ES2610302T3 - Hidrogel de reticulación in situ que comprende ácido gamma-poliglutámico y método para producirlo - Google Patents

Hidrogel de reticulación in situ que comprende ácido gamma-poliglutámico y método para producirlo Download PDF

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Abstract

Un derivado de ácido -poliglutámico de fórmula química 1:**Fórmula** en la cual, la suma total de l, m y n es un número entero de 390 a 15.500, la relación de l, m y n es l:m:n >= 0 a 0,5:0,2 a 0,5:0,2 a 0,8, L es un conector, M es cada uno independientemente H, un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, R es CH2, b es 0 ó 1 y c es un número entero de 1 a 5, en que el conector es -HN-(R)a-O-, con R >= CH2 y a >= un número entero de 1 a 5.

Description

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DESCRIPCION
Hidrogel de reticulacion in situ que comprende acido gamma-poliglutamico y metodo para producirlo Antecedentes de la invencion
(a) Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a un hidrogel biodegradable y biocompatible que puede ser usado para sellantes de supresion de perdidas de sangre o aire durante operacion quirurgica, adhesivos de tejidos, agentes antiadhesivos y portadores de suministro de farmacos, y un metodo para producirlo.
(b) Descripcion de la tecnica anterior
Los pegamentos de fibrina y adhesivos basados en proteinas han sido usados mayoritariamente para sellantes y adhesivos para fines medicos, especialmente de operacion quirurgica. Sin embargo, los pegamentos de fibrina son propensos a desprenderse de los sitios quirurgicos debido a su fuerza adhesiva bastante baja y pueden provocar tambien la propagacion de enfermedades como infecciones virales porque son productos sanguineos. Como adhesivos basados en proteinas se han usado productos (documento USP 5.385.606, nombre del producto: bioglue®) que usan albumina (albumina de suero bovino) y glutaraldehido y productos (nombre del producto: GRF glue®) que usan una combinacion de gelatina, resorcinol y formaldehido, pero pueden provocar infecciones debido al uso de proteinas de origen animal y tienen una escasa biocompatibilidad debido a problemas toxicos de los aldehidos que son usados como un agente reticulante.
Posteriormente, con el fin de sustituir estos productos sanguineos o productos de proteinas, se han realizado de forma energica estudios de hidrogeles de formacion in situ que usan polimeros sinteticos (habitualmente, polietilenglicol (PEG)) o hidratos de carbono (habitualmente dextrano) y algunos de ellos han sido ya puestos a disposicion en el mercado. Dependiendo del tipo de reacciones de reticulacion, pueden ser una reaccion de polimerizacion por radicales y reaccion de sustitucion nucleofilica y electrofilica. La reaccion de sustitucion se puede dividir adicionalmente en un enlace de imina y un enlace de amida, segun los tipos de enlaces. Para un ejemplo de polimerizacion por radicales, un polietilenglicol (PEG) fotoactivado que esta siendo comercializado bajo el nombre comercial Focal-Seal® (Genzyme), se describe que exhibe una mayor resistencia que los sellantes de fibrina, pero requiere una fuente de luz y un fotoiniciador y puede provocar problemas en cuanto que la sangre inhibe la reaccion de polimerizacion evitando la penetracion de las fuentes de luz, e inconvenientes para su uso. El enlace de imina debe ser generado a partir de la reaccion de un grupo aldehido y un grupo amino y se ha informado que los dextranos aldehidados son usados como electrofilos y el quitosano o poli(alcoholes vinilicos)aminados (documento US 2005/00028930), multi-amino-PEG (documento US 2006/0078536, Biomaterials 29 (2008) 4584-4591) y £- polilisina sintetizada a traves de un cultivo en microtubos (documento WO 2006/080523) son usados como nucleofilos. Sin embargo, los dextranos aldehidados tienen todavia una toxicidad que resulta de los grupos aldehido y carecen de la caracteristica de estabilidad porque son facilmente oxidados y, por tanto, pierden su reactividad. Para los enlaces de amidas, ha habido metodos ampliamente usados para activar un acido carboxilico a un ester succinimidilico, haciendolo reaccionar seguidamente con un grupo amino que es nucleofilo. Se ha informado que mayoritariamente se usa un ester de PEG multicaboxilato activado como un electrofilo y colageno (documento US 5.162.430) y albumina de suero (documento US RE38.827), que son proteinas naturales, se usan como un nucleofilo, pero tienen todavia inconvenientes sobre la propagacion de enfermedades, como se describio anteriormente. Ademas, se ha descrito un hidrogel mediante una reaccion de reticulacion de ester activado de PEG multifuncional con quitosano o quitosano conjugado con metoxi-PEG (documento US 6.602.952), pero como su tiempo de gelificacion es de dos horas aproximadamente, no es adecuado para un hidrogel de reticulacion in situ. Como nucleofilos sinteticos, se han desarrollado y comercializado ejemplos para usar multiamino- o multimercapto- PEG (documento S 5.874.500, nombre del producto CoSeal®) y ejemplos de usar trilisina (documento US 6.566.406, nombre del producto DuraSeal®). Como se establecio anteriormente, han sido expuestos numerosos ejemplos de usar polietilenglicol con una excelente biocompatibilidad como un polimero sintetico.
El acido Y-poliglutamico, un Y-polipeptido producido mediante el enlace amido de acido Y-carboxilico y el grupo a- amino del acido glutamico, es un polimero soluble en agua, anionico, biodegradable, biocompatible que es biosintetizado mediante Bacillus subtilis, un microorganismo alimenticio fermentado por soja. Se han hecho intentos de preparar acido Y-poliglutamico para ser usado como un absorbente o un hidrogel para fines medicos, y los ejemplos tipicos del mismo son como sigue.
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Como metodos de enlaces ionicos, la patente japonesa puesta a disposicion del publico n° 1999-276572 describe un complejo de poligamma-glutamato preparado mediante sales de aminas cuaternarias hidrogenantes como quitosano para aniones carboxilicos de Y-polil-glutamatos si se usa para suturas quirurgicas, vendas para el cuidado de heridas, productos antiadhesivos y antihemorragicos.
Como ejemplos de reticulacion mediante enlaces quimicos que usan agentes reticulantes, la patente japonesa puesta a disposicion del publico n° 1999-343339 describe que el acido Y-poliglutamico es reticulado mediante el uso de compuestos de poliepoxi como dietilenglicol-diglicidil-eter como agente reticulante, y es aplicado a agentes antiadhesivos en el documento WO 2007/132785. Sin embargo, como las condiciones de la reaccion son a 40 °C durante 48 horas, o 90 °C durante 30 minutos es imposible aplicarlo para la finalidad de una gelacion in situ en campos medicos.
Tambien, se ha informado que se usan carbodiimidas solubles en agua como un condensado para favorecer la reaccion de grupos carboxilos de acido Y-poliglutamico y nucleofilos. De estos, se ha descrito en la patente japonesa puesta a disposicion del publico n° 2002-128899 que la fructosa con biodegradabilidad, lisina, quitosano, etc. son usados como compuestos reticulantes y la 3-(3-dimetil-aminopropil)-1-etil-carbodiimida (EDC) es usada como una carbodiimida soluble en agua, pero esta realizacion de la reaccion es todavia demasiado larga, como 24 horas a temperatura ambiente. Ademas, se ha descrito en la publicacion J. Appl. Polym. Sci. 65, pags. 1889-1896, 1997 que los precipitados de y-PEG-EDC se produjeron a traves de la reaccion de acido Y-poliglutamico y EDC, seguido de la adicion de 1,3-propano-diamina como agente reticulante para preparar un hidrogel. Sin embargo, esta realizacion se describe tambien que se deja en reposo durante un dia despues de la mezcla y su rendimiento es considerablemente bajo, de 10% o menos.
Se ha descrito en la patente japonesa puesta a disposicion del publico n° 1997-103479 y en la publicacion Biomaterial 19 (1998) 1869-1876 que cuando se hace reaccionar gelatina con acido a-poliglutamico succinimidizado como agente reticulante, se gelifica en 30 segundos, pero este resultado sugiere que el acido a-poliglutamico solamente ayuda a la reaccion de gelacion de gelatinas que son gelificadas de forma natural a una cierta temperatura de aproximadamente 40 °C, y no sugiere que el acido Y-poliglutamico por si mismo constituya un ingrediente principal de los hidrogeles.
Ademas, el documento KR 2011-0076838 describe un hidrogel preparado mediante reticulacion de acido y- poliglutamico y una polilisina o polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilicos. Analogamente, el documento KR 2011-0076826 describe un hidrogel reticulado de acido y- poliglutamico y e-polilisina. Ademas de ello, el documento WO 2007/034794 describe un gel de acido poli-Y- glutamico biodegradable preparado mediante reticulacion de acido poli-Y-glutamico y una poliamina usando una carbodiimida soluble en agua y una N-hidroxiimida.
Por lo tanto, hay una necesidad constante de hidrogeles con un tiempo de gelacion corto, biocompatibilidad y biodegradabilidad, y que tenga una excelente fuerza adhesiva y una resistencia al bombeo de modo que sea preferentemente aplicable a la adhesion de tejidos.
Sumario de la invencion
Segun los antecedentes tecnicos anteriormente descritos, es un objeto de la presente invencion proporcionar un derivado de acido Y-poliglutamico con actividad mejorada en soluciones acuosas y un hidrogel que comprende los derivados de acido Y-poliglutamico con una fuerza adhesiva para tejidos necesaria para sellantes de tejidos, para fines medicos y que tiene biodegrabilidad y biocompatibilidad.
Ademas, es otro objeto de la invencion proporcionar un metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico y el hidrogel, un estuche de ensayo para la preparacion del hidrogel y una composicion adhesiva para tejidos que comprende componentes capaces de la formacion del hidrogel.
Los inventores, mientras estudiaban el modo de cumplir las condiciones de formacion de hidrogeles y mantener su actividad durante un cierto periodo de tiempo en un estado de solucion acuosa de cada material, han encontrado que se podria producir un hidrogel con una fuerza adhesiva para tejidos necesaria para sellantes de tejidos para fines medicos y que tiene biodegradabilidad y biocompatibilidad, usando la reaccion reticulante de un derivado de acido Y-poliglutamico cuya produccion en masa esta disponible mediante fermentacion de microbios, y que es un poli-aminoacido biosintetico, posee en sus cadenas laterales grupos carboxilos de los que algunos estan activados y un polimero basado en polietilenglicol que es ampliamente usado como un biomaterial y posee grupos amino o
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grupos tiol en sus cadenas laterales y, por tanto, completaron la invencion. En particular, el derivado de acido y- poliglutamico activado se caracteriza porque es introducido un grupo alquilo en el acido Y-poliglutamico con el fin de minimizar la disminucion de actividad del mismo en sus soluciones acuosas, que es el inconveniente de los acidos y- poliglutamicos directamente activados con grupos succinimido (y-PGA-NHS).
Por lo tanto, en una realizacion de la presente invencion, se proporciona un derivado de acido Y-poliglutamico en el que su grupo carboxilo es modificado para proporcionar terminal de acido alcanoico y un grupo funcional carboxilo nuevamente formado es activado mediante un grupo succinimido hasta al menos algunos grupos carboxilo.
En otra realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico segun una realizacion de la invencion, que comprende una primera etapa de hacer reaccionar al menos algunos grupos carboxilo de un acido Y-poliglutamico con una alcanolamina inferior que tiene de 1 a 5 atomos de carbono para formar un acido Y-poliglutamico-alcanolamina; una segunda etapa de hacer reaccionar un grupo hidroxilo del acido Y-poliglutamico-alcanolamina con un anhidrido de un acido seleccionado entre el grupo que consiste en acido glutarico o acido succinico, o un ester 1-halo-alcanoico seleccionado entre el grupo que consiste en acido 1-halo- valerico, acido 1-halo-propionico y acido 1-halo-metilcarbonico para formar un terminal de acido alcanoico; y una tercera etapa de hacer reaccionar el terminal de carboxilo formado con N-hidroxisuccinimida o N- hidroxisulfosuccinimida para formar un derivado de acido Y-poliglutamico del que al menos algunos grupos carboxilo estan activados.
En todavia otra realizacion de la invencion, se proporciona un hidrogel que comprende una estructura reticulada obtenida reticulando el derivado de acido Y-poliglutamico segun una realizacion de la presente invencion y un polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos.
Ademas, se proporciona en otra realizacion de la invencion un metodo para preparar un hidrogel, que comprende una primera etapa de hacer reaccionar al menos algunos grupos carboxilo de un acido Y-poliglutamico con una alcanolamina inferior que tiene 1 a 5 atomos de carbono para formar un acido Y-poliglutamico-alcanolamina; una segunda etapa de hacer reaccionar un grupo hidroxilo del acido Y-poliglutamico-alcanolamina con un anhidrido de un acido seleccionado entre el grupo que consiste en acido glutarico y acido succinico, o un acido 1-halo-alcanoico seleccionado entre el grupo que consiste en acido 1-halo-valerico, acido 1-halo-propionico y acido 1-halo- metilcarbonico para formar un terminal de acido alcanoico; y una tercera etapa de hacer reaccionar el terminal de carboxilo asi formado con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida para formar un derivado de acido y- poliglutamico del que al menos algunos grupos carboxilo estan activados; y una cuarta etapa de realizar la reaccion de reticulacion del derivado de acido Y-poliglutamico asi activado y un polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos.
Ademas, en todavia otra realizacion de la invencion, se proporciona un estuche de ensayo para la preparacion de un hidrogel y una composicion adhesiva para tejidos, que comprende el derivado de acido Y-poliglutamico segun una realizacion de la invencion y un polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos.
En lo que sigue se describiran en detalle los derivados de acido Y-poliglutamico, los hidrogeles, los metodos para producirlos y los adhesivos para tejidos segun las realizaciones de la invencion.
Con el fin de producir un hidrogel con fuerza adhesiva, es deseable que la reticulacion se produzca a traves de un enlace entre cadenas de polimero que tienen al menos dos grupos funcionales y hacerlas reaccionar unas con otras y al menos uno de los polimeros forma un enlace covalente con la superficie del tejido, de forma simultanea con la reaccion de reticulacion.
Se forma un enlace covalente quimico mediante reaccion entre un electrofilo y un nucleofilo, y el grupo funcional electrofilo se adhiere a los tejidos reaccionando con un grupo amino (-NH2), un grupo tiol (-SH) o un grupo hidroxilo (-OH) presente en los componentes del colageno del tejido biologico. Para estos grupos funcionales electrofilos, se pueden usar grupos aldehido y un grupo ester activado y, por ejemplo, en el caso de la reaccion con grupos amino, la adhesion al tejido se produce a traves de un enlace imino y un enlace amido, respectivamente, de forma simultanea con la reaccion de reticulacion. Se ha puesto de manifiesto que si al menos parte del acido y- poliglutamico es activado para convertirlo en grupos ester succinimido mediante reaccion con cierto compuesto, el acido Y-poliglutamico asi activado se puede gelificar rapidamente (reaccion de reticulacion) con un polimero basado en polietilenglicol que tiene grupos funcionales nucleofilos como un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo a un temperatura ambiente para formar un hidrogel. Por tanto, los hidrogeles son muy adecuados para ser aplicados a
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la adhesion a tejidos porque pueden ser formados in situ en un estado de gel en campos medicos. Ademas, el derivado de acido Y-poliglutamico activado segun una realizacion preferida de la invencion se caracteriza porque se introduce un grupo alquilo en el acido Y-poliglutamico con el fin de minimizar su disminucion de actividad en sus soluciones acuosas, que es el inconveniente de los acidos Y-poliglutamicos directamente activados con succinimidas.
El derivado de acido Y-poliglutamico asf activado que tiene un grupo de acido alcanoico puede formar un hidrogel gelificando rapidamente con un polfmero basado en polietilenglicol que tiene un grupo funcional nucleofilo como un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo a temperatura ambiente. Ademas, el derivado de acido y- poliglutamico activado tiene una estabilidad mejorada en sus soluciones acuosas debido a la adicion de grupos alquilo, sin que sea necesario que se use justo despues de la disolucion y mantiene todavfa el tiempo de gelificacion, resistencia al bombeo y resistencia de la adhesion a su nivel inicial durante dos o mas horas despues de la disolucion. Como los hidrogeles que tienen estas propiedades se pueden adherir a tejidos con una excelente fuerza adhesiva y pueden ser ventajosamente aplicados para la adhesion de tejidos biologicos, pueden eficazmente usados como un sellante de tejidos para fines medicos.
Los derivados de acido Y-poliglutamico y los hidrogeles segun estas realizaciones se explicaran mas en detalle.
Los “hidrogeles” pueden ser definidos para hacer referencia a una matriz polfmera capaz de hincharse y puede tener una estructura reticulada que incluye un enlace covalente y un enlace no covalente. Ademas, estos hidrogeles pueden tener una estructura reticular tridimensional que comprende la estructura reticulada y pueden formar geles elasticos absorbiendo agua.
Los hidrogeles segun una realizacion de la presente invencion comprenden una estructura reticulada obtenida mediante reticulacion de derivados de acido Y-poliglutamico de los que al menos algunos grupos carboxilo han sido activados y polfmeros basados en polietilenglicol que tienen una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos y los derivados de acido Y-poliglutamico pueden ser aquellos en los que son introducidos derivados de esteres de succinimida que contienen grupos alquilo, que resultan introduciendo alcanolaminas inferiores que tienen 1 a 5 atomos de carbono como un conector en al menos algunos grupos carboxilo, haciendo reaccionar los grupos terminales hidroxilo introducidos del conector con anhfdridos alquflicos cfclicos para generar grupos carboxilo en posiciones terminales y activandolos hasta succinimidas.
Las alcanolaminas inferiores que tienen 1 a 5 atomos de carbono usadas como un conector pueden ser, por ejemplo, aminometanol, 1-amino-2-propanol, 1-amino-3-propanol, 1-amino-4-butanol, 1-amino-5-pentanol o monoetanolamina (MEA o 2-aminoetanol) y, preferentemente, pueden ser monoetanolamina.
Los derivados de esteres de succinimida pueden incluir valerato de succinimidilo (SVA:-CH2CH2CH2CH2-CO-NHS), glutarato de succinimidilo (SG: -CO-CH2CH2CH2-CO-NHS), propionato de succimidilo (SPA:-CH2CH2-CO-NHS), succinato de succinimidilo (SS:-CO-CH2CH2-CO-NHS), y succinimidilo carboximetilado (SCM:-CH2-CO-NHS), dependiendo de los tipos de los grupos alquilo introducidos.
Preferentemente, los derivados de acido Y-poliglutamico pueden ser los representados mediante la formula qufmica 1:
imagen1
en la cual,
la suma total de l, m y n es un numero entero de 390 a 15.500, la relacion de l, m y n es l:m:n = 0 a 0,5:0,2 a 0,5:0,2 a 0,8,
L es un conector, M es cada uno independientemente H, un metal alcalino o un metal alcalinoterreo, R es CH2, b es 0 o 1 y c es un numero entero de 1 a 5.
5 El conector es preferentemente -HN-(R)a-O-, y R contenido en el conector es CH2 y a es un numero entero de 1 a 5.
En la formula qufmica 1 anterior, -(CO)b-(R)c-CO- puede ser preferentemente -CH2CH2CH2CH2-CO-, -CO- CH2CH2CH2-CO-, -CH2CH2-CO-, -CO-CH2CH2-CO-, o - CH2-CO-.
Los hidrogeles se pueden gelificar rapidamente mediante una reaccion de reticulacion en sus soluciones acuosas a pH 7,2 ~ 11,0, 37 °C que cae bajo condiciones fisiologicas, y la formacion del gel in situ es posible en organos o 10 tejidos vivos de animales o seres humanos. El tiempo de la reaccion de reticulacion hasta que se convierten en geles, incluso bajo estas condiciones fisiologicas, puede ser en 10 minutos, preferentemente en 2 minutos y mas preferentemente en 30 segundos. Por lo tanto, como los hidrogeles se pueden formar in situ en un estado de gel en los campos medicos para ser aplicados a tejidos biologicos, pueden ser usados eficazmente para la adhesion de tejidos.
15 Una relacion en moles de los grupos ester del derivado de acido Y-poliglutamico activado entre los grupos carboxilo del derivado de acido Y-poliglutamico puede ser preferentemente de 0,10 a 0,99, mas preferentemente de 0,30 a 0,80 y lo mas preferentemente de 0,5 a 0,7. Al ser activado a esta relacion en moles, el tiempo de gelificacion de los hidrogeles puede ser acortado y la fuerza adhesiva y la resistencia para tejidos biologicos pueden ser optimizadas. A medida que aumenta el nivel de activacion, aumentan tambien los puntos de reticulacion que forman una estructura 20 de malla tridimensional de los hidrogeles producidos mediante la reaccion de reticulacion. Por tanto, las resistencias ffsicas de los hidrogeles como la resistencia a la compresion o la resistencia a la traccion son aumentadas, y es aumentada tambien la fuerza adhesiva a los tejidos.
Antes de la activacion, puede ser preparado el acido Y-poliglutamico representado por la formula general 1:
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25 en la cual
n es de 390 a 15.500 y, preferentemente, de 3.900 a 7.800,
M es H, un metal alcalino o alcalinoterreo (por ejemplo, Na, K, Ca o Mg y, preferentemente, Na),
Un peso molecular medio ponderal del acido Y-poliglutamico puede ser preferentemente de 50.000 a 2.000.000 Daltones, mas preferentemente de 50.000 a 1.000.000 Daltones.
30 Si el peso molecular es demasiado elevado, el tiempo de disolucion es demasiado largo, por lo que es inconveniente de usar.
Los polfmeros basados en polietilenglicol que forman una estructura reticulada conjuntamente con los derivados de acido Y-poliglutamico activados segun las realizaciones preferidas de la invencion pueden ser preferentemente aquellos con un grupo amino o un grupo tiol unido a sus terminales. Por ejemplo, estos polfmeros basados en 35 polietilenglicol pueden tener una estructura tal que una unidad repetida de polietilenglicoles este unida a cada grupo hidroxilo de alcoholes dihidroxilados o, mas preferentemente, de 2 a 12 polihidroxilados y un grupo amino, grupo tiol
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o grupo hidroxilo esta unido a sus terminales. Mas particularmente, estos polfmeros basados en polietilenglicoles pueden estar representados por la formula qufmica 2:
|-[(CH2CH2O)n-CH2CH2X]m2
en la que I es un radical derivado de 2 a 12 alcoholes polihidroxilados, en que el atomo de hidrogeno de cada grupo hidroxilo de alcoholes polihidroxilados esta sustituido con -(CH2CH2O)n-CH2CH2 y representa un radical en la forma de un enlace eter con el mismo, X representa un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo, n es de 12 a 170 y m es un numero entero de 2 a 12, que es igual al numero de los grupos hidroxilo de los alcoholes polihidroxilados de los que deriva I.
En la formula qufmica 2 anterior, ejemplos especfficos de I pueden incluir dioles como etilenglicol, propanodiol, butanodiol, pentanodiol, hexanodiol, etc.; o polioles dodecahidroxilados seleccionados entre disacaridos como glicerol, eritritol, treitol, pentaeritritol, xilitol, adonitol, sorbitol, manitol, palatinosa, monohidrato de maltosa r maltitol or trisacaridos como pentahidrato de D-rafinosa. Mas particularmente, el I anterior puede ser un radical derivado de alcoholes de 4 a 12 polihidroxilados.
Un ejemplo de los polfmeros basados en polietilenglicol que caen bajo la categorfa de la formula qufmica 2 anterior puede incluir polfmeros preparados uniendo una unidad repetida de polietilenglicol que tiene grupos funcionales nucleofilos a un radical derivado de pentaeritritol o sorbitol, por ejemplo, un polfmero de formula qufmica 3 o 4 siguientes.
CH20-^CH2CH20^-CH2CH2X
XCH2CH2{oCH2CH2]hOCH2—C—CH20-^CH2CH20^-CH2CH2X
CH20-^CH2CH20^CH2CH2X
imagen3
En las formulas qufmicas 3 y 4 anteriores, X y n son como se definieron en la formula 2 anterior.
Como estos polfmeros basados en polietilenglicol contienen muchos grupos funcionales nucleofilos como grupos amino, grupos tiol o grupos hidroxilo, pueden formar un enlace amido, un enlace tioamido o un enlace ester junto con los derivados de acido Y-poliglutamico activados de formula qufmica 1, y pueden formar una estructura reticulada a partir de los mismos para crear una estructura reticulada y un hidrogel que tiene una estructura reticular tridimensional. En particular, estos polfmeros basados en polietilenglicol pueden realizar una reaccion de reticulacion a velocidad elevada con los derivados de acido Y-poliglutamico activados para proporcionar hidrogeles que tienen un tiempo de gelificacion corto.
Ademas, estos polfmeros basados en polietilenglicol, que son polfmeros biocompatibles tfpicos entre los polfmeros sinteticos, pueden hacer que un hidrogel que contiene su estructura reticulada muestre una biocompatibilidad adecuada para ser aplicada para la adhesion de tejidos, etc. Los polfmeros basados en polietilenglicol pueden ser
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preparados segun cualesquiera metodos ordinarios, por ejemplo, realizando la polimerizacion por adicion de oxidos de etileno y alcoholes polihidroxilados e introduciendo grupos funcionales nucleofilos en los mismos.
Un peso molecular medio ponderal de los polimeros basados en polietilenglicol puede ser de 5.000 a 30.000 Daltones, particularmente de 10.000 a 20.000 Daltones. Si el peso molecular medio ponderal es demasiado pequeno, se aumenta el tiempo de gelificacion requerido para la formacion de la estructura reticulada y los hidrogeles, o la reaccion de gelificacion puede que no se produzca bien. Por el contrario, si el peso molecular de los polimeros basados en polietilenglicol es demasiado grande, se puede deteriorar la biodegradabilidad de la estructura reticulada y los hidrogeles.
En los hidrogeles de una realizacion de la invencion, los grupos funcionales nucleofilos de los polimeros basados en polietilenglicol pueden tener una relacion en moles de 0,1 a 2,0, particularmente de 0,2 a 1,0 y, mas particularmente, de 0,4 a 0,6, con respecto a los grupos carboxilo activados (por ejemplo, grupos de ester succinimido, de los derivados de acido Y-poliglutamico. Con el cumplimiento de esta relacion en moles, los hidrogeles pueden tener una fuerza adhesiva y una resistencia al bombeo excelentes con respecto a tejidos biologicos, y el grado de reticulacion de los hidrogeles puede ser tambien optimizado. Sin embargo, si la relacion en moles es demasiado baja, la resistencia de los hidrogeles se puede hacer debil debido a sus pequenos puntos de reticulacion.
Adicionalmente, segun otra realizacion de la invencion, se proporcionan metodos para producir el derivado de acido Y-poliglutamico anteriormente mencionado y un hidrogel en que son reticulados el derivado de acido Y-poliglutamico y el polimero basado en polietilenglicol.
Preferentemente, el metodo puede incluir una primera etapa de hacer reaccionar al menos algunos de los grupos carboxilo de un acido Y-poliglutamico con una alcanolamina inferior que tenga de 1 a 5 atomos de carbono para formar un acido Y-poliglutamico-alcanolamina; una segunda etapa de hacer reaccionar un grupo hidroxilo del acido Y-poliglutamico-alcanolamina con un anhidrido de un acido seleccionado entre el grupo que consiste en acido glutarico y acido succinico, o un acido 1-halo-alcanoico seleccionado entre el grupo que consiste en acido 1-halo- valerico, acido 1-halo-propionico y acido 1-halo-metilcabonico para formar un terminal de acido alcanoico; y una tercera etapa de hacer reaccionar el terminal carboxilo asi formado con N-hidroxisuccinimida o N- hidroxisulfosuccinimida para formar un derivado de acido Y-poliglutamico del que estan activados al menos algunos grupos carboxilo.
Las etapas 1 a 3 de formar el derivado de acido Y-poliglutamico del que estan activados al menos algunos grupos carboxilo se explicara con referencia a la formula 1 siguiente. La formula de reaccion 1 es un ejemplo de produccion del derivado de acido Y-poliglutamico segun una realizacion de la invencion en la que se usa monoetanolamina (MEA) como un conector, y se forma un terminal de carboxilo al que esta unido un grupo alquilo usando un anhidrido de acido succinico que es seguidamente activado usando NHS.
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Todas las reacciones en las etapas 1 a 3 anteriores se pueden llevar a cabo preferentemente de 0 a 150 °C, 5 preferentemente de 20 a 70 °C y durante un tiempo de reaccion de 0,5 a 35 horas, preferentemente de 5 a 24 horas.
En la primera etapa, como una etapa de introducir un conector para los grupos carboxilo de acidos Y-poliglutamico, el conector puede ser introducido haciendo reaccionar al menos algunos de los grupos carboxilo del acido y- poliglutamico con una alcanolamina inferior que tiene 1 a 5 atomos de carbono para formar un acido Y-poliglutamico- alcanolamina.
10 La alcanolamina inferior que tiene 1 a 5 de carbono puede ser, por ejemplo, aminometanol, 1-amino-2-propanol, 1- amino-3-propanol, 1-amino-4-butanol, 1-amino-5-pentanol o monoetanolamina (MEA o 2-aminoetanol) y, preferentemente, puede ser monoetanolamina.
Preferentemente, las alcanolaminas se pueden hacer reaccionar en presencia de compuestos de tipo carbodiimida como DCC y N-hidroxisuccinimida (o N-hidroxisulfosuccinimida) y los compuestos de tipo carbodiimida y IN- 15 hidroxisuccinimida (o N-hidroxisulfosuccinimida) y alcanolaminas se pueden hacer reaccionar preferentemente en una relacion en moles de 0,1 a 2, mas preferentemente 1 a 2, respectivamente, con respecto a la unidad molar de los grupos carboxilo incluidos en el acido Y-poliglutamico antes de la activacion.
Preferentemente, la primera etapa se puede realizar en disolventes aproticos como DMSO (dimetilsulfoxido), DMF (dimetilformamida) y formamida. No es deseable usar disolventes proticos porque pueden reaccionar con los NHS- 20 esteres activados, o usar otros disolventes organicos comunes porque los materiales de la reaccion son insolubles en ellos.
En la segunda etapa, como una etapa de introduccion de un terminar de acido alcanoico, el terminar carboxilo se puede formar haciendo reaccionar un grupo hidroxilo del acido Y-poliglutamico-alcanolamina formado en disolventes aproticos como formamida, DMF (dimetilformamida) y DMSO (dimetilsulfoxido) con un anhidrido de un acido 25 seleccionado entre el grupo que consiste en acido glutarico y acido succinico haciendolo reaccionar con un acido 1-
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halo-alcanoico seleccionado entre el grupo que consiste en acido 1-halo-valerico, acido l-halo-propionico y acido 1- halo-metilcarbonico.
Preferentemente, el anhidrido de un acido o acido 1-halo-alcanoico se puede hacer reaccionar en una relacion en moles de 3 a 8, mas preferentemente de 4 a 6, con respecto a una unidad molar de las alcanolaminas inferiores introducidas para formar el acido Y-poliglutamico-alcanolamina, con el fin de introducir grupos carboxilo en las acido Y-poliglutamico-alcanolaminas a un 100% en moles.
En la tercera etapa, como una etapa de formar derivados de acido Y-poliglutamico activados, los derivados de acido Y-poliglutamico de formula quimica 1 en la que al menos algunos grupos carboxilo estan activados, se pueden formar haciendo reaccionar el terminal carboxilo asi formado con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida en presencia de compuestos de tipo carbodiimida como diciclohexilcarbodiimida (DCC).
Preferentemente, con respecto a una unidad molar de los grupos carboxilo formados a traves de la reaccion con el anhidrido de un acido o acido 1-halo-alcanoico, los compuestos de tipo carbodiimida pueden ser anadidos en una relacion en moles de 0,1 a 3, mas preferentemente de 1 a 2 y la N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida puede ser anadida en una relacion en moles de 0,1 a 3, mas preferentemente de 1 a 2.
La relacion en moles de los grupos ester de los derivados de acido Y-poliglutamico activados a traves de la tercera etapa puede ser preferentemente de 0,10 a 0,99, mas preferentemente de 0,30 a 0,80 y, lo mas preferentemente, de 0,5 a 0,7, con respecto a los grupos carboxilo del acido Y-poliglutamico antes de la activacion. Con la activacion en esta relacion en moles, el tiempo de gelificacion de los hidrogeles puede ser acortado y pueden ser optimizadas la fuerza adhesiva y la resistencia con respecto a los tejidos biologicos.
Despues de la preparacion de los derivados de acido Y-poliglutamico activados como se describio anteriormente, pueden ser adicionalmente reticulados con polimeros basados en polietilenglicol que tienen una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos para producir una estructura reticulada y un hidrogel.
Por tanto, segun una realizacion preferida de la presente invencion, se proporciona un metodo para preparar un hidrogel que comprende realizar la reaccion de reticulacion del derivado de acido Y-poliglutamico de formula quimica 1 y un polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos. Segun este metodo de preparacion, es posible obtener un hidrogel capaz de formar una estructura reticulada con un tiempo de gelificacion corto incluso en condiciones fisiologicas de aproximadamente temperatura ambiente y, en particular, hace que sea facil el uso de estos hidrogeles para la adhesion a tejidos aplicandolos para un tratamiento medico in situ.
Particularmente, el metodo para preparar el hidrogel puede comprender adicionalmente, con posterioridad a la realizacion de las etapas 1 a 3 de preparar el derivado de acido Y-poliglutamico, una cuarta etapa de realizar la reaccion de reticulacion de los derivados de acido Y-poliglutamico activados y los polimeros basados en polietilenglicol que tienen una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos.
La reaccion de reticulacion de la cuarta etapa se puede realizar en un estado de solucion en el que los derivados de acido Y-poliglutamico activados y los polimeros basados en polietilenglicol se mezclan. Por ejemplo, se puede realizar mezclando en primer lugar una solucion que contiene una solucion de los derivados de acido Y-poliglutamico activados y una segunda solucion que contiene una solucion de los polimeros basados en polietilenglicol.
Cuando se combinan la primera solucion y la segunda solucion, es deseable mezclarlas en concentraciones mutuamente adecuadas con el fin de obtener un gel uniforme. Una densidad de reticulacion puede ser regulada mediante las concentraciones de los polimeros. A medida que aumentan las concentraciones de los polimeros, se hace disminuir tambien la densidad de reticulacion. Sin embargo, en el caso de la primera solucion en la que los derivados de acido Y-poliglutamico activados que tienen un peso molecular mayor que 1.000 KDaltones, su viscosidad comienza a aumentar mas alla de cierta concentracion, haciendo que sea dificil una mezcla uniforme. Si la concentracion de los polimeros es demasiado baja, la resistencia de los geles es debil o la propia formacion del gel se hace dificil debido a su bajo grado de reticulacion.
Por tanto, la concentracion de los polimeros, es decir, la concentracion total de los derivados de acido y- poliglutamico activados y los polimeros basados en polietilenglicol frente a las soluciones totales debe ser preferentemente de 1 a 20% p, mas preferentemente de 5 a 15% p y, lo mas preferentemente, de 8 a 10% p.
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Ademas, una relacion de concentraciones entre los derivados de acido Y-poliglutamico activados y los polimeros basados en polietilenglicol puede ser preferentemente 5~10:10~15 (% p).
Como un disolvente usado para preparar la primera solucion y la segunda solucion, se pueden usar agua destilada y otras soluciones no toxicas como soluciones tamponantes que incluyen una solucion salina fisiologica, bicarbonato de sodio (NaHCO3), acido borico y acido fosforico.
De los disolventes, las soluciones tamponantes afectan al tiempo de gelificacion. Es decir, una reaccion de gelificacion puede producirse o no producirse, o el tiempo de gelificacion puede ser controlado de una forma rapida o lenta, dependiendo de los tipos de las soluciones tamponantes. Las soluciones tamponantes deben ser preparadas usando sales que tengan un pKa similar al pH de los componentes solidos de la primera solucion y la segunda solucion, y cuando se preparan de esta manera, sus efectos tamponantes pueden ser maximizados con el fin de ayudar a reducir una disminucion de la actividad de los derivados de acido Y-poliglutamico activados en soluciones acuosas.
Preferentemente, se puede usar un tampon de fosfato de sodio como una solucion tamponante para preparar la primera solucion. Ademas, se puede usar un tampon de mezcla de fosfato de sodio y carbonato de sodio para preparar la segunda solucion. El tampon de mezcla puede ser de los que tienen fosfato de sodio y carbonato de sodio preferentemente en una relacion en volumen de 1:9 a 9:1.
La solucion tamponante de la primera solucion puede ser usada preferentemente a una concentracion de 0,01 a 0,3 M, mas preferentemente de 0,05 a 0,1 M, y la solucion tamponante de la segunda solucion puede ser usada preferentemente a una concentracion de 0,01 a 0,5 M, mas preferentemente de 0,1 a 0,3 M.
Los componentes solidos de la primera solucion y la segunda solucion pueden ser esterilizados facilmente mediante esterilizacion por radiacion y la esterilizacion se puede realizar preferentemente por radiacion de rayos gamma de 10 a 50 kGy, mas preferentemente una radiacion gamma de 20 a 30 kGy. El tratamiento de esterilizacion se puede llevar a cabo bajo condiciones tales que no tenga efectos adversos sobre el tiempo de gelificacion y otras propiedades fisicas de los hidrogeles.
Cuando la primera solucion y la segunda solucion se mezclan, se forman enlaces de tioamida o ester entre los grupos carboxilo activados (grupos ester succinimido, etc.) de los derivados de acido Y-poliglutamico y los grupos funcionales nucleofilos y se pueden convertir en puntos de reticulacion para hacer posible la formacion de un hidrogel que tenga una estructura reticular tridimensional. Como consecuencia, una reaccion de reticulacion se puede realizar preferentemente de 0 a 50 °C, mas preferentemente de 25 a 40 °C y la reaccion de gelificacion de reticulacion (gelificacion) puede empezar a producirse en 1 s hasta 200 s, preferentemente de 2 s a 100 s y mas preferentemente de 3 s a 50 s desde su mezcla.
Sin embargo, si el tiempo de gelificacion es 2 s o menos, puede hacer que la aplicacion sea dificil una aplicacion suave debido a los taponamientos de las agujas de inyeccion o puntas de pulverizacion, y como el tiempo no es suficiente para mezclar cada componente, se pueden formar geles que no son uniformes, o la formacion de enlaces covalentes a la superficie de los tejidos puede ser dificil, provocando asi una fuerza adhesiva baja. Por el contrario, si el tiempo de gelificacion es demasiado prolongado puede que no sea facil aplicarla porque puede funcionar en la forma de soluciones antes de la formacion de gel en los sitios de aplicacion. Por tanto, es deseable tener 3 s o mas, particularmente no menos de 5 s y no mas de 15 s con el fin de mantener una fuerza adhesiva y una resistencia al bombeo elevadas hasta la penetracion en el tejido biologico.
Como los hidrogeles tienen excelentes propiedades a traves de una gelificacion rapida incluso bajo condiciones fisiologicas como las anteriormente expuestas, pueden ser ventajosamente aplicados para la adhesion a tejidos, etc., en el campo medico. Esta aplicacion se puede hacer usando dispositivos como una jeringuilla de doble cilindro, pero sin estar limitada a la misma.
Los hidrogeles preparados mediante los metodos anteriores pueden ser proporcionados en la forma de una esponja o una lamina, o polvos mediante la realizacion de una liofilizacion, y pueden ser empleados en estas formas para agentes antiadhesivos, absorbentes, para el suministro de farmacos, etc. Ademas, se puede aplicar un estuche de ensayo o una composicion que contenga cada componente para la formacion de los hidrogeles (los derivados de acido Y-poliglutamico activados de formula quimica 1 y los polimeros basados en polietilenglicol) para la adhesion de tejidos biologicos realizando una reaccion de reticulacion y formando asi un hidrogel in situ en el campo medico, como se explicara en detalle con posterioridad. Para la aplicacion a la adhesion a tejidos, una mezcla que contiene
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los derivados de acido Y-poliglutamico activos y los polimeros de polietilenglicol, por ejemplo, se forma una solucion acuosa de mezcla sobre el tejido biologico y, seguidamente, la solucion acuosa asi formada es sometida a una reaccion de reticulacion para formar un hidrogel, que puede formar revestimientos sobre el tejido biologico.
Segun otra realizacion de la invencion, se proporciona un estuche de ensayo para la preparacion de los hidrogeles anteriormente mencionados. Este estuche de ensayo para la preparacion de los hidrogeles puede comprender los derivados de acido Y-poliglutamico de formula quimica 1 de los que al menos algunos grupos carboxilo estan activados y los polimeros basados en polietilenglicol que tienen una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos, como se describio anteriormente.
Como se explico con anterioridad, los hidrogeles segun una realizacion pueden ser obtenidas a una velocidad de gelificacion elevada incluso bajo condiciones fisiologicas. Estos hidrogeles, en la forma de un estuche de ensayo o una composicion antes de su gelificacion, que comprende cada componente de su formacion, pueden ser aplicados para la adhesion a tejidos, etc. Por ejemplo, despues de que el estuche de ensayo o composicion que comprende cada componente es aplicado a tejidos biologicos, se produce la gelificacion sobre el tejido biologico para hace posible la formacion de un hidrogel y exhibir la funcion de adhesion al tejido. Para estas aplicaciones, puede ser usado un estuche de ensayo segun otra realizacion.
Segun ejemplos especificos, el estuche de ensayo para la preparacion de hidrogeles puede incluir una primera solucion que contiene una solucion acuosa de los derivados de acido Y-poliglutamico activados y una segunda solucion que contiene una solucion acuosa de los polimeros que tienen grupos funcionales nucleofilos. El estuche de ensayo puede ser usado mezclando las soluciones acuosas de la primera solucion y la segunda solucion y, especialmente, se caracteriza por tener una fuerza adhesiva para tejidos mezclando la primera solucion y la segunda solucion y formando in situ el hidrogel.
Cuando se va a usar este sellante de tipo reaccion de dos soluciones, la mezcla y el uso de la primera solucion y la segunda solucion se puede llevar a cabo mediante diversos metodos. Por ejemplo, la mezcla se puede llevar a cabo aplicando uno de los concentrados de la primera solucion y la segunda solucion a la superficie de un objeto que va a ser revestido y aplicando continuamente la otra, o se puede llevar a cabo mezclando la primera solucion y la segunda solucion en un aplicador, como una jeringuilla de doble cilindro, y aplicandolas seguidamente. Si se desea, se puede usar para fines de antiadhesion como una lamina que consiste en una resina en estado de gel ademas del uso como un sellante. Una relacion de mezcla (relacion en volumen) de la primera solucion y la segunda solucion se ajusta habitualmente de 0,5 a 2,0 (la relacion de la segunda solucion frente a la primera solucion; su proporcion inversa es la misma).
Segun otra realizacion de la invencion, se proporciona una composicion adhesiva para tejidos usando los hidrogeles descritos con anterioridad. Como se ilustro en lo que antecede, los hidrogeles pueden ser usados preferentemente para la adhesion a tejidos biologicos en la forma de una composicion antes de su gelificacion, que comprende cada componente para su formacion. Por tanto, una realizacion de la composicion adhesiva para tejidos puede comprender cada componente para la preparacion del hidrogel, por ejemplo, el derivado de acido Y-poliglutamico de formula quimica 1 del que al menos algunos grupos hidroxilo estan activados y el polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos.
La composicion de una realizacion que comprende el derivado de acido Y-poliglutamico del que al menos algunos grupos carboxilo estan activados y el polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad de grupos funcionales nucleofilos puede ser aplicada en el cuerpo a un intervalo de temperaturas de 25 a 40 °C, por ejemplo, proxima a las condiciones fisiologicas, y cuando estan siendo mezclados la gelificacion se puede producir en 10 minutos, particularmente en 2 minutos y, mas particularmente, en 5 a 30 segundos para formar un hidrogel. Por tanto, como estas composiciones se pueden gelificar en un tiempo corto despues de ser aplicadas a tejidos biologicos y seguidamente adheridas a los tejidos, preferentemente, es posible su aplicacion in situ en campos medicos.
Como los metodos de aplicacion de las composiciones adhesivas para tejidos son los mismos que se explicaron en el estuche de ensayo para la preparacion de hidrogeles, no se proporcionara una descripcion adicional de los mismos.
Las composiciones adhesivas para tejidos pueden ser aplicadas para diversas aplicaciones como una sutura topica para heridas, gastroenterostomia, anastomosis vascular y cirugia oftalmologica.
Como los derivados de acido Y-poliglutamico preparados mediante el uso de los mismos segun la presente invencion pueden mantener sus actividades en su estado de solucion acuosa durante un cierto tiempo, las soluciones no necesitan ser usadas directamente despues de su preparacion. Pueden formar geles instantaneamente en la zona de la herida, tienen una fuerza adhesiva para tejidos biologicos excelente, suprimiendo asi las perdidas de sangre o 5 aire, son degradables en cuerpos vivos y, por tanto, son absorbidos o secretados y no tienen toxicidad para el cuerpo vivo. Ademas, el tiempo de gelificacion puede ser tambien controlado y regulado a un nivel deseado.
Por lo tanto, los hidrogeles pueden ser ventajosamente usados para diversas aplicaciones que incluyen la adhesion a tejidos biologicos.
Breve descripcion de los dibujos
10 La Fig. 1 es un grafico que muestra la estabilidad de los derivados de acido Y-poliglutamico activados en soluciones acuosas a traves del cambio de la resistencia al bombeo de los geles segun el transcurso del tiempo despues de la disolucion.
La Fig. 2 es un grafico que muestra la capacidad de hinchamiento del hidrogel preparado mediante la reaccion de reticulacion del derivado de acido Y-poliglutamico activado y el polietilenglicol segun la temperatura y el tiempo de 15 inversion (Ejemplo 1).
La Fig. 3 es un grafico que muestra la degradacion del hidrogel preparado mediante la reaccion de reticulacion del derivado de acido Y-poliglutamico activado y el polietilenglicol.
La Fig. 4 muestra el espectro 1H RMN con respecto al contenido de NHS sustituido con el SS-PGA activado segun el Ejemplo Experimental 1 de la invencion.
20 La Fig. 5 muestra el espectro 1H RMN con respecto al contenido de NHS sustituido con el SG-PGA activado segun el Ejemplo Experimental 1 de la invencion.
Descripcion detallada de las realizaciones
En lo que se sigue se explicara la invencion mas en detalle a traves de ejemplos. Sin embargo, debe apreciarse que estos ejemplos estan destinados meramente a ilustrar la invencion.
25 Ejemplo de Preparacion 1: Preparacion de SS-PGA activado
Ejemplo de Preparacion 1.1: Preparacion de y-PGA-MEA mediante la introduccion de un conector a y-PGA
A un matraz de vidrio redondo de dos bocas de 1.000 ml seco se anadieron 100 mmol (12,9 g) de acido y- poliglutamico (PGA, peso molecular 50K, 500K, 1000K, y 2000K Da) sobre la base de unidades de carboxilo y 650 ml de dimetilsulfosido (DMSO), que seguidamente se agitaron a 60 °C durante 16 horas de forma que se disolvieran 30 uniformemente y seguidamente la temperatura de la solucion de reaccion se disminuyo hasta temperatura ambiente (25 °C). Se midieron N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 2 sobrepesos equivalentes, respectivamente, con respecto a las unidades carboxilo del acido Y-poliglutamico y se midio bicarbonato de sodio en la misma relacion en moles que el acido Y-poliglutamico y, seguidamente, se anadieron y se agitaron bajo presion reducida para eliminar la humedad. Despues de una hora, se hicieron reaccionar bajo una atmosfera de nitrogeno 35 durante 3 horas. Despues de completarse la reaccion, se anadio se midio monoetanolamina (MEA) medida en 2 sobrepesos equivalentes con respecto a las unidades carboxilo del acido Y-poliglutamico y seguidamente se hicieron reaccionar durante 1 hora.
Despues de completarse la reaccion, la solucion de reaccion se filtro y al mismo tiempo se precipito en 4 l de acetato de etilo (EA) para eliminar bicarbonato de sodio y la urea producida. Despues de la eliminacion completa de la NHS 40 y DCC sin reaccionar lavando dos veces con EA, se secaron en una estufa a vacio durante 16 horas o mas con el fin de eliminar disolventes residuales. Por tanto, se obtuvieron finalmente compuestos de acido Y-poliglutamico (yPGA- MEA) en los que se introdujo el conector.
Ejemplo de Preparacion 1.2: Preparacion de S-PGA (PGA succinado) mediante introduccion de un grupo de acido alcanoico en el terminal conector
A un matraz de fondo redondeado de dos bocas de 100 ml seco se anadieron 100 mmol (18,3 g) de g-PGA-MEA preparado en el Ejemplo de Preparacion 1.1 anterior, sobre la base de unidades hidroxilo y 450 ml de dimetilsufoxido (DMSO), que seguidamente se agitaron a temperatura ambiente (25 °C durante 2 horas de forma que se disolvieran uniformemente y seguidamente se midio anhidrido succinico (SA) en 6 sobrepesos equivalentes con respecto a las 5 unidades hidroxilo de y-PGA-MEA y se midio bicarbonato de sodio en un nivel 1/2 con respecto a los moles de SA y seguidamente se anadieron y se agitaron bajo una presion reducida para eliminar la humedad. Despues de una hora, se hicieron reaccionar bajo atmosfera de nitrogeno durante 24 horas.
Despues de completarse la reaccion, la solucion de reaccion se filtro para eliminar bicarbonato de sodio y seguidamente se precipito en 2,7 l de acetato de etilo (EA). Despues de completar la eliminacion del SA sin 10 reaccionar lavando dos veces con EA, se secaron en una estufa a vacio durante 16 horas o mas con el fin de eliminar disolventes residuales.
Ejemplo de Preparacion 1.3: Preparacion de SS-PGA activado (succinidimidil-succinil-PGA)
A un matraz de vidrio redondo de dos bocas de 1.000 ml seco se anadieron 100 mmol (27,28 g) de S-PGA preparado en el Ejemplo de Preparacion 1.2 anterior sobre la base de unidades carboxilo y 700 ml de 15 dimetilsulfoxido (DMSO), que seguidamente se agitaron a temperatura ambiente (25 °C durante 2 horas de forma que se disolvieran uniformemente y seguidamente se midieron N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) en las relaciones en moles descritas en la Tabla 1 posterior, respectivamente con respecto a la unidad en moles de grupos carboxilo formados a traves de la reaccion de SA y seguidamente se anadieron y se agitaron bajo una presion reducida para eliminar la humedad. Despues de una hora, se hicieron reaccionar bajo atmosfera de 20 nitrogeno durante 24 horas.
Despues de completarse la reaccion, la solucion de reaccion se filtro para eliminar la urea producida y seguidamente se precipito en 5,6 l de acetato de etilo (EA). Despues de la eliminacion completa de la NHS y DCC sin reaccionar lavando dos veces con EA, se secaron en una estufa a vacio durante 3 horas y seguidamente se secaron nuevamente durante 72 a una temperatura que se aumento hasta 60 °C, con el fin de eliminar disolventes 25 residuales. Por tanto, se obtuvieron finalmente compuestos de esteres de SS-PGA activados.
Ejemplo de Preparacion 2: Preparacion de SG-PGA activado
Ejemplo de Preparacion 2.1: Preparacion de G-PGA (PGA glutarilado)
A un matraz de vidrio de fondo redondeado de dos bocas de 1.000 ml seco se anadieron 100 mmol (18,3 g) de y- PGA-MEA preparado en Ejemplo de Preparacion 1.1 anterior sobre la base de unidades hidroxilo y 450 ml de dimetil 30 sulfosido (DMSO), que seguidamente se agitaron a temperatura ambiente (25 °C) durante 2 horas, de forma que se disolvieran uniformemente y seguidamente se midio anhidrido glutarico (GA) en 6 sobrepesos equivalentes con respecto a las unidades hidroxilo de y-PGA-MEA y se midio bicarbonato de sodio en un nivel de 1/2 con respecto a los moles de GA y seguidamente se anadieron y se agitaron bajo una presion reducida para eliminar la humedad. Despues de 1 hora se hicieron reaccionar bajo atmosfera de nitrogeno durante 24 horas.
35 Despues de completarse la reaccion, la solucion de reaccion se filtro para eliminar bicarbonato de sodio y seguidamente se precipito en 2,7 l de acetato de etilo (EA). Despues de completarse la eliminacion de GA sin reaccion lavando dos veces con EA, se secaron en una estufa a vacio durante 16 horas o mas, con el fin de eliminar disolventes residuales.
Ejemplo de Preparacion 2.2: Preparacion de PSG-PGA activado (succinimidil-glutaril-PGA)
40 A un matraz de vidrio de fondo redondeado de dos bocas de 1.000 ml seco se anadieron 100 ml (27,28 g) de G-PGA preparado en el Ejemplo de Preparacion 2.1 anterior sobre la base de unidades carboxilo y 700 ml de dimetilsulfosido (DMSO), que seguidamente se agitaron a temperatura ambiente (25 1°C) durante 2 horas de forma que se disolvieran uniformemente y seguidamente se midieron N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) en las relaciones en moles descritas en la Tabla 1 posterior, respectivamente, con respecto a la unidad molar 45 de grupos carboxilo formados a traves de la reaccion de GA y seguidamente se anadieron y se agitaron bajo una presion reducida para eliminar la humedad. Despues de una hora, se hicieron reaccionar bajo atmosfera de nitrogeno durante 24 horas.
Despues de completarse las reaccion, la solucion de reaccion se filtro para eliminar la urea producida y
5
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seguidamente se precipito en 5,6 l de acetato de etilo (EA). Despues de completar la reaccion de NHS y DCC sin reaccionar lavando dos veces con EA, se secaron en una estufa a vacfo durante 3 horas y seguidamente se secaron nuevamente durante 72 a una temperatura aumentada hasta 60 °C con el fin de eliminar disolventes residuales. Asf, se obtuvieron finalmente compuestos de esteres de SG-PGA activados.
Ejemplo Experimental 1: Medicion del contenido de NHS sin sustituir
El contenido de NHS sin sustituir en el SS-PGA activado y el SG-PGA activado preparados segun los Ejemplos de Preparacion 1 y 2 anteriores se midieron RMN como se ilustra en la Tabla 1 siguiente y en la Fig. 4 (SS-PGA) y Fig. 5 (SG-PGA). En particular, se obtuvo en forma de una relacion del valor integral de -CH2- (2,8 ppm) de N- hidroxisuccinimida (NHS) unida con respecto al valor integral de -CH2- (2,05 ppm) de y-PGA medido en 1H RMN (disolvente D2O).
Tabla 1
Relacion de introduccion de NHS de y-PGA segun el aporte de NHS y DCC
N2
Peso molecular medio ponderal de y-PGA (kDa) [NHS]/[COOH] [DCC]/[COOH] Contenido de NHS sin sustituir (% en moles)
T-1
50 2,0 2,0 65
T-2
1.000 1,0 1,0 35
T-3
1.000 1,5 1,5 53
T-4
1.000 2,0 2,0 64
T-5
1.000 3,0 3,0 81
T-6
1.000 4,0 4,0 84
Con referencia a la Tabla 1 anterior, cuando la reaccion se realizo durante 24 horas a temperatura ambiente, el grado de sustitucion de NHS aumentaba en proporcion a las cantidades de NHS y DCC, independiente del peso molecular medio ponderal de y-PGA. Sin embargo, solamente un 80% en moles aproximadamente de los grupos carboxilo totales fueron sustituidos incluso cuando se hicieron reaccionar cantidades en exceso de NHS y DCC de mas de 3 equivalentes con respecto a los grupos carboxilo.
Ejemplos 1 a 6: Preparacion de hidrogeles segun las concentraciones de derivados de acido Y-poliglutamico activado y polfmeros basados en polietilenglicol
Los derivados de acido Y-poliglutamico activados (SS-PGA) sintetizados siguiendo las condiciones de T-1 de la Tabla 1 y PEG-SH de 4 brazos que tiene un peso molecular de 20 kDa fueron sometidos a una reaccion de reticulacion (Ejemplos 1 a 3). Ademas, el SS-PGA sintetizado siguiendo las condiciones de T-4 de la Tabla 1 y PEG- SH de 4 brazos que tiene un peso molecular de 20 kDa fueron sometidos a una reaccion de reticulacion (Ejemplos 4 a 6).
La solucion acuosa de SS-PGA (primera solucion) se formulo disolviendo SS-PGA en 1 ml de solucion acuosa de fosfato de sodio 0,05 M segun las cantidades expuestas en la Tabla 2. Analogamente, se formulo solucion acuosa de PGA-SH de 4 brazos (segunda solucion) disolviendo PGE-SH de 4 brazos en 1 ml de una mezclan 0,3 M de fosfato de sodio/carbonato de sodio (5:5) en solucion acuosa segun las cantidades expuestas en la Tabla 2. Se recogieron 0,5 ml de cada una de la primera solucion y la segunda solucion en una jeringuilla de 1 ml de volumen. Se equiparon 2 jeringuillas para una jeringuilla de cilindro doble de forma que se pudiera mezclar previamente en un pulverizador.
Tabla 2
Condiciones de la reaccion de reticulacion de SS-PGA (solucion tamponante: solucion acuosa de fosfato de sodio 0,05 M y polimero basado en polietilenglicol (solucion tamponante: solucion acuosa 0,3 M de mezcla P/C)
N2
Peso molecular medio ponderal de y-pga (kDa) Concentracion de SS-PGA (primera solucion) (%) Polimero basado en polietilenglicol Concentracion de polimero basado en polietilenglicol (%)
Tipo
Peso molecular (kDa)
Ej. 1
50 7 4-PEG-SH 20 12
Ej. 2
50 7 4-PEG-SH 20 10
Ej. 3
50 6 4-PEG-SH 20 10
Ej. 4
1.000 8 4-PEG-SH 20 12
Ej. 5
1.000 10 4-PEG-SH 20 10
Ej. 6
1.000 12 4-PEG-SH 20 10
Ejemplos 7-16: Preparacion de hidrogeles segun los tipos de polimeros basados en polietilenglicol
Los derivados de acido Y-poliglutamico activados (SS-PGA) sintetizados siguiendo las condiciones de T-4 de la Tabla 1 y polimeros basados en polietilenglicol se sometieron a una reaccion de reticulacion. Se formulo una solucion acuosa de SS-PGA (primera solucion) disolviendo SS-PGA en 1 ml de solucion acuosa 0,05 M de fosfato 5 de sodio segun las cantidades expuestas en la Tabla 3. Analogamente, se formulo una solucion acuosa (segunda solucion) disolviendo polimero basado en polietilenglicol en 1 ml de solucion acuosa 0,3 M de mezcla de fosfato de sodio de carbonato de sodio segun las cantidades expuestas en la Tabla 3. Se recogieron 5 ml de cada una de la primera solucion y segunda solucion en una jeringuilla de 1 ml de volumen. Se equiparon dos jeringuillas para una jeringuilla de cilindro doble de forma que pudieran ser previamente mezclados en un pulverizador.
10 Tabla 3
Condiciones de la reaccion de reticulacion de SS-PGA (solucion tamponante: solucion acuosa de fosfato de sodio 0,05 M y polimero basado en polietilenglicol (solucion tamponante: solucion acuosa 0,3 M de mezcla P/C)
N2
Peso molecular medio ponderal de Y-PGA (kDa) Concentracion de SS-PGA (primera solucion) (%) Polimero basado en polietilenglicol Concentracion de polimero basado en polietilenglicol (%)
Tipo
Peso molecular (kDa)
Ej. 7
1.000 10 2-PEG-NH2 10 10
Ej. 8
1.000 10 2-PEG-NH2 20 10
Ej. 9
1.000 10 4-PEG-NH2 20 10
Ej. 10
1.000 12 4-PEG-NH2 20 10
Ej. 11
1.000 12 4-PEG-SH 10 6
Ej. 12
1.000 12 4-PEG-SH 10 1
Ej. 13
1.000 12 6-PEG-SH 10 2
Ej. 14
1.000 10 6-PEG-SH 10 2
Ej. 15
1.000 12 6-PEG-SH 20 4
Ej. 16
1.000 12 6-PEG-SH 20 8
Ejemplo Experimental 2. Medicion del tiempo de gelificacion
5
10
15
20
25
Se recogieron 0,5 ml de la primera solucion de reaccion y la segunda solucion de reaccion preparadas segun los Ejemplos 1 a 16 cada una en una jeringuilla de 1 ml y seguidamente las dos soluciones se mezclaron usando un agitador magnetico en una placa de cultivo de celulas de 24 pocillos hecha de poliestireno transparente. Se agitaron usando una barra agitadora que tenia un diametro de 4 mm y una longitud de 12 mm a una velocidad de 500 rpm a temperatura ambiente, y se midio el tiempo inmediatamente despues de que se anadieron la primera solucion de reaccion y la segunda solucion de reaccion hasta que se detuvo la barra agitadora, usando un cronometro. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Tiempo de gelificacion de SS-PGA y derivados de polietilenglicol
N2
Tiempo de gelificacion (s)
Ej. 1
5
Ej. 2
7
Ej. 3
7
Ej. 4
8
Ej. 5
5
Ej. 6
2
Ej. 7
N/G
Ej. 8
N/G
Ej. 9
4
Ej. 10
5
Ej. 11
4
Ej. 12
30
Ej. 13
25
Ej. 14
21
Ej. 15
10
Ej. 16
1
Las reacciones de reticulacion de los derivados de acido Y-poliglutamico activados y los polimeros basados en polietilenglicol no mostraron una gran diferencia en tiempos de gelificacion, independientemente de los pesos moleculares de acidos Y-poliglutamicos, porque los grados de sustitucion de NHS fueron similares y tenian un tiempo de gelificacion de 5 segundo aproximadamente. Bajo condiciones identicas, a medida que aumentaba la concentracion de polimeros totales, disminuia el tiempo de gelificacion.
Ademas, en los Ejemplos 7 y 8 en los que se uso 2-PEG-NH2 como polimero basado en polietilenglicol, no se produjo una reaccion de gelificacion independientemente del peso molecular de PEG en 10 minutos. Ademas, en los Ejemplos 13 a 16 en los que la reaccion de reticulacion se realizo con respecto a PEG-6H de 6 brazos, como los grupos de reaccion por unidad de PEG son mas que PEG-SH de 4 brazos, se produjo una gelificacion rapida a una concentracion relativamente baja. Sin embargo, si la concentracion de PEG-SH de 6 brazos se aumentaba, los geles se formaban de manera no uniforme debido a una gelificacion demasiado rapida, como se expuso con anterioridad.
Ejemplo Experimental 3. Medicion de la resistencia al bombeo
La medicion de la resistencia al bombeo se llevo a cabo mediante metodos expuestos en la Norma ASTM2392. Se recogieron en una jeringuilla 0,35 ml de la primera solucion de reaccion y de la segunda solucion de reaccion preparadas segun los Ejemplos 1 a 16. Se lavo una envoltura de colageno dos veces en agua y etanol, respectivamente para eliminar la glicerina que estaba extendida sobre la envoltura de colageno y seguidamente se corto en 3x3 cm y se perforo un orificio de 3 mm usando un punzon para biopsia de piel, con el fin de ser usado como un producto de sustitucion de tejido. Posteriormente la envoltura de colageno que tenia un orificio de 3 mm se fijo usando teflon como un soporte. Despues de eso, se mezclaron 0,3 ml de cada una de la primera solucion de
reaccion y la segunda solucion de reaccion usando una jeringuilla de doble cilindro para producir un volumen de la solucion de reaccion que era de 0,6 ml, que fue seguidamente aplicado al orificio de la envoltura de colageno y se dejo en reposo durante 5 minutos para que se endureciera. Seguidamente, despues de que la envoltura de colageno a la que se aplico la solucion de reaccion mezclada se separo del soporte de teflon, se fijo a una maquina medidora 5 de la resistencia al bombeo fabricada mediante los metodos expuestos en la norma ASTM2392. La presion hidraulica medida cuando se rompieron los geles endurecidos fue usada como resistencia al bombeo. Ademas, para fines de comparacion, se llevo a cabo el mismo ensayo con respecto a pegamento de fibrina (Beriplast®’ CSL Behring). Los resultados de la resistencia del bombeo de los hidrogeles se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Resistencia al bombeo de SS-PGA y derivados de polietilenglicol
N2
Resistencia al bombeo (mm de Hg)
Ej. 1
191,5
Ej. 2
180
Ej. 3
165
Ej. 4
105
Ej. 5
180
Ej. 6
137
Ej. 7
N/G
Ej. 8
N/G
Ej. 9
240
Ej. 10
220
Ej. 11
118
Ej. 12
58
Ej. 13
80
Ej. 14
84
Ej. 15
148
Ej. 16
30
Beriplast®
105
10 A. Efectos segun las concentraciones de polimeros de acido Y-poliglutamico
El mantenimiento de la resistencia al bombeo hasta un cierto nivel esta afectado por las concentraciones de los polimeros de acido Y-poliglutamico activados. En los Ejemplos 2, 3, 5 y 6 en los que se usaron polimeros de PEG- SH de 4 brazos identicos a diversas concentraciones, a medida que se aumentaban las concentraciones de polimeros de y-PGA, aumento tambien su resistencia al bombeo. Sin embargo, si la concentracion de polimeros de 15 y-PGA era de 10% o mas, la resistencia al bombeo no aumento mas y si era de 12%, en lugar de ello, se redujo su
resistencia al bombeo. Esto es porque la concentracion demasiado elevada de polimeros condujo a un aumento de la viscosidad y, consecuentemente, la primera solucion y la segunda solucion no consiguieron formar un gel uniforme cuando se mezclaron.
Tambien, cuando la concentracion total de polimeros era de 9 a 10%, mostro la resistencia al bombeo mas elevada.
20 Ademas de ello, incluso aunque la concentracion total de los polimeros se hiciera de 10% aproximadamente aumentando la concentracion de polimeros de PEG-SH de 4 brazos, la resistencia al bombeo medida era baja si las concentraciones de polimeros de acido Y-poliglutamico se disminuian hasta 6% con respecto al peso molecular 50 K, o hasta 8% o menos con respecto a 1.000 K (veanse los Ejemplos 3 y 4).
B. Efectos segun las concentraciones de polimeros basados en polietilenglicol
5
10
15
20
25
30
35
En los Ejemplos 1 y 2 y Ejemplos 11 y 12, cuando se produjeron los hidrogeles solamente variando las concentraciones de los polfmeros basados en polietilenglicol bajo las mismas condiciones, su resistencia al bombeo aumento en proporcion a las concentraciones de los polfmeros basados en polietilenglicol.
Cuando se uso 6-PEG-SH como polfmero basado en polietilenglicol, como tiene mas grupos de reaccion por unidad de PEG que el PEG-SH de 4 brazos, pudo formar un gel uniforme a una concentracion inferior, pero la concentracion total de los polfmeros totales era baja, provocando asf menos puntos de reticulacion y, por tanto, mostro una resistencia al bombeo inferior a la reaccion de gelificacion con PEG-SH de 4 brazos. Ademas, si la concentracion de PEG-SH de 6 brazos era demasiado elevada (Ejemplo 6), se midio una resistencia al bombeo muy baja porque se formo un gel no uniforme debido a una gelificacion demasiado rapida de no mas de 1 segundo y, por el contrario, si la concentracion es demasiado baja, provoco que se formara un gel debil debido a unos puntos de reticulacion insuficientes.
C. Efectos segun los tipos de polfmeros
En los Ejemplos 5 y 9 y Ejemplos 6 y 10, en los que las concentraciones de y-PGA y polfmeros de polietilenglicol y el peso molecular de y-PGA fueron los mismos y los tipos de polfmeros basados en polietilenglicol se variaron como 4- PEG-SH y 4-PEG-NH2, respectivamente, los Ejemplos 9 y 10 preparados usando 4-PEG-NH2 mostraron una resistencia al bombeo mayor que los Ejemplos 5 y 6 en los que se uso 4-PEG-SH. Aparte de esto, tenfan la resistencia al bombeo mas elevada entre el conjunto de hidrogeles segun los Ejemplos 1 a 16.
Sin embargo, como se expuso en el apartado A, en el caso de los Ejemplos 6 y 10 en los que la concentracion de y- PGA era de 12%, mostraron resistencias al bombeo inferiores a los Ejemplos 5 y 9 en los que la concentracion de y- PGA era de 10%. Esto es porque la concentracion demasiado elevada de los polfmeros condujo a un aumento de la viscosidad y, consecuentemente, la primera solucion y la segunda solucion no consiguieron formar un gel uniforme cuando se mezclaron.
Ejemplo Experimental 4. Medicion de la resistencia de la adhesion
Se retiro una capa de grasa de piel de cerdo usando un bisturf y la piel se corto hasta 1x5 cm. Usando una jeringuilla de doble cilindro, se aplico 0,10 ml de cada una de la primera y la segunda soluciones a un lado de la dermis de la capa de piel. Inmediatamente se coloco la otra muestra de piel sobre la primera capa para conseguir un area de union de 1x1 cm2. Se aplico un peso de 50 g a las mismas y se dejo en reposo durante 10 minutos de forma que el gel se endureciera. Cuando transcurrieron 10 minutos, el peso se retiro y seguidamente se proporciono una fuerza de cizallamiento a la piel de cerdo acoplada o envoltura de colageno a una velocidad de 100 mm/minuto usando un dispositivo de ensayo de la traccion (H5K-T, Hounsfield Co.) hasta que se separaron una de otra. Un peso cargado cuando se produce la separacion se define como la resistencia de la adhesion. Ademas, para fines de comparacion, se llevo a cabo un ensayo identico con respecto a pegamento de fibrina (Beriplast®, CSL Behring). Los resultados de la resistencia de la adhesion de los hidrogeles se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6
Resistencia de la adhesion del SS-PGA y derivados del polietilenglicol
N2
Resistencia de la adhesion (gf/cm2)
Ej. 5
398
Ej. 6
148
Ej. 10
238
Ej. 14
65
Ej. 15
196
Beriplast®
92
La resistencia de la adhesion mostro un modelo similar a la resistencia al bombeo. Cuando el tiempo de gelificacion es de 5 segundos aproximadamente, la gelificacion entre los dos materiales, se produjo la resistencia a la gelificacion de los materiales al mismo tiempo, estaban unidos a la envoltura de colageno y, por tanto, se midio una resistencia de la adhesion de aproximadamente 400 gf/cm2. Sin embargo, si la gelificacion demasiado rapida, se midio una resistencia de la adhesion baja porque no hubo tiempo suficiente para la union a la envoltura de colageno.
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo Experimental 5. Tiempo de vida en recipiente en solucion acuosa
El tiempo en recipiente de SS-PGA en soluciones acuosas se ensayo midiendo la resistencia al bombeo segun el transcurso del tiempo despues de su disolucion. Despues de la disolucion de SS-PGA su solucion se dejo en reposo a temperatura ambiente durante un tiempo predeterminado.
Las resistencias al bombeo se midieron en un intervalo de 20 minutos hasta 2 horas justo despues de la preparacion de la primera solucion de reaccion y los resultados de vida en recipiente de SS-PGA en tampon se muestran en la Fig. 1.
Como se muestra en la Fig. 1, la vida en recipiente de SS-PGA segun los Ejemplos 1 a 5 en soluciones acuosas mejoro considerablemente, en comparacion con el acido Y-poliglutamico directamente activado con grupos succinimido (y-PGA-NHS producidos segun el Ejemplo de Preparacion T-12 de la solicitud de patente coreana n° 102010-0138189 de los mismos inventores (peso molecular del PGA 1.000 K ([NHS]/[COOH]=1,2, [DCC]/[COOH]=1,5, tiempo de reaccion 3 horas)). En el caso de PGA-NHS en soluciones acuosas, la NhS de desactivo rapidamente y la resistencia al bombeo de su hidrogel se redujo hasta 30 mm de Hg en 40 minutos, que era un 20% del nivel inicial (150 mm de Hg), mientras que el SS-PGA del Ejemplo 1 mantuvo su actividad durante 2 horas.
Ejemplo Experimental 6. Modulo elastico de hidrogeles
El modulo elastico (o modulo de almacenamiento) de los hidrogeles preparados en el Ejemplo 1 anterior con respecto a su relacion de cizallamiento se midio usando un reometro (ARES-G2, TA Instrument Co). Se aplicaron 0,7 ml de cada una de la primera solucion de reaccion y segunda solucion de reaccion a una placa del reometro (diametro 2 cm, intervalo 1,13 mm) usando una jeringuilla de doble cilindro equipada con una aguja de inyeccion y su orificio de eyeccion, con lo que no habia especio vacio alguno y seguidamente se dejaron en reposo 5 minutos a temperatura ambiente para que se endurecieran. Bajo las condiciones de una relacion de tension de 20%, cuando el modulo de almacenamiento se midio a relaciones de tension de 0,10 radianes/s aumentadas hasta 100 radianes/s, exhibio un modulo de almacenamiento de 1,03x105 dinas/cm2 a una relacion de cizallamiento baja de 0,10 radianes/s y 1,12 dinas/cm2 a una relacion de cizallamiento de 100 radianes/s.
Ejemplo Experimental 7. Ensayo de hinchamiento
Con el fin de investigar la capacidad de hinchamiento de hidrogeles in situ de la invencion, se sumergieron discos de hidrogeles que tenian un peso de 2 g, preparados en el Ejemplo 1, en PBS (pH 7,4) y seguidamente se almacenaron en un refrigerador a 4 °C y un bano de agua a 37 °C, respectivamente, durante 1 a 7 dias. La capacidad de hinchamiento se calculo mediante la formula de calculo 1 siguiente y los resultados segun la temperatura de inmersion y el tiempo se muestran en la Fig. 2.
[Formula de calculo 1]
Capacidad de hinchamiento = Wt/W0
(Wt: peso de hidrogeles despues de una inmersion de t horas, W0: peso de los hidrogeles iniciales)
A 0 °C, mostro una capacidad de hinchamiento constante, pero en el caso la inmersion a 37 °C, mostro una tendencia constantemente creciente. Esto se puede explicar por la degradacion de los polimeros reticulados por hidrolisis.
Ejemplo Experimental 8. Ensayo de degradacion in vitro
Con el fin de observar el comportamiento de degradacion del hidrogel, se preparo 1 g de hidrogel segun el Ejemplo 5 que se puso en 50 ml de PBS y se sumergio en un bano aislado de 37 °C y 47 °C, y 50 rpm durante un cierto periodo de tiempo (1 a 5 semanas, intervalo de 1 semana), y los resultados de la observacion se muestran en la Fig. 3. Los cambios de peso por hidrolisis del hidrogel se midieron en terminos de relacion en peso antes y despues de la degradacion a traves de liofilizacion.
Como se observa en la Fig. 3 que muestra los resultados de perdida de peso por la hidrolisis del hidrogel, cuando la temperatura de PBS era de 47 °C, el hidrogel comenzo a degradarse rapidamente despues del transcurso de una
semana y estaba todo degradado en tres semanas, y cuando la temperatura de PBS era de 37 °C, comenzo a degradarse lentamente despues del transcurso de una semana, quedaba aproximadamente un 10% de su peso inicial a las cuatro semanas y se degrado completamente a las 5 semanas. Consecuentemente, como el hidrogel segun una realizacion de la presente invencion comienza a degradarse despues de una semana inicial cuando la 5 curacion de la herida es completa, y es completamente degradable en dos meses, se puede concluir que tiene un comportamiento de degradacion deseable.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un derivado de acido Y-poliglutamico de formula quimica 1: Formula quimica 1:
    imagen1
    en la cual,
    la suma total de l, m y n es un numero entero de 390 a 15.500, la relacion de l, m y n es l:m:n = 0 a 0,5:0,2 a 0,5:0,2 a 0,8,
    L es un conector, M es cada uno independientemente H, un metal alcalino o un metal alcalinoterreo, R es CH2, b es 0 o 1 y c es un numero entero de 1 a 5,
    en que el conector es -HN-(R)a-O-, con R = CH2 y a = un numero entero de 1 a 5.
  2. 2. El derivado de acido Y-poliglutamico de la reivindicacion 1, en el que el conector es derivado de aminometanol, 1- amino-2-propanol, 1-amino-3-propanol, 1-amino-4-butanol, 1-amino-5-pentanol o 2-aminoetanol.
  3. 3. El derivado de acido Y-poliglutamico de la reivindicacion 1, en el que -(CO)b-(R)c-CO- es -CH2CH2CH2CH2-CO-, -CO-CH2CH2CH2-CO-, -CH2CH2-CO-, -CO-CH2CH2-CO- o - CH2-CO-.
  4. 4. Un metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
    una primera etapa de hacer reaccionar un acido Y-poliglutamico con una alcanolamina inferior que tiene de 1 a 5 atomos de carbono para formar un acido Y-poliglutamico-alcanolamina;
    una segunda etapa de hacer reaccionar el acido Y-poliglutamico-alcanolamina con un anhidrido de un acido seleccionado entre el grupo que consiste en acido glutarico o acido succinico, o un acido 1-halo-alcanoico seleccionado entre el grupo que consiste en acido 1-halo-valerico, acido 1-halo-propionico y acido 1-halo- metilcarbonico para formar un terminal de acido alcanoico; y una tercera etapa de hacer reaccionar el terminal de carboxilo asi formado con N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida en presencia de compuestos de tipo carbodiimida para formar un derivado de acido Y-poliglutamico del que al menos algunos grupos carboxilo estan activados.
  5. 5. El metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico segun la reivindicacion 4, en el que en la primera etapa, la alcanolamina inferior se hace reaccionar en una relacion en moles de 0,1 a 2 con respecto a una unidad molar de los grupos carboxilo del acido Y-poliglutamico.
  6. 6. El metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico segun la reivindicacion 4, en el que en la segunda etapa, el anhidrido de de un acido o acido 1-halo-alcanoico se hace reaccionar en una relacion en moles de 3 a 8 con respecto a una unidad molar de la alcanolamina inferior que forma el acido Y-poliglutamico-alcanolamina.
  7. 7. El metodo para preparar el derivado de acido Y-poliglutamico segun la reivindicacion 4, en el que en la tercera etapa, la N-hidroxisuccinimida o N-hidroxisulfosuccinimida se hace reaccionar en una relacion en moles de 0,1 a 3 con respecto a una unidad molar del terminal carboxilo formado.
  8. 8. Un hidrogel, que comprende una estructura reticulada obtenida reticulando el derivado de acido Y-poliglutamico 5 segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un polimero basado en polietilenglicol que tiene una pluralidad
    de grupos funcionales nucleofilos.
  9. 9. El hidrogel de la reivindicacion 8, en el que los grupos funcionales nucleofilos son un grupo amino, grupo tiol o grupo hidroxilo.
  10. 10. El hidrogel de la reivindicacion 8, en el que el polimero basado en polietilenglicol esta representado por la 10 formula quimica 2:
    Formula quimica 2 I-[(CH2CH2O)n-CH2CH2X]m
    en la que I es un radical derivado de 2 a 12 alcoholes polihidroxilados, X representa un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo, n es de 12 a 170 y m es un numero entero de 2 a 12, que es igual al numero de los grupos hidroxilo de los alcoholes polihidroxilados de los que deriva I.
    15 11. El hidrogel de la reivindicacion 10, en el que el polimero basado en polietilenglicol esta representado por la
    formula quimica 3 o 4:
    Formula quimica 3
    imagen2
    20
    Formula quimica 4
    imagen3
    X CHjCH^OCHjCH! } O-CH
    HC-O-fcHbCHaO-^CHzCHsX
    HC—04 CH2CH20 J- C hfeCH 2X XCHjCH ^OCHaCHa) O-CH
    CHjO-fcHjCHaOVcHaCHjX
    en las que X represente un grupo amino, un grupo tiol o un grupo hidroxilo y n es de 19 a 170.
  11. 12. Un derivado de acido Y-poliglutamico, que comprende unidades monomeras de formula quimica 5, unidades comonomeras de formula quimica 6 y unidades comonomeras de formula quimica 7:
    Formula quimica 5
    NH-CH -CH2-CH2-CG
    CO
    /
    OM
    Formula quimica 6 NH-CH-CH2'CH2-CO -
    .co-
    f:
    1 -(co)b-(n)(-co?M
    Formula quimica 7
    5
    imagen4
    en la que el derivado de acido Y-poliglutamico comprende 1 unidad monomera de formula 5, m unidades comonomeras de formula quimica 6 y n unidades comonomeras de formula 7, y
    en las cuales
    la suma total de l, m y n es un numero entero de 390 a 15.500,
    10 la relacion de l, m y n es l:m:n = 0 a 0,5:0,2 a 0,5:0,2 a 0,8,
    L es un conector, M es cada uno independientemente H, un metal alcalino o un metal alcalinoterreo, R es CH2, b es 0 o 1 y c es un numero entero de 1 a 5,
    en que el conector es preferentemente -HN-(R)a-O-, con R = CH2 y a = un numero entero de 1 a 5.
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