KR101444877B1

KR101444877B1 - 감마폴리글루탐산으로 구성된 현장 가교 수화겔 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR101444877B1
Application number: KR1020110147558A
Authority: KR
Inventors: 고영주; 김혜경; 김선우; 여규동
Original assignee: 주식회사 삼양바이오팜
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2014-10-01
Also published as: WO2013100715A1; US20140336276A1; EP2797984B1; KR20130078549A; EP2797984A1; EP2797984A4; ES2610302T3; US9254348B2

Abstract

본 발명은 외과수술 시 혈액이나 공기의 누출을 억제하는 실란트, 조직 접착제, 유착방지제 및 약물 전달 담체 등으로 사용 가능한 생분해성, 생체적합성 수화겔, 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수화겔은 외과 수술 시, 수용액 상태에서 일정 기간 동안 활성을 유지 하기 때문에 용액을 제조하고 바로 사용하지 않아도 된다. 상처 부위에서 바로 겔을 형성하면서 생체 조직에의 접착력이 우수하여 혈액이나 공기의 누출을 억제하고, 생체 내에서 분해되어 흡수 혹은 배출되고, 생체에 대한 독성이 없다. 겔화 시간에 대해서도 원하는 정도로 조정 및 제어가 가능하다. 따라서 상기 수화겔을 생체 조직 접착 등과 같은 다양한 용도로 매우 바람직하게 사용될 수 있다.

Description

감마폴리글루탐산으로 구성된 현장 가교 수화겔 및 그의 제조 방법 {In situ crosslinking hydrogel comprising γ-polyglutamic acid and method for producing the same}

본 발명은 외과수술 시 혈액이나 공기의 누출을 억제하는 실란트, 조직 접착제, 유착방지제 및 약물 전달 담체 등으로 사용 가능한 생분해성, 생체적합성 수화겔, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

의료용 특히 외과 수술용 실란트 및 접착제로서 피브린 글루와 단백질계 접착제가 주로 사용되어져 왔다. 그러나 피브린글루는 접착력이 상당히 낮아 수술 부위에서 쉽게 떨어지는 단점이 있고, 혈액 제재이므로 바이러스 감염 등 질병 전이의 우려가 있다. 또한 단백질계 접착제로서는 알부민(Bovine serum albumin)과 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용한 제품 (USP 5,385,606, 상품명:bioglue?)과 젤라틴, 레졸시놀(resorcinol) 및 포름알데히드를 혼합하여 사용하는 제품 (상품명: GRF glue?)이 사용되고 있으나, 모두 동물 유래 단백질의 사용으로 인한 감염 우려 및 가교제로 쓰이는 알데히드의 독성 문제로 생체 적합성이 떨어지는 단점이 있다.

최근에 이러한 혈액 제재나 단백질 제재의 대용으로 합성 고분자 (주로 Polyethylene glycol (PEG))나 탄수화물 (주로 덱스트란)을 사용하여 in situ forming 수화겔을 만드는 연구가 활발하고, 이중 일부가 제품으로 출시된 상태이다. 가교 반응의 종류에 따라 라디칼 중합반응, 친핵체 (nucleophile)와 친전자체 (electropile)간의 치환 반응으로 구분할 수 있다. 치환 반응은 다시 결합의 종류에 따라 이민 (imine) 결합, 아마이드 (amide) 결합으로 구분될 수 있다. 라디칼 중합의 예로서 FocalSeal? (Genzyme)이라는 상품명으로 판매되고 있는 광활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)는 피브린 실란트보다 높은 강도를 나타낸다고 보고되고 있지만, 가교반응이 일어나기 위해서는 광원과 광개시제가 필요하고, 혈액이 광원의 투과를 막아 중합반응을 저해하는 등의 문제와 사용상의 불편함이 있다. 이민 결합은 알데히드기와 아민기와의 반응으로 생성되는 것으로, 친전자체로서는 알데히드화 덱스트란을 사용하고, 친핵체로서 키토산 혹은 aminated 폴리비닐알코올 (US2005/00028930), multi amino PEG (US2006/0078536, Biomaterials 29 (2008) 4584-4591), 미생물 배양을 통해 합성한 ε-폴리라이신 (WO2006/080523)의 사용이 보고되었다. 하지만 알데히드화 덱스트란의 경우 알데히드기의 독성 및 쉽게 산화되어 반응성을 잃는 안정성 부족의 문제가 여전히 남아있다. 아마이드 결합은 카르복시기를 숙신이미드 에스테르(succinimidyl ester)기로 활성화시켜 친핵체인 아민기 등과 반응시키는 방법이 많이 사용되고 있다. 주로 activated multi carboxylate PEG를 친전자체로 사용하고, 친핵체로는 천연 단백질인 콜라겐 (US5,162,430)과 혈청 알부민(US RE38,827)을 사용한 예가 있으나, 전술한 바와 같이 이들은 질병의 전이의 우려가 여전히 남아있다. 또한, 키토산 혹은 메톡시 PEG가 콘쥬게이션된 키토산과의 가교반응 (US6,602,952)에 의한 수화젤이 개시되어 있으나, 이 발명에서 겔화 시간이 2 시간 정도로 현장 가교 수화겔로서는 적합하지 않다. 합성 친핵체로는 multiamino-, 혹은 multi mercapto- PEG를 사용한 예 (US5,874,500, 제품명 CoSeal?)와 trilysine을 사용한 예 (US6,566,406, 상품명 DuraSeal?)이 개발되어 상품화되어 있다. 이상과 같이 합성고분자로서 생체적합성이 우수한 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 예가 많이 보고되고 있다.

γ-폴리글루탐산은 글루탐산의 γ-카르복실기와 α-아미노기가 아마이드 결합된 γ-폴리펩타이드로 콩 발효식품미생물인 Bacillus subtilis에 의해서 생합성되는 수용성, 음이온성, 생분해성, 생체적합성 고분자이다. 이러한 γ-폴리글루탐산을 가교반응시켜 흡수제나 의료용 수화겔로 사용하고자 하는 시도가 이루어지고 있으며, 그 대표적인 예가 다음과 같다.

이온 결합에 의한 방법으로 일본특허 공개공보 1999-276572에는 γ-폴리글루탐산염의 카르복시 음이온에 키토산 등의 제 4급 아민염이 수소결합하여 제조된 폴리감마글루탐산염 복합체를 수술용 봉합사, 창상 피복재, 유착 방지재, 지혈재 등으로 이용한 예를 개시하고 있다.

가교시약을 이용한 화학결합으로 가교시키는 경우로, 일본특허 공개공보 1999-343339에는 γ-폴리글루탐산에 디에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (Diethylenegylcol diglycidyl ether)와 같은 폴리 에폭시 화합물을 가교제로 가하여 가교반응한 것이 개시되어 있고, 이를 유착방지제로 적용한 것이 WO 2007/132785에 공개되어 있다. 하지만 반응조건이 40℃*48시간 혹은, 90℃*30분으로 의료현장에서 겔화 (in situ gelation)시키는 용도로는 적용하기에 불가능하다.

또한 γ-폴리글루탐산의 카르복시기와 친핵체와의 반응을 촉진시키기위 위한 축합제로서 수용성 카르보디이미드 (water soluble carbodiimide)를 사용한 예가 보고되어 있다. 이중 가교화합물로서 생분해성을 가진 푸룩토오스, 라이신, 키토산 등을 이용하고, 수용성 카르보디이미드로 3-(3-dimethyl aminopropyl)-1-ethyl carbodiimide (EDC)를 사용한 예가 일본특허 공개공보 2002-128899에 개시되어 있으나, 이 반응 조건도 상온에서 24시간으로 매우 길다. 그리고 J. Appl. Polym. Sci. 65, pp1889-1896, 1997에 γ-폴리글루탐산과 EDC와의 반응을 통해 γ-PGA-EDC 침전을 만들고, 1,3-propane diamine을 가교제로 가하여 수화젤을 제조하는 방법을 제공하고 있다. 그러나 이 조건에서도 혼합 후 1일 동안 standing하는 것으로 기술되어 있고, 수율 또한 10% 이하로 매우 낮다.

일본특허 공개공보 1997-103479와 Biomaterial 19 (1998) 1869-1876에 succinimide화 α-폴리글루탐산을 가교제로 사용하여 젤라틴과 반응 시, 30초 이내에 겔화되는 결과가 개시되어 있으나, 이는 40 ℃ 내외의 일정 온도 이하에서 자연적으로 겔화가 되는 젤라틴의 겔화반응을 도와주는 역할을 하였을 뿐, γ-폴리글루탐산 자체가 수화겔의 주성분이 되는 것은 아니었다.

이에 겔화 시간이 짧고, 생체 적합성 및 생분해성을 나타내면서도, 접착력 및 파열 강도가 우수하여, 조직 접착 등에 바람직하게 적용 가능한 수화겔이 계속적으로 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 기술적 배경하에서, 수용액 상에서의 활성이 보다 향상된 γ-폴리글루탐산 유도체, 및 의료용 조직 실란트로서 필요한 조직 접착력을 가지며, 생분해성과 함께 생체적합성을 가지는 상기 γ-폴리글루탐산 유도체를 포함하는 수화겔을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 γ-폴리글루탐산 유도체 및 상기 수화겔을 제조하는 방법, 상기 수화겔 제조용 키트, 및 상기 수화겔의 형성을 가능케 하는 성분을 포함하는 조직 접착제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

수화겔의 형성 조건을 만족시키며 각 물질의 수용액 상태에서 일정시간 동안 활성을 유지시키기 위해서, 본 발명자들이 연구한 결과 미생물의 발효에 의한 대량 생산이 가능한 생합성 폴리아미노산이면서 카르복실기를 측쇄에 보유하고, 상기 카르복시기 중 적어도 일부가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 생체 재료로서 널리 사용되면서 아미노기 또는 티올기를 측쇄에 보유하고 있는 폴리에틸렌 글리콜계 고분자와의 결합 가교 반응을 이용함으로써 의료용 조직 실란트로서 필요한 조직 접착력을 가지며, 생분해성과 함께 생체적합성을 가지는 수화겔을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 특히 상기 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체는 기존의 숙신이미드기로 활성화된 γ-폴리글루탐산의 약점인 수용액 상에서의 활성 저하를 향상시키기 위하여 γ-폴리글루탐산에 알킬기를 도입한 것을 특징으로 한다.

이에, 본 발명의 일 구현예는 적어도 일부의 카르복시기에 알킬기 및 숙신이미드가 도입되어 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 γ-폴리글루탐산의 적어도 일부의 카르복시기를 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민과 반응시켜 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는 제1단계; 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민의 히드록시기를, 글루타르산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 무수물, 또는 1-할로 발레르산, 1-할로 프로피온산 및 1-할로 메틸카본산으로 이루어진 군에서 선택된 1-할로 알칸산(1-halo alkanoic acid)과 반응시켜 알킬기가 도입된 카르복시 말단을 형성하는 제2단계; 및 상기 형성된 카르복시 말단을 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 반응시켜 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성하는 제3단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 본 발명의 일 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체와 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자가 가교 결합된 가교체를 포함하는, 수화겔을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 일 구현예는, γ-폴리글루탐산의 적어도 일부의 카르복시기를 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민과 반응시켜 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는 제1단계; 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민의 히드록시기를, 글루타르산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 무수물, 또는 1-할로 발레르산, 1-할로 프로피온산 및 1-할로 메틸카본산으로 이루어진 군에서 선택된 1-할로 알칸산(1-halo alkanoic acid)과 반응시켜 알킬기가 도입된 카르복시 말단을 형성하는 제2단계; 상기 형성된 카르복시 말단을 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 반응시켜 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성하는 제3단계; 및 상기 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 가교 반응시키는 제4단계를 포함하는 수화겔의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 또 다른 일 구현예는, 상기 본 발명의 일 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 포함하는, 수화겔 제조용 키트, 및 조직 접착제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체, 수화겔, 이들의 제조 방법 및 조직 접착제 등에 대해 상세히 설명하기로 한다.

접착력이 있는 수화젤이 생성되기 위해서는 적어도 2개 이상의 작용기를 가진 상호 반응하는 고분자 사슬간에 결합으로 가교가 일어나고, 고분자 중 적어도 하나는 가교반응과 동시에 조직 표면과도 공유결합을 형성하는 것이 바람직하다.

화학적 공유 결합은 친전자기 (electrophile)와 친핵기 (necleophile)간의 반응에 의해 형성되는데, 친전자성 관능기는 생체조직의 콜라겐 성분에 있는 아미노기 (-NH₂), 티올기(-SH), 혹은 수산화기 (-OH)와 반응하면서 조직에 접착된다. 이러한 친전자성 관능기는 알데히드기와 활성화된 에스테르기가 이용될 수 있는데, 가령 아미노기와 반응하는 경우 각각 이민 결합과 아마이드 결합을 통해 가교 반응과 동시에 조직 접착이 일어난다. γ-폴리글루탐산의 적어도 일부를 특정한 화합물과 반응시켜 숙신이미드 에스테르기 등으로 전환시켜 활성화시키면, 이렇게 활성화된 γ-폴리글루탐산이 아민기, 티올기 또는 히드록시기 등의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자와 상온에서도 빠른 겔화(가교 반응)를 일으켜 수화겔을 형성할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 상기 수화겔은 의료 현장에서 바로 겔 상태로서 형성되어 조직 접착 등에 적용되기가 매우 적합하다. 나아가 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체는 기존의 숙신이미드기로 활성화된 γ-폴리글루탐산의 약점인 수용액 상에서의 활성 저하를 향상시키기 위하여 γ-폴리글루탐산에 알킬기를 도입한 것을 특징으로 한다.

이와 같이 알킬기가 도입된 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체는 아민기, 티올기, 또는 히드록시기 등의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자와 상온에서 빠른 겔화를 일으켜 수화겔을 형성할 수 있다. 또한 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체는 알킬기를 도입함으로서 용해 직후 바로 사용하지 않아도 수용액 상에서 향상된 안정성을 갖게 되어, 용해 후 2 시간 이상 초기 수준의 겔화 시간과 파열 강도 및 접착 강도를 유지한다. 이러한 특성을 갖는 수화겔은 우수한 접착력으로 조직에 접착될 수 있어 생체 조직의 접착에 매우 바람직하게 적용될 수 있으므로 의료용 조직 실란트 (sealant) 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.

이러한 일 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체 및 수화겔에 대해 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

상기 “수화겔”이라 함은 팽윤이 가능한 고분자 매트릭스를 의미하는 것으로 정의될 수 있으며, 공유 결합 또는 비공유 결합을 포함한 가교 구조를 가질 수 있다. 또, 이러한 수화겔은 상기 가교 구조로 이루어진 3차원 네트워크 구조를 포함할 수 있으며, 물을 흡수하여 탄성겔을 형성할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 수화겔은 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자가 가교 결합된 가교체를 포함하며, 상기 γ-폴리글루탐산 유도체는 적어도 일부의 카르복시기에 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민이 링커로서 도입되어 상기 도입된 링커의 히드록시 말단과 사이클릭 알킬 무수물(cyclic alkyl anhydride)을 반응시켜 말단에 카르복실기를 생성시키고, 이를 숙신이미드로 활성화시켜, 결과적으로 알킬기를 포함하는 숙신이미드 에스테르 유도체가 도입된 것일 수 있다.

상기 링커로서 사용되는 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민은 예컨대 아미노메탄올(Aminomethanol), 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol), 1-아미노-3-프로판올(1-amino-3-propanol), 1-아미노-4-부탄올(1-amino-4-butanol), 1-아미노-5-펜탄올(1-amino-5-pentanol) 또는 모노에탄올아민(MEA 또는 1-amino-2-ethanol) 일 수 있으며, 바람직하게는 모노에탄올아민일 수 있다.

상기 숙신이미드 에스테르 유도체는, 도입된 알킬기의 종류에 따라, 숙신이미딜 발레르산염(Succinimidyl Valerate, SVA:-CH₂CH₂CH₂CH₂-CO-NHS), 숙신이미딜 글루타르산염(Succinimidyl Glutarate, SG: :-CO-CH₂CH₂CH₂-CO-NHS), 숙신이미딜 프로피온산염(Succinimdyl Propionate, SPA:-CH₂CH₂-CO-NHS), 숙신이미딜 숙신산염(Succinimidyl Succinate, SS:-CO-CH₂CH₂-CO-NHS), 및 숙신이미딜 메틸카본산염(Succinimidyl Carboxymethylated, SCM:-CH₂-CO-NHS) 등이 될 수 있다.

바람직하게는 상기 γ-폴리글루탐산 유도체는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

상기 화학식 1에서,

l, m 및 n의 총 합은 390 내지 15,500의 정수이고,

상기 l, m 및 n의 비율은 l : m : n = 0 내지 0.5 : 0.2 내지 0.5 : 0.2 내지 0.8이며,

L은 링커이고, M은 각각 독립적으로 H, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속이고, R은 CH₂이며,

b는 0 또는 1이고, c는 1 내지 5의 정수이다.

상기 링커는 바람직하게는 -HN-(R)a-O-이고, 이때 상기 링커에 포함된 R은 CH2 이고, a는 1 내지 5의 정수이다.

또한 상기 화학식 1의 -(CO)b-(R)c-CO- 는 바람직하게는 -CH₂CH₂CH₂CH₂-CO-, -CO-CH₂CH₂CH₂-CO-, -CH₂CH₂-CO-, -CO-CH₂CH₂-CO- 또는 -CH₂-CO-일 수 있다.

상기 수화겔은 가교반응이 생리조건에 해당하는 pH 7.2 ~ 11.0, 37 ℃의 수용액 중에서 빠르게 겔화가 일어날 수 있고, 살아있는 동물이나 인체의 장기 혹은 조직 위에서 바로 현장 가교(in situ gel formation)가 일어날 수 있다. 상기와 같은 생리조건 하에서도 겔이 될 때까지의 가교 반응 시간이 10 분 이내이고, 더욱 바람직하게는 2 분 이내이고, 더욱 바람직하게는 30 초 이내로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 수화겔은 의료 현장에서 바로 겔 상태로 형성되고 생체 조직에 적용됨으로써, 조직 접착에 효과적으로 사용될 수 있다.

상기 γ-폴리글루탐산 유도체의 카르복시기 중 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 에스테르기의 몰비는 바람직하게는 0.10 내지 0.99, 보다 바람직하게는 0.30 내지 0.80, 가장 바람직하게는 0.5 내지 0.7으로 될 수 있다. 이러한 몰비로 활성화시킴에 따라, 수화겔의 겔화 시간을 단축시키고 생체 조직에 대한 접착력 및 강도를 최적화할 수 있다. 활성화 정도가 높을수록, 가교반응에 의해 생성된 수화겔의 3차원 망상구조를 이루는 가교점이 많아져 수화겔의 압축강도나 인장강도와 같은 물리적 강도도 증가하게 되며, 조직 접착력도 증가하게 된다.

활성화되기 전의 γ-폴리글루탐산은 하기 일반식 1로 나타낼 수 있다.

<일반식 1>

상기에서,

n은 390 에서 15,500, 바람직하게는 3,900에서 7,800 이며,

M은 H, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속(예를 들어, Na, K, Ca 또는 Mg, 바람직하게는 Na)이다.

상기 γ-폴리글루탐산의 중량평균 분자량은 바람직하게는 50,000 내지 2,000,000 달톤, 보다 바람직하게는 50,000 내지 1,000,000 달톤일 수 있다.

분자량이 너무 높으면 합성한 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 용해도가 떨어져 용해되는데 시간이 많이 걸리므로 바람직하지 않다.

상기 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 가교체를 형성하는 고분자인 폴리에틸렌글리콜계 고분자는, 바람직하게는 아민기 또는 티올기 등이 말단에 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 2가 이상, 바람직하게는 2 내지 12가의 다가 알코올의 각 히드록시기에 폴리에틸렌글리콜 반복단위가 결합되고, 그 말단에 아민기, 티올기 또는 히드록시기가 결합된 구조를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 화학식 2로 표시될 수 있다.

상기 화학식 2에서, I는 2 내지 12가의 다가 알코올에서 유래한 라디칼로서, 상기 다가 알코올의 각 히드록시기에서 수소가 -(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂X로 치환되어 이와 에테르 결합하고 있는 형태의 라디칼을 나타내며 X는 아민기, 티올기 또는 히드록시기를 나타내며, n은 19 내지 170이며, m은 2 내지 12의 정수로서, 상기 I가 유래한 다가 알코올의 히드록시기수와 같다.

상기 화학식 2에서, I의 구체적인 예로는 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로판디올(propandiol), 부탄디올(butandiol), 펜탄디올(pentandiol), 헥산디올(hexandiol) 등의 디올; 또는 글리세롤(glycerol), 에리쓰리톨(erythritol), 쓰레이톨(threitol), 펜타에리쓰리톨(pentaerythritol), 자일리톨(xy1itol), 아도니톨(adonitol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol) 팔라티노즈(palatinose), 말토즈 모노하이드레이트(maltose monohydrate) 또는 말티톨(maltitol) 등의 이당류나, D-라피노즈 펜타하이드레이트(D-raffinose pentahydrate) 등의 삼당류에서 선택되는 3 내지 12가의 폴리올에서 유래한 라디칼을 들 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 I는 4 내지 12가의 다가 알코올에서 유래한 라디칼로 될 수 있다.

상기 화학식 2의 범주에 속하는 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 예로는, 펜타에리트리톨이나 솔비톨에서 유래한 라디칼에, 말단 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 반복 단위가 결합된 형태의 고분자, 예를 들어, 하기 화학식 3 또는 4의 고분자를 들 수 있다.

상기 화학식 3 및 4에서, X 및 n은 상기 화학식 2에서 정의한 바와 같다.

이러한 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 상기 아민기, 티올기 또는 히드록시기와 같은 친핵성 작용기를 다수 포함함에 따라, 상기 화학식 1의 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 아마이드 결합, 티오아마이드 결합 또는 에스테르 결합을 형성할 수 있으며, 이로부터 가교 구조를 형성하여 3차원 네트워크 구조를 갖는 가교체 및 수화겔을 이룰 수 있다. 특히, 이러한 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 상기 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 빠른 가교 반응을 일으켜 짧은 겔화 시간을 갖는 수화겔의 제공을 가능케 한다.

또한, 이러한 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 합성 고분자 중에서 대표적인 생체 적합성 고분자로서, 이의 가교체를 포함하는 수화겔이 조직 접착 등에 적용되기에 적합한 생체 적합성 등을 나타내게 할 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜계 고분자는 다가 알코올에 에틸렌옥사이드를 부가 중합시키고 친핵성 작용기를 도입하는 등의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

그리고, 상기 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 중량평균 분자량은 5,000 내지 30,000달톤, 구체적으로 10,000 내지 20,000달톤으로 될 수 있다. 만일, 중량평균 분자량이 지나치게 작아지면, 가교체 및 수화겔 형성을 위한 겔화 시간이 길어지거나, 겔화 반응이 잘 일어나지 않을 수 있고, 반대로, 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 분자량이 지나치게 커지면, 가교체 및 수화겔의 생분해성이 저하될 수 있다.

또한, 상기 일 구현예의 수화겔에서, γ-폴리글루탐산 유도체의 활성화된 카르복실기(예를 들어, 숙신이미드 에스테르기)에 대하여, 상기 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 친핵성 작용기는 0.1내지 2.0, 구체적으로 0.2 내지 1.0, 보다 구체적으로 0.4 내지 0.6의 몰비를 가질 수 있다. 이러한 몰비를 충족함에 따라, 상기 수화겔의 생체 조직에 대한 접착력 및 파열 강도가 우수하게 될 수 있으며, 수화겔의 가교도 또한 최적화할 수 있다. 다만, 상기 몰비가 지나치게 낮아지면, 가교점이 적어 수화겔의 강도가 약해질 수 있다.

한편, 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상술한 γ-폴리글루탐산 유도체, 및 상기 γ-폴리글루탐산 유도체와 상기 폴리에틸렌글리콜계 고분자가 가교결합된 수화겔의 제조 방법이 제공된다.

바람직하게는 상기 제조 방법은 γ-폴리글루탐산의 적어도 일부의 카르복시기를 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민과 반응시켜 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는 제1단계; 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민의 히드록시기를, 글루타르산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 무수물, 또는 1-할로 발레르산, 1-할로 프로피온산 및 1-할로 메틸카본산으로 이루어진 군에서 선택된 1-할로 알칸산(1-halo alkanoic acid)과 반응시켜 알킬기가 도입된 카르복시 말단을 형성하는 제2단계; 및 상기 형성된 카르복시 말단을 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 반응시켜 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성하는 제3단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성하는 제1~3단계를 하기 반응식 1을 참조하여 설명한다. 하기 반응식 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체를 제조하는 방법의 일 예로서, 링커로서 모노에탄올아민(MEA)을 사용하고, 숙신산의 무수물을 이용하여 알킬기가 도입된 카르복시 말단을 형성한 후, NHS를 이용하여 활성화하는 과정을 나타낸 것이다.

[반응식 1]

상기 1 내지 3단계의 모든 반응은 0 내지 150 ℃, 구체적으로는 20 내지 70 ℃에서 진행하는 것이 바람직하며, 또한 반응시간 0.5 ~ 35 시간, 바람직하게는 5 ~ 24 시간의 조건하에서 진행시킨다.

상기 1 단계는 γ-폴리글루탐산의 카르복시기에 링커를 도입하는 단계로서, γ-폴리글루탐산의 적어도 일부의 카르복시기를 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민과 반응시켜 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하여 링커를 도입할 수 있다.

상기 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민은 예컨대 Aminomethanol, 1-amino-2-propanol, 1-amino-3-propanol, 1-amino-4-butanol, 1-amino-5-pentanol 또는 모노에탄올아민(MEA or 1-amino-2-ethanol) 일 수 있으며, 바람직하게는 모노에탄올아민일 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 알칸올아민은 DCC와 같은 카르보디이미드계 화합물 및 N-하이드록시숙신이미드(또는 N-하이드록시술포숙신이미드)의 존재 하에 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 카르보디이미드계 화합물 및 N-하이드록시숙신이미드(또는 N-하이드록시술포숙신이미드) 및 알칸올아민을 각각 활성화 전의 γ-폴리글루탐산에 포함된 카르복시기의 몰 유닛에 대해 0.1 내지 2, 보다 바람직하게는 1 내지 2의 몰비로 반응시킬 수 있다.

바람직하게는 상기 1단계는 DMSO(Dimethyl sulfoxide), DMF(Dimethyl formamide) 및 포름아미드(Formamide) 등과 같은 비양자성 용매 내에서 이루어질 수 있다. 양자성 용매는 활성화된 NHS-에스테르와 반응할 수 있어 바람직하지 않고, 기타 일반적인 유기용매에는 상기 반응물질이 불용성이므로 바람직하지 않다.

상기 2단계는 알킬기가 도입된 카르복시기를 도입하는 단계로서, 포름아미드(formamide), DMF(Dimethyl formamide), DMSO(Dimethyl sulfoxide)와 같은 비양자성 유기 용매 내에서 상기 형성된 γ-폴리글루탐산-알칸올아민의 히드록시기를 글루타르산, 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 무수물과 반응시켜 카르복시 말단을 형성할 수 있고, 1-할로 발레르산, 1-할로 프로피온산, 및 1-할로 메틸카본산으로 이루어진 군에서 선택된 1-할로 알칸산(1-halo alkanoic acid)과 반응시켜 카르복시 말단을 형성할 수도 있다. .

바람직하게는 상기 산의 무수물 또는 1-할로 알칸산은 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는데 도입된 저급 알칸올아민의 몰 유닛에 대해 3 내지 8, 보다 바람직하게는 4 내지 6 의 몰비로 반응시킴으로써 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민에 카르복시기를 100몰%로 도입할 수 있다.

상기 3 단계는 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성하는 단계로서, 상기 2단계를 거쳐 형성된 카르복시 말단을 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 반응시켜 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 화학식 1의 γ-폴리글루탐산 유도체를 형성할 수 있다.

상기 3단계는 바람직하게는 예컨대, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 같은 카르보디이미드계 화합물의 존재 하에 진행할 수 있으며, 이로 인해 상기 반응 단계가 보다 효율적으로 진행될 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 산의 무수물 또는 1-할로 알칸산과의 반응을 통해 형성된 카르복시기의 몰 유닛에 대해, 상기 카르보디이미드계 화합물을 0.1 내지 3, 더욱 바람직하게는 1 내지 2의 몰비로 투입하고, N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드를 0.1 내지 3, 더욱 바람직하게는 1 내지 2의 몰비로 투입하여 반응시킬 수 있다.

상기 3단계를 통해 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 에스테르기의 몰비는 활성화되기 전 γ-폴리글루탐산의 카르복시기에 대해 바람직하게는 0.10 내지 0.99, 보다 바람직하게는 0.30 내지 0.80, 가장 바람직하게는 0.5 내지 0.7으로 될 수 있다. 이러한 몰비로 활성화시킴에 따라, 수화겔의 겔화 시간을 단축시키고 생체 조직에 대한 접착력 및 강도를 최적화할 수 있다.

한편, 상술한 방법으로 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체를 제조한 후에는, 이를 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자와 가교 반응시키는 단계를 더욱 수행하여 가교체 및 수화겔을 제조할 수 있다.

이에 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따라, 상기 화학식 1의 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 가교 반응시키는 단계를 포함하는 수화겔의 제조방법이 제공된다. 이러한 제조 방법에 따르면, 상온 부근의 생리 조건에서도 빠른 겔화 시간 내에 가교 구조를 형성한 수화겔을 얻을 수 있으며, 특히, 의료 현장에서도 이러한 수화겔을 즉시 적용해 조직 접착 등에 사용하기가 용이해 진다.

구체적으로 상기 수화겔의 제조방법은 상기 γ-폴리글루탐산 유도체를 제조하는 제1 내지 제3단계를 수행한 이후에, 상기 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 가교 반응시키는 제4단계를 더욱 포함할 수 있다.

4단계의 가교 반응은 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 폴리에틸렌글리콜계 고분자가 혼합된 용액 상태에서 진행할 수 있다. 예를 들어, 상기 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 용액을 포함하는 제 1액 및 상기 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 용액을 포함하는 제 2액을 혼합하여 진행할 수 있다.

이때, 제 1 액과 제 2 액을 배합하는데 있어서 균일한 겔을 얻기 위해서는 쌍방 적절한 농도의 용액으로 혼합하는 것이 바람직하다. 가교도(crosslinking density)는 고분자의 농도에 의해 조절될 수 있다. 고분자의 농도가 높을수록 가교도는 증가하지만, 폴리에틸렌글리콜계 고분자보다 분자량이 큰 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체(1000K 이상)이 녹여져 있는 1액의 경우, 일정 농도 이상에서는 용해도가 떨어지며 용액의 점성이 증가하여 균일한 혼합이 어렵다. 또한 혼합 시 침전이 일어나 균일한 수화겔을 생성하지 못한다. 고분자의 농도가 너무 낮으면 가교도가 낮아 겔의 강도가 약하거나 겔이 생성되지 못한다.

따라서 고분자의 농도 즉, 전체 용액 대비 활성화된γ-폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 총 농도는 바람직하게는 1 ~ 20 중량%, 보다 바람직하게는 5 ~ 15 중량%, 가장 바람직하게는 8 ~ 10 중량%가 될 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 활성화된γ-폴리글루탐산 유도체 및 폴리에킬렌계 고분자간의 농도비는 5~10:10~15(중량%)일 수 있다.

제 1 액과 2 액을 제조하기 위한 용매로서는 증류수 및 이외 생리식염수, 탄산수소나트륨 (NaHCO₃), 붕산, 인산 등의 완충액 등 독성이 없는 것을 이용할 수 있다.

상기 용매 중 완충액은 겔화 시간에 영향을 준다. 즉, 완충액의 종류에 따라 겔화 반응이 일어나기도 하고 일어나지 않기도 하며, 겔화 시간을 빠르게 혹은 느리게도 조절할 수 있다. 완충액은 제 1 액과 제 2 액의 고체성분의 pH와 유사한 pKa를 갖는 염을 사용하여 만들어져야 하며, 그때 버퍼링 효과가 최대가 되어 수용액 상에서 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 활성 저하를 줄이는데 도움을 줄 수 있다.

바람직하게는 상기 제 1액을 제조하기 위해 완충액으로서 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)를 사용할 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 제 2액을 제조하기 위해 인산나트륨과 탄산나트륨(sodium carbonate)의 혼합 버퍼를 사용할 수 있다. 상기 혼합 버퍼는 바람직하게는 인산나트륨과 탄산나트륨을 1:9 내지 9:1의 부피비로 혼합한 것일 수 있다.

제 1액의 완충액은 바람직하게는 0.01 몰 내지 0.3 몰, 더욱 바람직하게는 0.05 몰 내지 0.1 몰의 농도로 사용할 수 있으며, 제2액의 완충액은 바람직하게는 0.01 몰 내지 0.5 몰, 더욱 바람직하게는 0.1 몰 내지 0.3 몰의 농도로 사용할 수 있다.

제 1 액과 제 2 액의 고체성분은 방사선 멸균에 의해 용이하게 멸균을 실시할 수 있고, 바람직하게는 10 내지 50 kGy의 감마선, 더욱 바람직하게는 20 내지 30 kGy의 감마선을 조사하여 멸균을 실시한다. 이와 같은 멸균처리는 경화시간 그 밖의 수화겔의 물성에는 전혀 악영향을 미치지 않도록 조건을 설정하여 실시할 수 있다.

제 1 액과 제 2 액이 혼합되면 γ-폴리글루탐산 유도체의 활성화된 카르복시기(숙신이미드 에스테르기 등)와, 친핵성 작용기 사이에 아미드, 티오아미드 또는 에스테르 결합이 형성되고, 이것이 가교점이 되어 3차원 네트워크 구조를 갖는 수화겔이 형성될 수 있다. 그 결과, 가교 반응은 바람직하게는 0 내지 50 ℃, 보다 바람직하게는 25 내지 40 ℃에서 진행될 수 있고, 혼합으로부터 1 초 내지 200 초, 바람직하게는 2 초 내지 100 초, 보다 바람직하게는 3 초 내지 50 초 사이에 가교 반응(겔화)이 개시될 수 있다.

혼합으로부터 겔화까지의 바람직한 시간은 용도에 따라서 다소 다를 수 있기는 하지만, 바람직하게는 10분 이내, 더욱 바람직하게는 2 분 이내이고, 더욱 바람직하게는 30 초 이내로 이루어질 수 있다.

다만 겔화 시간이 2초 이하인 경우에는 주사 바늘이나 스프레이 팁이 막혀 원활한 도포가 어려울 수 있고, 또한 각 성분이 혼합되는데 시간이 충분하지 않기 때문에 불균일한 겔이 형성되거나 조직 표면과 공유 결합을 형성하기도 힘들어 접착력이 낮아질 우려가 있다. 반면, 겔화 시간이 지나치게 길어지면 도포 부위에서 겔의 형성 전에 용액으로 흘러버릴 수 있어 사용이 쉽지 않다. 따라서 생체 조직내까지 침투하여 고도의 접착력과 파열강도 (burst strength)를 유지하기 까지는 3 초 이상, 특히 5 초 이상 15 초 이하인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 수화겔은 생리 조건 하에서도 빠른 겔화를 통해 우수한 특성을 가지므로, 의료 현장에서 조직 접착 등을 위해 매우 바람직하게 적용할 수 있다. 상기 적용은 예컨대 더블 배럴 시린지와 같은 기구를 이용하여 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

위의 방법으로 제조된 수화겔은 동결 건조하여 스펀지나 시트 형태로 제공되거나, 분말화될 수도 있으며, 이러한 형태로 유착방지제, 흡수제, 약물전달용 등으로 사용될 수 있다. 또한, 이하에 더욱 상세히 설명하겠지만, 수화겔의 형성을 위한 각 성분(화학식 1의 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌글리콜계 고분자)을 포함하는 키트 또는 조성물에 대해 의료 현장에서 가교 반응 등을 진행해 수화겔을 형성함으로써, 이를 생체 조직의 접착에 적용할 수 있다. 이러한 조직 접착에 대한 적용을 위해, 생체 조직 상에 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 포함하는 혼합물, 예를 들어, 혼합 수용액을 형성한 후, 이러한 수용액을 가교시켜 수화겔을 형성하고 생체 조직상에 코팅을 형성할 수 있다.

이에 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 수화겔의 제조를 위한 키트가 제공된다. 이러한 수화겔 제조용 키트는 상술한 바와 같이 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 화학식 1의 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 일 구현예의 수화겔은 생리 조건 하에서도 빠른 겔화 속도로 얻어질 수 있다. 따라서, 이러한 수화겔은 이의 형성을 위한 각 성분을 포함하는 겔화전의 키트 또는 조성물 등의 형태로서, 조직 접착 등을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 각 성분을 포함하는 키트 또는 조성물이 생체 조직에 적용된 후, 생체 조직 상에서 겔화가 이루어져 수화겔이 형성되고, 조직 접착의 작용을 나타낼 수 있다. 이러한 용도 등을 위해, 상기 또 다른 구현예의 키트가 사용될 수 있다.

구체적 실시예에 따르면, 이러한 수화겔 제조용 키트는 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 수용액을 포함하는 제 1액 및 친핵성 작용기를 갖는 고분자의 수용액을 포함하는 제 2 액을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 제 1 액 및 제 2 액의 수용액을 혼합해 사용할 수 있으며, 특히 제 1액과 제 2액을 혼합함으로써 현장에서 겔을 형성하면서 (in-situ forming hydrogel) 조직에 접착력을 갖는 것을 특징으로 한다.

이와 같이 2 액 반응형 실란트를 사용할 때, 제 1 액과 제 2 액의 혼합 및 사용은 여러 가지 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 액의 원액의 한쪽을 피착제 표면에 도포하고, 계속하여 또 한쪽을 도포함으로써 혼합을 실시할 수 있으며, 또는 제 1 액과 제 2액을 더블 배럴 시린지(double barrel syringe)와 같은 어플리케이터에서 혼합하여 도포를 실시할 수도 있다. 경우에 따라서는 실란트로서의 이용 이외에, 겔상 수지로 이루어진 시트 등으로 하여, 유착방지 등의 목적에 사용하는 것도 가능하다. 제 1 액과 제 2 액의 혼합비(체적비)는 통상 0.5 내지 2.0(제1액에 대한 제2액의 비율; 역의 경우도 동일함)으로 설정된다.

한편, 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 수화겔을 이용한 조직 접착제 조성물이 제공된다. 상술한 바와 같이, 상기 수화겔은 이의 형성을 위한 각 성분을 포함하는 겔화 전의 조성물 형태로서, 생체 조직 접착을 위해 바람직하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 조직 접착제 조성물의 일 실시예는 수화겔의 제조를 위한 각 성분, 예를 들어, 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 화학식 1의 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 포함할 수 있다.

적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와, 복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 포함하는 일 실시예의 조성물은 25 내지 40℃의 온도 범위, 예를 들어, 생리 조건 근방에서 체내 적용될 수 있으며, 혼합시 10 분 이내, 구체적으로 2분 이내, 보다 구체적으로 5 내지 30초 이내에 겔화가 일어나 수화겔을 형성할 수 있다. 따라서, 이러한 조성물을 생체 조직에 적용한 후 단 시간 내에 겔화시켜 조직 접착시킬 수 있으므로, 의료 현장에서의 바람직한 적용이 가능하다.

상술한 조직 접착제 조성물을 적용하는 방법은, 이미 수화겔 제조용 키트에 대해 설명한 바와 같으므로, 이에 대한 더 이상의 설명은 생략하기로 한다.

상기 조직 접착제 조성물은 국소적 상처 봉합, 위장관 문합술, 혈관 문합술, 안과 수술과 같은 수술과 다양한 용도로서 응용될 수 있다.

본 발명에 따른 γ-폴리글루탐산 유도체 및 이를 이용하여 제조되는 수화겔은 외과 수술 시, 수용액 상태에서 일정 기간 동안 활성을 유지 하기 때문에 용액을 제조하고 바로 사용하지 않아도 된다. 상처 부위에서 바로 겔을 형성하면서 생체 조직에의 접착력이 우수하여 혈액이나 공기의 누출을 억제하고, 생체 내에서 분해되어 흡수 혹은 배출되고, 생체에 대한 독성이 없다. 겔화 시간에 대해서도 원하는 정도로 조정 및 제어가 가능하다.

따라서 상기 수화겔을 생체 조직 접착 등과 같은 다양한 용도로 매우 바람직하게 사용될 수 있다.

도 1은 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체의 수용액에서의 안정성을 용해 후 시간 경과에 따른 겔의 파열 강도 변화를 통해 나타낸 도이다.
도 2는 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌글리콜과 가교반응하여 제조한 수화겔의 분해도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 1에 따라 활성화된 SS-PGA 내 치환된 NHS의 함량을 ¹H NMR 스펙트럼으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실험예 1에 따라 활성화된 SG-PGA 내 치환된 NHS의 함량을 ¹H NMR 스펙트럼으로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 대표적으로 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

제조예 1. 활성화된 SS - PGA 의 제조

제조예 1.1. γ- PGA 에 링커를 도입하여 γ- PGA - MEA 의 제조

건조된 1000 ml 둥근 2구 유리 플라스크에 γ-폴리글루탐산(PGA, 분자량 50K, 500K, 1000K, 2000K Da)을 카르복실 유닛 기준으로 100 mmol (12.9 g)을 넣고, 디메틸술폭사이드(DMSO) 650 ml을 넣어, 60 ℃에서 16시간 동안 교반하여 균일하게 용해시킨 후, 반응용액의 온도를 실온(25 ℃)으로 낮추었다. N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC) 를 γ-폴리글루탐산의 카르복실 유닛 대비 2 당량 과량으로 각각 정량하고 탄산수소나트륨 (sodium bicarbonate)을 γ-폴리글루탐산과 동일한 몰비로 정량하여 투입하고 감압하에서 교반하면서 수분을 제거하였다. 한 시간 뒤 질소하에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 모노에탄올아민(MEA)을 γ-폴리글루탐산의 카르복실 유닛 대비 2 당량 과량으로 정량하여 투입한 후 1시간 동안 반응시켰다.

반응 종료 후 탄산수소나트륨 및 생성된 유레아(urea)를 제거하기 위하여 반응액을 여과하면서 동시에 에틸아세테이트(EA) 4 L 에 침전시켰다. EA로 2회 세척하여 미반응 NHS와 DCC를 완전히 제거한 후 잔류하는 용매를 제거하기 위하여 진공 오븐에서 16 시간 이상 건조하였다. 최종적으로 링커가 도입된 γ-폴리글루탐산(γPGA-MEA) 화합물을 얻었다.

제조예 1.2. 링커 말단에 알킬기가 도입된 카르복시기를 도입하여 S-PGA(Succinylated PGA )의 제조

건조된 1000 ml 둥근 2구 유리 플라스크에 상기 제조예 1.1에서 제조된 γ-PGA-MEA 을 하이드록실 유닛 기준으로 100 mmol (18.3 g)을 넣고, 디메틸술폭사이드(DMSO) 450 ml을 넣어, 실온(25 ℃)에서 2 시간 동안 교반하여 균일하게 용해시킨 후, succinic anhydride(SA)를 γ-PGA-MEA 의 하이드록실 유닛 대비 6당량 과량으로 정량하고 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)를 SA 몰 대비 1/2 수준으로 정량하여 투입하고 감압하에 교반하면서 수분을 제거하였다. 한 시간 경과 후 질소하에서 24 시간 동안 반응하였다.

반응 종료 후 탄산수소나트륨을 제거하기 위하여 반응액을 여과하면서 동시에 에틸아세테이트(EA) 2.7 L 에 침전시켰다. EA로 2회 세척하여 미반응 SA를 완전히 제거한 후 잔류하는 용매를 제거하기 위하여 진공 오븐에서 16 시간 이상 건조하였다.

제조예 1.3. 활성화된 SS - PGA ( Succinimidyl succinyl PGA ) 의 제조

건조된 1000 ml 둥근 2구 유리 플라스크에 상기 제조예 1.2에서 제조된 S-PGA 을 카르복실 유닛 기준으로 100 mmol (27.28 g)을 넣고, 디메틸술폭사이드(DMSO) 700 ml을 넣어, 실온(25 ℃)에서 2 시간 동안 교반하여 균일하게 용해시킨 후, N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 를 를 각각 상기 SA와의 반응을 통해 형성된 카르복시기의 몰 유닛에 대해 하기 표 1에 기재된 몰비에 따라 각각 정량하여 투입하고 감압하에서 교반하면서 수분을 제거하였다. 한 시간 질소하에서 24 시간 동안 반응하였다.

반응 종료 후 생성된 유레아(urea)를 제거하기 위하여 반응액을 여과하면서 동시에 에틸아세테이트(EA) 5.6 L 에 침전시켰다. EA로 2회 세척하여 미반응 NHS와 DCC를 완전히 제거한 후 잔류하는 용매를 제거하기 위하여 진공 오븐에서 3 시간 건조 후 60 ℃로 승온하여 72 시간 건조하였다. 최종적으로 활성화된 SS-PGA 에스테르 화합물을 얻었다.

제조예 2. 활성화된 SG - PGA 의 제조

제조예 2.1. G- PGA ( Glutarylated PGA )의 제조

건조된 1000 ml 둥근 2구 유리 플라스크에 상기 제조예 1.1에서 제조된 γ-PGA-MEA 을 하이드록실 유닛 기준으로 100 mmol (18.3 g)을 넣고, 디메틸술폭사이드(DMSO) 450 ml을 넣어, 실온(25 ℃)에서 2 시간 동안 교반하여 균일하게 용해시킨 후, glutaric anhydride(GA)를 γ-PGA-MEA 의 하이드록실 유닛 대비 6당량 과량으로 정량하고 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)를 GA 몰 대비 1/2 수준으로 정량하여 투입하고 감압하에 교반하면서 수분을 제거하였다. 한 시간 경과 후 질소하에서 24 시간 동안 반응하였다.

반응 종료 후 탄산수소나트륨을 제거하기 위하여 반응액을 여과하면서 동시에 에틸아세테이트(EA) 2.7 L 에 침전시켰다. EA로 2회 세척하여 미반응 GA를 완전히 제거한 후 잔류하는 용매를 제거하기 위하여 진공 오븐에서 16 시간 이상 건조하였다.

제조예 2.2. 활성화된 SG - PGA ( Succinimidyl glutaryl PGA ) 의 제조

건조된 1000 ml 둥근 2구 유리 플라스크에 상기 제조예 2.1에서 제조된 G-PGA 을 카르복실 유닛 기준으로 100 mmol (27.28 g)을 넣고, 디메틸술폭사이드(DMSO) 700 ml을 넣어, 실온(25 ℃)에서 2 시간 동안 교반하여 균일하게 용해시킨 후, N-하이드록시숙신이미드(NHS) 및 디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 를 각각 상기 GA와의 반응을 통해 형성된 카르복시기의 몰 유닛에 대해 하기 표 1에 기재된 몰비에 따라 각각 정량하여 투입하고 감압하에서 교반하면서 수분을 제거하였다. 한 시간 질소하에서 24 시간 동안 반응하였다.

반응 종료 후 생성된 유레아(urea)를 제거하기 위하여 반응액을 여과하면서 동시에 에틸아세테이트(EA) 5.6 L 에 침전시켰다. EA로 2회 세척하여 미반응 NHS와 DCC를 완전히 제거한 후 잔류하는 용매를 제거하기 위하여 진공 오븐에서 3 시간 건조 후 60 ℃로 승온하여 72 시간 건조하였다. 최종적으로 활성화된 SG-PGA 에스테르 화합물을 얻었다.

실험예 1. 치환된 NHS 의 함량 측정

상기 제조예 1 및 2에 따라 제조된 활성화된 SS-PGA 및 활성화된 SG-PGA 내 치환된 NHS의 함량을 NMR을 이용하여 측정하여 하기 표 1과 도 3(SS-PGA) 및 도 4(SG-PGA)에 나타냈다. 구체적으로 1H NMR(D2O 용매)에서 측정한 γ-PGA의 -CH₂-(2.05 ppm)의 적분값 대비 결합된 N-hydroxysuccinimide (NHS)의 -CH₂- (2.8 ppm)의 적분값의 비율로 구하였다.

NHS, DCC 투입량에 따른 γ-PGA의 NHS 도입 비율

번호	γ-PGA 중량평균분자량(kDa)	[NHS]/[COOH]	[DCC]/[COOH]	치환된 NHS함량 (몰%)
T-1	50	2.0	2.0	65
T-2	1,000	1.0	1.0	35
T-3	1,000	1.5	1.5	53
T-4	1,000	2.0	2.0	64
T-5	1,000	3.0	3.0	81
T-6	1,000	4.0	4.0	84

상기 표 1을 참고하면, 상온에서 24시간 동안 반응시켰을 때, γ-PGA 중량평균분자량과는 무관하게 NHS와 DCC의 양이 증가하면 NHS의 치환도도 증가하였다. 그러나 카르복실기에 대해 3 당량 이상 과량의 NHS와 DCC를 반응시켜도 전체 카르복실기의 80 몰% 정도까지만 치환됨을 알 수 있었다.

실시예 1~6. 활성화된 γ- 폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 농도별 수화겔 제조

상기 표 1의 T-1 조건에 맞춰 합성한 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체(SS-PGA)과 분자량 20kDa의 4-arm PEG-SH를 가교반응 시켰다(실시예 1~3). 또한 표 1의 T-4 조건에 맞춰 합성한 SS-PGA와 분자량 20kDa의 4-arm PEG-SH를 가교반응 시켰다(실시예 4~6).

0.05 M 인산나트륨 수용액 1ml에 SS-PGA를 표 2의 양대로 녹여 SS-PGA 수용액 (제 1 액)을 조제하였다. 동일하게 0.3 M 인산나트륨 / 탄산나트륨 혼합(5:5) 수용액 1 ml에 4-arm PEG-SH를 표 2의 양대로 녹여 4-arm PEG-SH 수용액 (제 2 액)을 조제하였다. 제1 액과 제 2 액 각각 0.5 ml 를 1 ml 용량의 주사기에 채취하였다. 2 개의 주사기를 dual barrel syringe에 장착하여, spray 내에서 1차 혼합이 되도록 하여 적용하였다.

SS-PGA (완충액:0.05 M 인산나트륨 수용액)과 폴리에틸렌글리콜계 고분자 (완충액:0.3 M P/C 혼합 수용액)의 가교 반응 조건

번호	γPGA의 중량평균 분자량 (kDa)	SS-PGA (제 1 액) 의 농도 (%)	폴리에틸렌글리콜계 고분자		폴리에틸렌글리콜계 고분자 (제 2 액)의 농도 (%)
번호	γPGA의 중량평균 분자량 (kDa)	SS-PGA (제 1 액) 의 농도 (%)	종류	분자량 (kDa)	폴리에틸렌글리콜계 고분자 (제 2 액)의 농도 (%)
실시예1	50	7	4-PEG-SH	20	12
실시예2	50	7	4-PEG-SH	20	10
실시예3	50	6	4-PEG-SH	20	10
실시예4	1000	8	4-PEG-SH	20	12
실시예5	1000	10	4-PEG-SH	20	10
실시예6	1000	12	4-PEG-SH	20	10

실시예 7~16. 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 종류별 수화겔 제조

표 1의 T-4 조건에 맞춰 합성한 활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체(SS-PGA)과 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 가교반응 시켰다. 0.05 M 인산나트륨 수용액 1ml에 SS-PGA를 표 3의 양대로 녹여 SS-PGA 수용액 (제 1 액)을 조제하였다. 동일하게 0.3 M 인산나트륨 / 탄산나트륨 혼합 수용액 1 ml에 폴리에틸렌글리콜계 고분자를 표 3의 양대로 녹여 수용액 (제 2 액)을 조제하였다. 제1 액과 제 2 액을 각각 0.5ml 를 1ml 용량의 주사기에 채취하였다. 2 개의 주사기를 dual barrel syringe에 장착하여, spray 내에서 1차 혼합이 되도록 하여 적용하였다.

SS-PGA (완충액:0.05 M sodium phosphate 수용액)과 폴리에틸렌글리콜계 고분자 (완충액:0.3 M P/C 혼합 수용액)의 가교 반응 조건

번호	γPGA의 중량평균 분자량 (kDa)	SS-PGA (제 1 액) 의 농도 (%)	폴리에틸렌글리콜계 고분자		폴리에틸렌글리콜계 고분자 (제 2 액)의 농도 (%)
번호	γPGA의 중량평균 분자량 (kDa)	SS-PGA (제 1 액) 의 농도 (%)	종류	분자량 (kDa)	폴리에틸렌글리콜계 고분자 (제 2 액)의 농도 (%)
실시예7	1000	10	2-PEG-NH₂	10	10
실시예8	1000	10	2-PEG-NH₂	20	10
실시예9	1000	10	4-PEG-NH₂	20	10
실시예10	1000	12	4-PEG-NH₂	20	10
실시예11	1000	12	4-PEG-SH	10	6
실시예12	1000	12	4-PEG-SH	10	1
실시예13	1000	12	6-PEG-SH	10	2
실시예14	1000	10	6-PEG-SH	10	2
실시예15	1000	12	6-PEG-SH	20	4
실시예16	1000	12	6-PEG-SH	20	8

시험예 2. 겔화시간의 측정

상기 실시예 1 내지 16에 따라 제조된 제1 반응액과 제2 반응액을 각각 1ml 주사기에 0.5ml씩 채취한 이후, 투명한 폴리스티렌 재질의 24웰 세포 배양 판에서 자기 교반기를 이용하여 두 액을 교반하였다. 직경 4mm, 길이 12mm 크기의 자기 교반자를 사용하여 상온에서 500rpm 의 속도로 교반했으며 제1 반응액과 제2 반응액이 투입된 직후부터 자기교반자가 정지 할 때까지의 시간을 스톱워치로 계측하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.

SS-PGA 와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 겔화 시간

번호	겔화 시간 (초)
실시예 1	5
실시예 2	7
실시예 3	7
실시예 4	8
실시예 5	5
실시예 6	2
실시예 7	N/G
실시예 8	N/G
실시예 9	4
실시예 10	5
실시예 11	4
실시예 12	30
실시예 13	25
실시예 14	21
실시예 15	10
실시예 16	1

활성화된 γ-폴리글루탐산 유도체와 폴리에틸렌 글리콜계 고분자의 가교 반응에서는 γ-폴리글루탐산의 분자량에 상관 없이 NHS의 치환 정도가 비슷하여 겔화 시간에는 큰 차이를 보이지 않으며, 5초 내외의 겔화 시간을 갖는다. 동일한 조건에서 전체 고분자의 농도가 증가할수록 겔화 시간이 감소하나, 고분자의 농도가 10 % 보다 많은 경우에 너무 빠른 겔화로 인하여 겔이 부분적으로 생성되어 균일한 겔을 형성하지 못하였다.

한편, 폴리에틸렌글리콜계 고분자로서2-PEG-NH2를 사용한 실시예 7 및 실시예 8의 경우 PEG의 분자량에 상관 없이 겔화 반응이 일어나지 않았다. 또한 6-arm PEG-SH와의 가교 반응을 수행한 실시예 13 내지 16의 경우, PEG 하나의 유닛당 반응기가 4-arm PEG-SH 보다 많기 때문에, 상대적으로 더 낮은 농도에서도 빠른 겔화가 일어났다. 그러나 6-arm PEG-SH의 농도가 증가하면 마찬가지로 너무 빠른 겔화로 인하여 겔이 불균일하게 형성되었다.

시험예 3. 파열강도의 측정

파열강도의 측정은 ASTM2392 에 명시된 방법에 의하여 측정하였다. 실시예 1 내지 16에 따라 제조된 제1 반응액과 제2 반응액을 각각 1ml 주사기에 0.35ml 씩 채취하였다. 콜라겐 케이싱(Collagen Casing)을 물과 에탄올에 각각 2회 세척하여 콜라겐 케이싱에 묻어있는 글리세린을 제거한 이후 3×3cm 가 되도록 잘라내고 피부 생검용 펀치를 이용하여 3mm 의 구멍을 뚫어서 조직 대체제로서 사용하였다. 이후 3mm 의 구멍이 있는 콜라겐 케이싱을 테프론을 지지체로 하여 고정 시켰다. 이후 제1 반응액과 제2 반응액을 dual barrel syringe를 사용하여 각각 0.3 ml씩 혼합하여 반응액의 부피가 0.6ml가 되도록 하여 콜라겐 케이싱의 구멍에 도포한 이후 5 분동안 방치하여 경화 되도록 하였다. 이후 혼합 반응액이 도포된 콜라겐 케이싱을 테프론 지지체에서 분리한 뒤 ASTM2392 에서 명시된 방법에 의해 제조된 파열강도 측정기에 고정 시킨 후 수압을 측정한다. 경화된 겔이 부서지면서 측정된 수압을 파열강도로 한다. 상기 수화겔의 파열 강도 결과를 표 5에 나타내었다.

SS-PGA 와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 파열 강도

번호	파열 강도 (mmHg)
실시예 1	191.5
실시예 2	180
실시예 3	165
실시예 4	105
실시예 5	180
실시예 6	137
실시예 7	N/G
실시예 8	N/G
실시예 9	240
실시예 10	220
실시예 11	118
실시예 12	58
실시예 13	80
실시예 14	84
실시예 15	148
실시예 16	30

A. γ- 폴리글루탐산 고분자의 농도에 따른 영향

일정 수준 이상의 파열 강도의 유지는 활성화된 γ-폴리글루탐산 고분자의 농도에 영향을 받는다. 동일한 4-arm PEG-SH 고분자의 농도를 사용한 실시예 2, 3, 5, 및 6을 비교해보면, γ-PGA 고분자의 농도가 증가할수록 파열강도도 증가함을 알 수 있었다. 다만 γ-PGA 고분자의 농도가 10% 이상이 될 경우 파열강도는 더 이상 증가하지 않고, 12% 인 경우 오히려 파열 강도가 감소하는 것으로 나타났다. 이는 고분자의 농도가 지나치게 높아 용해도가 저하되어 점성이 증가함에 따라 제1액 및 제2액의 혼합시에 균일한 겔을 형성하지 못하였기 때문이다.

또한 전체 고분자 농도가 9 내지 10 % 일 때 파열 강도가 높게 측정되었다.

4-arm PEG-SH 고분자의 농도를 높여 전체 고분자의 농도가 10 % 정도가 된다 하여도 활성화된 γ-폴리글루탐산 고분자의 농도가 분자량 50k 은 6%, 1000k은 8 % 이하로 떨어지면 파열 강도가 낮게 측정되었다(실시예 3 및 4 참조).

B. 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 농도에 따른 영향

실시예 1 및 2와, 실시예 11 및 12를 비교하여 보면, 동일한 조건에서 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 농도만을 달리하여 제조된 수화겔의 경우, 폴리에틸렌글리콜게 고분자의 농도가 증가할수록 파열강도 또한 증가함을 확인할 수 있었다.

폴리에틸렌글리콜계 고분자로서 6-PEG-SH를 사용한 경우, PEG 한 유닛당 반응기가 4-arm PEG-SH 보다 많기 때문에 더 낮은 농도에서도 균일한 겔이 형성되나, 전체 고분자 농도가 낮아 가교점이 적게 되며 4-arm PEG-SH와의 겔화 반응 보다는 낮은 파열 강도 값이 측정되었다. 또한 6-arm PEG-SH의 농도가 지나치게 높을 경우(실시예 16), 1초에 불과한 너무 빠른 겔화로 인하여 겔이 불균일하게 형성되어 매우 낮은 파열강도 값이 측정되었고, 반대로 농도가 너무 낮으면 충분한 가교점을 갖지 못해 겔이 약하게 형성되었다.

C. 고분자의 종류에 따른 영향

γ-PGA및 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 농도 및 γ-PGA의 분자량을 동일하게 하고, 폴리에틸렌글리콜계 고분자의 종류만을 각각 4-PEG-SH, 4-PEG-NH₂ 로 달리하여 제조한 실시예 5와 9 및 실시예 6과 10을 비교하면, 4-PEG-NH₂ 를 사용하여 제조한 실시예 9 및 10의 경우 4-PEG-SH를 사용한 실시예 5 및 6에 비해 높은 파열 강도를 나타냈으며, 뿐만 아니라 실시예 1 내지 16 에 따른 수화겔을 통틀어서도 가장 높은 파열 강도를 갖는 것으로 나타났다.

다만 γ-PGA의 농도가 12% 인 실시예 6 및 실시예 10의 경우, 상기 A에서 살펴본 바와 마찬가지로, γ-PGA의 농도가 10%인 실시예 5 및 실시예 9에 비해 파열 강도가 낮게 나타났다. 이는 고분자의 농도가 지나치게 높아 용해도가 저하되어 점성이 증가함에 따라 제1액 및 제2액의 혼합시에 균일한 겔을 형성하지 못하였기 때문이다.

한편, 2-PEG-NH₂ 를 사용하여 제조한 실시예 7 및 8의 경우, 시험예 2의 겔화시간 측정시 언급한 바와 같이 겔화반응이 일어나지 않았는바, 파열강도 또한 측정할 수 없었다.

시험예 4. 접착강도의 측정

실시예에 따라 제조된 제1 반응액과 제2 반응액을 각각 1ml 주사기에 0.15ml 씩 채취하였다. 냉동된 돼지 피부를 상온에서 해동한 이후 탈지하여 1×5cm 가 되도록 잘라 놓았다. 또한 콜라겐 케이싱(collagen casing)도 물과 에탄올에 각각 2회 세척하여 1×5cm 가 되도록 잘라 놓았다. 1ml 주사기에 채취된 제1 반응액과 제2 반응액을 dual barrel syringe를 사용하여 각각 0.1ml씩 혼합하여 반응액의 부피가 0.2 ml가 되도록 하여 돼지 피부의 표면 또는 콜라겐 케이싱에 (1×1cm²) 도포하였다. 동일한 크기의 돼지 피부 또는 콜라겐 케이싱을 접합한 이후 50g 의 하중을 가하여 10분 동안 방치하여 겔이 경화되도록 하였다. 10분이 지난 이후 하중을 제거하고 인장시험기(H5K-T, Hounsfield사)를 이용하여 접착된 돼지 피부 또는 콜라겐 케이싱이 서로 박리될 때까지 100 mm/min 의 속도로 전단력을 계속 부과하며 박리될 때의 부하 하중을 접착강도로 했다. 또한 비교를 위해 피브린글루 (Beriplast?, CSL Behring)에 대해서도 동일하게 시험하였다. 상기 하이드로겔의 접착 강도 결과를 표 6에 나타내었다.

SS-PGA 와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 접착강도

번 호	접착강도 (gf/cm²)
실시예 5	398
실시예 6	148
실시예 10	238
실시예 14	65
실시예 15	196

접착강도는 파열강도와 유사한 양상을 보임이 확인되었다. 겔화시간이 5초 내외의 경우 두 물질간의 겔화가 일어남과 동시에 콜라겐 캐이싱과도 결합이 일어나 400 gf/cm 정도 수준의 접착강도가 측정되었다. 그러나 겔화 시간이 너무 빠른 경우 콜라겐 캐이싱에 결합될 충분한 시간이 없기 때문에 접착 강도가 낮게 측정되었다.

시험예 5. 수용액에서 안정성( pot life ) test

SS-PGA 의 수용액에서 안정성은 용해 후 시간 경과에 따른 파열 강도를 측정하여서 확인하였다. 파열강도의 측정은 ASTM2392 에 명시된 방법에 의하여 측정하였다. 실시예 1 및5에서 시행한 방법과 동일한 방식으로 SS-PGA 수용액 (제 1 반응액) 폴리에틸렌글리콜 유도체 수용액 (제 2 반응액)을 제조한 이후 수용액을 각각 1ml 주사기에 0.35ml 씩 채취하였다. 콜라겐 케이싱을 물과 에탄올에 각각 2회 세척하여 콜라겐 케이싱에 묻어있는 글리세린을 제거한 이후 3×3cm 가 되도록 잘라내고 피부 생검용 펀치를 이용하여 3mm 의 구멍을 뚫어서 조직 대체제로서 사용하였다. 이후 3mm 의 구멍이 있는 콜라겐 케이싱을 테프론을 지지체로 하여 고정 시켰다. 제1 반응액과 제2 반응액을 double barrel syringe를 사용하여 각각 0.3 ml씩 혼합하여 반응액의 부피가 0.6ml가 되도록 하여 콜라겐 케이싱의 구멍에 도포한 이후 5 분 동안 방치하여 경화 되도록 하였다. 이후 혼합 반응액이 도포된 콜라겐 케이싱을 테프론 지지체에서 분리한 뒤 ASTM2392 에서 명시된 방법에 의해 제조된 파열강도 측정기에 고정 시킨 후 수압을 측정하였다.

경화된 겔이 부서지면서 측정된 수압을 파열강도로 하였으며, 제 1 반응액을 제조한 직 후부터 20 분 내지 30 분 간격으로 두 시간까지 변화를 측정하고, 상기 SS-PGA 의 buffer에서 안정성에 따른 하이드로겔의 수용액에서의 안정성 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 5에 따른 수화겔의 수용액 내 안정성이 기존의 숙신이미드기로 활성화된 γ-폴리글루탐산을 사용하여 제조된 수화겔(본 발명자의 한국특허출원 제 10-2010-0138189 호의 제조예 T-12에 따라 제조된 수화겔(PGA 분자량 1,000K, ([NHS]/[COOH] = 1.2, [DCC]/[COOH] = 1.5, 반응시간 3 시간)) 에 비해 현저히 향상되었음을 확인할 수 있었다. 수용액 상에서 기존의 숙신이미드기로 활성화된 γ-폴리글루탐산의 경우 NHS가 빠르게 불활성화(deactivation) 되었고, 파열강도는 40분 이내에 약 30mmHg까지 떨어져서 초기(150mmHg)의 20 % 수준으로 감소하였다. 반면, 실시예 1의 수화겔은 2시간까지 측정했을 때 초기 물성이 유지되었으며, 실시예 5의 수화겔 또한 1시간 정도에 이르기까지 초기 물성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 다만 실시예 5의 수화겔은 1시간 이후부터 초기 강도의 50 % 수준으로 떨어지는 것으로 나타났는데, 이는 실시예 5의 활성화된 γ-폴리글루탐산의 농도(10%)가 실시예 1의 농도(7%)에 비해 더 높기 때문에 수용액 상에서 free NHS의 양이 더 많게 되고 그로 인해 안정성 저하가 나타나 시간에 따른 파열강도 값이 더 낮게 측정된 것이다.

시험예 6. 분해도 ( in vitro degradation ) test

수화겔의 분해 거동을 알아보기 위하여, 실시예 5에 따라 제조된 수화겔 1 g을 50 ml PBS에 넣고 37 ℃ 및 47 ℃, 50 rpm의 항온조에서 일정 기간(1 ~ 5 주, 1주 간격)동안 침지 후 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타냈다. 수화겔의 가수분해에 의한 중량 변화는 동결건조를 통하여 분해 전후의 무게비로 측정하였다.

상기 수화겔의 가수분해에 의한 중량 감소(weight loss) 결과를 나타낸 도2에서 알 수 있듯이, PBS 온도가 47 ℃ 인 경우, 1주 경과 후부터 수화겔이 급격하게 분해되어 3 주 이내 모두 분해되었으며, PBS 온도가 37 ℃에서는 1주 경과 후부터 완만하게 분해되어 4주에 초기 무게의 10 % 수준으로 남아 있고 5 주에 완전히 분해되었다. 이처럼, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 수화겔은 체내에서 상처 치유가 완료되는 초기 1 주일 후부터 분해가 시작되어 2 개월 내에 완전히 분해되므로 바람직한 분해 거동을 나타냄을 확인할 수 있었다.

Claims

하기 화학식 1의 γ-폴리글루탐산 유도체:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
l, m 및 n의 총 합은 390 내지 15,500의 정수이고,
상기 l, m 및 n의 비율은 l : m : n = 0 내지 0.5 : 0.2 내지 0.5 : 0.2 내지 0.8이며,
L은 링커이고, M은 각각 독립적으로 H, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속이고, R은 CH₂이며,
b는 0 또는 1이고, c는 1 내지 5의 정수이다.
제1항에 있어서,
상기 링커는 -HN-(R)a-O-(상기 R은 CH₂ 이고, a는 1 내지 5의 정수)인, γ-폴리글루탐산 유도체.
제2항에 있어서,
상기 링커는 아미노메탄올(Aminomethanol), 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol), 1-아미노-3-프로판올(1-amino-3-propanol), 1-아미노-4-부탄올(1-amino-4-butanol), 1-아미노-5-펜탄올(1-amino-5-pentanol) 또는 1-아미노-2-에탄올(MEA 또는 1-amino-2-ethanol)로부터 유래된 것인, γ-폴리글루탐산 유도체.
제1항에 있어서, -(CO)b-(R)c-CO- 는 -CH₂CH₂CH₂CH₂-CO-, -CO-CH₂CH₂CH₂-CO-, -CH₂CH₂-CO-, -CO-CH₂CH₂-CO- 또는 -CH₂-CO- 인 γ-폴리글루탐산 유도체.
γ-폴리글루탐산을 탄소수 1 내지 5인 저급 알칸올아민과 반응시켜 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는 제1단계;
상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 글루타르산 및 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 무수물, 또는 1-할로 발레르산, 1-할로 프로피온산 및 1-할로 메틸카본산으로 이루어진 군에서 선택된 1-할로 알칸산(1-halo alkanoic acid)과 반응시켜 알킬기가 도입된 카르복시 말단을 형성하는 제2단계; 및
상기 형성된 카르복시 말단을 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드와 반응시켜 적어도 일부의 카르복시기가 활성화된 γ-폴리글루탐산을 형성하는 제3단계
를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 γ-폴리글루탐산 유도체 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 1단계는
상기 저급 알칸올아민을 γ-폴리글루탐산의 카르복실기의 몰 유닛에 대해 0.1 내지 2의 몰비로 반응시키는 것인, γ-폴리글루탐산 유도체의 제조 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 2단계는
상기 산의 무수물 또는 1-할로 알칸산을 상기 γ-폴리글루탐산-알칸올아민을 형성하는 저급 알칸올아민의 몰 유닛에 대해 3 내지 8의 몰비로 반응시키는 것인, γ-폴리글루탐산 유도체의 제조 방법.
제 5항에 있어서, 상기 3단계는
상기 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시술포숙신이미드를 상기 형성된 카르복시 말단의 몰 유닛에 대해 0.1 내지 3의 몰비로 반응시키는 것인, γ-폴리글루탐산 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 γ-폴리글루탐산 유도체와,
복수의 친핵성 작용기를 갖는 폴리에틸렌글리콜계 고분자가 가교 결합된 가교체를 포함하는, 수화겔.
제 9항에 있어서,
친핵성 작용기는 아민기, 티올기 또는 히드록시기인 수화겔.
제9항에 있어서,
폴리에틸렌글리콜계 고분자는 화학식 2로 표시되는 수화겔:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, I는 2 내지 12가의 다가 알코올에서 유래한 라디칼이고, X는 아민기, 티올기 또는 히드록시기를 나타내며, n은 19 내지 170이며, m은 2 내지 12의 정수로서, 상기 I가 유래한 다가 알코올의 히드록시기수와 같다.
제11항에 있어서,
폴리에틸렌글리콜계 고분자는 하기 화학식 3 또는 4으로 표시되는 수화겔:
[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 3 및 4에서, X는 아민기, 티올기 또는 히드록시기를 나타내며, n은 19 내지 170이다.