CN116459232B - 一种温敏载药复合纳米颗粒的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种温敏载药复合纳米颗粒的制备及应用。首次利用CN和HBCOS溶解后加入交联剂京尼平，获得具有温度敏感的纳米颗粒，其本申请对于细胞具有低毒性和良好的稀释稳定性和血液相容性；当获得的复合纳米颗粒作为载体与化疗药物混合制备获得载药复合纳米颗粒时，其具有良好温度敏感性；可用于包埋DOX等抗肿瘤药物，实现载药纳米颗粒的温敏控制释放，治疗癌症。

Description

一种温敏载药复合纳米颗粒的制备及应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及温度敏感的药物递送载体的制备。
背景技术
癌症在世界各国均是导致死亡的主要原因，也是缩短预期寿命的一个重要因素。化疗是治疗癌症的重要手段，然而，化疗药物的选择性差、药物利用率低、毒副作用强。因此，针对肿瘤微环境和正常组织的差异性(如温度、pH、酶)，设计具有刺激响应性特性的纳米载体提高肿瘤的选择性、增强药物在肿瘤部位的靶向积累和控制释放成为肿瘤治疗的重要手段。刺激响应性纳米载体是在特定物理化学刺激(包括温度、pH、光和离子强度)下具有可控收缩或膨胀行为的材料，因其刺激响应特性使其可以在适当的时间和位置释放被包埋的药物。在各种刺激中，温度是刺激响应给药研究最广泛的刺激之一，因为温度刺激可以由内源或远程控制的热变化诱导。
许多合成的温度响应材料包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)和聚(环氧乙烷)等被开发出来应用于生物医学领域。但是这些合成类聚合物的生物相容性或可生物降解性差，制约了其应用。天然产物衍生出来聚合物如羟丁基壳聚糖、羟丁基壳寡糖和羟丙基纤维素也具有温度响应特性，同时具有良好的生物相容性和生物可降解性。然而，这些材料的温敏性都具有浓度依赖性，在低浓度下其温度响应临界点上升或者温度响应特性消失，因此主要应用于智能窗户、重金属清除、伤口敷料、水污染治理等方面。而聚合物在生物医药领域的应用过程中，势必会经由各种途径而导致浓度被稀释，导致其温敏作用减弱甚至消失。因此，被用于药物递送的载体必须具有稀释稳定性，浓度依赖型的温敏响应聚合物在药物递送应用中受限。
发明内容：
解决浓度依赖型的温敏响应聚合物在药物递送应用中的不足。
我们利用带正电的温敏性羟丁基壳寡糖(HBCOS)与带负电的酪蛋白酸钠(CN)通过静电相互作用形成稳定的聚电解质复合物。CN具有磷酸丝氨酸和羧基，可以通过静电相互作用与带正电的羟丁基壳寡糖结合或者装载带正电的药物如阿霉素(DOX)。由于CN容易被胰蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶和组织蛋白酶B等水解，CN与其他材料复合后可以产生易于生物降解的材料。将HBCOS与CN通过静电相互作用结合得到复合纳米颗粒进行交联，可以得到稳定的温敏性复合纳米颗粒，可用于包埋DOX等抗肿瘤药物，实现载药纳米颗粒的温敏控制释放，治疗癌症。
本发明的第一个方面是提供一种温敏复合纳米颗粒，所述的纳米颗粒由羟丁基壳聚糖(HBCOS)和酪蛋白酸钠(CN)组成，具体由如下方法制备：
(1)将CN和HBCOS分别溶于水中，将CN与HBCOS混合使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
(2)加入京尼平，35℃～39反应24～72h，调pH后透析1～3天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒。
在一个优选的实施例中，所述的CN为浓度为0.5～1.5mg/mL，HBCOS的浓度为30-50mg/mL；在另外一个优选的实施例中，所述的CN与HBCOS的质量比为：1:0.4-0.8；在另外一个具体的实施例中，所述的pH值为5.8～6.5；
在另外一个具体的实施例中，步骤2)中京尼平的浓度为0.01-0.1mg/mL；在另外一个具体的实施例中，反应温度为37℃，pH值为7.0～7.8，优选7.4；在另外一个具体的实施例中，透析膜截留分子量为8000～12000Da，优选为10000Da。
本发明的第二个方面提供一种载有药物的复合纳米颗粒，所述载药纳米颗粒以如下方法制备，
(1)将CN和HBCOS分别溶于水中，将CN与HBCOS混合使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
(2)加入京尼平，35℃～39℃反应24～72h，调pH后透析1～3天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒；
(3)将步骤2)中制备的复合纳米颗粒用超纯水复溶，调pH，加入药物，避光条件下室温摇晃12～15h后用超纯水透析，透析袋的截留分子量为8000～12000a，每8～15h换一次透析液；将透析袋里的样品冻干，得到载药复合纳米颗粒。
在一个优选的实施例中，所述的步骤1)中CN为浓度为0.5～1.5mg/mL，HBCOS的浓度为30-50mg/mL；在另外一个优选的实施例中，所述的CN与HBCOS的质量比为：1:0.4-0.8；在另外一个具体的实施例中，所述的pH值为5.8～6.5；
在另外一个具体的实施例中，步骤2)中京尼平的浓度为0.01-0.1mg/mL优选的0.05mg/mL；在另外一个具体的实施例中，反应温度为37℃，pH值为7.0～7.8，优选7.4；在另外一个具体的实施例中，透析膜分子粒径8000～12000Da，优选为10000Da。
在另外一个具体的实施例中，所述步骤3)中复合纳米颗粒溶解的终浓度为0.8～1.2mg/mL，优选为1mg/mL；在另外一个具体的实施方式中，所述的药物为化学药物，优选为抗肿瘤的化疗药物，最优选的为DOX；在另外一个具体的实施例中，所述的药物的终浓度为0.08～0.12mg/mL，优选为0.1mg/mL。
本发明的第三个方面提供一种温敏复合纳米颗粒的制备方法，所述的方法为：
(1)将CN和HBCOS分别溶于水中，将CN与HBCOS混合使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
(2)加入京尼平，35℃～39℃反应24～72h，调pH后透析1～3天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒。
在一个优选的实施例中，所述的CN为浓度为0.5～1.5mg/mL，HBCOS的浓度为30-50mg/mL；在另外一个优选的实施例中，所述的CN与HBCOS的质量比为：1:0.4-0.8；在另外一个具体的实施例中，所述的pH值为5.8～6.5；
在另外一个具体的实施例中，步骤2)中京尼平的浓度为0.01-0.1mg/mL；在另外一个具体的实施例中，反应温度为37℃，pH值为7.0～7.8，优选7.4；在另外一个具体的实施例中，透析膜截留分子量为8000～12000Da，优选为10000Da。
本发明的第四个方面是提供一种载药的温敏复合纳米颗粒的制备方法，所述的方法为：
(1)将CN和HBCOS分别溶于水中，将CN与HBCOS混合使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
(2)加入京尼平，35℃～39℃反应24～72h，调pH后透析1～3天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒；
(3)将步骤2)中制备的复合纳米颗粒用超纯水复溶，调pH，加入药物，避光条件下室温摇晃12～15h后用超纯水透析，透析袋的截留分子量为8000～12000a，每8～15h换一次透析液；将透析袋里的样品冻干，得到载药复合纳米颗粒。
在一个优选的实施例中，所述的步骤1)中CN为浓度为0.5～1.5mg/mL，HBCOS的浓度为30-50mg/mL；在另外一个优选的实施例中，所述的CN与HBCOS的质量比为：1:0.4-0.8；在另外一个具体的实施例中，所述的pH值为5.8～6.5；
在另外一个具体的实施例中，步骤2)中京尼平的浓度为0.01-0.1mg/mL优选的0.05mg/mL；在另外一个具体的实施例中，反应温度为37℃，pH值为7.0～7.8，优选7.4；在另外一个具体的实施例中，透析膜分子粒径8000～12000Da，优选为10000Da。
在另外一个具体的实施例中，所述步骤3)中复合纳米颗粒溶解的终浓度为0.8～1.2mg/mL，优选为1mg/mL；在另外一个具体的实施方式中，所述的药物为化学药物，优选为抗肿瘤的化疗药物，最优先的为DOX；在另外一个具体的实施例中，所述的药物的终浓度为0.08～0.12mg/mL，优选为0.1mg/mL。
本发明第五个方面是提供第一方面所述的温敏复合纳米颗粒或第三方面所述的温敏复合纳米颗粒的制备方法在制备药物组合物中的应用，具体的，所述的药物组合物中载有化学药物，优选的为抗肿瘤的化疗药物，更优选的为DOX。
本发明的有益效果为：
本发明首次利用CN和HBCOS溶解后加入交联剂京尼平，获得具有温度敏感的纳米颗粒，其本申请对于细胞具有低毒性和良好的生物相容性；
当获得的复合纳米颗粒作为载体与化疗药物混合制备获得载药复合纳米颗粒时，其具有良好的血液相容性以及温度敏感性；
由于CN容易被胰蛋白酶、胃蛋白酶、基质金属蛋白酶和组织蛋白酶B等水解，CN与其他材料复合后可以产生易于生物降解的材料。将HBCOS与CN通过静电相互作用结合得到复合纳米颗粒进行交联，可以得到稳定的温敏性复合纳米颗粒，可用于包埋DOX等抗肿瘤药物，实现载药纳米颗粒的温敏控制释放，治疗癌症。
附图说明
图1：复合纳米颗粒的温敏性：图1A，不同京尼平浓度的温敏检测；图1B，不同CN:HBCOS质量比构成的纳米颗粒温敏性检测。
图2复合纳米颗粒的稀释稳定性。
图3复合纳米颗粒的血液稳定性：图3A,纳米颗粒的血清稳定性；图3B,纳米颗粒的血液相容性。
图4载DOX复合纳米颗粒的响应释放。
图5载DOX复合纳米颗粒的抗癌活性：图5A,不同浓度的复合纳米颗粒的细胞毒性检测；图5B,负载DOX的复合纳米颗粒分别在37℃、42℃孵育24h后细胞存活率。
具体实施方式：
以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
实施例1羟丁基壳寡糖-酪蛋白酸钠聚电解质复合物的制备
1、CN-HBCOS复合纳米颗粒的制备
(1)溶解CN和HBCOS于水中，将1mg/mL的CN与HBCOS(40mg/mL)混合使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调pH至6.2，形成复合纳米颗粒。
(2)加入京尼平，使京尼平的浓度为0.01-0.1mg/mL，37℃反应48h，调pH至7.4后透析(10000Da)2天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒。
(3)温敏性检测
通过调整京尼平的浓度，观察复合纳米颗粒的温敏性，结果如图1A所示：通过比较复合纳米颗粒在37℃和42℃的粒径变化探究其温敏性，随着京尼平浓度的增加，复合纳米颗粒的温敏性先增加后下降，在京尼平浓度达到0.05mg/mL时其粒径变化最大，温敏性最强。
调整CN与HBCOS的质量比，观察纳米颗粒的温度敏感性，发现当HBCOS的浓度为0.4mg/mL时，复合纳米颗粒不具备温敏性；当HBCOS浓度达到0.5mg/mL以后，复合纳米颗粒出现温敏性(图1B)。
实施例2CN-HBCOS复合纳米颗粒的稳定性
1)稀释稳定性
通过测定复合纳米颗粒(CN:HBCOS＝1:0.5，京尼平浓度为0.05mg/mL)在不同浓度和不同温度下的粒径来判断其在高度稀释下的稳定性情况。如图2所示，当复合纳米颗粒从1mg/mL稀释到0.1mg/mL之后，其粒径大小和温敏性均没有发现显著性差异。表明经过静电相互作用和共价交联形成的复合纳米颗粒的温敏性和稳定性不会受稀释过程的影响，可以在高稀释环境下发挥作用。
2)血清吸附实验
抗癌药物通过静脉注射需要保持其在血液中的稳定性。选择10％的胎牛血清来评估复合纳米颗粒在血清中的稳定性，以防止药物载体的非特异性蛋白质吸附。若纳米载体与血清蛋白发生吸附会导致纳米载体粒径的增加，因此采用动态光散射测定颗粒尺寸的变化进行稳定性评估。结果如图3A所示，复合纳米颗粒粒径在3天内没有增加，因此复合纳米颗粒在10％胎牛血清的存在下是稳定的。
3)溶血试验
评价复合纳米颗粒的血液相容性。溶血率表示与血液接触的物质破坏红细胞膜的程度，溶血率值越小，说明生物材料的血液相容性越好。将红细胞与不同浓度的复合纳米颗粒共孵育1h，结果如图3B所示，在所有的浓度范围内，复合纳米颗粒的溶血率均为负值。与其他研究人员采用PEG材料得到的结果类似。证明复合纳米颗粒具有良好的血液相容性。
实施例3载药CN-HBCOS复合纳米颗粒的制备
1)将实施例1制备获得的复合纳米颗粒用超纯水复溶至1mg/mL，调pH至7.4，加入4mg/mL的DOX使其浓度为0.1mg/mL，避光条件下室温摇晃12h后用500mL超纯水透析24h，透析袋的截留分子量为10000Da，每12h换一次透析液。将透析袋里的样品冻干，得到载DOX复合纳米颗粒。
2)纳米颗粒对药物包封率检测
表1复合纳米对DOX的包封
*CN的浓度为1mg/mL
复合纳米对DOX具有良好的包封率和载药量。
实施例4载药复合纳米颗粒温敏释放检测
对上述载DOX复合纳米颗粒进行释放测定，发现其释放动力学曲线具有温度响应特性，在高温下释放速率和释放量显著增加。
将载DOX复合纳米颗粒溶解于10mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中得到浓度为1mg/mL的溶液，取4mL样品置于透析袋(10000Da)中进行透析，透析液分别为pH 7.4和5.5的10mmol/L的磷酸盐缓冲液(透析体积为60mL)，透析温度分别为37℃和42℃。分别于0.5、1、2、3、4、6、8小时取样3mL进行测定，测定波长为485nm。每次取样后加入同体积同pH的新鲜透析液。结果如图4所示，在37℃，pH 7.4时复合纳米载体中的药物在8小时内缓慢释放至36.5％。当温度从37℃增加到42℃，在pH 7.4条件下8小时内累积释放比从36.5％增加到41.0％，表明载药复合纳米颗粒可以对外部温度刺激作出反应，具有温敏性，因此在更高的温度下增强了药物的释放。同时，在释放初期，DOX的释放速率在42℃更快。在生理条件下(pH 7.4)，复合纳米颗粒所带的负电荷较多，和DOX的静电相互作用较强，释放较弱。然而，在肿瘤组织或核内体/溶酶体(pH 6.5-5.0)所表现的酸性介质中，复合纳米颗粒中CN所带-COO-减少，同时HBCOS开始质子化，由此导致复合纳米颗粒与DOX的静电相互减弱，促进DOX的释放。在37℃，pH 5.5时，载药复合纳米颗粒中DOX在8小时内的释放达到46.9％，显著高于同等温度下pH 7.4时的释放程度，证明了低pH条件下质子的置换会促进DOX的释放，表现出pH响应性。复合纳米颗粒的温度响应在低pH下表现的更明显，在pH5.5时，42℃下载药纳米颗粒中的DOX会释放的更加迅速，在8小时内的释放也更加彻底，达到62.0％。
实施例5载DOX复合纳米颗粒与肿瘤细胞共孵育发现其抗肿瘤活性具有温度响应性
采用CCK-8试验评估复合纳米载体和载DOX复合纳米颗粒在结肠癌细胞HT-29细胞系中的体外细胞毒性。
将HT-29细胞以每孔2×104个细胞的密度接种于96孔培养板中，培养48h。然后用不同浓度的复合纳米载体(2-0.125mg/mL)处理细胞。孵育24h后，向每个孔中加入10μL的CCK-8溶液，孵育1h后用酶标仪在450nm和650nm下测定HBCOS处理和未处理(对照)样品的吸光度。用相对细胞活力评价细胞毒性，对照组为100％。
将载DOX复合纳米颗粒溶在pH7.4的磷酸缓冲液中溶解至包埋的DOX浓度为100μg/mL。加入到细胞培养基中使其浓度分别为10-0.625μg/mL，分别于37℃和42℃培养箱中培养24h后采用CCK-8测定细胞活性。结果如图5所示。
在测定载药复合纳米颗粒的体外抗癌活性之前，我们先测定了不同浓度复合纳米颗粒对结肠癌细胞HT-29细胞的细胞毒性。结果如图5A所示，在加入不同浓度的复合纳米颗粒以后，所有细胞活性仍保持在95％以上，表明复合纳米颗粒作为药物载体对细胞具有低毒性和良好的生物相容性。我们对载DOX复合纳米颗粒在不同温度下对HT-29细胞的细胞毒性也进行了评估。图5B显示了负载DOX的复合纳米颗粒分别在37℃、42℃孵育24h后细胞存活率。结果发现，载药纳米颗粒对HT-29细胞的毒性具有明显的浓度依赖性。HT-29细胞在37℃和42℃孵育24小时后细胞活性均高于90％，表明温度自身对细胞活性没有抑制作用。在DOX浓度较低(0.625μg/mL)时，不同温度下的细胞活性没有明显差异；当DOX浓度增加，42℃条件下孵育的载DOX的复合纳米颗粒对HT-29细胞的毒性显著高于在37℃条件下孵育的载药颗粒。这表明当温度高于复合纳米材料的相变温度时，载DOX的复合纳米颗粒的细胞毒性显著增强。这与载DOX复合纳米颗粒的释放曲线结果相一致，高温下较高的细胞毒性归因于DOX从复合纳米颗粒中更快地释放。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种温敏复合纳米颗粒的制备方法，所述的温敏复核纳米颗粒包含羟丁基壳聚糖（HBCOS）和酪蛋白酸钠（CN），具体由如下方法制备：
（1）将CN和HBCOS分别溶于水中，获得CN水溶液和HBCOS水溶液，将CN与HBCOS混合，使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
（2）加入京尼平，35℃~39℃反应24~72h，调pH后透析1~3天后冻干，得到交联后的温敏复合纳米颗粒；
其中步骤（1），所述的CN水溶液浓度为0.5~1.5mg/mL，HBCOS水溶液浓度为30-50mg/mL；HBCOS的反应浓度在0.5mg/mL以上；所述的pH值为5.8~6.5。
2.根据权利要求1所述的复合纳米颗粒的制备方法，其中步骤2）中，加入京尼平，使京尼平的浓度为0.01-0.1 mg/mL； pH值为7.0~7.8。
3.一种载药复合纳米颗粒的制备方法，所述载药复合纳米颗粒以如下方法制备，
（1）将CN和HBCOS分别溶于水中，分别获得CN水溶液和HBCOS水溶液，将CN与HBCOS混合，使CN与HBCOS的质量比为1:0.4-0.8，调节pH，形成复合纳米颗粒；
（2）加入京尼平进行交联反应，35℃~39反应24~72h，调pH后透析1~3天后冻干，得到交联后的复合纳米颗粒；
（3）将步骤（2）中制备的复合纳米颗粒用超纯水复溶，调pH，加入药物，避光条件下室温摇晃12~15h后用超纯水透析，每8~15h换一次透析液；将透析袋里的样品冻干，得到载药复合纳米颗粒；
其中所述的步骤1）中CN水溶液浓度为0.5~1.5mg/mL，HBCOS水溶液浓度为30-50mg/mL；HBCOS的反应浓度在0.5mg/mL以上；所述的pH值为5.8~6.5。
4.根据权利要求3所述的载药复合纳米颗粒的制备方法，其中步骤2）中使京尼平交联反应的浓度为0.01-0.1 mg/mL，反应温度为37°C， pH值为7.0~7.8。
5.根据权利要求4所述的载药复合纳米颗粒的制备方法，其中所述步骤3）复合纳米颗粒用超纯水复溶至0.8~1.2mg/mL；所述的药物为化学药物。
6.权利要求1-或2所述的方法制备获得的温敏复合纳米颗粒。
7.权利要求3或4所述的方法制备获得的载药复合纳米颗粒。
8.权利要求6所述的温敏复合纳米颗粒或者权利要求7所述的载药复合纳米颗粒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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