CN113061159A - 一种多肽自组装因子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽自组装因子及其制备方法和应用，所述的多肽自组装因子如式I所示，该自组装多肽分子能分别在碱性磷酸酶以及pH引发下自组装形成纳米纤维结构并生成水凝胶，且在不同的引发条件下，自组装的多肽具有特异性的二级结构；本身具有低生物毒性，能包裹抗癌药物，实现缓慢释放药物的功能，在癌症细胞内发挥更显著的抗癌性能。
Description
技术领域
本发明属于材料化学技术领域，特别涉及一种多肽自组装因子及其制备方法和应用。
背景技术
短的多肽分子自组装所形成超分子的材料，具有显著的优势，包括合成简便，易于修饰，生物兼容性好，且是两性分子。这些特征使得其在许多生物医学领域中有良好的应用前景。二级结构是多肽类物质的重要结构特征之一，在生物体内其二级结构的转变与许多神经退化性疾病密切相关，例如帕金森症以及阿尔兹海默症。因此，在多肽纳米纤维中实现对二级结构的精确调控，在发展新型生物材料以及疾病治疗，药物运载以及组织工程学方面的应用具有广阔的前景。但是多肽序列对二级结构的影响机制仍然是目前的研究难题之一。此外，癌症仍是目前人类面临的最大的疾病威胁之一，在癌症药物的治疗过程中仍存在细胞摄取量少，保留时间短等问题。多肽自组装分子作为生物兼容性好的新型超分子材料，则能应用于药物运输及孵育，在癌症治疗方面的具有显著的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种用于碱性磷酸酶和pH双引发的自组装多肽序列及其制备方法和应用。本发明提供的自组装多肽序列能在不同引发条件的自组装形成具有不同二级结构的纳米纤维，并在包裹抗癌药物磷酸依托泊苷后能通过缓慢释放，具有更强的抗癌效果。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种具有式I所示结构的多肽自组装分子：
本发明所述的多肽自组装分子在不同引发条件下能自组装形成具有不同二级结构的纳米纤维结构，并包裹药物，通过缓慢释放药物，显示出更好的抗癌效果。
具体的自组装引发条件包括碱性磷酸酶以及pH，二级结构测试包括圆二色谱和傅里叶变换红外光谱。
因此，所述的多肽自组装分子在作为药物载体上的应用也在本发明的保护范围。
在本发明的另一方面，提供了所述多肽自组装分子得制备方法，包括以下步骤：
1)将五氧化二磷加入到磷酸溶液中搅拌至室温，再将酪氨酸加入并在氮气保护下搅拌反应，得到具有式II所示结构的磷酸酪氨酸；
2)将得到磷酸酪氨酸与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和水及有机溶剂混合后进行反应，得到具有式III所示结构的化合物；
3)通过固相多肽合成法合成以及高效液相色谱提纯得到具有式I所示结构的多肽自组装分子；
其中，
进一步的，所述酪氨酸与五氧化二磷的摩尔比为1:3～5。
进一步的，所述磷酸溶液为质量分数为85％的溶液。
进一步的，所述酪氨酸的磷酸化反应的温度为80℃。
进一步的，所述的磷酸酪氨酸与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比优选为1:1.1～1.5。
进一步的，所述有机溶剂与水的体积比为1:1，所述有机溶剂为乙腈。
进一步的，所述的固相多肽合成法为2-氯三苯甲基氯树脂经标准的固态多肽合成法得到多肽自组装分子。
本发明的有益效果为：
本发明提供了具有式I所示结构的自组装多肽分子。该自组装分子合成方法简单，可以在不同引发条件下自组装形成具有不同二级结构的纳米纤维，本身具有很低的生物毒性，且能自组装包裹药物实现缓慢释放，从而发挥更好的抗癌性能。
附图说明
图1为实施例3中得到的自组装多肽分子的质谱；
图2为实施例4中得到的自组装水凝胶ALP-水凝胶，pH-水凝胶以及自组装多肽分子的透射电镜图；
图3为实施例4中得到的自组装水凝胶ALP-水凝胶，pH-水凝胶的圆二色谱；
图4为实施例4中得到的自组装水凝胶ALP-水凝胶，pH-水凝胶的傅里叶转变红外吸收光谱；
图5为实施例6中药物本身以及药物和自组装多肽因子共孵育的细胞毒性试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种具有式I所示结构的自组装多肽分子：
上述自组装多肽分子的制备方法，包括以下步骤：将五氧化二磷加入到磷酸溶液中搅拌至室温，再将酪氨酸加入并在氮气保护下搅拌反应，得到具有式II所示结构的磷酸酪氨酸。再进一步与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和水，有机溶剂混合后进行反应，得到具有式III所示结构的化合物。最后通过固相多肽合成法合成成具有式I所示结构的多肽自组装分子。
在本发明中，所述酪氨酸磷酸化时，酪氨酸与五氧化二磷的摩尔优选为1：3～5，更优选为1：3.5～4.5，最优选为1：4。
在本发明中，所述磷酸优选为质量分数为85％的磷酸溶液。
在本发明中，所述酪氨酸的磷酸化反应的温度为80℃。
在本发明中，所述磷酸化反应的时间优选为18～30h，更优选为20～24h。
在本发明中，所述磷酸化反应完成后还优选包括依次对反应液加入正丁醇稀释并置入冰箱过夜，过滤收集析出的固体产物，并用水，乙醇，乙醚清洗，得到具有式II所示结构的化合物。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比优选为1:1.1～1.5，最优选为1:1.2。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的反应溶液优选为水和乙腈的1:1混合溶液。
在本发明中，所述具有式III所示结构的化合物由反应液经乙酸乙酯萃取后得到。
在本发明中，所述具有式I所示结构的化合物由2-氯三苯甲基氯树脂经标准的固态多肽合成法得到。
在本发明中，所述减压蒸发的温度优选为50～70℃，更优选为55～60℃；所述减压蒸发的时间优选为10～25分钟，更优选为15～20分钟。
在本发明中，优选使用质谱测试所述具有式I所示结构的化合物的纯度。
在本发明中，所述高效液相色谱柱的洗脱剂优选为含有0.1％三氟乙酸的水和乙腈的梯度洗脱，所述水和乙腈的体积比优选为由1：9梯度洗脱至8：2，洗脱时间优选为30分钟。
本发明还提供了上述自组装多肽分子在不同引发条件下能自组装形成具有不同二级结构的纳米纤维，以及其在药物缓慢释放中的应用。
在本发明中，所述自组装引发条件包括碱性磷酸酶以及pH。
在本发明中，所述二级结构测试包括圆二色谱和傅里叶变换红外光谱。
在本发明中，所述自组装多肽分子能自组装并包裹药物，通过缓慢释放药物，显示出更好的抗癌效果。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例1
将80mmol五氧化二磷加入到7.74mL的85％的磷酸溶液中，搅拌至温度降至室温后，再将L-酪氨酸加入，在氮气保护下80℃搅拌反应24h。反应后，在反应液中加入30mL水再加热搅拌30分钟。待反应液降温至室温后，加入650mL正丁醇并静置在冰箱中冷却过夜。过滤收集析出的白色固体，并依次用20mL水，乙醇以及乙醚分别洗涤两次。再真空干燥箱干燥后收集得到4.28g白色固体产物。产率为82％。
实施例2
将2mmol实施例1中得到的化合物和2.4mmol 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于5mL水和5mL乙腈的混合溶液中，在25℃下搅拌30分钟。2mmol的三乙胺在20分钟内逐滴加入至反应液中。随后减压蒸发除去溶液，再加入50mL乙酸乙酯以及50mL的水，用12M盐酸溶液调节pH至2。随后，萃取收集有机溶液后，依次用1M盐酸溶液，水，饱和氯化钠溶液洗涤后，加入无水硫酸钠干燥。减压蒸发后除去溶剂后，得到固体产物，产率41％。
实施例3
将实施例2中得到的化合物以及N-芴甲氧羰基-L-赖氨酸通过标准的固相多肽合成法，在2-氯三苯甲基氯树脂上合成得到具有式I所示结构的化合物。其质谱数据如图1所示，[M-H]-计算得到为981.33，图谱峰为981.6。
实施例4
将实施例3中得到的多肽加入至水中，分别在碱性磷酸酶和pH调节下引发自组装形成纳米纤维并生成水凝胶，并通过透射电镜成像表征其纳米结构。
将2mg实施例3中得到的多肽加入至200μL水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH至7.4，得到澄清溶液后加入2μL 100U/mL碱性磷酸酶后，在常温下孵育30分钟后，澄清溶液变为白色固体状水凝胶，ALP-水凝胶，如图2所示。另将2mg实施例3中得到的多肽加入至200μL水中，用1M氢氧化钠溶液调节pH至7.4后，再用1M盐酸溶液调节pH至5后，澄清溶液变为白色固体状水凝胶，pH-水凝胶，如图2所示。随后取10μL水凝胶加水稀释10倍后，各取10μL滴在400目铜网的碳膜面，并干燥过夜。随后铜网用水洗涤三次后，小心的用滤纸吸去铜网表面水份。透射电镜图如图2所示，ALP-水凝胶为扭曲的纳米纤维结构，纤维直径约34±2nm。pH-水凝胶也显示为纤维结构，但没有扭曲的构型，纤维直径略细，直径为13±1nm。而在没有碱性磷酸酶或pH引发的多肽分子的澄清溶液的电镜图片显示，仅有纳米颗粒形成，而无纳米纤维结构。由图2可知，具有式I所示结构的多肽分子能在碱性磷酸酶以及pH的分别引发下自组装形成具有不同形貌特征的纳米纤维结构。
实施例5
将实施例4中得到的ALP-水凝胶以及pH-水凝胶的纳米结构进行二级结构表征，包括圆二色谱以及傅里叶转变红外色谱分析。
分别取实施例4中得到的ALP-水凝胶以及pH-水凝胶稀释20倍溶于水，获得最后浓度为0.5mM的溶液，并测试其圆二色谱。如图3所示，ALP-水凝胶在208以及220nm处有两个特征的负峰，表明了α-螺旋结构的存在。而pH-水凝胶则包含一个202nm的正峰以及220nm处的负峰，显示的含有β-折叠结构。此外，红外吸收光谱也用于进一步分析水凝胶的二级结构，其酰胺I带(1600-1700cm-1)的峰谱与分子骨架的二级结构相关。如图4所示，ALP-水凝胶含有5个特征吸收峰，分别为β-折叠(1620，1688cm-1)，α-螺旋(1656cm-1)，β-转角(1667cm-1)以及无规卷曲(1641cm-1)。而pH-水凝胶则仅含有4个特征吸收峰，分别为β-折叠(1615，1680cm-1)，β-转角(1662cm-1)以及无规卷曲(1639cm-1)，没有α-螺旋特征峰。由图3和4可知，两种水凝胶具有不同的二级结构组成，虽然都含有主要的β-折叠以及无规卷曲结构，但是只有ALP-水凝胶含有α-螺旋结构。
实施例6
将实施例3中得到的多肽用于包裹抗癌药物，实现缓慢释放，以达到更长的保留时间，实现更好的抗癌效果。
将400μM实施例3中得到的多肽分别与5，10，20，40μM磷酸依托泊苷共同与海拉癌细胞孵育24，48，72h，随后用CCK8细胞毒性试剂盒检测细胞存活率。如图5所示，在48h孵育后药与多肽的共孵育没有显示出比药物本身更好的抗癌效果，而在长时间的72h孵育后，药与多肽的共孵育则显示出比药物自身更强的杀死癌细胞的效果。进一步的药物联合指数分析显示，在72h孵育后，两者药物联合指数小于1，药与多肽显示出明显的协同作用效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种具有式I所示结构的多肽自组装分子，其特征在于，所述多肽自组装分子结构为：
2.权利要求1所述多肽自组装分子在作为药物载体中的应用。
3.权利要求1所述多肽自组装分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将五氧化二磷加入到磷酸溶液中搅拌至室温，再将酪氨酸加入并在氮气保护下搅拌反应，得到具有式II所示结构的磷酸酪氨酸；
2)将得到磷酸酪氨酸与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和水及有机溶剂混合后进行反应，得到具有式III所示结构的化合物；
3)通过固相多肽合成法合成以及高效液相色谱提纯得到具有式I所示结构的多肽自组装分子；
其中，
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酪氨酸与五氧化二磷的摩尔比为1:3～5。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸溶液为质量分数为85％的溶液。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酪氨酸的磷酸化反应的温度为80℃。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸酪氨酸与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比优选为1:1.1～1.5。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂与水的体积比为1:1，所述有机溶剂为乙腈。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的固相多肽合成法为2-氯三苯甲基氯树脂经标准的固态多肽合成法得到多肽自组装分子。
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