KR101966555B1

KR101966555B1 - 생체친화형 하이드로젤 및 제조방법

Info

Publication number: KR101966555B1
Application number: KR1020170140869A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 김병기; 박성준; 이상혁
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-04-05
Also published as: EP3524634B1; KR20180046378A; EP3524634A4; WO2018080221A1; EP3524634A1; US11389568B2; US20190314556A1

Abstract

본 발명은 광중합개시제 가교를 이용한 기능성 바이오 소재로서의 생체고분자 기반 하이드로젤 및 제조방법에 관한 것으로, 생체적용에 적합하면서도 탄력성이 있어 체외뿐 아니라 체내 적용처의 다양한 형상에 대하여 적절하게 창상 피복, 조직 유착과 같은 상처 치료 효과가 극대화된 생체친화성 하이드로젤을 간편한 방식으로 제공하는 효과가 있다.

Description

생체친화형 하이드로젤 및 제조방법 {BIOCOMPATIBLE HYDROGEL AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 명세서에 개시된 기술은 광중합개시제 가교를 이용한 기능성 바이오 소재로서의 생체고분자 기반 하이드로젤로서, 생체친화형 하이드로젤 및 제조방법에 관한 것이다.

하이드로젤은 조직공학적 관점에서 세포에게 자랄 공간을 제공하는 지지체 혹은 인공 세포외 기질이 된다. 상기 지지체, 혹은 인공 세포외 기질은 세포가 조직공학적 목적에 의해 더 잘 자라거나 혹은 원하는 방향으로 자라도록 사용되는 것으로, 이 같은 맥락에서 생체 고분자를 기반으로 한 하이드로젤은 생물의약 분야에 있어 높은 활용도를 갖는다.

생체 고분자는 글리코겐, 키토산, 셀룰로오스, 히알루론산 등 다양한 종류가 존재하며, 이들을 하이드로젤로 만드는데 물리적 가교, 혹은 비가역적 화학가교 방식 등이 사용된다. 일례로 생체 고분자의 비가역적 화학가교 방식은 생체 고분자에 노출된 아민기, 카복실기와 같은 잔기들에 티올기, 카테콜기, 페놀기와 같은 기능기들을 화학결합을 통해 도입한 다음 이들 기능기들을 가교시키는 것이다. 가교를 위하여 효소 혹은 광중합 개시제 등이 사용될 수 있는데, 효소는 기능기들이 효소의 활성자리와 만나면서 기능기들의 구조를 변화시키고 나아가 가교 반응을 일으키게 하며, 광중합 개시제는 적정 파장의 빛을 쐬어주게 되면 감광성을 갖게 되며 이로 인해 자유 라디칼이 만들어져서 잔기들의 가교 반응을 진행시킬 수 있다.

효소 사용과 관련하여, 겨자무과산화효소(Horseradish Peroxidase, HRP)를 사용하여 효소 촉발 반응으로 가교하는 기술을 한국 공개특허 제2010-0076173호에서 찾아볼 수 있다. 상기 종래 기술에 따르면 반응속도 조절의 용이성과 우수한 생체 적합성 기반 하이드로젤을 제공할 수 있으나, 효소 이외에 과산화수소(H₂O₂)와 같은 유독성 촉진제의 사용을 수반하여야 하므로 생체친화성이 떨어지는 문제가 있다. 이러한 효소 대신 광중합 개시제로서 금속 리간드 결합체를 사용하고 탄력성이 있는 하이드로젤을 제공하는 기술을 한국 공개특허 제2016-0026441호 및 Yang et al. Biomacromolecules 2015, 16, 3819-3826 등에서 찾아볼 수 있다. 그러나 상기 금속 리간드 결합체인 Ru(II)(bpy)₃ ² ⁺에 포함된 루테늄은 산업체에서 사용되는 금속이므로 체내외에 사용하기에 적절한 생체 친화적이라 할 수 없다.

이에 유독 물질이나 금속의 사용을 배제하고 생체친화성 하이드로젤을 간편한 방식으로 제공하는 기술, 탄력성이 있어 체외뿐 아니라 체내 적용처의 다양한 형상에 대하여 적절하게 창상 피복, 혹은 조직 유착 효과를 발휘할 수 있는 하이드로젤을 제공하는 기술이 필요하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체적용에 적합하면서도 탄력성이 있어 체외뿐 아니라 체내 적용처의 다양한 형상에 대하여 적절하게 창상 피복, 조직 유착과 같은 상처 치료 효과가 극대화된 생체친화성 하이드로젤을 간편한 방식으로 제공하는 것이다.

본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면,

생체 고분자에 아민기 함유 페놀 화합물을 커플링 결합시켜 아미드 결합된 생체 고분자를 제공하는 단계;

상기 아미드 결합된 생체 고분자에 모노페놀 화합물과 YY-X-YY(여기서 Y는 타이로신 잔기이고, X는 20종의 아미노산 잔기이다)로 나타내는 타이로신계 펩타이드를 혼합하여 혼합 용액을 형성하는 단계; 및

상기 혼합 용액에 광중합 개시제를 혼합하고 광 경화시켜 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 다이타이로신 결합 구조를 형성하는 단계를 포함하는 생체친화형 하이드로젤 제조방법을 제공한다.

본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 양 말단에 아민기 함유 페놀 화합물이 각각 커플링 결합된 생체 고분자이고, 상기 생체 고분자가 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나 혹은 상기 생체 고분자가 2종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되,

상기 2종 이상의 다이타이로신 링커는 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것인 생체친화형 하이드로젤을 제공한다.

본 명세서에 개시된 기술의 또 다른 측면에 의하면, 일 말단이 아민기 함유 페놀 화합물 커플링 결합된 생체 고분자이고, 타 말단이 상기 생체 고분자에 도입된 말단 관능기와 다이타이로신 결합으로 연결된 구조를 제공하는 아민기 함유 페놀 화합물이되,

상기 생체 고분자는 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 1종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되고 상기 1종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것인 생체친화형 하이드로젤을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 생체친화형 하이드로젤은 천연물 광중합 개시제를 사용함으로 인해 독성 문제가 전혀 없으며 만들어진 하이드로젤 또한 저장 탄력성을 증가시킨 부드러운 하이드로젤을 만들어, 체외 뿐 아니라 체내 적용처의 다양한 형태에 적용하기 적합한 형태를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 친환경 하이드로젤을 제조하는 공정흐름도이다.
도 2는 생체 고분자의 일종인 히알루론산에 아민 함유 페놀 화합물로서 티라민을 다이타이로신 가교의 브릿지로 도입하는 반응의 메카니즘을 나타낸 도면이다.
도 3은 도 2에서 제조된 티라민이 도입된 히알루론산에 타이로신계 펩타이드를 투입하고 리보플라빈 광중합 개시제 하에 자외선 경화시켜 다이타이로신 결합 구조를 갖는 히알루론산을 제조하는 반응의 메카니즘을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 티라민이 도입된 생체 고분자 내 티라민 도입율에 대하여 NMR 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 티라민이 도입된 생체 고분자가 하이드로젤이 되면서 나타내는 흡광도 변화 측정 그래프이다.
도 6은 기울기 실험을 통해 본 발명에 효과적인 광중합 개시제 농도를 확인한 사진이다.
도 7은 가교 반응시간을 도시한 도면이다.
도 8은 타이로신이 풍분한 펩타이드를 첨가하지 않은 경우와 타이로신 풍부 펩타이드를 추가한 경우 제조된 하이드로젤의 탄력성을 대비한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 타이로신이 풍분한 펩타이드 서열에 따라 나타나는 저장 탄성률 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 하이드로젤에 대하여, 펩타이드 서열에 따른 하이드로젤의 팽윤 정도 차이를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명에서 사용한 타이로신계 펩타이드의 서열별 하이드로젤의 분해 정도 차이를 도시한 그래프이다.
도 12는 가교시키지 않은 생체 고분자(a), 가교시킨 생체 고분자(b), 타이로신이 풍분한 펩타이드를 첨가하여 가교시킨 생체 고분자(c)의 SEM 사진이다.
도 13은 세포 독성 관련 생존율을 대비한 그래프이다.
도 14는 세포 증식 실험을 위해 사용된 하이드로젤 재료들의 세포 독성 시험 결과를 도시한 그래프이다.
도 15는 상처 범위 면적에 기초하여 상처 치료 효과를 대비한 그래프이다.
도 16은 상처 치료 효과를 보이는 사진이다.
도 17은 메이슨 트리크롬 조직염색으로 분석한 경시 상처 회복 속도를 확인한 도면이다.
도 18은 상처치료 펩타이드 GHK-Cu를 배양한 다음 피부섬유아세포 증식 실험 결과를 대비한 그래프이다.
도 19는 상처치료 펩타이드 GHK-Cu를 배양한 다음 피부섬유아세포 증식 실험을 통해 확인한 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로젤의 기능성 지지체로서의 효과를 살펴본 도면이다.

이하, 본 발명에 대하여 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 생체친화형 하이드로젤은 천연물 광중합 개시제를 사용함으로 인해 독성 문제가 전혀 없으며, 수득된 하이드로젤에 저장 탄력성을 증가시킨 부드러운 하이드로젤을 만들어서 체외뿐 아니라 체내 적용처의 다양한 형태에 적용하기 적합한 형태를 제공하고자 한다. 참고로, 종래 히알루론산 단독을 리보플라빈으로 가교시킨 방식으로 제작된 히알루론산 가교체는 지지체 성능이 부족하며, 리보플라빈과 자외선을 이용한 가교 기전을 통해 다이타이로신 결합을 충분히 형성할 수 있는 점에 착안하여 본 발명자들은 연구를 계속한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에서 생체친화형 하이드로젤은 생체 고분자를 광중합 개시제와 광을 통해 비가역적으로 가교시켜 부드러운 물성의 하이드로젤로서 제공할 수 있다. 다만 저장 탄성력, 복소 점성, 결합력 등을 보강할 목적으로 상기 생체 고분자는 특정 작용기를 양 말단에 갖는 화합물로 처리된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 처리 메카니즘은 다음과 같이 나타낼 수 있다:

[반응기전 1]

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 친환경 하이드로젤을 제조하는 공정흐름도이다. 도 1을 참고하면, 단계 S1으로서, 생체 고분자에 아민기 함유 페놀 화합물을 커플링 결합시켜 아미드 결합된 생체 고분자를 제공한다.

상기 아민기 함유 페놀 화합물은 일례로 일 말단에는 상기 생체 고분자와 아미드 결합을 형성하는 작용기로서 아민기를 갖고, 타 말단에는 후술하는 다이타이로신 결합을 형성하는 작용기로서 히드록시기, 퀴논기 등을 갖는 물질일 수 있다. 상기 아민기 함유 페놀 화합물은 아미드 결합을 형성하는 아민기와 다이타이로신 결합을 형성하는 히드록시기를 모두 갖는 물질인 티라민, 메타 티라민, 도파민 등을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 티라민은 후술하는 다이 타이로신 결합의 브릿지 역할을 하는 생체친화형 물질이므로 사용하기 바람직하다.

본 발명에서는 생체 고분자 100 단위를 기준으로 상기 아민기 함유 페놀 화합물을 5 중량% 이상, 5 내지 15 중량%, 혹은 10 내지 13 중량%로 포함할 수 있고, 이 범위 내에서 브릿지 역할을 효과적으로 수행할 수 있다 (도 2 및 도 3 참조).

상기 생체 고분자는 다당류 및 생분해성 고분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것으로, 여기서 상기 다당류는 글리코겐, 셀룰로오스, 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 등을 들 수 있고, 상기 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락티드-Co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(σ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트), 폴리(β-하이드록시발레레이트) 등을 들 수 있다. 하기 실시예에서 보듯이, 히알루론산으로서 10 내지 1200 kDa(달톤)인 것을 사용할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

참고로, 티라민이 도입된 생체고분자를 광중합 개시제와 빛(자외선)으로 가교시켜 하이드로젤을 제조하는 반응 메카니즘을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보듯이, 양 말단에 아미드 결합된 생체 고분자들이 다이타이로신 결합을 통해 연결된 구조를 제공하는 것을 확인할 수 있었다. 도 2의 하단부 우측 식은 다이타이로신 결합을 통해 연결된 구조이며, 좌측 식은 카테콜 결합을 통해 연결된 구조로서 여기서 카테콜 결합은 다이타이로신 유사결합에 해당한다.

본 발명은 상술한 반응 기전 2와 같이 티라민이 도입된 생체 고분자를 광중합 개시제로 가교시키는데 그치지 않고, 타이로신계 펩타이드와 혼합하여 사용함에 특징을 갖는 것으로, 그 반응 메카니즘을 도 3에 나타내었다. 도 3 중 첫 번째 반응물은 다이타이로신 결합(매개물 없는 직접 결합에 해당)을 통해 연결된 구조이며, 두 번째 반응물은 상기 다이타이로신 결합이 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 간접 결합된 구조에 해당한다. 상기 두 번째 반응물의 다이타이로신 결합 구조에서 매개물인 타이로신계 펩타이드는 생체에 적용된 경우, 생체환경에 존재하는 세포들이 분비하는 페놀산화효소들인 티로게나아제 혹은 라카아제에 의해 방출되어 그 기능을 할 수 있을 것으로 예상된다.

단계 S2로서, 상기 아미드 결합된 생체 고분자에 모노페놀 화합물과 YY-X-YY(여기서 Y는 타이로신 잔기이고, X는 20종의 아미노산 잔기이다)로 나타내는 타이로신계 펩타이드를 혼합하여 혼합 용액을 형성한다.

상기 모노페놀 화합물은 타이로신계 펩타이드의 가교 반응 지점 작용을 위해 도입되는 것으로, 일례로 페놀, 파라크레졸 및 파라이소옥틸페놀로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 반응성을 고려할 때 파라크레졸과 파라이소옥틸페놀을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 타이로신계 펩타이드는 후술하는 다이타이로신 결합에서 다이타이로신 링커간 연결체로서 작용하여 저장 탄성을 보강할 수 있도록 타이로신이 풍부한 펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 타이로신계 펩타이드는 일례로 YYACAYY, YYACAYY 이량체(Di-YYACAYY), YYAHAYY, YYAYY 및 YYCYY (여기서 Y는 타이로신 잔기이고, A는 알라닌(Ala), C는 시스테인(Cys), H는 (His)이다)로 이루어진 군 중에서 공급되는 1종 이상일 수 있고, 이들 펩타이드들을 첨가할 때 타이로신 (Y) 잔기들은 생체고분자에 도입된 페놀기와 가교 반응을 일으킬 수 있으므로 생체 내 페놀산화효소에 의해 펩타이드와 생체고분자의 혼합 하이드로젤이 만들어질 수 있고, 결과적으로 하이드로젤의 저장 탄성률과 복소점도를 증가시키는 것을 확인할 수 있다(도 5 내지 도 8 참조).

다만 용해도 측면에서 YYACAYY, YYAHAYY, YYAYY 및 YYCYY를 사용할 수 있다.

상기 아미드 결합된 생체 고분자와 상기 모노페놀 화합물, 상기 타이로신계 펩타이드 및 상기 광중합 개시제의 함유량은 중량비로 90 내지 95: 2 내지 6: 0.5 내지 5: 0.5 내지 5인 것이 하이드로젤 경화 역할을 제공하기에 바람직하다.

단계 S3로서, 상기 혼합 용액에 광중합 개시제를 혼합하고 광 경화시켜 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 다이타이로신 결합 구조를 형성한다.

본 발명에서 상기 광경화 방식은 친환경 리보플라빈계 광개시제를 이용한 자외선 경화방식을 사용함에 특징을 갖는 것으로, 리보플라빈의 경우 비타민 B2 유도체로서 빛을 쬐면 콜라겐을 합성시킬 수 있어 각막 치료에 활용된 적이 있고, 과량 존재하더라도 소변으로 배출되므로 과다 복용에 대한 부작용도 전혀 없는 생체친화형 물질에 해당한다. 따라서 생체친화적으로 활용하기 위한 생체고분자의 광중합 개시제로 바람직하다.

상기 광중합 개시제는 일례로, 리보플라빈, 페로센, 안트라퀴논 등이 생체친화형 하이드로젤을 제조하기에 바람직하다.

상기 광중합 개시제의 농도는 도 6에 예시한 기울기 실험을 통해 결정할 수있으며, 구체적인 예로 0.02 ~ 4 mM일 수 있다.

상기 다이타이로신 결합 구조는 일례로 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 2종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되, 상기 2종 이상의 다이타이로신 링커는 상기 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 광 경화는 리보플라빈계 광개시제를 사용하여 365 nm와 같은 300nm 파장대 자외선을 이용하여 수행할 수 있다(도 5 참조).

상기 하이드로젤은 너비, 두께 및 길이 중 적어도 하나가 1㎛ 이상이고 10mm 이하일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 생체친화형 하이드로젤은 일례로, 양 말단에 아민기 함유 페놀 화합물이 각각 커플링 결합된 생체 고분자이고, 상기 생체 고분자가 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 상기 생체 고분자가 2종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되, 상기 2종 이상의 다이타이로신 링커는 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 다이타이로신 링커로 직접 연결된 구조는 예를 들어 하기 식 1으로 나타내는 구조일 수 있다:

[식 1]

상기 2종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조는 예를 들어 하기 식 2로 나타내는 구조일 수 있다.

[식 2]

본 발명의 방법에 따라 제조된 생체친화형 하이드로젤은 다른 예로, 일 말단이 아민기 함유 페놀 화합물 커플링 결합된 생체 고분자이고, 타 말단이 상기 생체 고분자에 도입된 말단 관능기와 다이타이로신 결합으로 연결된 구조를 제공하는 아민기 함유 페놀 화합물이되, 상기 생체 고분자는 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 1종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되, 상기 1종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 다이타이로신 링커로 직접 연결된 구조는 예를 들어 하기 식 3으로 나타내는 구조일 수 있다.

[식 3]

상기 1종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조는 예를 들어 하기 식 2로 나타내는 구조일 수 있다.

[식 4]

상기 하이드로젤은 생체친화형이면서 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도 (rad/s) 규격으로 측정한 저장 탄성률이 100 내지 300 Pa인 다이타이로신 가교결합 구조체일 수 있다. 상기 하이드로젤은 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도(rad/s) 규격으로 측정한 복소점도가 0 내지 250 Pa.s인 다이타이로신 가교결합 구조체일 수 있다. 또한 상기 하이드로젤은 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도(rad/s) 규격으로 측정한 손실 탄성률이 0 내지 100Pa를 갖는 다이타이로신 가교결합 구조체일 수 있다.

상기 하이드로젤은 창상 피복 혹은 조직유착 방지용 기능성 지지체로 응용할 수 있으며, 필요에 따라 선택적으로 GHK-Cu, 세포성장인자, 항산화제를 비롯한 상처치료 인자 등을 포함할 수 있다. 상기 하이드로젤은 너비, 두께 및 길이 중 적어도 하나가 1㎛ 이상이고 10mm 이하일 수 있다.

도 8을 참조하면, 히알루론산만을 가교시킨 하이드로젤은 탄성이 떨어져서 잘 찢어지는 성향을 보인 반면(도 8의 좌측 도면 참조), 펩타이드가 첨가된 히알루론산은 탄성이 있음을 육안으로도 확인할 수 있었다(도 8의 우측 도면 참조).

이로써 리보플라빈과 자외선 가교된 히알루론산 하이드로젤은 타이로신이 풍부한 펩타이드를 첨가함으로써 탄성을 잃지 않는 창상 피복 혹은 조직유착 방지 등의 용도로 사용할 수 있고(도 9 내지 11 등 참조), 상처치료 효과가 있는 기능성 인자(일례로 GHK-Cu, 세포성장인자, 항산화제)에 대한 기능성 생체 지지체로 활용될 수 있다(도 18 내지 19 참조).

참고로, 본건에 적합한 UV 규격은, 115 V, 60 Hz, 0.7 A, 8 W, 254 내지 365 nm일 수 있고, UV 조사량은 10 내지 120 분일 수 있다.

성분별 사용량으로서 상기 아민기 함유 화합물 결합된 생체고분자는 0.5 내지 1.5 중량% 범위내일 수 있고, 상기 타이로신계 펩타이드는 0.01 내지 0.5 mM 범위내일 수 있으며, 광중합 개시제로서 리보플라빈계 개시제는 0.02 내지 4 mM 범위내일 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 다양한 실험을 통하여 예시하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

<실시예>

재료 준비

히알루론산 (소듐염, Mw 1200 kDa)은 SK Bioland사 제품을 Lifecore Biomedical에서 구입하였다. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride 98% (EDC) 및 리보플라빈 5‘-포스페이트 소디움, 3-(4,5-elapxlfxl아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, 히알루로니다아제 및 termolysin은 Sigma aldrich에서 구입하였다. N-hydroxysulfosuccinimide Sodium Salt는 TCI에서 구입하였다. 티라민 염산염(Tyramine hydrochloride, 99% 농도)는 Acros Organics에서 구입하였다. Dulbecco' Modified Eagle' Medium과 Phosphate Buffer Saline은 Welgene에서 구입하였고, 소 태아 혈청은 BeadTech에서 구입하였다. UV 조사는 LightningCure 2000 (Hamamatsu, Japan)을 사용하여 수행하였고, 유변학적 분석은 Discovery Hybrid Rheometer-3(TA Instruments)에 의해 수행하였다.

실시예 1:

히알루론산-티라민 결합체의 제조

HA-Ty (히알루론산-티라민) 결합체를 EDC/NHS 커플링 반응으로 제조하였다(도 2). 히알루론산 나트륨염 (1.0 g, 2.5 mmol 카르복실기)은 증류수 100 mL (0.01 mol/L)에 녹인 다음, 이 용액에 EDC (1437.75 mg, 7.5 mmol)와 NHS (863.175 mg, 7.5 mmol), 티라민 염산염(Tyramine hydrochloride, 1302.3 mg, 7.5 mmol)를 투입하였다. 생성된 용액을 상온에서 밤새 교반하였고, 반응 혼합물을 NaCl 용액 (100 mmol/L) 5L, 에탄올 용액 (18 mol/L) 및 증류수 5L로 초미세여과 (MWCO 12000)로 정제하였다.

생성된 HA-Ty 결합체는 동결건조시켜 흰색 분말로 수득하였다. HA-Ty 결합체의 티라민 결합율은 NMR 측정을 통해서 확인하였으며, 도 4에 결과를 정리하였다. 도 4에서 보듯이, 히알루론산 100단위당 티라민 잔기 수로서 정의되는 HA-Ty 결합체에서의 티라민 잔기의 치환도는 ¹HNMR.¹HNMR(D₂O):　δ1.99(아세틸메틸 양성자), 6.8 및 7.2 (티라민 잔기의 방향족 양성자)에 의해 결정된 바와 같이 11인 것으로 계산되었다(도 4 참조).

히알루론산의 카르복시산에 대한 티라민의 결합을 UV 분광학으로 재확인하였다. 티라민 하이드로클로라이드를 pH 7.4의 PBS 완충액에 용해시키고 0.1 uM~10 uM으로 희석하고 자외선 흡수조사 스캔을 수행하고 결과를 도 5에 정리하였다. 도 5에서 보듯이, 특유의 274 nm 흡광도를 확인하였다.

생체친화형 하이드로젤의 제조-1

티라민이 도입된 히알루론산을 광가교 시켜서 하이드로젤을 만들기 위해서 HA-Ty 1.5 wt%를 PBS buffer (pH 7.4)에 녹인 후 광중합개시제 리보플라빈을 더해서 잘 섞은 후 365 nm 파장대 자외선을 쬐었다. 적정한 리보플라빈 농도(0.1~20 mg/mL)는 기울기 실험을 통해서 결정했다(도 6 참조). 광가교 반응 진행 중에 흡광을 시간대별로 찍어서 260 nm에서 새로운 peak이 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 2 및 도 5 참조).

생체친화형 하이드로젤의 제조-2

티로신 펩타이드와 히알루론산을 함께 광가교 시킨 하이드로젤을 만들기 위해서 HA-Ty 1.5 wt%를 PBS buffer (pH 7.4)에 녹인 다음, 타이로신계 5종의 펩타이드 (YYACAYY (이하 YC7라 칭함), 이량화 YYACAYY (이하 DYC7라 칭함), YYAHAYY (이하 YH7라 칭함), YYAYY (이하 YA5라 칭함), YYCYY (이하 YC5라 칭함), 각각 0.1 mM 농도)을 HA-Ty 용액에 각각 첨가하여 총 4종의 혼합 용액을 준비하였다.

구체적으로는, 타이로신이 풍부한 펩타이드 서열들 (YYACAYY, 2량체 YYACAYY, YYAYY, YYCYY / 0.01~1 mM)을 각각 HA-Ty 용액에 더했다. 그리고 광중합개시제 리보플라빈 (0.1~1 mg/mL)을 더해서 잘 섞은 후 365 nm 파장대 자외선을 쬐었다(도 3 참조).

<물성 평가>

1) 가교 반응 시간과 저장 탄성률 (G’) 분석

가교 반응 시간과 저장 탄성률 (G’) 분석은 리오미터 장비를 이용하여 진행했다. 하이드로젤 샘플은 지름 20 mm, 두께 5 mm로 제작하여 측정했다. 가교 반응 시간은 진동 주파수 1 Hz, 응력 스윕 10 Pa 조건으로 시간에 따라 측정했으며 저장 탄성률은 진동 주파수 1 Hz, 응력 스윕 1~100 Pa 조건으로 측정 되었다. 모든 측정치는 3중으로 얻어서 평균값으로 구했다.

구체적으로는 저장 탄성률 G’의 진동 전단 측정을 일정한 응력 점도계(TA Instruments, USA, Discovery Hybrid Rheometer-3)를 사용하여 상온에서 수행하였다. 측정을 위해 직경 20 mm 및 두께 5 mm의 한정된 형상을 갖는 하이드로젤 샘플을 제조하였다. 경화된 하이드로젤을 하부 레오미터 스테이지에 놓고 상부 레오미터 고정 장치(직경 20mm)를 샘플의 상부 표면과 접촉할 때까지 낮추었다. 그런 다음 G’를 1~100 Pa까지의 응력 스위프 테스트에서 진동 주파수 1Hz에서 측정하였다. 선형 점탄성 영역의 한계를 결정하기 위해 응력 스위프(stress sweep)를 수행하였다. 모든 G’측정치는 3배로 얻어졌으며 모든 도면에서 오차 막대는 평균값에 대한 표본 표준편차는 나타낸다(도 7 및 9 참조). 도 7 및 도 9에서 보듯이, 타이로신계 펩타이드가 첨가된 경우 대부분 경화 시간이 늦춰지고 저장 탄성 수치는 모두 증가한 결과를 확인할 수 있다.

2) 팽윤 및 분해 실험

하이드로젤의 팽윤, 분해 실험은 다음과 같이 진행되었다. HA 하이드로젤은 0.1 mM 농도의 각각 다른 펩타이드 서열 (YYACAYY, Di-YYACAYY, YYAYY, YYCYY, YYAHAYY)들과 함께 광가교 되었다. 팽윤 실험은 동결건조 시킨 하이드로젤을 1mL 증류수에 25도에서 담가서 처음 무게 대비 증가한 무게로 계산하여 진행했다. S% = [(Wt-W0]/W0)]100에서 S는 팽윤율, Wt는 팽윤된 젤의 무게, W0는 동결건조 상태의 젤의 무게다. 분해 실험은 같은 방법으로 준비한 하이드로젤들을 0.01 mg/mL 히알루로니다아제 PBS 용액에 담가서 시간 별로 무게를 측정하는 방식으로 진행했다.

구체적으로, 가교 결합 밀도는 하이드로젤의 기계적 물성과 밀접하게 연관된 것으로 공지되어 있다. 레올로지 분석에 의해 측정된 저장 탄성률(G’)은 처리된 하이드로젤이 얼마나 경질인지 알 수 있는 신뢰할 만한 값이다. 펩타이드 미첨가 HA-Ty 하이드로젤의 G’는 30 rad/s에서 1%의 변형율 하에 측정 결과 156.6 Pa 이었다(도 10 참조). 타이로신계 펩타이드의 첨가는 하이드로젤의 G’를 증가시켰으며, 이는 펩타이드가 가교결합밀도를 증가시켜 하이드로젤을 강화시킬 수 있음을 나타낸다.

DYC 7 (297.6 Pa)와 YC 7 (271.8 Pa)의 G’는 HA-Ty 하이드로젤의 거의 2배를 차지하는 2가지 가장 높은 경우를 보였다. 상기 YC 7과 단 한 개의 아미노산 차이를 갖는 YH7 펩타이드는 30 rad/s에서 HA-Ty와 거의 동일한 G’를 나타내었다.

이로부터 HA=Ty의 가교 정도는 타이로신계 펩타이드의 길이에 의존하지 않고 서열 자체에 의존함을 나타낸다. 이는 YA5와 YC의 결과와도 일치하는데 실제로 길이가 더 짧은데도 이 2가지 경우의 G’가 YH7보다 높았다.

이러한 경향은 또한 하이드로젤의 팽창 특성에 의해서도 관찰되었다(도 10 참조). 하이드로젤의 팽창 거동은 유변학적 측정과 반비례하는 가교 밀도의 또 다른 지표에 해당한다.

예측된 것과 마찬가지로, YC7은 HA-Ty단독(674.6)에 비해 최소 팽창비(206.6)를 보였다. 결과는 대부분 예상대로였으며, DYC7은 가장 높은 G’값을 나타냈지만 YC7 보다 약간 높은 팽윤 비율을 나타낸 것으로 확인되었다. 이는 DYC7의 부분 불용성으로 인해 발생된 결과로 예측되는 것으로, 그 일부가 가교에 관여하지 않음을 의미한다. 용해되지 않은 펩타이드는 G’의 증가를 초래할 수 있는 침전물로 남을 수 있다. 분해 시험에서도 유사한 패턴을 확인하였다(도 10 참조). 대부분의 HA-Ty 하이드로젤이 24시간까지 용해되는 동안, 타이로신계 펩타이드로 가교 결합된 하이드로젤의 분해가 지연되는 결과를 보였다(도 11 참조). 팽창 특성과 함께 YC7과 DYC7은 HA-Ty하이드로젤의 조절에 가장 적합한 것으로 확인되었다.

이중에서 YC7을 사용하여 다음 추가 실험을 수행하였다.

3) 하이드로젤의 전자 주사 현미경 분석

하이드로젤의 전자 주사 현미경 분석은 동결건조 시킨 하이드로젤 샘플을 가지고 진행했다. 가교되지 않은 히알루론산은 입자가 독립적으로 존재하는데 반해서 가교된 히알루론산 하이드로젤은 입자들이 뭉쳐져 있는 결과를 확인할 수 있다. 티로신 펩타이드 (YYACAYY)는 0.1 mM 농도로 하이드로젤에 첨가되었다. 도 12는 가교시키지 않은 생체 고분자(a), 가교시킨 생체 고분자(b), 타이로신이 풍분한 펩타이드를 첨가하여 가교시킨 생체 고분자(c)의 SEM 사진이다. 도 12에서 보듯이, 타이로신계 펩타이드가 함께 가교된 경우 입자의 형태를 고루 갖추면서 뭉쳐 있는 결과를 확인할 수 있었다.

4) 하이드로젤의 세포 독성 여부

하이드로젤의 세포 독성 여부 실험을 위해서 사람의 피부섬유아세포를 이용했다. 섬유아세포는 24 well dish에 4x104/well농도로 키웠고 하루 뒤 2시간 혈청 기아 상태를 만들었다. 그 뒤 리보플라빈 (0.1 μM~10 mM), YC7 (0.1 μM~10 mM) 농도로 처리되어 37도에서 24시간 동안 배양시켰다. 최종적으로 MTT assay를 통해서 세포 독성 여부를 판단하였다. 하이드로젤에 따른 피부섬유아세포 증식 실험은 12 well dish에 1x105/well농도로 키워서 진행했다. 자라난 세포를 피펫 팁으로 길게 긁어서 상처와 유사한 환경을 만들고 12 transwell에 하이드로젤을 넣어서 transwell을 세포가 자란 dish에 설치했다. 긁은 자리에 세포가 채워지는 정도로 증식 효과를 확인하고 결과를 도 13 및 14에 나타내었다. 도 13 및 도 14에서 보듯이, 리보플라빈과 YC7은 농도에 관계없이 세포독성이 없었으며, 하이드로젤이 대조군과 비교했을 때 세포 증식이 증가하는 결과를 확인하였다.

5) 쥐에서의 창상모델을 이용하여 하이드로젤의 상처 치료 효과

쥐에서의 창상모델을 이용하여 하이드로젤의 상처 치료 효과를 확인했다. 쥐는 생후 5주 wild type Balb/c 쥐를 이용했고, 창상모델은 생검용 구멍 뚫는 도구를 사용해서 만들었다. 대조군으로는 3M사의 Tegaderm이라는 제품을 사용했고, 상처부위를 덮은 하이드로젤 역시 Tegaderm으로 덧덮어줬다. 사진으로 창상의 아무는 정도와 상처 면적으로 HA/Y가 상처 치료 효과가 더 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다. 확인 결과를 도 15 및 16에 나타내었다. 이는 HA/Y의 티로신 펩타이드로 인해 하이드로젤의 팽윤과 분해가 느려져서 상처부위에 더 오래 머무를 수 있기 때문에 치료 효과가 더 뛰어난 것으로 추정된다.

또한, 쥐 창상모델을 이용한 상처 치료 효과는 더 나아가서 메이슨 트리크롬 염색 분석을 이용하여 조직의 회복 상태를 확인했다. 각각의 시일마다 조직을 채취하여 동물용 고정액에 조직을 24시간 동안 고정시킨 후, PBS로 치환시켜서 보관했다. 그 후 조직 절단을 해서 절단면을 만들고 메이슨 트리크롬 염색을 해서 분석을 하고 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 보듯이, 타이로신계 펩타이드가 포함된 하이드로젤이 상처난 조직의 회복도를 보다 양호한 결과를 확인하였다.

6) 기능성 첨가물을 이용한 지지체 효능 확인

기능성 첨가물 GHK-Cu (상처치료 펩타이드)를 함께 넣어서 만든 하이드로젤이 기능성 (상처 치료) 증진 효과가 있는지 세포 실험으로 간단하게 확인했다. 사람의 피부섬유아세포를 활용했으며 증식 실험을 12 well dish에 1x105/well농도로 키워서 진행했다. 도 18의 막대 그래프 실험 결과는 MTT assay를 활용한 결과이며 도 19의 세포 이미지는 Scratch assay를 활용한 결과이다.

도 18 및 19를 참조하면, 제조된 하이드로젤의 기능성 지지체로서의 역할을 확인할 수 있었으며, 일례로 GHK-Cu가 포함되지 않은 하이드로젤 만으로도 대조군에 비해 4배가 넘는 증식 효과를 확인하였을 뿐 아니라, GHK-Cu가 포함된 경우 6배가 넘는 증식 효과를 확인할 수 있었다. 이로써 GHK-Cu를 포함시킨 하이드로젤이 상처치료 기능을 지닌 바이오 소재로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

참고로, 종래 시도되던 티로시나아제 효소 가교 반응의 경우 페놀기를 퀴논기로 바꿔서 다이타이로신 결합 구조를 만드는 기작으로 광가교보다 반응 단계가 늘어나기 때문에 이론상으로 티로시나아제를 사용했을 경우 물성이 비슷하거나 약간 떨어지는 하이드로젤이 형성되게 된다.

결론적으로, 본 발명의 리보플라빈과 자외선에 의해 가교된 히알루론산 하이드로젤은 GHK-Cu 뿐만 아니라 다양한 기능성 물질들의 지지체 역할을 해주는 다방면의 바이오 소재로 활용될 수 있을 것이다. 결과 제공된 생체친화형 하이드로젤은 기초적으로는 조직공학, 그리고 나아가서 수술 및 임상과 관련된 의약분야에 응용 가능하며, 수분 공급, 상처 치료, 오염 물질 차단, 인공 연골과 같은 구조체 형성, 유착 방지 등 다양한 생물 의약적 적용이 가능하다.

Claims

생체 고분자에 아민기 함유 페놀 화합물을 커플링 결합시켜 아미드 결합된 생체 고분자를 제공하는 단계;
상기 아미드 결합된 생체 고분자에 모노페놀 화합물과 YY-X-YY(여기서 Y는 타이로신 잔기이고, X는 20종의 아미노산 잔기이다)로 나타내는 타이로신계 펩타이드를 혼합하여 혼합 용액을 형성하는 단계; 및
상기 혼합 용액에 광중합 개시제를 혼합하고 광 경화시켜 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 다이타이로신 결합 구조를 형성하는 단계를 포함하며,
상기 아미드 결합된 생체 고분자와 상기 모노페놀 화합물, 상기 타이로신계 펩타이드 그리고 상기 광중합 개시제의 함량은 중량비로 90 내지 95 : 2 내지 6 : 0.5 내지 5 : 0.5 내지 5인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
제1 항에 있어서,
상기 다이타이로신 결합 구조는 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 상기 아미드 결합된 생체 고분자가 2종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되,
상기 2종 이상의 다이타이로신 링커는 상기 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 구조를 갖는 것인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
제1 항에 있어서,
상기 타이로신계 펩타이드는 YYACAYY, YYACAYY 이량체(Di-YYACAYY), YYAHAYY, YYAYY 및 YYCYY (여기서 Y는 타이로신 잔기이고, A는 알라닌(Ala), C는 시스테인(Cys), H는 (His)이다)로 이루어진 군 중에서 공급되는 1 이상의 펩타이드인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
제1 항에 있어서,
상기 아민기 함유 페놀 화합물은 티라민, 메타 티라민 및 도파민으로 이루어지는 군 중에서 선택된 1종 이상이고, 상기 생체 고분자 100 단위당 5 중량% 이상 포함되는 것인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
제1 항에 있어서,
상기 생체 고분자는 글리코겐, 셀룰로오스, 헤파린, 알지네이트, 히알루론산 및 키토산을 비롯한 다당류 및 폴리(D,L-락티드-Co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(σ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 및 폴리(β-하이드록시발레레이트)를 비롯한 생분해성 고분자 중 선택되는 어느 1종인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
제1 항에 있어서,
상기 모노페놀 화합물은 페놀, 파라크레졸 및 파라이소옥틸페놀로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
삭제
제1 항에 있어서,
상기 광중합 개시제는 리보플라빈, 페로센 및 안트라퀴논으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 생체친화형 하이드로젤 제조방법.
양 말단에 아민기 함유 페놀 화합물이 각각 커플링 결합된 생체 고분자이고, 상기 생체 고분자가 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나 혹은 상기 생체 고분자가 2종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되되,
상기 2종 이상의 다이타이로신 링커는 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것인 생체친화형 하이드로젤.
제9 항에 있어서,
상기 다이타이로신 링커로 직접 연결된 구조는 하기 식 1으로 나타내는 구조이고, 상기 2종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조는 하기 식 2로 나타내는 구조인 생체친화형 하이드로젤.
[식 1]

[식 2]
일 말단이 아민기 함유 페놀 화합물이 커플링된 생체 고분자이고, 타 말단이 상기 생체 고분자에 도입된 말단 관능기와 다이타이로신 결합으로 연결된 구조를 제공하는 아민기 함유 페놀 화합물이되, 상기 생체 고분자는 다이타이로신 링커로 직접 연결된 결합 구조를 갖거나, 혹은 1종 이상의 다이타이로신 링커로 연결되고 상기 1종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조를 갖는 것인 생체친화형 하이드로젤.
제11 항에 있어서,
상기 다이타이로신 링커로 직접 연결된 구조는 하기 식 3으로 나타내는 구조이고, 상기 1종 이상의 다이타이로신 링커가 타이로신계 펩타이드를 매개로 하여 연결된 결합 구조는 하기 식 4로 나타내는 구조인 생체친화형 하이드로젤.
[식 3]

[식 4]
제9 항 또는 제11 항에 있어서,
상기 하이드로젤은 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도 (rad/s) 규격으로 측정한 저장 탄성률이 100 내지 300 Pa이고, 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도(rad/s) 규격으로 측정한 복소점도가 0 내지 250Pa.s이며, 1 Hz 진동 주파수, 10~100 초당 각속도(rad/s) 규격으로 측정한 손실 탄성률이 0 내지 100Pa를 갖는 다이타이로신 가교결합 구조체인 생체친화형 하이드로젤.
제9 항 또는 제11 항에 있어서,
상기 하이드로젤은 창상 피복 혹은 조직유착 방지용 기능성 지지체인 것인 생체친화형 하이드로젤.
제9 항 또는 제11 항에 있어서,
상기 하이드로젤은 GHK-Cu, 세포성장인자, 항산화제를 비롯한 상처치료 인자를 포함하는 것인 생체친화형 하이드로젤.