CN114316084B - Aie功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种AIE功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料、制备方法和应用，选择含醛基或者酯炔基并具有AIE性能的小分子化合物B，与甲壳素衍生物的氨基在温和条件下反应纯化，制得的新材料固体具有较强的荧光特性，本身可以荧光示踪，并且制得的改性甲壳素具有好的水溶性，特别是具有温敏可注射改性甲壳素水溶液可以通过物理交联形成水凝胶或者薄膜，不使用任何化学交联剂，具有良好的生物相容性和生物可降解性，制备成本低，绿色环保，可以用于动物或人体内的降解示踪和使用示踪，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

Description

AIE功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种可荧光示踪的改性甲壳素材料，具体涉及一种基于AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素材料、制备方法和应用。

背景技术

甲壳素是地球上含量最丰富的天然高分子之一，由于甲壳素具有一定的生物功能，因而甲壳素及其衍生物在生物材料和医用领域的研究和应用已日益引人注目。水凝胶是由三维亲水性高分子网络构成，它类似于细胞外基质，因而在生物医学领域得到了广泛研究。这些甲壳素衍生物和温敏可注射改性甲壳素水凝胶的生物医用功能的发挥效果与其体内降解速度密切相关，所以系统研究这些甲壳素衍生物材料的体内外降解特性，特别是原位跟踪可注射水凝胶在体内的降解至关重要。传统解剖法可跟踪常规水凝胶降解，动物需求量大、示踪连续性差。可以利用现代显像技术实现无创实时降解示踪材料，如荧光示踪可注射水凝胶，是近年来可注射水凝胶的研究热点。

以聚集诱导发光(AIE，Aggregation Induced Emission)为特征的发光材料最近引起了人们的极大兴趣。通常，发色团聚集对发光过程有两种影响，即聚合引起的猝灭(ACQ)现象和聚集诱导发光(AIE)现象。一般情况下，有机发光材料在稀溶液中表现出现强烈的荧光现象，然而在聚集状态下则呈现出微弱荧光甚至无荧光，这是ACQ现象。有些化合物分子，在溶液中几乎不发光，但在聚集的状态下发光增强，由于此发光增强是由化合物分子聚集所导致的，这类现象定义为“聚集诱导发光”(AIE)。聚集诱导发光(AIE)的研究在近十年得到了极大发展，在AIE体系中，聚集体的荧光往往比它们各自的荧光强度大。目前，基于AIE分子的发光材料在生物成像、离子鉴别、分子离子传感器等科技前沿领域具有很大的应用前景。将具有AIE特性的分子接枝在大分子链上，一般不影响其AIE特性，然而，与许多典型的有机染料一样，大部分AIE分子具有疏水性，难以溶解在水中，因此，将AIE分子与亲水性甲壳素衍生物结合以形成具有高的发光效率，高亲水性、良好的生物相容性和可生物降解性的AIE荧光可示踪甲壳素衍生物材料具有重要的意义。例如浙大王征科等报道了一系列水溶性壳聚糖基聚集诱导发光材料(CN201510273395.7，CN201610632880.3，CN201610981769.5，CN201711345493.2)，但他们使用了多达5步有机反应合成得到异硫氰酸酯功能化的四苯基乙烯AIE活性分子TPE-ITC(Wang，Zhengke等，J.Am.Chem.Soc.135，8238-8245.Long-term fluorescent cellular tracing by the aggregates of AIEbioconjugates)，并且TPE-ITC只能与较低分子量的壳聚糖反应，否则较高分子量的壳聚糖不溶于DMSO，反应则很难进行(壳聚糖从116万降解到5.6万后使用)。因此通过简单反应开发AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素材料的新的制备方法非常重要。

专利CN111560244A公开了一种pH响应的壳聚糖荧光复合胶束及其制备方法和应用，具体的，采用将四羧基四苯乙烯化合物溶液调节pH至弱碱性，搅拌条件下滴入壳聚糖溶液，过滤，即得pH响应的壳聚糖荧光复合胶束。其原理为利用羧基与壳聚糖上氨基的静电络合效应将具有AIE功能的四苯乙烯与壳聚糖结合在一起，从而得到荧光复合胶束。但在体系pH下降至酸性，上述静电络合向更强的氢键络合效应转变，但这种强的氢键络合只能在酸性条件下才能生效，弱碱环境就解除了；并且，根据该专利记载，酸性环境下氢键络合的荧光效益明显强于中性或者弱碱环境，而很多环境是无法达到强酸，比如人体和动物组织的医用环境，因此该技术在生物医药领域的使用受限。并且这些静电络合或者氢键络合的稳定性有限，远低于化学键合的稳定性，因而也影响其应用。

发明内容

针对现有技术中的不足，结合前人工作的基础，本发明的目的是提供一种AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素材料特别是可荧光示踪的温敏可注射改性甲壳素水凝胶和薄膜及其制备方法和应用，可广泛应用于生物医药领域。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种AIE功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料的制备方法，该方法使用了具有AIE效应的化合物B与含有氨基的甲壳素衍生物反应得到，并且该化合物B含有在室温或者体温下可以与氨基反应的醛基或者酯炔基。

采用下列方法制备得到：

步骤(1)制备含有氨基的甲壳素衍生物的溶液A；

步骤(2)将具有AIE效应并含有醛基的化合物B加入到溶液A中，搅拌使之均匀混合反应。

步骤(3)将反应产物纯化除去小分子反应物和杂质，得到可荧光示踪的改性甲壳素材料。

优选地，所述含有氨基的甲壳素衍生物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素中的任一种或几种的混合物；其中壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖的乙酰度范围为0.01～0.4；羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素的乙酰度范围为0.7～0.92。

优选地，甲壳素衍生物的分子量范围为5kDa～1000kDa。

优选地，溶液A中含有氨基的甲壳素衍生物的质量浓度范围为0.5～20wt％。

优选地，所述含有氨基的甲壳素衍生物为温敏改性甲壳素，所述含有氨基的甲壳素衍生物的水溶液A具有温度敏感性，经过步骤(2)的反应纯化后还保留类似的温度敏感性，步骤(1)中在低温下可配置成水溶液，步骤(2)中搅拌均匀后置于转变温度以上自发物理交联转变成可荧光示踪的改性甲壳素水凝胶，这里的低温温度范围为0-16℃。

优选地，所述转变温度为生理温度，大致在30-40℃。

优选地，所述温敏改性甲壳素为温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素或者温敏性羟丁基甲壳素中的任意一种或几种组合。

优选地，具有AIE效应并含有醛基的化合物为B为单端醛基四苯基乙烯(I)或间苯二甲醛苯酚衍生物(羟基间苯二甲醛)(II)；具有AIE效应并含有酯炔基的化合物B为单端酯炔基四苯基乙烯(III)；

单端醛基四苯基乙烯(I)结构式为：

间苯二甲醛苯酚衍生物(II)结构式为：

其中(II)中R是烷基；

单端酯炔基四苯基乙烯(III)结构式为：

优选地，其中(II)中R是甲基(CH₃)或叔丁基(C(CH₃)₃)。

优选地，所述具有AIE效应的化合物B中能参与反应的醛基或者酯炔基与甲壳素衍生物中氨基的摩尔比值范围为0.05～5。

优选地，步骤(2)中搅拌反应温度为2-15℃，反应时间为1-12h。

更进一步的，一种AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素材料，其特征在于，可由以上方法制得。

一种AIE功能化的可荧光示踪的温敏可注射改性甲壳素水凝胶或者薄膜，其特征在于，可由以上方法制得。

一种上述改性甲壳素材料或者所述温敏可注射改性甲壳素水凝胶或者薄膜的应用，其特征在于，用于在动物或人体内的降解示踪和使用示踪。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明公开了一种AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素材料的制备方法，首先选择了含醛基或者酯炔基并具有AIE性能的小分子化合物，与甲壳素衍生物的氨基在温和条件(本发明温和条件是指常温，常压，pH为弱酸、弱碱或者中性)下可以反应，制得的新材料固体具有较强的荧光特性，具有高的发光效率，本身可以荧光示踪，避免了传统荧光小分子在高浓度下荧光减弱甚至淬灭的现象。

本发明制得的AIE功能化的可荧光示踪的改性甲壳素具有好的水溶性，特别是具有温敏可注射改性甲壳素水溶液可以通过物理交联形成水凝胶或者薄膜，不使用任何化学交联剂，具有良好的生物相容性和生物可降解性，制备简单成本低，绿色环保，可以用于动物或人体内的降解示踪和使用示踪，在生物医药领域具有广阔的应用前景。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。

图1为实施例1中TPE-CHO的AIE效应测试图，其中图1(a)为TPE-CHO在六氟异丙醇溶液中的UV-vis光谱，图1(b)为TPE-CHO在不同水体积百分比(f_w)(六氟异丙醇和水的混合溶剂中，c＝50μM，λ_ex＝334nm)下的荧光光谱，图1(c)为TPE-CHO的相对荧光强度(I/I₀)，I₀是在纯六氟异丙醇溶液中的荧光强度，插图为在紫外365nm照射下的照片(左插图在纯六氟异丙醇溶液和右插图在f_w＝90％的六氟异丙醇水的混合溶剂中)。

图2为实施例1中50μg/ml 2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚的四氢呋喃/水混合溶液中的AIE效应图，图2(A)为不同水含量(四氢呋喃/水混合溶剂中水含量依次从左0，10％，20％......，90％)紫外灯下荧光效应图；图2(B)为不同水含量(四氢呋喃/水混合溶剂中水含量依次从左0，10％，20％......，90％)下荧光强度；图2(C)为不同水含量下(四氢呋喃/水混合溶剂中水含量依次从左0，10％，20％......，90％)520nm处的相对荧光强度(I/I₀)(激发波长Ex＝460nm)。

图3为实施例3中浓度为1％的溶解在六氟异丙醇或者水中的HPCH-TPE-CHO-0.30的荧光强度，λ_ex＝334nm，15℃。

图4为实施例3中HPCH-TPE-CHO-0.30的温度敏感性对比图，其中，图4a是浓度为2％的HPCH-TPE-CHO-0.30温度敏感性图(频率1Hz，应变1％)；图4b是浓度为2％的对照HPCH的温度敏感性图(频率1Hz，应变1％)。

图5为实施例3中2％FHPCH水溶液低温4℃和在37℃形成凝胶状态时在自然光和紫外光照射下的荧光效应图。

图6为实施例3中改性羟丙基甲壳素FHPCH在不同溶剂里的荧光特性，图6(A)为50μg/ml FHPCH在HFIP和水溶液中的荧光光谱；图6(B)为100μg/ml FHPCH水溶液中不同激发波长的荧光发射光谱及500nm发射时的激发光谱；图6(C)为不同浓度的FHPCH水溶液的荧光强度(Ex＝460nm)。

图7为实施例5中1％羟丙基改性荧光甲壳素FHPCH水凝胶不同时间在动物体内的示踪。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1含有可与氨基反应的醛基或者酯炔基并具有AIE效应的化合物

单端醛基四苯基乙烯(I)AIE化合物的制备：将2.01g的三苯溴乙烯、1.35g的4-甲酰基苯硼酸和0.19g的四丁基溴化铵溶解到40mL甲苯和10mL 1.2M的碳酸钾混合溶液中，该混合溶液在氮气保护下室温搅拌30分钟，然后加入60mg四(三苯基膦)钯(Pd(PPh₃)₄)并升温到90℃反应24小时。反应结束后加入水，并用乙酸乙酯萃取三遍，收集有机层，并用无水硫酸钠干燥，然后过滤并旋蒸除掉溶剂得到粗产物，再用硅胶色谱柱进行分离提纯，得到固体产物(I)，产率为90％。

单端酯炔基四苯基乙烯(III，TPE-Yne)AIE化合物的制备：首先通过二苯甲酮和4-羟基-二苯甲酮合成纯化得到单羟基四苯基乙烯(产率为70％)。之后称量522mg单羟基四苯基乙烯溶解在30mL干燥的二氯甲烷/四氢呋喃(3:1v/v)混合溶液中，在4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺的作用下，滴加二氯甲烷/四氢呋喃(3:1v/v)混合溶液中溶解了126mg丙炔酸的溶液，合成得到粗产物，然后通过硅胶色谱柱进行分离提纯，得到固体产物(III)，产率为50％。

AIE效应测试：以单端醛基四苯基乙烯(I)(TPE-CHO)为例进行研究，结果如图1所示。溶解在六氟异丙醇中的TPE-CHO的紫外吸收光谱如图1a所示，可知其在334nm附近有紫外吸收峰值，因此，我们将334nm作为激发波(λex)测试其荧光光谱。从图1b和1c中可知，TPE-CHO溶解在HFIP中的稀溶液没有检测到荧光(PL)信号，且在紫外光照射下无明显荧光(在1c插图中的左图)；当大量的水混合到六氟异丙醇溶液中后(fw＝90％)，PL的强度大大增强，在紫外光照射下可以看到明显的黄绿色荧光(在图1c插图中的右图)。这些结果表明TPE-CHO具有典型的AIE效应。同样单端酯炔基四苯基乙烯(III)也具有典型的AIE效应。

间苯二甲醛苯酚衍生物的AIE效应，以2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚为例说明其具有AIE效应(图2)。2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚在四氢呋喃(THF)中具有良好的溶解性，THF为2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚的良溶剂，2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚在水中的溶解度较小。如图2所示，2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚在纯四氢呋喃(THF)中基本不发光，随着水含量的上升，荧光强度不断提高，这些结果表明2，6-二甲酰-4-叔丁基-苯酚具有典型的AIE效应。水含量提高到60％后，荧光强度基本不再变化，提到到90％后，荧光强度反而有下降(图2B和2C)。同时，由于溶解度的降低，液体的黏度增大，出现挂壁现象(图2A)。同样的，2，6-二甲酰-4-甲基-苯酚也具有类似的AIE效应。

实施例2可荧光示踪的改性甲壳素衍生物材料

将2，6-二甲酰-4-甲基苯酚10mg加入到150ml的1％羧甲基壳聚糖水溶液中，15℃搅拌2h使之均匀混合反应。将得到的溶液在水中透析，直至透析液无色。透析后的溶液通过冷冻干燥。得到黄色海绵状固体，在紫外光照射下具有明显的黄绿色荧光。

使用其他含有氨基的甲壳素衍生物如壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素中的任一种或几种的混合物代替羧甲基壳聚糖都可以制得可荧光示踪的改性甲壳素衍生物材料，其中壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖的乙酰度范围为0.01～0.4；羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素的乙酰度范围为0.7～0.92；甲壳素衍生物的分子量范围为5kDa～1000kDa。溶液A中含有氨基的甲壳素衍生物的质量浓度范围为0.5～20wt％。

实施例3可荧光示踪的温敏改性甲壳素及其凝胶

根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN 201410170871.8]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的羟丙基甲壳素。称取2克纯化后的甲壳素搅拌分散于预先冷冻的含有11wt％氢氧化钠和4wt％尿素的100克水溶液中，在-20℃下冷冻6h，取出在室温下机械搅拌将其解冻，再重复冷冻解冻2次即可得到溶解的甲壳素水溶液。向得到的甲壳素溶液(100克，2wt％)中加入11.42g环氧丙烷，体系在2℃下机械搅拌反应2h，使反应物混合均匀，接着升温至5℃反应24h，随后升温至15℃反应6h。最后将体系冷却至2℃，用3M盐酸调节体系pH值到7，用去离子水透析7天除去溶液中的尿素和盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，产率为87％。¹H NMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.904，取代度为0.845。

利用HPCH分子链上的氨基与TPE-CHO或TPE-Yne荧光分子的活性基团(醛基或酯炔基)室温下在六氟异丙醇溶剂中发生反应，使具有AIE效应的TPE单元标记到HPCH分子侧链上，无需使用任何引发剂和催化剂。称取0.5g冻干后的HPCH加入到装有50g六氟异丙醇(HFIP)的单口烧瓶中在室温下搅拌至完全溶解，称量18.4mg TPE-CHO加入到单口烧瓶中继续搅拌反应7天，产物沉淀于乙醚中得到固体产物，再将产物溶于低温5℃水中透析5天，最后冷冻干燥得到海绵状固体产物(HPCH-TPE-CHO)，整个操作过程均在避光条件下进行。用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)测试分析确定产物的荧光分子标记率(degree of labeling，DL)为0.30mol％，将产物命名为HPCH-TPE-CHO-0.30。通过改变TPE-CHO与HPCH的投料比，可以获得不同标记率的TPE-CHO荧光分子标记的羟丙基甲壳素(HPCH-TPE-CHO-0.09，HPCH-TPE-CHO-0.21)。这些荧光标记的羟丙基甲壳素(HPCH-TPE-CHO)在低温5℃时是溶解于水，也溶解于六氟异丙醇。将HPCH-TPE-CHO-0.30分别溶解在六氟异丙醇和水中(浓度均为1％)，测其紫外吸收光谱，可知其在六氟异丙醇和水中的紫外吸收曲线基本一致，都在334nm附近有紫外吸收峰，与TPE-CHO荧光分子的紫外吸收也一致，表明具有AIE效应的TPE荧光分子接枝到大分子链上并没有影响其紫外吸收特性。由图3可知溶解在六氟异丙醇中的HPCH-TPE-CHO-0.30没有荧光信号，荧光曲线与基线相平，这是由于苯环可以自由旋转，以非辐射跃迁方式消耗了能量，导致其在该溶剂中不发光，无荧光信号，没有AIE效应；而溶解在水中的显示了强烈的荧光信号，具有AIE效应，即荧光分子发生了聚集。研究了HPCH-TPE-CHO-0.30水溶液在不同浓度(0.002-1.00mg/mL)下的浓度依赖性，其荧光强度与浓度呈线性关系。溶解在水中的不同DL的HPCH-TPE-CHO在相同浓度下(1mg/mL)的荧光强度随DL的升高而增强，所以可以利用测试的荧光强度实时原位示踪可降解高分子在体内的降解过程。

同样，称取0.5g冻干后的HPCH加入到装有50g六氟异丙醇的单口烧瓶中在室温下搅拌至完全溶解，并加入20.5mg的TPE-Yne到单口烧瓶中继续搅拌反应7天，将产物沉淀于乙醚中得到固体产物，再将产物溶于低温5℃水中透析5天，最后冷冻干燥得到海绵状固体产物，整个操作过程均在避光条件下进行。用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)分析确定产物的荧光分子标记率(DL)为0.41mol％，因此将产物命名为HPCH-TPE-Yne-0.41。HPCH-TPE-Yne-0.41与HPCH-TPE-CHO-0.30有类似的性能，溶解在六氟异丙醇中没有AIE效应，而在水里具有AIE效应，只是HPCH-TPE-Yne-0.41在水中的最佳激发波长λ_ex为284nm，发射波峰值λ_em约为475nm，HPCH-TPE-CHO-0.30在水中的最佳激发波长λ_ex为334nm，发射波峰值λ_em约为485nm。

HPCH原料在日光下呈白色，在紫外灯(365nm)下没有荧光，HPCH-TPE-CHO-0.30和HPCH-TPE-Yne-0.41在日光下均呈白色，在紫外灯下前者发出蓝绿色荧光，后者显示蓝色荧光，且后者的荧光较前者更暗，尽管后者的荧光分子标记率更高一些。这些表明了TPE荧光分子标记的HPCH的固体产物具有AIE效应，这不同于传统的具有聚集诱导猝灭(ACQ效应)的荧光分子。将商用异硫氰酸荧光素(FITC)作为对照，其在日光下显示橙色，而在紫外灯下没有荧光，是ACQ效应。

对AIE荧光分子接枝的羟丙基甲壳素的温度敏感性进行了研究，在2-18℃时，HPCH水溶液(浓度为2％)和HPCH-TPE-CHO-0.30水溶液(浓度为2％)都具有流动性，在日光下，二者的外观没有区别，都呈澄清透明的液体；在紫外灯下，HPCH-TPE-CHO-0.30发出蓝绿色荧光，而HPCH无荧光。在37℃时，HPCH水溶液和HPCH-TPE-CHO-0.30水溶液都立即形成水凝胶，在日光下，二者都呈澄清透明的凝胶态；在紫外灯下，HPCH-TPE-CHO-0.30水凝胶发出蓝绿色荧光，而HPCH水凝胶无荧光。

进一步采用流变仪研究了HPCH-TPE-CHO-0.30的温度敏感性。储能模量(storagemodulus，G')代表体系的弹性行为，损耗模量(loss modulus，G")代表体系的粘性行为，浓度为2％的HPCH-TPE-CHO-0.30水溶液(图4a)的G'和G"在19.1℃开始相交，表明此时开始形成凝胶，所对应的温度定义为凝胶化温度，稍低于同一浓度下的原料HPCH水溶液(图4b)的凝胶化温度(19.6℃)，这些表明对AIE荧光改性的羟丙基甲壳素的温敏性基本没变。

通过COS-7细胞和HeLa细胞的毒性实验结果表明HPCH-TPE-CHO具有良好的细胞相容性，并且HPCH-TPE-CHO可作为大分子荧光探针有效用于细胞成像研究，在生物医学领域具有好的应用价值。

类似地，间苯二甲醛苯酚衍生物和HPCH在常温下反应也能生成可荧光示踪的改性羟丙基甲壳素，将2，6-二甲酰-4-叔丁基苯酚5mg，10mg，15mg分别加入到150ml的1％羟丙基甲壳素溶液中，4℃搅拌2h使之均匀混合反应。将得到的溶液在水中透析，直至透析液无色。透析后的溶液通过冷冻干燥。得到三种不同接枝率的黄色海绵状羟丙基甲壳素(FHPCH)(使用紫外光谱测试其摩尔接枝率，分别为0.27％，0.36％和0.55％，)，在紫外光照射下均具有强烈的黄绿色荧光。分别被标记为FHPCH-0.27，FHPCH-0.36，FHPCH-0.55。

FHPCH-0.27，FHPCH-0.36，FHPCH-0.55三种海绵样品均具有荧光，但是相对来说，FHPCH-0.27荧光较弱，FHPCH-0.55水溶性相对较差。所以后续的实验都使用FHPCH-0.36来作为研究对象。后文所提到的荧光羟丙基甲壳素(FHPCH)如无特殊说明，均指FHPCH-0.36。

将这里得到的海绵状荧光羟丙基甲壳素配置成2％水溶液，置于37℃下1min可自发物理交联转变成荧光羟丙基甲壳素水凝胶。如图5中所示，得到的水凝胶在4℃转变为可以流动的液体，在自然光下为黄色液体，在紫外光照射下发出强烈的黄绿色荧光。在体温条件下转变为凝胶，这种黄色的水凝胶在紫外灯照射下发射强烈的黄绿色荧光。

我们探索了制得的改性羟丙基甲壳素FHPCH在不同溶剂里的荧光特性，由图6A可知，50μg/ml的FHPCH的水溶液在460nm的激发光下的荧光强度远低于其在六氟异丙醇(HFIP)溶液的强度，这可能是由于FHPCH微交联在HFIP溶液里形成的聚集状态引起AIE基团的运动受限程度高于水溶液中。为了提高其水溶液荧光强度的灵敏性，配制了100μg/ml的水溶液，测试其不同激发光谱的荧光发射光谱图(图6B)，发现激发波长为350nm的荧光强度高于激发波长为460nm的强度，但这和在HFIP溶液中相反(图6A)。设置的增强，FHPCH水溶液的荧光强度随着其浓度增加迅速增强(图6C)。用2，6-二甲酰-4-甲基苯酚代替2，6-二甲酰-4-叔丁基苯酚与羟丙基甲壳素水溶液反应也得到类似的结果。

使用含有氨基的温敏甲壳素衍生物如温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素或者温敏性羟丁基甲壳素中的任一种或几种的混合物，在加入具有AIE效应并含有醛基的化合物，如单端醛基四苯基乙烯(I)，间苯二甲醛苯酚衍生物(II)；具有AIE效应并含有酯炔基的化合物为单端酯炔基四苯基乙烯(III)后，反应处理后，均可以得到类似的可荧光示踪的改性甲壳素材料及其水凝胶。且得到的可荧光示踪的改性甲壳素可配制成合适浓度的水溶液，在低温(0-16℃)下具有流动性，在体温下可以自发物理交联转变成水凝胶。

实施例4可荧光示踪的改性甲壳素衍生物及其薄膜

根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN 201310641249.6]，一种均相制备低脱乙酰度羧基甲壳素的方法及其应用。称取22g氢氧化钠和8g尿素，加入166g水，充分搅拌至完全溶解，将氢氧化钠/尿素水溶液预冷至-18℃后，称取4g甲壳素粉末均匀分散在预冷溶液中，然后放置在-32℃的冰箱冷冻室中冷冻，冷冻/解冻三次，最后离心除去气泡、杂质，得到甲壳素溶液。均相合成羧甲基甲壳素具体合成过程如下：在1℃下，向甲壳素溶液中缓慢加入氯乙酸钠(氯乙酸钠：甲壳素＝1:15物质的量的比)，机械搅拌待其完全溶解，然后将体系温度升至5℃，以250rpm转速反应24h，到达反应终点时，缓慢滴加3mol/L HCl到反应溶液中直到反应体系的pH为中性，再用丙酮沉淀，过滤后的沉淀物用80％(V/V)乙醇水溶液洗涤，洗涤后的产物在60℃下烘干得到粉末状的羧甲基甲壳素。使用核磁来表征，得出产物的乙酰度为0.90，羧甲基取代度为0.18。将2，6-二甲酰-4-叔丁基苯酚10mg加入到15ml制得的5％羧甲基甲壳素1M氢氧化钠水溶液中，4℃搅拌2h使之均匀混合反应，取其中的10ml溶液在玻璃板上涂成1mm的薄膜，然后将玻璃板放入乙醇中浸泡6-12h，取出用去离子水冲洗后撕下得到的具有荧光的羧甲基甲壳素薄膜。

使用其他含有氨基的甲壳素衍生物如壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素中的任一种或几种的混合物，在加入具有AIE效应并含有醛基的化合物，如单端醛基四苯基乙烯(I)，间苯二甲醛苯酚衍生物(II)；具有AIE效应并含有酯炔基的化合物为单端酯炔基四苯基乙烯(III)后，反应处理后，均可以得到可荧光示踪的改性甲壳素，并且可以被制备成薄膜。

实施例5体内示踪

结合动物实验对本发明实施例3制备的2，6-二甲酰-4-叔丁基苯酚改性的羟丙基甲壳素(FHPCH)黄色海绵状材料在体内示踪方面的效果进行评价。将实施例3中得到的2，6-二甲酰-4-叔丁基苯酚改性的羟丙基甲壳素(FHPCH)配制成1％的水溶液在4℃保存，取其中500μL的FHPCH水溶液在低温下(0-16℃)注射到小鼠体内。在不同时间使用活体成像仪观察小鼠体内的凝胶区域荧光强度变化(Ex＝460nm&Em＝520nm)。如图7所示，1％的FHPCH水凝胶在小鼠体内随着时间的延长而逐渐降解，荧光强度变弱，能清晰地表明了材料的降解程度，可以用于体内的示踪。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种AIE功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料的制备方法，其特征在于，该方法使用了具有AIE效应的化合物B与含有氨基的甲壳素衍生物反应得到，并且该化合物B含有在室温或者体温下与氨基反应的醛基或者酯炔基；

具有AIE效应并含有醛基的化合物B为单端醛基四苯基乙烯或间苯二甲醛苯酚衍生物；具有AIE效应并含有酯炔基的化合物B为单端酯炔基四苯基乙烯；

单端醛基四苯基乙烯结构式为：

间苯二甲醛苯酚衍生物结构式为：

其中，R是烷基；

单端酯炔基四苯基乙烯结构式为：

且所述具有AIE效应的化合物B中能参与反应的醛基或者酯炔基与甲壳素衍生物中氨基的摩尔比值范围为0.05～5。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤(1)制备含有氨基的甲壳素衍生物的溶液A；

步骤(2)将具有AIE效应并含有醛基的化合物B加入到溶液A中，搅拌使之均匀混合反应；

步骤(3)将反应产物纯化除去小分子反应物和杂质，得到可荧光示踪的改性甲壳素材料。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含有氨基的甲壳素衍生物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素中的任一种或几种的混合物；

其中壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖的乙酰度范围为0.01～0.4；羧甲基甲壳素、羟乙基甲壳素、羟丙基甲壳素、羟丁基甲壳素的乙酰度范围为0.7～0.92；

甲壳素衍生物的分子量范围为5kDa～1000kDa；

溶液A中含有氨基的甲壳素衍生物的质量浓度范围为0.5～20wt％。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述含有氨基的甲壳素衍生物为温敏改性甲壳素，含有氨基的甲壳素衍生物的水溶液A具有温度敏感性；步骤(1)中在低温下配置成水溶液，步骤(2)中搅拌均匀后置于转变温度以上自发物理交联转变成可荧光示踪的改性甲壳素水凝胶或者薄膜，这里的低温温度范围为0-16℃。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述温敏改性甲壳素为温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素或者温敏性羟丁基甲壳素中的任意一种或几种组合。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中搅拌反应温度为2-15℃，反应时间为1-12h。

7.一种AIE功能化可荧光示踪的改性甲壳素材料，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到。

8.一种AIE功能化可荧光示踪的温敏可注射改性甲壳素水凝胶或者薄膜，其特征在于，采用权利要求4或5所述的方法制备得到。

9.一种权利要求7中所述改性甲壳素材料或者权利要求8中所述温敏可注射改性甲壳素水凝胶或者薄膜的应用，其特征在于，用于在动物或人体内的降解示踪和使用示踪。

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