KR102464966B1

KR102464966B1 - 주사 가능한 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102464966B1
Application number: KR1020170121075A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 김우영; 김만세
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2022-11-09
Also published as: KR20190032799A

Abstract

본 발명은 주사 가능한 형태의 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid)과 키토산(chitosan)이 물리적으로 결합되어 있는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔(hydrogel) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

주사 가능한 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔 및 이의 제조 방법{INJECTABLE γ-PGA-BASED HYDROGEL AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

키토산은 키틴의 디아세틸화 유도체로서, 생체적합성, 생분해성과 같은 특성을 지닌 가장 풍부한 천연 고분자 중 하나이다. 이는 약염기, 특히 글리세로포스페이트 등을 사용하여 주사가능한 온도감응성 겔 시스템에 사용되어 왔다. 글리세로포스페이트는 키토산의 양전화된 암모늄 그룹 간 반발력을 감소시켜 키토산 사슬의 상호작용을 더 강하게 한다.

특히, 베타 글리세로포스페이트에 의하여 유도된 온도감응성 키토산 수화겔은 키토산을 변형시키지 않고 빠른 겔화 시간, 향상된 기계적 특성을 보여주었다. 이 온도감응성 겔 시스템은 정전기적 상호작용에 의한 온도감응성 수화겔이 많은 생체분야에서 사용될 수 있음을 제안하였다.

폴리감마글루탐산은 바실러스 균으로부터 생산되는 천연 음전하성 고분자인 글루탐산의 감마 탄소에 카르보닐기와 다음 글루탐산의 알파 탄소의 카르복실기 그룹이 반복된 구조를 갖는다. 폴리감마글루탐산은 친수성, 생분해성, 무독성, 그리고 비면역성인 특징을 가져 단백질/유전자 전달, 생체 이미징, 그리고 조직공학과 같은 생체분야에서 널리 사용되어 왔다.

예를 들어, 폴리감마글루탐산은 탈수소화 그리고 냉각 겔화 방법을 이용하여 키토산과 함께 다공성 매트리스로 사용되었다. 합성된 매트리스는 폴리감마글루탐산을 첨가함에 따라 좋은 구멍 상호연결성, 향상된 세럼 단백질 흡착, 그리고 세포적합성을 보였다. 폴리감마글루탐산에 기반한 나노입자를 포함시켜 항원이나 이미징 물질의 효율적인 전달에 관한 연구 또한 활발히 진행되어 왔다.

점막층으로의 항원전달과 점막과의 강한 상호작용을 얻기 위하여 부분적으로 변형된 폴리감마글루탐산으로 이루어진 나노미셀에 바이러스성 항원을 함입하였고 이는 모델 단백질 펩타이드로부터 증가된 인터페론-감마(IFN-γ) 형성을 보여주었다. 자기공명이미징 조영제에 일반적으로 사용되는 초상자성의 산화철 나노입자는 폴리감마글루탐산이 있는 경우 안정화되었고 최소한의 생체 외 대식세포의 섭취, 그리고 생체 내 증진된 투과 및 유지 효과(EPR effect)를 보였다.

키토산의 아민 그룹과 폴리감마글루탐산의 카르복실기 그룹의 비를 달리하여 구성된 또 다른 형태인 고분자전해질 복합체(PEC) 필름이 연구되었는데, 이 경우 폴리감마글루탐산 대비 키토산의 비가 증가할수록 낮은 흡수율, 감소된 구멍크기, 동물실험에서의 억제된 염증반응 등을 보였다.

종래 사용되던 폴리감마글루탐산(Poly gamma glutamic acid)은 강한 (-) 성질을 가지고 있기 때문에, 인체 내에 사용시 유용한 효과가 있음에도 불구하고, 나노 입자 형태로 혈관 주사를 이용하여 사용될 수 밖에 없는 문제가 있었다.

또한, 하이드로 겔 상태는 인체 주입시 이물감이 적고 쉽게 용해되는 성질을 가지고 있기 때문에, 피부 주사가 가능하다는 장점이 있으나, 화학적 변화 또는 감마선 조사 등이 수반되어야 하기 때문에, 인체 내에 주사하기에는 위험이 따르는 문제가 있었다.

즉, 폴리감마글루탐산을 기반으로 하는 물리적 방법에 의해 형성되는 수화젤 및 주사가능한 수화겔 형성에 관한 연구는 현재까지 진행되지 않은 상태이다.

국제공개 제WO 2013/100715호 한국 등록특허 제1342641호

본 발명은 주사 가능한 형태의 폴리감마글루탐산과 키토산이 물리적으로 결합되어 있는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔 및 이의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 수화겔의 제조 방법은 (a) 저온에서 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 수화겔 전구체를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 수화겔 전구체를 가온하여 수화겔을 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 양상은 (a) 저온에서 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid) 용액과 키토산(chitosan) 용액을 혼합하여 수화겔(hydrogel) 전구체를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 수화겔 전구체를 가온하여 수화겔을 형성하는 단계를 포함하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 저온은 0℃ 내지 15℃인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 가온은 35℃ 내지 40℃까지 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산 용액은 분자량이 상이한 2종 이상의 키토산을 혼합하여 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산 용액은 수용성인 저분자량의 키토산과 약산성용액에 녹는 고분자량의 키토산을 3:7 내지 7:3의 중량비로 혼합하여 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수화겔 중 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1 내지 6:1인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 가온은 동물 체내에 상기 수화겔 전구체가 주입됨으로써 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 양상은 폴리감마글루탐산과 키토산이 물리적으로 결합되어 있는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔을 제공한다.

본 발명의 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산은 수용성 및 분자량이 상이한 2종 이상의 키토산을 혼합하여 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산은 수용성인 저분자량의 키토산과 약산성용액에 녹는 고분자량의 키토산을 3:7 내지 7:3의 중량비로 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1 내지 6:1인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 폴리감마글루탐산과 키토산을 포함하는 주사용 조성물로서, 상기 폴리감마글루탐산과 키토산은 저온에서 분리된 상태로 존재하고, 고온에서 물리적으로 결합하여 수화겔을 형성하는 것인 주사용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고온은 35℃ 내지 40℃인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키토산 용액은 수용성인 저분자량의 키토산과 고분자량의 3:7 내지 7:3의 중량비로 혼합하여 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 주사용 조성물 중 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1 내지 6:1인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 주사용 조성물은 상기 폴리감마글루탐산과 키토산은 분리된 상태로 동물의 체내에 주입되어 상기 동물의 체내에서 수화겔을 형성하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 양상은 상기 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법으로 제조된 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔에, 성장인자, 단백질, ??타이드, 유전자물질, 저분자량 약물 중 어느 하나인 수용액상에 녹는 약물을 포집하여 주사형으로 전달할 수 있는 약물전달체를 포함한다.

본 발명에 따른 온도감응성인 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔을 이루는 폴리감마글루탐산과 키토산은 저온에서 분리된 형태로 존재하나 고온에서 물리적 결합, 특히 정전기적 상호작용을 통한 결합에 의하여 수화겔을 형성하므로, 분리된 상태의 두 물질을 동물의 체내에 주입하여 체내에서 수화겔을 형성하게 함으로써 최소한의 침습 방법으로 수화겔을 전달할 수 있다.

본 발명에 따른 수화겔은 생체 내외에서 안정적이며, 우수한 기계적 특징을 나타내며, 수화겔 내에 함입된 약물을 서방출시키는 효과를 보여준다.

도 1은 체온 범위에서 형성된 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔을 바이알 기울임법을 통해 확인한 결과를 나타내며, 사용된 0.5중량% 농도의 키토산 중 약산성용액에 녹는 고분자량 키토산 대 수용성인 5kDa 키토산의 배합비는 각각 3:7(a), 5:5(b) 및 7:3(c)인 것을 나타낸다.
도 2는 서로 다른 분자량의 키토산의 중량, 비율을 조절하여 형성한 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔의 생체 외 배양에서의 분해거동을 나타내며, (A)는 전체 농도가 0.5중량%, (B)는 1중량%로 고정된 키토산 용액을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸다(3:7, 5:5, 7:3은 약산성용액에 녹는 고분자량 키토산 대 수용성인 5kDa 키토산 배합비를 의미함, n=3).
도 3의 (A)는 온도 변화에 따른 수화젤의 형성을 확인한 결과를 나타내며, (B)는 온도 변화에 따른 수화젤의 손실 모듈러스 확인한 결과를 나타낸다.
도 4의 (A)는 37℃에서 7:3, 5:5 및 3:7의 약산성용액에 녹는 고분자량 키토산 대 수용성인 5kDa 키토산 배합비를 가진 0.5중량% 키토산 용액을 포함하는 폴리감마글루탐산 수화겔의 저장 모듈러스(A) 및 손실 모듈러스(B)를 나타낸다(수화겔의 총부피: 200㎕, 레오미터 측정 높이: 0.5㎜, 0.1% 변형율, 주파수 범위: 0.1rad/s 내지 10rad/s, 15㎜ PS 기하학 구조(geometry) 이용, n=3).
도 5는 폴리감마글루탐산 수화겔에 함입된 인간 염기성 섬유아성장인자(bFGF)의 방출거동을 나타낸다(n=3).
도 6은 순수 bFGF와 방출된 bFGF 간 생체활성 비교분석 결과를 나타낸다(*: p < 0.05, #: p > 0.05, n=5).
도 7은 폴리감마글루탐산 수화겔에 대한 생체 내 수화젤 형성 및 시간 경과에 따른 안정성을 나타낸다(n=3).

본 발명자들은 체내에 수화겔을 제공하기 위한 방법에 대한 연구 중, 저온에서 분리된 상태에서 존재하는 폴리감마글루탐산 및 키토산이 체온 범위에서 가변적인 수화겔을 형성하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 일 양상은 (a) 저온에서 폴리감마글루탐산 용액과 키토산 용액을 혼합하여 수화겔 전구체를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 수화겔 전구체를 가온하여 수화겔을 형성하는 단계를 포함하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 “폴리감마글루탐산”의 분자량은 500kDa 에서 2500kDa 사이, 바람직하게는 2,000kDa일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “키토산”의 분자량은 5kDa에서 350kDa일 수 있다. 상기 키토산 용액은 분자량이 상이한 2종 이상의 키토산을 혼합하여 제조하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 수용성인 저분자량(2.5 kDa 에서 30 kDa 사이, 바람직하게는 5kDa)의 키토산 및 약산성용액에 녹는 고분자량(100 kDa 내지 1000kDa, 바람직하게는 310kDa 내지 350kDa)의 키토산을 혼합하여 키토산 용액을 제조할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 키토산 용액은 약산성용액에 녹는 고분자량의 키토산과 수용성인 저분자량의 키토산을 3:7 내지 7:3, 바람직하게는 7:3의 중량비로 혼합하여 제조하는 것일 수 있다. 상기 저분자량의 키토산은 물에 대하여 가용성을 갖는 것일 수 있으며, 상기 고분자량의 키토산은 약산성용액(아세트산)에 대하여 가용성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “수화겔 전구체”는 폴리감마글루탐산 및 키토산이 용액 중에 분리된 상태로 존재하는 혼합물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 “저온”은 상기 수화겔 전구체 상태를 유지할 수 있는 온도 범위를 의미하며, 구체적으로는 0℃ 내지 15℃, 바람직하게는 4℃일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “고온” 및 “가온”은 수화겔 전구체 상태인 폴리감마글루탐산 및 키토산이 물리적 결합에 의하여 수화겔을 형성할 수 있는 온도 범위 및 상기 온도 범위까지 온도를 상승시키는 것을 의미하며, 구체적으로는 35℃ 내지 40℃, 바람직하게는 체온인 37℃일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수화겔 중 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1 내지 6:1, 바람직하게는 12:1 내지 6:1인 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 일 양상은 상기 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔을 포함하는 약물전달체를 제공한다.

상기 약물전달체를 동물의 체내에 주입하기 위하여는, (1) 폴리감마글루탐산 및 키토산을 임의의 온도 범위, 예컨대 상온에서 각각 별도로 보관한 상태에서, 혼합 직전에만 저온 범위, 예컨대 4℃로 유지하여 체내로 주입하는 방법; (2) 분기되어 있는 주사기 또는 혼합기 등에 폴리감마글루탐산과 키토산을 분리된 상태로 보관하고 있다가, 인체 내에 주사하기 직전에 이를 혼합하여 사용하는 방법; (3) 폴리감마글루탐산 및 키토산의 혼합물을 지속적으로 4℃에서 보관하고 있다가 인체 내에 주사하는 방법 등의 방법을 사용할 수 있다.

상기 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔에 포함될 수 있는 약물의 종류에는 제한이 없으나, 수용성 약물이 바람직하며, 예컨대 성장인자를 포함하는 단백질 약물, ??타이드, 유전자물질 및 저분자 약물 등을 포함한다.

이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

분자량 2,000kDa의 폴리감마글루탐산(γ-PGA)은 바이오리더스(Bioleaders, 대전, 한국)에서, 분자량 5kDa의 키토산은 키토라이프(Kittolife Co., Ltd., 서울, 한국)에서, 고분자량(약 310 내지 350kDa)의 키토산(75%의 탈아세틸화 정도)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, 미주리주, 미국)에서 구매하였다. 포타슘 포스페이트 모노베이직(potassium phosphate monobasic), 소듐 포스페이트 다이베이직(sodium phosphate dibasic), 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소듐 아자이드(sodium azide), 라이소자임(lysozyme)은 시그마 알드리치에서 구매하였다. pH 7.4의 포스페이트 버퍼 살린 용액(PBS)은 탈이온수에 1.47mM의 포타슘 포스페이트 모노베이직, 10mM의 소듐 포스페이트 다이베이직, 2.7mM의 포타슘 클로라이드, 137mM의 소듐 클로라이드 및 2mM의 소듐 아자이드를 첨가하여 준비하였다. 0.2㎛ 셀룰로오스 아세테이트 실린지 필터는 도요로시(Toyo Roshi Kaisha. Ltd., 도쿄, 일본)에서, 0.2㎛ 나일론 실린지 필터 및 0.45㎛ 폴리프로필렌(PP) 실린지 필터는 왓맨 인터네셔널(Whatman International Ltd., 뉴저지, 미국)에서 구매하였다.

실시예 1. 폴리감마글루탐산/키토산 전구체 용액의 준비

폴리감마글루탐산/키토산 전구체 용액은 단순 혼합을 통해 준비하였다.

먼저, 0.5g의 염(나트륨 염)이 포함된 분자량 2,000kDa의 폴리감마글루탐산을 5㎖의 탈이온수에 하루 간 용해시켰다. 서로 다른 분자량 (3 kDa 그리고 ~350 kDa)을 가진 키토산을 각각 0.5g씩 1(v/v)% 아세트산 5㎖에 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 각 고분자들을 무수 디에틸에터 용액 500㎖에서 침전 및 여과시킨 후 2일 간 진공상태에서 건조하였다.

1.1. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔의 제조 1

5kDa의 분자량을 지닌 키토산과 고분자량의 키토산 배합비를 달리하여 구성된 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔은 단순 혼합법에 의하여 형성되었다. 동결건조 후, 분자량 2,000kDa의 폴리감마글루탐산은 탈이온수에, 키토산의 경우 물에 용해될 수 있는 5kDa의 분자량을 지닌 키토산과 산성용액에 용해될 수 있는 고분자량의 키토산의 배합비를 달리하여 1% 아세트산 용액에 용해시킨 후 0.2㎛ 셀룰로오스 아세테이트 실린지 필터를 통해 여과시켰다.

폴리감마글루탐산 용액의 최종농도는 6중량%, 키토산의 최종농도는 수용성인 분자량 5kDa 키토산과 약산성용액에 녹는 고분자량 키토산의 배합비를 7:3, 5:5, 3:7이 되도록 달리하고 키토산 용액의 최종농도가 0.5중량%가 되도록 하였다.

먼저, 각 고분자 용액을 1.5㎖ 튜브에 준비한 후 4℃에서 10분간 방치하였다. 응집체가 바로 형성되는 것을 방지하기 위하여 폴리감마글루탐산 수용액에 키토산 용액을 한 방울씩 첨가하였다. 서로 다른 키토산 배합비를 가진 겔 전구체 용액의 겔화를 유도하기 위하여 37℃에 방치하였다.

수화겔의 겔 형성은 바이알 기울임법에 의하여 확인하였다. 즉, 겔화가 진행된 시험 튜브를 뒤집어 1분 동안 겔 전구체 용액의 유동성이 관찰되지 않는 것을 통하여 겔 형성을 확인하였다(도 1 참조).

1.2. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔의 제조 2

키토산 용액의 최종농도가 1중량%가 되도록 한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1.1에 기재된 방법과 동일한 방법을 수행하여, 폴리감마글루탐산 용액의 최종농도는 6중량%, 키토산의 최종농도는 분자량 5kDa 키토산과 고분자량 ~350 kDa 키토산의 배합비를 7:3, 5:5, 3:7이 되도록 달리하고 키토산 용액의 최종농도가 0.5중량%가 되도록 하여 여러 종류의 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔을 제조하였다.

실험예 1. 폴리감마글루탐산 기반 수화겔의 생체 외 배양에서의 분해거동 관찰

폴리감마글루탐산 기반의 수화겔의 생체 외 배양 시 안정성을 분석하기 위하여 상기 실시예 3에서 제조된 수화겔을 이용하여 이의 분해거동을 측정하였다.

잔존해있는 수화겔의 부피는 다음 방법에 의하여 측정하였다. 간략하게는, 모든 수화겔을 각각 200㎕의 부피로 준비하여 15㎖ 튜브의 하부에 배치시켰다. 겔화를 유도하기 위하여 37℃에 방치한 후, 각 시험관 튜브에 5㎖ 부피의 방출 완충용액(release buffer, pH 7.4인 PBS)을 첨가하였다. 이후, 각 수화겔을 37℃, 원심속도 100rpm의 교반 인큐베이터(SI-600R, Lab. Companion, JEIO TECH, city, 한국)에 두었다. 전체 방출 완충용액을 매일 새로운 방출 완충용액으로 교체하였고, 잔존해있는 수화겔의 부피는 각 시간 시점에 측정되는 잔존 수화겔 높이와 초기 수화겔 높이를 비교하여 계산하였다. 잔존해있는 모든 수화겔 부피가 완전히 분해될 때까지 3회 반복하였다.

실험 결과, 분자량 5kDa 키토산 대 고분자량의 키토산의 배합비가 3:7인 수화겔의 경우 1주일까지 안정성을 유지한 반면, 분자량 5kDa 키토산 대 고분자량의 키토산 배합비가 5:5, 7:3의 수화겔의 경우 각각 15일, 17일의 안정성을 유지함을 확인하였다(도 2의 (a) 참조). 또한, 키토산 농도가 증가함에 따라 생체 외 배양 시 안정성이 보다 증가함을 확인할 수 있었다(7:3의 배합비의 경우 17일, 5:5의 경우 29일, 3:7 배합비의 경우 35일)(도 2의 (B) 참조).

생체 외 배양 시, 산성환경에 용해가능한 고분자량의 키토산의 양이 증가할수록 수화겔의 안정성이 향상됨을 확인하였다. 이는 약산성용액에 녹는 고분자량의 키토산의 양자화된 아민기 그룹이 물에 용해된 5kDa의 키토산의 아민기 그룹에 비하여 폴리감마글루탐산의 카르복실기 그룹과 더 반응하는 것에 기인한다. 특히, 0.5중량%의 농도 및 고분자량의 키토산의 비율이 더 높은 7:3 배합비의 키토산을 포함하는 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔은 다른 두 가지의 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔과 비교할 때 생체 외 배양 시 향상된 안정성을 보여주었다.

실험예 2. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔의 기계적 특성 관찰

온도변화에 의한 수화겔 형성 정도와 그 기계적 강도를 확인하기 위하여, 키토산 농도와 배합비를 달리한 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔의 겔화 거동 과 수화겔의 모듈러스(modulus)를 레오미터(Kinexus lab⁺, Malvern instruments Ltd., Worcester shire, UK)를 이용하여 관찰하였다. 간략하게, 모든 수화겔을 4℃에서 200㎕ 부피의 수용액 상태로 준비하여 각각 레오미터 측정판에 로딩하였다. 직경 15mm의 기하학 구조(geometry), 측정판과 기하학 구조 간 거리 0.5㎜, 0.1 rad/s 및 0.1% 변형율(strain)로 각 수화겔에 대한 모듈러스를 측정하였다. 구체적으로는, 4℃에서 측정을 시작하였으며 37℃까지 온도를 증가시킨 후 총 32분 간 모듈러스를 측정하였다. 그 후, 37℃에서 수화겔을 로딩한 후, 각속도 0.1rad/s에서 10rad/s까지 0.1%의 변형율로 주파수 스윕 시험(frequency sweep test)을 수행하여 저장 모듈러스 및 손실 모듈러스를 측정하였다.

단일주파수를 통한 폴리감마글루탐산 기반의 수화겔의 겔화 거동의 관찰 결과, 온도가 증가함에 따라, 폴리감마글루탐산과 키토산 간 정전기적 상호작용에 의하여 형성한 모든 수화겔은 온도 민감성을 보임을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 폴리감마글루탐산과 키토산 간 정전기적 상호작용 정도에 따른 모듈러스 측정한 결과, 정전기적 상호작용에 의하여 형성된 수화겔은 비교할만한 모듈러스를 보였다(도 4 참조). 구체적으로는, 배합비 7:3의 0.5중량% 키토산을 포함한 수화겔의 경우 저장 모듈러스가 약 1.5 x 10⁴Pa였던 반면, 배합비 5:5의 동일 농도의 키토산을 포함한 수화겔의 경우 1.2 x 10⁴Pa을, 배합비 3:7의 동일 농도의 키토산을 포함한 수화겔의 경우 1.0 x 10⁴Pa의 수치를 나타냈다. 이는 아미노 그룹과 카르복실기 그룹 간 강한 정전기적 상호작용으로 인하여, 물리적으로 혼합된 수화겔이 높은 저장 모듈러스를 보인 것으로 보인다. 산에 용해가능한 고분자량의 키토산의 양이 증가할 수록, 수화겔의 저장 모듈러스와 손실 모듈러스 모두 증가하였으며, 이는 폴리감마글루탐산의 카르복실기 그룹과 키토산의 양자화된 아미노 그룹간 증가된 정전기적 상호작용 때문일 것으로 예상된다.

실험예 3. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔에 bFGF 함입 및 방출거동의 관찰

폴리감마글루탐산에 결합할 수 있는 양전하 상태를 지닌 염기성 인간 염기성 섬유아성장인자를 모델 단백질로 선택하였다. 생체 외 배양 시 지속된 안정성을 보였던, 6중량%의 폴리감마글루탐산, 및 고분자량 키토산과 5kDa 키토산의 배합비가 7:3인 0.5중량%의 키토산으로 구성된 수화겔을 모델 수화겔로 사용하였다.

폴리감마글루탐산/키토산 수화겔로부터 인간 섬유아성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)의 방출량을 측정하기 위하여, 4℃에서 폴리감마글루탐산 수용액에 100ng의 bFGF를 함입시켰다. 구체적으로는, 충분한 파이펫팅으로 폴리감마글루탐산 수용액과 bFGF를 혼합시킨 후, 4℃에서 bFGF가 함입된 폴리감마글루탐산 수용액을 0.5중량%의 키토산 수용액과 혼합하였다. 200㎕ 부피의 각 겔 전구체의 겔화 유도를 위하여 37℃ 인큐베이터에 방치하였다. 수화겔 형성 후, 37℃ 및 100rpm의 교반 인큐베이터에서 각 수화겔이 있는 15㎖ 시험관 튜브에 10㎖의 방출 완충용액(pH 7.4, 0.01중량%의 BSA가 첨가된 PBS)을 첨가하였다. 전체 방출 완충용액은 각 시간 지점에 새로운 것으로 교체하였다. 방출된 bFGF 양은 ELISA 키트(Peprotech, 뉴저지, 미국) 및 다중웰 플레이트 리더(multi-well plate reader, Microplate Fluorescence Reader, FL600, BIO-TEK^®, MTX Lab Systems, Inc., 버지니아, 미국)를 사용한 405㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하여 정량 분석하였으며, 모든 실험은 3회 반복 시행하였다.

실험 결과, 인간 bFGF의 경우 수화겔이 모두 분해될 때까지 방출되었는데, 약 15일까지 측정되었다(도 5 참조). 이를 통하여, 폴리감마글루탐산과 bFGF간 결합력에 의하여 형성된 수화겔이 그 구조로부터 bFGF를 서방출시킴을 확인하였다.

실험예 4. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔로부터 방출된 bFGF의 생체활성 관찰

수화겔로부터 방출된 인간 섬유아성장인자(bFGF)의 생체활성을 순수 bFGF와 비교하기 위하여, WST-8 분석법을 진행하였다. 간략하게는, bFGF가 함입된 수화겔을 방출 완충용액 및 37℃에서 배양하였다. 이후, 방출된 bFGF 혹은 순수 bFGF를 bFGF에 의존하여 증식하는 세포주에 사용하여 각각의 생체활성을 분석하였다.

먼저, NIH3T3 세포주(각 웰당 1.0 x 10⁵세포)를 37℃/5% CO₂, 10% FBS 및 1% Abs가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 8시간 인큐베이션 후, 모든 세포는 PBS를 이용하여 세척하고, 이를 방출된 bFGF 혹은 순수한 bFGF가 각각 10ng/㎖의 농도로 포함된 DMEM(1% Abs 포함)에서 배양하였다. 모든 세포는 2일 간 인큐베이션하였고, 세포 증식도는 WST-8 분석법에 의하여 수행되었다. 세포를 포함한 각각의 웰에 WST-8 반응용액을 첨가한 후, 37℃ 환경에서 90분 동안 인큐베이션 하였고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450㎚ 파장대에서 흡광도 측정을 하였다.

실험 결과, 아무 처리도 하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 순수한 bFGF 및 수화겔로부터 방출된 bFGF 두 경우 모두에서 향상된 세포 증식도를 확인하였다(도 6 참조). 또한, 두 경우 모두 인큐베이션 동안 보인 생체활성에서 유의미한 차이를 보이지 않았다. 이를 통하여, 수화겔로부터 방출된 bFGF의 생체활성이 수화겔 자체에 의하여 영향을 받지 않음을 알 수 있고, 약 2주간 그 생체활성을 유지함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 폴리감마글루탐산/키토산 수화겔에 대한 생체 내 수화겔 형성 및 안정성 관찰

폴리감마글루탐산/키토산 수화겔에 대한 생체 내 형성 및 안정성과 생체적합성을 조사하기 위하여, BALB/c 실험쥐(8주생)를 이용하였다. 모든 실험쥐는 오리엔트바이오(Orient Bio Inc., 서울, 한국)로부터 제공받았으며, 광주과학기술원(GIST) 동물보호 및 관리 지침에 따라 관리되었다.

6중량%의 폴리감마글루탐산 용액 및 7:3 배합비를 지닌 0.5중량%의 키토산 용액을 얼음욕조에 준비하고, 잘 혼합해주었다. 이후, 22G 바늘을 이용하여 실험쥐의 등에 용액상태로 피하주사하였다. 겔화 유도를 위하여 주사 후 약 8분 후, 실험쥐에 형성된 수화겔의 잔존 면적을 특정 시간 지점(겔화 직후, 1일, 2일, 3일, 5일, 1주, 10일 및 2주)에 측정하였으며, 이를 통하여 생체 내 안정성을 확인하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다.

실험 결과, 겔화 직후 주사 부위에서 수화겔은 그 형태를 유지하였다. 시간이 경과함에 따라, 측정된 수화겔의 면적이 감소하였는데(도 7 참조), 이는 생체 내 주사 부위 근처에서 계속적인 이온 교환이 발생하여 일어난 것으로 보인다. 주로 정전기적 상호작용에 의하여 수화겔이 형성, 즉 서로 반대되는 전하 간 물리적 혼합에 의한 겔 형성이므로 수화겔의 지속적인 해리는 초기 면적과 비교했을 때 감소되었다. 주사 부위에서의 수화겔은 약 2주간 유지하였으며, 이는 대부분 해리되었을 때 이온 교환을 위한 수화겔이 더 이상 없음을 의미한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 0℃ 이상 15℃이하의 저온에서 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid) 용액과 키토산(chitosan) 용액을 혼합하여 수화겔(hydrogel) 전구체를 준비하는 단계; 및
(b) 상기 수화겔 전구체를 가온하여 수화겔을 형성하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하고,
상기 키토산 용액은 수용성인 2.5 kDa 내지 30 kDa의 저분자량의 키토산과 약산성용액에 녹는 100 kDa 내지 1000kDa의 고분자량의 키토산을 5:5에서 7:3 사이의 중량비로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 가온은 인체 체온의 온도 범위에 가까운 35℃ 내지 40℃ 의 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 수화겔 중 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비가 30:1에서 6:1 사이인 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 가온은 체내에 상기 수화겔 전구체가 주입됨으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법.
폴리감마글루탐산과 키토산이 물리적으로 혼합되어 있는 것을 특징으로 하고,
상기 키토산은 수용성인 2.5 kDa 내지 30 kDa의 저분자량의 키토산과 약산성용액에 녹는 100 kDa 내지 1000kDa의 고분자량의 키토산을 5:5에서 7:3 사이 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔.
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제 8 항에 있어서,
상기 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1에서 6:1 사이 인 것을 특징으로 하는 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔.
폴리감마글루탐산과 키토산을 포함하는 주사용 조성물로서,
상기 폴리감마글루탐산과 키토산은 0℃ 이상 15℃이하의 저온에서 분리된 상태로 존재하고, 35℃ 내지 40℃ 의 고온에서 물리적으로 결합하여 수화겔을 형성하는 것을 특징으로 하고,
상기 키토산은 수용성인 2.5 kDa 내지 30 kDa의 저분자량의 키토산과 약산성용액에 녹는 100 kDa 내지 1000kDa의 고분자량의 키토산을 5:5에서 7:3 사이 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 주사용 조성물.
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제 12 항에 있어서,
상기 주사용 조성물 중 폴리감마글루탐산과 키토산의 중량비는 30:1에서 6:1 사이인 것인 주사용 조성물.
제 12 항에 있어서,
상기 주사용 조성물은 상기 폴리감마글루탐산과 키토산은 분리된 상태로 체내에 주입되어 상기 체내에서 수화겔로 형성되는 것을 특징으로 하는 주사용 조성물.
제 1 항에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔의 제조 방법으로 제조된 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔.
제 8 항에 따른 폴리감마글루탐산-키토산 수화겔에, 수용액상에 녹는 약물을 포집하여 주사형으로 전달할 수 있는 약물전달체.