CN112266409B - 依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用,制备得到的依托泊苷小分子多肽化合物Nap‑GFFPYK‑Etoposide(包括Nap‑GFFPYK‑Etoposide1和Nap‑GFFPYK‑Etoposide2),用小分子多肽Nap‑GFFPYK的C端赖氨酸上的氨基与依托泊苷活性酯连接起来形成依托泊苷纳米纤维前体药物分子,该纳米纤维分子能经过碱性磷酸酶催化自组装形成10nm左右的纳米纤维,可以内吞的方式快速进入细胞,提高了依托泊苷的入胞效率,增强了依托泊苷对肿瘤细胞的治疗效果。因此本发明所建立的依托泊苷新型传输体系不仅解决了依托泊苷溶解度差的问题,而且提高了依托泊苷的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,尤其是依托泊苷自组装纳米纤维多肽、制备方法及应用。
背景技术
依托泊苷是应用于临床治疗肿瘤的广谱抗癌药。由于其的水溶性差,目前临床上使用的依托泊苷制剂多以聚山梨酯-80,聚乙二醇-400,苯甲醇,枸橼酸和无水乙醇混合液作为助溶剂。给药前用生理盐水或者葡萄糖稀释到终浓度。这些助溶剂可导致多种不良反应,比较明确的包括过敏反应和神经毒性。为了解决依托泊苷水溶性差和临床制剂的毒副作用,现在普遍认为纳米粒子作为药物载体具有潜在的应用前景,纳米颗粒或者纳米纤维作为药物传输体系可以延长药物作用时间增强药效,减轻毒副作用控制药物释放、提高难溶药物的溶解性而且可以通过对纳米颗粒或者纳米纤维的修饰,比如连上靶向性的基团如叶酸,转铁蛋白等提高载体或者纳米药物粒子的靶向性,从而避免药物在非特异性的组织释放。小分子自组装形成的纳米粒子或者纳米纤维在近几年得到广泛的关注,尤其是小分子多肽类的自组装,因为其具有生物相容性好,对身体无毒,容易合成等优点。小分子水凝胶作为一种新型的材料,由于其良好的生物相容性,较好的三维形貌,已经在生物医学和生物材料方面得到国内外科学家广泛的研究。迄今为止,还没有出现用小分子多肽连接疏水药物依托泊苷,并通过酶催化自组装形成纳米纤维的报道。因此我们设计了依托泊苷的自组装纳米纤维,在同等浓度下可以显著增强依托泊苷对肿瘤的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题,通过自组装短肽Nap-GFFPYK与疏水性药物依托泊苷连接起来形成Nap-GFFPYK-Etoposide的小分子多肽化合物,该多肽化合物在PBS溶液中具有较好的溶解性。通过碱性磷酸酶催化自组装形成纳米纤维,该纳米纤维可以内吞的方式进入细胞,显著提高了依托泊苷进入细胞的效率,增强了依托泊苷对肿瘤的治疗效果。
本发明的依托泊苷自组装纳米纤维多肽,该多肽Nap-GFFPYK-Etoposide为由Nap-GFFPYK和依托泊苷酯化而成,其结构式如下:
即,该多肽的N端为具有酶促自组装性质的多肽Nap-GFFPYK,C端通过赖氨酸与依托泊苷活性酯连接;且自组装的短肽Nap-GFFPYK与依托泊苷的链接方式可以选用1到3个亚乙基连接。
进一步,所述-Etoposide包括-Etoposide1和-Etoposide2两种形式;
其中,-Etoposide1结构式如下:
-Etoposide2结构式如下:
基于同一发明构思,本发明还在于提供上述依托泊苷自组装纳米纤维多肽的制备方法,其特征在于,主要包括如下步骤:
(1)中间体化合物Fmoc-PY-COOH的合成过程如下:
i)取五氧化二磷、磷酸、酪氨酸反应;反应后加入水,用正丁醇稀释,低温下有白色固体析出,过滤、沉淀、洗涤、干燥后可得到磷酸化的酪氨酸;
ii)把磷酸化的酪氨酸溶于饱和的碳酸氢钠溶液中,加入溶剂溶解的Fmoc-OSU进行反应,除去溶剂,加入盐酸,乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯层,无水硫酸钠干燥,除去乙酸乙酯,即可得Fmoc-磷酸化酪氨酸;
(2)Nap-GFFPYK的固相合成过程如下:
ⅲ)在固相合成器中将Fmoc-Lys(Boc)-COOH连接在固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上,用二氯甲烷作为溶剂进行反应;
iv)用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液去除保护基团Fmoc,取多肽缩合剂HBTU放入ⅲ)步骤的固相合成器中,依次加入Fmoc-磷酸酪氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-甘氨酸,并用多肽的N端用萘乙酸封端,即可得到自组装短肽Nap-GFFPYK;
v)用95%的三氟乙酸把制备的短肽从树脂上切割下来,并将所得Nap-GFFPYK用高效液相色谱仪进行分离;
(3)Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2的合成过程如下:
vi)把依托泊苷溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶反应;HPLC纯化得到Etoposide1和Etoposide2修饰的衍生物;之后再在加入N-羟基琥珀酰亚胺和多肽缩合剂HBTU,得到Etoposide1和Etoposide2活性酯结构;
ⅶ)分别取依托泊苷的两个活性酯结构和固相合成的自组装多肽(Nap-GFFPYK),在N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应12小时,用高效液相分离得到依托泊苷的两个自组装多肽Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2化合物。
基于同一发明构思,本发明还在于提供上述依托泊苷自组装多肽应用于小分子水凝胶纳米纤维传输体系的方法,Nap-GFFPYK-Etoposide1的小分子化合物在PBS溶液中或细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下,自组装形成纳米纤维,可以内吞的方式进入细胞内。
Nap-GFFPYK-Etoposide2的小分子化合物在PBS溶液中或细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下,自组装形成纳米纤维,可以内吞的方式进入细胞内。
需要说明的是,本发明用到的氨基酸均为L构型的天然氨基酸。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明制备得到的依托泊苷自组装多肽化合物Nap-GFFPYK-Etoposide(包括Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2),用自组装小分子多肽Nap-GFFPYK连接疏水性药物依托泊苷,该依托泊苷自组装多肽化合物在体外碱性磷酸酶或者细胞膜表面碱性磷酸酶催化下自组装形成纳米水凝胶(纳米纤维),该纳米水凝胶可以内吞的方式进入细胞,提高了依托泊苷的入胞效率,增强了依托泊苷治疗肿瘤的作用效果。
(2)本发明的依托泊苷自组装小分子多肽化合物Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2制备过程中用到的原料为培养细胞所需要的各种氨基酸,对细胞不产生毒副作用,制备得到的自组装多肽载体Nap-GFFPYK对细胞生长没有明显的抑制现象;
(3)本发明制备得到的纳米水凝胶具有良好的生物相容性及较好的三维形貌(10纳米左右的纳米纤维),能更容易进入肿瘤细胞,可在生物材料药物递送方面得到广泛应用。
附图说明
图1为Fmoc-L-PY-COOH的化学合成路线图;
图2为Nap-GFFPYK的固相合成路线图;
图3为Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2的化学合成路线图;
图4为Nap-GFFPYK-Etoposide1的氢谱图;
图5为Nap-GFFPYK-Etoposide2的氢谱图;
图6、图7分别为Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2两种小分子水凝胶的透射电镜观察的三维形貌图;
图8为Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)对不同种类的肿瘤细胞的抑制情况;
图9、图10、图11为Nap-GFFPYK-Etoposide1和Nap-GFFPYK-Etoposide2对小鼠肺癌LLC肿瘤细胞的治疗情况,其中,PBS代表PBS组,F代表Nap-GFFPYK组,Etopl代表依托泊苷组,E+F代表Nap-GFFPYK+依托泊苷组,NFE1代表Nap-GFFPYK-Etoposide1组,NFE2代表Nap-GFFPYK-Etoposide2组。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例一Fmoc-PY-COOH的合成
称取五氧化二磷(P2O5,10g,70.4mmol)加85%磷酸(H3PO4,13.0g)于三通烧瓶中,在80度油浴中加热搅拌至几乎全部混匀。在加入3.22g的酪氨酸(17.8mmol)于体系中,用氮气保护,以免接触空气中的水分,80度恒温反应24小时。向暗棕色粘稠液体中加入30毫升的水,继续加热30分钟后,冷却至室温,用650毫升的正丁醇稀释,0度下保持3小时,有白色固体析出,过滤沉淀,每次用冰水20毫升洗两遍,乙醇20毫升洗两遍,乙醚20毫升洗两遍。放于正空干燥箱中,干燥5小时。即可得到磷酸酪氨酸。
称取磷酸酪氨酸2.62g(10mmol)溶于20毫升饱和的碳酸氢钠溶液中,称取3.38(10mmol)Fmoc-OSU。溶于20毫升乙腈溶液中,缓慢滴加。反应12小时。旋蒸除去乙腈,加入1mol/L盐酸150毫升,用200毫升乙酸乙酯萃取三次,收集乙酸乙酯层,无水硫酸钠干燥3小时,旋蒸除去乙酸乙酯,即可得Fmoc-磷酸化酪氨酸(Fmoc-PY-COOH)。
本实施例的合成步骤可参考图1。
实施例二Nap-GFFPYK的合成
采用固相合成法合成Nap-GFFPYK,具体合成步骤如下:
(1)称量0.75mmol(700毫克)二氯树脂,加入固相合成器中,加入20毫升二氯甲烷(DCM)浸没树脂,溶胀树脂20分钟,除去DCM溶剂,加入1mmol(469毫克)Fmoc-Lys(Boc)-COOH的DCM溶液,加入800微升的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。反应2小时。之后用DCM洗五次,每次2分钟。用体积比DCM:甲醇:DIPEA=17:2:1的封闭液,封闭30分钟。每次用DCM溶液20毫升,洗涤5次,每次1分钟。每次用DMF溶液20毫升,洗涤5次,每次2分钟。之后加入20毫升20%哌啶的DMF溶液,反应30分钟,脱去Fmoc保护基,暴露出下一步反应的氨基。
(2)加入1mmol Fmoc-磷酸酪氨酸(484毫克),1ml的DIPEA,1mmol多肽缩合剂HBTU(380毫克),反应2小时,用二甲基甲酰胺(DMF)溶液20毫升,洗涤5次,每次2分钟。加入20毫升含20%哌啶的DMF溶液,反应30分钟,脱去Fmoc保护基,暴露出下一步反应的氨基。
(3)重复(2)的实验步骤,只需要更换每次所加入的Fmoc保护的氨基酸即可,依次加入的氨基酸顺序为:Fmoc-苯丙氨酸,Fmoc-苯丙氨酸,Fmoc-甘氨酸。将氨基酸依次链接在树脂上;最后一个加入的封端基团为:萘乙酸。
(4)反应完毕之后,用DMF溶液20毫升,洗涤5次,每次2分钟。每次用DCM溶液20毫升,洗涤5次,每次1分钟。用95%的TFA(TFA:H2O:TIS=95%:2.5%:2.5%)切割1小时,用1%的三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液20毫升洗两遍,收集总切割液,旋蒸除去液体,用高效液相分离得到多肽化合物Nap-GFFPYK。
本实施例的合成步骤可参考图2。
实施例三Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)的化学合成。
(1)加入1mmol依托泊苷(484毫克),1mmol丁二酸酐(10毫克),100微升的DIPEA,1毫克的4-二甲氨基吡啶在N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应12小时,用三氟乙酸调节PH值小于7即可。后用HPLC纯化得到依托泊苷的两个羧酸衍生物(依托泊苷1-COOH、依托泊苷2-COOH)。各取两个羧酸衍生物0.5mmol(344毫克),N-羟基琥珀酰亚胺0.5mmol(57毫克),缩合剂HBTU为0.5mmol(190毫克)于DMF溶液10毫升中,反应12小时。后用HPLC纯化得到依托泊苷的两个活性酯结构。
(2)分别取0.05mmol的依托泊苷活性酯(78.6毫克),Nap-GFFPYK为0.05mmol(90.9毫克),N,N-二丙基乙胺为20微升。于3毫升的二甲基甲酰胺溶液中,反应12小时。之后用三氟乙酸调节PH值小于7。后用HPLC纯化得到Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)
本实施例的合成步骤可参考图3;NFE1的氢谱图可参考图4;NFE2的氢谱图可参考图5。
实施例四Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)纳米纤维的形成
小分子水凝胶的形成步骤如下:
(1)分别称取2.00mg得到的依托泊苷多肽化合物Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2),加入1ml的PBS(PH=7.4缓冲液)用碳酸钠调节PH至7.4,透明的溶液。然后加入碱性磷酸酶(ALP)溶液(酶的最终浓度为2.0U/ml),静置过夜后,倒置小瓶可以看到类似果冻状的胶体,即得到Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)的纳米纤维分子。
(2)用移液枪分别吸取大约5微升左右的胶体滴加到表面干净的硅片上,旋涂使胶体在硅片上分布均匀,用透射电镜观察形貌,具体见图6、图7;其形貌为分散均匀的10nm左右的纳米纤维。
实施例五Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)在细胞水平上提高依托泊苷对多种肿瘤细胞的抑制效果。
为了观察依托泊苷的两个自组装前提分子对肿瘤细胞的抑制情况,我们选取处于对数期生长的人源细胞MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞以及鼠源肿瘤细胞LLC细胞和4T1细胞,均匀的平铺到96孔板中,每孔细胞数目为5.0x103个。待6个小时细胞贴壁之后加入依托泊苷,Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)采取等度稀释(80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.625μmol/L、0.3125μmol/L、0μmol/L)的方法,37℃细胞培养箱中培养48小时。用MTT的方法检测依托泊苷,Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)对不同肿瘤细胞的抑制情况,结果见图8。图8表明依托泊苷纳米纤维前提药物活性与单纯依托泊苷(Etoposide)相比有显著的提高,在常氧的条件下,对4种细胞的IC50值均提高了10倍。比依托泊苷原药有更好的作用效果。但是两种依托泊苷的纳米纤维多肽分子之间却没有显著差异。原因是依托泊苷前提药物自组装成纳米纤维的机理和依托泊苷均以羧酸酯酶水解酯键的释放机制相同,因此才表现出相似的生物活性。
实施例六Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)在小鼠LLC肿瘤模型中抑制LLC肿瘤的生长。
由于依托泊苷纳米纤维多肽分子Nap-GFFPYK-Etoposide1(NFE1)和Nap-GFFPYK-Etoposide2(NFE2)对LLC细胞的作用效果比单纯使用依托泊苷提高了10倍。我们在C57小鼠皮下接种鼠源LLC细胞,观察一下单独的依托泊苷纳米纤维多肽分子在小鼠模型上对LLC肿瘤的生长抑制情况。
准备36只健康的C57小鼠,雌性,6到8周鼠龄,体重20克左右。随机分为6组(PBS组,Nap-GFFPYK组,依托泊苷组,Nap-GFFPYK+依托泊苷组,NFE1组和NFE2组)每组6只。取处于对数期的LLC细胞,细胞计数制备成1.0x106个细胞/毫升,按照每只小鼠皮下注射200微升LLC细胞悬液,即每只C57小鼠注射的细胞数目为2.0x105个细胞。皮下注射LLC细胞之后,每天观察小鼠的生活饮食及其接种部位肿瘤的生长情况,包括瘤体出现的时间,瘤子体积大小,肿瘤重量的变化,结果见图9、图10、图11。依托泊苷给药浓度为5mg/kg。以等摩尔的来计算依托泊苷纳米纤维(NFE1和NFE2)的给药量为13.5mg/kg。采取瘤内注射的方式。经过16天连续给药,均没有发现小鼠死亡的情况,且NFE1和NFE2对肿瘤的抑制情况最好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
2.权利要求1所述的依托泊苷自组装纳米纤维多肽的制备方法,其特征在于,主要包括如下步骤:
(1)中间体化合物Fmoc-pY-COOH的合成过程如下:
i)取五氧化二磷、磷酸、酪氨酸反应;反应后加入水,用正丁醇稀释,低温下有白色固体析出,过滤、沉淀、洗涤、干燥后可得到磷酸化的酪氨酸;
ii)把磷酸化的酪氨酸溶于饱和的碳酸氢钠溶液中,加入溶剂溶解的Fmoc-OSU进行反应,除去溶剂,加入盐酸,乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯层,加无水硫酸钠干燥,除去乙酸乙酯,即可得Fmoc-磷酸化酪氨酸;
(2)Nap-GFFpYK的固相合成过程如下:
ⅲ)在固相合成器中将Fmoc-Lys(Boc)-COOH连接在固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上,用二氯甲烷作为溶剂进行反应;
iv)用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液去除保护基团Fmoc,取多肽缩合剂HBTU放入ⅲ)步骤的固相合成器中,依次加入Fmoc-磷酸酪氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Fmoc-甘氨酸,并在多肽的N端用萘乙酸封端,即可得到自组装短肽Nap-GFFpYK;
v)用切割液三氟乙酸把制备的短肽从树脂上切除,并将所得Nap-GFFpYK用高效液相色谱仪进行分离;
(3)Nap-GFFpYK-Etoposide1和Nap-GFFpYK-Etoposide2的合成过程如下:
vi)把依托泊苷溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中,加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶反应;纯化得到Etoposide1和Etoposide2修饰的羧酸衍生物;之后再在加入N-羟基琥珀酰亚胺和多肽缩合剂HBTU,得到Etoposide1和Etoposide2活性酯结构;
ⅶ)分别取依托泊苷的两个活性酯结构和固相合成的自组装多肽Nap-GFFpYK,在N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应12小时,用高效液相分离得到依托泊苷的两个自组装多肽Nap-GFFpYK-Etoposide1和Nap-GFFpYK-Etoposide2化合物。
3.权利要求1所述的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用,其特征在于,Nap-GFFPYK-Etoposide1的小分子化合物在PBS溶液中或细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下,自组装形成纳米纤维,可以内吞的方式进入细胞内。
4.权利要求1所述的依托泊苷自组装纳米纤维多肽在制备小分子水凝胶纳米纤维传输体系中的应用,其特征在于,Nap-GFFPYK-Etoposide2的小分子化合物在PBS溶液中或细胞膜表面碱性磷酸酶的作用下,自组装形成纳米纤维,可以内吞的方式进入细胞内。
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Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences;Irene Coin等;《Nature Protocols》;20071213;第2卷;全文 * |
Two-Mechanism Model for the Interaction of Etoposide Quinone with Topoisomerase IIα;Elizabeth G.Gibson等;《Chem. Res. Toxicol.》;20160817;第29卷(第9期);全文 * |
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