CN117599013A - 纳米组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及纳米组合物及其制备方法和用途。所述纳米组合物由含有色氨酸二肽基元的寡肽和顺铂自组装形成，所述寡肽的通式为Xaa1‑Xaa2‑Xaa3‑Xaa4‑Xaa5‑Xaa6‑W‑W‑Xaa7‑Xaa8‑Xaa9‑Xaa10‑Xaa11‑Xaa12，其中W为色氨酸；以及Xaa1‑Xaa12各自独立地不存在或表示任意氨基酸残基。所述纳米组合物的制备条件温和、操作简单，环境友好等，适合工业化生产，可实现对药物的高效负载。所述纳米组合物可以用于抗肿瘤药物的制备。

Description

纳米组合物及其制备方法和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年8月22日提交中国专利局的第202211006334.0号和第202211005108.0号中国专利申请的优先权，将所述中国专利申请的公开内容通过援引加入的方式整体并入本文，用于所有目的。
技术领域
本公开内容涉及生物医药领域，尤其是涉及由包含色氨酸二肽基的寡肽和顺铂形成的自组装纳米组合物及其制备方法和用途。
背景技术
随着纳米技术在生物医药领域的广泛应用，基于各种高分子、无机或脂质材料所构建的纳米载运系统在实现药物的体内有效递送方面显示出极具潜力的应用价值和开发前景。与游离药物溶液相比，纳米载运系统具有改善药物体内过程、调节释药速率、增强病灶组织靶向性、提高生物利用度和降低药物毒副作用等优势。
然而，基于传统材料构建的纳米载运系统由于尺寸小、比表面积大，要实现对临床有效治疗剂量药物(尤其是化学小分子药物)的完全包封通常需要较大比例的载体材料，从而导致载药量低(<10％)、制备工艺复杂、缺乏重复性和可控性，难以实现大规模生产和临床转化。另外，体内连续引入大量高分子或无机类载体材料不可避免会带来因降解缓慢或代谢产物有毒等所致的蓄积毒性。近年来阳离子脂质纳米载体以其良好的生物降解性和制备可重复性而在核酸类药物的递送中受到青睐，但仍存在细胞转染效率不高和有一定细胞毒性等问题，从而在一定程度上影响了其在临床治疗上的使用。
顺铂，又名顺式-二氯二氨合铂，是一种含铂的抗癌药物，临床上对卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。但顺铂用于治疗癌症有一定的毒性，会引起副作用。
因此，在生物医药领域迫切需要开发新的生物相容性载体来推动基于顺铂的纳米药物的规模化生产和临床转化。
发明内容
为了解决上述技术问题，本公开内容提供了色氨酸二肽基自组装纳米组合物及其制备方法和用途，即利用色氨酸二肽所提供的具有芳香电子结构的吲哚环与药物(例如，顺铂)通过π-π相互作用驱动自组装形成纳米颗粒。该构建方式有别于传统的载体物理包埋，可实现对药物的高效负载，并避免了共价交联对药物活性的影响；同时色氨酸多肽基元可促进药物的内体逃逸及在胞质中的有效累积。
在一方面，本公开内容提供了纳米组合物，所述纳米组合物由含有色氨酸的寡肽和顺铂自组装形成。
在一些实施方案中，寡肽的通式可以是
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-W-W-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12，其中，W是色氨酸；以及Xaa1-Xaa12可以各自独立地不存在或表示任意氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述寡肽可以选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸、色氨酸-色氨酸-甘氨酸、色氨酸-色氨酸-丝氨酸、色氨酸-色氨酸-组氨酸、色氨酸-色氨酸-赖氨酸、色氨酸-色氨酸-酪氨酸、色氨酸-色氨酸-半胱氨酸、色氨酸-色氨酸-苏氨酸，优选地，所述寡肽可以选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸。
在一些实施方案中，所述纳米组合物可以是色氨酸-色氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-顺铂或色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂；优选地，所述纳米组合物可以是色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂。
在一些实施方案中，所述纳米组合物的载药量可以是约20％至约60％，优选是约24％至约55％，更优选是约24％至约50％。
在一些实施方案中，所述纳米组合物粒径可以是10-1000nm，优选是20-200nm。
在另一方面，本公开内容提供了包含上述纳米组合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂选自粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂和着色剂中的一种或多种。
在又一方面，本公开内容提供了上述纳米组合物的制备方法，包括：将寡肽分散于水相C中，然后加入顺铂，获得混合液C，将混合液C避光高速搅拌，去除溶剂，得到所述纳米组合物的胶体溶液。
在一些实施方案中，所述寡肽与顺铂的摩尔比可以是约0.25-20:1，优选是约0.5-20:1，优选是约1-5:1，更优选是约1-2:1。
在一些实施方案中，所述纳米组合物的包封率可以是约35％至约99％，优选是约67.5％至约99％，更优选是约80％至约99％。
在一些实施方案中，所述水相C选自纯化水、注射用水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液或磷酸缓冲盐(PBS)缓冲液中的一种或多种；优选地，所述水相C是HEPES缓冲液；更优选的，所述水相C的pH为5-9。
在一些实施方案中，所述方法还包括添加分散剂的步骤。
在一些实施方案中，所述分散剂选自mPEG2K-NHS、血清白蛋白、磷脂聚乙二醇(depe-peg2000)、卵磷脂、聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga-peg)中的一种或多种；优选地，所述分散剂是mPEG2K-NHS。
在一些实施方案中，在将寡肽分散于水相C中之后，还包括于水相D中透析的步骤。
在一些实施方案中，所述水相D选自纯化水、注射用水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液或磷酸缓冲盐(PBS)缓冲液中的一种或多种；优选地，所述水相D是注射用水。
在一些实施方案中，将混合液C在40-60℃下，优选地在50℃下避光高速搅拌。
在一些实施方案中，去除混合液C中的溶剂采用减压蒸发法、高速离心法、透析法或超滤法，优选使用减压蒸发法。
在一些实施方案中，所述方法可以还包括添加冻干保护剂，冷冻干燥得到固体粉末的步骤。
在一些实施方案中，所述冻干保护剂可以选自蔗糖、海藻糖和甘露醇中的一种或多种；优选地，所述冻干保护剂可以是蔗糖。
在另一方面，本公开内容提供了上述纳米组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
在又一方面，本公开内容提供了上述纳米组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
在另一方面，本公开内容提供了用于治疗肿瘤的上述纳米组合物或上述药物组合物。
在又一方面，本公开内容提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的对象给予包含上述纳米组合物的药物或上述药物组合物，例如治疗有效量的包含上述纳米组合物的药物或上述药物组合物。
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。
在一些实施方案中，所述肿瘤是肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肾上腺皮质癌、皮肤鳞癌、头颈部癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤或神经母细胞瘤。
附图说明
包括附图以提供对本公开内容的进一步理解，以及将附图并入本文以构成本公开内容的一部分，由此附图连同相关描述一起用于解释本公开内容的构思。在附图中：
图1为实施例1中所制备的WWE的ESI-MS图；
图2为实施例1中所制备的WWE的1H NMR图；
图3为实施例1中所制备的P-DDP纳米组合物的透射电子显微镜照片；
图4为实施例1中所制备的P-DDP纳米组合物的粒度分布图；
图5为在实施例3中，P-DDP纳米组合物在PBS和细胞裂解液中的释放曲线；
图6为在实施例4中，P-DDP纳米组合物在10％ FBS和HEPES中的粒度变化；
图7为在实施例5中，P-DDP纳米组合物和CDDP游离顺铂对SKOV3细胞的体外细胞毒性；
图8为在实施例5中，P-DDP纳米组合物和CDDP游离顺铂对A549细胞的体外细胞毒性；
图9为在实施例6中，生理盐水、4mg/kg CDDP、2mg/kg P-DDP、4mg/kg P-DDP和6mg/kg P-DDP在给药期间对肿瘤体积的影响；
图10为在实施例6中，生理盐水、4mg/kg CDDP、2mg/kg P-DDP、4mg/kg P-DDP和6mg/kg P-DDP在给药期间对肿瘤重量的影响；
图11为在实施例7中，CDDP和P-DDP在给药后的血药浓度-时间曲线；
图12为在实施例8中，CDDP和P-DDP在给药后的组织分布情况；
图13为在实施例9中，生理盐水、4mg/kg CDDP、2mg/kg P-DDP、4mg/kg P-DDP和6mg/kg P-DDP在给药期间对小鼠体重的影响；以及
图14为在实施例9中，生理盐水、4mg/kg CDDP和4mg/kg P-DDP给药20天后的组织病理学检查结果。
具体实施方式
现在将在下文更全面地描述本公开内容。然而，本公开内容可以以不同的形式实施，并且不应解释为局限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容将是透彻且完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本公开内容的范围。
此外，当使用于本申请的说明书与所附的权利要求中时，除非有相反的指定，否则下列术语具有所指示的意义。
如本文使用，术语“和/或”包括相关列出项中的一个或多个的任意组合和所有组合。例如，“A和/或B”可以理解为意指“A、B、或者A和B”。术语“和”和“或”可以以连接词或反意连接词的意义使用，并且可以理解为等同于“和/或”。
如本文使用的术语“约”包括规定值并且意指在如由本领域普通技术人员考虑相关测量和与所述量的测量相关的误差(即，测量系统的限制)所确定的所述值的可接受的偏差范围内。例如，“约”可以意指在一个或多于一个的标准偏差内，或者在规定值的±20％、±10％或±5％内。
应理解，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”等旨在指明本公开内容中的规定的特征、数字、步骤、操作、元素、成分或其组合的存在，但不排除一个或多个其它的特征、数字、步骤、操作、元素、成分或其组合的存在或增添。
在整个本说明书中提到的“在实施方案中”、“在一个实施方案中”、“在另一个实施方案中”或“在一些实施方案中”意指在至少一个实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在实施方案中”、“在一个实施方案中”、“在另一个实施方案中”或“在一些实施方案中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
除非本文另外定义，使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
如本文使用的术语“自组装纳米组合物”或“纳米组合物”是指由包含色氨酸二肽基的寡肽和药物(例如，顺铂)自组装而成的纳米级药物递送系统。寡肽和药物可以通过π-π相互作用驱动自组装。
如本文使用的术语“寡肽”是指由2-14个氨基酸彼此缩合形成的氨基酸链。在一些实施方案中，寡肽是由2-10个、2-8个、2-6个、2-5个、2-4个或2-3个氨基酸彼此缩合形成的氨基酸链。
如本文使用的术语“氨基酸”是指构成生命体中的蛋白质的主要单元，例如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、组氨酸(H)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)等。在描述肽的结构时，本公开内容使用国际标准的氨基酸单字母缩写。除明确指出，本申请中的氨基酸是指天然氨基酸。除非明确指出，当提及这些氨基酸时，可以包括L型和D型。
如本文使用的术语“包封率”是指本申请纳米组合物中的药物量与制备时使用的药物量(即，投药量)的比例。
如本文使用的术语“载药量”是指本申请纳米组合物中的药物量与药物量和寡肽量之和的比例。
如本文使用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指被国家药品管理机构批准为可接受用于人或家畜的在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。举例而言，片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂中的基质部分；液体制剂中的溶剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。
术语“对象”可以包括人和家畜如实验室动物与家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、家兔)，及非驯养动物，如野生动物等。
如本文使用的术语“治疗有效量”是指本申请纳米组合物的量，当其被给予哺乳动物，优选为人时，足以在哺乳动物，优选为人中实现对肿瘤的治疗。构成“治疗有效量”的本申请纳米组合物的量，根据活性药物、疾病状态及其严重性、给药方式以及要治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可常规地由本领域一般技术人员根据其自有知识及本公开内容而决定。
如本文使用的术语“治疗”涵盖对患有肿瘤的哺乳动物，优选为人的肿瘤的治疗，且包括：
(i)防止肿瘤发生于哺乳动物中，尤其是当这些哺乳动物易患肿瘤，但尚未被诊断为患有肿瘤时；
(ii)抑制肿瘤，即阻止其发展；
(iii)缓解肿瘤，即引起肿瘤的复原；或
(iv)缓解由肿瘤引发的症状。
纳米组合物
本公开内容提供了纳米组合物，其由含有色氨酸二肽基元的寡肽和药物自组装形成，其中寡肽与药物通过π-π相互作用连接。
寡肽的通式可以是
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-W-W-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12，其中，W是色氨酸；Xaa1-Xaa12可以各自独立地不存在或表示任意氨基酸残基。
在一些实施方案中，Xaa1-Xaa12可以各自相同或不同。在一些实施方案中，Xaa1-Xaa12同时不存在，则使用的寡肽为色氨酸-色氨酸。在一些实施方案中，Xaa1-Xaa6可以均不存在，选自Xaa7至Xaa12中的1个表示任意氨基酸残基，或者Xaa7-Xaa12可以均不存在，选自Xaa1至Xaa6中的1个表示任意氨基酸残基，例如，当Xaa1至Xaa6同时不存在，而Xaa7至Xaa12中的1个表示谷氨酸残基时，使用的寡肽为色氨酸-色氨酸-谷氨酸。在一些实施方案中，Xaa1-Xaa6可以均不存在，选自Xaa7至Xaa12中的2个各自独立地表示任意氨基酸残基，或者Xaa7-Xaa12可以均不存在，选自Xaa1至Xaa6中的2个各自独立地表示任意氨基酸残基，例如，当Xaa1至Xaa6同时不存在，而Xaa7至Xaa12中的2个分别表示天冬氨酸残基和精氨酸残基时，使用的寡肽可以是例如色氨酸-色氨酸-天冬氨酸-精氨酸。在一些实施方案中，Xaa1-Xaa6可以均不存在，选自Xaa7至Xaa12中的3个各自独立地表示任意氨基酸残基，或者Xaa7-Xaa12可以均不存在，选自Xaa1至Xaa6中的3个各自独立地表示任意氨基酸残基，例如，当Xaa1至Xaa6同时不存在，而Xaa7至Xaa12中的3个分别表示甘氨酸残基、天冬氨酸残基和精氨酸残基时，使用的寡肽可以是例如色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。然而，本公开内容的实施方案不限于此。
在一些实施方案中，寡肽可以选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸、色氨酸-色氨酸-甘氨酸、色氨酸-色氨酸-丝氨酸、色氨酸-色氨酸-组氨酸、色氨酸-色氨酸-赖氨酸、色氨酸-色氨酸-酪氨酸、色氨酸-色氨酸-半胱氨酸、色氨酸-色氨酸-苏氨酸，优选地，寡肽可以选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸。然而，本公开内容的实施方案不限于此。
在一些实施方案中，纳米组合物可以是色氨酸-色氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-顺铂或色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂。在一些实施方案中，纳米组合物可以是色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂。
在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以是约20％至约60％，例如约24％至约55％，例如约24％至约50％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为32.1％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为40.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为30.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为31.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为49.5％。
在一些实施方案中，纳米组合物粒径可以是10-1000nm，20-600nm，更优选是20-200nm。
药物组合物
本公开内容还提供了药物组合物，包含上述纳米组合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以选自本领域常用的粘合剂、助悬剂、助流剂、调味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、稳定剂、渗透促进剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂等或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物可以用于治疗肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤可以是肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肾上腺皮质癌、皮肤鳞癌、头颈部癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤或神经母细胞瘤。在一个实施方案中，肿瘤可以是肺癌、乳腺癌、食管癌、结直肠癌或卵巢癌。在另一个实施方案中，肿瘤可以是子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌。在其它实施方案中，肿瘤可以是尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤或神经母细胞瘤。
本申请的药物组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、吸入、肠胃外、鼻内、眼内、肌内、皮下、静脉内给药。
本申请的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
制备方法
制备本申请的纳米组合物的方法如下：
步骤一：将寡肽和顺铂溶于第一溶剂，得到有机相A；
步骤二：在搅拌下将上一步骤得到的有机相A注入到水相B中；加毕继续搅拌10-60min，得混合溶液C；
步骤三：去除混合液C中的溶剂，得到自组装纳米组合物。
在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约0.25-20:1，优选是约0.5-20:1，更优选是约1-5:1，更优选是约1-2:1。在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约0.25-2:1。在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约1-2:1，在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约1.2-1.8:1。。
在一些实施方案中，根据本申请制备的纳米组合物的包封率可以是约35％至约99％，例如约67.5％至约99％，例如约80％至约99％，例如约86.5％至约98.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为98.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为90.7％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为86.5％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为97.3％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为94.3％。
在一些实施方案中，根据本申请制备的纳米组合物的载药量可以是约20％至约60％，例如约24％至约55％，例如约24％至约50％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为32.1％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为40.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为30.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为31.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的载药量可以为49.5％。
在一些实施方案中，第一溶剂可以选自丙酮、乙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或多种；优选地，第一溶剂选自丙酮、乙醇和二甲基亚砜中的一种或多种。
在一些实施方案中，水相B选自纯化水、注射用水、HEPES缓冲液、Tris缓冲液或PBS缓冲液中的一种或多种；优选地，水相B为注射用水或HEPES缓冲液，更优选地，水相的pH值为7.0-7.8。
在一些实施方案中，搅拌条件下将有机相A注入到水相B中，水相B与所述有机相A的体积比可以是1-100:1，优选为1-40:1。
在一些实施方案中，去除混合液C中的溶剂采用减压蒸发法、高速离心法、透析法或超滤法，优选使用减压蒸发法。
替代地，也可以采用不同的方法来制备纳米组合物。
在另一方面，提供了本申请的纳米组合物的另一制备方法，包括：将寡肽分散于水相C中，然后加入顺铂，获得混合液C，将混合液C避光高速搅拌，去除溶剂，得到所述纳米组合物的胶体溶液。
在一些实施方案中，水相C可以选自纯化水、注射用水、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种。在一些实施方案中，水相C是HEPES缓冲液。在一些实施方案中，水相C的pH为5至9。
在一些实施方案中，在将寡肽分散于水相C中时，还可以添加分散稳定剂。
在一些实施方案中，分散稳定剂可以选自mPEG2K-NHS、血清白蛋白、depe-peg2000、卵磷脂、plga-peg中的一种或多种。在一些实施方案中，分散稳定剂可以是mPEG2K-NHS。
在一些实施方案中，加入分散稳定剂后，在室温下搅拌0.5至1.5小时，优选1小时。
在一些实施方案中，在将寡肽分散于水相C中之后，还包括于水相D中透析的步骤，以去除一部分粒径较大的物质。
在一些实施方案中，水相D可以选自纯化水、注射用水、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种。在一些实施方案中，水相D可以是注射用水。
在一些实施方案中，在水相D中透析的时间可以是12-36小时，优选18-32小时，更优选24小时。
在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约0.25-20:1，优选是约0.5-20:1，更优选是约1-5:1，更优选是约1-2:1。在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约0.25-2:1。在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约1-2:1，在一些实施方案中，寡肽与顺铂的摩尔比是约1.2-1.8:1。
在一些实施方案中，根据本申请制备的纳米组合物的包封率可以是约35％至约99％，例如约67.5％至约99％，例如约80％至约99％，例如约86.5％至约98.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为98.2％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为90.7％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为86.5％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为97.3％。在一些实施方案中，纳米组合物的包封率可以为94.3％。
在一些实施方案中，将包含寡肽和顺铂的混合物在40-60℃下，优选在50℃下避光高速搅拌。
在一些实施方案中，去除混合液C中的溶剂采用减压蒸发法、高速离心法、透析法或超滤法，优选使用透析法。
另外，在一些实施方案中，上述方法可以还包括添加冻干保护剂，冷冻干燥得到固体粉末的步骤。
在一些实施方案中，冻干保护剂可以选自蔗糖、海藻糖和甘露醇；优选地，所述冻干保护剂可以是蔗糖。
上述纳米组合物的制备过程条件温和、操作简单，生产过程不涉及有害溶剂等，适合工业化生产。
用途
本公开内容提供了上述纳米组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本公开内容还提供了上述纳米组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
可替代地，本公开内容又提供了用于治疗肿瘤的上述纳米组合物。
可替代地，本公开内容提供了治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的对象给予包含上述纳米组合物的药物，例如治疗有效量的包含上述纳米组合物的药物。
在一些实施方案中，肿瘤是指癌症。
癌症的非限制性实例包括但不限于肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肾上腺皮质癌、皮肤鳞癌、头颈部癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤、神经母细胞瘤的治疗药物。然而，本公开内容的实施方案不限于此。
根据本申请的纳米组合物的剂型包括但不限于普通粉针、冻干粉针、水针、乳剂、溶液剂和混悬剂。
在一些实施方案中，根据本申请的纳米组合物由寡肽和药物通过π-π堆积驱动的自组装形成，可实现对药物的高效负载；该驱动力为物理相互作用，避免了共价交联对药物活性的影响。
在一些实施方案中，根据本申请的纳米组合物具有良好的生物相容性和安全性，寡肽中所含组装基元色氨酸为人体必需氨基酸之一，参与机体蛋白质合成和代谢调节，降解产物均为人体内源性物质，例如可显著减低肿瘤治疗的药物的毒副作用。
在一些实施方案中，组装基元色氨酸等电点为5.9，在内涵体/溶酶体的酸性环境(pH 5.0-5.5)中触发其转变为正电性，破坏了活性药物成分与寡肽载体之间的作用力，从而加速药物在胞内的释放和累积。
下面结合附图对本公开内容的实施例进行说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
缩略语：
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸
Tris：三羟甲基氨基甲烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
Fmoc-Glu(OtBu)-OH：
Fmoc-Trp(Me)-OH：
WWE：
mPEG2K-NHS：甲氧基聚乙二醇-活性酯
实施例1.WWE-顺铂自组装纳米组合物的制备
1.1寡肽(WWE)的制备
A.脱保护
称取替代度为0.34mmol/g的Fmoc-Glu(OtBu)-OH王树脂1.5g(0.5mmol)，置于100mL多肽合成反应柱中，加入25mL DMF，混合后浸泡2h使树脂充分溶胀。加入25mL脱保护试剂PIP(20％哌啶/DMF)，通入氮气充分混合45min；用DMF(25mL x 6)洗涤。
取出少许树脂置于0.5mL EP管中，加入20μL 5％茚三酮无水乙醇溶液，80μL 80％苯酚无水乙醇溶液，沸水浴加热5min。若树脂为紫红色，则Fmoc保护基脱除完全，进行下步偶联反应；若树脂为无色或浅黄色，则需要延长脱保护时间。
B.肽链延长
称取Fmoc-Trp(Me)-OH(440mg,1mmol)、1-羟基苯并三唑(148mg，1.2mmol)和2.5mLDMF，搅拌使其溶解；冰水浴下加入0.19mL N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC，1.2mmol)，活化8min。将活化好的样品加入到上述多肽合成反应器中，室温反应1h。以茚三酮试剂检测反应进程，若缩合完全，树脂则呈无色或浅黄色：若为紫红色则需要延长缩合时间或重复缩合。
待缩合完全后，树脂用DMF(25mL x 6)洗涤。按A步骤进行Fmoc脱保护，脱保护完全且洗涤好的树脂按B步骤进行下一个Fmoc-Trp(Me)-OH的缩合。
肽链合成结束后，用无水乙醇洗涤8次，然后抽干树脂。
C.肽链切割
取上述合成树脂，加入25mL裂解试剂(三氟乙酸：茴香硫醚：三乙基硅烷：乙二硫醇：水＝90:1:2:2:5)，室温下搅拌2h；过滤，浓缩；将浓缩后的液体加入到10倍量冰乙醚中沉淀，离心，取沉淀加冷乙醚重复上述操作6次，减压干燥，得到目标肽。
通过ESI-MS(图1)和1H NMR(图2)确认寡肽的结构，[M+Na]+:570.29。
1.2 WWE-顺铂自组装纳米组合物的制备
称取色氨酸-色氨酸-谷氨酸(WWE)(4mg，7.8μmol)分散于2mL HEPES缓冲液(pH8)中，加入15mg mPEG2K-NHS作分散稳定剂，室温搅拌1h，于注射用水中透析24h；加入2mg顺铂(CDDP)，在50℃下避光高速搅拌1h，透析除去游离药物，得到胶体溶液。
所得自组装纳米组合物的外观形态为单分散的球形(图3)。为了便于描述，将WWE-顺铂自组装纳米组合物称为P-DDP，在P-DDP冻干前进行粒度分析(图4)，其平均粒径是121nm，单分散指数(PDI)是0.12。
1.3药物组合物的制备
将1.2所得胶体溶液加入200mg蔗糖粉末，冷冻干燥得到固体粉末。
实施例2.制备条件的影响
2.1投料比对包封率和载药量的影响
寡肽与药物的比例对包封率和载药量的影响参见以下表1。为了便于描述，将WWE-顺铂自组装纳米组合物称为P-DDP，而将游离顺铂称为CDDP，WWE表示寡肽。
表1
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包封率＝(P-DDP中的药物量/投药量)×100％
载药量＝(P-DDP中的药物量/(P-DDP中的药物量+WWE量))×100％。
实施例3.体外释放
称取2mg P-DDP冻干粉末分散于20mL含肿瘤细胞裂解液的HEPES缓冲液中(10mM，pH 7.4)和20mL PBS(pH 7.4)中，分别在特定时间点取样0.1mL，20000rpm高速离心30min，吸取20μL上清液HPLC测定药物浓度，绘制释放曲线，如图5所示。
P-DDP纳米组合物在PBS中呈缓慢释放，顺铂累积释放持续48小时；在肿瘤细胞匀浆孵育的条件下可加速顺铂从P-DDP纳米组合物中的释放。
实施例4.血清稳定性
将2mg P-DDP冻干粉末分散在含10％胎牛血清(FBS)的缓冲液(pH＝7.4)中，置于37℃恒温摇床中振荡，分别于0、2、4、8、12、24、48h取样，进行粒度分析，与在HEPES缓冲液(pH8)中的粒度分布进行比较，结果如图6所示，表明在24h内P-DDP在10％ FBS中粒度分布没有显著变化，说明纳米组合物在血液循环中具有较好的稳定性。
实施例5.体外细胞毒性
如前按照CCK8方法，将对数生长期的肿瘤细胞(人卵巢癌细胞SKOV3细胞和人非小细胞肺癌细胞A549细胞)接种到96孔板中(5×103/孔)，待细胞贴壁后，将培养液更换为含P-DDP或CDDP的培养液，在37℃下继续孵育48h后，向每孔加入10μL CCK8试剂，孵育4h后在450nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞活力，结果如图7(SKOV3)和图8(A549)所示，并由此获得药物对细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，结果如表2所示。
表2
实施例6.体内抑瘤实验
将150μL SKOV3肿瘤细胞悬液(1×107)皮下接种于Balb/c裸鼠的腹侧皮下，待肿瘤体积达到约150mm3时，将荷瘤小鼠随机分为三组(n＝5)，分别尾静脉注射0.2mL生理盐水、0.2mL 4mg/kg CDDP生理盐水溶液、0.2mL 2mg/kg P-DDP生理盐水稀释液、0.2mL 4mg/kg P-DDP生理盐水稀释液和0.2mL 6mg/kg P-DDP生理盐水稀释液(以顺铂含量计)。各实验组连续3周尾静脉给药，每周2次。给药期间每2天测量肿瘤的长径与短径，计算肿瘤体积，结果如图9所示，同时称取肿瘤重量，结果如图10所示。
实施例7.药代动力学
(1)测定方法的建立
①铂标准储备液制备(2.5mg/L)：准确量取2.5mL铂标准液(1mg/mL)，用0.2％硝酸定容至10mL；准确量取100μL，用0.2％硝酸定容至10mL；
②铂标准工作液(200μg/L)：准确量取0.8mL铂标准贮备液，用0.2％硝酸定容至10mL；
③分析条件：工作波长为265.9nm，带宽0.2nm，进样体积20μL；
④标准曲线：在12.5-200μg/L范围内线性关系良好。
(2)取样
SD大鼠(体重200-250g)随机分为2组(n＝5)，正式给药前禁食12h，自由饮水。各组尾静脉分别单次注射3mg/kg CDDP生理盐水溶液(以顺铂含量计)、3mg/kg P-DDP生理盐水稀释液，在给药后的5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h眼眶取血至涂有肝素钠的EP管中混匀，5000rpm离心10min获取血浆，-20℃冰箱保存。
血浆样品处理与测定：精密量取血浆样品100μL，加入2mL硝酸-高氯酸(9:1)，置于电热板上加热直至硝解近干。残渣用0.2％硝酸溶解并定容至10mL，石墨炉原子吸收分光光度计测定，并代入标准曲线计算血药浓度。以血药浓度为纵坐标，时间为横坐标，绘制血药浓度-时间曲线，如图11所示。用Kinetica软件通过双室模型对测得的Pt含量进行拟合，并计算各项药代动力学参数，显示在以下表3中。
表3
结果表明，P-DDP的消除半衰期为18.54h，显著高于CDDP组(5.62h)。结果表明，P-DDP可以显著提升铂类药物的血液循环时间。
实施例8.组织分布
将150μL SKOV3肿瘤细胞悬液(1×107)皮下接种于Balb/c裸鼠的腹侧皮下，待肿瘤体积达到约150mm3时，将荷瘤小鼠随机分为2组(n＝5)，分别尾静脉注射5mg/kg CDDP生理盐水溶液和5mg/kg P-DDP生理盐水稀释液(以顺铂含量计)。注射12h后处死小鼠，并取出不同脏器心、肝、脾、肺、肾及肿瘤称重。将组织样本切碎，加入2mL硝酸-高氯酸(9:1)，置于电热板上加热直至硝解近干。残渣用0.2％硝酸溶解并定容至10mL，石墨炉原子吸收分光光度计测定，并代入标准曲线计算Pt浓度，结果如图12所示。
结果表明，P-DDP具有更好的肿瘤靶向能力，在肿瘤部位的蓄积量可高达7452ng/g组织，显著优于CDDP组(1958ng/g组织)，验证了P-DDP的靶向输送效率。
实施例9.安全性评价
(1)溶血性试验
取兔血数毫升，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1500rpm离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％(V/V)的混悬液，供试验用。
取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为受试物管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按表4所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液(生理盐水)或蒸馏水。
表4
各组设3个平行，涡旋混匀后，于37℃孵育3小时。离心取上清液，于540nm处测吸光度值。
溶血率％＝[(OD样品–OD阴性)/(OD阳性–OD阴性)]×100％。
P-DDP浓度与平均溶血率的关系显示在以下表5中。
表5
P-DDP浓度(μg/mL) 12.5 25 50 100 200
溶血率(％)Mean±SD 0.25±0.10 0.51±0.27 0.64±0.45 0.97±0.42 1.52±0.48
结果表明，P-DDP在12.5～200μg/mL浓度范围内溶血率<5％。
(2)体重变化及组织病理学检查
取健康KM小鼠(5-7周)，体重20-23g，随机分为3组(每组10只)，分别尾静脉注射生理盐水、4mg/kg CDDP、2mg/kg P-DDP、4mg/kg P-DDP和6mg/kg P-DDP(以顺铂含量计)，每隔2日给药1次，连续给药5次，给药后常规喂养，每日关注小鼠的生存状况，测量体重，其结果显示在图13中。结果表明，4mg/kg CPPD(游离顺铂)组的小鼠在治疗期间不断消瘦，通过观察发现进食减少、神态萎靡、不喜动弹，小鼠体重下降明显；而三个浓度的P-DDP(纳米组合物)组的小鼠体重无明显变化现象且小鼠状态良好。
给药后第20日处死小鼠，收集主要器官(心、肝、脾、肺、肾)，4％多聚甲醛固定24小时后，送样进行石蜡包埋，制作组织切片并进行H&E染色，生理盐水组、4mg/kg CDDP组和4mg/kg P-DDP组的结果显示在图14中。结果表明，相较于生理盐水组，4mg/kg CDDP组小鼠的肝和肾切片出现明显的病变部位；4mg/kg P-DDP组没有明显的差异，说明根据本申请的纳米组合物没有造成明显的器官毒性，安全性良好，较大程度上避免了游离CDDP的肝肾毒性。
本文已经公开了实施方案，并且尽管使用了术语，但它们仅以一般性和描述性的意义进行使用和解释，而不是出于限制的目的。在一些情况下，如本领域普通技术人员将显而易见的，关于实施方案描述的特征、特性和/或要素可以单独使用或与关于其它实施方案描述的特征、特性和/或要素组合使用，除非另外具体指出。因此，本领域普通技术人员将理解，在不背离如在权利要求或其等同中阐述的本公开内容的主旨和范围的情况下，可以进行形式和细节的各种改变。

Claims (18)

1.纳米组合物，所述纳米组合物由含有色氨酸二肽基元的寡肽和顺铂自组装形成。
2.根据权利要求1所述的纳米组合物，其中所述寡肽的通式为Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-W-W-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12，
其中，W为色氨酸；以及
Xaa1-Xaa12各自独立地不存在或表示任意氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的纳米组合物，其中
所述寡肽选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸、色氨酸-色氨酸-甘氨酸、色氨酸-色氨酸-丝氨酸、色氨酸-色氨酸-组氨酸、色氨酸-色氨酸-赖氨酸、色氨酸-色氨酸-酪氨酸、色氨酸-色氨酸-半胱氨酸、色氨酸-色氨酸-苏氨酸；
优选地，所述寡肽选自色氨酸-色氨酸、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、色氨酸-色氨酸-精氨酸、色氨酸-色氨酸-谷氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米组合物，其中
所述纳米组合物是色氨酸-色氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-顺铂、色氨酸-色氨酸-精氨酸-顺铂或色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂；
优选地，所述纳米组合物是色氨酸-色氨酸-谷氨酸-顺铂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米组合物，其中所述纳米组合物的载药量是约20％至约60％，优选是约24％至约55％，更优选是约24％至约50％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的纳米组合物，其中所述纳米组合物粒径是10-1000nm，优选是20-200nm。
7.药物组合物，包含权利要求1至6中任一项所述的纳米组合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述药学上可接受的赋形剂选自粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂和着色剂中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，用于治疗肿瘤，
优选地，所述肿瘤是肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肾上腺皮质癌、皮肤鳞癌、头颈部癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤或神经母细胞瘤。
10.权利要求1至6中任一项所述的纳米组合物的制备方法，包括：将寡肽分散于水相C中，然后加入顺铂，获得混合液C，将混合液C避光高速搅拌，去除溶剂，得到所述纳米组合物的胶体溶液。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中
所述寡肽与顺铂的摩尔比是约0.25-20:1，优选是约0.5-20:1，更优选是约1-5:1，更优选是约1-2:1；和/或
所述纳米组合物的包封率是约35％至约99％，优选是约67.5％至约99％，更优选是约80％至约99％。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中
所述水相C选自纯化水、注射用水、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种；优选地，所述水相C是HEPES缓冲液；更优选地，所述水相的pH为5-9。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的制备方法，还包括添加分散剂的步骤，
优选地，所述分散剂选自mPEG2K-NHS、血清白蛋白、depe-peg2000、卵磷脂、plga-peg中的一种或多种；优选地，所述分散剂是mPEG2K-NHS。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的制备方法，在将寡肽分散于水相C中之后，还包括于水相D中透析的步骤，
优选地，所述水相D选自纯化水、注射用水、HEPES缓冲液、Tris缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种；优选地，所述水相D是注射用水。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的制备方法，其中将混合液C在40-60℃下，优选地在50℃下避光高速搅拌。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的制备方法，其中去除混合液C中的溶剂采用减压蒸发法、高速离心法、透析法或超滤法，优选透析法。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的制备方法，还包括添加冻干保护剂，冷冻干燥得到固体粉末的步骤，
优选地，所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖和甘露醇中的一种或多种；更优选地，所述冻干保护剂是蔗糖。
18.权利要求1至6中任一项所述的纳米组合物在制备抗肿瘤药物中的用途,所述的抗肿瘤药物选自肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肾上腺皮质癌、皮肤鳞癌、头颈部癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道鳞状上皮癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤、神经母细胞瘤的治疗药物。
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