缓冲液)培养20分钟，在室温下与DAPI培养15分钟，置于盖玻片上，并在共聚焦激光显微镜下观察。
图4D示出了通过膜联蛋白V染色测量的在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，从注射过HT29肿瘤的肿瘤动物模型中切离的器官组织的共聚焦激光显微图像，以研究在器官组织中是否发生细胞凋亡。在图4B中，绿色是发生细胞凋亡的膜联蛋白V染色的组织，蓝色是DAPI染色的细胞核。
本发明旨在提供一种用于有效地预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物抑制常规癌症用治疗剂遇到的毒性和副作用，确保长期服用的稳定性，并且可以防止由于给药时的二次副作用引起的死亡。鉴于此，如图4D中所示，评价单独用阿霉素和实施例1的药物缀合物FRRG-DOX处理肿瘤动物模型对其它器官的影响。
如图4D中所示，在单独给药阿霉素(游离DOX)的肿瘤动物模型的心脏、脾脏和肿瘤组织中均观察到细胞凋亡。相反，仅在给药实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的肿瘤动物模型的肿瘤组织中观察到细胞凋亡。
图4E示出了在单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX之后，在肿瘤动物模型的血液样品中指示心脏损伤的四种典型标记物(包括hs肌钙蛋白-T、肌钙蛋白-I、CK-MM和CPK总数)，检测它们来研究动物模型中的心脏毒性。
进行观察是否由单独给药阿霉素(DOX)或药物缀合物FRRG-DOX引起心脏损伤。如图4E中所示，在单独给药阿霉素(游离DOX)的肿瘤动物模型中观察到更高水平的所有标记物。相反，与对照(生理盐水)相比，在给药实施例1的药物缀合物FRRG-DOX的肿瘤动物模型中观察到的指示心脏损伤的标记物的水平低约两倍或与之相当。
实验例7：在实施例2至4中制备的药物缀合物在肿瘤动物模型中的特性和药理作 用的评价
在该实验例中，研究实施例1的FRRG DOX和具有与FRRG DOX的氨基酸序列相似的氨基酸序列的实施例2至4的药物缀合物的物理性能和抗肿瘤效果。图5A示出了在实施例2至4中制备的药物缀合物的化学式。
图5B示出了由在实施例2至4中制备的药物缀合物形成纳米粒子和粒子的测量尺寸。
如图5B中所示，具有与实施例1的FRRG-DOX的结构相似的结构的GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)形成不同尺寸的纳米粒子。
具体地，测量的GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)的尺寸分别为200nm至600nm，50nm至200nm，以及300nm至700nm。
图5C示出了用阿霉素(DOX)处理过的细胞、用GGGGFRRG-DOX(实施例2)处理过的细胞、用GGFRRGGG-DOX(实施例3)处理过的细胞和用FRRGGGGG-DOX(实施例4)处理过的细胞的共聚焦显微镜图像。图5D示出了来自图5C的图像的荧光强度。在图5D中，“细胞溶质”和“细胞核”分别表示在细胞溶质和细胞核中测量的DOX的荧光强度。
如图5C和图5D中所示，GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)表现出抗肿瘤作用或细胞内吸收作用。
具体地，其序列包含位于FRR下游的四个以上的连续甘氨酸(G)残基的FRRGGGGG-DOX(实施例4)不容易被吸收到细胞中，这解释了为什么优选使用FRRG-DOX(实施例1)、GGGGFRRG-DOX(实施例2)或GGFRRGGG-DOX(实施例3)。
其序列包含位于FRR下游的三个连续的甘氨酸(G)残基的GGFRRGGG-DOX(实施例3)容易被吸收到细胞中，但是细胞核对其的吸收比对实施例1和2的药物缀合物的吸收低10倍，这解释了为什么优选使用FRRG-DOX(实施例1)或GGGGFRRG-DOX(实施例2)。
图5E示出了用阿霉素(DOX)、GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)处理后肿瘤细胞(HT29)的细胞活性(％)。
由于存在许多与亲水氨基酸苯丙氨酸(F)结合的氨基酸，因此，FRRGGGGG-DOX(实施例4)不容易被吸收到细胞中。因此，优选地，表示本发明的药物缀合物的两亲性肽的式1中的n大于1。
确认GGGGFRRG-DOX(实施例2)表现出与DOX相同的抗肿瘤效果。FRRG-DOX(实施例1)和GGGGFRRG-DOX(实施例2)在抗肿瘤作用中最有效。
图5F示出了由图5B至图5E的实验结果得到的药物缀合物GGGGFRRG-DOX(实施例2)、GGFRRGGG-DOX(实施例3)和FRRGGGGG-DOX(实施例4)的细胞内吸收路径。
实验例8：在实施例2至4中制备的药物缀合物在肿瘤动物模型中的特性和药理作 用的评价
1)多电极阵列(MEA)分析
通过下面的步骤进行多电极阵列分析。首先，将人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC-CM，Cellular Dynamics International[CDI]，Madison，WI，USA)在100mm的培养皿中解冻。1周后，将解冻的hiPSC-CM接种在涂布有纤连蛋白溶液(50μg/ml)的MEA板中。在解冻后的第2天，用维持培养基(CDI)替换平板培养基。维持培养基每2至3天用新维持培养基更换一次。仅50％的培养基被新培养基替换。接种在板中2周后，使用Maestro system(Axion Biosystems Inc.，Atlanta，GA，USA)记录自发搏动的心肌细胞的场电位。在平衡期之后，记录细胞外场电位的波形10分钟。对峰间间隔(inter-spike interval)和细胞外场电位持续期(FPD)进行分析和定量。为了使搏动率对FPD的影响最小化，使用Fridericia公式1计算校正的FPD(FPDcF)：
FPDcF＝FPD/[峰间间隔]1/3 (1)
2)心电图(ECG)分析
ECG分析经过机构动物管理及使用委员会的批准在韩国毒理学研究所进行。所有步骤根据美国国立卫生研究院关于实验室动物管理和使用的指南进行。以2cc/分钟的速率对ICR小鼠(25g至35g，Orient Bio Inc.，Seoul，韩国)注射作为麻醉气体的异氟烷与氧气的混合物。在将麻醉气体注入动物生物放大器(ADInstruments Pty Ltd，Bella Vista，澳大利亚)中之前测量ECG。测量的ECG被定义为基线。注射麻醉气体后6小时，测量ECG。对所有小鼠静脉注射生理盐水、5mg/kg的阿霉素(在生理盐水中)或10mg/kg的FRRG-阿霉素(实施例1)(在生理盐水中)。使用LabChart 8软件(ADInstruments Pty Ltd，Bella Vista，澳大利亚)分析测量的ECG数据。使用Van de Water公式2和Bazett公式3计算校正的QT(QTc)：
QTc-V＝0.087[(60/HR)-1] (2)
QTc-B＝QT/(RR)1/2 (3)
3)心电图相关的毒性分析结果
图6A示出了用FRRG-DOX(实施例1)(0.2μM)和阿霉素(0.1μM)处理过的hiPSC-CM的多电极阵列(MEA)分析结果。
如图6A中所示，与基线相比，单独用阿霉素处理过的hiPSC-CM的FPD和FPDcF显著低，而用FRRG-DOX(实施例1)处理过的hiPSC-CM的FPD和FPDcF基本上保持不变。即，与直接使用阿霉素时相比，当使用FRRG-DOX(实施例1)时心脏毒性显著降低。
图6B示出了用FRRG-DOX(实施例1)和阿霉素处理过的ICR小鼠的心电图。
如图6B中所示，与在对照中测量的相比，用5mg/kg的阿霉素处理过的ICR小鼠中测量的QTc值扩大。相反，检测到用FRRG-DOX(实施例1)处理过的ICR小鼠中测量的QTc值与对照中测量的相似。总之，由于药物缀合物FRRG-DOX(实施例1)仅在实验动物的肿瘤部位被活化，因此，它对包括心脏、肝脏、肾脏和脾脏的正常器官没有毒性。
总而言之，药物缀合物FRRG-DOX表现出肿瘤特异性预防或治疗效果，这通过动物实验得到证实。此外，可以确认，药物缀合物FRRG-DOX是稳定的药物，对其它器官组织甚至生命没有毒性。此外，药物缀合物FRRG-DOX可以以非常简单的方式制备，因此，从经济性观点来看有利。
Figure ISA0000162086130000011
Figure ISA0000162086130000021

Claims (9)

1.一种低分子量药物缀合物，包含：两亲性肽；以及被肿瘤细胞中的组织蛋白酶B选择性活化的疏水性药物，所述药物缀合物在溶剂中自发形成球形纳米粒子，
所述疏水性药物缀合至所述两亲性肽的C-末端，
其中，所述两亲性肽的序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2中任意一个所示的序列。
2.根据权利要求1所述的药物缀合物，其中，所述疏水性药物选自：吉西他滨、甲氨蝶呤、阿霉素、表柔比星、米托蒽醌、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、卡铂、顺铂和奥沙利铂。
3.根据权利要求1所述的药物缀合物，其中，所述药物缀合物的分子量为800Da至3000Da。
4.根据权利要求1所述的药物缀合物，其中，所述两亲性肽被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解以释放所述疏水性药物。
5.球形自组装纳米粒子，该球形自组装纳米粒子由权利要求1所述的药物缀合物在溶剂中自发形成，并且具有如下结构：所述药物缀合物的疏水部分形成核，所述药物缀合物的亲水部分暴露于所述核的外部。
6.根据权利要求5所述的球形自组装纳米粒子，其中，所述药物缀合物的两亲性肽被肿瘤细胞中存在的组织蛋白酶B降解以释放位于纳米粒子的核的疏水性药物。
7.根据权利要求5所述的球形自组装纳米粒子，其中，所述溶剂选自蒸馏水、磷酸盐缓冲液(PBS)和生理盐水。
8.根据权利要求5所述的球形自组装纳米粒子，其中，所述溶剂选自含有0.5％至1％的NaCl的蒸馏水以及含有0.5％至1％的NaCl的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
9.根据权利要求5所述的球形自组装纳米粒子，其中，所述球形自组装纳米粒子的平均直径为50nm至500nm。
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