CN107281141B - 生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法，包括以下步骤，将小分子加入交联纳米药物悬浮液中；然后液氮冷却后进行冷冻干燥，得到生物可降解交联纳米药物冻干粉；所述小分子包括甘露醇，还包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种；所述小分子与交联纳米药物的质量比为（7.5～20）∶100；所述交联纳米药物包括生物可降解聚合物以及药物；所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体制备得到。本发明冷冻干燥得到的冻干粉，解决了现有技术纳米药物制备复杂、储存时间短等缺陷；由亲水性和疏水性化疗药物制备的靶向或非靶向纳米药物均可以制备形成冻干粉，说明该技术在癌症化疗方面具有巨大的潜在应用。

Description

生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法
技术领域
本发明属于聚合物纳米药物技术领域，具体涉及一种基于交联纳米药物冻干粉的制备方法，得到的冻干粉制剂再分散性能优异。
背景技术
随着近几十年纳米技术的发展，交联纳米药物凭借其肿瘤选择性和低毒副作用成为治疗癌症的常见药物。但是多数纳米药物以液态形式存在，长期保存可能会引起药物性质的改变和泄漏。为了克服交联纳米药物制剂长期储存时的物理化学不稳定性问题，可将其冷冻干燥，给药前再以适当介质水化重新分散成纳米药物悬液。然而，冷冻和干燥工艺可能会影响冻干产品的性状，比如将导致纳米药物聚集与融合，同时也可能伴随着药物的泄漏。为了有效抑制纳米药物的聚集与融合，防止药物在再分散过程中的泄漏，加入冻干保护剂是最直接有效的方法。
另一方面，侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体可以与其他单体共聚结合或者不结合靶向分子形成药物载体，用于药物循环输送；但是现有技术仅有液体药物的报道，因为聚合物特有的结构导致常规方式无法制得冻干制剂，尤其是采用现有加入冻干剂的方式，虽然会形成粉剂，但是再次分散后会极大破坏载体，包括载药能力、循环能力等，实际无法应用；因此现有技术没有有关生物可降解交联纳米药物冻干粉制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于交联纳米药物系统冻干粉的制备方法，通过冷冻干燥即可得到物理化学性质稳定的冻干粉制剂，有效抑制纳米药物的聚集与融合，防止药物在再分散过程中的泄漏，解决现有纳米药物储存时间短、使用不便等缺陷。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法，包括以下步骤，将小分子加入交联纳米药物悬浮液中；然后在液氮中冷却后冷冻干燥，得到生物可降解交联纳米药物冻干粉；所述小分子包括甘露醇，还包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种；所述小分子与交联纳米药物的质量比为（7.5～20）∶100；所述交联纳米药物包括生物可降解聚合物以及药物；所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体制备得到。
本发明进一步公开了一种纳米药物冻干制剂的制备方法，包括以下步骤，将小分子加入交联纳米药物悬浮液中；然后在液氮中冷却后冷冻干燥，得到生物可降解交联纳米药物冻干粉；将生物可降解交联纳米药物冻干粉进行包装，比如包装袋、包装瓶，得到纳米药物冻干制剂；所述小分子包括甘露醇，还包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或几种；所述小分子与交联纳米药物的质量比为（7.5～20）∶100；所述交联纳米药物包括生物可降解聚合物以及药物；所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体制备得到。
上述技术方案中，所述交联纳米药物悬浮液为交联纳米药物水悬浮液或者交联纳米药物缓冲液悬浮液；所述交联纳米药物悬浮液的浓度为5～15mg/mL，优选10 mg/mL。
上述技术方案中，所述小分子为甘露醇与蔗糖；优选甘露醇与蔗糖的质量比为1∶（1～1.5），进一步优选1。
上述技术方案中，所述小分子与交联纳米药物的质量比为（14～18）∶100。
上述技术方案中，液氮冷却时间为30～45分钟；冷冻干燥的冷阱温度为-53℃，时间为8～48小时。本发明限定原料比例结合制备工艺，得到的侧链含有二硫戊环结构的生物可降解聚合物负载的药物冻干粉性能优异，无泄漏，再分散能力优异。
上述技术方案中，所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体、其他单体、亲水高聚物、靶向分子制备得到；或者所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体、其他单体、亲水高聚物制备得到。
上述技术方案中，所述亲水高聚物为亲水链段，碳酸酯单体、其他单体链段为疏水链段；亲水高聚物为聚乙二醇或者端基官能化的聚乙二醇，比如聚乙二醇单甲醚（MeO-PEG-OH，M n = 5.0 kg/mol，M w/M n = 1.03）、马来酰亚胺活化的聚乙二醇（Mal-PEG-OH，M n = 7.5kg/mol，M w/M n = 1.04）；其他单体为三亚甲基碳酸酯（TMC）、丙交酯（LA）和己内酯（CL）；侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体的化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
上述技术方案中，所述药物为亲水药物比如盐酸阿霉素、硫酸长春新碱、盐酸伊立替康，也可以为疏水药物比如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。
上述技术方案中，所述生物可降解聚合物为聚合物胶束或者聚合物囊泡结构，优选聚合物囊泡结构；本发明通过调节亲水/疏水链段比例可得到囊泡结构的交联纳米药物，活性药物被包裹，结合冷冻干燥工艺，得到的冻干粉可避免出现聚集或药物的泄漏。
本发明中，由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体与其他单体共聚，或者再结合靶向分子或者亲水高聚物，得到侧链含有二硫戊环结构的生物可降解聚合物；得到的聚合物结构中，疏水链段包括侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体结构单元与其他单体结构单元，亲水高聚物构成亲水链段，限定疏水链段的总分子量与亲水链段分子量的比例以及疏水链段中不同结构单元的比例，可以得到不同结构的纳米药物。当疏水链段的总分子量为亲水链段分子量的0.3～1.5倍，侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体结构单元的总分子量为其他单体结构单元的总分子量与侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体结构总分子量之和的15%～60%，得到纳米胶束结构；当疏水链段的总分子量为亲水链段分子量的1.6～7倍，侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体结构单元的总分子量为其他单体结构单元的总分子量与侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体结构总分子量之和的8%～30%，得到纳米囊泡结构。
上述技术方案中，所述靶向分子为多肽（如cRGD、cNGQ、CPP44）、抗体、叶酸等；亲水聚合物为聚乙二醇，包括端基为甲氧基的和活性官能团修饰的。在亲水聚合物存在下，制备的聚合物中，亲水链段的分子量为3000-10000Da；比如本发明的聚合物可以为以下结构：
Figure 45635DEST_PATH_IMAGE002
上述技术方案中，在室温空气下将小分子加入交联纳米药物悬浮液中。
本发明通过限定条件冷冻干燥后得到纳米药物的冻干粉制剂解决了现有纳米药物需要复杂和苛刻的条件，比如保质期短、使用不便等缺陷；而且得到的冻干粉制剂没有出现聚集或药物的泄漏。
本发明首次公开了一种交联纳米药物冻干粉的制备方法，通过限定交联纳米药物悬浮液浓度以及小分子与药物的比例，可以制备冻干粉制剂，冻干粉可以长期稳定储存，加水或者其他缓冲液重新分散即可使用，粒径变化小、药物无泄漏，符合医学应用。
附图说明
图1为实施例一中共聚物PEG-P(TMC-DTC)的核磁共振谱图；
图2为实施例一中共聚物CPP44-PEG-P(TMC-DTC) 核磁共振谱图；
图3为实施例一中共聚物PEG-P(TMC-DTC)的GPC图；
图4为实施例一中共聚物CPP44-PEG-P(TMC-DTC)的GPC图；
图5为实施例一中纳米药物CPP44-PS-VCR的粒径分布图；
图6为实施例一中纳米药物CPP44-PS-VCR的稳定性测试图；
图7为实施例一中纳米药物CPP44-PS-VCR的电子透射电镜图；
图8为聚合物囊泡对K562细胞的流式细胞实验（A）和激光共聚焦实验结果（B）图；
图9为聚合物囊泡对AML-2细胞的流式细胞实验（A）和激光共聚焦实验结果（B）图；
图10为PS-VCR和CPP44-PS-VCR对AML-2细胞(A)和MCF-7细胞(B)的毒性结果图；
图11为CPP44-PS-VCR、PS-VCR和游离VCR 在荷AML-2瘤小鼠体内的抗肿瘤结果图；
图12为荷 AML-2 瘤小鼠经各组治疗20天后各主要器官的 H&E 染色切片图。
具体实施方式
原料与试剂
聚乙二醇单甲醚（MeO-PEG-OH，M n = 5.0 kg/mol，M w/M n = 1.03，Fluka），使用前经甲苯共沸除水；马来酰亚胺活化的聚乙二醇（Mal-PEG-OH，M n = 7.5 kg/mol，M w/M n = 1.04，北京健凯科技有限公司），购买后直接使用；三亚甲基碳酸酯（TMC，济南岱罡生物工程有限公司），使用前经甲苯重结晶；急性髓性白血病细胞AML-2和慢性髓性白血病细胞 K562 均从中科院上海细胞库购买。磷酸二苯酯（DPP，> 99.0 %，TCI）、硫酸长春新碱（98%，美仑生物技术有限公司）、CPP44多肽（98 %，强耀生物有限公司）、谷胱甘肽（GSH，99 %，Roche）、4, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，碧云天）、3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，碧云天生物技术公司）等购买后直接使用。二氯甲烷（DCM，AR，国药集团化学试剂有限公司）和甲苯（AR，国药集团化学试剂有限公司）经溶剂纯化系统（Innovative TechnologyLtd.）纯化后使用。
仪器与表征
核磁共振氢谱（1H NMR）由美国瓦里安（Unity Inova）600 MHz 超导核磁共振谱仪，采用氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲亚砜（DMSO-d 6）为溶剂，化学位移以溶剂峰为参考标准。共聚物的分子量和分子量分布使用Waters 1515凝胶渗透色谱仪（GPC）测定，以DMF为流动相，流动速率为1.0 mL/min，温度为30 ºC，采用一系列单分散线性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为标样。囊泡粒径和粒径分布通过Zeta sizer Nano-ZS动态光散射仪（英国Malvern 公司）测定，采用波长为633 nm的 He/Ne 背散射激光光源。透射电子显微镜使用Hitachi HT7700 TEM，加速电压为120 kV。将10 μL聚合物囊泡样品溶液（0.2 mg/mL）滴在碳支撑膜上，并用1 wt.%磷钨酸溶液染色1分钟。纳米药物的载药量用紫外分光光度计检测硫酸长春新碱在296 nm的吸收来测定。共聚焦激光显微镜（CLSM）图片使用TCS SP5 共聚焦系统（Leica）拍摄。流式细胞术使用FACSCalibur流式细胞仪（美国 BD 公司）测量。
实施例一
CPP44-PS-VCR冻干粉制剂由聚合物囊泡纳米药物CPP44-PS-VCR悬浮液添加甘露醇和蔗糖后通过适当的冷冻干燥制得，该纳米药物由共聚物CPP44-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC) (w/w 10/90)自组装形成囊泡后通过pH梯度法装载硫酸长春新碱得到。
本实施例涉及的聚合物的化学结构式如下，表征如表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
交联纳米药物CPP44-PS-VCR由共聚物聚乙二醇-b-聚（三亚甲基碳酸酯-co-二硫三亚甲基戊环碳酸酯）（PEG-b-P(TMC-co-DTC)）和CPP44修饰的共聚物（CPP44-PEG-b-P(TMC-co-DTC)）在自组装形成囊泡后通过pH梯度法主动装载硫酸长春新碱（VCR）而形成。共聚物PEG-b-P(TMC-co-DTC)和CPP44-PEG-b-P(TMC-co-DTC)由三亚甲基碳酸酯（TMC）和二硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）通过开环聚合得到。
首先，Mal-PEG-b-P(TMC-co-DTC)是以Mal-PEG为大分子引发剂、由三亚甲基碳酸酯（TMC）和二硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）开环聚合得到。具体地说，在氮气保护下，将Mal-PEG-OH（M n = 7.5 kg/mol，75 mg，10 μmol），TMC（150 mg，1.2 mmol）和DTC（20 mg，0.11mmol）溶在1.1 mL无水二氯甲烷中，随后加入磷酸二苯酯（DPP，25 mg，100 μmol）在密闭反应器中30℃条件下反应72 h。反应结束后，在冰乙醚中沉淀两次，抽滤并真空干燥过夜。产率：94 %。1H NMR (600 MHz, CDCl3, ppm): PEG: δ 3.64; TMC: δ 2.06, 4.24; DTC: δ3.02, 4.19; Mal: δ 7.0。 M n (1H NMR) = 24.4 kg/mol。M n(GPC) = 30.9 kg/mol, M w /M n=1.12。最后，得到的Mal-PEG-b-P(TMC-co-DTC)（100 mg，4 μmol）在5 mL的DMF中与多肽CPP44（10 mg，4.3 μmol）室温下反应48 h，最终用去离子水透析后得到产物CPP44-PEG-b-P(TMC-co-DTC)。产率：98%。CPP44的接枝率由BCA蛋白试剂盒（Thermo scientific）检测获得，接枝率为96%。
CPP44-PEG-b-P(TMC-co-DTC)是由马来酰亚胺活化的聚乙二醇（Mal-PEG-OH）作为大分子引发剂、开环聚合TMC和DTC得到Mal-PEG-b-P(TMC-co-DTC)，然后与CPP44-SH迈克尔加成反应得到。而PEG-b-P(TMC-co-DTC)是由聚乙二醇单甲醚（CH3O-PEG-OH）作为大分子引发剂聚合TMC和DTC得到，产率：92%。疏水链段P(TMC-co-DTC)的分子量可以通过1H NMR来表征，参见图1、图2。从表1可以看出，PEG-b-P(TMC-co-DTC)和Mal-PEG-b-P(TMC-co-DTC)的数均分子量跟设计的分子量都很接近，分子量分布也很窄，参见图3、图4，体现了很好的控制性。而且，共聚物的亲水段和疏水段的比例为23 wt.%，更倾向于形成囊泡。
表1 PEG-b-P(TMC-co-DTC)和Mal-PEG-b-P(TMC-co-DTC)的表征
Figure 25093DEST_PATH_IMAGE004
a由1H NMR测得；b由GPC测得。
往900 μL的PB溶液（10 mM，pH 4.0）中注射100 μL的按特定比例混合的PEG-P(TMC-DTC)/CPP44-PEG-P(TMC-DTC)的DMF溶液（10 mg/mL）。静置4小时后，用饱和磷酸氢二钠溶液将囊泡溶液的pH调至7.4。然后立即分别加入10、20、30或40 μL的浓度为10 mg/mL的硫酸长春新碱溶液（对应理论载药量分别为9.1、16.7、23.1和28.6 wt.%）。在37℃摇床中孵育5小时后，在PB介质中透析5小时，更换介质4次以上，整个过程中避光。DLC及DLE通过紫外分光光度计（297 nm）来测定。
纳米药物CPP44-PEG-P(TMC-DTC)的粒径以及粒径分布通过动态光散射（DLS）测得。其囊泡膜的结构通过透射电子显微镜照片来确定，在制备聚合物囊泡时即在溶液中加入0.1 mg/mL的磷钨酸溶液为囊泡内腔着色，样品在碳支撑膜上挥发干燥之前再一次用1%的磷钨酸溶液为囊泡膜着色，溶液中游离的磷钨酸用二次水清洗两次去除。
CPP44-PEG-P(TMC-DTC)的稳定性分别在PBS和加入10 %的胎牛血清（FBS）中孵育6小时，并用DLS记录其粒径的变化来表征。而在模拟细胞内还原环境下的快速解交联响应性通过向用PB（pH 7.4，10 mM）稀释后的聚合物囊泡溶液（0.1 mg/mL）中加入谷胱甘肽（GSH，10 mM），同样孵育6小时后通过DLS来表征其粒径变化。聚合物囊泡纳米药物是利用上述得到的共聚物自组装后通过pH梯度法主动装载硫酸长春新碱而得到，该纳米药物的流体力学大小在90~100 nm，而且分布较窄（多分散指数为0.11），见图5。纳米药物在PBS中和含有10%牛血清蛋白（FBS）缓冲介质中孵育6小时后依然保持较高的稳定性，见图6，同样佐证了其交联稳定的结构。而在含有10 mM 谷胱甘肽（GSH）的还原环境中孵育6小时后，聚合物囊泡的粒径和粒径分布发生较大的变化，说明其具有还原敏感性。透射电子显微镜照片（TEM）也证实了该纳米前药的膜/内腔结构，同时显示囊泡尺寸也与DLS结果相近，见图7。
紫外分光光度计的测试结果显示该纳米药物具有较高的载药量和载药效率，理论载药量为28.6 wt.% 时，实际载药量达到21.3 wt.%，见表2。
表2 CPP44-PS-VCR纳米药物的表征
Figure DEST_PATH_IMAGE005
a 由紫外分光光度计测得；b 由动态光散射测得。
除最简单的的细菌及微生物以外，绝大多数物质冻干时都易于聚集或破坏，为了防止冻干物的聚集或破坏，必须加入保护剂来维持；但是现有技术针对表面修饰PEG的纳米粒子，冷冻干燥后会出现聚集而无法复溶。
将上述得到的纳米药物CPP44-PS-VCR浓缩至10 mg/mL，然后加入小分子粉末，10分钟内溶解完全；最后在液氮中快速冷冻（15～30分钟），后放冷冻干燥机-50℃干燥48小时后取出密封保存，全程避光。使用前加入1 mL水溶解后用PB/PBS稀释后使用。
设计添加的小分子量分别为5%、10%和15%，以冻干后外观、再分散性和在分散后粒径作为主要考察指标，同时以不加任何小分子的样品作为对照。由表3可知，小分子的加入对聚合物囊泡的冻干产品有明显的影响，并且虽然几种小分子性质类似，但是依然存在明显差别：蔗糖和海藻糖可以很好地保护囊泡，使其冻干后可以重新分散，而甘露醇不能保护囊泡使其再分散，但是它可以形成外观蓬松的样品。
研究甘露醇/蔗糖合用对冻干产品质量的影响，同样考察冻干样品的外观、再分散性和再分散后粒径变化。表4研究结果表明，当甘露醇/蔗糖比例接近1时，再分散后尺寸变化小，保护效果较好；表5结果显示，甘露醇/蔗糖比例为1、小分子含量在14~18 wt.%时，聚合物囊泡冻干样品外观蓬松而且再分散后粒径变化最小，保护效果最好。在此条件下，聚合物囊泡纳米药物冻干后外观蓬松，再分散后粒径~116 nm，由紫外分光光度计测得药物泄漏量< 2 %。从而本发明通过限定条件，解决了较少量的冻干保护剂不能使囊泡再分散，而过多量的冻干保护剂将导致囊泡再分散后尺寸变化较大的问题；更主要解决了现有技术无法制备侧链含有二硫戊环结构的聚碳酸酯聚合物交联纳米药物冻干粉的缺陷。
表3 单一小分子对聚合物囊泡冻干的影响
Figure 867147DEST_PATH_IMAGE006
注：*代表1分钟内溶解，**代表3分钟内溶解，***代表10分钟内溶解，+代表粒径增大值
表4 甘露醇/蔗糖合用对聚合物囊泡冻干的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE007
注：“+”代表粒径增大值
表5 甘露醇/蔗糖合用用量对聚合物囊泡冻干的影响
Figure 926937DEST_PATH_IMAGE008
实施例二
根据实施例一，制备聚合物PEG-P(TMC-DTC) 和NHS-PEG-P(TMC-DTC)，从后者制备靶向分子为GE11多肽的靶向聚合物GE11-PEG-P(TMC-DTC)，化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
用PEG-P(TMC-DTC) 和GE11-PEG-P(TMC-DTC)混合制备囊泡、通过pH梯度法装载DOX×HCl进一步制备得到靶向交联纳米药物GE11-PS-DOX，为粒径90-100纳米左右的囊泡结构；载药量DLC可达10-20 wt.%；研究结果显示，GE11-PS-DOX在甘露醇和蔗糖合用（质量比为1，小分子用量为15 wt.%）的条件下，冻干样品呈蓬松粉末，用去离子水或缓冲介质可快速溶解（小于2分钟）重新分散为粒径不超过130纳米的囊泡。
实施例三
根据实施例一，将TMC更换为CL，制备聚合物PEG-P(CL-DTC) ，化学结构式如下：
Figure 803626DEST_PATH_IMAGE010
通过疏水作用力装载DTX进一步制备得到交联纳米药物MS-DTX，为粒径30-50纳米左右的胶束结构；载药量DLC为5~15 wt.%；研究结果显示，GE11-PS-DOX在甘露醇和蔗糖合用（质量比为1，小分子用量为16 wt%）的条件下，冻干样品呈蓬松粉末，用去离子水或缓冲介质可以快速溶解（小于2分钟）重新分散为粒径不超过60纳米的囊泡。
实施例四
根据实施例一，将TMC更换为LA制备聚合物PEG-P(LA-DTC) 和Mal-PEG-P(LA-DTC)，从后者制备靶向分子为anti-CD19抗体的靶向聚合物Anti-CD19-PEG-P(LA-DTC)，化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
进一步制备得到交联纳米药物与靶向交联纳米药物，为粒径50-70纳米左右的囊泡结构；在甘露醇和蔗糖合用（质量比为1，小分子用量为17%）的条件下，冻干样品呈蓬松粉末，用去离子水或缓冲介质可快速溶解（小于2分钟）重新分散为粒径不超过85纳米的囊泡。
实施例五
根据实施例一，将TMC更换为CL，制备聚合物PEG-P(CL-DTC) 和MAL-PEG-P(CL-DTC)，从后者制备靶向分子为叶酸（使用巯基官能化的叶酸）的靶向聚合物FA-PEG-P(CL-DTC)，化学结构式如下：
Figure 157247DEST_PATH_IMAGE012
进一步制备得到靶向纳米药物，为粒径70-90纳米左右的囊泡结构；装载疏水药物PTX，载药量DLC可达12 wt.%；在甘露醇和蔗糖合用（质量比为1∶1.5，小分子用量为15 wt%）的条件下，冻干样品呈蓬松粉末，用去离子水或缓冲介质可快速溶解（小于2分钟）重新分散为粒径不超过110纳米的囊泡。
以上可说明，本发明将交联纳米药物通过限定条件进行冷冻干燥，给药前再以适当介质水化重新分散成纳米药物悬液，解决了现有技术针对侧链含有二硫戊环结构的聚碳酸酯聚合物的冷冻和干燥工艺会影响冻干产品的性状，将导致纳米药物聚集与融合，同时也伴随着药物的泄漏的问题；还解决了纳米药物制剂长期储存时的物理化学不稳定性问题。以下以实施例一的生物可降解聚合物交联纳米药物冻干粉（质量比为1∶1，14 wt.%）说明本发明制备的冻干粉再分散后取得的医学效果。
流式细胞仪和激光共聚焦显微镜表征细胞内吞及细胞内释放
用亲水DOX×HCl作为药物模型考察细胞内吞和释放行为，DOX×HCl通过pH梯度法装载到囊泡亲水内腔，在流式细胞仪测试中，将AML-2细胞或K562细胞在6孔细胞培养板内（1 × 106细胞/孔）培养24小时后，加入100 μL的 PS-DOX 或CPP44-PS-DOX的PBS溶液（DOX浓度为10 μg/mL）孵育0.5小时。得到的细胞悬浮液在1000 × g离心3分钟，用PBS洗两次，再次分散在500 μL PBS中，1小时内进行流式细胞仪（BD FACS Calibur，BectonDickinson) 测试，用Cell Quest软件圈取10000个细胞分析。
细胞内吞及细胞内药物释放行为通过CLSM照片观察得到。将AML-2或K562细胞铺于含有细胞爬片的24孔细胞培养板里（1 × 105细胞/孔）培养24 小时后，加入50 μL的PS-DOX或CPP44-PS-DOX的PBS溶液（DOX浓度为10 μg/mL）。孵育2/4小时后，将培养基移除用PBS清洗两遍。用DAPI染细胞核15分钟后用PBS清洗两次。荧光图片由CLSM（TCS SP5）拍摄获得。
由流式细胞仪结果显示，荧光强度随囊泡中CPP44含量从0到10 mol %增加而增强，但CPP44增加到20 mol %、30 mol %时并没有比10 mol %有更明显的增强（图8A），所以在接下来的试验中，靶向组CPP44-PS中CPP44的含量均为10 mol %。激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）拍摄的照片显示，孵育2/4小时后，CPP44-PS组细胞核内DOX·HCl荧光很强，明显强于无靶向对照组PS-DOX（图8B）。这些结果证实CPP44-PS能主动靶向到K562细胞并在细胞内快速释放出药物。
细胞CPP44-PS对急性髓性白血病细胞AML-2的体外抗肿瘤活性，与K562细胞类似，如图9（为聚合物囊泡对AML-2细胞的流式细胞实验（A）和激光共聚焦实验结果（B）图）所示，流式细胞仪分析结果和激光共聚焦实验结果都显示CPP44-PS可以主动靶向到AML-2细胞，摄取量更多。
毒性试验（MTT）
游离的硫酸长春新碱和纳米药物的MTT实验选用两种细胞，一种是人急性髓系白血病细胞（AML-2），另外一种是人乳腺癌细胞（MCF-7）。AML-2或MCF-7细胞均在含有10 %FBS、1 % 青链霉素（100 IU/mL）的DMEM培养基中培养，铺在96孔细胞培养板内，细胞密度分别为1.5×104细胞/孔（AML-2）和5×103细胞/孔（MCF-7）。细胞培养24小时后，加入10 μL 样品（VCR、PS-VCR或CPP44-PS-VCR）的PB溶液（10 mM，pH 7.4）。孵育4小时后更换新鲜培养基，继续孵育44小时后，加入10 μL的3-（4，5-二甲基-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液（5 mg/mL)孵育4小时后，除去培养基，加入150 μL DMSO溶解活细胞产生的MTT-甲瓒。酶标仪测定各孔在492 nm的吸收，以加了MTT的培养基孔为零点。每个实验数据平行做四组（n= 4）。
通过MTT实验进一步评估CPP44-PS-VCR纳米药物的抗癌活性。如图10（为PS-VCR和CPP44-PS-VCR对AML-2细胞(A)和MCF-7细胞(B)的毒性结果图）所示，CPP44-PS-VCR纳米药物对AML-2细胞具有很强的抑制效果，毒性明显强于非主动靶向对照组PS-VCR。此外，还选取了MCF-7细胞作为阴性对照，结果显示CPP44-PS-VCR与PS-VCR具有相近的细胞毒性。上述结果表明，对于MCF-7细胞，非靶向组和CPP44组的细胞内吞和细胞毒性没有明显差别。而对于K562细胞和AML-2细胞，具有更高的细胞摄取量和更强的细胞毒性，说明该靶向纳米药物具有细胞选择性穿透效果。
纳米药物对荷瘤小鼠的治疗实验
所有动物实验均遵守苏州大学实验动物中心和苏州大学动物保护与使用条例。AML-2肿瘤模型通过在Nude小鼠（18-20 g，5周龄）右后背皮下注射20 mm3的AML-2肿块建立。大概十天过后，当肿瘤体积生长至100-200 mm3时，此天定义为第0天，并将荷AML-2肿瘤小鼠随机分成4组（每组平行5只）。分别每四天尾静脉注射200 µL的 CPP44-PS-VCR (1 mgVCR equiv./kg)，PS-VCR (1 mg VCR equiv./kg)，free VCR (1 mg/kg) 和 PBS，其中CPP44-PS-VCR和PS-VCR总共给药四次，free VCR组由于小鼠的耐受问题第二次给药后停止治疗。每两天用游标卡尺测量一次肿瘤体积，并由公式V = 0.5 × L ×W2计算得到肿瘤体积，其中L和W分别代表肿瘤的长和宽。相对肿瘤体积为V/V0（V0为肿瘤第0天时体积）。每两天称量一次小鼠体重，计算相对于最初体重的肿瘤相对体重变化。到第20天时，将肿瘤取出拍照称量，并随机解剖一只将心、肝和肾取出用于组织学分析。组织学分析时，组织用4%的福尔马林溶液固定并包埋于石蜡中，载玻片上的厚度约4 mm的组织切片用苏木紫和伊红（H&E）染色后由载玻片封片，用正置光学显微镜（Olympus BX41）拍摄。
在荷AML-2肿瘤的小鼠模型上评估了纳米药物和游离VCR的抗肿瘤活性。计划每四天给一次药，总共给药四次，给药剂量为1.0 mg/kg。但是游离药物组接受两次治疗后体重急剧下降，8天内体重下降超过10 %，同时皮肤脱落严重，健康状况堪忧，表现出严重的毒副作用（图11A），所以第二次给药后决定放弃继续治疗。与此相反，PS-VCR和CPP44-PS-VCR治疗组的小鼠在整个治疗周期内没有出现明显的体重下降，也未出现蜕皮等现象，说明有或者没有CPP44主动靶向基团，纳米药物的系统毒性都很小。同时，相对肿瘤体积结果显示（图11A），相同剂量下的主动靶向 CPP-PS-VCR治疗组的抑瘤效果显著好于非主动靶向PS-VCR组。这说明在特异性细胞穿膜肽的作用下，纳米药物能够被白血病细胞快速内吞和释放出化学药物，从而增强治疗效果。
从20天后取出的肿块照片（图11B）和称取的肿块质量（图11C）同样可以看出CPP-PS-VCR具有更好的抑瘤效果，肿瘤体积较小。受系统性毒性影响，小鼠肿瘤体积随体重减轻而增长不明显，肿瘤大小并不能完全反应药效，所以对于游离VCR组的肿瘤大小不做过多的对比和讨论。
图11为CPP44-PS-VCR、PS-VCR和游离VCR 在荷AML-2瘤小鼠体内的抗肿瘤活性研究结果图，VCR剂量均为1 mg/kg，游离VCR分别在第0天和第4天给药，PS-VCR和CPP44-PS-VCR分别在第0，4，8和12天给药，图中(A)肿瘤体积变化和小鼠体重变化图；(B)第20天剥离的肿瘤照片；(C)第20天剥离的肿瘤质量。
另外，小鼠主要器官的切片的H&E染色分析结果参见图12，图片通过奥林巴斯BX41 正置荧光显微镜（Olympus BX 41）使用40倍物镜拍摄，各治疗组对主要器官都没有表现出明显的毒副作用，表明聚合物囊泡的存在形式并没有引起长春新碱物对心、肝和肾等主要器官毒副作用的增强。
另外，采用甘露醇与葡萄糖或者海藻糖配合后，各种比例下，得到的冻干粉再分散性能较差，粒径变化超过120nm，而且有不同程度的药物泄露，不适于实际应用；还采用其他冷冻条件作对比，比如液氮冷却时间的变化、冷冻干燥参数的变化，得到的冻干粉再分散后粒径变化稍大，超过80nm，存在不同程度的药物泄露，也不适于实际应用。
本发明通过pH梯度主动载药法成功制备了生物可降解聚合物囊泡纳米药物，载药量高达21.3 wt.%，与现有药物相比，该聚合物囊泡纳米药物具有明显的优势：（1）该纳米药物在甘露醇/蔗糖合用条件下制备成冻干粉，方便储存和使用；（2）该纳米药物冻干粉通过硫硫键交联而具有很好的稳定性，在10 %血清中依然保持较高的稳定性，极大抑制药物的泄露，降低毒副作用；（3）该纳米药物冻干粉可以主动靶向到AML-2和K562两种白血病细胞，体内和体外实验都证明本发明的冻干粉再分散后具有优异的治疗效果，特别是与新制备的纳米药物疗效一致。因此，本发明的冻干粉已经在诸多方面优于临床上的脂质体药物，特别是通过再分散医学研究证实本发明制备的冻干粉没有出现纳米药物聚集与融合，同时也没有出现药物的泄漏，有望作为一种靶向纳米药物用于疾病，比如白血病的治疗。

Claims (3)

1.一种生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将小分子加入交联纳米药物悬浮液中；然后在液氮中冷却后冷冻干燥，得到生物可降解交联纳米药物冻干粉；所述小分子为甘露醇与蔗糖；所述小分子与交联纳米药物的质量比为（7.5～20）∶100；所述交联纳米药物包括生物可降解聚合物以及药物；所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体制备得到；所述交联纳米药物悬浮液为交联纳米药物水溶液或者交联纳米药物缓冲液溶液；所述交联纳米药物悬浮液的浓度为8～12 mg/mL；在室温空气下将小分子加入交联纳米药物悬浮液中；液氮冷却时间为30～45分钟；冷冻干燥的冷阱温度为-53℃，时间为8～48小时；所述甘露醇与蔗糖的质量比为1∶（1～1.5）；所述小分子与交联纳米药物的质量比为（14～18）∶100；所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体、其他单体、亲水高聚物、靶向分子制备得到；或者所述生物可降解聚合物由侧链含有二硫戊环结构的碳酸酯单体、其他单体、亲水高聚物制备得到；所述其他单体包括三亚甲基碳酸酯、丙交酯或者己内酯。
2.根据权利要求1所述生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述生物可降解聚合物为胶束结构或者囊泡结构。
3.根据权利要求1所述生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述药物为亲水药物或者疏水药物；所述靶向分子为多肽、抗体或者叶酸。
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