CN114129721B - 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 - Google Patents
双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114129721B CN114129721B CN202111186210.0A CN202111186210A CN114129721B CN 114129721 B CN114129721 B CN 114129721B CN 202111186210 A CN202111186210 A CN 202111186210A CN 114129721 B CN114129721 B CN 114129721B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gamma
- imiquimod
- polyglutamic acid
- grafted
- amphiphilic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 title claims abstract description 54
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 41
- -1 lauryl ester Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012320 chlorinating reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 71
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical group CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 12
- GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 5-aminofluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(N)=CC=C21 GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical group ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims description 3
- 208000020061 Hand, Foot and Mouth Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025713 Hand-foot-and-mouth disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 6
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 2
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 36
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 3
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentachloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)(Cl)Cl UHZYTMXLRWXGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000012890 simulated body fluid Substances 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 241000414067 Inonotus obliquus Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124615 TLR 7 agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 125000002723 alicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008349 antigen-specific humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000004251 balanced diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N dimethoate Chemical compound CNC(=O)CSP(=S)(OC)OC MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007108 local immune response Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydrogen carbonate;carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC([O-])=O.[O-]C([O-])=O WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
- A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提供双亲性咪喹莫特嫁接γ‑聚谷氨酸月桂酯及其应用，属于生物医用材料领域。双亲性咪喹莫特嫁接γ‑聚谷氨酸月桂酯，采用包括如下步骤的方法制备：（1）在无水氛围下，将γ‑聚谷氨酸分散在非质子溶剂中，然后加入催化剂N,N‑二甲基甲酰胺，在搅拌状态下，滴入氯化剂，反应10‑40小时；（2）将咪喹莫特、脂溶性醇和缚酸剂加入步骤（1）反应后所得溶液中，反应42‑54小时；（3）纯化后，得到双亲性咪喹莫特嫁接γ‑聚谷氨酸月桂酯材料。本发明双亲性咪喹莫特嫁接γ‑聚谷氨酸月桂酯及其荧光素标记物，不仅水溶性好，具良好的生物相容性，降低了毒副作用，而且能够提高机体特异性免疫应答，是理想的佐剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用。
背景技术
接种疫苗被认为是当今社会预防传染病最经济、最方便和最有效的方法之一。在免疫过程中，抗原递送是至关重要的一步。在疫苗的实际使用过程中，由于许多抗原单独施用时不足以赋予免疫性抗体应答，这就需要设计能固定抗原并刺激免疫应答的佐剂。
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一类模式识别受体(Patternrecognition receptor，PRR)，这种受体在受到微生物特殊的保守产物-病原体相关分子模式(Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)激活时，不仅会诱导天然免疫应答，同时还能激活获得性免疫系统，是理论上佐剂的理想选择。近年来，人工合成的咪喹莫特(R837)作为TLR 7激动剂，是小分子免疫调节剂，具有优异的抗病毒、抗肿瘤能力。因为相对分子量小，可以通过多种途径进入体内，提高抗原呈递的细胞活性，聚集较多的树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞等到接种位点，增强局部免疫反应。可是，咪喹莫特也存在以下缺陷：(1)在水中以及常见有机溶剂中溶解度较小，因此不易制备成注射剂，对细胞有一定的毒性；(2)单一使用R837会产生一些不良反应，例如红斑、糜烂、剥脱/剥落和水肿等属于常见不良反应；(3)咪喹莫特的药代动力学具有从局部(例如皮下或肌肉内)迅速向全身扩散等特点，从而在多个远端组织引起不必要的内在免疫激活。由于这些缺点的存在，使其应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的是提供双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，不仅水溶性好，具良好的生物相容性，降低了毒副作用，而且能够提高机体特异性免疫应答，是理想的佐剂。
本发明的再一目的是提供双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯在疫苗佐剂方面的用途。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，采用包括如下步骤的方法制备：
(1)在无水氛围下，将γ-聚谷氨酸分散在非质子溶剂中，然后加入催化剂N,N-二甲基甲酰胺，在搅拌状态下，滴入氯化剂，反应10-40小时；
(2)将咪喹莫特、脂溶性醇和缚酸剂加入步骤(1)反应后所得溶液中，反应42-54小时；
(3)纯化后，得到双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯材料。
在本发明中，γ-聚谷氨酸的分子量为1-200万，优选为30-70万；所述氯化剂为氯化亚砜、草酰氯或五氯化磷，优选氯化亚砜和草酰氯；脂溶性醇为C8-C24醇、脂环醇或者甾醇，优选正月桂醇或胆固醇；缚酸剂为三乙胺、4-N,N-二甲氨基吡啶、吡啶、无水碳酸铯、无水碳酸钾、无水碳酸钠、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种。
在本发明中，非质子溶剂中为二氯甲烷、氯仿、乙腈、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和甲苯中的一种；所述非质子溶剂优选为二氯甲烷或乙腈。
在本发明中，γ-聚谷氨酸、咪喹莫特、脂溶性醇和缚酸剂的摩尔比为10:0.5-1.5:1-3:10-15；步骤(1)中γ-聚谷氨酸与氯化剂的物质的量之比为1:(1～2.5)，优选为1:1，反应时间为20-25小时。
在本发明中，步骤(1)、(2)的反应温度均为10-40℃；优选20-25℃。
在本发明中，步骤(1)中每克γ-聚谷氨酸分散在5～70mL的非质子溶剂中。
在本发明中，所述制备方法还包括采用荧光素进行标记的步骤；所述荧光素为氨基荧光素或氨基罗丹明，优选5-氨基荧光素。
在本发明中，纯化步骤如下：除去溶剂，残留固体用无水丙酮、甲醇、乙醇或乙腈浸泡，过滤、洗涤和真空干燥。
本发明还提供所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯作为疫苗佐剂方面的用途。
在本发明中，所述疫苗为手足口病、禽流感、新城疫、伪狂犬、猪细小、猪瘟和猪蓝耳疫苗；所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯与抗原的质量比为(0.01～1):(0.5～1)。
为了克服现有的R837免疫佐剂水溶性差和毒副作用较大的缺陷，本发明利用γ-聚谷氨酸作为亲水性聚合物骨架，通过酰胺共价键偶联5-氨基荧光素、R837，通过酯键偶联憎水性脂溶性醇(如正月桂醇)，形成双亲性聚合物FIP(FL-γ-PGA-R837-LA)。通常对γ-PGA进行修饰是鉴于其羧基在EDC/NHS活化下形成酯和酰胺。由于咪喹莫特的氨基很不活泼，难以用该方法进行酰胺化偶联。因此，先将γ-PGA的羧基用氯化亚砜、草酰氯或五氯化磷在N,N二甲基甲酰胺催化下制成高活性的酰氯，然后与咪喹莫特的氨基反应，成功地通过酰胺键进行偶联。通过Scifinder和Web of Science文献搜索，发现将γ-PGA的羧酸基制成酰氯后再进行酯化或酰胺化的方法也未曾报导。其原因可能是氯化的条件不易控制，反应体系很容易碳化发黑。本发明通过控制反应温度和氯化剂加入的速度，成功地实现酰氯的产生。因此，本发明FIP和γ-PGA-R837-LA的制备方法简单，巧妙。由于原料来源丰富，生物安全性良好，价格低，因此本发明中的FIP和γ-PGA-R837-LA成本较低。
本发明制备的FIP和γ-PGA-R837-LA，不仅水溶性好，具良好的生物相容性，降低了毒副作用，而且在显著减少了咪喹莫特用量的情况下，可以有效地刺激机体的免疫应答，提高IgG的分泌水平，可用于疫苗、载药、探针等领域。动物实验显示，接种含有FIP的疫苗的小鼠的注射部位皮肤、肝、脾和肾均未发现病变问题，证明实验组小鼠体征指标正常，无不良副反应。含有FIP的不同剂型的疫苗接种小鼠后，效价水平均有明显的上升，在首免后6周，效价约达到仅含有OVA的疫苗的2倍，说明FIP是一种很好的水剂型佐剂，安全性更好，是一种较为理想多剂型佐剂。FIP中含有荧光基团，可用于生物体内/外荧光追踪和定量，直观的确定体液免疫和细胞免疫之间的联系。本发明FIP可以制成W、O/W、W/O、W/O/W剂型的疫苗，均能够显著提高免疫效力。由于FIP是两亲性高分子聚合物，因此能在水或者油相介质中通过分子间作用力自组装形成纳米微粒(胶束或囊泡)，为药物和疫苗载体的制备提供了一种新的方法。FIP(即FL-γ-PGA-R837-LA)能与多种抗原物理混合，制成粘膜给药疫苗，可进行滴鼻和口服给药。
附图说明：
图1.双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(γ-PGA-R837-LA)合成路线。
图2.荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FIP，FL-γ-PGA-R837-LA)合成路线及5-氨基荧光素的化学结构式。
图3.荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)1H NMR图。
图4.荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)的UV-vis表征图。
图5是FIP、咪喹莫特、荧光素的荧光光谱表征图，其中a是FIP与咪喹莫特的荧光光谱表征图，b是FIP和荧光素的荧光光谱表征图。
图6是荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)与γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的Zeta电位图。
图7是不同浓度的荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)对RAW 264.7细胞的存活率实验结果，横坐标为浓度，纵坐标为细胞存活率(％)，FIP为不同浓度FL-γ-PGA-R837-LA溶液；IMQ是不同浓度R837溶液；HAc为pH 6.0的醋酸水溶液；PBS为PBS缓冲液。
图8.RAW 264.7细胞吞噬荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)的荧光流式图；a是浓度为50μg/mL的FIP干预细胞的FSC-SSC散点图，横坐标是前向角度散射光强度，纵坐标是侧向散射光强度；b是浓度为50μg/mL的FIP干预细胞的单参数直方图，横坐标是荧光信号的值；c是不同浓度的FIP干预细胞的平均荧光图，横坐标为FIP浓度，纵坐标为荧光强度。
图9是小鼠免疫后5天皮肤情况的照片，虚线框内为接种部位所在区域；其中a图中小鼠皮下注射含有咪喹莫特(R837，IMQ)的疫苗，b图中小鼠皮下注射含有FIP的疫苗。
图10是FIP和咪喹莫特(R837,IMQ)作为佐剂的免疫效果对比图。
图11接种小鼠的注射部位皮肤及内脏(如肝、肾、脾)的组织学检测，其中第一行是接种PBS缓冲液的小鼠，第二行是接种疫苗1的小鼠，a为注射位点皮肤，b为肝，c为脾和d为肾。
图12显示了接种FIP/OVA不同剂型疫苗的小鼠血清IgG抗体水平，其中图A是接种两周后抗体效价，图B是接种六周后血清抗体效价。FIP/OVA是各疫苗(同时含有FIP和OVA)，OVA是各阳性对照疫苗(仅含有OVA)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其荧光素标记物的制备及鉴定
1.双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(缩写为γ-PGA-R837-LA)的制备
γ-PGA-R837-LA的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.1mol(13g)的γ-聚谷氨酸(γ-PGA，MW＝700000，轩凯生物科技有限公司)，分散在200mL无水二氯甲烷(DCM)中，然后加入0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为催化剂，在室温(20-25℃)搅拌状态下，滴入0.1mol(7.3mL)的氯化亚砜(SOCl2)，滴速为2秒/滴，体系为无水操作；滴加结束后，反应24小时，反应过程中产生的尾气用10％NaOH水溶液吸收。
(2)将0.01mol(2.4g)的咪喹莫特(R837)、0.02mol(3.72g)正月桂醇(LA)和0.12mol(12g)缚酸剂三乙胺(NEt3)加入到步骤(1)反应后所得溶液中，室温(20-25℃)反应48小时。
(3)旋转蒸发除去溶剂，残留固体用无水甲醇浸泡，过滤取滤渣、用水洗涤、真空干燥，得到双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯。
反应原理见图1。
2.荧光素标记双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(缩写为FL-γ-PGA-R837-LA，缩写为FIP)的制备
FIP的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.1mol(13g)γ-聚谷氨酸(γ-PGA，MW＝700000，轩凯生物科技有限公司)，分散在200mL无水二氯甲烷(DCM)中，然后加入0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为催化剂，在室温(20-25℃)搅拌状态下，滴入0.1mol(7.3mL)的氯化亚砜(SOCl2)，滴速为2秒/滴，体系为无水操作；滴加结束后，反应24小时，反应过程中产生的尾气用10％NaOH水溶液吸收；
(2)将0.01mol(2.4g)的咪喹莫特(R837)、0.02mol(3.72g)正月桂醇(LA)、0.5mmol(0.17g)5-氨基荧光素(缩写为5-NH2-FL)和0.12mol(12g)缚酸剂三乙胺(NEt3)加入到步骤(1)反应后所得溶液中，室温(20-25℃)反应48小时。
(3)旋转蒸发除去溶剂，残留固体用无水甲醇浸泡，过滤取滤渣，用水洗涤、真空干燥，得到荧光素标记的双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA)。
反应原理见图2。
3.物质鉴定
(1)核磁检测
将FL-γ-PGA-R837-LA溶解于DMSO-d6中，用于核磁共振氢谱(1H NMR)的表征。同时，γ-聚谷氨酸(溶于D2O)和R837(溶于DMSO-d6)作为对照，评价R837的嫁接与定量。核磁检测结果见图3，FL-γ-PGA-R837-LA的1H NMR谱图中，7-9ppm为R837芳环区氢的化学位移，说明R837已经嫁接到γ-聚谷氨酸骨架上，同时与γ-聚谷氨酸积分面积比表明嫁接率(R837在FL-γ-PGA-R837-LA中的质量百分含量)为10％左右；高场区出现的峰表明，正月桂醇也嫁接到γ-聚谷氨酸骨架上。由于FL-γ-PGA-R837-LA中荧光素含量很低，在1H NMR谱上几乎被噪音淹没。
(2)紫外-可见(UV-vis)检测
UV-vis检测灵敏度高。由于嫁接的荧光素含量很低，核磁共振氢谱(1H NMR)难以检测出。为了确定R837和5-氨基荧光素是否被嫁接上，将FL-γ-PGA-R837-LA溶于超纯水，用UV-vis(紫外-可见光分光光度计)检测FL-γ-PGA-R837-LA中的主要成分；将R837溶于盐酸酸化的超纯水(pH 6)，作为对照1；以5-氨基荧光素水溶液作为对照2。在200-600nm的波长下检测吸光度，将检测结果归一化后比较。结果如图4，结合FL-γ-PGA-R837-LA和其他单一成分的紫外图中出现200-250nm处的R837特征峰、250-300nm处的γ-PGA的特征峰和475-525nm处的5-FL的特征峰，证明了R837、荧光素均嫁接到γ-PGA骨架上，验证了FL-γ-PGA-R837-LA的结构。
(3)荧光(FL)检测
为了进一步确证R837和5-氨基荧光素是否被嫁接到γ-PGA侧链上，将FL-γ-PGA-R837-LA溶于超纯水，用荧光分光光度计检测。将R837溶于盐酸酸化的超纯水(pH 6)溶液，作为对照1；以5-氨基荧光素水溶液，作为对照2。结果如图5，当使用激发波长(λEx)为280nm的光激发R837发色团时，归一化后，发现FL-γ-PGA-R837-LA和R837的R837发射峰(λEm＝340nm)峰形几乎形同，仅有3nm的位移，这表明R837已经被嫁接到γ-PGA侧链上；当使用激发波长(λEx)为455nm的光激发荧光素发色团时，FL-γ-PGA-R837-LA出现荧光素发射峰(λEm＝519nm)，归一化后发现，FL-γ-PGA-R837-LA和5-氨基荧光素的最大发射峰仅有4nm的位移，但两者峰形几乎相同，因此，5-氨基荧光素已经被嫁接到γ-PGA侧链上。
(4)Zeta电位检测
Zeta电位值的正负和大小对应着着物质结构的稳定性和正负电荷。从图6可见，FL-γ-PGA-R837-LA的Zeta电位为-3.3mV，说明FL-γ-PGA-R837-LA能快速凝结，如果浓度过大，则形成凝胶状物质。
(5)溶解性检测
将R837、γ-PGA-R837-LA和FL-γ-PGA-R837-LA分别溶于水相(例如，超纯水，0.1MpH为7.4的PBS缓冲液、0.9％生理盐水，5％葡萄糖水溶液和pH 1～6的酸性水溶液，SBF模拟体液)和溶剂相(乙醇、DMSO、DMF)中，对比观察其溶解度，评价其水佐剂的可行性及注射缓冲液的选择。
结果：20毫克的γ-PGA-R837-LA和FL-γ-PGA-R837-LA在5mL的超纯水、0.1M、pH为7.4的PBS缓冲液、0.9％生理盐水、5％葡萄糖水溶液、pH 1～6的酸性水溶液和SBF模拟体液中均全部溶解；20毫克的γ-PGA-R837-LA和FL-γ-PGA-R837-LA在3mL的DMSO、乙醇、DMF和丙酮均全部溶解。因此γ-PGA-R837-LA和FL-γ-PGA-R837-LA是双亲性材料，有望于制备水佐剂。
R837不能溶解在超纯水、0.1M、pH为7.4的PBS缓冲液、0.9％生理盐水、5％葡萄糖水溶液和SBF模拟体液中，仅溶解在pH≤6以下的酸性水溶液中；R837微溶于热的DMSO和DMF溶液中。因此，限制了它在水佐剂类的应用。
实施例2FIP的体外实验、FIP与R837免疫效果比较
(1)FIP的体外细胞毒性测试
以pH 7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制不同浓度的FIP溶液。以pH 6的醋酸水溶液为溶剂，配制不同浓度的R837溶液。考察FIP溶液、R837溶液对细胞的毒性，以pH 6.0的醋酸水溶液为阴性对照，以pH 7.4的PBS缓冲液为空白对照，采用小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为模式源，利用CCK-8法进行毒性检测，具体方法如下：在96孔板上铺上RAW 264.7细胞，在37℃、5％CO2/95％O2的生物环境下孵育24小时，显微镜观察，当细胞计数达到2×106cells/孔时，每孔加入100μL不同浓度的FIP溶液或R837溶液，继续孵育24小时，然后加入CCK-8试剂(细胞增殖试剂盒中试剂，购自百赛生物)，孵育4小时，采用酶标仪(BioTek酶标仪)检测细胞凋亡程度。结果：如图7所示，当FIP溶液浓度为1000μg/mL(所含R837成分浓度为100μg/mL)时，细胞仍保持着88％的存活率，FIP溶液浓度小于1000μg/mL时，细胞无凋亡现象，细胞存活率与PBS缓冲液处理的细胞类似；相反，R837溶液对细胞伤害较大，当浓度为100μg/mL时，大量的RAW 264.7细胞发生了凋亡。因此，FIP具有良好的生物相容性和低毒性，可用于疫苗、载药、探针等领域。
(2)FIP/OVA纯水剂型的荧光流式测定
以pH 7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制50μg/mL的FIP溶液，其中R837的浓度为5μg/mL。
在24孔细胞板上铺上RAW 264.7细胞，孵育18小时，细胞数量达到2×106cells/孔，每孔加入100μL、50μg/mL的FIP溶液。继续孵育24小时后，吹打细胞，用PBS洗涤离心三次，最后用冰的PBS重悬后用流式细胞仪(BD FACSCalibur流式细胞仪)进行检测。另外，采用上述相同方法考察不同浓度FIP溶液对RAW 264.7细胞的影响。结果如图8所示，当FIP浓度为50μg/mL时，RAW 264.7细胞仍能看到明显的荧光峰，其未分化的CD3+细胞展现较强的活性。随着FIP浓度的增加，其细胞的荧光强度逐渐增高。这些结果说明了FIP很容易被细胞摄入，能够在生物体内的组织器官中呈现荧光标记，通过不同的时间段进行为追踪免疫路径提供了帮助。
(3)FIP与R837免疫效果比较
以pH 7.4的PBS缓冲液为溶剂，分别配制1000μg/mL的OVA(卵清蛋白)溶液和200μg/mL的FIP溶液，然后将两溶液等体积混合，得到含有FIP的疫苗。
以pH 6的醋酸水溶液为溶剂，分别配制1000μg/mL的OVA溶液和200μg/mL的R837溶液，然后将两溶液等体积混合，得到含有R837的疫苗。
另外，以pH 7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制500μg/mL的OVA溶液(缩写为OVA)；以pH7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制100μg/mL的FIP溶液(缩写为FIP)。
将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(20-25g)随机分成5组，每组小鼠有6只，分别接种含有FIP的疫苗、含有R837的疫苗、500μg/mL的OVA溶液、100μg/mL的FIP溶液和pH 7.4的PBS缓冲液，接种剂量均为200μL疫苗/只。接种后，一周内观察注射部位皮肤状况。接种后28天，眼眶采血，分离血清，检测抗体效价。
抗体效价采用如下方法检测：以pH 9.6、0.05mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液为溶剂，配制10μg/mL的OVA蛋白溶液。取50μL的OVA蛋白溶液包被96孔板，4℃过夜吸附；弃液，使用PBST缓冲液(在1L、0.1M的pH 7.4的PBS缓冲液中添加500μL的吐温-20所得)洗板2次，置于干净吸水纸上拍干；每孔加入100μL的封闭液(1L、0.1M的pH 7.4PBS缓冲液中添加10g的BSA后所得)后封膜，置于37℃摇床孵育1小时，然后用PBST缓冲液洗板2次，置于干净吸水纸上拍干；加入100μL用PBST缓冲液稀释后的小鼠血清，37℃避光孵育1.5小时，弃去溶液，加入PBST缓冲液洗板5次，置于干净吸水纸上拍干；每孔加入50μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(购自碧云天，产品编号A0216)，37℃避光孵育1小时，弃去溶液，加入PBST缓冲液洗板5次，置于干净吸水纸上拍干；每孔加入50μL的显色液(将购自英创生物的双组分TMB显色液中的A溶液和B溶液按照体积比为1:1混合)在37℃避光孵育30分钟，最后每孔加入50μL终止液(2mol/L的H2SO4水溶液)，用酶标仪在450nm处检测吸光度。
结果：接种含有R837的疫苗的小鼠，出现了小面积的皮肤溃烂、红肿、化脓等不良反应，见图9；接种含有FIP的疫苗的小鼠，被毛柔顺，饮食稳定，生命体征正常，注射部位没有红肿，鼓包等炎症反应。由图10可见，虽然咪喹莫特作为佐剂时IgG效价最高(OD450nm＝3.07)，但是FIP作为水佐剂时仍展现较强的效价(OD450 nm＝2.1)。由于含有FIP的疫苗中咪喹莫特成分仅有10μg/mL，仅是含有R837的疫苗中的10％，因此FIP作为水佐剂，不仅水溶性好，降低了毒副作用，而且在显著减少了咪喹莫特用量的情况下，可以有效地刺激机体的免疫应答，提高IgG的分泌水平。
由于上述免疫实验中咪喹莫特结构的浓度仅有10μg/mL，小鼠注射部位没有红肿，鼓包等炎症反应，为了验证高浓度下是否存在毒副作用，以pH 7.4的PBS缓冲液为溶剂，分别配制1000μg/mL的OVA溶液和1000μg/mL的FIP(即FL-γ-PGA-R837-LA)溶液，然后将两溶液等体积混合，得到含有1000μg/mL的FIP的疫苗。采用上述相同方法进行接种，一周内，小鼠被毛柔顺，饮食稳定，生命体征正常，注射部位没有红肿，鼓包等炎症反应。因此FIP无毒副作用。
实施例3免疫实验
本实施例说明实施例1制备的荧光素标记双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯(FL-γ-PGA-R837-LA，简称FIP)，作为疫苗免疫佐剂的应用。
一、制备疫苗制剂
以卵清蛋白(OVA)为模式抗原，不同配方的疫苗按表1进行配制，然后对小鼠进行皮下注射。
表1.各疫苗组成及免疫剂量
制备FIP/OVA水剂型疫苗(记为疫苗1)：以0.1M的PBS(pH 7.4)缓冲液作为溶剂，分别配制1000μg/mL的OVA溶液和200μg/mL的FIP(即FL-γ-PGA-R837-LA)溶液，然后将两溶液等体积混合，制备成FIP/OVA水剂型疫苗(记为疫苗1)。疫苗1中，FIP浓度为100μg/mL，OVA浓度为500μg/mL。按疫苗1的制备方法制备阳性对照疫苗1，不同之处仅在于以水替代FIP溶液。
制备FIP/OVA水包油剂型疫苗(记为疫苗2)：以中国专利ZL201310021011.3中配方4作为油相；以0.1M的PBS(pH 7.4)缓冲液作为溶剂，配制含有OVA和FIP的水相；将水相与油相按照体积比1：1混合、高压均质化处理，得到FIP/OVA水包油剂型疫苗(记为疫苗2)。该疫苗中FIP的浓度为100μg/mL，OVA浓度为500μg/mL。按照FIP/OVA水包油剂型疫苗的制备方法制备阳性对照疫苗2，不同之处仅在于该疫苗中不含有FIP。
制备FIP/OVA油包水剂型疫苗(记为疫苗3)：以0.1M的PBS(pH 7.4)缓冲液作为溶剂，配制含有OVA和FIP的水相；将水相与白油按照体积比为1：3混合、乳化，得到FIP/OVA油包水剂型疫苗(记为疫苗3)。疫苗3中OVA的浓度为500μg/mL，FIP的浓度为100μg/mL。按疫苗3的制备方法制备阳性对照疫苗3，不同之处仅在于水相中不含有FIP。
制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗：以0.1M的PBS(pH 7.4)缓冲液作为溶剂，配制含有FIP和OVA的水相；将水相与ISA201按照体积比为1：1混合、乳化，得到FIP/OVA水包油包水剂型疫苗(记为疫苗4)，该疫苗中FIP的浓度为100μg/mL，OVA浓度为500μg/mL。按照疫苗4的制备方法制备阳性对照疫苗4，不同之处仅在于水相中不含有FIP。
二、小鼠免疫接种方案
将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(20-25g)随机分成9组，每组小鼠有6只，其中8组小鼠分别免疫阳性对照疫苗1-4、疫苗1-4(表1)，剩余一组小鼠接种0.1M、pH 7.4的PBS缓冲液作为阴性对照。各疫苗的接种方法如下：总共接种两次，在第1天和14天接种疫苗，接种剂量均为200μL疫苗/只。
三、各项生化和免疫指标的测定
(1)首免后28天组织H&E染色毒副作用测定
将接种PBS缓冲液和疫苗1的两组小鼠，在首免后28天，进行接种位点、肝、肾、脾组织切片，观察是否有损伤和病变等问题。具体方法如下：每组取3只小鼠进行安乐死处理，并手术分离出注射部位皮肤及内脏(如肝、肾、脾)，用4％多聚甲醛(购买于雷根生物，产品货号DF0135)固定浸泡，石蜡包埋，切片处理，进行免疫组织化学染色。结果如图11所示，与接种PBS缓冲液的小鼠对比，接种疫苗1小鼠的注射部位皮肤、肝、脾和肾均未发现病变问题，证明实验组小鼠体征指标正常，无不良副反应。
(2)IgG抗体效价测定
首免后每隔两周眼眶采血，分离血清，按照实施例2中方法测定各小鼠血清中的特异性抗体(IgG)水平。
结果如图12所示，通过与不同剂型、仅含有OVA的阳性对照疫苗对比，可以发现含有FIP的疫苗具有更强的免疫应答能力。针对兽用疫苗的市场中剂型类型进行抗体效价检测，通过对小鼠进行免疫效价评估，在首免后2周、6周采血，利用ELSIA法进行判定其抗体效价，对比抗体效价，可以发现O/W>W/O/W>W/O>W，随着免疫时间的增加，含有FIP的不同剂型的疫苗效价水平均有明显的上升，约达到相应对照阳性疫苗的2倍，说明FIP是一种很好的水剂型佐剂，安全性更好，是一种较为理想多剂型佐剂。
综上所述，申请人首次利用酰胺键将咪喹莫特与γ-聚谷氨酸共价键偶联，并嫁接了脂溶性基团和荧光发色团修饰的FL-γ-PGA-R837-LA聚合物。FL-γ-PGA-R837-LA具有良好的生物相容性和双亲溶解性。小鼠免疫研究表明，OVA作为模型抗原，使用γ-PGA-R837-LA或FL-γ-PGA-R837-LA作为免疫佐剂，能够高效、持久地促进抗原特异性体液和细胞免疫应答；可以通过荧光标记追踪疫苗的进入、刺激、转运及代谢过程；可以制成不同的剂型，用于皮下注射、肌肉注射、鼻腔或口服给药，为免疫剂型设计和选择提供了可行性方案。因此，γ-PGA-R837-LA和FL-γ-PGA-R837-LA作为免疫佐剂在免疫治疗领域有着重要的应用价值。
Claims (7)
1.双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，采用包括如下步骤的方法制备：
（1）在无水氛围下，将γ-聚谷氨酸分散在非质子溶剂中，然后加入催化剂N, N-二甲基甲酰胺，在搅拌状态下，滴入氯化剂，室温反应20-25小时；
（2）将咪喹莫特、脂溶性醇和缚酸剂加入步骤（1）反应后所得溶液中，室温反应42 - 54小时；
（3）纯化后，得到双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯材料；
γ-聚谷氨酸的分子量为70万；所述氯化剂为氯化亚砜；脂溶性醇为正月桂醇；缚酸剂为三乙胺；所述非质子溶剂为二氯甲烷或乙腈；γ-聚谷氨酸、咪喹莫特、脂溶性醇和缚酸剂的摩尔比为10: 1: 2: 12；步骤（1）中γ-聚谷氨酸与氯化剂的摩尔比为1:1 。
2.根据权利要求1所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，其特征在于步骤（1）中每克γ-聚谷氨酸分散在5 ~ 70 mL的非质子溶剂中。
3.根据权利要求2所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，其特征在于所述制备还包括采用荧光素进行标记的步骤；所述荧光素为氨基荧光素。
4.根据权利要求3所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，其特征在于所述氨基荧光素为5-氨基荧光素。
5.根据权利要求4所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯，其特征在于纯化步骤如下：除去溶剂，残留固体用无水丙酮、甲醇、乙醇或乙腈浸泡，过滤、洗涤和真空干燥。
6.权利要求1所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯在制备疫苗佐剂方面的用途。
7.根据权利要求6所述用途，其特征在于所述疫苗为手足口病、禽流感、新城疫、伪狂犬、猪细小、猪瘟或猪蓝耳疫苗；所述双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯与抗原的质量比为（0.01 ~ 1）:（0.5 ~ 1）。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111186210.0A CN114129721B (zh) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 |
| PCT/CN2021/131111 WO2023060686A1 (zh) | 2021-10-12 | 2021-11-17 | 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111186210.0A CN114129721B (zh) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114129721A CN114129721A (zh) | 2022-03-04 |
| CN114129721B true CN114129721B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=80394781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111186210.0A Active CN114129721B (zh) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114129721B (zh) |
| WO (1) | WO2023060686A1 (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102698279A (zh) * | 2012-07-03 | 2012-10-03 | 南京医科大学 | 一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法 |
| CN107847398A (zh) * | 2016-05-05 | 2018-03-27 | 南京三迭纪医药科技有限公司 | 控制释放的药物剂型 |
| WO2019157714A1 (en) * | 2018-02-14 | 2019-08-22 | Jan Jeng Shiung | Amphiphilic block copolymer, nanoparticle containing the same, medicinal composition thereof and method of inhibiting ribonucleic acid binding to human antigen r using the same |
| CN112661961A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-16 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 两亲性聚噁唑啉共聚物、其制备方法及应用 |
| CN112717126A (zh) * | 2021-01-16 | 2021-04-30 | 北京化工大学 | 一种聚谷氨酸载体佐剂的制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7785612B2 (en) * | 2005-04-20 | 2010-08-31 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Polyamino acid for use as adjuvant |
| KR101444877B1 (ko) * | 2011-12-30 | 2014-10-01 | 주식회사 삼양바이오팜 | 감마폴리글루탐산으로 구성된 현장 가교 수화겔 및 그의 제조 방법 |
| CN111658780B (zh) * | 2019-10-14 | 2021-10-12 | 四川大学 | 一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体 |
-
2021
- 2021-10-12 CN CN202111186210.0A patent/CN114129721B/zh active Active
- 2021-11-17 WO PCT/CN2021/131111 patent/WO2023060686A1/zh unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102698279A (zh) * | 2012-07-03 | 2012-10-03 | 南京医科大学 | 一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法 |
| CN107847398A (zh) * | 2016-05-05 | 2018-03-27 | 南京三迭纪医药科技有限公司 | 控制释放的药物剂型 |
| WO2019157714A1 (en) * | 2018-02-14 | 2019-08-22 | Jan Jeng Shiung | Amphiphilic block copolymer, nanoparticle containing the same, medicinal composition thereof and method of inhibiting ribonucleic acid binding to human antigen r using the same |
| CN112661961A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-16 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 两亲性聚噁唑啉共聚物、其制备方法及应用 |
| CN112717126A (zh) * | 2021-01-16 | 2021-04-30 | 北京化工大学 | 一种聚谷氨酸载体佐剂的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Poly (γ-glutamic acid) based combination of water-insoluble paclitaxel and TLR7 agonist for chemo-immunotherapy;Anushree Seth 等;Biomaterials;20140619;第35卷;第7992-8001页 * |
| γ-聚谷氨酸-天冬氨酸聚合物的合成表征及性质;薛晓敏 等;高分子材料科学与工程;20110515(第05期);第6-9、13页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023060686A1 (zh) | 2023-04-20 |
| CN114129721A (zh) | 2022-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10946109B2 (en) | Polymer-type fluorescent molecule probe | |
| US6623764B1 (en) | Biodegradable targetable microparticle delivery system | |
| EP2405758B1 (en) | Methods and compositions for liposomal formulation of antigens and uses thereof | |
| Ganda et al. | Dendrimer-conjugated peptide vaccine enhances clearance of Chlamydia trachomatis genital infection | |
| US20100004390A1 (en) | Biodegradable metal-chelating polymers and vaccines | |
| US11718625B2 (en) | Near-infrared fluorescent molecule active targeting folate receptor and preparation method thereof | |
| CN103402547A (zh) | 开关型荧光纳米颗粒探针以及使用其的荧光分子成像法 | |
| US10869939B2 (en) | Delivery system in micellar form having modular spectral response based on enzyme-responsive amphiphilic PEG-dendron hybrid polymers | |
| Ebrahimian et al. | Induction of a balanced Th1/Th2 immune responses by co-delivery of PLGA/ovalbumin nanospheres and CpG ODNs/PEI-SWCNT nanoparticles as TLR9 agonist in BALB/c mice | |
| CN113476598A (zh) | 一种新型冠状病毒亚蛋白纳米疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN114129721B (zh) | 双亲性咪喹莫特嫁接γ-聚谷氨酸月桂酯及其应用 | |
| JP2010053354A (ja) | 新規高分子化合物及び該新規高分子化合物を有する蛍光プローブ | |
| CN111249234B (zh) | 一种糖基联合细胞穿透肽修饰的脑靶向纳米脂质体的制备方法与应用 | |
| CN114522247B (zh) | 一种复合纳米粒及其制备方法和用途 | |
| JP3399100B2 (ja) | オキシアルキレン誘導体 | |
| CN114507270B (zh) | 一种靶向pd-l1多肽、制备方法，组装形成的纳米管及应用 | |
| CN112618489B (zh) | 一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方法与应用 | |
| CN116836700B (zh) | 一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用 | |
| CN117815386A (zh) | 一种淋巴结靶向的肿瘤原位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN117462664A (zh) | 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用 | |
| CN118085026A (zh) | 一种基于溶瘤肽的原位水凝胶疫苗制剂及其制备方法和应用 | |
| Bai et al. | Fluorinate polyacrylic acid and its use as a potential adjuvant field | |
| Chudina et al. | Adjuvant properties of nanoparticles immobilized recombinant diphtheria toxoid fragment | |
| CN108578714A (zh) | 利用磷脂提高bodipy荧光探针中靶向基团与荧光基团利用率的方法 | |
| CN116947969A (zh) | 一种靶向pd-l1的多肽、制备方法，组装形成纳米球及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |