CN112986349A

CN112986349A - 一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法

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Publication number: CN112986349A
Application number: CN202110497459.7A
Authority: CN
Inventors: 杨志伟; 刘铮; 胡春苗
Original assignee: Suzhou Yilai Biotechnology Co ltd; Jiangsu Jicui Molecule Engineering Research Institute Co ltd
Current assignee: Suzhou Yilai Biotechnology Co ltd; Jiangsu Jicui Molecule Engineering Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-05-08
Filing date: 2021-05-08
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-05-08
Also published as: CN112986349B

Abstract

本发明公开了一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，属于电化学检测材料技术领域。所述的磁珠改性标记方法，特征步骤为：1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯，与氨基磁珠表面的氨基通过成酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得到用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与反应基团X能够形成化学键。本发明标记后的磁珠可以明显改善通电后磁珠清洗后的残留。

Description

一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法

技术领域

本发明属于电化学检测材料技术领域，更具体的涉及一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法。

背景技术

在使用磁珠进行的电化学发光检测中，通电之后磁珠在电极表面发生氧化还原反应。在这一过程中，会导致电极表面和磁珠表面产生电磁相互作用，从而使得磁珠吸附在电极表面，导致检测后电极表面不易清洗干净。残余磁珠使得检测背景增高，降低了仪器的检出限，因此必须得到解决。

目前有很多公司提供链霉亲和素或抗体标记的磁珠，也有多种比较成熟的磁珠表面蛋白质标记技术。传统的磁珠上标记蛋白的办法，通常是使用羧基磁珠，使用缩合试剂如DCC，EDC和活化试剂如HOBT、HOSu等的缩合试剂对羧基进行活化，再与蛋白质分子表面的氨基进行偶联反应。然而，由于蛋白质标记通常在水溶液中进行，磁珠表面的活化酯在标记过程中大部分会水解重新变成羧基，因此会增加标记后磁珠的电极表面残留。

由于使用磁珠进行的电化学发光检测目前基本由罗氏诊断所垄断，因此市面上很难找到专门针对电化学发光检测而优化过的磁珠产品。申请人测试的磁珠产品和样品也基本上都只是为化学发光或者核酸检测而开发的，这些产品在我们的测试中都有很严重的电极表面残留。当我们对未做修饰的羟基磁珠、羧基磁珠以及氨基磁珠悬浊液加到金电极表面，进行通电测试（-1-2.5V）后，用清洗液洗涤，可观察到三种磁珠在金电极表面的残留程度：氨基磁珠>羧基磁珠>>羟基磁珠。

针对电化学发光的特殊性，本发明申请人研究了磁珠表面电荷性质和亲水/疏水性质对于电极吸附的影响，设计了全新的标记方法，有效控制了标记后的磁珠表面的残余电荷和疏水基团，从而大大降低了电极表面的磁珠残留。

发明内容

本发明通过修饰磁珠的表面，实现链霉亲和素或其他蛋白质在磁珠表面的标记，同时增加磁珠表面的亲水性，减少磁珠表面的带电基团和剩余电荷，从而实现有效降低磁珠在电极表面残留的目的。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，见式（X），包括如下步骤

式（X）

1）将带有反应基团A的磁珠与化合物L1和封闭基团MSK先后或同时反应得处理后的磁珠；封闭基团MSK带有极性不带电的基团，含有保护基PG或不含保护基PG；

2）将带有与化合物L1反应的标记物L2-Lable与步骤1）处理后的磁珠进行标记反应，得到表面封闭的标记磁珠；其中L2与L1反应，Lable为想要标记到磁珠上的分子；

当封闭基团MSK含有保护基PG时，所述保护基PG可以在标记反应之前或之后进行，得到最终用于电化学发光检测的标记磁珠；

反应基团A选自以下反应基团的一种，包括氨基、羧基、羟基、炔基、叠氮基、卤代烷基、卤代芳基或磺酰基，优选氨基；

当反应基团A为氨基时，具体步骤为：

1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯（简称羟基活化酯）和带有反应基团X的酸的活化酯（X基团活化酯），与氨基磁珠表面的氨基通过酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；

2）将改性氨基磁珠（I）进行脱羟基保护基PG游离出羟基，得到表面是部分羟基和部分反应基团X的磁珠（II）；

3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与X基团能够形成化学键；

优选的，所述保护基PG为叔丁氧羰基、苄氧羰基、苄基、三氟甲酰基、苯甲酰基、芴氧羰基、烯丙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、乙酰基、特戊酰基、甲氧甲基或4,4'-二甲氧基三苯基甲基中任意一种。

优选的，步骤1）中羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯中，羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯是由羟基被保护基PG保护的羟基酸与酯的活化剂形成，带有反应基团X的酸的活化酯是由带有反应基团X的酸与酯的活化剂形成。

优选的，所述羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的活化酯；进一步优选为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯，即5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸与N-羟基丁二酰亚胺形成的活化酯。

优选的，所述带有反应基团X的酸的活化酯为炔基酸的活化酯；进一步优选为4-戊炔酸的活化酯，更优选为4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯，即4-戊炔酸与N-羟基丁二酰亚胺形成的活化酯。

优选的，所述反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA为叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。

所述叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA的制备方法包括如下步骤：将5-叠氮戊酸置于反应管中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）、 N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和 DMF；室温下反应后得到5-叠氮戊酸的N-羟基丁二酰亚胺酯（活化酯）的DMF溶液；将1毫克的链霉亲和素（SA）配置为水溶液，加入制备得到5-叠氮戊酸活化酯的DMF溶液，震荡4-12小时后，经过Sephadex G-25脱盐柱纯化得到叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。

优选的，所述羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯为5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯，所述带有反应基团X的酸的活化酯为4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯，所述反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA为叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。

优选的，5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯和4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯是将4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸与N-羟基丁二酰亚胺在缩合剂的作用下一锅法制备而成，其中4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸的摩尔比为1：0.1-5.0；进一步优选为3:1。

本发明整个标记路线反应条件温和，不会破坏磁珠的化学结构，也不会造成蛋白质分子的失活。通过控制羟基活化酯和X基团活化酯的比例，可以调节磁珠表面的蛋白质载量以及亲水/疏水性、电荷等性能。该种磁珠可以明显改善通电后磁珠清洗后的残留。我们使用商业可得的磁珠进行了通电发光的测试，得到了相应的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

本发明设计了如下磁珠标记路线（见下“式1”），以改善磁珠在电极表面残留的问题。一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，包括如下步骤：

1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯（简称羟基活化酯）和带有反应基团X的酸的活化酯（简称X基团活化酯），与氨基磁珠表面的氨基通过酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；

其技术原理可以见式1所示：

整个标记路线反应条件温和，不会破坏磁珠的化学结构，也不会造成蛋白质分子的失活。通过控制羟基活化酯和X基团活化酯的比例，可以调节磁珠表面的蛋白质载量以及亲水/疏水性、电荷等性能。

实施例

1）5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊酸苄酯的合成

将19.3 g 5-羟基戊酸苄酯置于干燥的反应瓶中，氩气保护，加入100 mL干燥过的吡啶搅拌使固体完全溶解。分批加入37.7g 4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷（DMT-Cl），加入0.2 g 4-二甲氨基吡啶（DMAP），室温保持反应16小时，TLC监测原料反应完全。加入10 mL甲醇淬灭反应，40℃减压蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯150 mL和饱和碳酸氢钠水溶液100 mL分液，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥。

快速柱层析PE:EA=30:1-20:1，得到13.0 g产品。质谱检测：511.20（M+1）。

2）5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊酸的合成

将13g 步骤1）所得到的产品加入反应瓶中，加入200 mL乙酸乙酯和6 mL三乙胺，用氩气置换出体系的空气后，加入2.6g 10wt% Pd/C催化剂，通入氢气后在室温反应16小时。TLC显示原料反应完全，经过硅藻土过滤，真空除去溶剂得到目标产品的粗品11.6 g。质谱检测：419.19（M-1）。

3）叠氮化合物标记的链霉亲和素(SA-N₃)的合成

将14.3 mg 5-叠氮戊酸置于反应管中，加入25 mg 二环己基碳二亚胺（DCC）和13mg N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和1 mL DMF。室温下反应2小时后得到0.10 M 5-叠氮戊酸的N-羟基丁二酰亚胺酯（活化酯）的DMF溶液。将1毫克的链霉亲和素（SA）配置为10 mg/mL的水溶液，加入0.5 微升制备得到5-叠氮戊酸活化酯的DMF溶液（此处为10当量，相对于SA；其它技术方案可以为1-100当量相对于SA），在37℃下震荡4-12小时后，经过Sephadex G-25脱盐柱纯化得到叠氮化合物标记的链霉亲和素。

4）链霉亲和素和羟基包被磁珠的制备，如式2所示：

将50 mg 5-(4,4'-二甲氧基三苯基甲氧基)-戊酸和25 mg 4-戊炔酸置于反应管中，加入25 mg 二环己基碳二亚胺和13 mg N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和1 mL DMF。室温下反应2小时后得到活化酯的混合物。向氨基磁珠（苏州纳微生物生产磁珠，型号为lot#J12P3M4）中加入上述得到的活化酯的混合物，室温下震荡8小时。向修饰后的磁珠中加入10% TFA的DMF溶液，得到羟基和炔基表面修饰的磁珠。加入0.010 mL 10 mmol/L三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺-铜（I）络合物)Cu(I)-TPAP复合物和0.020 mL 5 mg/mL叠氮化合物标记的链霉亲和素(SA-N₃)，25℃反应振荡8小时，经过磁力架的分离，得到链霉亲和素和羟基包被的磁珠。

市面上常用的生物素标记的磁珠，例如Dynabeads M-270 Streptavidin和Dynabeads M-280 Streptavidin，没有为电化学发光进行过优化，因此在电极上的残留比较严重。我们的研究和测试磁珠表面，通过对磁珠表面进行改性及改变磁珠载量可以大幅降低磁珠的电极表面残留，从而更适合用于电化学发光检测。

将购买的磁珠（Dynabeads M-270 SA、Dynabeads M-280 SA）分别稀释10倍后取0.020mL，加入2μL生物素标记的三联吡啶钌标样（1毫克/毫升），37℃温育20min后用DropsensμStat ECL电化学工作站和金电极片（DRP-C220AT），循环伏安法测定电化学发光信号（-0.2~1.5V，0.05V/s）。测试完后使用罗氏清洗液和水进行清洗（罗氏清洗液洗2遍，水洗一遍），观察磁珠的发光情况及清洗程度。

将SA包被以及羟基改性后的氨基磁珠（3微米），通过改变上述实施例中步骤4）中羟基活化酯和X基团活化酯的比例（即调节5-(4,4'-二甲氧基三苯基甲氧基)-戊酸和4-戊炔酸的加入量摩尔比）分别标记。改变羟基活化酯和X基团活化酯（即炔基活化酯）的摩尔比1：3（样品a），1：1（样品b），3：1（样品c）。将上述磁珠分别稀释10倍后取0.020mL，加入0.002mL标准样品0.1 mg/mL生物素标记的三联吡啶钌标样（1毫克/毫升），37℃温育20min后，用同样的方法测试磁珠的电化学发光强度和清洗后磁珠的残留信号强度，测试结果见表1。

表1电化学发光强度和清洗后磁珠的残留信号强度

对于不同型号磁珠进行电化学发光及其清洗后残留发光值的测试，Dynabeads M-270 SA和Dynabeads M-280 SA磁珠发光值均为50万，数值接近，清洗后残留分别为30%和15%。而从三种不同羟基试剂和炔基试剂比例标记的三种磁珠a，b，c的测试结果来看，三种标记磁珠发光值较低，但从清洗后的发光值来看，残留也大大降低，均小于Dynabeads M-280 SA的残留。并且当羟基试剂和炔基试剂比例达到3:1时，残留仅为3.1%，很大程度降低了磁珠在电极表面的残留。当羟基试剂比例的增加，被修饰后磁珠的表面电荷密度会进一步降低，磁珠表面和电极表面之间的作用力也会减弱，使得磁珠更容易被清洗液洗去。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，例如用其他化学修饰方法增加磁珠表面亲水性，减少带电基团和剩余电荷的标记方法均应视为等效的置换方式，包括但不限于选择表面有其他反应基团（非氨基）的磁珠做为起始原料；或者通过其他路线做点击化学或其他缀合反应实现蛋白质标记和增加极性基团的目的等，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于电化学发光检测的磁珠改性标记方法，其特征在于：包括如下步骤：

当封闭基团MSK含有保护基PG时，所述保护基PG在标记反应之前或之后进行，得到最终用于电化学发光检测的标记磁珠；

反应基团A选自以下反应基团的一种，包括氨基、羧基、羟基、炔基、叠氮基、卤代烷基、卤代芳基或磺酰基；

当反应基团A为氨基时，具体步骤为：

1）将羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯，与氨基磁珠表面的氨基通过成酰胺键反应，将氨基磁珠表面的氨基完全反应掉形成改性氨基磁珠（I）；

3）将被反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA与磁珠表面的X基团进行标记反应得到用于电化学发光检测的磁珠；所述反应基团Y与反应基团X能够形成化学键。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述保护基PG是叔丁氧羰基、苄氧羰基、苄基、三氟甲酰基、苯甲酰基、芴氧羰基、烯丙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、乙酰基、特戊酰基、甲氧甲基或4,4'-二甲氧基三苯基甲基中任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯和带有反应基团X的酸的活化酯中，羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯是由羟基被保护基PG保护的羟基酸与酯的活化剂形成，带有反应基团X的酸的活化酯是由带有反应基团X的酸与酯的活化剂形成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述羟基被保护基PG保护的羟基酸活化酯是5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述带有反应基团X的酸的活化酯是4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应基团Y修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA为叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA的制备方法包括如下步骤：将5-叠氮戊酸置于反应管中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）、 N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和 DMF；室温下反应后得到5-叠氮戊酸的N-羟基丁二酰亚胺酯的DMF溶液；将1毫克的链霉亲和素（SA）配置为水溶液，加入制备得到5-叠氮戊酸活化酯的DMF溶液，震荡4-12小时后，经过Sephadex G-25脱盐柱纯化得到叠氮修饰的蛋白质分子链霉亲和素SA。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：5位被4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸的丁二酰亚胺活化酯和4-戊炔酸的丁二酰亚胺活化酯是将4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸与N-羟基丁二酰亚胺在缩合剂的作用下一锅法制备而成，其中4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸的摩尔比为1:0.1-5.0。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：4,4'-二甲氧基三苯基甲基保护的羟基戊酸和4-戊炔酸的摩尔比为3:1。