CN108310460B - 可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶及其制备方法和应用，该凝胶的特征在于利用温敏性甲壳素衍生物在低温下溶于水体系并引入交联剂或者光引发剂，形成具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液，将其注射入体内后即在生理条件下通过自发的化学交联或者光照射交联形成的可注射高强度水凝胶。该水凝胶的前体材料来源丰富，易制备，所使用的是在水中具有较好溶解性的毒性很低的光引发剂或者交联剂。使用的是温敏性甲壳素衍生物，可在生理条件下原位物理交联成型再在原位进一步化学交联或者光交联制备可注射高强度水凝胶，不需要任何的后处理。此外，该类水凝胶具有可生物降解性，可广泛用于生物医用材料及组织工程技术等领域。

Description

可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种可注射智能高强度甲壳素基水凝胶产品及其制备方法和应用。
背景技术
高分子水凝胶是一种具有三维网络结构并吸附大量水分而不溶于水的交联聚合物，由于其接近于细胞外基质，具有良好的亲水性、优良的溶胀性能和生物相容性等，在生物医药及组织工程材料领域具有广泛的应用前景。例如，水凝胶作为医疗器械可用于创面敷料，手术中的粘合、封堵和防渗漏，手术中止血，组织填充，手术后防粘连，或者可均匀包裹细胞、蛋白质、多肽、激素等各种生物活性物质和药物的载体及组织工程材料等生物医用领域。
根据水凝胶的凝胶方式，可分为体外凝胶和体内原位凝胶。体内原位凝胶具有可注射性的优点，利用具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液，在生理条件下原位交联形成水凝胶，不仅可用于开放性手术也可用于微创手术甚至避免外科手术只用很细小的针头原位注射，减少对病人的损伤。根据水凝胶的形成原理，可分为化学交联水凝胶和物理交联水凝胶两大类。物理交联主要通过分子间相互作用力(范德华力、疏水相互作用、电荷作用、氢键等)形成，这类凝胶由于形成过程中不涉及化学反应，因而成胶快，应用更简单、更安全。特别是温敏性可注射聚合物水凝胶被广泛研究用于医用目的。这类温敏性凝胶在低温时保持液体，可均匀地包载细胞/药物及无需外科手术植入从而提高患者顺应性，一旦进入体内37℃时，迅速形成凝胶避免细胞和生物活性分子等流失促使损伤部位修复再生，因为温度响应是相对最容易实现和最有效的响应，这类智能水凝胶在生物医药和组织工程材料领域具有诱人的发展前景。但只有物理交联其力学性能较弱，稳定性较差。化学交联或者光交联，可大大提高水凝胶的力学强度和稳定性，并且可以通过控制组分之间的不同比例来调节其强度以满足其不同的使用场景和目的。但化学交联需要时间，并且化学反应活性物质的潜在毒性也限制了化学交联水凝胶在体内的应用。例如Bioglue是一种基于牛白蛋白溶液与戊二醛溶液的体内原位凝胶封合剂，利用牛血清白蛋白的氨基和戊二醛的醛基反应交联，在国外已经获得美国、欧盟、加拿大和澳大利亚等国食品药品管理部门批准，广泛用于心血管和大血管外科渗漏部位机械性地封合；但是，Bioglue残留戊二醛会引起细胞毒性，甚至会引发神经组织变性[中国专利申请公开说明书CN201510960917.0]。如何结合化学交联和物理交联的优点，使用低毒性的交联剂或者光引发剂，对于实际应用非常重要和必要。
因为甲壳素及其衍生物具有非常好的生物相容性、生物可降解性和多种生物活性，适合于生物医用材料及组织工程领域的应用。甲壳素与羧基化试剂在氢氧化钠-尿素体系中反应，可制得具有pH敏感性和温敏性的羧基甲壳素[中国发明专利申请公开说明书CN201310641249.6],甲壳素与羟丙基化试剂在氢氧化钠-尿素体系中反应，可制得具有温敏性的羟丙基甲壳素[中国发明专利申请公开说明书CN201410170871.8],侯春林等报道了温敏性羟丁基壳聚糖[中国专利申请公开说明书CN200810033699.6]和温敏性羟戊基壳聚糖[中国专利申请公开说明书CN201210220246.0]的制备。但是温敏性甲壳素衍生物通过升温物理凝胶制得的材料强度较弱。因此，开发一种安全且具有在生理条件体温下可以先原位物理交联成型，再在原位进一步自发化学交联或者光交联直接原位使用的高强度的新型智能可注射水凝胶在临床治疗上显得尤为迫切。
发明内容
针对现有技术中的不足，结合前人工作的基础，本发明的目的是提供一种双组份可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶产品及其制备方法和应用。本发明利用温敏性改性甲壳素在体内生理条件下快速物理交联成胶，再在原位生理条件下进一步自发化学交联或者光交联，制备可注射高强度智能水凝胶，不需要任何的后处理。采用的交联剂或者光引发剂为水溶性，毒性很低，甲壳素衍生物生物相容性好，体系具有温敏性和可生物降解性，可广泛应用于生物医药领域。
一种双组份可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶产品的制备方法，采用下列方法制备得到：
(1)制备组分A，其中组分A为可在生理条件下原位自发物理交联的具有温敏性的甲壳素衍生物的溶液；
(2)向组分A中引入组分B，其中组分B为在生理条件下可引发组分A发生交联反应的具有生物相容性的亲水性光引发剂或者在生理条件下可与组分A发生交联反应的具有生物相容性的亲水性交联剂，得到具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液；
(3)将步骤(2)得到的水凝胶前体溶液置于生理条件下原位自发物理交联成型，并进一步化学交联或者光照射交联形成所述高强度水凝胶。
优选地，所述组分A中温敏性改性甲壳素为温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟戊基壳聚糖、温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中的任一种或者它们的混合物。其中温敏性羟丁基壳聚糖的乙酰度范围为0.01～0.4；温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素的乙酰度范围为0.7～0.92；分子量范围为5kDa～1000kDa；
优选地，步骤(2)引入的交联剂B组分为含两个或两个以上醛端基改性的聚乙二醇PEG衍生物或其它多醛端基改性的亲水性高分子聚合物或它们的混合物，或者为京尼平或者京尼平的衍生物或它们的混合物。
优选地，所述组分A为侧链引入呋喃双键改性的温敏性改性甲壳素的溶液，交联剂B组分为含两个或两个以上马来酰亚胺端基改性的亲水性高分子聚合物。
优选地，所述组分A为侧链引入丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯双键改性的温敏性改性甲壳素，B组分为水溶性光引发剂；步骤(3)使用光照射交联形成所述高强度水凝胶。
优选地，所述组分A为甲基丙烯酸缩水甘油酯或者甲基丙烯酸酐改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物，组分B为水溶性紫外光引发剂Irgacure 2959。
优选地，组分A中聚合物的质量分数范围为0.5～20％，所得前体溶液中B组分交联剂或者光引发剂的质量分数范围为0.5～30％，这些溶液可选用pH为5～11的任何一种缓冲液，可任选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、二乙醇胺缓冲液或上述缓冲盐的组合等，优选磷酸盐生理盐水缓冲液，优选pH值为7.0-8.0。。
优选地，步骤(1)、(2)的配制温度均为2-15℃，步骤(3)所述生理条件为体温条件。
一种可注射高强度温敏性甲壳素基水凝胶，采用上述的方法制备得到。
上述可注射高强度温敏甲壳素基水凝胶的应用，用于人体各种手术中的粘合、封堵、止血、防渗漏或者防粘连，以及用于生物医用领域的生物活性物质和细胞的载体及组织工程材料。
由于聚乙二醇具有高度的亲水性，并且没有免疫原性，它的生物相容性已经得到了FDA认证，由医用聚乙二醇(PEG)产品制备的医疗器械产品能够广泛应用于人体各种外科手术中创口的粘合、止血、防渗漏和防粘连等材料中。并且可以选取不同聚合度的PEG，通过端基改性制得不同端基功能化的PEG改善水凝胶性能以满足各种需要。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.本发明制备的双组分可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶生物材料，利用温敏性甲壳素衍生物在低温下溶于水体系并引入水溶性交联剂或者光引发剂，形成具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液，将其注射入体内后即在生理条件下原位物理交联快速成型再在原位进一步通过自发的化学交联或者光照射交联形成的可注射高强度水凝胶。其制备方法简单快速，过程无副产物生成，生物相容性好，容易实现工业化生产，因此具有创新性和极其重要的意义。
2.本发明水凝胶产品使用具有温敏性甲壳素衍生物的水溶液，在低温下配置前体溶液和混合，在体温下先原位快速物理交联成型，再在原位进一步交联制得可注射高强度水凝胶产品，结合了物理交联和化学交联，所得水凝胶强度比单纯的物理温敏凝胶或者单纯的化学交联凝胶高很多。
3.本发明水凝胶产品生物相容性良好，体系具有温度敏感性、可注射性、和可生物降解性，在生物医药或组织工程领域中具有广泛的应用前景。
4.本发明的双组分可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶的前体易于获得或制备，水凝胶的制备通过改变两种水凝胶前体的浓度、聚合物中官能团(醛基和氨基或者马来酰亚胺端基和呋喃双键基团)的数量和配比及聚合物分子量等调节。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明实施例1中三臂PEG和三臂苯甲醛端基PEG的核磁共振氢谱图(CDCl3)；
图2为本发明实施例1中三臂马来酰亚胺端基PEG的核磁共振氢谱图(d6-DMSO)；
图3为本发明实施例3中1-2.5％DF-PEG/HPCH和HPCH-2.5％水凝胶在37℃下的流变测试(平行板动态剪切模式，频率：1Hz；应变：1％)；
图4为本发明实施例3中一系列改变交联剂DF-PEG浓度制备得到的水凝胶和2.5％-HPCH水凝胶在37℃下的压缩应力应变曲线。采用DMA测试，图中的压缩应力速率为1N/min，图中2.5％-HPCH的压缩应力速率为0.2N/min；
图5为本发明实施例5中FGE-HPCH温敏性凝胶和DMAL-PEG/FGE-HPCH双组份凝胶的储能模量G’和损耗模量(G”)在37℃下随时间的变化曲线(频率：1Hz；应变：1％)；
图6为本发明实施例7中羟丙基甲壳素HPCH(a)和甲基丙烯酸酯羟丙基甲壳素(b:GM4-HPCH，c:GM8-HPCH)的温敏性(聚合物浓度2％，频率：1Hz；应变：1％)。
图7为本发明实施例7中典型的温敏水凝胶光交联不同时间后的压缩断裂应力应变曲线A和压缩模量(压缩断裂应力应变曲线和压缩模量的测试温度是37℃，除了样品GM8-HPCH(10℃)是指测试温度是10℃)。
图8为本发明实施例9温敏光敏水凝胶光交联不同时间后的酶促降解性。(A)GM8-HPCH-30min(UV)水凝胶在含不同溶菌酶浓度的PBS缓冲盐里；(B)不同温敏光敏水凝胶在2mg/mL溶菌酶浓度的PBS缓冲盐里。
图9为本发明实施例9：HeLa细胞(A，B，二维培养，细胞密度2×104/well，标尺100微米)在GM4-HPCH and GM8-HPCH水凝胶紫外交联30分钟凝胶碎块存在下培养6,24和48小时或者(C,D，三维培养，细胞密度5×104/well)在GM4-HPCH水凝胶里紫外交联2分钟后培养1,4和7天，以空白没水凝胶二维做对照。(A,C)细胞增殖速率(CCK-8试剂测试,mean±SD,n＝4,*p<0.05).(B，D)使用活死细胞染色剂后激光共聚焦图像(绿色，活细胞；红色，死细胞)。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：亲水性大分子交联剂的合成
1.苯甲醛修饰的聚乙二醇(PEG)大分子交联剂的合成
(1)线型双苯甲醛端基PEG(DF-PEG)的合成
线性PEG端基的苯甲醛线型双苯甲醛端基PEG
称取1.5克PEG 6k和0.19克4-羧基苯甲醛置于100mL圆底烧瓶中，加入30mL干燥后的二氯甲烷溶解，在磁力搅拌下再加入0.15克4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.31克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应24h后过滤收集滤液并在大量乙醚中沉淀，将收集到的粗产物用异丙醇溶解重结晶干燥后得到双功能化苯甲醛PEG，产率79％。1H NMR(500MHz,CDCl3,δ):10.1(醛基官能团上的氢),8.2,7.9(苯环上的氢)，4.5(酯键COOCH2 ),3.6(PEG主链OCH2 CH2 O)。选取不同分子量的线型PEG(例如PEG 2k，PEG4k)作为原料，同样都可以合成得到不同聚合度(n：1-1000)的线型双功能化苯甲醛PEG(DF-PEG)。
(2)三臂苯甲醛端基PEG(TF-PEG)的合成
三臂苯甲醛端基PEG
称取2.0克三臂PEG(Mn＝2600)和0.98克4-羧基苯甲醛,溶于60mL干燥后的二氯甲烷中，在磁力搅拌下再加入0.25克4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.62克二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应24h后过滤收集滤液并在大量乙醚中沉淀，将收集到的粗产物用异丙醇溶解重结晶干燥后得到三臂苯甲醛端基PEG，产率82％。图1为三臂苯甲醛端基PEG的1HNMR谱图：4.5ppm处的信号峰归属于酯键氧旁边的氢b'，7.9ppm和8.2ppm处的信号峰分别归属于苯环上的氢d'和氢c'，10.1ppm处的峰信号峰归属于苯甲醛上醛基官能团的氢e'。其中，b'峰的出现，表明反应产物中有酯键的生成。根据PEG-3-CHO 2.7k的1HNMR可以判断，通过酯化反应得到了苯甲醛改性的三臂PEG。选取不同分子量的三臂PEG作为原料，同样都可以合成得到不同聚合度(n：1-1000)的三臂苯甲醛端基TF-PEG。
2.马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(PEG)大分子交联剂的合成
(1)线型双马来酰亚胺端基PEG(DMAL-PEG)的合成
首先利用甘氨酸和马来酸酐在冰乙酸中室温反应纯化制得白色固体N-甘氨酸基马来酰胺酸(产率95％)。将N-甘氨酸基马来酰胺酸(10g)置于300mL甲苯中，并加入三乙胺11.7g，混合物加热保持回流状态2.5h，并通过Dean-Stark装置除去反应生成的水。反应结束后冷却至室温倾出甲苯溶液，减压旋蒸除去甲苯，得到固体N-甘氨酸基马来酰亚胺的三乙胺盐。将固体溶解于100mL pH＝2的水中(盐酸调pH)，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥，减压抽滤除去固体，滤液减压旋蒸除去乙酸乙酯，真空干燥后得N-甘氨酸基马来酰亚胺固体，产率30％。称取N-甘氨酸基马来酰亚胺0.624g,二环己基碳二亚胺DCC 0.99g和4-二甲氨基吡啶DMAP 0.24g加入到1克的PEG 2k的二氯甲烷溶液中(30mL)。室温下磁力搅拌反应24h后，过滤收集滤液并减压旋蒸除去二氯甲烷，再用异丙醇(30mL)溶解4℃下静置3h，重结晶干燥后得到双功能化马来酰亚胺PEG，其结构用核磁氢谱表征了，产率82％。选取不同分子量的线型PEG(例如PEG 6k，PEG4k)作为原料，同样都可以合成得到不同聚合度(n：1-1000)的线型双功能化马来酰亚胺PEG(DMAL-PEG)。
(2)三臂马来酰亚胺端基PEG(TMAL-PEG)的合成
三臂马来酰亚胺端基PEG的合成与线型双马来酰亚胺端基PEG的合成类似，将N-甘氨酸基马来酰亚胺0.67g，DCC 1.07g和DMAP 0.1g加入到1克的三臂PEG(Mn＝2600，3-armPEG的二氯甲烷溶液中(30mL)。室温下磁力搅拌反应24h后，过滤收集滤液并减压旋蒸除去二氯甲烷，再用异丙醇(30mL)溶解4℃下静置3h，重结晶干燥后得到双功能化马来酰亚胺PEG，其结构用核磁氢谱表征了(图2)，产率76％。选取不同分子量的三臂PEG作为原料，同样都可以合成得到不同聚合度(n：1-1000)的三臂马来酰亚胺端基TMAL-PEG。
3.多元苯甲醛端基或马来酰亚胺端基修饰的亲水性大分子交联剂的合成
选取含多羟基的亲水性聚合物如右旋糖酐(例如dextran 1，重均分子量1000，dextran 3.5,重均分子量3500，dextran 5,重均分子量5000)，超支化多羟基聚合物(例如Boltorn H40，Boltorn H30，Boltorn H20，超支化聚缩水甘油醚，超支化多羟基聚酰胺酯)，或者树枝状聚合物溶于干燥的二甲基亚砜(DMSO)中，在磁力搅拌下加入适量的4-羧基苯甲醛或者N-甘氨酸基马来酰亚胺,4-二甲氨基吡啶(DMAP)和二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应,同样都可以合成得到多元苯甲醛端基或马来酰亚胺端基修饰的亲水性大分子交联剂。
实施例2：温敏性甲壳素衍生物A的制备
温敏性羟丙基甲壳素(HPCH)的制备
根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN201410170871.8]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的羟丙基甲壳素。称取2克纯化后的甲壳素(粘均分子量为75.6万)搅拌分散于预先冷冻的含有11wt％氢氧化钠和4wt％尿素的100克水溶液中，在-25℃下冷冻过夜，取出在室温下机械搅拌将其解冻，再重复冷冻解冻2次即可得到溶解的甲壳素水溶液。向得到的甲壳素溶液(100克，2wt％)中加入11.5克环氧丙烷，体系在2℃下机械搅拌反应2h，使反应物混合均匀，接着升温至5℃反应24h，随后升温至15℃反应6h。最后将体系冷却至2℃，用3M盐酸调节体系pH值到7，用去离子水透析7天除去溶液中的尿素和盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，产率为86％。1HNMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.90，取代度为0.86。该均相合成的HPCH溶液具有温度敏感性，流变结果显示出可逆的溶胶-凝胶的转变行为，该样品记为HPCH-T1。
根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN201410170871.8]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的羟丙基甲壳素。称取2克纯化后的甲壳素搅拌分散于预先冷冻的含有11wt％氢氧化钠和4wt％尿素的100克水溶液中，在-20℃下冷冻6h，取出在室温下机械搅拌将其解冻，再重复冷冻解冻2次即可得到溶解的甲壳素水溶液。向得到的甲壳素溶液(100克，2wt％)中加入11.42克环氧丙烷，体系在2℃下机械搅拌反应2h，使反应物混合均匀，接着升温至5℃反应24h，随后升温至15℃反应6h。最后将体系冷却至2℃，用3M盐酸调节体系pH值到7，用去离子水透析7天除去溶液中的尿素和盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，产率为87％。1H NMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.89，取代度为0.88。用乌氏粘度计测得其粘均分子量为Mη＝410kDa。该均相合成的HPCH溶液具有温度敏感性，流变结果显示出可逆的溶胶-凝胶的转变行为，其中浓度为2wt％的HPCH溶液的凝胶转变温度为19.2℃，该样品记为HPCH-T2。
根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN201410170871.8]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的羟丙基甲壳素。称取2克纯化后的甲壳素(粘均分子量为37.5万)搅拌分散于预先冷冻的含有11wt％氢氧化钠和4wt％尿素的100克水溶液中，在-20℃下冷冻过夜，取出在室温下机械搅拌将其解冻，再重复冷冻解冻2次即可得到溶解的甲壳素水溶液。向得到的甲壳素溶液(100克，2wt％)中加入11克环氧丙烷，体系在4℃下机械搅拌反应2h，使反应物混合均匀，接着升温至5℃反应24h，随后升温至15℃反应6h。最后将体系冷却至2℃，用3M盐酸调节体系pH值到7，用去离子水透析7天除去溶液中的尿素和盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，产率为87％。1HNMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.85，取代度为0.76。用乌氏粘度计测得其粘均分子量为Mη＝414kDa。该均相合成的HPCH溶液具有温度敏感性，流变结果显示出可逆的溶胶-凝胶的转变行为(图6)，其中浓度为2wt％的HPCH溶液的凝胶转变温度为22℃，该样品记为HPCH-T3。
呋喃环羟丙基甲壳素FGE-HPCH的合成
称取1克上述制得的温敏羟丙基甲壳素HPCH-T2溶解在125mL 1M的NaOH溶液中，加入12克缩水甘油糠醚(CAS号码5380-87-0，furfuryl glycidylether,FGE)，室温下搅拌反应24h，用3M HCl中和至中性，透析一周，冷冻干燥制得呋喃环改性羟丙基甲壳素，记为FGE-HPCH，产率93％，其结构通过核磁氢谱测得呋喃环的摩尔取代度MSFGE为0.20。改变FGE与HPCH的投料比，可得到一系列呋喃环取代度的FGE-HPCH。通过流变学测试FGE-HPCH的温敏性转变温度与原料HPCH的温敏性转变温度相近。
根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN201310641249.6]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的温敏羧甲基甲壳素，氢谱NMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.87，羧甲基取代度为0.19。类似的，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的温敏性羟乙基甲壳素和温敏性羟丁基甲壳素，这些甲壳素衍生物的乙酰度范围在0.7-0.92，其分子量范围为5kDa～1000kDa。温敏性壳聚糖衍生物可以外购：温敏性羟丁基壳聚糖和温敏性羟戊基壳聚糖，它们的乙酰度范围为0.01～0.4。分子量范围为5kDa～1000kDa。
实施例3：温敏性氨醛原位反应改性羟丙基甲壳素HPCH水凝胶的制备
将实施例1制备的DF-PEG(PEG的分子量为2000)与实施例2制备的具有温敏性的羟丙基甲壳素HPCH-T1分别溶于0.15M pH 7.4的PBS缓冲液中，配置浓度为20wt％的DF-PEG和3wt％的HPCH-T1的溶液。取0.047gDF-PEG溶液、1g HPCH-T1溶液和0.14g PBS缓冲液在低温下2-15℃进行均匀混合半分钟后(其在低温下混合很长一段时间都是液体，具有良好的可注射性)将其置于37℃的恒温水浴中静置很快成凝胶，说明其体内原位快速成胶特性。因为氨醛化学交联在体内慢慢进行，在37℃的恒温水浴中6-24h，都可得到醛基/氨基的摩尔比为1，HPCH浓度为2.5wt％水凝胶，不流动，记为1-2.5％DF-PEG/HPCH水凝胶。
图3为2.5wt％HPCH温敏性凝胶和1-2.5％DF-PEG/HPCH双组份凝胶溶液的储能模量(G’)在37℃下随时间的变化曲线，从该图中可知，包括温敏物理交联和氨醛化学交联的DF-PEG/HPCH水凝胶的储能模量G’值比仅含温敏物理交联的HPCH水凝胶大将近1倍，说明该体系发生了化学交联反应，表明在温敏物理凝胶的基础上进行的化学交联可以提高水凝胶的力学性能。
选取不同浓度的HPCH和不同醛基/氨基摩尔比，同样可以制备不同的DF-PEG/HPCH水凝胶，分别记为0.3-2.5％，0.6-2.5％，1.2-2.5％，1-2％，1-1.5％。图4为其中4种水凝胶和2.5wt％HPCH温敏性凝胶的压缩断裂应力应变曲线，从该图可知，2.5wt％HPCH温敏性凝胶断裂应力只有10kPa，对应的断裂应变约43％，而1-2.5％DF-PEG/HPCH水凝胶的断裂应力高达130kPa，同时对应的断裂应变达到75％，表明在温敏物理凝胶的基础上进行的化学交联可以大大提高水凝胶的力学性能。使用三臂苯甲醛端基聚乙二醇TF-PEG或者多元苯甲醛端基修饰的亲水性大分子交联剂代替线型双苯甲醛端端基PEG不影响可注射水凝胶的制备。改变PEG分子量从低聚物到5万，或者改变PEG浓度在0.5-30wt％范围内，都可以做成双组份可注射温敏改性甲壳素高强度水凝胶。
实施例4：京尼平/温敏性羟丙基甲壳素HPCH水凝胶的制备
将京尼平(genipin)与实施例2制得的具有温敏性的羟丙基甲壳素HPCH-T2分别溶于40℃和4℃的0.15M pH 7.4的PBS缓冲液中，配置浓度为1wt％的京尼平和3wt％的HPCH的溶液。取0.04克京尼平溶液，1克HPCH-T2溶液和0.16克PBS缓冲液在低温下2-15℃进行均匀混合半分钟后，再将其置于37℃的恒温水浴中48小时，制得0.04％-2.5％genipin/HPCH水凝胶，其中前者表示京尼平浓度为0.04wt％，后者表示HPCH的浓度为2.5wt％。通过改变前体溶液京尼平和HPCH溶液的浓度，可得到一系列京尼平/温敏性羟丙基甲壳素HPCH水凝胶。这些水凝胶的储能模量和压缩强度随京尼平浓度的增加(0.02％-0.10％)而明显增大，说明该体系发生了化学交联反应。采用京尼平衍生物代替京尼平也可得到类似的水凝胶。此外，改变前体溶液HPCH的分子量和脱乙酰度，同样可以获得一系列的京尼平/温敏性羟丙基甲壳素HPCH水凝胶。
实施例5：将线型双马来酰亚胺端基聚乙二醇DMAL-PEG)(分子量约为2000)与实施例2制得的具有温敏性的呋喃环羟丙基甲壳素FGE-HPCH分别溶于低温4℃的0.15M pH 7.4的PBS缓冲液中，配置浓度为1.0g/mL的DMAL-PEG和20mg/mL的FGE-HPCH的溶液。取16.4微升DMAL-PEG溶液和1mLFGE-HPCH溶液在低温下2-15℃进行均匀混合半分钟后，再将其置于37℃的恒温水浴中12h，即可得到马来酰亚胺基/呋喃环的摩尔比为1：1，浓度为16.4/20mg/mL的DMAL-PEG/FGE-HPCH水凝胶。体系中的呋喃环和马来酰亚胺通过Diels-Alder点击反应交联，可实现在物理温敏凝胶的基础上进行化学交联，可增强该物理凝胶的力学性能。图5为20mg/mL FGE-HPCH温敏性凝胶和16.4/20mg/mL MAL-PEG/FGE-HPCH双组份凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)在37℃下随时间的变化曲线，从该图中可知，包含物理和化学交联的MAL-PEG/FGE-HPCH水凝胶的G’值比仅含物理交联的FGE-HPCH水凝胶大1.5倍以上，表明在物理凝胶的基础上进行的化学交联可以大大提高水凝胶的力学性能。通过改变前体溶液FGE-HPCH的呋喃环摩尔取代度和马来酰亚胺基/呋喃环的摩尔投料比(0-2)，可得到一系列MAL-PEG/FGE-HPCH水凝胶。此外，改变前体溶液FGE-HPCH的浓度(10-30mg/mL)、分子量和脱乙酰度，或者用三臂马来酰亚胺端基PEG(TMAL-PEG)部分或全部代替DMAL-PEG，同样可以制得一系列可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶产品。
实施例6：三臂酯炔端基PEG/温敏性羟丙基甲壳素HPCH水凝胶的制备
利用三臂PEG可以制备三臂酯炔端基TA-PEG(PEG的分子量为2600)与实施例2制备的HPCH-T2分别溶于低温4℃的0.15M pH 7.4的PBS缓冲液中，在低温下2-15℃进行均匀混合半分钟后，再将其置于37℃的恒温水浴中10h，即可通过胺炔反应制备TA-PEG/HPCH水凝胶，体系中的氨基和炔基通过形成烯胺键，实现在物理凝胶的基础上进行化学交联，从而可以增强该物理凝胶的力学性能。实验结果表明包含物理和化学交联的TA-PEG/HPCH水凝胶的G’值比仅含物理交联的HPCH水凝胶大2.5倍，表明在温敏物理凝胶的基础上进行的化学交联可以大大提高水凝胶的力学性能。
实施例7：甲基丙烯酸缩水甘油酯改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物水凝胶的制备
在25℃下，0.5g的上述的羟丙基甲壳素HPCH-T3溶于100mL去离子水中，用3M NaOH调节pH至9，向溶液中加入一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA(GMA与糖单元摩尔比分别5和11)反应48h，反应过程用NaOH调节溶液的pH为7-9。反应结束后，用1M HCl溶液中和，用去离子水透析5天除去溶液中的盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状甲基丙烯酸缩水甘油酯改性羟丙基甲壳素(GM-HPCH)。通过1H NMR谱图测得产物的乙酰度为0.85，羟丙基取代度为0.76，GMA取代度分别为0.04和0.08,分别记为GM4-HPCH和GM8-HPCH。用乌氏粘度计测得其粘均分子量为Mη＝441和470kDa。该类改性的GM-HPCH溶液具有温度敏感性，流变结果图6显示出温敏的溶胶-凝胶的转变行为，其中浓度为2wt％的GM4-HPCH和GM8-HPCH溶液的凝胶转变温度分别为20.6和19.1℃。为了与温敏性的GM8-HPCH比较，根据我们前期的研究工作[中国发明专利申请公开说明书CN201310641249.6]，采用均相法在氢氧化钠-尿素体系中制备低脱乙酰度的没有温敏性的水溶性羧甲基甲壳素，氢谱NMR谱图计算得出产物的乙酰度为0.85，羧甲基取代度为0.34。利用这个没有温敏性的羧甲基甲壳素改性，同样制得GMA取代度为0.08的甲基丙烯酸缩水甘油酯改性羧甲基甲壳素(记为GM8-CMCH)，GM8-CMCH溶于水，测试结果为没有温敏性。
将上述的GM-HPCH溶于磷酸缓冲盐PBS水溶液中制成2wt％的GM-HPCH溶液，再加入含量为0.05wt％的水溶性紫外光引发剂Irgacure 2959混合均匀。将该溶液注入直径为8.7mm，高为7mm的圆形模具中，放置在37℃下30min温敏凝胶固化后，再进行不同时间的紫外(365nm,0.85mW/cm2，除非特殊说明，否则本专利都是这种光照强度)光照，得到一系列不同光交联程度的高强度聚合物水凝胶产品。采用动态力学分析仪(DMA,TA instrumentQ800series,USA)来测定GM-HPCH凝胶的压缩强度，在37℃下进行测试。图7a为这6种水凝胶的压缩断裂应力应变曲线，从该图中可知随着紫外光交联时间的延长GM8-HPCH水凝胶的压缩强度提高直至完全交联，且光交联后的GM8-HPCH水凝胶的压缩强度大大高于没有光交联的只有物理交联的温敏性水凝胶HPCH和GM8-HPCH压缩强度。图7b为5种水凝胶的压缩模量比较，在37℃测得的光交联后的GM8-HPCH水凝胶的压缩模量高于没有光交联的只有物理交联的温敏性水凝胶HPCH和GM8-HPCH压缩模量，也高于只有光交联后的GM8-CMCH，已加入水凝胶的压缩模量和在10℃时测得的光交联后的GM8-HPCH水凝胶的压缩模量(只有化学光交联，没有物理交联)。这些结果表明温敏物理交联和光化学交联的结合的聚合物水凝胶比只有单独的温敏物理交联或者光化学交联的水凝胶提高了力学强度。
实施例8：甲基丙烯酸酐改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物水凝胶的制备
同样，在冰水混合浴下，0.5g的上述的羟丙基甲壳素HPCH-T3溶于100mL去离子水中，用1M NaOH调节pH至8，向溶液中加入一定量的甲基丙烯酸酐MeA(MeA与糖单元摩尔比1：1)反应12h，反应过程用NaOH调节溶液的pH为7-8。反应结束后，用丙酮沉淀，再用乙醇多次洗涤后，用去离子水透析5天除去溶液中的盐等小分子，冷冻干燥得到白色海绵状甲基丙烯酸酐改性羟丙基甲壳素(MeA-HPCH)。通过1H NMR谱图测得产物的乙酰度为0.85，羟丙基取代度为0.76，MeA取代度为0.12,得到的MeA-HPCH具有温敏性。将甲基丙烯酸酐改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物1％的水溶液里加入含量为0.2wt％的水溶性紫外光引发剂Irgacure 2959混合均匀。将该溶液注入圆形模具中，放置在37℃下30min温敏凝胶固化后，再进行不同时间的紫外(365nm,0.85mW/cm2)光照，得到一系列不同光交联程度的高强度聚合物水凝胶产品。光交联之后再降温还是凝胶。同样使用温敏性的羧甲基甲壳素，在冰浴中溶于0.1M的NaOH溶液，使用甲基丙烯酸酐改性也制得了温敏性甲基丙烯酸酐改性羧甲基甲壳素，引入水溶性紫外光引发剂同样制得原位物理交联再光交联的高强度聚合物水凝胶产品。
使用其它多元苯甲醛端基的亲水性大分子交联剂代替苯甲醛修饰的PEG大分子交联剂与温敏性羟丙基甲壳素复合，或者使用其它多元马来酰亚胺端基修饰的亲水性大分子交联剂和温敏性呋喃环羟丙基甲壳素的复合的PEG，可在生理条件下原位物理交联成型再在原位进一步化学交联制备可注射可降解高强度水凝胶。使用其它的温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟戊基壳聚糖、温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中的任一种或者它们的混合物的水溶液代替羟丙基甲壳素也可复合做成双组份可注射的水凝胶，在生理条件下原位物理交联成型再在原位进一步化学交联制备可注射可降解高强度水凝胶。或者使用其它的温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟戊基壳聚糖、温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中的任一种或者它们的混合物进行改性引入可光交联的侧链双键，再加入光引发剂，形成具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液，在生理条件下原位物理交联成型再在原位进一步光交联制备可注射高强度水凝胶。
实施例9：水凝胶的体外酶促降解
甲壳素分子链中的β-(1→4)-糖苷键能被人体普遍存在的溶菌酶所降解。以实施例7中的甲基丙烯酸缩水甘油酯改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物光交联前后含水原始凝胶为代表，图8A显示了不同酶浓度对GM8-HPCH-30min(UV)凝胶降解的影响。当水凝胶浸泡在不含溶菌酶的PBS中，水凝胶没有明显的质量损失，表现出良好的稳定性。当PBS的酶浓度增至2mg/L及20mg/L时，浸泡50天后，凝胶的质量损失分别为50％以及100％。同时，为了研究光交联对GM-HPCH水凝胶体外降解的影响，将不同光交联程度的水凝胶浸泡在37℃含有2mg/mL溶菌酶的PBS中。由图8B可知，降解33天后，未经光交联的水凝胶完全降解，GM8-HPCH-10min(UV),GM4-HPCH-30min(UV),GM8-HPCH-30min(UV)水凝胶还分别保有他们原本质量的35％,47％,60％，说明紫外光交联能有效提高GM-HPCH的酶降解稳定性。因此，光交联温敏性GM-HPCH水凝胶具有良好的生物降解性，同时，可以根据甲基丙烯酸酯的取代度，光照时间，酶浓度来调节GM-HPCH水凝胶的降解性能。
实施例10：水凝胶的细胞毒性研究
以实施例7中的甲基丙烯酸缩水甘油酯改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物光交联前后含水原始凝胶为代表，使用HeLa细胞测试GM-HPCH光交联水凝胶的毒性。采用CCK-8试剂盒测定细胞增值率，通过HeLa细胞与凝胶碎块直接接触后的细胞存活率来评估，如图9A所示。HeLa细胞在两组有GM4-HPCH和GM8-HPCH光交联水凝胶碎块存在下可持续增值，与无GM-HPCH凝胶碎块对照组的细胞增殖相似。对HeLa细胞进行死活染色，绿色代表活细胞，红色代表死细胞，通过激光共聚焦观察，如图9B所示。结果显示对照组及凝胶组的细胞数都显示出持续增长，两组的红色死细胞数非常少，这表明GM-HPCH交联凝胶不影响HeLa细胞的生长。为了评估该可注射温敏光交联GM-HPCH水凝胶用于组织工程和三维细胞培养的可行性，将灭菌过的GM4-HPCH聚合物和光引发剂Irgacure 2959(0.05％)在无菌条件4℃下溶于PBS水溶液，并与HeLa细胞混合均匀(细胞密度为2.5×10 5/mL)，放入细胞培养板里37℃ 30分钟成胶后使用紫外灯(365nm,6mW/cm2)光照2分钟，在培养箱里进行三维细胞培养，每天换培养基，观察细胞生长和检测细胞增殖(CCK-8法)，并用死活细胞试剂检测(Live/DeadCell Staining Kit)，用激光共聚焦测试，同时与二维普通细胞培养做比较，如图9C和9D。由该图可知细胞在凝胶里可以正常增殖，活的绿色细胞均匀分布在水凝胶了，红色死细胞数非常少，7天后增殖速度比二维普通细胞增殖还快，这些都说明光交联GM-HPCH水凝胶没有明显的细胞毒性。因此，实验结果表明了该类可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶具有良好的细胞相容性，可望在人体各种手术中的粘合、封堵、止血、防渗漏或者防粘连中的应用，或者用于生物活性物质和细胞的载体及组织工程材料等生物医用领域。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种双组份可注射高强度温敏性改性甲壳素基水凝胶产品的制备方法，其特征在于，采用下列方法制备得到：
（1）制备组分A，其中组分A为可在生理条件下原位自发物理交联的具有温敏性的甲壳素衍生物的溶液；
（2）向组分A中引入组分B，其中组分B为在生理条件下可引发组分A发生交联反应的具有生物相容性的亲水性光引发剂或者在生理条件下可与组分A发生交联反应的具有生物相容性的亲水性交联剂，得到具有良好流动性的可注射水凝胶前体溶液；
（3）将步骤（2）得到的水凝胶前体溶液置于生理条件下原位自发物理交联成型，并进一步化学交联或者光照射交联形成所述高强度水凝胶；
其中：
组分A中温敏性改性甲壳素为温敏性羟丁基壳聚糖、温敏性羟戊基壳聚糖、温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中的任一种或者它们的混合物；同时B组分为两个以上醛端基改性的聚乙二醇PEG衍生物和其它多醛端基改性的亲水性高分子聚合物中的一种或多种，或者为京尼平或者京尼平的衍生物中的一种或多种；
或者，
组分A为侧链引入呋喃双键改性的温敏性改性甲壳素的溶液，同时交联剂B组分为两个以上马来酰亚胺端基改性的亲水性高分子聚合物，其中，组分A的制备方法为：称取1克温敏羟丙基甲壳素HPCH-T2溶解在125 mL 1 M的NaOH溶液中，加入12克缩水甘油糠醚，室温下搅拌反应24 h，用3 M HCl中和至中性，透析一周，冷冻干燥制得呋喃环改性羟丙基甲壳素；
或者，
组分A为侧链引入丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯双键改性的温敏性改性甲壳素，B组分为水溶性光引发剂；步骤（3）使用光照射交联形成所述高强度水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组分A为甲基丙烯酸缩水甘油酯或者甲基丙烯酸酐改性羟丙基甲壳素的温敏性聚合物，组分B为水溶性紫外光引发剂Irgacure 2959。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，组分A中聚合物的质量分数范围为0.5～20%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）的配制温度均为2-15oC。
5.一种可注射高强度温敏性甲壳素基水凝胶，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。
6.如权利要求5所述的可注射高强度温敏甲壳素基水凝胶的应用，其特征在于，用于制备人体各种手术中的粘合、封堵、止血、防渗漏或者防粘连材料，以及用于生物医用领域的生物活性物质和细胞的载体及组织工程材料。
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