CN108619085A - 一类超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子前体及其制法 - Google Patents

一类超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子前体及其制法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法，特征是通过有机合成反应合成荷载抗炎小分子药物的凝胶因子前体，通过加入碱性磷酸酶进行恒温孵育的方式控制成胶，能够直观地显示牛小肠来源的碱性磷酸酶的活性。本发明的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料凝胶因子合成简单，成胶条件容易控制；由于凝胶因子前体荷载有小分子药物，小分子药物可从侧链缓慢释放，因此可以延长药物驻留时间和提高药效。本发明填补了荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法方面的空白。

Description

一类超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子前体及其制法
技术领域
本发明属于超分子水凝胶纳米材料技术领域，具体涉及荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法。
背景技术
德国威利集团的《先进材料》杂志(Adv.Mater.,2006,18,1365–1370)报道了芴甲氧羰基保护的寡肽作为凝胶因子的超分子水凝胶，该凝胶因子是通过调节pH即物理刺激形成超分子水凝胶，并不适宜生物体系的应用。采用萘乙酸修饰的寡肽作为凝胶因子的超分子水凝胶曾见于《美国化学会会志》(J.Am.Chem.Soc.,2006,128,3038-3043)的报道。相对于芴甲氧羰基保护基，萘乙酸具有更好的生物相容性，且在较强碱性条件下更稳定。其将生物过程整合在凝胶化过程中，采用磷酸酶调节成胶，并研究了在激酶作用下降解凝胶的可能性，但未见进一步对荷载抗炎小分子药物的凝胶因子前体及其成胶方式和相应凝胶性质的研究。
至今尚未见到对于采用荷载抗炎药物“地塞米松”小分子药物的萘乙酸修饰磷酸化寡肽作为凝胶因子前体，通过牛小肠来源的碱性磷酸酶的作用形成超分子水凝胶纳米材料的具体成胶方式及凝胶性质方面研究工作的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一类荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及凝胶因子前体及其制备方法，以获得荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料，填补荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法方面的空白。
本发明的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料的酶敏感凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：先合成地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯，按：将2.55毫摩尔地塞米松(Dex)溶于25毫升吡啶，加入含7.65毫摩尔丁二酸酐和0.255毫摩尔二甲氨基吡啶的1毫升吡啶溶液，在氮气保护下室温磁力搅拌反应过夜，用真空泵将吡啶去除后向残留物中加入40毫升去离子水，室温磁力搅拌十分钟，离心所得的沉淀再次使用去离子水进行清洗即得地塞米松丁二酸(命名为P1)；取0.2毫摩尔地塞米松丁二酸与0.2毫摩尔N-羟基琥珀酰亚胺混合溶解于10毫升三氯甲烷中，加入0.2毫摩尔二环己基碳二亚胺，室温磁力搅拌过夜反应，通过冷冻干燥以及高效液相色谱纯化后，得地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(命名为P2)；
再合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀15分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，切去酪氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-赖氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔1-萘乙酸反应6-8小时，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为萘乙酸修饰的磷酸化寡肽序列——萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(叔丁基氧羰基)-酪氨酸-O-磷酸基，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P3；
最后合成荷载地塞米松小分子药物的凝胶因子前体，按：将1毫摩尔纯化合物P3用含19毫升三氟乙酸和1毫升二氯甲烷以及200微升三异丙基硅烷的混合溶液在室温反应3小时脱去其赖氨酸侧链的保护基叔丁基氧羰基；通过真空泵干燥后用高效液相色谱分离纯化，收集在紫外波长226纳米级268纳米处有特征吸收的主要组分，得到第三种纯的化合物P4；将0.37毫摩尔地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(P2)溶解于4毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再将0.37毫摩尔P4和0.61毫摩尔N，N-二异丙基乙胺加入上述溶液中并在室温磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P5；
其中固相多肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基，而赖氨酸侧链氨基由叔丁基氧羰基修饰，酪氨酸的侧链酚羟基由磷酸基修饰；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，切除9-芴甲氧羰基的试剂是体积浓度为20％的哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液；在每接上一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯撒测试(KaiserTest)试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸已接上。
上述合成的纯化合物P1、P2、P3、P4和P5，其特征结构分别为：
其中第五种纯化合物P5是荷载抗炎小分子药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶特异性识别并剪切的化合物。
本发明的另一种产品为荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及其制备方法，其特征在于按照如下配比调节成胶：将2毫克的第一种纯化合物P5溶于200微升pH为7.4、浓度为0.2摩尔的磷酸盐缓冲液中，至第五种纯化合物P5完全溶解形成无色透明溶液，再加入40单位每毫升的牛小肠来源的碱式磷酸酶溶液10微升，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度孵育至形成超分子水凝胶纳米材料。
与传统的超分子水凝胶纳米材料相比，本发明的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料的显著优点是凝胶因子合成简单，成胶条件容易控制，可用于有效荷载小分子抗炎药物地塞米松，有效在细胞水平抑制炎症，也能有效对肝脏纤维化疾病进程产生抑制；本发明的荷载抗炎小分子药物的凝胶因子前体通过简单的有机合成得到，制备容易，可以通过加入碱性磷酸酶进行恒温孵育的方式控制成胶，同时由于凝胶因子前体含有通过酯键与肽链底物相连接的小分子药物，其可以在酯酶的作用下被缓慢剪切，从而达到在高表达酯酶的病理部位缓慢释放小分子药物的效果。因此，利用本发明的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及其制备方法可以实现通过简单的方法合成凝胶因子前体及控制生成凝胶因子自组装形成荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料，同时完成了凝胶材料的力学性质研究。本发明填补了双酶控制的药物缓释超分子水凝胶材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法方面的空白。
附图说明
图1为实施例1中合成的第一种纯化合物P1的质谱图。
图2为实施例1中合成的第二种纯化合物P2的质谱图。
图3为实施例2中第四种纯化合物P4的核磁共振氢谱；
图4为实施例2中第五种纯化合物P5的核磁共振氢谱；
图5为实施例2中第五种纯化合物P5的核磁共振碳谱；
图6为实施例2中第五种纯化合物P5的核磁共振磷谱。
图7为实施例2中合成的第四种纯化合物P4的质谱图。
图8为实施例2中合成的第五种纯化合物P5的质谱图。
图9为实施例3中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的光学照片。
图10为实施例3中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的冷冻电子显微镜表征。
图11为实施例3中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的应力扫描图谱；
图12为实施例3中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的频率扫描图谱。
图13位实施例4中第五种纯化合物P5在体外环境完成牛小肠来源的碱性磷酸酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析的结果。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明作进一步具体详细的说明。其中实施例1中提供了第一种纯化合物P1与第二种纯化合物P2的合成，实施例2中提供了第三、四和五种纯化合物P3、P4和P5的合成，实施例3为超分子水凝胶材料力学性质检测实验，实施例4为在体外条件下牛小肠来源的碱性磷酸酶的活性检测实验。第五种纯化合物P5是荷载小分子抗炎药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶特异性识别并剪切的化合物。
实施例1：纯化合物P1和P2的合成
先合成地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯。
本实施例中第一种纯化合物P1(Dex-COOH)和第二种纯化合物P2(Dex-COOH-NHS)的合成路线如下：
将2.55毫摩尔地塞米松溶于25毫升吡啶，再加入含7.65毫摩尔丁二酸酐和0.255毫摩尔二甲氨基吡啶的1毫升吡啶溶液，溶液在氮气保护下室温中磁力搅拌反应过夜，用真空泵将吡啶去除然后向残留物中加入40毫升去离子水，再将所得水溶液在室温下磁力搅拌十分钟，离心所得的沉淀再次使用去离子水进行清洗即可得地塞米松丁二酸(命名为P1)，再取0.2毫摩尔地塞米松丁二酸与0.2毫摩尔N-羟基琥珀酰亚胺混合溶解于10毫升三氯甲烷中，在室温下完全溶解后，向所得溶液中加入0.2毫摩尔二环己基碳二亚胺，将所得混合溶液在室温下磁力搅拌过夜反应，通过冷冻干燥以及高效液相色谱纯化后，便可得地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(命名为P2)。
采用赛默飞公司生产的FinniganLCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物P1和P2进行电喷雾离子质谱数据采集得到如图1和图2所示的两个质谱图：
图1是本实施例中合成的第一种纯化合物P1的质谱图；图2为第一种纯化合物P1的质谱图。由图1可见，第一种纯化合物P1的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z493.00；由图2可见，第二种纯化合物P2的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z590.24。
实施例2：纯化合物P3、P4和P5的合成
采用固相肽合成法将萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(叔丁基氧羰基)-酪氨酸-O-磷酸基、寡肽片段分别合成出来。
本实施例中第三种纯化合物P3(Nap-Phe-Phe-Lys(Boc)-Tyr(PO(OH)2))、第四种纯化合物P4(Nap-Phe-Phe-Lys-Tyr(PO(OH)2))以及第五种纯化合物P5(Nap-Phe-Phe-Lys(Dex)-Tyr(PO(OH)2))的合成路线如下：
将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀15分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，切去酪氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-赖氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔1-萘乙酸反应6-8小时，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为萘乙酸修饰的磷酸化寡肽序列——萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(叔丁基氧羰基)-酪氨酸-O-磷酸基，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P3；
最后合成荷载地塞米松小分子药物的凝胶因子前体，按：将1毫摩尔纯化合物P3用含19毫升三氟乙酸和1毫升二氯甲烷以及200微升三异丙基硅烷的混合溶液在室温下反应3小时脱去其赖氨酸侧链的保护基。通过真空泵干燥后用高效液相色谱分离纯化，收集在紫外波长226纳米级268纳米处有特征吸收的主要组分，可得到第三种纯的化合物P4；将0.37毫摩尔地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(P2)溶解于4毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再将0.37毫摩尔P4和0.61毫摩尔N，N-二异丙基乙胺加入上述溶液中并在室温下磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P5。
采用德国布鲁克公司(bruker)布鲁克核磁软件解析本实施例中合成的纯化合物得到如图3、图4、图5和图6所示的核磁共振谱图：
图3是本实施例中合成的第四种纯化合物P4的核磁共振氢谱图；图4为第五种纯化合物P5的核磁共振氢谱图；图5为第五种纯化合物P5的核磁共振碳谱图；图6为第五种纯化合物P5的核磁共振磷谱图。由图3可见，第四种纯化合物P4的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜，400MHz):δ8.34(d,J＝8.5Hz,1H),8.18–8.08(m,2H),7.98–7.63(m,6H),7.42(ddd,J＝30.0,15.0,7.4Hz,3H),7.19(q,J＝5.1,4.5Hz,10H),7.07(d,J＝8.2Hz,2H),4.59–4.36(m,3H),4.30(d,J＝7.0Hz,1H),3.83(d,J＝12.1Hz,2H),3.12–2.82(m,8H),2.72(d,J＝6.8Hz,4H),1.53–1.43(m,2H),1.24(s,4H)；由图4可见，第五种纯化合物P5的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜，400MHz):δ8.32(d,J＝8.5Hz,1H),8.20–8.14(m,1H),8.04(d,J＝8.0Hz,1H),7.90–7.73(m,3H),7.50–7.26(m,3H),7.20(d,J＝11.4Hz,10H),7.07(d,J＝8.1Hz,2H),6.22(d,J＝10.1Hz,1H),6.01(s,1H),5.40(s,1H),5.35–4.93(m,2H),4.77(d,J＝17.7Hz,1H),4.54(dt,J＝22.2,8.9Hz,2H),4.42(q,J＝7.4Hz,1H),4.31(d,J＝6.7Hz,1H),4.14(d,J＝10.8Hz,1H),3.02(d,J＝12.2Hz,4H),2.95–2.65(m,5H),2.58(d,J＝7.9Hz,2H),2.44–2.24(m,4H),2.13(dt,J＝20.3,11.7Hz,2H),2.04–1.71(m,2H),1.71–1.52(m,3H),1.48(s,3H),1.37(q,J＝6.3Hz,2H),1.26(d,J＝21.8Hz,4H),1.11–0.90(m,1H),0.88(s,3H),0.78(d,J＝7.1Hz,3H)；由图5可见，第五种纯化合物P5的核磁共振碳谱(d6-二甲亚砜，75MHz):δ205.27,185.79,173.10,172.36,172.00,171.63,171.12,170.79,170.25,167.60,153.26,150.56,138.20(2C),133.65,133.32,132.87,132.32,130.56,129.66,129.42,128.69,128.46,128.40,128.10,127.39,126.63,126.38,125.96,125.84,124.59,120.21(3C),90.91(2C),54.23,54.14,48.56(2C),37.99,37.80,36.13,35.82,32.42,30.32,29.27,27.74,23.38,23.09,16.71,15.56；由图6可见，第五种纯化合物P5的核磁共振磷谱(d6-二甲亚砜，162MHz):δ(ppm):-6.27。
采用赛默飞公司生产的FinniganLCQ先进离子捕获质谱仪对纯化合物P4和P5进行电喷雾离子质谱数据采集得到如图7和图8所示的两个质谱图：
图7是本实施例中合成的第四种纯化合物P4的质谱图；图8为第五种纯化合物P5的质谱图。由图7可见，第四种纯化合物P4的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z852.26(FigureS5).；由图8可见，第五种纯化合物P5的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H+)]:m/z1326.52。
第五种纯化合物P5是荷载抗炎小分子药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶特异性识别并剪切的化合物；第五种纯化合物P5与牛小肠来源的碱性磷酸酶共孵育的方式调节成胶得到超分子水凝胶纳米材料。
本发明的酶敏感的超分子水凝胶纳米材料，按照如下配比进行调节成胶：将2毫克的第五种纯化合物P5溶于200微升，pH为7.4，浓度为0.2摩尔的磷酸盐缓冲液中，至第五种纯化合物P5完全溶解形成无色透明溶液，再加入40单位的牛小肠来源的碱式磷酸酶溶液10微升，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度下孵育10小时至形成超分子水凝胶纳米材料。前述成胶过程中，磷酸盐缓冲液的使用是为了让溶解纯化合物的溶液保持弱碱性，以保持随后加入的牛小肠来源的碱式磷酸酶的生物活性，保证成胶过程的顺利进行。
采用上述方法制备得到的材料，用于超分子水凝胶材料的微观形貌观察。
图9为本实施例2中第五种纯化合物P5形成超分子水凝胶纳米材料前后的对比光学照片。图10为本实施例中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的冷冻透射电子显微镜表征。
图9给出的对比光学照片中，a瓶为第一种纯化合物P5形成超分子水凝胶纳米材料后的光学照片，表现为凝胶，表明经过与牛小肠来源的碱性磷酸酶的共孵育，确实得到了荷载抗炎小分子药物的凝胶材料；图10给出的本实施例中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的冷冻透射电子显微镜表征，表明所得超分子水凝胶材料由直径为3.7±0.7纳米的纳米纤维组成。
实施例3：超分子水凝胶材料力学性质检测实验
图11为实施例2中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的应力扫描图谱。图12为实施例2中第五种纯化合物P5形成的超分子水凝胶纳米材料的储能模量(G’)及损失模量(G”)的动态频率扫描图谱。
由图11中储能模量随应力变化的方块曲线b和损失模量随应力变化的圆点曲线c可以看出，采用本发明方法制备的超分子水凝胶纳米材料在所受应力从0.1％增加到10％时，储能模量(G’)与损失模量(G”)随应力的变化没有明显变化，且储能模量(G’)大约为损失模量(G”)的五倍，表明所得材料为超分子水凝胶材料。由图12中储能模量随频率变化的方块曲线d和损失模量随频率变化的圆点曲线e可以看出，采用本发明方法制备的超分子水凝胶纳米材料在频率扫描范围为0.1赫兹到10赫兹时，储能模量(G’)与损失模量(G”)随频率的变化没有明显变化，且储能模量(G’)大约为损失模量(G”)的六倍，表明所得材料为超分子水凝胶材料。
实施例4：牛小肠来源的碱性磷酸酶的活性检测实验
本实施例活性检测实验中采用浓度为7.5毫摩尔每升的第五种纯化合物P5，在含有浓度为10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷、50毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的氯化镁、0.1毫摩尔每升的氯化锌和100个单位体积为10微升的牛小肠来源的碱性磷酸酶的总体积为500微升的溶液里，37摄氏度下孵育6小时完成酶的识别及剪切。
图13是对本发明方法制备的第五种纯化合物P5在体外环境完成牛小肠来源的碱性磷酸酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测的表征结果，曲线f为第五种纯化合物P5不与牛小肠来源的碱式磷酸酶一起孵育，得到的色谱分析结果，其色谱峰f1即表示第五种纯化合物P5；曲线g为第五种纯化合物P5与牛小肠来源的碱性磷酸酶一起孵育2小时，得到的色谱分析结果，其中色谱峰g1与曲线f的色谱峰f1有相同的保留时间，即表示第五种纯化合物P5经过酶识别剪切2小时后仍有近一半残留，而新出现的色谱峰g2则具有更长的保留时间，同时经过电喷雾离子化三重四级杆质谱检测，其确为第五种纯化合物P5被酶识别剪切后的得到的凝胶因子，表明第五种纯化合物P5在体外环境中可以被牛小肠来源的碱式磷酸酶识别并剪切；曲线h为第五种纯化合物P5与牛小肠来源的碱性磷酸酶一起孵育6小时，得到的色谱分析结果，其中色谱峰h1与曲线f的色谱峰f1有相同的保留时间，即表示第五种纯化合物P5经过酶识别剪切6小时后已经基本完全被酶切成失去磷酸根的凝胶因子。
通过上述实施例及其检测实验的结果可知：本发明的荷载抗炎小分子药物的凝胶因子前体通过简单的有机合成得到，制备容易，可以通过加入碱性磷酸酶进行恒温孵育的方式控制成胶，从而直观地反映碱式磷酸酶的活动情况，同时由于凝胶因子前体荷载有小分子药物，该药物可以经过缓慢释放而发挥疗效。综上，利用本发明的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料及其制备方法可以实现通过简单的方法合成凝胶因子前体及控制生成凝胶因子自组装形成荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料。本发明方法填补了荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶材料及酶敏感凝胶因子前体及其制备方法方面的空白，并实现在体外条件下检测牛小肠来源的碱性磷酸酶的活性。

Claims (6)

1.一类荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料的酶敏感凝胶因子前体的制备方法，其特征在于：
先合成地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活性酯，按：将2.55毫摩尔地塞米松溶于25毫升吡啶，加入含7.65毫摩尔丁二酸酐和0.255毫摩尔二甲氨基吡啶的1毫升吡啶溶液，在氮气保护下室温磁力搅拌反应过夜，用真空泵将吡啶去除后向残留物中加入40毫升去离子水，室温磁力搅拌十分钟，离心所得的沉淀再次使用去离子水进行清洗即得地塞米松丁二酸，命名为P1；取0.2毫摩尔地塞米松丁二酸与0.2毫摩尔N-羟基琥珀酰亚胺混合溶解于10毫升三氯甲烷中，加入0.2毫摩尔二环己基碳二亚胺，室温磁力搅拌过夜反应，通过冷冻干燥以及高效液相色谱纯化后，得地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯，命名为P2；
再合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀15分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-O-磷酸基-L-酪氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应6-8小时后，用200微升甲醇反应30分钟，切去酪氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-赖氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸反应6-8小时，切去苯丙氨酸的保护基，加入活化的1.6毫摩尔1-萘乙酸反应6-8小时，最后用体积浓度为1％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下合成的肽段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为萘乙酸修饰的磷酸化寡肽序列——萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(叔丁基氧羰基)-酪氨酸-O-磷酸基，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P3；
最后合成荷载地塞米松小分子药物的凝胶因子前体，按：将1毫摩尔纯化合物P3用含19毫升三氟乙酸和1毫升二氯甲烷以及200微升三异丙基硅烷的混合溶液在室温反应3小时脱去其赖氨酸侧链的保护基叔丁基氧羰基；通过真空泵干燥后用高效液相色谱分离纯化，收集在紫外波长226纳米级268纳米处有特征吸收的主要组分，得到第三种纯的化合物P4；将0.37毫摩尔地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯P2溶解于4毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再将0.37毫摩尔P4和0.61毫摩尔N，N-二异丙基乙胺加入上述溶液中并在室温磁力搅拌反应过夜，反应液经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波长226纳米及268纳米处有特征吸收的主要组分，即为第二种纯化合物P5；
其中固相多肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基，而赖氨酸侧链氨基由叔丁基氧羰基修饰，酪氨酸的侧链酚羟基由磷酸基修饰；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，切除9-芴甲氧羰基的试剂是体积浓度为20％的哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液；在每接上一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯撒测试试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸已接上。
2.一种权利要求1所述方法制备的地塞米松丁二酸N-羟基琥珀酰亚胺活化酯即第二种纯化合物P2，其特征在于结构为：
3.一种权利要求1所述方法制备的萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(叔丁基氧羰基)-酪氨酸-O-磷酸基即第三种纯化合物P3，其特征在于结构为：
4.一种权利要求1所述方法制备的萘乙酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-O-磷酸基即第四种纯化合物P4，其特征在于结构为：
5.一种权利要求1所述方法制备的超分子水凝胶纳米材料的酶敏感凝胶因子前体即第五种纯化合物P5，其特征在于结构为：
它是荷载抗炎小分子药物的可以被牛小肠来源的碱性磷酸酶特异性识别并剪切的化合物。
6.一种以权利要求1方法制备的超分子水凝胶纳米材料的凝胶因子前体即第五种纯化合物P5调制成的荷载抗炎小分子药物的超分子水凝胶纳米材料，其特征在于按照如下配比调节成胶：将2毫克的第一种纯化合物P1溶于200微升pH为7.4、浓度为0.2摩尔的磷酸盐缓冲液中，至第一种纯化合物P1完全溶解形成无色透明溶液，再加入40单位的牛小肠来源的碱式磷酸酶溶液10微升，振荡溶液使之混合均匀，在37摄氏度孵育至形成超分子水凝胶纳米材料。
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