CN107652316B - 一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示；本发明同时涉及所述蛋白质化学交联剂的制备方法。本发明提供的多功能交联剂交联效率和稳定性都很好，尤其是基于三甲基硅基重氮甲基功能团类型的交联剂，对天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基以及蛋白质的碳端羧基的交联效率很高，是首例无需加入缩合剂活化的基于含有羧基的氨基酸残基选择性的交联剂。本发明通过对N‑(Boc)谷氨酸甲酯以及对含多种氨基酸的多肽的交联反应证明所述交联剂了对含有羧酸氨基酸残基有很高的交联效率及选择性，其与九种模式蛋白质和一种含有八种蛋白的混合物的交联反应证明了该类交联剂与含有羧基的氨基酸残基的简单纯蛋白体以及复杂的蛋白体系都具有很高的交联效率。R1‑X‑R2‑‑I。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质的结构及功能研究领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂交联应用及其制备方法。
背景技术
随着人类基因组计划的完成，仅完成基因层面的研究对于深入了解生物体各项生理功能及机制还远远不够。蛋白质作为生命体的物质基础和生命活动的主要承担者，在过去十几年被发现的数量大幅增加，研究其功能对理解各项生命活动的本质意义重大。目前，人们对于大量新发现的蛋白质的功能及其作用机制仍然不清楚，而蛋白质功能研究的本质就是解析其三维结构以及与其相互作用的蛋白。传统的蛋白质结构解析的方法主要包括：X射线晶体衍射法和核磁共振光谱学。这两种方法的分辨率都可以达到原子水平，但是对于蛋白样品量及纯度要求较高。对于X射线晶体衍射法而言，必须有蛋白晶体使其局限性较高，对于一些分子量大的蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常难获得的，此类蛋白用该方法无法实现结构解析；而核磁共振光谱学则对蛋白质有的水溶性有较高要求，且一般蛋白分子量要小于30kDa。化学交联蛋白结合质谱鉴定技术是近些年发展起来的一种高效方法，该方法则克服了上述问题。其原理主要通过用化学交联剂(chemical cross-linker)在相互作用的蛋白表面之间选择性与某些类型的氨基酸残基共价连接，再通过质谱鉴定交联的氨基酸位点获得蛋白结构信息。该方法整个工作流程包括(如图1所示)：1)交联剂特异性与蛋白质上某种氨基酸发生交联反应；2)被交联的蛋白样品通过酶切处理成肽段；3)串联质谱分析鉴定酶切后的交联肽段，进一步分析鉴定蛋白结构信息。此外，还有一种新兴的单分子冷冻电镜－三维重构技术目前备受结构生物学关注及应用，但其不能满足分子量大的蛋白质或蛋白复合体的局部构象解析的要求，所以常被用于与化学交联蛋白结合质谱鉴定技术联合使用于蛋白结构解析。化学交联剂常分为两种：分体式交联剂与一体式交联剂，他们的结构示意图如图2所示。
质谱技术的快速发展推动了化学交联剂对蛋白与蛋白的相互作用的研究应用。这主要归功于化学交联蛋白结合质谱鉴定技术的一些独特优势：1)化学交联剂可通过不可逆的共价键连接相互作用的蛋白质，理论上可以捕获到瞬时的以及动态的蛋白相互作用，而这运用其它方法很难实现；2)由于质谱分析是在蛋白质被水解后的多肽水平，因此该方法不受蛋白质纯度或蛋白复合物分子大小的限制；3)该方法分析速度快，对样品纯度要求低，灵敏度很高，需要的蛋白量可低至微克级别；4)有很多种可供选择的不同性质的化学交联剂，根据两个反应官能团的差别可分为：氨基—氨基，氨基—巯基，巯基—巯基，巯基—羧基；同时两个反应官能团之间的臂长也可以改变。
目前，已经有不少的基于赖氨酸和半胱氨酸等残基选择性的化学方法被发展用于蛋白交联。而发展更多方法来交联其他氨基酸对于研究蛋白-蛋白相互作用及蛋白复合物结构解析的意义重大，特别是对于那些蛋白相互作用表面丰度较高的氨基酸的交联对研究蛋白相互作用尤为重要。根据最新的数据库统计显示，含有羧酸的氨基酸残基占氨基酸总量的12.2％(天冬氨酸5.5％和谷氨酸6.7％)，与已被广泛发展交联的基于赖氨酸(5.8％)的方法相比，发展高效的交联羧基的方法意义尤为重大。但由于羧基本身活性较低，一般需要加入缩合剂活化，目前基于羧基的交联剂也很少，尤其是无需缩合剂活化的交联剂还无任何报道。
最早的有关连接蛋白羧基的试剂是基于碳二亚胺类试剂，其中代表性的是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，此类试剂交联羧基的机理是通过EDCI先活化较为惰性的羧基形成活泼的O-酰基异脲中间体，然后再与氨基类亲核试剂反应生成稳定的酰胺类交联产物。EDCI直接最早作为交联剂用于蛋白空间上相互接近的氨基与羧基的交联，生成零长度的交联产物。此类交联剂通常用于空间上相聚小于
的氨基与羧基之间的交联。通过引入双功能团的二酰肼类(dihydrazide)化合物作为交联剂，EDCI作为缩合剂的交联方法被进一步改进，二酰肼类交联剂与O-酰基异脲活性中间体反应实现了蛋白羧基与羧基的交联。由于二酰肼类交联剂有一定的臂长，交联蛋白空间上可能的位点范围大大增加，提高了交联效率以及交联产物的多样性。但该交联剂只在pH 5.5效率较高，主要因为O-酰基异脲活性中间体只在偏酸性pH环境下才较为稳定，中性或碱性容易被水解成无活性的脲类化合物。因此，pH限制了该方法在生理条件下的蛋白交联应用。使用缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)替代EDCI，结合使用二酰肼类交联剂能实现生理条件下的羧基的高效交联。主要因为DMTMM与羧基形成的中间体稳定性较高，交联效率较EDCI的方法提高很多，二酰肼类交联剂能有效捕捉交联中间体，能高效用于纯蛋白及蛋白复合体的交联。综上所述，目前关于羧基的交联方法，主要通过使用缩合剂EDCI以及DMTMM活化羧基的策略，但都须要使用大大过量的缩合剂，而过量的缩合剂会与带负电的羧基结合形成带正电或电中性的活性酯中间体，改变了蛋白表面电荷分布，这很可能造成蛋白在交联剂交联之前就发生构想改变甚至变性，从而造成交联得出的蛋白结构信息不是自然状态下的真实信息。因此，开发无需缩合剂在生理条件下选择性交联羧基的化学交联剂意义非常重大。
另外，尽管目前已经有很多化学交联剂被商业化，但是对于较为复杂的蛋白体系，由于酶切后的蛋白产物大部分都是无交联的普通肽段，被交联肽段所占比例很低，在复杂的体系中去鉴定交联的肽段非常困难。大部分交联剂目前仅仅局限于对相对简单的蛋白样品的分析，对复杂的样品的分析并没有太大作用。而通过引入生物素到交联剂，对交联后的复杂样品进行纯化富集，可以实现交联肽段与普通肽段的分离，进而能大大降低样品的复杂程度，因此可富集型交联剂也是当前发展的重点之一。因此，将这些官能团有效地融合在一起，发展三功能团的化学交联剂来解决复杂生物样品的分析也是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛋白质化学交联剂(Diazo-containing cross-linkers，Diazoker)。
具体而言，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I所示：
R1-X-R2 I；
所述通式I中，R1、R2各自独立地选自以下基团：
所述通式I中，X选自以下基团：
其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为1～3的整数；n5为1～5的整数；n6为1～3的整数；n7为1～7的整数；n8为1～5的整数；n9为1～5的整数；n10为1～5的整数；n11为1～3的整数；n12为1～5的整数；n13为1～5的整数；n14为1～3的整数；n15为1～5的整数；Ry为H或Me。
本发明优选所述R1和R2代表相同的基团。
本发明进一步优选R1和R2均为：
所述TMS(Trimethylsilyl)代表三甲基硅基。
当R1和R2均为：
时，本发明进一步对X基团进行优选，具体而言：
所述X可选自以下基团：
其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为1～3的整数；n5为1～5的整数；n6为1～3的整数；n7为1～7的整数；Ry为H或Me。
所述X也可以选自以下基团：
其中，n8为1～5的整数；n9为1～5的整数；n10为1～5的整数；n11为1～3的整数；n12为1～5的整数；n13为1～5的整数；n14为1～3的整数；n15为1～5的整数。
作为本发明的一种优选方案，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-1所示：
所述通式I-1中，n1为1～3的整数；R1、R2分别代表不同的基团；
优选地，所述R1为
所述R2为
作为本发明的一种优选方案，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-2所示：
所述通式I-2中，n6为1～3的整数；R1、R2分别代表不同的基团；
优选地，所述R1为
所述R2为 
作为本发明的一种优选方案，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-3所示：
所述通式I-3中，n7为1～7的整数；R1、R2分别代表不同的基团；
优选地，所述R1为
所述R2为
作为本发明的一种优选方案，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-4所示：
所述通式I-4中，n16代表1、2或3。
作为本发明的一种优选方案，所述蛋白质化学交联剂选自如下化合物：
本发明进一步保护所述交联剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：以双卤代直链烃类化合物为原料，在正丁基锂作碱以及-30℃～-40℃条件下，以三甲基硅基重氮甲烷(TMSCHN2)为亲核试剂进行亲核取代反应即得。
所述反应包括以下具体步骤：将正丁基锂在-78℃下加入到溶有TMSCHN2四氢呋喃溶液中，充分搅拌反应(约0.5～1h)后，缓慢加入双卤代直链烃类化合物的四氢呋喃溶液，在-78℃下搅拌反应(约0.5～1h)后，最后反应升至-30℃～-40℃搅拌过夜。反应加入水淬灭。用乙醚萃取后，经无水硫酸钠干燥。过滤后在减压下浓缩干燥除去残余溶剂得到橘黄色油状液体交联剂。
本发明所述双卤代直链烃类化合物可以以双羟基(二元醇)直链烃类化合物为原料，在碘、三苯基膦以及咪唑存在的条件下，经碘代反应得到。
本发明保护的化合物均可对原料中相应基团进行替换的情况下，采用与上述方法相同或相似的手段合成得到。
本发明进一步保护所述的交联剂在蛋白质分析中的应用。由于本发明的交联剂对含羧基的氨基酸可以实现特异性识别，因此，优选所述交联剂应用于含羧基的氨基酸的蛋白质分析。
现有技术提供的化学交联剂大多选择性交联赖氨酸或半胱氨酸，本发明提供的蛋白质化学交联剂是首次无需缩合剂的交联方法被应用于含羧基的氨基酸选择性交联剂。本发明证明了所述交联剂在含多种氨基酸肽段交联水平对含羧基的氨基酸的选择性，其与九种模式蛋白质和一种含有八种蛋白的混合体系的交联反应证明了这些交联剂与含羧基的氨基酸结合的高效性。化学交联蛋白联合质谱分析技术(CXMS)是一种高效且快速发展的蛋白结构解析技术，能被有效地应用于复杂的蛋白质复合物结构解析，且不需要进行严格的纯化过程。本发明的交联剂丰富了化学交联蛋白联合质谱分析技术实验中获得的结构信息。
附图说明
图1为利用化学交联剂研究蛋白质相互作用或蛋白复合物示意图；
图2为分体式交联剂与一体式交联剂结构示意图；
图3为使用交联剂Diazoker 1与N-(Boc)谷氨酸甲酯交联反应活性评估示意图；
图4为使用交联剂Diazoker 1在肽段水平上测试其与不同氨基酸反应选择性评估结果示意图；其中(a)、(b)、(c)分别为被交联测试的肽段KR-7(KVEEDVR),VR-7(VWDLVKR),以及TR-8(TPDVNKDR)被交联后的二级质谱结果，标记上三角符号的为选择性交联的天冬氨酸残基；
图5为使用优化后的交联条件对9种模式蛋白质的交联示意图；其中，图5a为Diazoker 1与各模式蛋白的交联的流程示意图；图5b为Diazoker 1与各模式蛋白的交联的结果，纹理直方图为交联的产物二级质谱谱图数，黑色实心直方图为交联的肽段对数；
图6为使用Diazoker 1评估模式蛋白结构交联得到的Cα-Cα距离分布；黑色实心直方图表示Diazoker 1的数据，表格显示了Diazoker 1交联结果中符合晶体结构的结果数目所占比例和各个交联剂的最大交联限制范围；
图7为Diazoker 1在一种含8种模式蛋白上混合物得到的交联对的结果示意图；纹理直方图表示交联的产物二级质谱谱图数，黑色实心直方图表示交联的肽段对数。
具体实施方式
本发明各实施例及实验例中：
关于试剂:本发明涉及的化学试剂均购于百灵威公司、阿尔法爱莎公司或TCI试剂公司。N-(Boc)谷氨酸甲酯、diiodide 1、diiodide2均根据相应文献报道制得。
关于溶剂:全部反应如无特殊说明，均使用无水溶剂进行。二氯甲烷、四氢呋喃通过氧化铝柱干燥。
关于实验技术:全部反应如无特殊说明，均在氩气保护下的干燥玻璃容器中进行。使用注射器或套管进行对空气或水蒸气敏感的试剂进行转移。除室温外，所有低温反应温度均用低温恒温反应浴控温进行。使用Kieselgel 60F254预先铺制的薄层色谱板进行分析，使用254nm紫外光进行观察，磷钼酸乙醇溶液进行染色。使用200-400目的硅胶进行色谱分离。非额外说明，产率均指色谱和光谱纯物质的产率。
关于化合物的表征:使用ATR-IR红外检测仪进行傅里叶变化红外光谱测定并记录。1H、13C图谱均使用Bruker DRX-400、Bruker AV-400核磁仪进行测定。化学位移(d)使用相对于溶剂峰的兆比率(ppm)表示。简写中s代表单峰，d代表双峰，t代表三重峰，q代表四重峰，m代表多重峰。高分辨质谱通过北京大学质谱实验室中的Bruker APEX Flashchromatography质谱仪测得。
具体而言，以下实施例1～2提供的化合物在仅对原料相应链长进行替换的基础上，均采用如下方法合成得到：
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
步骤(1)：将原料聚乙二醇(14.62mmol)溶解在二氯甲烷(10mL)中。同时，将碘(8.91g,35.09mmol)、三苯基膦(9.20g,35.09mmol)以及咪唑(2.99g,43.86mmol)溶解在二氯甲烷(90mL)中搅拌5分钟。然后将聚乙二醇二氯甲烷溶液滴加到混合液当中。反应在室温下搅拌3小时。TLC监测原料转化完全。饱和硫代硫酸钠加入到反应液中淬灭反应。分离出有机相并再用二氯甲烷萃取。合并有机相后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后。得到的残余物通过硅胶柱层析分离纯化(5％～10％乙酸乙酯/石油醚)，得到淡黄色油状液体二碘代化物(diiodide)。
步骤(2)：将2M三甲基硅重氮甲烷正己烷溶液(4.5mL,9.0mmol)加入到无水四氢呋喃(10mL)中。然后在-78℃下向反应液中缓慢滴加2.5M正丁基锂正己烷溶液(3.0mL,7.5mmol)。滴加完毕后继续搅拌30分钟。然后，将步骤(1)所得二碘代化物(1.5mmol)溶解到四氢呋喃(2mL)并滴加到反应液中，反应在-78℃下进一步反应30分钟。最后反应升至-30℃～-40℃搅拌过夜。反应加入水淬灭。用乙醚萃取后，经无水硫酸钠干燥。过滤后在减压下浓缩干燥除去残余溶剂得到橘黄色油状液体交联剂。
本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二缩三乙二醇为原料进行碘代反应，得如下产物：
淡黄色油状液体；5.08g，收率95％(以14.62mmol二缩三乙二醇为原料计算)。产物的核磁谱图与文献报道一致。
本实施例在所得diiodide 1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：
表征信息如下：
橘黄色油状液体；555mg,收率定量(以1.5mmol diiodide 1为原料计算)；
IR(neat)νmax 2954,2898,2861,2030,1248,1111,832,691,642cm-1；
1H NMR(400MHz CDCl3):δ0.14(s,18H),2.21(t,J＝6.8Hz,4H),3.55(t,J＝6.8Hz,4H),3.60(s,4H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ-1.7,25.7,70.3,70.8.
实施例2：
本实施例采用实施例1所述方法的步骤(1)，以三缩四乙二醇为原料进行碘代代反应，得如下产物：
淡黄色油状液体；2.39g，收率88％(以6.56mmol三缩四乙二醇为原料计算)。产物的核磁谱图与文献报道一致。
本实施例在所得diiodide 2的基础上，经实施例1所述述步骤(2)反应，得如下产物：
表征信息如下：
橘黄色油状液体；993mg,收率定量(以2.46mmol diiodide 2为原料计算):
IR(neat)νmax 2954,2896,2863,2030,1248,1110,835,751,625cm-1.
1H NMR(400MHz CDCl3):δ0.14(s,18H),2.21(t,J＝6.8Hz,4H),3.54(t,J＝6.8Hz,4H),3.62(m,8H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ-1.7,25.7,70.3,70.6,70.7；
经检测，本发明各实施例提供交联剂均可以与含羧基氨基酸残基实现有效交联。
实验例1：Diazoker 1交联剂与N-(Boc)谷氨酸甲酯的反应
本发明利Diazoker 1和N-(Boc)谷氨酸甲酯测试该交联剂与含羧酸氨基酸交联的反应性(图3)。将N-(Boc)谷氨酸甲酯(50.0mg,0.191mmol)溶解在水(3mL)中。然后将交联剂Diazoker 1(131.0mg,0.383mmol)溶解在乙腈(1mL)中并在室温下敞口加入到反应液中伴随有气泡冒出。反应在室温下搅拌1小时。TLC监测原料N-(Boc)谷氨酸甲酯转化完全。反应液迅速用乙酸乙酯萃取。合并有机相后，经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在减压下浓缩。得到的残余物通过硅胶柱层析分离纯化(20％～50％乙酸乙酯/石油醚)，得到双交联产物(15.3mg,24％)、单交联产物1(13.0mg,17％)、单交联产物2(9.2mg,10％,E/Z＝5/1)以及单交联产物3(10.2mg,12％)。这个结果在一定程度说明Diazoker 1具有较高的交联效率。
双交联产物；
表征信息如下：
淡黄色油状液体；15.3mg,收率24％:
IR(neat)νmax 3362,2954,2929,2870,1735,1711,1516,1365,1161,1050,856,779cm-1；
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.44(s,18H),1.93(m,6H),2.18(m,2H),2.41(m,4H),3.53(t,J＝6.4Hz,4H),3.56(s,4H),4.23(t,J＝6.4Hz,4H),4.32(m,2H),5.15(d,J＝7.6Hz,2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ27.8,28.3,28.8,30.3,51.8,52.8,62.7,67.4,70.2,79.9,155.3,172.2,173.2；
HRMS(ESI)m/z C30H53N2O14(M+H)+的理论值为665.3491,实测值为665.3471.
表征信息如下：
淡黄色油状液体；13.0mg,产率17％：
IR(neat)νmax 3370,2953,2929,2868,1737,1715,1513,1366,1249,1165,1119,1052,841,778cm-1；
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.43(s,9H),1.94(m,3H),2.17(m,1H),2.39(m,2H),3.54(t,J＝6.4Hz,2H),3.58(s,4H),4.02(s,3H),3.78(dt,J＝5.6,1.2Hz,2H),4.24(td,J＝6.4,1.6Hz,2H),4.31(m,1H),5.12(d,J＝8.0Hz,1H),5.18(ddd,J＝10.4,3.2,1.2Hz,1H),5.18(ddd,J＝17.2,3.2,1.6Hz,1H),5.91(m,1H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ27.8,28.3,28.8,30.1,51.8,52.9,62.8,67.5,69.3,70.3,72.2,80.0,117.2,134.7,155.3,172.2,173.2；
HRMS(ESI)m/z C19H34NO8(M+H)+的理论值为404.2279,实测值为404.2269.
单交联产物2；
表征信息如下：
淡黄色油状液体；9.2mg,收率10％,E构型/Z构型＝5/1：
IR(neat)νmax 3365,2954,2868,1739,1716,1513,1366,1248,1166,1051,839,768cm-1；
1H NMR(400MHz CDCl3):δ0.06(s,7.0H),0.12(s,1.4H),1.43(s,9H),1.94(m,3H),2.18(m,1H),2.40(m,2H),3.54(m,2H),3.59(m,4H),3.67(s,3H),4.04(dd,J＝5.2,1.6Hz,1.6H),4.08(dd,J＝6.4,1.2Hz,0.3H),4.24(td,J＝6.4,1.2Hz,2H),4.31(m,1H),5.12(d,J＝8.0Hz,1H),5.73(dt,J＝14.4,1.6Hz,0.2H),5.91(dt,J＝18.8,1.6Hz,0.7H),6.08(dt,J＝18.8,4.8Hz,0.7H),6.39(dt,J＝14.4,6.4Hz,0.2H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ-1.4,0.1,27.8,28.8,29.7,30.1,51.8,52.9,62.8,67.5,69.4,69.5,70.3,71.3,74.2,80.0,132.2,132.7,142.2,144.4,155.3,172.2,173.2；
HRMS(ESI)m/z C22H42NO8Si(M+H)+的理论值为476.2674,实测值为476.2671.
表征信息如下：
淡黄色油状液体；10.2mg,收率12％：
IR(neat)νmax 3380,2923,2870,1736,1713,1517,1366,1249,1165,1109,843,783cm-1；
1H NMR(400MHz CDCl3):δ1.43(s,9H),1.83(m,2H),1.93(m,3H),2.17(m,1H),2.40(m,2H),3.56(m,6H),3.68(m,5H),3.78(t,J＝5.6Hz,2H),4.24(m,2H),4.31(m,1H),5.18(d,J＝8.0Hz,1H)；
13C NMR(100MHz CDCl3):δ27.8,28.3,28.8,30.1,31.8,51.8,52.9,61.8,62.7,67.4,70.2,70.4,79.9,155.4,172.2,173.2；
HRMS(ESI)m/z C19H36NO9(M+H)+的理论值为422.2385,实测值为422.2388.
实验例2：交联剂Diazoker 1在肽段水平上与氨基酸反应选择性
本实验例为了确定Diazoker 1是否会选择性交联含有羧基的氨基酸残基，本实验例使用了同时含有赖氨酸、苏氨酸以及色氨酸等具有一定亲核基团的氨基酸残基的肽段KR-7(KVEEDVR),VR-7(VWDLVKR),以及TR-8(TPDVNKDR)评价Diazoker 1的选择性。如图4，质谱分析结果显示，Diazoker 1在同时存在羧基、氨基、羟基以及吲哚基团的缓冲液中，对羧酸表现出了较高的交联选择性。
实验例3：使用优化的交联条件(Diazoker 1)对9种模式蛋白质的交联
本实验例在BSA优化交联条件结果的基础上，选取Diazoker 1与9种模式蛋白(二磷酸果糖酶，去铁铁蛋白，β-淀粉酶，BSA，碳酸酐酶2，过氧化氢酶，GST，乳铁蛋白和PUD 1/2异质二聚体)(图5)进行进一步的交联评估。图5a为交联反应流程图：第一步，9个模式蛋白分别用Diazoker 1进行交联；第二步，将交联后的蛋白样品进行胰蛋白酶酶切；第三部，酶切后的样品进入液相色谱-串联质谱进行分析。结果见图5b，总的来说，Diazoker 1在不同蛋白体系的交联效率都很高。不同蛋白交联结果存在差异。这说明，交联的结果主要是取决于蛋白本身的性质而非交联交联剂的特性。
实验例4：交联剂的结构兼容性
本实验例为了确定Diazoker 1是否可以提供准确的蛋白质结构信息，将识别得到的交联结果和每个蛋白质对应的晶体结构比对(图6)。Diazoker 1的结构兼容性为64.40％，距离的最大值为
较高的结构兼容性说明Diazoker 1对于蛋白构象的影响较小，能在接近蛋白自然状态下交联蛋白。很多因素都可能造成余下那些不符合晶体结构的交联分子出现，包括蛋白质在溶液中的动力学。根据上述结果，我们总结得到含羧基的氨基酸特异的Diazoker 1交联剂可以有效的捕捉蛋白质构象。
实验例5：使用优化的交联条件(Diazoker 1)对一种含8种模式蛋白质的混合物的交联
本实验例使用最优的Diazoker 1交联剂及蛋白交联条件进一步含有8种蛋白的混合物体系用于此交联方法的研究。交联的结果如图7，Diazoker 1鉴定到75个交联肽段对。这个结果说明Diazoker 1交联方法对于蛋白混合物的交联表现出较高的效率。从而进一步说明本发明的交联剂是一种高效的含羧基氨基酸选择性交联剂。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种蛋白质化学交联剂，其特征在于，其结构如通式I所示：
R1-X-R2 I；
所述通式I中，R1和R2代表相同的基团，均为：
所述通式I中，X选自以下基团：
其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为1～3的整数；n5为1～5的整数；n6为1～3的整数；n7为1～7的整数；n8为1～5的整数；n9为1～5的整数；n10为1～5的整数；n11为1～3的整数；n12为1～5的整数；n13为1～5的整数；n14为1～3的整数；n15为1～5的整数；Ry为H或Me。
2.一种蛋白质化学交联剂，其特征在于，其结构如通式I-4所示：
所述通式I-4中，n16为1～3的整数。
3.一种蛋白质化学交联剂，其特征在于，选自如下化合物：
4.权利要求1～3任意一项所述蛋白质化学交联剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以双卤代直链烃类化合物为原料，在正丁基锂作碱以及-30℃～-40℃条件下，以三甲基硅基重氮甲烷TMSCHN2为亲核试剂进行亲核取代反应即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述双卤代直链烃类化合物是以双羟基直链烃类化合物为原料，在碘、三苯基膦以及咪唑存在的条件下，经碘代反应得到。
6.权利要求1～3任意一项所述的交联剂在蛋白质分析中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述蛋白质为含有羧基的氨基酸残基的蛋白质。
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