CN111504923B - 一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法。本发明提供的测定方法测试过程操作简单、可控，且最低检出限、定量限和加标回收率等测试表明本发明提供的测定方法能被用于改性甲壳素样品中蛋白质含量的准确测试；本发明提供的测定方法可为开发新型改性甲壳素医用材料提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质测定方法，尤其涉及一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法。
背景技术
甲壳素是从甲壳动物外壳或真菌、藻类的细胞壁中提取的，是仅次于纤维素的第二大可再生天然高分子。甲壳素及其衍生物具有非常好的生物相容性、生物可降解性、低毒性和多种生物活性，具有极大的研究和应用价值大，但作为天然来源的甲壳素原料以及其衍生物中含有多种杂质，特别是含有难以除去的少量异源蛋白质可能在人体内引起免疫反应。
甲壳素通常以纳米纤维的形式与碳酸钙、蛋白质结合并成生物矿物质。由于这种生物矿物质具有多层级结构，且由于甲壳素分子链间的氢键作用，因而使得这种生物矿物质既不溶于水和低浓度的酸碱，也不溶于常用的有机溶剂，从而限制了它的研究开发和应用。
近年来，具有温敏性的甲壳素衍生物受到广泛关注，这类甲壳素衍生物在低温时溶于水中后可保持液态，从而均匀地包载细胞/药物并填充不规则的创面部位，加之这类甲壳素衍生物可进入体内并迅速原位成凝胶，因而这类甲壳素衍生物可作为可注射水凝胶用于生物医用领域，如微创原位给药、细胞和活性因子载体、3D打印生物墨水、高端植入医疗器械和组织工程原位修复中。由于现有甲壳素衍生物(特别是乙酰度大于0.50的改性甲壳素)中蛋白质含量的准确测定方法很少，只有壳聚糖中蛋白质含量的测试使用考马斯亮蓝法(根据一般命名规则，乙酰度高于50％的甲壳素衍生物称为改性甲壳素，乙酰度低于50％的甲壳素衍生物称为改性壳聚糖)，这就限制了这类温敏改性甲壳素在生物医药领域的应用。
根据2015版中国药典收录，当前市场上常用的蛋白质测定方法有凯氏定氮(Kjeldahl)法、双缩脲(biuret)法、紫外可见光检测法(UV)、2’2-联喹啉-4’4-二羧酸钠(bicinchoninic acid，BCA)法、考马斯亮蓝(Bradford)法和福林酚(Lowry)法。但对于甲壳素衍生物中蛋白质含量的准确测定中由于UV检测法和双缩脲法的干扰因素较多、灵敏度不高等原因而被排除；而甲壳素衍生物中本身含氮也会影响凯氏定氮法的测试准确性；而Bradford测试法中一些高分子物质如壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基淀粉和乙二醇丙二醇共聚物等可能会干扰影响考马斯亮蓝法的蛋白质量测定结果；Lowry法和BCA法的原理都是碱性条件下Cu2+被蛋白质肽键还原成Cu+，不同的是前者利用福林酚试剂与蛋白质反应还原Cu+成深蓝色色，而后者是利用BCA与Cu+鳌合显色。BCA法是1985年美国学者Smith等提出的一种改进的Lowery测定法,这种检测法干扰物质相对较少，对微量蛋白质(0.5-10mg/L)测试灵敏度和准确度较高，但未见BCA法对甲壳素衍生物中微量蛋白质含量测试的报道。
发明内容
针对上述问题，现提供一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法，旨在有效解决甲壳素衍生物中微量蛋白质的含量测定，从而促进其在医药领域的应用。
具体技术方案如下：
一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法，具有这样的特征，包括如下步骤：
(1)、依次配制获得BCA工作液、蛋白质标准溶液及待测改性甲壳素衍生物的样品溶液；
(2)、取蛋白质标准溶液，分别以去离子水稀释成一系列不同浓度的蛋白质标准溶液，再分别向各蛋白质标准溶液中加入BCA工作液，混合均匀后将混合液置于水浴中处理一段时间，随后取出并冷却至室温，以不加蛋白质标准溶液的空白混合液作为参比，测定各混合液在1000-400nm处的吸光度值，绘制标准曲线；
(3)、取待测改性甲壳素衍生物的样品溶液，向其中加入BCA工作液，混合均匀后置于水浴中处理一段时间，随后取出并冷却至室温，测定混合液在1000-400nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品溶液中蛋白质含量和甲壳素衍生物中蛋白质含量；
其中，改性甲壳素衍生物中乙酰度高于50％。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(2)中标准曲线的绘制方法为：以样品溶液中的蛋白质含量为横坐标，以样品溶液的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(2)及步骤(3)中吸光度测试波长为562nm。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中一种或两种，且待测改性甲壳素衍生物的乙酰度为0.63-0.92；且样品溶液浓度为0.4-4mg/mL。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羟丙基甲壳素或温敏性羧甲基甲壳素中的一种或两种，且样品溶液为1-2mg/mL。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(2)中标准曲线的绘制方法为：以吸光度值对波长进行一阶求导，计算吸光度一阶导数的峰值，以样品溶液中的蛋白质含量为横坐标，以峰值处的吸光度一阶导数值为纵坐标绘制标准曲线；且步骤(3)中测定混合液在峰值处的吸光度一阶导数值，再根据标准曲线计算样品溶液中蛋白质含量和甲壳素衍生物中蛋白质含量。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中一种或几种，且待测改性甲壳素衍生物的乙酰度为0.63-0.92；且样品溶液浓度为1-10mg/mL。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(2)及步骤(3)中吸光度一阶导数的峰值波长为585nm。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(1)中蛋白质标准溶液为浓度为50mg/L的牛血清白蛋白溶液，其配置方法为：精确称取0.010gBSA，将其溶解于10mL去离子水中，加水定容成浓度为50mg/L的牛血清白蛋白标准溶液；步骤(2)中不同浓度的蛋白质标准溶液的配制方法为：分别取蛋白质标准溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mL，再以去离子水稀释成浓度分别为2、4、6、8、10、12、14mg×L-1的系列蛋白质标准溶液。
上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤(2)中BCA工作液的加入量为1:(1-20)，且混合液置于温度为50-70℃的时间为50-70min；步骤(3)中BCA工作液的加入量为1:(1-20)，且混合液置于温度为50-70℃的时间为50-70min。
本发明中BCA工作液的配制采用1985年美国学者Smith的“Measurement ofprotein using bicinchoninic acid”一文[Smith,P.K.；Krohn,R.I.；Hermanson,G.T.；Mallia,A.K.；Gartner,F.H.；Provenzano,M.D.；Fujimoto,E.K.；Goeke,N.M.；Olson,B.J.；Klenk,D.C.,Analytical Biochemistry1985,150,76-85]中微量BCA的配制方案，具体为：
A1液配制：将4克碳酸钠、0.8克氢氧化钠、0.8克酒石酸钠加入至10mL去离子水中，溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液将其调节、定容至pH为11.25、体积为50mL溶液，避光保存；
A2液配制：将1克2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸二钠(BCA-Na2)溶解在25mL去离子水中；
A3液配制：将0.4克五水合硫酸铜溶解在10mL去离子水中；
BCA工作液的配制：按体积0.32:8:8依次混合A3、A2、A1，得BCA工作溶液。
本发明中也可以根据被测改性甲壳素中蛋白质含量的高低选择该文献标准BCA(standard BCA)方案或者适当调整各组分的比例。
需要说明的是，根据一般命名规则，乙酰度高于50％的甲壳素衍生物称为改性甲壳素，乙酰度低于50％的甲壳素衍生物称为改性壳聚糖。
本发明中待测改性甲壳素衍生物的乙酰度也可进一步优选为0.63-0.90。
上述方案的有益效果是：
1)、本发明提供的测定方法测试过程操作简单、可控，且最低检出限、定量限和加标回收率等测试表明本发明提供的测定方法能被用于改性甲壳素样品中蛋白质含量的准确测试；
2)、本发明提供的测定方法可为开发新型改性甲壳素医用材料提供技术支持。
附图说明
图1为本发明的实施例1中羟丙基甲壳素、纯PEG及PEG-model溶液中蛋白质浓度的测试图；
图2为本发明的实施例1中HPCP溶液的吸光度测试图；
图3为本发明的实施例1中HPCH与BCA工作液反应混合后的沉淀照片；
图4为本发明的实施例3中HPCH样品中蛋白质含量的紫外可见光全谱图；
图5为图4的一阶导数图谱；
图6为对比例1中羟丙基甲壳素、纯PEG及PEG-model溶液中蛋白质浓度的测试图；
图7为对比例2中蛋白质标准样品及HPCH样品的UV谱(A)及HPCH样品溶液在检测过程中出现的絮状沉淀照片(B)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1一种羟丙基甲壳素中蛋白质含量的测定方法
一种羟丙基甲壳素中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)、依次配制获得BCA工作液、蛋白质标准溶液(本发明中为浓度为50mg/L的牛血清白蛋白(BSA)标准溶液)及待测羟丙基甲壳素(根据课题组授权公告号为CN103951764B的中国授权发明专利中提供的制备方法制备获得的白色海绵状羟丙基甲壳素(HPCH)，1H NMR谱图计算得该羟丙基甲壳素的乙酰度为0.90，羟丙基取代度为0.75)样品溶液(将其直接溶于去离子水中)；
(2)、取牛血清白蛋白标准溶液，以去离子水稀释成浓度不同的系列牛血清白蛋白标准溶液，再依次取各牛血清白蛋白标准溶液0.5mL，依次向其中加入0.5mLBCA工作液，混合均匀后将混合液置于60℃水浴下孵化60min，随后将混合液于室温下冷却至室温，测定各混合液在562nm处的吸光度值，绘制得蛋白质浓度-吸光度值的标准曲线；
(3)、将样品溶液0.5mL，向其中加入0.5mLBCA工作液，充分混合后再将混合液于60℃下孵化60min，测定混合液在562nm处的吸光度值并根据标准曲线计算待测改性甲壳素衍生物中的蛋白质含量；
其中，步骤(1)中BCA工作液的配置方法采用1985年美国学者Smith的“Measurement of protein using bicinchoninic acid”一文中微量BCA的配制方案，本实施例中不再赘述；
其中，步骤(2)中系列牛血清白蛋白标准溶液中各物质用量及吸光度值如下表所示：
由上表绘制得标准曲线为y＝0.021x(R2＝0.999)，其中，x表示蛋白质浓度(mg/L)，y表示吸光值；
其中，步骤(3)中待测样品溶液浓度及其在562nm的吸光度和蛋白质含量计算值如下表所示：
测定中羟丙基甲壳素本身对HPCH蛋白质含量测定的干扰
由于HPCH总是含有少量蛋白质，没有办法获得无蛋白的纯HPCH(protein-free)，而聚合物聚乙二醇(PEG)没有任何蛋白，可作为参照使用，故本发明中使用分子量4k的PEG，设计一个PEG参考模型(即PEG-model溶液(PEG与BSA的质量比恒为1000:5的混合溶液))，验证PEG-4K和HPCH本身是否干扰上述测定方法，即PEG和HPCH样品在上述测定方法下产生的UV吸收是否均来源于其所含蛋白质。
不同浓度(0-5mg/mL)的各高分子样品(HPCH、PEG-4k、PEG-model通过上述测定方法测定的所含蛋白质的结果如图1所示。由该图可知，不同浓度的纯PEG-4k样品在上述测定方法下均不产生UV吸收；而PEG-model样品中所测蛋白质含量与已知加入的量一致，这说明PEG-4K(≤0.5wt％)不干扰蛋白质的测定；而HPCH测定结果与PEG-model具有相同的规律，都是呈线性正比例关系，因此我们认为HPCH聚合物本身没有对测定方法存在明显的干扰。
稳定性试验
本发明中先将BCA工作液加入如上浓度分别为1-5mg/mL的HPCH样品中进行染色反应，染色后将混合液冷却至室温，再测试不同静置时间后在562nm处的吸光值，结果如图2。
由该图可以看出1-4mg/mLHPCH样品在前30min内吸光值基本是稳定的，而5mg/mLHPCH样品的吸光值随着时间的延长略有增加，故为了提高分析的准确性，本申请使用较低浓度的HPCH样品(≤4mg/mL)测定蛋白质的含量。
测量限及准确度
本发明中以BCA工作液的空白测试得到空白检出限，再以浓度为0.4mg/mL的HPCH溶液为接近空白样，对如上浓度为0.4mg/mL的HPCH溶液进行测试并计算得到接近空白检出限(LOD＝3σ/s)及定量限(LOQ＝10σ/s)，其LOD及LOQ计算如下表所示：
如上表所示，本发明提供的测定方法可被用于2mg/mLHPCH溶液中蛋白质含量的准确测试，即本发明提供的测定方法满足美国医用壳聚糖蛋白质含量低于0.2％的要求，可用于蛋白质量高于0.12％的HPCH固体材料的准确分析。
本发明中对如上浓度为1mg/mL和2mg/mL的HPCH样品溶液进行加标实验，即分别加入大约已有蛋白质含量的80％、100％、120％的BSA，再测定加入后总蛋白质含量，按如下公式计算加标回收率：
(总蛋白计算值-原蛋白计算值)/BSA加入量x100％。
上述加标实验回收率如下表所示：
如上表所述，本发明中加标回收率值均在95-105％之间，相对标准偏差小于5％，均满足《中国药典药品质量标准分析方法验证指南》中对于被检测物含量在0.01-0.1％间时所要求的回收率在85-110％、相对标准偏差(RSD)不高于6％的要求。
羟丙基甲壳素和羟丙基壳聚糖中蛋白质含量的可行性
本发明中取实施例1中HPCH样品分别溶解去离子水、1MNaOH和4M NaOH溶液中后再在室温下放置4天，然后中和透析，经过冷冻干燥后核磁测试其乙酰度分别为0.89、0.63和0.35，并分别精确称取上述三种样品溶解于水中，制得浓度为1.0mg/mL的待测溶液，再分别取0.5mL待测溶液，并依次向其中加入新配制的BCA工作液0.5mL，立即用旋涡式混合器充分混合5秒，并在60℃的水浴锅中静置孵化60min后再冷至室温。
如图3所示，空白水、乙酰度分别为0.89和0.63的HPCH样品溶液都正常透明，而乙酰度为0.35的样品溶液中存在明显絮状沉淀(造成絮状沉淀可能是因为羟丙基壳聚糖(DA＝0.35)分子链中存在大量的氨基与Cu2+形成稳定的螯合物)，所以这说明本测定方法可用于羟丙基甲壳素(乙酰度大于0.50)中蛋白质含量的测定，而无法适用于羟丙基壳聚糖(乙酰度小于0.50)中蛋白质含量的测定。
实施例2温敏性羧甲基甲壳素中蛋白质含量的测定
本发明中利用实施例1中测定方法测定待测羧甲基甲壳素(根据课题组授权公告号为CN103601819B对中国授权发明专利中提供的制备方法制备获得的低脱乙酰度的羧甲基甲壳素(CMCH)，1HNMR谱图计算得该羧甲基甲壳素的乙酰度为0.87，羧甲基取代度为0.19)样品溶液(称取CMCH并配置形成CHPCH＝1mg/mL的样品溶液)中蛋白质的含量，具体的，3次平行试验下该待测样品溶液在562nm的吸光度分别为0.107、0.112、0.99，利用线性方程y＝0.021x(R2＝0.999)计算得该待测样品溶液中蛋白质含量为5.03±0.2mg/L。
本实施例中采用实施例1中相同方法测得本实施例中加标回收率值均在95-102％之间，相对标准偏差小于3％，均满足《中国药典药品质量标准分析方法验证指南》中对于被检测物含量在0.01-0.1％间时所要求的回收率在85-110％、相对标准偏差(RSD)不高于6％的要求。
对于其它温敏性改性甲壳素，如温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中蛋白质含量的测定，上述测定方法同样可行，本发明中不再赘述。
实施例3一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法
一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)、依次配制获得BCA工作液、蛋白质标准溶液(本发明中为浓度为50mg/L的牛血清白蛋白标准溶液)及待测改性甲壳素衍生物的样品溶液；
(2)、取牛血清白蛋白标准溶液，以去离子水稀释成浓度不同的系列牛血清白蛋白标准溶液，再依次取各牛血清白蛋白标准溶液0.5mL，依次向其中加入0.5mLBCA工作液，混合均匀后将混合液置于60℃水浴下孵化60min，随后将混合液于室温下冷却至室温，以不加蛋白质标准溶液的空白混合液作为参比，测定各混合液在1000-400nm下的吸光度值A，以吸光度值A对波长求一阶导数，计算得吸光度一阶导数的峰值波长为585nm，再以各混合液中的蛋白质含量为横坐标，以585nm处的吸光度一阶导数值为纵坐标绘制标准曲线，得y＝0.408x(R2＝0.999)，其中x为蛋白质浓度(mg/L)，y表示585nm处的吸光度一阶导数值；
(3)、将样品溶液0.5mL，向其中加入0.5mLBCA工作液，充分混合后再将混合液于60℃下孵化60min，测定混合液在585nm处的吸光度一阶导数值并根据标准曲线计算待测改性甲壳素衍生物中的蛋白质含量；
其中，步骤(1)中BCA工作液的配置方法采用1985年美国学者Smith的“Measurement of protein using bicinchoninic acid”一文中微量BCA的配制方案，本实施例中不再赘述；
其中，步骤(2)中浓度不同的系列牛血清白蛋白标准溶液中各物质用量及吸光度值如下表所示：
本发明中发现浓度不同的(0-5mg/mL)HPCH样品中蛋白质含量的紫外可见光全谱图(如图4所示)中在近红外区(750-1000nm)吸光值不为零，这表明样品溶液不是非常透明，且随着HPCH浓度的增加吸光度增大，说明样品溶液透明性降低，这可能是由于利用实施例1中测定方法测定温敏性HPCH中蛋白质含量时存在因部分胶束化现象而造成光散射的问题，且越高浓度的HPCH样品在检测时由于胶束化造成的光散射现象越严重。为了减少这种光散射的干扰，本申请中利用吸光度值对波长求一阶导数，并计算吸光度一阶导数的峰值波长，再绘标准曲线。
根据朗伯比尔定律：A＝ECl(A:吸光度，E吸光系数，C浓度，l厚度)本发明中在上式两边同时对波长λ进行求导：
由于E只与被测物种类有关，所以
可视为一常数，所以吸光度的一阶导数结果
仍与被测物浓度(C)呈线性关系。
如图5所示，该吸光度一阶导数图谱中在波长为585nm处有一个吸收峰值，故585nm即为本申请中吸光度一阶导数的峰值波长。
本实施例中以实施例1中方法计算得到LOD及LOQ，其计算结果如下表所示：
如上表所示，本发明提供的测定方法可被用于2mg/mLHPCH溶液中蛋白质含量的准确测试，即本发明提供的测定方法满足美国医用壳聚糖蛋白质含量低于0.2％的要求，可用于蛋白质量高于0.14％的HPCH固体材料的准确分析。
本实施例中利用实施例1中方法进行准确度试验，本实施例中加标实验回收率如下表所示：
如上表所述，本发明中加标回收率值均在95-105％之间，相对标准偏差小于5％，均满足《中国药典药品质量标准分析方法验证指南》中对于被检测物含量在0.01-0.1％间时所要求的回收率在85-110％、相对标准偏差(RSD)不高于6％的要求。
配方、反应温度和时间对测试羟丙基甲壳素中蛋白质含量的影响
1)、配置浓度为50mg/L的BSA标准蛋白质溶液，并按照下表配制标准蛋白质溶液系列：
2)、在0.5mL各蛋白质标准溶液和10mg/mL的待测HPCH溶液中分别加入新配制的BCA工作液10mL，立即用旋涡式混合器充分混合5秒，并在37℃的水浴锅中静置孵化2小时，冷至室温，用空白组作为对照，采用与实施例3中相同的测定方法处理得标准曲线。
步骤2)中获得的标准曲线具有良好的线性关系，由此说明将待测样品与BCA工作液的体积比从1:1提高到1:20后获得的标准曲线仍具有良好的线性关系和灵敏度，即将待测样品与BCA工作液的体积比提高到1:20后所获得的标准曲线可用于羟丙基甲壳素中蛋白质含量的计算。
同样，本申请中调整步骤2)中反应温度在30-80℃范围内，反应时间在30分钟到4小时内，最终所制得的标准曲线具有良好的线性关系和灵敏度，即改变反应温度及反应时间后所获得的标准曲线可用于羟丙基甲壳素中蛋白质含量的计算。
对比例1考马斯亮蓝法测试羟丙基甲壳素蛋白质含量可行性
根据YY 0953-2015医用羧甲基壳聚糖医药行业标准(YY)中考马斯亮蓝法测定蛋白质含量：
1)、配制考马斯亮蓝试液：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL的95％乙醇后，加入100mL85％的磷酸和800mL去离子水，搅拌待完全溶解后定容到1000mL，最后过滤取滤液避光保存。
2)、配制标准蛋白质溶液：精确称取标准蛋白BSA用去离子水溶解配置浓度为50mg/L的BSA标准蛋白质溶液，并按下表配制标准蛋白质溶液系列：
3)、配制HPCH待测样品配制：使用10mg/mL的HPCH溶液，按下表配制不同浓度的HPCH待测样品1.5mL：
4)、将1.5mL考马斯亮蓝试液分别加到1.5mL标准蛋白质溶液及不同浓度的HPCH待测溶液中，迅速混合并于室温下反应10min，最后在595nm下用塑料比色皿以空白组为对照测定吸光度，结果如下表所示：
由上表绘制得吸光值-浓度标准曲线，其方程为y＝0.0168x+0.083(R2＝0.998)，其中，x表示蛋白质浓度(mg/L)，y表示吸光值。
经计算，各测试样品中蛋白质含量测试如下表所示：
*考马斯亮蓝法测得HPCH和PEGmodel样品中蛋白质含量
由上表可知相同的HPCH材料中所含蛋白质的量与待测样品HPCH浓度不成正比例关系，为了更清楚说明羟丙基甲壳素本身在考马斯亮蓝法测试HPCH蛋白质含量时是否有干扰，我们按照实施例1中3部分进行类似比较。由于我们制得的HPCH总是含有少量蛋白质，没有办法获得无蛋白的纯HPCH(protein-free)，而合成聚合物聚乙二醇(PEG)没有任何蛋白，可作为参照使用，这里使用分子量4k的PEG，设计一个PEG参考模型(即PEG-mode溶液，即PEG与BSA的质量比恒为1000:5的混合溶液)，验证PEG-4K和HPCH本身是否干扰考马斯亮蓝法法测定其蛋白含量，即PEG和HPCH样品在考马斯亮蓝法法下产生的UV吸收是否均来源于其所含蛋白质。
如图6所示，在本实施例中的测定方法中，不同浓度的纯PEG-4k样品均不产生UV吸收；而PEG-model样品所测蛋白质含量与已知加入的量一致，这说明PEG-4K(≦0.5wt％)不干扰考马斯亮蓝法法测定蛋白质；而HPCH的测定结果与PEG-model的测定结果具有不相同的规律，均不是呈线性正比例关系，例如1mg/mL HPCH中含蛋白质的测量结果为14.3mg/L，然而2mg/mL HPCH中含蛋白质的量为15.9mg/L而不是14.3mg/L的2倍。以此类推，这显然不符合假设，因此我们认为HPCH本身会干扰Bradford法测定蛋白结果，说明考马斯亮蓝法测试浓度在0-5mg/mL的羟丙基甲壳素蛋白质含量不可行。
对比例2 Lowry法测试羟丙基甲壳素蛋白质含量的可行性
根据2015版《中国药典》中记载的药品中蛋白质含量Lowry测定方法(0731)对HPCH样品进行测定。
1)、Lowry试剂配制：
试剂A液配制：取0.1g五水合硫酸铜溶解在10mL水中；
试剂B液配制：称取0.25g酒石酸钠钾四水合物溶解在10mL水中；
试剂C液配制：称取2g碳酸钠，0.4g氢氧化钠溶解于20mL水中；
试剂D液配制：取1mL试剂A与1mL试剂B混合；
试剂E液配制：量取1mL试剂D与10mL试剂C混合；
试剂F液配制：量取2mL福林酚试剂加入18mL水中进行稀释；
其中D、E、F需要现配现用。
2)、配制标准蛋白质样品：按照实施例1中标准蛋白质溶液进行配制。
3)、HPCH待测样品配制：按照实施例1中HPCH待测溶液进行配制。
4)、将1.5mL试剂E分别与蛋白质标准溶液及待测HPCH样品迅速混合于25℃下反应10min，随后加入4.5mL的试剂F，立即混匀，并在50℃下反应10min，最后在750nm处测试UV吸收。
上述实验过程中由于发现明显絮状沉淀现象，不满足比色法要求(如图7B所示)；空白组与标准BSA组在混合反应后仍保持清澈透明，而HPCH组却出现明显浑浊现象，且越高浓度的HPCH样品沉淀现象越明显，这说明Lowry法也不能对HPCH材料中蛋白质含量进行检测。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种甲壳素衍生物中蛋白质含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、依次配制获得BCA工作液、蛋白质标准溶液及待测改性甲壳素衍生物的样品溶液；
(2)、取蛋白质标准溶液，分别以去离子水稀释成一系列不同浓度的蛋白质标准溶液，再分别向各蛋白质标准溶液中加入BCA工作液，混合均匀后将混合液置于水浴中处理一段时间，随后取出并冷却至室温，以不加蛋白质标准溶液的空白混合液作为参比，测定各混合液在1000-400nm处的吸光度值，绘制标准曲线；
(3)、取待测改性甲壳素衍生物的样品溶液，向其中加入BCA工作液，混合均匀后置于水浴中处理一段时间，随后取出并冷却至室温，测定混合液在1000-400nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品溶液中蛋白质含量和甲壳素衍生物中蛋白质含量；
其中，改性甲壳素衍生物中乙酰度高于50％。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中标准曲线的绘制方法为：以样品溶液中的蛋白质含量为横坐标，以样品溶液的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)及步骤(3)中吸光度测试波长为562nm。
4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中一种或几种，且待测改性甲壳素衍生物的乙酰度为0.63-0.92；且样品溶液浓度为0.4-4mg/mL。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羟丙基甲壳素或温敏性羧甲基甲壳素中的一种或两种，且样品溶液为1-2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中标准曲线的绘制方法为：以吸光度值对波长进行一阶求导，计算吸光度一阶导数的峰值，以样品溶液中的蛋白质含量为横坐标，以峰值处的吸光度一阶导数值为纵坐标绘制标准曲线；且步骤(3)中测定混合液在峰值处的吸光度一阶导数值，再根据标准曲线计算样品溶液中蛋白质含量和甲壳素衍生物中蛋白质含量。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中待测改性甲壳素衍生物选自温敏性羧甲基甲壳素、温敏性羟乙基甲壳素、温敏性羟丙基甲壳素、温敏性羟丁基甲壳素中一种或几种，且待测改性甲壳素衍生物的乙酰度为0.63-0.92；且样品溶液浓度为1-10mg/mL。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)及步骤(3)中吸光度一阶导数的峰值波长为585nm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中蛋白质标准溶液为浓度为50mg/L的牛血清白蛋白溶液，其配置方法为：精确称取0.010g BSA，将其溶解于10mL去离子水中，加水定容成浓度为50mg/L的牛血清白蛋白标准溶液；步骤(2)中不同浓度的蛋白质标准溶液的配制方法为：分别取蛋白质标准溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mL，再以去离子水稀释成浓度分别为2、4、6、8、10、12、14mg×L-1的系列蛋白质标准溶液。
10.根据权利要求1-8任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中BCA工作液的加入量为1:(1-20)，且混合液置于温度为50-70℃的时间为50-70min；步骤(3)中BCA工作液的加入量为1:(1-20)，且混合液置于温度为50-70℃的时间为50-70min。
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