CN102698279A - 一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法 - Google Patents
一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，即以γ-聚谷氨酸为主链接枝疏水性基团，从而获得一种生物相容性好、可降解的两亲性γ-聚谷氨酸衍生物，在水介质中可自组装形成粒径为200～1000nm的纳米胶束，其疏水核-亲水壳结构有利于提高疏水性药物在水介质中的溶解度，进而有望提高药物在体内的生物利用度，此外还可以用于蛋白及DNA的负载。本发明所述γ-聚谷氨酸纳米微球的制备方法简单易行，原料均可工业化生产，重现性好，且载药率高，具有良好的缓释效果和环境智能响应（pH-酶复合敏感）等相应特性，具有很好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及高分子与医用生物材料领域，具体来讲是一种具有环境响应特性和疏水核-亲水壳结构的γ-聚谷氨酸纳米微粒的方法。
背景技术
目前，基于功能基因组分析的药物筛选已获得各种药物活性物质，如蛋白、多肽、DNA等生物大分子药物，但这些潜在的候选药物由于结构复杂，易因环境和载体材料的影响失去药物活性，而利用两亲性嵌段/接枝聚合物以超分子自组装的方式实现药物负载和控缓释的有效途径，特别是采用两亲性嵌段/接枝聚合物获得自组装载药纳米微粒是目前该领域研究的热点。
从体内安全性考虑，天然高分子材料具有良好的水溶性、生物相容性、生物可降解性和非免疫原性等，用于药物载体更具优势。此外，由于天然高分子链上通常含有大量游离的功能基团（如羧基和氨基等），其自身性质（如二级结构、体积、形状、表面积、力学性能等将）对温度、离子、pH、酶、电场等环境因子具有一定响应特性。目前，针对多糖及其改性衍生物的聚合物胶束的研究较多，如壳聚糖、支链淀粉、透明质酸等。由于高分子多糖水溶性较差，往往还需引入亲水基团改善其水溶性，导致改性产物的自组装性能变差、包封药物以及控释药物的能力减弱，而水溶性小分子多糖药物负载量不高，应用于药物载体受到极大限制。
聚氨基酸是目前研究较多的另一种重要的功能高分子材料，包括化学法合成的聚氨基酸材料和天然聚氨基酸。目前，基于化学法合成聚氨基酸材料的功能化改性及用于药物载体的研究较多，如α-聚谷氨酸（谷氨酸单体经α-酰胺键结合）（Liang,etal.Biomaterials,2006,27:2051-2059）、聚天冬氨酸（Yang,etal.Biotechnology Letter,2005,27,977-982）。作为迄今发现的三种天然聚氨基酸之一，γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA）是一种由D,L-谷氨酸单体经γ-酰胺键结合形成的多聚氨基酸，较化学合成的聚氨基酸具有更好的组织亲和性、相容性和可生物降解性能，能被机体吸收、代谢和排泄，不易产生积蓄和毒副作用，初步研究结果已显示出在药物传输领域的应用潜力（Shih IL,Van YT.Bioresour Technol,2001,79:207-225；Bajaj I,Singhal R.BioresourTechnol,2011,102:5551-5561）。
微生物发酵法合成的γ-PGA分子量与高分子多糖相近，分子量在10~1000KDa，但具有更好的水溶性，侧链修饰后获得两亲性γ-PGA接枝衍生物，在水介质中可自组装为稳定的亲水壳-疏水核结构，可作为疏水性药物或活性大分子药物的理想载体。值得注意的是γ-PGA二级结构与侧链羧基的电离度有关，未电离的侧链羧基对二级结构的分子内氢键有稳定作用，当羧基电离时会破坏其氢键稳定从而发生结构转变，具体表现为γ-PGA二级结构对pH非常敏感，在酸性条件下呈平行的β-折叠片层，在中性条件下呈无规卷曲，而在碱性条件下是更为收缩的无规卷曲形式（Ashiuchi M,Misono H.Biopolymers[M].Weinheim:Wiley-VCH,2002,7:123），由于人体内各组织的环境pH值各有差别，特别是肿瘤组织的pH值一般低于正常组织，设计针对肿瘤组织或特定器官的pH敏感的给药系统无疑具有重要的意义和临床应用价值。除pH敏感特性外，γ-PGA还可被生物体内特异性的γ-酰胺键水解酶—谷氨酰转肽酶（GGT）外切水解为寡聚氨基酸或谷氨酸单体（Kimura K,Tran PL,Uchida I,etal.Microbiology，2004,150:4115-4123），而人血清中GGT主要来自肝脏，因此，γ-PGA的pH-酶双重敏感特性使得开发针对特定器官（如肝脏）肿瘤组织的刺激-应答式给药系统成为可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两亲性γ-PGA纳米药物载体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的思路是以γ-PGA为主链，将内源性的疏水基团引入其侧链游离的羧基上，使获得的接枝γ-PGA衍生物同时具有优异的生物相容性、生物降解性和环境响应特性（pH-GGT复合敏感）。将此接枝聚合物溶于水介质中，在超声条件下，通过分子自组装原理，可快速形成γ-PGA纳米胶束，并可作为蛋白、DNA以及疏水性药物的良好载体。
本发明采用的技术方案如下：
一种两亲性γ-PGA纳米药物载体的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物的合成：
(1a)将γ-聚谷氨酸溶解于溶剂I中，形成10~20g/L的γ-聚谷氨酸溶液；
(1b)将催化剂加入步骤(1a)得到的γ-聚谷氨酸溶液中，催化剂与γ-聚谷氨酸中的谷氨酸单体残基的摩尔比为(12~2.0):1，500~1000r/min反应活化6~12h，形成反应活化液；
(1c)将疏水性修饰物H溶解于溶剂II中，疏水性修饰物H与γ-聚谷氨酸中谷氨酸单体残基的摩尔比为(0.2~1.0):1；
(1d)将步骤(1c)得到的疏水性修饰物H溶液于30~90min内缓慢滴加到步骤(1b)得到的反应活化液中，10~40℃、500~1000r/min条件下反应12~24h，形成反应液；
(1e)将步骤(1d)得到的反应液加入溶剂III中使γ-聚谷氨酸接枝产物沉淀，溶剂III的体积用量为步骤(1d)得到的反应液体积的1~2倍，过滤收集沉淀，先用溶剂III清洗，再用乙醚清洗，反复透析-冻干后得两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物；
(2)两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备：
将步骤(1e)得到的两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物加入到pH4~7.5、0.1~5mol/L的磷酸盐缓冲液中，两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物在磷酸盐缓冲液中的浓度为1~5mg/mL，于25~37℃下震荡12~36h获得准备液，随后利用分子组装的原理，将准备液采用探针型超声仪于冰水浴中超声处理后获得粒径为200~1000nm、粒径多分散系数PDI为0.1~0.5的纳米胶束分散液，再经离心或超滤，冷冻干燥获得两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体。
步骤(1a)中，γ-PGA可采用不同分子量的γ-PGA原料（10KDa~1000KDa），其分子量分布系数应在1.1~2.0之间。
步骤(1a)中，所述的溶剂I为0.3~1.0mol/L的Na2CO3水溶液、0.3~1.0mol/L的NaHCO3水溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二乙基甲酰胺（DEF）和N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）中的任意一种或几种的混合物。
步骤(1b)中，所述催化剂为碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）中的任意一种或两种的混合物。
步骤(1c)中，所述的疏水性修饰物H为带有非极性或疏水侧链的氨基酸的酯化衍生物、或固醇类化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚（N-异丙基丙烯酰胺）、或糖皮质激素、或阿霉素、或紫杉醇；其中，所述的带有非极性或疏水侧链的氨基酸的酯化衍生物为酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或缬氨酸、或亮氨酸、或异亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸的酯化衍生物；所述的固醇类化合物为胆甾醇；所述的烷醇为辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮质激素为地塞米松或氢化可的松。优选酪氨酸乙酯、缬氨酸乙酯、异亮氨酸乙酯、苯丙氨酸甲酯、胆甾醇、生育酚、聚（N-异丙基丙烯酰胺）、十六烷醇、油醇、阿霉素、紫杉醇、地塞米松。
步骤(1c)中，所述的溶剂II为二甲亚砜（DMSO）、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二乙基甲酰胺（DEF）、N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）和氯仿中的任意一种或几种的混合物。
步骤(1e)中，所述的溶剂III为低级醇或丙酮，所述的低级醇为甲醇或乙醇。
步骤(2)中，超声的功率为40~90W，工作2~5s，停1~3s，总时间3~9min。
步骤(2)中，所述的离心为高速离心，离心力在10000g以上。
步骤(2)中，获得的两亲性接枝γ-PGA的自组装性能（胶束形态、粒径、粒径分布、临界胶束浓度）可通过γ-PGA原料的分子量特性、疏水改性基团的选择以及接枝产物侧链取代度来调控。
上述方法制备得到的两亲性γ-PGA纳米药物载体。
上述两亲性γ-PGA纳米药物载体在负载蛋白、DNA以及疏水性药物中的应用。所述的疏水性药物为阿霉素、紫杉醇或糖皮质激素等。
两亲性γ-PGA纳米药物载体在负载药物时，一般将要负载的药物投加至上述两亲性γ-PGA纳米药物载体分散液中，室温、避光条件下低速振荡（50~100r/min）12~24h，利用药物与载体间的疏水作用、氢键作用、静电作用等实现自组装γ-PGA纳米药物载体对药物的负载，采用超滤或透析的方法除去游离的药物，或以高速离心（＞10000g）的方法收集载药纳米胶束，冷冻干燥后即获得载药γ-PGA纳米胶束。
载药γ-PGA纳米胶束的释药行为（环境响应特性）可通过介质pH和是否存在GGT作用来控制。
对于阿霉素、紫杉醇或糖皮质激素等疏水性药物，其本身即可作为疏水接枝基团，可按照本发明所述的两亲性γ-PGA纳米药物载体的制备方法直接制备出两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物从而不再需要利用自组装原理额外负载药物的步骤；或者，以阿霉素、紫杉醇或糖皮质激素以外的物质（即带有非极性或疏水侧链的氨基酸的酯化衍生物、或固醇类化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚（N-异丙基丙烯酰胺））为疏水性修饰物H，接枝于γ-聚谷氨酸上得到得两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体，再利用自组装原理负载阿霉素、紫杉醇或糖皮质激素。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1）本发明所用的γ-PGA可采用微生物发酵法大量合成，所用的侧链改性基团、催化剂等均可通过市场渠道获得。
2）本发明以酰胺合成与酯化反应中常用的EDC或NHS为催化剂制备两亲性的γ-PGA接枝衍生物，产量可控，易于放大。
3）本发明获得的两亲性γ-PGA在水介质中的自组装性能（胶束形态、粒径、粒径分布、临界胶束浓度）可通过γ-PGA原料的分子量特性、疏水改性基团的选择、接枝产物侧链的取代度的调控来控制。
4）本发明利用两亲性聚合物自组装的原理，在超声条件下制备纳米胶束，工艺简单，易于操作。疏水核-亲水壳结构的纳米胶束适合于疏水性或生物利用度较差的药物及生物活性大分子药物的负载和传输，利于保留药物的活性和提高其生物利用度。
5）获得的γ-PGA纳米胶束同时具备环境响应特性（pH-GGT复合敏感）、生物相容性以及可降解性，因而可在药物控制释放、生物智能开关等领域具有广泛的应用。
附图说明
图1为本发明方法的γ-PGA接枝改性的化学反应式。
图2为本发明方法的γ-PGA原料（a）及其接枝改性后graft-γ-PGA(b)的红外谱图（FTIR）。
图3为本发明方法的γ-PGA原料（A）及其接枝改性后graft-γ-PGA(B)的1H-NMR谱图。
图4为实施例2中芘荧光探针表征γ-PGA接枝改性物两亲性的发射光谱图。
图5为实施例2中芘荧光探针表征的特征峰比值（I372/I385）与γ-PGA接枝改性物浓度的对数图。
图6为实施例4制备的两亲性γ-PGA纳米胶束的投射电镜照片。
图7为实施例15不同pH的释药介质中载药γ-PGA纳米胶束的体外释药曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一种两亲性γ-PGA纳米药物载体的制备方法，该方法包括以下步骤。
(1)室温下，将1gγ-PGA（分子量380KDa，分子量分布系数1.3）溶解于100mL DMSO（溶剂I）中，形成透明的10g/Lγ-PGA溶液。
(2)按与步骤(1)中所取γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.2的量称取EDC加入上述γ-PGA溶液中，并在室温下于500r/min反应活化12h，形成反应活化液。
(3)按与步骤(1)中所取γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为0.4的量称取胆甾醇，溶于100mL等比例混合的DMSO-吡啶（溶剂II）中。
(4)将步骤(3)得到的含胆甾醇的溶液于30min内缓慢滴加到步骤(2)得到的反应活化液中，30℃下于500~1000r/min反应12h，形成反应液。
(5)将步骤(4)得到的反应液加入到1倍体积的丙酮中，使γ-PGA接枝产物沉淀。过滤收集沉淀，先用甲醇（或乙醇）清洗，再用乙醚清洗，反复透析-冻干后得合成产物。根据产物1H-NMR图谱分析，侧链取代度约为22%。
实施例2：
溶剂I采用1.0mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），催化剂EDC用量与所取γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为2.0，胆甾醇用量与所取γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.0外，其他条件同实施例1。该条件下制备的γ-PGA接枝产物的FTIR与1H-NMR如图2(b)和图3(B)所示。根据1H-NMR图谱分析，侧链取代度约为37%。
采用芘荧光探针法考察该条件下制备的γ-PGA接枝改性产物的两亲性及临界胶束浓度（CMC），其芘发射光谱如图4所示，芘荧光探针表征的特征峰比值（I372/I385）与γ-PGA接枝改性物浓度的对数图如图5，变化的转折点（即两条直线的交点）对应的浓度即为CMC（0.027mg/mL）。
实施例3：
将实施例1的合成产物，加入到pH4.0的1mol/L PBS缓冲液中，使得合成产物浓度为1mg/mL，于25℃下低速震荡12h，随后用探针型超声仪于冰水浴中超声处理，工作2s，停2s，超声时间2min，重复3次，获两亲性γ-PGA纳米胶束的分散液，再通过14000g离心收集沉淀-冷冻干燥步骤即可获得两亲性γ-PGA纳米胶束。电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则；平均粒径约为220nm，粒径多分散系数（PDI）为0.35。
实施例4：
将实施例1的合成产物，加入到pH7.42mol/L的PBS缓冲液中，其余同实施例3。该条件下制备的纳米胶束的投射电镜照片如图6所示，平均粒径约为350nm、形态规则、粒径分布较为均一；粒径分析仪的测定结果与电镜观测结果基本一致，其粒径多分散系数（PDI）为0.16。
实施例5：
除原料γ-PGA的分子量为1000KDa，分子量多分散系数1.4，两亲性γ-PGA接枝产物的制备同实施例1，CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.014mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为780nm，粒径多分散系数（PDI）为0.42。
实施例6：
除疏水性修饰物H采用酪氨酸乙酯，两亲性γ-PGA接枝产物的制备和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.033mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为260nm，粒径多分散系数（PDI）为0.19。
实施例7：
溶剂I采用等比例混合的吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的复合溶剂，溶剂II采用等比例混合的N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）和氯仿的复合溶剂，疏水性修饰物H采用十六烷醇，催化剂采用EDC（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.2），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.056mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为210nm，粒径多分散系数（PDI）为0.22。
实施例8：
溶剂I采用N,N-二乙基甲酰胺（DEF），溶剂II采用等比例混合的N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）和氯仿的复合溶剂，疏水性修饰物H采用油醇，催化剂采用EDC（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.5），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.008mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为440nm，粒径多分散系数（PDI）为0.28。
实施例9：
溶剂I采用N,N-二甲基乙酰胺（DMAC），溶剂II采用N,N-二甲基甲酰胺（DMF），疏水性修饰物H采用生育酚，其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.013g/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为520nm，粒径多分散系数（PDI）为0.20。
实施例10：
溶剂I采用1.0mol/L的NaHCO3水溶液，溶剂II采用N,N-二乙基甲酰胺（DEF），疏水性修饰物H采用聚（N-异丙基丙烯酰胺），催化剂采用NHS（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.5），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.011mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为370nm，粒径多分散系数（PDI）为0.17。
实施例11：
溶剂I采用N,N-二乙基甲酰胺（DEF），溶剂II采用N,N-二乙基甲酰胺（DEF），疏水性修饰物H采用氢化可的松，催化剂采用EDC（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.2），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.041mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为310nm，粒径多分散系数（PDI）为0.16。
实施例12：
将实施例4制备的两亲性γ-PGA纳米胶束分散于pH7.4的PBS溶液中（10g/L）。以卵清蛋白（OVA）作为负载的模型蛋白药物，按终浓度3mg/ml的量投加OVA至上述两亲性γ-PGA纳米药物载体的分散液中，室温、避光、100r/min条件下振荡12h，14000g离心收集沉淀，冷冻干燥即得负载OVA的γ-PGA纳米胶束。并采用Lowry法测定离心上清液游离的OVA或沉淀中包含的OVA（即装载的OVA），γ-PGA纳米胶束的载药量=负载药物量/纳米载体质量（μg/mg），包封率=(负载药物量/投加药物量)×100%。根据上式计算得γ-PGA纳米胶束对OVA的载药量为145μg/mg，包封率为45%。
实施例13：
以盐酸阿霉素作为负载药物，按终浓度5mg/ml的量投加至实施例4制备的两亲性γ-PGA纳米胶束的分散液中（10g/L），室温、避光、50r/min条件下振荡12h，透析、冷冻干燥后即得载药γ-PGA纳米胶束。计算得γ-PGA纳米胶束对阿霉素的载药量为103μg/mg，包封率为79%。
实施例14：
以地塞米松磷酸钠作为负载药物，按终浓度5mg/ml的量投加至实施例4制备的两亲性γ-PGA纳米胶束的分散液中（10g/L），室温、避光、50r/min条件下振荡12h，透析、冷冻干燥后即得载药γ-PGA纳米胶束。计算得γ-PGA纳米胶束对地塞米松的载药量为26μg/mg，包封率为75%。
实施例15：
将实施例12制备的γ-PGA载药（OVA）纳米胶束分散于不同pH的PBS缓冲溶液中，考察介质pH对其体外释药特性的影响。实验结果表明两亲性的γ-PGA纳米胶束具有pH敏感的特性，具体表现为其释药行为对介质pH条件具有响应特性：在pH7.4的PBS溶液中OVA释放较慢，12h内的释药率仅为19.6％，84h内的释药率为42.1％，无突释现象；而在pH4.0与pH8.0的PBS溶液中，释放速率明显增加（如图7所示）。
实施例16：
除原料γ-PGA的分子量为10KDa，分子量多分散系数1.1，两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.010mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为180nm，粒径多分散系数（PDI）为0.17。
实施例17：
疏水性修饰物H采用十二烷醇，催化剂采用EDC（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为2.0），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例7，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.019mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为310nm，粒径多分散系数（PDI）为0.32。
实施例18：
除疏水性修饰物H采用十四烷醇，催化剂采用EDC（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.5），两亲性γ-PGA接枝产物的制备和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.027mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为290nm，粒径多分散系数（PDI）为0.26。
实施例19：
除疏水性修饰物H采用缬氨酸乙酯，两亲性γ-PGA接枝产物的制备和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.039mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为305nm，粒径多分散系数（PDI）为0.16。
实施例20：
除疏水性修饰物H采用苯丙氨酸甲酯，两亲性γ-PGA接枝产物的制备和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.055mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为405nm，粒径多分散系数（PDI）为0.29。
实施例21：
溶剂I采用1.0mol/L的NaHCO3水溶液，溶剂II采用等比例混合的N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）和DMSO溶液，疏水性修饰物H采用阿霉素，催化剂采用NHS（催化剂与γ-PGA中谷氨酸单体残基的物质量之比为1.2），其余两亲性γ-PGA接枝产物的制备条件和CMC浓度的测定同实施例2，两亲性γ-PGA纳米胶束的制备同实施例4。CMC为0.044mg/mL；电镜观测与粒径分析仪的测定结果显示，两亲性γ-PGA纳米胶束的形态较规则、平均粒径约为333nm，粒径多分散系数（PDI）为0.38。
实施例22：
将实施例4制备的两亲性γ-PGA纳米胶束分散于pH7.4的PBS溶液中（10g/L）。以质粒DNA（pEGFP：其中含有编码绿色荧光蛋白的报告基因）作为负载模型药物（50μg/100ul），取载体分散液与质粒DNA溶液等比例混合，其余同实施例12。测定游离的质粒DNA浓度，计算得包封率为96%。
Claims (11)
1.一种两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物的合成：
(1a)将γ-聚谷氨酸溶解于溶剂I中，形成10~20g/L的γ-聚谷氨酸溶液；
(1b)将催化剂加入步骤(1a)得到的γ-聚谷氨酸溶液中，催化剂与γ-聚谷氨酸中的谷氨酸单体残基的摩尔比为(12~2.0):1，500~1000r/min反应活化6~12h，形成反应活化液；
(1c)将疏水性修饰物H溶解于溶剂II中，疏水性修饰物H与γ-聚谷氨酸中谷氨酸单体残基的摩尔比为(0.2~1.0):1；
(1d)将步骤(1c)得到的疏水性修饰物H溶液于30~90min内缓慢滴加到步骤(1b)得到的反应活化液中，10~40℃、500~1000r/min条件下反应12~24h，形成反应液；
(1e)将步骤(1d)得到的反应液加入溶剂III中使γ-聚谷氨酸接枝产物沉淀，溶剂III的体积用量为步骤(1d)得到的反应液体积的1~2倍，过滤收集沉淀，先用溶剂III清洗，再用乙醚清洗，反复透析-冻干后得两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物；
(2)两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备：
将步骤(1e)得到的两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物加入到pH4~7.5、0.1~5mol/L的磷酸盐缓冲液中，两亲性γ-聚谷氨酸接枝产物在磷酸盐缓冲液中的浓度为1~5mg/mL，于25~37℃下震荡12~36h获得准备液，随后利用分子组装的原理，将准备液采用探针型超声仪于冰水浴中超声处理后获得粒径为200~1000nm、粒径多分散系数PDI为0.1~0.5的纳米胶束分散液，再经离心或超滤，冷冻干燥获得两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述γ-聚谷氨酸的分子量为10KDa~1000KDa，其分子量分布系数应在1.1~2.0之间。
3.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述的溶剂I为0.3~1.0mol/L的Na2CO3水溶液、0.3~1.0mol/L的NaHCO3水溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二乙基甲酰胺（DEF）和N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）中的任意一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1b)中，所述催化剂为碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）中的任意一种或两种的混合物。
5.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1c)中，所述的疏水性修饰物H为带有非极性或疏水侧链的氨基酸的酯化衍生物、或固醇类化合物、或烷醇、或油醇、或生育酚、或聚（N-异丙基丙烯酰胺）、或糖皮质激素、或阿霉素、或紫杉醇；其中，所述的带有非极性或疏水侧链的氨基酸为或酪氨酸、或色氨酸、或苯丙氨酸、或缬氨酸、或亮氨酸、或异亮氨酸、或脯氨酸、或丙氨酸；所述的固醇类化合物为胆甾醇；所述的烷醇为辛醇、十二烷醇、十四烷醇或十六烷醇；所述的糖皮质激素为地塞米松或氢化可的松。
6.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1c)中，所述的溶剂II为二甲亚砜（DMSO）、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二乙基甲酰胺（DEF）、N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）和氯仿中的任意一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1e)中，所述的溶剂III为低级醇或丙酮。
8.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，超声的功率为40~90W，工作2~5s，停1~3s，总时间3~9min。
9.根据权利要求1所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的离心为高速离心，离心力在10000g以上。
10.权利要求1所述方法制备得到的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体。
11.权利要求10所述的两亲性γ-聚谷氨酸纳米药物载体在负载蛋白、DNA以及疏水性药物中的应用。
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